ES2327312T3 - SECRETASE OF ALZHEIMER'S DISEASE, SUBSTRATES APP FOR THE SAME, AND USES FOR THE SAME. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para evaluar la actividad de la alfa-secretasa de hu-Asp1, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un polipéptido hu-Asp1, que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 95% a un fragmento, que incluye los tripéptidos DTG y DSG del sitio activo de las aspartil proteasas, de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, en el que el polipéptido y el fragmento conservan una actividad de alfa-secretasa, con el sustrato de la proteína precursora del amiloide (APP) que contiene un sitio de escisión de alfa-secretasa, y (b) medir la escisión del sustrato de APP en el sitio de escisión de la alfa-secretasa de hu-Asp1.A method for evaluating the activity of hu-Asp1 alpha-secretase, which comprises the steps of: (a) contacting a hu-Asp1 polypeptide, which comprises an amino acid sequence identical in at least 95% to a fragment, which includes the DTG and DSG tripeptides of the active site of aspartyl proteases, of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, in which the polypeptide and the fragment retain an alpha-secretase activity, with the precursor protein substrate of the amyloid (APP) that contains an alpha-secretase cleavage site, and (b) measure the cleavage of the APP substrate at the alpha-secretase cleavage site of hu-Asp1.

Description

Secretasa de la enfermedad de Alzheimer, sustratos de APP para la misma, y usos para la misma.Alzheimer's disease secretase, APP substrates for it, and uses for it.

Campo de la invenciónField of the Invention

La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar la actividad de la \alpha-secretasa de Aspartil Proteasa 1 humana (hu-Asp1).The present invention relates to a procedure to determine the activity of the human Aspartyl Protease 1 secretase (hu-Asp1).

Antecedentes de la invenciónBackground of the invention

La enfermedad de Alzheimer (EA) provoca una demencia progresiva, con la consiguiente formación de placas amiloides, enredos neurofibrilares, gliosis y pérdida neuronal. La enfermedad se produce tanto de forma genética como esporádica, cuya evolución y características patológicas son bastante similares. Hasta la fecha, se han descubierto tres genes que, cuando sufren mutaciones, provocan una forma autosómica dominante de enfermedad de Alzheimer. Éstos codifican el precursor de la proteína amiloide (APP) y dos proteínas relacionadas, presenilina-1 (PS1) y presenilina-2 (PS2) que, tal como señalan sus nombres, están relacionadas estructural y funcionalmente. Se ha observado que las mutaciones de cualquiera de las tres proteínas potencian el procesamiento proteolítico de APP a través de una vía intracelular que produce el péptido amiloide beta (péptido A\beta u, ocasionalmente en este documento, Abeta), un péptido de 40 a 42 aminoácidos de longitud que es el componente principal de la placa amiloide en la EA.Alzheimer's disease (AD) causes progressive dementia, with subsequent plaque formation Amyloids, neurofibrillary tangles, gliosis and neuronal loss. The disease occurs both genetically and sporadically, whose evolution and pathological characteristics are quite similar. To date, three genes have been discovered that, when they suffer mutations, cause an autosomal dominant form of disease Alzheimer's These encode the amyloid protein precursor (APP) and two related proteins, presenilin-1 (PS1) and presenilin-2 (PS2) which, as they point out Their names are structurally and functionally related. It has been observed that mutations of any of the three proteins enhance the proteolytic processing of APP through one route intracellular that produces the beta amyloid peptide (A? peptide or, occasionally in this document, Abeta), a peptide from 40 to 42 amino acids in length that is the main component of plaque amyloid in AD.

La disregulación de las vías intracelulares para el procesamiento proteolítico puede ser un factor primordial en la fisiopatología de la EA. En el caso de la formación de la placa, las mutaciones de APP, PS1 o PS2 alteran de manera consistente el procesamiento proteolítico de APP, hasta el punto de fomentar la formación de A\beta 1-42, una forma de péptido A\beta que parece ser especialmente amiloidogénico y, por lo tanto, muy importante en la EA. Diferentes formas de APP tienen tamaños comprendidos en el intervalo de 695 a 770 aminoácidos, se localizan hacia la superficie celular, y exhiben un único dominio transmembranoso C-terminal. Ejemplos de isotipos específicos de APP cuya existencia en el ser humano está demostrada son el polipéptido de 695 aminoácidos descrito por Kang et al. (1987), Nature 325: 733-736, considerado como APP "normal"; el polipéptido de 751 aminoácidos descrito por Ponte et al. (1988), Nature 331: 525-527 (1988) y Tanzi et al. (1988), Nature 331: 528-530; y el polipéptido de 770 aminoácidos descrito por Kitaguchi et al. (1988), Nature 331: 530-532. El polipéptido Abeta deriva de una región de APP adyacente a y que contiene una porción del dominio transmembranoso. Normalmente, el procesamiento de APP en el sitio de la \alpha-secretasa escinde la región central de la secuencia A\beta adyacente a la membrana y libera el dominio extracelular y soluble de APP de la superficie celular. Este procesamiento de la APP \alpha-secretasa genera APP-\alpha soluble (sAPP\alpha), que es normal y que no se considera que contribuya a la EA.Dysregulation of intracellular pathways for proteolytic processing may be a primary factor in the pathophysiology of AD. In the case of plaque formation, APP, PS1 or PS2 mutations consistently alter the proteolytic processing of APP, to the point of promoting the formation of Aβ 1-42, a form of Aβ peptide which seems to be especially amyloidogenic and, therefore, very important in AD. Different forms of APP have sizes in the range of 695 to 770 amino acids, are located towards the cell surface, and exhibit a single C-terminal transmembrane domain. Examples of specific APP isotypes whose existence in humans is demonstrated are the 695 amino acid polypeptide described by Kang et al . (1987), Nature 325: 733-736, considered as a "normal"APP; the 751 amino acid polypeptide described by Ponte et al . (1988), Nature 331: 525-527 (1988) and Tanzi et al . (1988), Nature 331: 528-530; and the 770 amino acid polypeptide described by Kitaguchi et al . (1988), Nature 331: 530-532. The Abeta polypeptide is derived from an adjacent APP region and contains a portion of the transmembrane domain. Normally, the processing of APP at the α-secretase site cleaves the central region of the A? Sequence adjacent to the membrane and releases the extracellular and soluble domain of APP from the cell surface. This processing of APP? -Secretase generates soluble APP-? (SAPP?), Which is normal and is not considered to contribute to AD.

El procesamiento patológico de APP en los sitios de las secretasas \beta y \gamma, que están localizadas de forma N-terminal y C-terminal en relación con el sitio de la \alpha-secretasa, respectivamente, produce un resultado muy diferente al del procesamiento del sitio \alpha. El procesamiento secuencial de los sitios de las secretasas \beta y \gamma libera el péptido A\beta, un péptido que posiblemente es muy importante en la patogénesis de la EA. El procesamiento de los sitios de las secretasas \beta y \gamma puede producirse tanto en el retículo endoplásmico (en las neuronas) como en la vía endosómica/lisosómica tras la reinternalización de la APP de la superficie celular (en todas las células).Pathological processing of APP on sites of the β and γ secretases, which are located from N-terminal and C-terminal form in relationship with the α-secretase site, respectively, it produces a very different result from that of α site processing. The sequential processing of β and γ secretase sites release the peptide A?, A peptide that is possibly very important in the pathogenesis of AD. The processing of the sites of the β and γ secretases can occur both in the reticulum endoplasmic (in neurons) as in the endosomal / lysosomal pathway after reinternalization of the APP of the cell surface (in all cells).

Resumen de la invenciónSummary of the Invention

De acuerdo con la presente invención, un procedimiento para evaluar la actividad de la \alpha-secretasa de hu-Asp1 comprende las etapas de:In accordance with the present invention, a procedure to evaluate the activity of the hu-Asp1 α-secretase It comprises the stages of:

(a) (to)

poner en contacto un polipéptido hu-Asp1 que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 95% a un fragmento que incluye los tripéptidos DTG y DSG del sitio activo de las aspartil proteasas, de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, en donde el polipéptido y el fragmento conservan actividad de \alpha-secretasa, con un sustrato para la proteína precursora del amiloide (APP), que contiene un sitio de escisión de \alpha-secretasa; ycontact a polypeptide hu-Asp1 comprising an amino acid sequence which is at least 95% identical to a fragment that includes the DTG and DSG tripeptides from the active site of aspartyl proteases, of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide and fragment retain activity of α-secretase, with a substrate for protein amyloid precursor (APP), which contains a cleavage site of α-secretase; Y

(b) (b)

medir la escisión del sustrato de APP en el sitio de escisión de la \alpha-secretasa de hu-Asp1.measure the cleavage of the APP substrate at the site of α-secretase cleavage of hu-Asp1.

La invención ofrece procedimientos para determinar la actividad de la \alpha-secretasa de la Asp1 humana (hu-Asp1) que comprenden poner en contacto la proteína hu-Asp1 con un sustrato para la proteína precursora del amiloide (APP), en donde el sustrato contiene un sitio de escisión de \alpha-secretasa; y medir la escisión del sustrato de APP en el sitio de escisión de \alpha-secretasa, analizando de este modo la actividad de la \alpha-secretasa de hu-Asp1. Un ejemplo de actividad de \alpha-secretasa es el procesamiento de APP, en donde el sustrato de APP se escinde en un sitio adyacente a la membrana celular (en los residuos Phe^{20}1Ala^{21} en relación con el péptido A\beta). Esta escisión da como resultado la liberación de un dominio extracelular y soluble de APP, conocido como péptido amiloide alfa (sAPP\alpha), desde la superficie celular hacia el citoplasma. El sAPP\alpha en el interior del citoplasma se puede detectar y cuantificar, midiendo de este modo la actividad de \alpha-secretasa.The invention offers methods for determine the α-secretase activity of the human Asp1 (hu-Asp1) that comprise putting in contact the hu-Asp1 protein with a substrate for amyloid precursor protein (APP), where the substrate it contains an α-secretase cleavage site; and measure the cleavage of the APP substrate at the cleavage site of α-secretase, thus analyzing the α-secretase activity of hu-Asp1. An example of activity from α-secretase is the processing of APP, in where the APP substrate is cleaved at a site adjacent to the cell membrane (in residues Phe20 1Ala 21 in relation with the Aβ peptide). This split results in the release of an extracellular and soluble domain of APP, known as alpha amyloid peptide (sAPPα), from the surface cell to the cytoplasm. The sAPP? Inside the Cytoplasm can be detected and quantified, thus measuring α-secretase activity.

La enzima hu-Asp1 utilizada en los procedimientos según la invención se puede purificar y aislar a partir de una célula que se transfecta o transforma con un polinucleótido que codifica hu-Asp1, tal como SEQ ID NO:1, o una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Adicionalmente, la proteína hu-Asp1 usada en los procedimientos puede ser un fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, que conserva actividad de \alpha-secretasa. Fragmentos posibles que pueden ser de utilidad incluyen los que carecen de los aminoácidos del dominio transmembranoso 469-492 de SEQ ID NO:2, los fragmentos que carecen de los aminoácidos citoplasmáticos 493-492 de SEQ ID NO:2, los fragmentos que carecen de los aminoácidos amino-terminales 1-62 de SEQ ID NO:2, o combinaciones de los mismos.The enzyme hu-Asp1 used in the methods according to the invention can be purified and isolated to from a cell that is transfected or transformed with a polynucleotide encoding hu-Asp1, such as SEQ ID NO: 1, or a polynucleotide sequence encoding the sequence of amino acids of SEQ ID NO: 2. Additionally, the protein hu-Asp1 used in the procedures can be a amino acid sequence fragment of SEQ ID NO: 2, which retains α-secretase activity. Fragments Possible ones that may be useful include those that lack amino acids of the transmembrane domain 469-492 of SEQ ID NO: 2, fragments lacking amino acids cytoplasmic 493-492 of SEQ ID NO: 2, the fragments that lack amino acids amino terminals 1-62 of SEQ ID NO: 2, or combinations thereof.

La invención comprende también procedimientos de análisis de la actividad de \alpha-secretasa, en donde se ponen en contacto la proteína hu-Asp1 y su sustrato por medio de una célula en crecimiento, transfectada o transformada con un polinucleótido que codifica la proteína hu-Asp1, o un fragmento de la misma, que conserva actividad de \alpha-secretasa bajo condiciones en las que la célula expresa la proteína hu-Asp1 en presencia del sustrato de APP. En tales circunstancias, el sustrato de APP se puede introducir de forma exógena o, más preferentemente, se expresa en la célula que expresa Asp1. Estos procedimientos comprenden también poner en contacto la proteína hu-Asp1 con una célula que expresa un polinucleótido que codifica un sustrato de APP que contiene un sitio de escisión de \alpha-secretasa. Por ejemplo, la célula puede expresar un polinucleótido que codifica un polipéptido que posee un sitio de escisión de \alpha-secretasa que comprende la secuencia de aminoácidos LVFFAEDF o KLVFFAED. Además, el sustrato de APP puede comprender cualquier isoforma humana de APP tal como APP "normal" (APP695), APP751 o APP750. Estos sustratos de APP se pueden modificar adicionalmente para que comprendan un patrón di-lisina carboxi-terminal.The invention also comprises methods of analysis of α-secretase activity, in where the hu-Asp1 protein and its substrate through a growing cell, transfected or transformed with a polynucleotide that encodes the protein hu-Asp1, or a fragment thereof, that preserves α-secretase activity under conditions in which the cell expresses the hu-Asp1 protein in APP substrate presence. In such circumstances, the substrate APP can be introduced exogenously or, more preferably, It is expressed in the cell expressing Asp1. These procedures they also include contacting the protein hu-Asp1 with a cell that expresses a polynucleotide which encodes an APP substrate that contains a cleavage site of α-secretase. For example, the cell can express a polynucleotide encoding a polypeptide that possesses a α-secretase cleavage site that it comprises the amino acid sequence LVFFAEDF or KLVFFAED. Further, the APP substrate can comprise any human isoform of APP such as "normal" APP (APP695), APP751 or APP750. These APP substrates can be further modified so that understand a di-lysine pattern carboxy-terminal.

Para medir la escisión de los sustratos para los procedimientos de análisis de la actividad de \alpha-secretasa de la invención, es posible modificar adicionalmente los sustratos del procedimiento para que comprendan marcas detectables tales como marcas radioactivas, enzimáticas, quimioluminiscentes o fluorescentes. De manera particular, los sustratos peptídicos más cortos comprenden, preferentemente, marcas de extinción interna que dan como resultado un incremento de la capacidad de detección tras la escisión de los sustratos peptídicos. Los sustratos peptídicos se pueden modificar para que tengan fijados un fluoróforo acoplado con un extintor, que incluye, pero sin estar limitado a ellos, 7-amino-4-metil cumarina y dinitrofenol, respectivamente, de manera que la escisión del péptido por hu-Asp1 da como resultado un aumento de la fluorescencia debido a la separación física del fluoróforo y el extintor. Otros fluoróforos y extintores acoplados incluyen boro-dipirrometeno (bodipy)-tetrametil-rodamina y QSY-5 (Molecular Probes, Inc.). En una variante de este ensayo, se puede utilizar biotina u otra marca apropiada en un extremo del péptido para anclar el péptido a una placa de ensayo del sustrato, y se puede situar un fluoróforo en el otro extremo del péptido. Los fluoróforos de utilidad incluyen los que se han mencionado anteriormente, así como las marcas Europium tales como W8044 (EG&G Wallac, Inc.). Una marca preferida es el verde Oregón que se puede unir con un residuo Cys. La escisión del péptido por medio de Asp1 liberará el fluoróforo o cualquier otra marca de la placa, permitiendo analizar los componentes con respecto a la inhibición de la escisión proteolítica de Asp1, tal como se demuestra por un aumento de la fluorescencia retenida. Los ensayos colorimétricos preferidos de la actividad proteolítica de Asp1 utilizan otros sustratos apropiados, que incluyen los aminoácidos P2 y P1 que comprenden el sitio de reconocimiento para la escisión enlazado con o-nitrofenol a través de un enlace amida, de modo que la escisión por medio de hu-Asp1 da como resultado un incremento de la densidad óptica después de alterar el tampón de ensayo a pH alcalino.To measure the cleavage of substrates for activity analysis procedures α-secretase of the invention, it is possible further modify the process substrates so that understand detectable marks such as radioactive marks, enzymatic, chemiluminescent or fluorescent. By way of in particular, the shorter peptide substrates comprise, preferably, internal extinction marks that result an increase in detection capacity after excision of peptide substrates. Peptide substrates can be modified so that they have a fluorophore attached to a fire extinguisher, which includes, but not limited to them, 7-amino-4-methyl coumarin and dinitrophenol, respectively, so that excision of the peptide by hu-Asp1 results in an increase of fluorescence due to physical separation of fluorophore and the extinguisher Other coupled fluorophores and extinguishers include boron-dipyrrometene (bodipy) -tetramethyl-rhodamine and QSY-5 (Molecular Probes, Inc.). In a variant of This assay can be used biotin or other appropriate brand in a end of the peptide to anchor the peptide to a test plate of the substrate, and a fluorophore can be placed at the other end of the peptide Useful fluorophores include those that have been mentioned above, as well as Europium brands such as W8044 (EG&G Wallac, Inc.). A preferred brand is green Oregon that can be joined with a Cys residue. Peptide cleavage by means of Asp1 it will release the fluorophore or any other brand of the plate, allowing to analyze the components with respect to the inhibition of proteolytic cleavage of Asp1, as demonstrated by an increase in retained fluorescence. The essays Preferred colorimetric proteolytic activity of Asp1 use other appropriate substrates, which include amino acids P2 and P1 comprising the recognition site for cleavage linked with o-nitrophenol through a link amide, so that the cleavage by hu-Asp1 results in an increase in optical density after alter the assay buffer at alkaline pH.

Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention

A continuación, se ofrecen algunas definiciones usadas en esta invención; la mayoría de las definiciones utilizadas son las que emplearía un experto en la técnica.Here are some definitions. used in this invention; most of the definitions used they are those that an expert in the art would employ.

La expresión "péptido \beta amiloide" significa cualquier péptido resultante de la escisión por la beta-secretasa de APP. Esto incluye péptidos de 39, 40, 41, 42 y 43 aminoácidos, que se extienden desde el sitio de escisión de la \beta-secretasa hasta los 39, 40, 41, 42 y 43 aminoácidos en situación C-terminal con respecto al sitio de escisión de \beta-secretasa. El péptido \beta amiloide incluye también las secuencias 1-6, SEQ ID NOs:1-6 del documento US 5.750.349, emitido el 12 de mayo de 1998 (incorporado como referencia a este documento). Un fragmento de la escisión de \beta-secretasa que se describe en este documento se denomina CTF-99, que se extiende desde el sitio de escisión de \beta-secretasa hasta el extremo carboxi de APP.The expression "β-amyloid peptide" means any peptide resulting from cleavage by the APP beta-secretase. This includes peptides of 39, 40, 41, 42 and 43 amino acids, which extend from the site of cleavage of β-secretase until 39, 40, 41, 42 and 43 amino acids in C-terminal situation with with respect to the β-secretase cleavage site. The β-amyloid peptide also includes the sequences 1-6, SEQ ID NOs: 1-6 of the document US 5,750,349, issued May 12, 1998 (incorporated as reference to this document). A fragment of the excision of β-secretase described herein It is called CTF-99, which extends from the site β-secretase cleavage to the extreme APP carboxy.

Cuando se hace referencia a una isoforma de APP se pretende indicar cualquier polipéptido APP, incluidas las variantes de APP (mutaciones incluidas) y fragmentos de APP que existen en el ser humano, tales como los que se describen en el documento US 5.766.846, col. 7, líneas 45-67, que se incorpora como referencia a este documento.When referring to an APP isoform It is intended to indicate any APP polypeptide, including APP variants (mutations included) and APP fragments that they exist in humans, such as those described in the US 5,766,846, col. 7, lines 45-67, which Incorporates this document as a reference.

La expresión "proteína precursora de \beta-amiloide" (APP), tal como se usa en este documento, se define como un polipéptido codificado por un gen del mismo nombre, localizado en el ser humano en el brazo largo del cromosoma 21, y que incluye "\betaAP", en este documento "proteína \beta-amiloide" (véase más arriba) dentro de tercio carboxilo. APP es una proteína glicosilada, capaz de atravesar una membrana única, expresada en una amplia variedad de células en numerosos tejidos de mamífero. Ejemplos de isotipos específicos de APP, cuya existencia es conocida actualmente en el ser humano son el polipéptido de 695 aminoácidos descrito por Kang et al. (1987), Nature 325: 733-736, denominada APP "normal" (SEQ ID NOs:9-10); el polipéptido de 751 aminoácidos descrito por Ponte et al. (1988), Nature 331: 525-527 (1988) y Tanzi et al. (1988), Nature 331: 528-530 (SEQ ID NOs: 56-57); y el polipéptido de 770 aminoácidos descrito por Kitaguchi et al. (1988), Nature 331: 530-532 (SEQ ID NOs: 54-55). Ejemplos de variantes específicas de APP incluyen mutaciones puntuales que pueden diferenciarse tanto en posición como en fenotipo (para una revisión de mutaciones variantes conocidas, véase Hardy (1992) Nature Genet. 1:233-234). La expresión "fragmentos de APP", tal como se usa en este documento, hace referencia a fragmentos de APP distintos de los que consisten exclusivamente en \betaAP o fragmentos de \betaAP, es decir, los fragmentos de APP incluirán secuencias de aminoácidos de APP, además que las que forman \betaAP intacto o un fragmento de \betaAP.The term "β-amyloid precursor protein" (APP), as used herein, is defined as a polypeptide encoded by a gene of the same name, located in humans on the long arm of chromosome 21, and which includes "βAP", in this document "β-amyloid protein" (see above) within third carboxyl. APP is a glycosylated protein, capable of crossing a single membrane, expressed in a wide variety of cells in numerous mammalian tissues. Examples of specific isotypes of APP, whose existence is currently known in humans are the 695 amino acid polypeptide described by Kang et al . (1987), Nature 325: 733-736, called "normal" APP (SEQ ID NOs: 9-10); the 751 amino acid polypeptide described by Ponte et al . (1988), Nature 331: 525-527 (1988) and Tanzi et al . (1988), Nature 331: 528-530 (SEQ ID NOs: 56-57); and the 770 amino acid polypeptide described by Kitaguchi et al . (1988), Nature 331: 530-532 (SEQ ID NOs: 54-55). Examples of specific APP variants include point mutations that can be differentiated in both position and phenotype (for a review of known variant mutations, see Hardy (1992) Nature Genet . 1: 233-234). The term "APP fragments", as used herein, refers to APP fragments other than those consisting exclusively of βAP or βAP fragments, that is, the APP fragments will include APP amino acid sequences. , in addition to those that form intact βAP or a βAP fragment.

Cuando se utiliza la expresión "cualquier aminoácido", los aminoácidos a los que se hace referencia deben seleccionarse de las siguientes abreviaturas de tres o de una letra - que se pueden usar igualmente, ofrecidas a continuación:When the expression "any" is used amino acid ", the amino acids referred to must be selected from the following three or one letter abbreviations - which can also be used, offered below:

\quadquad

Alanina, Ala, A; Arginina, Arg, R; Asparagina, Asn, N; Ácido aspártico, Asp, D; Cisteína, Cys, C; Glutamina, Gln, Q; Ácido glutámico, Glu, E; Glicina, Gly, G; Histidina, His, H; Isoleucina, Ile, I; Leucina, Leu, L; Lisina, Lys, K; Metionina, Met, M; Fenilalanina, Phe, F; Prolina, Pro, P; Serina, Ser, S; Treonina, Thr, T; Triptófano, Trp, W; Tirosina, Tyr, Y; Valina, Val, V; Ácido aspártico o Asparagina, Asx, B; Ácido glutámico o Glutamina, Glx, Z; cualquier aminoácido, Xaa, X.Alanina, Ala, A; Arginine, Arg, R; Asparagine, Asn, N; Aspartic acid, Asp, D; Cysteine, Cys, C; Glutamine, Gln, Q; Glutamic acid, Glu, E; Glycine, Gly, G; Histidine, His, H; Isoleucine, Ile, I; Leucine, Leu, L; Lysine, Lys, K; Methionine, Met, M; Phenylalanine, Phe, F; Prolina, Pro, P; Serina, Ser, S; Threonine, Thr, T; Tryptophan, Trp, W; Tyrosine, Tyr, Y; Valine, Val, V; Aspartic acid or asparagine, Asx, B; Glutamic acid or Glutamine, Glx, Z; any amino acid, Xaa, X.

La secuencia prevista de aminoácidos de Hu-Asp1 comparte una homología significativa con aspartil proteasas de mamífero identificadas previamente tales como pepsinógeno A, pepsinógeno B, catepsina D, catepsina E y renina. P.B. Szecs, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 52:(Supl. 210 5-22 (1992)). Estas enzimas se caracterizan por la presencia de un patrón de secuencia DTG/DSG duplicado. El polipéptido hu-Asp1 descrito en este documento exhibe también una homología extremadamente elevada con el patrón de consenso ProSite para aspartil proteasas extraídas de la base de datos SwissProt.The predicted amino acid sequence of Hu-Asp1 shares a significant homology with previously identified mammalian aspartyl proteases such as pepsinogen A, pepsinogen B, cathepsin D, cathepsin E and renin. PB Szecs, Scand. J. Clin. Lab. Invest . 52: (Suppl. 210 5-22 (1992)). These enzymes are characterized by the presence of a duplicate DTG / DSG sequence pattern. The hu-Asp1 polypeptide described herein also exhibits extremely high homology with the ProSite consensus pattern for aspartyl proteases extracted from the SwissProt database.

La secuencia de nucleótidos ofrecida como residuos 1-1554 de SEQ ID NO:1 corresponde a la secuencia de nucleótidos que codifica Hu-Asp1. El aislamiento y secuenciación del ADN que codifica Hu-Asp1 se describe a continuación en los Ejemplos 1 y 2.The nucleotide sequence offered as residues 1-1554 of SEQ ID NO: 1 corresponds to the nucleotide sequence encoding Hu-Asp1. He isolation and sequencing of the DNA it encodes Hu-Asp1 is described below in the Examples 1 and 2.

Tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2, se utilizaron procedimientos de secuenciación automática para obtener la secuencia de nucleótidos de Hu-Asp1. Las secuencias de nucleótidos de Hu-Asp se obtuvieron para las dos cadenas de ADN y se estima que tienen una exactitud de 100%. Sin embargo, tal como se conoce en la técnica, las secuencias de nucleótidos obtenidas por procedimientos automáticos como los citados pueden contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas de manera automática son, típicamente, idénticas en al menos aproximadamente 90%, más típicamente en al menos aproximadamente 95% hasta al menos aproximadamente 99,9%, a la secuencia de nucleótidos real de una molécula determinada de ácido nucleico. La secuencia verdadera se puede determinar con mayor precisión usando procedimientos de secuenciación manual, que son bien conocidos en la técnica. Un error de secuencia que dé como resultado una inserción o deleción de uno o múltiples nucleótidos puede tener como consecuencia un desplazamiento del marco de lectura en la traducción, de manera que la secuencia prevista de aminoácidos diferirá de la que se hubiera previsto a partir de la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ácido nucleico, partiendo en el punto de mutación.As described in Examples 1 and 2, they used automatic sequencing procedures to obtain the nucleotide sequence of Hu-Asp1. The Hu-Asp nucleotide sequences were obtained for the two strands of DNA and are estimated to have an accuracy of 100% However, as is known in the art, the sequences of nucleotides obtained by automatic procedures such as cited may contain some errors. The sequences of Automatically determined nucleotides are typically identical in at least about 90%, more typically in al less about 95% to at least about 99.9%, to the actual nucleotide sequence of a given molecule of nucleic acid. The true sequence can be determined with greater accuracy using manual sequencing procedures, which They are well known in the art. A sequence error that gives as result an insertion or deletion of one or multiple nucleotides it can result in a shift of the reading frame in translation, so that the intended sequence of amino acids will differ from what was expected from the actual nucleotide sequence of the nucleic acid molecule, starting at the point of mutation.

Células hospedadoras adecuadas para la expresión de polipéptidos Hu-Asp incluyen células procariotas, de levadura y eucariotas superiores. Los huéspedes procariotas apropiados para utilizar en la expresión de Hu-Asp incluyen bacterias de los géneros Escherichia, Bacillus y Salmonella, así como miembros de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. Por ejemplo, para la expresión en E. coli, un polipéptido de Hu-Asp puede incluir un residuo metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en un huésped procariótico. Opcionalmente, la Met N-terminal se puede escindir entonces del polipéptido Hu-Asp expresado. Se pueden agregar otros residuos aminoácidos N-terminales al polipéptido Hu-Asp para facilitar la expresión en Escherichia coli, que incluyen, sin limitaciones, la secuencia líder T7, la secuencia líder T7-caspasa 8, así como otros líderes que incluyen marcas para purificación tales como la marca 6-His (Ejemplo 9). Los polipéptidos Hu-Asp expresados en E. coli se pueden acortar por la eliminación de la cola citoplasmática, el dominio transmembrana o la región proximal a la membrana. Los polipéptidos Hu-Asp expresados en E. coli se pueden obtener en forma soluble o insoluble que puede o no estar presente en forma de cuerpo de inclusión. El polipéptido insoluble se puede hacer soluble por medio de hidrocloruro de guanidina, urea u otros agentes desnaturalizantes de proteínas, para volver a plegarlos seguidamente en una forma soluble, antes o después de la purificación, por dilución o diálisis en un tampón acuoso apropiado. Si con el uso de procedimientos recombinantes se produce la proforma inactiva de Hu-Asp, es posible hacerla activa por la escisión del pro-segmento con una segunda proteasa apropiada, tal como la proteasa de virus de la inmunodeficiencia humana.Suitable host cells for the expression of Hu-Asp polypeptides include prokaryotic, yeast and higher eukaryotic cells. Prokaryotic hosts suitable for use in the expression of Hu-Asp include bacteria of the Escherichia , Bacillus and Salmonella genera, as well as members of the Pseudomonas , Streptomyces and Staphylococcus genera. For example, for expression in E. coli , a Hu-Asp polypeptide may include an N-terminal methionine residue to facilitate expression of the recombinant polypeptide in a prokaryotic host. Optionally, the N-terminal Met can then be cleaved from the expressed Hu-Asp polypeptide. Other N-terminal amino acid residues can be added to the Hu-Asp polypeptide to facilitate expression in Escherichia coli , which include, without limitation, the T7 leader sequence, the T7-caspase 8 leader sequence, as well as other leaders that include purification tags. such as the 6-His brand (Example 9). Hu-Asp polypeptides expressed in E. coli can be shortened by the removal of the cytoplasmic tail, the transmembrane domain or the region proximal to the membrane. Hu-Asp polypeptides expressed in E. coli can be obtained in soluble or insoluble form that may or may not be present as an inclusion body. The insoluble polypeptide can be made soluble by means of guanidine hydrochloride, urea or other protein denaturing agents, then folded back into a soluble form, before or after purification, by dilution or dialysis in an appropriate aqueous buffer. If the inactive proforma of Hu-Asp is produced with the use of recombinant procedures, it is possible to make it active by cleavage of the pro-segment with an appropriate second protease, such as the human immunodeficiency virus protease.

Los vectores de expresión para utilizar en huéspedes procarióticos comprenden por lo general uno o múltiples genes marcadores fenotípicos seleccionables. Estos genes codifican, por lo general, por ejemplo, una proteína que confiere resistencia a un antibiótico o que suministra un requisito auxotrófico. Hay actualmente disponible una amplia variedad de vectores de este tipo en fuentes comerciales. Los ejemplos incluyen vectores pSPORT, vectores pGEM (Promega), vectores pPROEX (L.TI, Bethesda, MD), vectores Bluescript (Stratagene), vectores pET (Novagen) y vectores pQE (Qiagen).Expression vectors to use in prokaryotic hosts usually comprise one or multiple selectable phenotypic marker genes. These genes encode, usually, for example, a protein that confers resistance to an antibiotic or that provides an auxotrophic requirement. There is currently available a wide variety of vectors of this type in commercial sources. Examples include pSPORT vectors, pGEM vectors (Promega), pPROEX vectors (L.TI, Bethesda, MD), Bluescript vectors (Stratagene), pET vectors (Novagen) and vectors pQE (Qiagen).

Hu-Asp se puede expresar también en células hospedadoras de levadura de géneros que incluyen Saccharomyces, Pichia y Kluveromyces. Huéspedes de levadura preferidos son S. cerevisiae y P. pasioris. Los vectores de levadura contendrán a menudo una secuencia de origen de replicación de un plásmido de levadura 2T, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción, y un gen marcador seleccionable. También se pueden usar vectores replicables tanto en levadura como en E. coli (denominados vectores versátiles). Además de las características mencionadas anteriormente de los vectores de levadura, un vector versátil incluirá también secuencias para la replicación y selección en E. coli. La secreción directa de polipéptidos Hu-Asp expresados en huéspedes de levadura se puede lograr por la inclusión de una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia líder para el factor I de levadura en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica Hu-Asp.Hu-Asp can also be expressed in yeast host cells of genera that include Saccharomyces , Pichia and Kluveromyces . Preferred yeast guests are S. cerevisiae and P. pasioris . Yeast vectors will often contain a sequence of origin of replication of a 2T yeast plasmid, an autonomous replication sequence (ARS), a promoter region, polyadenylation sequences, sequences for transcription termination, and a selectable marker gene . Replicable vectors can also be used in both yeast and E. coli (called versatile vectors). In addition to the above-mentioned characteristics of yeast vectors, a versatile vector will also include sequences for replication and selection in E. coli . Direct secretion of Hu-Asp polypeptides expressed in yeast hosts can be achieved by the inclusion of a nucleotide sequence encoding the leader sequence for yeast factor I at the 5 'end of the nucleotide sequence encoding Hu-Asp .

Asimismo, se pueden utilizar sistemas de cultivo de células hospedadoras de insecto para la expresión de los polipéptidos Hu-Asp. En una realización preferida, los polipéptidos Hu-Asp de la invención se expresan usando un sistema de expresión de célula de insecto (véase el Ejemplo 10). Adicionalmente, Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) estudiaron un sistema de expresión en Baculovirus para la expresión en células de insecto.Also, insect host cell culture systems can be used for the expression of Hu-Asp polypeptides. In a preferred embodiment, the Hu-Asp polypeptides of the invention are expressed using an insect cell expression system (see Example 10). Additionally, Luckow and Summers, Bio / Technology 6:47 (1988) studied a Baculovirus expression system for expression in insect cells.

En otra realización preferida, el polipéptido Hu-Asp se expresa en células hospedadoras de mamífero. Ejemplos no limitantes de líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen la línea COS7 de células renales de simio (Gluzman et al., Cell 23:175 (1981), la línea 293 de células renales embrionarias humanas, y las células de ovario del hámster chino (CHO). Preferentemente, se utilizan células de ovario del hámster chino (CHO) para la expresión de proteínas Hu-Asp.In another preferred embodiment, the Hu-Asp polypeptide is expressed in mammalian host cells. Non-limiting examples of suitable mammalian cell lines include the COS7 line of simian renal cells (Gluzman et al ., Cell 23: 175 (1981), the 293 line of human embryonic kidney cells, and the Chinese hamster ovary cells ( CHO) Preferably, Chinese hamster ovary (CHO) cells are used for the expression of Hu-Asp proteins.

Evidentemente, la elección de un vector de expresión adecuado para la expresión de los polipéptidos Hu-Asp según la invención dependerá de la célula hospedadora de mamífero específica que se use, lo que está dentro de las competencias de un experto en la técnica. Ejemplos de vectores de expresión apropiados incluyen pcDNA3 (Invitrogen) y pSVL (Pharmacia Biotech). Un vector preferido para la expresión de polipéptidos Hu-Asp es pcDNA3.1-Hygro (Invitrogen). Los vectores de expresión para utilizar en células hospedadoras de mamífero pueden incluir secuencias de control de transcripción y traducción derivadas de genomas virales. Las secuencias promotoras y potenciadoras usadas habitualmente, que se pueden usar en la presente invención, incluyen, pero sin estar limitadas a ellas, las derivadas del citomegalovirus (CMV) humano, Adenovirus 2, virus del polioma y el Papovirus-SV 40. Los procedimientos para la construcción de vectores de expresión de mamífero se describen, por ejemplo, en Okayama y Berg (Mol. Cell Biol. 3:280 (1983)); Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935 (1986)); Cosman et al. (Nature 312:768 (1984)); documentos EP-A-0367566, y WO 91/18982.Obviously, the choice of an expression vector suitable for the expression of the Hu-Asp polypeptides according to the invention will depend on the specific mammalian host cell used, which is within the competence of one skilled in the art. Examples of appropriate expression vectors include pcDNA3 (Invitrogen) and pSVL (Pharmacia Biotech). A preferred vector for the expression of Hu-Asp polypeptides is pcDNA3.1-Hygro (Invitrogen). Expression vectors for use in mammalian host cells may include transcription and translation control sequences derived from viral genomes. The commonly used promoter and enhancer sequences, which can be used in the present invention, include, but are not limited to, those derived from human cytomegalovirus (CMV), Adenovirus 2, polyoma virus and Papovirus-SV 40. The methods for the construction of mammalian expression vectors they are described, for example, in Okayama and Berg ( Mol. Cell Biol . 3: 280 (1983)); Cosman et al . ( Mol. Immunol . 23: 935 (1986)); Cosman et al . ( Nature 312: 768 (1984)); EP-A-0367566, and WO 91/18982.

Una vez descrita la invención de forma general, ésta se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los ejemplos siguientes, que se ofrecen a modo de ilustración y no pretenden imponer limitaciones.Once the invention has been described in general, this will be more easily understood by referring to the examples following, offered by way of illustration and not intended impose limitations

Ejemplo 1Example 1 Desarrollo de un Algoritmo de Búsqueda de Utilidad para la Identificación de Aspartil Proteasas, e Identificación de los Genes de Aspartil Proteasa de C. elegans en Wormpep 12Development of a Utility Search Algorithm for the Identification of Aspartyl Proteases, and Identification of Aspartyl Protease Genes from C. elegans in Wormpep 12 Materiales y ProcedimientosMaterials and Procedures

Las aspartil proteasas clásicas tales como pepsina y renina poseen una estructura de dos dominios que se pliega para aproximar dos residuos aspartilo dentro del sitio activo. Éstos se incluyen en el patrón tripeptídico corto DTG o más raramente, DSG. El patrón del sitio activo DTG o DSG aparece aproximadamente en el residuo 25-30 en la enzima, pero aproximadamente a 65-70 en la proenzima (pro-renina, pepsinógeno). Este patrón aparece nuevamente aproximadamente 150-200 residuos corriente abajo. La proenzima se activa por la escisión del pro-dominio N-terminal. Este patrón pone de manifiesto la estructura de doble dominio de las enzimas aspartil actuales que surgió, aparentemente, por duplicación y divergencia de genes. Por lo tanto;Classic aspartyl proteases such as Pepsin and Renin have a two domain structure that folds  to approximate two aspartyl residues within the active site. These are included in the short tripeptide pattern DTG or more rarely, DSG. The DTG or DSG active site pattern appears approximately in residue 25-30 in the enzyme, but about 65-70 in the proenzyme (pro-renin, pepsinogen). This pattern appears. again approximately 150-200 waste downstream. Proenzyme is activated by excision of the N-terminal pro-domain. This pattern highlights the double domain structure of enzymes current aspartile that arose, apparently, by duplication and gene divergence Thus;

1one

en donde X significa el inicio de la enzima, después del pro-dominio N-terminal, e Y representa el centro de la molécula, en donde se inicia nuevamente la repetición del gen.where X means the beginning of the enzyme, after the pro-domain N-terminal, and Y represents the center of the molecule, where the repetition of the gen.

En el caso de enzimas retrovirales tal como la proteasa de VIH, representan solamente una mitad de las estructuras de dos dominios de enzimas bien conocidas tales como pepsina, catepsina D, renina, etc. Carecen de pro-segmento, y se moldean a partir de un precursor de poliproteínas que contiene las proteínas gag y pol del virus. Se les puede representar con:In the case of retroviral enzymes such as HIV protease, they represent only one half of the structures of two well-known enzyme domains such as pepsin, cathepsin D, renin, etc. They lack pro-segment, and they are molded from a polyprotein precursor that contains the gag and pol virus proteins. They can be represented with:

22

Este "monómero" tiene sólo aproximadamente 100 aa, por lo que es extremadamente ahorrador en comparación con los restantes "dímeros" de aspartil proteasas, que tienen del orden de aproximadamente 300 aa, sin contar el pro-dominio N-terminal.This "monomer" has only about 100 aa, so it is extremely economical compared to the remaining "dimers" of aspartyl proteases, which have the order of approximately 300 aa, not counting the N-terminal pro-domain.

La longitud limitada del patrón del sitio activo de la aspartil proteasa eucariótica dificulta la investigación de colecciones de EST en busca de nuevas secuencias. Las secuencias EST tienen en promedio, típicamente, 250 nucleótidos y, por lo tanto, en este caso, sería improbable extender los dos patrones de sitios activos de aspartil proteasa. En lugar de ello, los presentes inventores dirigieron su atención al genoma de C. elegans. Se calcula que el genoma de C. elegans contiene alrededor de 13.000 genes. De ellos, se han secuenciado escasamente 12.000 y el correspondiente marco de lectura abierto (ORF) hipotético se ha incluido en la base de datos Wormpep 12. Los inventores utilizaron esta base de datos como base para un barrido total del genoma de un eucariota superior en busca de nuevas aspartil proteasas, usando un algoritmo desarrollado específicamente con este propósito por los inventores. En la búsqueda, se utilizó el siguiente script AWK para localizar proteínas que contienen dos patrones DTG o DSG, que se repitió cuatro veces para recuperar todas las combinaciones que forman pares del patrón aspartilo.The limited length of the pattern of the active site of eukaryotic aspartyl protease makes it difficult to investigate collections of ESTs in search of new sequences. EST sequences typically average 250 nucleotides and, therefore, in this case, it would be unlikely to extend the two patterns of active aspartyl protease sites. Instead, the present inventors turned their attention to the genome of C. elegans . The genome of C. elegans is estimated to contain about 13,000 genes. Of these, 12,000 have been sparsely sequenced and the corresponding hypothetical open reading frame (ORF) has been included in the Wormpep 12 database. The inventors used this database as the basis for a total genome scan of a higher eukaryotic in Search for new aspartyl proteases, using an algorithm developed specifically for this purpose by the inventors. In the search, the following AWK script was used to locate proteins containing two DTG or DSG patterns, which was repeated four times to retrieve all combinations that form pairs of the aspartyl pattern.

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El script AWK que se muestra más arriba se utilizó para buscar en Wormpep12, que se descargó de ftp.sanger.ac.uk/
pub/databases/wormpep para estradas de secuencia que contienen al menos dos patrones DTG o DSG. El uso de AWK limitó cada registro a 3000 caracteres o menos. De esta forma, se eliminaron de Wormpep12 manualmente alrededor de 35 registros de mayor tamaño, ya que, en cualquier caso, era improbable que codificaran aspartil proteasas.The AWK script shown above was used to search Wormpep12, which was downloaded from ftp.sanger.ac.uk/
pub / databases / wormpep for sequence runs that contain at least two DTG or DSG patterns. The use of AWK limited each record to 3000 characters or less. In this way, about 35 larger records were manually removed from Wormpep12, since, in any case, it was unlikely that they encoded aspartyl proteases.

Resultados y DiscusiónResults and Discussion

La base de datos Wormpep12 contiene 12.178 entradas, aunque algunas de ellas (<10%) representan transcriptos empalmados de forma alternativa del mismo gen. Las estimaciones del número de genes codificados en el genoma de C. elegans son del orden de 13.000 genes, de modo que se puede considerar que Wormpep12 abarca más de 90% del genoma de C. elegans.The Wormpep12 database contains 12,178 entries, although some of them (<10%) represent spliced transcripts alternately of the same gene. Estimates of the number of genes encoded in the C. elegans genome are of the order of 13,000 genes, so that Wormpep12 can be considered to cover more than 90% of the C. elegans genome.

Las aspartil proteasas eucarióticas contienen una estructura de dos dominios, que surge probablemente de la duplicación de genes ancestrales. cada dominio contiene el patrón del sitio activo D(S/T)G localizado a partir de 20-25 residuos de aminoácidos en cada dominio. Las proteasas retrovirales (por ejemplo, VIH-proteasa) o las retrotransposón-proteasas son homodímeros de subunidades que son homólogas con respecto a un único dominio de aspartil proteasa eucariótica. Se utilizó un script AWK para buscar en la base de datos Wormpep12 proteínas en las que el patrón D(S/T)G estuviera presente al menos dos veces. Se identificaron >60 proteínas con dos patrones DTG o DSG. Se empleó la inspección visual para seleccionar proteínas en las que la posición de los dominios aspartilo permitiera sugerir la presencia de una estructura de dos dominios capaz de satisfacer los criterios descritos anteriormente.Eukaryotic aspartyl proteases contain a two-domain structure, which probably arises from the duplication of ancestral genes. each domain contains the pattern of the active site D (S / T) G located from 20-25 amino acid residues in each domain. The retroviral proteases (for example, HIV protease) or  retrotransposon proteases are homodimers of subunits that are homologous with respect to a single domain of aspartyl eukaryotic protease. An AWK script was used to search in the Wormpep12 protein database in which the pattern D (S / T) G was present at least twice. Be identified> 60 proteins with two DTG or DSG patterns. Be used visual inspection to select proteins in which the position of the aspartyl domains would suggest the presence of a two domain structure capable of satisfying the criteria described above.

Adicionalmente, se usó el patrón de sitios activos de aspartil proteasas eucarióticas y virales PROSITE, PS00141, para buscar en Wormpep12 aspartil proteasas candidatas. (Bairoch A., Bucher P., Hofmann K., The PROSITE database: its status in 1997, Nucleic Acids Res. 24:217-221 (1997)). Se generó de este modo un conjunto de secuencias de Wormpep12 solapado sobre el anterior. De éstas, siete secuencias contuvieron dos patrones DTG o DSG y el patrón de sitio activo de aspartil proteasa PROSITE. De estas siete, tres se encontraron en el mismo clon cosmídico (F21F8.3, F21F8.4 y F21F8.7), lo que sugiere que representan una familia de proteínas surgida por duplicación de genes ancestrales. Los otros dos ORFs con extensa homología con respecto a F21F8.3, F21F8.4 y F21F8.7 se hallan presentes en el mismo clúster génico (F21F8.2 y F21F8.6) que, sin embargo, contienen solamente un único patrón DTG. Exhaustivas investigaciones BLAST con estas siete secuencias con respecto a Wormpep12 no pusieron de manifiesto aspartil proteasas candidatas adicionales en el genoma de C. elegans que contiene dos repeticiones del patrón DTG o DSG.Additionally, the pattern of active aspartyl protease and viral PROSITE, PS00141, aspartyl proteases sites was used to search candidate Wormpep12 aspartyl proteases. (Bairoch A., Bucher P., Hofmann K., The PROSITE database: its status in 1997, Nucleic Acids Res . 24: 217-221 (1997)). A set of overlapping Wormpep12 sequences was generated in this way over the previous one. Of these, seven sequences contained two DTG or DSG patterns and the active site pattern of aspartyl protease PROSITE. Of these seven, three were found in the same cosmid clone (F21F8.3, F21F8.4 and F21F8.7), suggesting that they represent a family of proteins arising from duplication of ancestral genes. The other two ORFs with extensive homology with respect to F21F8.3, F21F8.4 and F21F8.7 are present in the same gene cluster (F21F8.2 and F21F8.6) which, however, contain only a single DTG pattern. Thorough BLAST investigations with these seven sequences with respect to Wormpep12 did not reveal additional candidate aspartyl proteases in the genome of C. elegans that contains two repeats of the DTG or DSG pattern.

La búsqueda con BLASTX con cada secuencia de C. elegans con respecto a SWISS-PROT, GenPep y TREMBL demostró que R12H7.2 fue el homólogo "worm" (gusano) más próximo a las aspartil proteasas de mamífero conocidas, y que T18H9.2 estuvo relacionada de forma algo más lejana, mientras que CEASP1, F21F8.4 y F21F8.7 formaron un sub-clúster que tuvo la menor homología de secuencia con las secuencias de mamífero.The BLASTX search with each sequence of C. elegans with respect to SWISS-PROT, GenPep and TREMBL showed that R12H7.2 was the homolog " worm " ( worm ) closest to the known mammalian aspartyl proteases, and that T18H9.2 It was related somewhat further, while CEASP1, F21F8.4 and F21F8.7 formed a sub-cluster that had the lowest sequence homology with mammalian sequences.

Discusión Discussion

APP, las presenilinas y p35, el activador de cdk5 sufren un procesamiento proteolítico intracelular en los sitios que se adaptan a la especificidad de sustrato de la VIH-proteasa. La disregulación de una aspartil proteasa celular con la misma especificidad de sustrato podría proporcionar, por tanto, un mecanismo de unificación para el origen de las patologías en placa y de enredo de la EA. Por consiguiente, los presentes inventores intentaron identificar nuevas aspartil proteasas humanas. El barrido de todo el genoma de C. elegans identificó siete marcos de lectura abiertos que se adhieren al perfil de aspartil proteasa que habían identificado estos inventores. Estas siete aspartil proteasas comprenden probablemente el complemento completo de tales proteasas en un eucariota multicelular único. Incluyen cuatro aspartil proteasas estrechamente relacionadas, exclusivas para C. elegans, que surgieron probablemente por la duplicación de un gen ancestral. Las otras tres aspartil proteasas candidatas (T18H9.2, R12H7.2 y C11D2.2) demostraron exhibir homología con respecto a las secuencias génicas de mamífero.APP, presenilins and p35, the cdk5 activator undergo intracellular proteolytic processing at sites that adapt to the substrate specificity of HIV protease. Disregulation of a cellular aspartyl protease with the same substrate specificity could therefore provide a unifying mechanism for the origin of plaque and entanglement pathologies of AD. Accordingly, the present inventors attempted to identify new human aspartyl proteases. The scanning of the entire genome of C. elegans identified seven open reading frames that adhere to the aspartyl protease profile identified by these inventors. These seven aspartyl proteases probably comprise the complete complement of such proteases in a single multicellular eukaryotic. They include four closely related aspartyl proteases, exclusive to C. elegans , which probably arose from duplication of an ancestral gene. The other three candidate aspartyl proteases (T18H9.2, R12H7.2 and C11D2.2) were shown to exhibit homology with respect to mammalian gene sequences.

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Ejemplo 2Example 2 Identificación de Nuevas Aspartil Proteasas Humanas Usando Extracciones de Bases de Datos por Puenteo de GenomaIdentification of New Aspartyl Human Proteases Using Database Extractions by Genome Bypass Materiales y ProcedimientosMaterials and Procedures

Análisis computadorizado de bases de datos EST, ADNc y secuencias polipeptídicas previstas:Computerized analysis of EST databases, CDNA and polypeptide sequences provided:

Las exhaustivas búsquedas de homología de las bases de datos EST con las secuencias CEASP1, F21F8.3, F21F8.4 y F21F8.7 no revelaron ningún nuevo homólogo de mamífero. Las búsquedas TBLASTN con R12H7.2 mostraron homología con la catepsina D, catepsina E, pepsinógeno A, pepsinógeno C y renina, especialmente alrededor del patrón DTG dentro del sitio activo, pero tampoco lograron identificar nuevas aspartil proteasas adicionales de mamífero. Estos indica que el genoma de C. elegans contiene probablemente sólo una única aspartil proteasa que, en el mamífero, está representada por una familia de genes que surgió por la duplicación y subsiguiente modificaciones de un gen ancestral.The exhaustive homology searches of EST databases with the sequences CEASP1, F21F8.3, F21F8.4 and F21F8.7 did not reveal any new mammalian homologs. TBLASTN searches with R12H7.2 showed homology with cathepsin D, cathepsin E, pepsinogen A, pepsinogen C and renin, especially around the DTG pattern within the active site, but also failed to identify new additional mammalian aspartyl proteases. These indicate that the C. elegans genome probably contains only a single aspartyl protease that, in the mammal, is represented by a family of genes that arose from duplication and subsequent modifications of an ancestral gene.

Las búsquedas de TBLASTN con T18H9.2, la secuencia remanente de C. elegans, identificaron diversas ESTs que se ensamblaron en un contig que codifica una nueva aspartil proteasa humana (Hu-Asp1). Tal como se ha descrito en el anterior Ejemplo 1, la búsqueda BLASTX con el contig de Hu-Asp1 con respecto a SWISS-PROT reveló que los patrones del sitio activo en la secuencia se alinean con los sitios activos de otras aspartil proteasas. Ciclos repetidos y exhaustivos de búsquedas BLASTN con respecto a LifeSeq, LifeSeqFL y las colecciones públicas EST identificaron 102 ESTs de múltiples bibliotecas de ADNc que se ensamblaron en un único contig. El Institute for Genome Research (TIGR) ensambló las 51 secuencias de este contig hallado en colecciones de EST públicas también en un único contig (THC213329). La anotación de TIGR indica que no lograron hallar en la base de datos ningún indicio para el contig. Obsérvese que el contig TIGR es el complemento inverso del contig de LifeSeq ensamblado por los presentes inventores. La búsqueda BLAST de Hu-Asp1 con respecto a las secuencias EST de rata y ratón en ZooSeq puso de manifiesto una EST homóloga en cada base de datos (clon Incyte 700311523 y clon IMAGE 313341, número de acceso a GenBank W10530, respectivamente).TBLASTN searches with T18H9.2, the remaining sequence of C. elegans , identified several ESTs that were assembled in a contig encoding a new human aspartyl protease (Hu-Asp1). As described in the previous Example 1, the BLASTX search with the contour of Hu-Asp1 with respect to SWISS-PROT revealed that the patterns of the active site in the sequence are aligned with the active sites of other aspartyl proteases. Repeated and comprehensive BLASTN search cycles with respect to LifeSeq, LifeSeqFL and public EST collections identified 102 ESTs from multiple cDNA libraries that were assembled into a single contig. The Institute for Genome Research (TIGR) assembled the 51 sequences of this contig found in public EST collections also in a single contig (THC213329). The annotation of TIGR indicates that they failed to find in the database any clue to the contig. Note that the TIGR contig is the inverse complement of the LifeSeq contig assembled by the present inventors. The BLAST search of Hu-Asp1 with respect to the rat and mouse EST sequences in ZooSeq revealed a homologous EST in each database (clone Incyte 700311523 and clone IMAGE 313341, GenBank accession number W10530, respectively).

Las búsquedas TBLASTN con la secuencia de ADN ensamblada para Hu-Asp1 con respecto a tanto LifeSeqFL como las bases de datos públicas EST identificaron una segunda secuencia humana relacionada (Hu-Asp2), representada por una única EST (2696295). La traducción de esta secuencia parcial de ADNc revela un único patrón DTG que muestra homología en relación con el patrón del sitio activo de una aspartil proteasa bovina, NM1.TBLASTN searches with the DNA sequence assembled for Hu-Asp1 regarding both LifeSeqFL as the EST public databases identified a second related human sequence (Hu-Asp2), represented by a single EST (2696295). The translation of this partial cDNA sequence reveals a single DTG pattern that shows homology in relation to the pattern of the active site of an aspartil bovine protease, NM1.

Las búsquedas BLAST, ensamblajes de contig y alineaciones de múltiples contigs se llevaron a cabo usando las herramientas de bio-informática que se suministran con las bases de datos LifeSeq, LifeSeqFL y LifeSeq Assembled de Incyte. Los patrones de proteínas previstas se identificaron usando el diccionario ProSite (Motifs in GCG 9) o la base de datos Pfam.BLAST searches, contig assemblies and multiple contig alignments were carried out using the bio-computing tools that are supplied with the LifeSeq, LifeSeqFL and LifeSeq Assembled databases of Incyte The expected protein patterns were identified using the ProSite dictionary (Motifs in GCG 9) or the database Pfam

Clonación de ADNc completos de Hu-Asp1Complete cDNA cloning of Hu-Asp1

Se utilizó el marco de lectura abierto del gen T18H9.2CE de C. elegans para investigar las bases de datos de Incyte LifeSeq y LifeSeq-FL, y se detectó un ensamblaje electrónico único designado como 1863920CE1. El clon de ADNc más 5' en este contig, 1863920, se obtuvo de Incyte y se secuenció por completo en sus dos cadenas. La traducción del marco de lectura abierta contenido en el interior del clon 1863920 reveló la presencia del patrón duplicado del sitio activo de aspartil proteasa (DTG/DSG), pero el extremo 5' estuvo incompleto. El resto de la secuencia codificadora de Hu-Asp1 se determinó por análisis 5' Marathon RACE usando un modelo de ADNc preparado de placenta humana Marathon (Clontech). Se apareó un cebador de oligonucleótido 3'-antisentido, específico para el extremo 5' del clon 1863920 con el cebador 5'-sentido específico para el adaptador sintético para ADNc preparado de Marathon en la PCR. Los productos específicos de PCR se secuenciaron directamente por secuenciación de ciclos y la secuencia resultante se ensambló con la secuencia del clon 1863920 para dar la secuencia codificadora completa de Hu-Asp1 (SEQ ID NO:1).The open reading frame of the T18H9.2CE gene from C. elegans was used to investigate the Incyte LifeSeq and LifeSeq-FL databases, and a unique electronic assembly designated as 1863920CE1 was detected. The cDNA clone plus 5 'in this contig, 1863920, was obtained from Incyte and completely sequenced in its two chains. Translation of the open reading frame contained within clone 1863920 revealed the presence of the duplicated pattern of the active aspartyl protease site (DTG / DSG), but the 5 'end was incomplete. The rest of the Hu-Asp1 coding sequence was determined by 5 'Marathon RACE analysis using a cDNA model prepared from human Marathon placenta (Clontech). A 3'-antisense oligonucleotide primer, specific for the 5 'end of clone 1863920, was paired with the 5'-sense primer specific for the synthetic adapter for Marathon cDNA prepared in the PCR. The specific PCR products were sequenced directly by cycle sequencing and the resulting sequence was assembled with the sequence of clone 1863920 to give the complete coding sequence of Hu-Asp1 (SEQ ID NO: 1).

En la secuencia de aminoácidos primaria de Hu-Asp1 (Figura 1, SEQ ID NO:2) están presentes diversas características interesantes. La secuencia contiene un péptido señalizador (residuos 1-20 en SEQ ID NO:2), un pro-segmento, y un dominio catalítico que contiene dos copias del patrón del sitio activo de aspartil proteasa (DTG/DSG). El espacio existente entre el primer y segundo patrones de sitio activo es de aproximadamente 200 residuos, lo que debería corresponder al tamaño esperado de un único dominio de aspartil proteasa eucariótica. Más interesante aún resulta el hecho de que la secuencia contiene un dominio trans-membrana predicho (residuos 469-492 en SEQ ILL NO:2) próximo a su extremo C, lo que indica que la proteasa está unida a la membrana. Esta característica no se encuentra en ninguna otra aspartil proteasa.In the primary amino acid sequence of Hu-Asp1 (Figure 1, SEQ ID NO: 2) are present Various interesting features. The sequence contains a signal peptide (residues 1-20 in SEQ ID NO: 2), a pro-segment, and a catalytic domain that contains two copies of the aspartyl protease active site pattern (DTG / DSG). The space between the first and second patterns Active site is about 200 residues, which should correspond to the expected size of a single aspartil domain eukaryotic protease Even more interesting is the fact that the sequence contains a trans-membrane domain predicted (residues 469-492 in SEQ ILL NO: 2) next at its C-terminus, which indicates that the protease is bound to the membrane. This feature is not found in any other aspartyl protease

Clonación de ADNc completos de Hu-Asp-2Complete cDNA cloning of Hu-Asp-2

Tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, el barrido amplio del genoma de la base de datos WormPep12 de Caenorhabditis elegans en busca de aspartil proteasas putativas y la subsiguiente extracción de bases de datos EST humanas reveló un ortólogo humano para el gen T18H9.2 de C. elegans, designado como Hu-Asp1. Se utilizó el contig ensamblado de Hu-Asp1 para investigar parálogos humanos usando la herramienta de búsqueda BLAST en bases de datos EST humanas, y se encontró una única coincidencia significativa (2696295CE1) con una identidad compartida de aproximadamente 60% en la base de datos LifeSeqFL. Búsquedas similares de gb105PubEST o la familia de bases de datos humanas disponibles de TIGR no lograron identificar clones de EST similares. El clon 2696295, identificado por el análisis de secuencia de un solo pasaje de la biblioteca de ADNc del útero humano, se obtuvo de Incyte y se secuenció por completo en sus dos cadenas. Este clon contuvo un marco de lectura abierta incompleto de 1266 pb que codificó un polipéptido de 422 aminoácidos, pero que careció de un iniciador ATG en el extremo 5'. La inspección de la secuencia predicha puso de manifiesto la presencia del patrón del sitio activo de aspartil proteasa DTG/DSG duplicado, separados por 194 residuos de aminoácidos. Posteriores investigaciones de las últimas versiones de la base de datos EST LifeSeq identificaron una ESTs adicional, secuenciada a partir de la biblioteca de ADNc del astrocito humano (4386993), que pareció contener una secuencia 5' adicional en relación con el clon 2696295. Se obtuvo el clon 4386993 de Incyte y se secuenció por completo en sus dos cadenas. Los análisis comparativos del clon 4386993 y del clon 2696295 confirmaron que el clon 4386993 amplió el marco de lectura abierta en 31 residuos de aminoácidos, incluidos dos codones de iniciación de la traducción dentro del marco. A pesar de la presencia de los dos ATGs dentro del marco, no se observó ningún codón de detención dentro del marco corriente arriba del ATG, lo que indica que el 4386993 puede no tener su longitud completa. Adicionalmente, la alineación de secuencias de los clones 2696295 y 386993 reveló una inserción de 75 pares de bases en el clon 2696295 con respecto al clon 4386993, que tiene como resultado la inserción de 25 residuos aminoácidos adicionales en 2696295. El resto de la secuencia codificadora de Hu-Asp2 se determinó por análisis 5' Marathon RACE usando un análisis humano.As described above in Example 1, wide scanning of the genome of the WormPep12 database of Caenorhabditis elegans in search of putative aspartyl proteases and the subsequent extraction of human EST databases revealed a human ortholog for the T18H9 gene. 2 of C. elegans , designated as Hu-Asp1. The contig assembly of Hu-Asp1 was used to investigate human paralogs using the BLAST search tool in human EST databases, and a single significant match (2696295CE1) with a shared identity of approximately 60% was found in the LifeSeqFL database . Similar searches of gb105PubEST or the family of human databases available from TIGR failed to identify similar EST clones. Clone 2696295, identified by the single-passage sequence analysis of the human uterus cDNA library, was obtained from Incyte and completely sequenced in its two chains. This clone contained an incomplete open reading frame of 1266 bp that encoded a 422 amino acid polypeptide, but lacked an ATG initiator at the 5 'end. Inspection of the predicted sequence revealed the presence of the duplicated aspartyl protease DTG / DSG active site pattern, separated by 194 amino acid residues. Further investigations of the latest versions of the EST LifeSeq database identified an additional ESTs, sequenced from the human astrocyte cDNA library (4386993), which appeared to contain an additional 5 'sequence in relation to clone 2696295. clone 4386993 of Incyte and was completely sequenced in its two chains. Comparative analyzes of clone 4386993 and clone 2696295 confirmed that clone 4386993 extended the open reading frame by 31 amino acid residues, including two translation initiation codons within the framework. Despite the presence of the two ATGs within the frame, no stop codon was observed within the upstream frame of the ATG, indicating that 4386993 may not have its full length. Additionally, sequence alignment of clones 2696295 and 386993 revealed an insertion of 75 base pairs in clone 2696295 with respect to clone 4386993, which results in the insertion of 25 additional amino acid residues in 2696295. The rest of the coding sequence of Hu-Asp2 was determined by 5 'Marathon RACE analysis using a human analysis.

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Ejemplo 3Example 3 Detección por Transferencia de Northern de Transcriptos de Hu-Asp1 en Líneas Celulares HumanasNorthern Transfer Detection of Transcripts Hu-Asp1 in Human Cell Lines

Se analizó la capacidad de diversas líneas celulares humanas para producir ARNm de Hu-Asp1 y Asp2. Se obtuvieron de la ATCC células renales embrionarias humanas (HEK-293), células del mono verde africano (Cos-7), células de ovario del hámster chino (CHO), células HELA y la línea celular de neuroblastoma IMR-32. Las células se cultivaron en DME que contuvo SFB (suero fetal bovino) al 10%, excepto las células CHO, que se mantuvieron en \alpha-MEM/10% de SFB a 37ºC en CO_{2} al 5% hasta que se aproximaron a la confluencia. Las monocapas lavadas de células (3 x 10^{7}) se lisaron en las placas y se extrajo ARN A^{+} usando el kit de ARNm Oligotex Direct de Qiagen. Bajo condiciones de desnaturalización (tratamiento con glioxal), se fraccionaron las muestras que contuvieron 2 \mug de ARN poli-A^{+} de cada línea celular, se transfirieron a un soporte de membrana de nailon sólido por acción capilar, y se visualizaron los transcriptos por hibridación con sondas de secuencia codificadora marcadas con cebadores aleatorios (^{32}P) derivadas de Hu-Asp1 o Hu-Asp2. Las señales radioactivas se detectaron por exposición a una película de rayos X y por análisis de imagen con un PhosphorImager.The ability of various human cell lines to produce Hu-Asp1 and Asp2 mRNA was analyzed. Human embryonic kidney cells (HEK-293), African green monkey cells (Cos-7), Chinese hamster ovary (CHO) cells, HELA cells and the IMR-32 neuroblastoma cell line were obtained from the ATCC. Cells were cultured in DME containing 10% SFB (fetal bovine serum), except CHO cells, which were maintained in α-MEM / 10% SFB at 37 ° C in 5% CO 2 until they approached to the confluence. The washed cell monolayers (3 x 10 7) were lysed on the plates and A + RNA was extracted using the Qiagen Oligotex Direct mRNA kit. Under denaturing conditions (glyoxal treatment), samples containing 2 µg of poly-A + RNA from each cell line were fractionated, transferred to a solid nylon membrane support by capillary action, and visualized transcripts by hybridization with coding sequence probes labeled with random primers (32 P) derived from Hu-Asp1 or Hu-Asp2. Radioactive signals were detected by exposure to an X-ray film and by image analysis with a PhosphorImager .

La sonda de ADN de Hu-Asp1 visualizó una constelación similar de transcriptos (2,6 kb y 3,5 kb) que se detectaron previamente en tejidos humanos. La abundancia relativa, determinada por cuantificación de la señal radioactiva, fue Cos-7 > HEK-292 = HELA > IMR32.The Hu-Asp1 DNA probe visualized a similar constellation of transcripts (2.6 kb and 3.5 kb) which were previously detected in human tissues. Abundance relative, determined by quantification of the radioactive signal, it was Cos-7> HEK-292 = HELA> IMR32.

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Ejemplo 4Example 4 Modificación de APP para Incrementar el Procesamiento de A\beta para el Rastreo In Vitro APP Modification to Increase A? Processing for In Vitro Tracking

Las líneas celulares humanas que procesan el péptido A\beta de APP ofrecen un medio para rastrear en ensayos celulares inhibidores de \beta- y \gamma-secretasa. La producción y liberación del péptido A\beta en el sobrenadante del cultivo se monitoriza por un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (EIA). Aunque la expresión de APP está ampliamente extendida y las líneas celulares tanto neurales como no neurales procesan y liberan el péptido A\beta, los niveles de procesamiento de APP endógena son bajos y difíciles de detectar por EIA. Es posible incrementar el procesamiento por A\beta expresando en líneas celulares transformadas mutaciones de APP que potencian el procesamiento por A\beta. Los presentes inventores llevaron a cabo la observación fortuita de que la adición de dos residuos lisina al extremo carbonilo de APP695 aumenta todavía más el procesamiento por A\beta. Esto les permitió crear una línea celular transformada que libera péptido A\beta al medio de cultivo a un nivel destacable de 20.000 pg/ml.The human cell lines that process the APP A? peptide offer a means to track in assays β- and cell inhibitors γ-secretase. The production and release of Aβ peptide in the culture supernatant is monitored by an enzyme-linked immunosorbent assay (EIA). Although the APP expression is widely spread and cell lines both neural and non-neural process and release the peptide At β, endogenous APP processing levels are low and difficult to detect by EIA. It is possible to increase the Aβ processing expressing in cell lines transformed APP mutations that enhance processing by A? The present inventors carried out the observation fortuitous that the addition of two lysine residues to the end APP695 carbonyl further increases the processing by A? This allowed them to create a transformed cell line that releases Aβ peptide to the culture medium at a remarkable level 20,000 pg / ml.

Materiales y ProcedimientosMaterials and Procedures Materiales materials

De forma interna, se obtuvo la línea de células renales embrionarias humanas 293 (células HEK293). El vector pIRES-EGFP se adquirió en Clontech. Los oligonucleótidos para mutación usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se adquirieron en Genosys. La Facultad de Medicina de la Universidad Northwestern proporcionó un plásmido que contiene APP695 humano (SEQ ID NO:9 [nucleótido] y SEQ ID NO:10 [aminoácido]), que se sub-clonó en pSK (Stratagene) en el sitio NotI, generando el plásmido pAPP695.Internally, the human embryonic renal cell line 293 (HEK293 cells) was obtained. The pIRES-EGFP vector was purchased from Clontech. Oligonucleotides for mutation using polymerase chain reaction (PCR) were purchased from Genosys. The Northwestern University School of Medicine provided a plasmid containing human APP695 (SEQ ID NO: 9 [nucleotide] and SEQ ID NO: 10 [amino acid]), which was sub-cloned into pSK (Stratagene) at the Not I site , generating plasmid pAPP695.

Protocolo de mutagénesisMutagenesis Protocol

En pAPP695 se introdujo la mutación sueca (K670N, M671L) utilizando el Kit de Stratagene Quick Change Mutagenesis para crear el plásmido pAPP695NL (SEQ ID NO:11 [nucleótido] y SEQ ID NO:12 [aminoácido]). Para introducir un patrón di-lisina en el extremo C de APP695, se usó el cebador forward nº 276 5' GACTGACCACTC
GACCAGGTTC (SEQ ID NO:47) con el cebador "de parche" nº 274 5' CGAATTAAATTCCAGCACACTGGC
TACTTCTTGTTCTGCATCTCAAAGAAC (SEQ ID NO:48), y el cebador flanqueante nº 275 CGAATTAAATTC
CAGCACACTGGCTA (SEQ ID NO: 49), para modificar el extremo 3' del ADNc de APP695 (SEQ ID NO:15 [nucleótido] y SEQ ID NO:16 [aminoácido]). Esto agregó también un sitio de restricción BstX 1 que será compatible con el sitio BstX 1 en el sitio de clonación múltiple de pIRES-EGFP. La amplificación por PCR se llevó a cabo con el kit de PCR HF Advantage cDNA de Clontech, usando la mezcla de polimerasa y los tampones suministrados por el fabricante. Para la PCR "de parche", se usó el cebador de parche a una vigésima parte de la concentración molar de los cebadores flanqueantes. Los productos de amplificación por PCR se purificaron usando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen). Tras la digestión con enzimas de restricción, se separaron los productos sobre geles de agarosa al 0,8% y, a continuación, los fragmentos de ADN escindidos se purificaron usando un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen).In pAPP695 the Swedish mutation (K670N, M671L) was introduced using the Stratagene Quick Change Mutagenesis Kit to create plasmid pAPP695NL (SEQ ID NO: 11 [nucleotide] and SEQ ID NO: 12 [amino acid]). To introduce a di-lysine pattern at the C-terminus of APP695, forward primer No. 276 5 'GACTGACCACTC was used
GACCAGGTTC (SEQ ID NO: 47) with "patch" primer No. 274 5 'CGAATTAAATTCCAGCACACTGGC
TACTTCTTGTTCTGCATCTCAAAGAAC (SEQ ID NO: 48), and flanking primer No. 275 CGAATTAAATTC
CAGCACACTGGCTA (SEQ ID NO: 49), to modify the 3 'end of the APP695 cDNA (SEQ ID NO: 15 [nucleotide] and SEQ ID NO: 16 [amino acid]). This also added a BstX 1 restriction site that will be compatible with the BstX 1 site at the multiple cloning site of pIRES-EGFP. PCR amplification was carried out with the Clontech HF Advantage cDNA PCR kit, using the polymerase mixture and buffers supplied by the manufacturer. For the "patch" PCR, the patch primer was used at one twentieth of the molar concentration of the flanking primers. The PCR amplification products were purified using the QIAquick PCR purification kit (Qiagen). After digestion with restriction enzymes, the products were separated on 0.8% agarose gels and then the cleaved DNA fragments were purified using a QIAquick gel extraction kit (Qiagen).

Para volver a ensamblar un ADNc modificado de APP695-Sw, el fragmento 5' NotI-BgI2 del ADNc de APP695-Sw y el fragmento de ADNc 3' BgI2-BstX 1 de APP695 obtenidos por PCR, se ligaron en el ADN del plásmido pIRES-EGFP abierto en los sitios NotI y BstX 1. Las ligaduras se llevaron a cabo durante 5 minutos a temperatura ambiente, empleando un kit Rapid DNA Ligation (Boehringer Mannheim) y se transformaron en Células Library Efficiency DH5a Competent (GibcoBRL, Life Technologies). Se rastrearon las colonias bacterianas en busca de insertos por amplificación por PCR, usando los cebadores nº 276 y 275. El ADN plasmídico se purificó para la transfección de células de mamífero usando el kit QIAprep Spin Minprep (Qiagen). La construcción obtenida se designó pMG125.3 (APPSW-KK, SEQ ID NO: 17 [nucleótido] y SEQ ID NO:18 [aminoácido]).To reassemble a modified cDNA from APP695-Sw, the 5 'NotI-BgI2 fragment of APP695-Sw cDNA and 3 'cDNA fragment BgI2-BstX 1 of APP695 obtained by PCR, were ligated in the DNA of plasmid pIRES-EGFP open in the NotI and BstX sites 1. Ligatures were carried out for 5 minutes at room temperature, using a Rapid DNA Ligation kit (Boehringer Mannheim) and transformed into Library Cells Efficiency DH5a Competent (GibcoBRL, Life Technologies). Be they tracked the bacterial colonies for inserts by PCR amplification, using primers # 276 and 275. DNA Plasmid was purified for transfection of mammalian cells using the QIAprep Spin Minprep kit (Qiagen). Construction obtained was designated pMG125.3 (APPSW-KK, SEQ ID NO: 17 [nucleotide] and SEQ ID NO: 18 [amino acid]).

Transfección de Células de MamíferoMammalian Cell Transfection

Las células HEK293 para transfección se cultivaron hasta 80% de confluencia en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero fetal bovino al 10%. Se efectuaron co-transfecciones usando LipofectAmine (Gibco-BRL) con 3 \mug de ADN de pMG125.3 y 9 \mug de ADNpc por 1 x 10^{6} células. Tres días después de la transfección, las células se hicieron pasar a través de medio que contuvo G418 a una concentración de 400 \mug/ml. Después de tres días de crecimiento en medio selectivo, las células se clasificaron de acuerdo con su fluorescencia.HEK293 cells for transfection are cultivated up to 80% confluence in the middle of Eagle modified by  Dulbecco (DMEM) with 10% fetal bovine serum. They were made co-transfections using LipofectAmine (Gibco-BRL) with 3 µg of pMG125.3 and 9 DNA mug cDNA for 1 x 10 6 cells. Three days after transfection, the cells were passed through medium that It contained G418 at a concentration of 400 µg / ml. After three days of growth in selective medium, the cells were classified according to its fluorescence.

Selección Clonal de Células 125.3 por FACSClonal Cell Selection 125.3 by FACS

Se analizaron muestras de células en un citómetro de flujo ESP EPICS Elite (Coulter, Hialeah, FL) equipado con una conexión de excitación de 488 nm suministrada por un láser de argón refrigerado por aire. La emisión de EGFP se midió a través de un filtro de paso de banda de 525 nm y la intensidad de la fluorescencia se representó en una escala logarítmica de 4 décadas después de aplicarla sobre células viables, según se determinó por la difusión hacia adelante y el ángulo derecho de la luz. Se separaron células verdes aisladas en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, que contuvieron medio de crecimiento sin G418. Después de un período de recuperación de cuatro días, se agregó G418 al medio hasta una concentración final de 400 \mug/ml. Después de la selección, 32% de los pocillos contuvieron clones expandidos. Los pocillos con clones se expandieron a partir de la placa de 96 pocillos a una placa de 24 pocillos y, luego, a una placa de 6 pocillos, seleccionándose las colonias de crecimiento más rápido para la expansión en cada pasaje. La línea celular seleccionada finalmente fue la de crecimiento más rápido de las seis sometidas a pasaje. Este clon, designado 125.3, se mantuvo en G418 a 400 \mug/ml, haciéndolo pasar cada cuatro días a medio fresco. Después de 23 pasajes, no se observó pérdida de producción de A\beta de la fluorescencia de EGFP.Cell samples were analyzed in a flow cytometer ESP EPICS Elite (Coulter, Hialeah, FL) equipped with a 488 nm excitation connection supplied by a laser of air-cooled argon. The emission of EGFP was measured through of a 525 nm bandpass filter and the intensity of the fluorescence was represented on a 4-decade logarithmic scale after application on viable cells, as determined by forward diffusion and the right angle of light. Be separated isolated green cells in each well of a plate of 96 wells, which contained growth medium without G418. After of a four day recovery period, G418 was added to the medium to a final concentration of 400 µg / ml. After the selection, 32% of the wells contained expanded clones. The wells with clones expanded from the 96 plate wells to a 24-well plate and then to a 6-plate wells, the fastest growing colonies being selected for expansion in each passage. The selected cell line finally it was the fastest growing of the six submitted to passage. This clone, designated 125.3, was maintained at G418-400 ? / ml, making it pass every four days to half fresh. After of 23 passages, no loss of A? production of EGFP fluorescence.

Análisis por EIA de A\beta (ELISA de Emparedado de Doble Anticuerpo para hA\beta 1-40/42)Aβ EIA analysis (Double Sandwich ELISA Antibody for hAβ 1-40 / 42)

Los sobrenadantes del cultivo celular cosechados 48 horas después de la transfección se analizaron en un EIA de A\beta estándar del modo siguiente. Se midió A\beta 1-40 ó 1-42 humano usando el anticuerpo monoclonal (mAb) 6E10 (Senetek, St. Louis, MO) y antisuero biotinilado de conejo 162 ó 164 (Instituto de Investigación Básica del Estado de Nueva York, Staten Island, NY) en un ELISA emparedado de doble anticuerpo. El anticuerpo de captura 6E10 es específico para un epítope presente en los residuos aminoácidos N-terminales 1-16 o hA\beta. Los anticuerpos conjugados de detección 162 y 164 son específicos para hA\beta 1-40 y 1-42, respectivamente. En pocas palabras, una placa inmunológica de 96 pocillos Nunc Maxisorp se recubrió con 100 \mul/pocillo de mAb 6E10 ((5 \mug/ml), diluido en tampón carbonato-bicarbonato 0,1 M a pH 9,6, y se incubó a 4ºC durante la noche. Después de lavar la placa 3 veces con DPBS 0,01 M (Solución Salina Tamponada con Fosfato, Modificada por Dulbecco (fosfato sódico 0,008 M, fosfato de potasio 0,002 M, cloruro sódico 0,14 M, cloruro de potasio 0,01 M, pH 7,4), de Pierce, Rockford, Il) que contuvo 0,05% de Tween-20 (DPBST), la placa se bloqueó durante 60 minutos con 200 \mul de suero ovino normal al 10% (Sigma) en DPBS 0,01 M para evitar la fijación inespecífica. Se agregaron estándares de A\beta 1-40 ó 1-42 humano, 100 \mul/pocillo (Bachem, Torrance, CA) diluidos, a partir de una solución madre de 1 mg/ml en DMSO, en medio de cultivo, des-
pués de lavar la placa, así como 100 \mul/pocillo de muestra, por ejemplo, medio acondicionado de células transfectadas.Cell culture supernatants harvested 48 hours after transfection were analyzed in a standard Aβ EIA as follows. Human Aβ 1-40 or 1-42 was measured using monoclonal antibody (mAb) 6E10 (Senetek, St. Louis, MO) and biotinylated rabbit antiserum 162 or 164 (Basic Research Institute of the State of New York, Staten Island, NY) in a double antibody sandwich ELISA. The 6E10 capture antibody is specific for an epitope present in the N-terminal amino acid residues 1-16 or hAβ. The conjugated detection antibodies 162 and 164 are specific for hAβ 1-40 and 1-42, respectively. Simply put, a 96-well Nunc Maxisorp immune plate was coated with 100 µl / well of 6E10 mAb ((5 µg / ml), diluted in 0.1 M carbonate-bicarbonate buffer at pH 9.6, and incubated at 4 ° C. overnight After washing the plate 3 times with 0.01 M DPBS (Phosphate Buffered Saline, Modified by Dulbecco (0.008 M sodium phosphate, 0.002 M potassium phosphate, 0.14 M sodium chloride, chloride 0.01 M potassium, pH 7.4), from Pierce, Rockford, Il) containing 0.05% Tween-20 (DPBST), the plate was blocked for 60 minutes with 200 µl of normal sheep serum 10% (Sigma) in 0.01 M DPBS to avoid nonspecific fixation: Aβ 1-40 or 1-42 human standards, 100 µl / well (Bachem, Torrance, CA) diluted, from a stock solution of 1 mg / ml in DMSO, in culture medium, after
after washing the plate, as well as 100 µl / well of sample, for example, conditioned medium of transfected cells.

La placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente y a 4ºC durante la noche. Al día siguiente, después de lavar la placa, se agregaron 100 \mul/pocillo de antisuero biotinilado de conejo 162 1:400 ó 164 1:50, diluido en DPBST + SFB al 0,5%, y se incubó durante 1 hora y 15 minutos a temperatura ambiente. Después de los lavados, se aplicaron 100 \mul/pocillo de neutravidina-peroxidasa de rábano picante (Pierce, Rockford, Il) diluido a 1:10.000 en DPBST, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de los últimos lavados, se agregaron como sustrato 100 \mul/pocillo de dihidrocloruro de o-fenilen-diamina (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) en un tampón de ácido cítrico 50 mM/fosfato sódico 100 mM (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) a pH 5,0, y se monitorizó el cambio de color a 450 nm en un lector cinético de microplaca durante 20 minutos, usando el software Soft max Pro. Todos los estándares y muestras se sometieron a análisis por triplicado. Las muestras con valores de absorbancia comprendidos dentro de la curva estándar se extrapolaron a partir de las curvas estándares usando el software Soft max Pro y se expresaron en pg/ml de medio de cultivo.The plate was incubated for 2 hours at temperature ambient and at 4 ° C overnight. The next day, after wash the plate, 100 µl / well of antiserum was added biotinylated rabbit 162 1: 400 or 164 1:50, diluted in DPBST + SFB 0.5%, and incubated for 1 hour and 15 minutes at temperature ambient. After washing, 100 µl / well was applied of horseradish neutravidin peroxidase (Pierce, Rockford, Il) diluted to 1: 10,000 in DPBST, and incubated for 1 hour at room temperature. After the last washed, 100 µl / well of substrate was added as substrate o-phenylene diamine dihydrochloride (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) in a 50 citric acid buffer mM / 100 mM sodium phosphate (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) at pH 5.0, and the color change at 450 nm was monitored in a kinetic reader of microplate for 20 minutes, using Soft max Pro software. All standards and samples were subjected to analysis by triplicate. Samples with absorbance values included within the standard curve they were extrapolated from the curves standards using Soft max Pro software and expressed in pg / ml of culture medium.

Resultados Results

La adición de dos residuos lisina al extremo carboxilo terminal de APP695 incrementa en gran medida el procesamiento por A\beta en células HEK293, tal como se demuestra por la expresión transitoria (Tabla 1). La adición del patrón di-lisina a APP695 aumenta el procesamiento por A\beta al nivel observado con la APP695 que contiene la mutación sueca. La combinación del patrón di-lisina con la mutación sueca aumenta adicionalmente el procesamiento en 2,8 veces adicionales.The addition of two lysine residues to the end APP695 terminal carboxyl greatly increases the Aβ processing in HEK293 cells, as demonstrated by the transient expression (Table 1). The addition of the pattern di-lysine to APP695 increases processing by A? At the level observed with APP695 containing the mutation Swedish The combination of the di-lysine pattern with the Swedish mutation further increases processing by 2.8 times additional.

La co-transformación de células HEK293 con pMG125.3 y pcDNA3.1 permitió la selección dual de células transformadas para resistencia a G418 y alto nivel de expresión de EGFP. Tras la selección clonal por FACS, la línea celular obtenida produce una cantidad destacable de 20.000 pg de péptido A\beta por ml de medio de cultivo después del crecimiento durante 36 horas en placas de 24 pocillos. La producción del péptido A\beta bajo diversas condiciones de crecimiento se resume en la Tabla 2.The co-transformation of cells HEK293 with pMG125.3 and pcDNA3.1 allowed dual cell selection transformed for resistance to G418 and high level of expression of EGFP After clonal selection by FACS, the cell line obtained produces a remarkable amount of 20,000 pg of Aβ peptide per ml of culture medium after growth for 36 hours in 24 well plates. Low Aβ peptide production Various growth conditions are summarized in Table 2.

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TABLA 1TABLE 1 Liberación de péptido A\beta hacia el medio de cultivo 48 horas después de la transfección transitoria de células HEK293 con los vectores indicados, que contienen APP natural o modificado. Los valores que se recogen en la tabla son media \pm DE y el valor P para la comparación por pares, usando el test t de Student suponiendo varianzas desigualesRelease of Aβ peptide into the medium of culture 48 hours after transient cell transfection HEK293 with the indicated vectors, which contain natural APP or modified. The values shown in the table are average. ± SD and the P value for pairwise comparison, using Student's t-test assuming variances unequal

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TABLA 2TABLE 2 Liberación de péptido A\beta desde células HEK293 bajo diferentes condiciones de crecimientoRelease of Aβ peptide from HEK293 cells under different growth conditions

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Ejemplo 5Example 5 Demostración de que Asp1 procesa APP en el sitio de \alpha-secretasaDemonstration that Asp1 processes APP on the site of α-secretase

Cabría esperar que el aumento de expresión de un gen candidato de \alpha-secretasa en células humanas aumentara la liberación basal de sAPP\alpha y redujera la liberación de péptidos A\beta. Este efecto se observó cuando se co-expresa Asp1 humana completa con APP en células HEK293. El experimento utilizó la isoforma de APP de 695 aminoácidos que había sido modificada por la adición de un par de residuos lisina al extremo C-terminal (APP-KK). El patrón di-lisina C-terminal aumenta la semivida intracelular de APP glicosilada y, por lo tanto, la producción tanto de sAPP\alpha como de A\beta. Tal como se muestra en la Tabla 3, la co-transfección de células HEK293 con APP-KK con Asp1 aumentó la producción de sAPP\alpha en 3,5 veces (p<0,001), y redujo la producción de A\beta40 en 2,8 veces. De esta forma, Asp1 actúa directa o indirectamente para facilitar la escisión de \alpha-secretasa constitutiva y este efecto es competitivo con el procesamiento amiloidogénico de APP con respecto a los péptidos A\beta. Esto implica que las mutaciones o polimorfismos genéticos en Asp1 pueden afectar a la producción de A\beta al alterar el equilibrio entre las vías competitivas para la escisión de \alpha-secretasa constitutiva y la producción de péptidos A\beta.You might expect the increase in expression of a α-secretase candidate gene in cells human increase the basal release of sAPP? and reduce the release of Aβ peptides. This effect was observed when co-expresses human Asp1 complete with APP in cells HEK293. The experiment used the APP isoform of 695 amino acids that had been modified by the addition of a couple of lysine residues at the C-terminal end (APP-KK). The di-lysine pattern C-terminal increases the intracellular half-life of APP glycosylated and, therefore, the production of both sAPP? as of Aβ. As shown in Table 3, the co-transfection of HEK293 cells with APP-KK with Asp1 increased production of sAPP? 3.5 times (p <0.001), and reduced the production of A? 40 in 2.8 times. In this way, Asp1 acts directly or indirectly to facilitate the cleavage of constitutive α-secretase and this effect is Competitive with amyloidogenic processing of APP with respect to the Aβ peptides. This implies that mutations or genetic polymorphisms in Asp1 may affect the production of A? By altering the balance between competitive pathways to the cleavage of constitutive α-secretase and the Aβ peptide production.

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TABLA 3TABLE 3 Asp1 estimula la liberación basal de sAPP\alpha a partir de células HEK293 tras la co-transfección con APP-KKAsp1 stimulates basal release of sAPP? A starting from HEK293 cells after co-transfection with APP-KK

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Se utilizaron los siguientes procedimientos específicos. Se clonó el ADNc completo de Asp1 en el vector pcDNA3.1/hygro+ (Invitrogen) para los estudios de transfección, tal como se ha descrito anteriormente (Yan et al. (1999), Nature 402:533-537). El ADNc de APP-KK se clonó en el vector pIRES (Clontech) también de la forma descrita anteriormente. Se transfectaron células HEK293 con las construcciones de expresión, usando el reactivo Lipofectamine Plus de Gibco BRL. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos a una densidad de 70-80% de confluencia. Se transfectaron 4 pocillos por placa con 2 \mug de ADN (3:1, APP:Asp1 o vector pcDNA3.1/hygro+ vacío), 8 \mul de reactivo Plus y 4 \mul de Lipofectamine en OptiMEM. Se agregó OptiMEM hasta un volumen total de 1 ml, se distribuyeron 200 \mul por pocillo y se incubó durante 3 horas. Se tuvo la precaución de mantener constantes las relaciones de los dos plásmidos usados para la co-transfección, así como la cantidad total de ADN empleado en la transfección. Los medios de transfección se sustituyeron por DMEM suplementado con SFB al 10% y piruvato sódico, con antibiótico/antimicótico, y las células se incubaron bajo condiciones normales (37ºC, CO_{2} al 5%) durante 48 horas. Los medios acondicionados se transfirieron a tubos de polipropileno y se almacenaron a -80ºC hasta el análisis del contenido en sAPP\alpha o A\beta40&A\beta42 por ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (EIA), según se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4. El EIA de A\beta se atuvo al protocolo de Pirttila et al. (Neuro. Lett. (1999) 249:21-4), usando el anticuerpo monoclonal 6E10 (Senetek) como anticuerpo de captura, y antisuero biotinilado de conejo 162 ó 165 (Instituto de Investigación Básica del Estado de Nueva York, Staten Island, NY) para la detección de A\beta40 y A\beta42, respectivamente. El anticuerpo 6E10 reconoce los residuos 1-16 del péptido A\beta. El EIA de sAPP\alpha utilizó el anticuerpo LN27 como anticuerpo de captura y 6E10 biotinilado para la detección, tal como se ha descrito anteriormente (Yan et al. (1999), véase más arriba). El anticuerpo LN27 reconoció los primeros 20 aminoácidos del péptido APP humano.The following specific procedures were used. The entire Asp1 cDNA was cloned into the pcDNA3.1 / hygro + (Invitrogen) vector for transfection studies, as described above (Yan et al . (1999), Nature 402: 533-537). APP-KK cDNA was cloned into the pIRES vector (Clontech) also in the manner described above. HEK293 cells were transfected with the expression constructs, using Gibco BRL Lipofectamine Plus reagent. The cells were seeded in 24-well tissue culture plates at a density of 70-80% confluence. 4 wells per plate were transfected with 2 µg of DNA (3: 1, APP: Asp1 or pcDNA3.1 / hygro + empty vector), 8 µL of Plus reagent and 4 µl of Lipofectamine in OptiMEM. OptiMEM was added to a total volume of 1 ml, 200 µl was distributed per well and incubated for 3 hours. Care was taken to keep the ratios of the two plasmids used for co-transfection constant, as well as the total amount of DNA used in the transfection. Transfection media were replaced by DMEM supplemented with 10% SFB and sodium pyruvate, with antibiotic / antifungal, and the cells were incubated under normal conditions (37 ° C, 5% CO2) for 48 hours. The conditioned media were transferred to polypropylene tubes and stored at -80 ° C until analysis of the content in sAPPα or Aβ40 & Aβ42 by enzyme-linked immunosorbent assay (EIA), as described above in Example 4 The A? EIA adhered to the protocol of Pirttila et al . (Neuro. Lett. (1999) 249: 21-4), using monoclonal antibody 6E10 (Senetek) as a capture antibody, and biotinylated rabbit antiserum 162 or 165 (Basic Research Institute of the State of New York, Staten Island, NY) for the detection of Aβ40 and Aβ42, respectively. The 6E10 antibody recognizes residues 1-16 of the Aβ peptide. The sAPP? EIA used the LN27 antibody as a capture antibody and biotinylated 6E10 for detection, as described above (Yan et al . (1999), see above). The LN27 antibody recognized the first 20 amino acids of the human APP peptide.

El incremento de actividad de \alpha-secretasa y la reducción concomitante de la producción de A\beta in vivo representa un efecto que puede ser deseable para la prevención, el tratamiento (por ejemplo, para poner de manifiesto su progresión) o la curación de la enfermedad de Alzheimer. De este modo, las actividades demostradas en este ejemplo ofrecen una indicación de que los moduladores de actividad de Asp1, que consiguen los mismos efectos in vivo, serán de utilidad en la terapia de la enfermedad de Alzheimer. Los procedimientos de rastreo para estos moduladores se contemplan como un aspecto de la invención.The increase in α-secretase activity and the concomitant reduction of Aβ production in vivo represents an effect that may be desirable for prevention, treatment (for example, to show its progression) or the cure of Alzheimer's disease. Thus, the activities demonstrated in this example offer an indication that the modulators of Asp1 activity, which achieve the same effects in vivo , will be useful in the therapy of Alzheimer's disease. Tracking procedures for these modulators are contemplated as an aspect of the invention.

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Ejemplo 6Example 6 Expresión de Pre-pro-Hu-Asp1 y Derivados en Células de InsectoExpression of Pre-pro-Hu-Asp1 and Derivatives in Insect Cells Expresión de hu-Asp1 TM(His)^{6} por infección de baculovirusExpression of hu-Asp1 ™ (His) 6 for baculovirus infection

La producción de la secuencia codificadora de pre-pro-Hu-Asp1 está diseñada como una forma soluble, secretada por células de insecto. Los cebadores de PCR fueron diseñados para (1) eliminar el dominio trans-membrana previsto y la cola de Asp1, e (2) introducir una secuencia de consenso de Kozak para el inicio eficaz de la traducción. Las secuencias de cebadores fueron las siguientes: sentido CGTTTAAGCTTGCCACCATGGGCGCACTGGCCCGGGCG (SEQ ID NO:74) y antisentido CGCTTTCTCGAGCTAA.TGGTGATGGTGATGGTGCCACAAATGGGCTGCTCAAAGA (SEQ ID NO:75), que reemplazaron los dominios trans-membrana C-terminal y citoplasmático eliminados con una marca de purificación de hexahistidina.The production of the coding sequence of pre-pro-Hu-Asp1 is Designed as a soluble form, secreted by insect cells. PCR primers were designed to (1) eliminate the domain planned trans-membrane and tail of Asp1, e (2) introduce a Kozak consensus sequence for effective startup of the translation. The primer sequences were the following: direction CGTTTAAGCTTGCCACCATGGGCGCACTGGCCCGGGCG (SEQ ID NO: 74) and antisense CGCTTTCTCGAGCTAA.TGGTGATGGTGATGGTGCCACAAATGGGCTGCTCAAAGA (SEQ ID NO: 75), which replaced the domains C-terminal trans-membrane and cytoplasmic removed with a purification mark of hexahistidine

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con 100 ng de la construcción Asp1 pcDNA3.1/hygro+ completa, NTPs 200 M, 300 nM de cada cebador, 1x tampón de reacción que contuvo MgSO4 2 mM, y 5 unidades de ADN-polimerasa Pwo I (Roche Biochemicals). Las reacciones se efectuaron bajo las siguientes condiciones: 94ºC durante 5 minutos, seguido de 15 ciclos de 94ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos y, entonces, una reacción de extensión final a 72ºC durante 10 minutos. La secuencia de aminoácidos predicha de este derivado generado por PCR (designado Asp-1\DeltaTM(His)_{6}) se representa como SEQ ID NO:66.PCR reactions were carried out with 100 Construction np Asp1 pcDNA3.1 / hygro + complete, NTPs 200 M, 300 nM of each primer, 1x reaction buffer containing MgSO4 2 mM, and 5 units of Pwo I DNA polymerase (Roche Biochemicals). The reactions were carried out under the following conditions: 94 ° C for 5 minutes, followed by 15 cycles of 94 ° C for 30 seconds and 72 for 30 seconds and then a final extension reaction at 72 ° C for 10 minutes. Sequence of predicted amino acids of this derivative generated by PCR (designated  Asp-1? (His) 6) is Represents as SEQ ID NO: 66.

El producto de reacción se digirió hasta la totalidad con HindIII-Xhol y se ligó en el vector de expresión pIB (Invitrogen) para dar la construcción pIB/Asp-1\DeltaTM(His)_{6}. La creación del baculovirus recombinante y la infección de células de insecto sf9 se llevó a efecto usando procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Se transfectaron células sf9 con el vector pIB solo o la construcción pIB/Asp-1\DeltaTM(His)_{6}, utilizando el reactivo Insectin Plus (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la transfección, las células se cultivaron en medio High Five exento de suero (Invitrogen) durante 3 días. Subsiguientemente, el medio acondicionado se cosechó y sometió a análisis por transferencia de Western. Este análisis reveló la expresión y secreción del polipéptido Asp-1\DeltaTM(His)_{6} inmunorreactivo hacia el medio extracelular. Las proteínas secretadas se detectaron en la transferencia de Western con la sonda India (Pierce Chemicals), específica para la marca de la secuencia de hexahistidina, o utilizando un antisuero policlonal de conejo. Los antisueros policlonales (designados como UP-199) se generaron inyectando en conejos Asp-1\DeltaTM(His)_{6} (SEQ ID NO:66) recombinante. Este péptido recombinante se preparó por expresión heteróloga en E. coli. El anticuerpo UP-199 reconoce la forma procesada de
Asp-1\DeltaTM.The reaction product was completely digested with HindIII-Xhol and ligated into the pIB (Invitrogen) expression vector to give the pIB / Asp-1? (His) 6 construct. Creation of the recombinant baculovirus and infection of sf9 insect cells was carried out using conventional procedures known in the art. Sf9 cells were transfected with the pIB vector alone or the pIB / Asp-1? (His) 6 construct, using the Insectin Plus reagent (Invitrogen), according to the manufacturer's instructions. After transfection, the cells were cultured in serum-free High Five medium (Invitrogen) for 3 days. Subsequently, the conditioned medium was harvested and subjected to Western blot analysis. This analysis revealed the expression and secretion of the immunoreactive Asp-1? (His) 6 polypeptide into the extracellular environment. Secreted proteins were detected in the Western blot with the India probe (Pierce Chemicals), specific for the hexahistidine sequence mark, or using a rabbit polyclonal antiserum. Polyclonal antisera (designated UP-199) were generated by injecting into recombinant Asp-1? (His) 6 (SEQ ID NO: 66) rabbits. This recombinant peptide was prepared by heterologous expression in E. coli. The UP-199 antibody recognizes the processed form of
Asp-1 \ DeltaTM.

El análisis directo con el antisuero policlonal (UP-199) reveló una banda inmunorreactiva del peso molecular esperado (50 kDa) solamente en células transfectadas con pIB/Asp-1\DeltaTM(His)_{6}. Esta señal mostró una potenciación significativa en medio acondicionado concentrado. Se obtuvo un patrón similar usando la sonda India. No se detectó señal alguna en el medio acondicionado derivado de células falsamente transfectadas con el uso de UP-199 ni de la sonda India.Direct analysis with the polyclonal antiserum (UP-199) revealed an immunoreactive weight band expected molecular (50 kDa) only in cells transfected with pIB / Asp-1? (His) 6. This signal showed significant potentiation in conditioned medium concentrated. A similar pattern was obtained using the Indian probe. Do not any signal was detected in the conditioned medium derived from falsely transfected cells with the use of UP-199 nor of the Indian probe.

Basándose en estos resultados, se llevaron a cabo transfecciones transitorias y estables de la construcción pIB/Asp-1\DeltaTM(His)_{6} en células sf9 de insecto, de la forma descrita más arriba. Cuatro días después de la transfección transitoria, se recogió el medio de cultivo para proporcionar material para caracterización adicional. En paralelo, se transfectaron células sf9 de forma estable con la construcción pIB/Asp-1\DeltaTM(His)_{6} y se cultivaron en medio High Five exento de suero (Invitrogen) suplementado con 50 \mug/ml de blasticidina durante aproximadamente 2 semanas. Tras la selección de blasticidina, el combinado resistente de células se expandió para dar una fuente estable de medio acondicionado para la purificación de Asp-1\DeltaTM(His)_{6}.Based on these results, they took out transient and stable construction transfections pIB / Asp-1? (His) 6 in sf9 insect cells, as described above. Four days after transient transfection, the medium of culture to provide material for additional characterization. In parallel, sf9 cells were stably transfected with the building pIB / Asp-1? (His) 6 and se cultured in serum-free High Five medium (Invitrogen) supplemented with 50 µg / ml blasticidine for about 2 weeks After the selection of blasticidine, the combined resistant cells expanded to give a source stable medium conditioning for purification of Asp-1? (His) 6.

Purificación de Asp-1\DeltaTM(His)_{6} recombinantePurification of Asp-1 ΔTM (His) 6 recombinant

Los medios acondicionados, procedentes de células sf9 transfectadas de forma transitoria o estable, se concentraron aproximadamente 10 veces usando un concentrador de células con agitación, equipado con una membrana 30.000 MWCO (Spectrum Medical Industries). Seguidamente, este concentrado se sometió a precipitación con sulfato de amonio para concentrar adicionalmente la muestra y aportar una purificación parcial. El material que precipitó entre 0 y 40% de saturación se descartó y el sobrenadante resultante se llevó a una saturación de 80%. El análisis de transferencia de Western de las diversas fracciones precipitadas con sulfato de amonio reveló que la mayoría del material inmunorreactivo estaba contenida dentro del conglomerado de sulfato de amonio 40-80%. En consecuencia, este material se sometió a purificación adicional.The conditioned media, coming from sf9 cells transiently or stably transfected, are concentrated approximately 10 times using a concentrator cells with agitation, equipped with a 30,000 MWCO membrane (Spectrum Medical Industries). Then this concentrate is was precipitated with ammonium sulfate to concentrate additionally the sample and provide a partial purification. He material that precipitated between 0 and 40% saturation was discarded and the The resulting supernatant was brought to 80% saturation. He Western blot analysis of the various fractions precipitates with ammonium sulfate revealed that most of the immunoreactive material was contained within the conglomerate of 40-80% ammonium sulfate. Consequently, this material was subjected to further purification.

El conglomerado de sulfato de amonio 40-80% se disolvió nuevamente en aproximadamente 1/20 del volumen original del tampón de carga Ni+-NTA (Tris-HCl 25 mM (pH 8,5)/NaCl 0,5 mM/imidazol 10 mM). A continuación, la muestra se aplicó en una columna Ni+-NTA equilibrada previamente en tampón Ni+-NTA. Después de aplicar la muestra, la columna se lavó con tampón de partida (Tris-HCl 25 mM (pH 8,5)/NaCl 0,5 mM/imidazol 20 mM) hasta que la A^{280 \ nm} del efluente de la columna recuperó el valor de cero. Después de lavar, se eliminó por elución la proteína recombinante fijada de la columna con un gradiente lineal de tampón Ni+-NTA que contuvo concentraciones crecientes (10 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM y 500 mM) de imidazol. La Asp-1\DeltaTM(His)_{6} inmunorreactiva se detectó en la carga de la columna y se eluyó con imidazol 50 mM. El análisis con gel NuPAGE de la fracción de imidazol 50 mM demostró una pureza de Asp-1\DeltaTM(His)_{6} de aproximadamente 50% y, por consiguiente, fue precisa una purificación adicional.The ammonium sulfate conglomerate 40-80% dissolved again in approximately 1/20 of the original volume of the Ni + -NTA loading buffer (25 mM Tris-HCl (pH 8.5) / 0.5 mM NaCl / 10 imidazole mM). Next, the sample was applied in a Ni + -NTA column previously equilibrated in Ni + -NTA buffer. After applying the sample, the column was washed with starting buffer (25 mM Tris-HCl (pH 8.5) / 0.5 mM NaCl / 20 mM imidazole) until the A 280 of the column effluent recovered the zero value. After washing, the protein was removed by elution recombinant column fixation with a linear gradient of buffer Ni + -NTA containing increasing concentrations (10 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM and 500 mM) of imidazole. The Asp-1 ΔTM (His) 6 immunoreactive was detected in the column load and eluted with 50 mM imidazole. NuPAGE gel analysis of the fraction of 50 mM imidazole demonstrated a purity of Asp-1? (His) 6 of approximately 50% and therefore a additional purification

A continuación, se combinaron las fracciones positivas, eluidas de la columna Ni+-NTA, (designadas como combinado post-IMAC), se concentraron usando una membrana YM30 (Amicron) y se sometieron a diálisis con Tris-HCl 25 mM (pH 8,0). El combinado post-IMAC dializado se fraccionó por elución de gradiente en cromatografía de intercambio de aniones MonoQ (Amersham-Pharmacia Biotech) que contuvo concentraciones crecientes (0-0,5 M) de NaCl (Tampón A: Tris-HCl 25 mM (pH 8,0), y Tampón B: Tris-HCl 25 mM (pH 8,0)/NaCl 0,5 M). El perfil de elución se determinó por análisis de transferencia de Western que puso de manifiesto fracciones inmunorreactivas tales como las que exhibieron inmunorreactividad con el antisuero UP-199. El análisis con gel NuPAGE con tinción de plata demostró que el material preparado de este modo tenía una pureza >90%. Se combinaron las fracciones inmunorreactivas eliminadas por elución de la columna de intercambio aniónico MonoQ, se dializaron con HEPES-Na+ 25 mM (pH 8,0) y se almacenaron a 4ºC hasta su posterior análisis.Then the fractions were combined positive, eluted from the Ni + -NTA column, (designated as combined  post-IMAC), were concentrated using a membrane YM30 (Amicron) and underwent dialysis with 25 mM Tris-HCl (pH 8.0). The combined post-dialyzed IMAC was fractionated by elution of gradient in MonoQ anion exchange chromatography (Amersham-Pharmacia Biotech) that contained increasing concentrations (0-0.5 M) of NaCl (Buffer  A: 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), and Buffer B: 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) / 0.5 M NaCl). The profile of elution was determined by Western blot analysis that revealed immunoreactive fractions such as those that exhibited immunoreactivity with the antiserum UP-199. NuPAGE gel analysis with staining of silver showed that the material prepared in this way had a purity> 90%. Immunoreactive fractions were combined removed by elution of the MonoQ anion exchange column, dialyzed with 25 mM HEPES-Na + (pH 8.0) and stored at 4 ° C until further analysis.

Activación Ácida de Asp-1\DeltaTM(His)_{6} recombinanteAcid Activation of Asp-1 ΔTM (His) 6 recombinant

La Asp-1\DeltaTM(His)_{6} recombinante migró con un peso molecular aparente de 50 kDa. El análisis directo de la secuencia N-terminal llevado a cabo por degradación automática de Edman durante 20 ciclos reveló un inicio único de secuencia en Glu^{3} (SEQ NO:67), que confirmó la identidad de la proteína recombinante. La predicción computadorizada del sitio de escisión de la señal de peptidasa indicó que la pro-forma debería iniciarse en Ala^{1}, lo que sugiere un sitio de procesamiento inusual por la señal de peptidasa durante la secreción, o una etapa adicional de procesamiento que elimina dos residuos aminoácidos adicionales.The Asp-1 ΔTM (His) 6 recombinant migrated with an apparent molecular weight of 50 kDa. He direct analysis of the N-terminal sequence carried carried out by automatic degradation of Edman for 20 cycles revealed a single sequence start in Glu 3 (SEQ NO: 67), which confirmed the identity of the recombinant protein. The prediction computerized peptidase signal cleavage site indicated that the pro-form should begin in Ala1, which suggests an unusual processing site by the peptidase signal during secretion, or an additional stage of processing that eliminates two additional amino acid residues.

Para investigar el mecanismo de activación de pro-Asp-1\DeltaTM(His)_{6}, se incubaron partes alícuotas de la proteína purificada en diversos ambientes ácidos, con valores de pH dentro del intervalo de 3,0 a 8,0 a 37ºC durante 2 horas. Subsiguientemente, las proteínas recombinantes se analizaron por transferencia de Western. Se detectó una especie polipeptídica de migración más rápida tras la incubación a valores de pH de 4,0, 4,5 y 5,0. La migración del polipéptido se mantuvo inalterada tras la incubación en ambientes que fueron más ácidos (pH 3,0 y 3,5) o más básicos (pH 6,0, 7,0 y 8,0). El análisis de secuencia de esta especie de migración más rápida reveló que se iniciaba exclusivamente en Ala^{43}, que es consistente con la eliminación de un segmento residual de 42 aminoácidos del pro-péptido, inducida por el tratamiento de la pro-enzima a pH 4,5. La secuencia de aminoácidos predicha de la forma procesada por ácidos de Asp-1\DeltaTM(His)_{6} se establece como SEQ ID NO:68.To investigate the activation mechanism of pro-Asp-1? (His) 6, aliquots of the purified protein were incubated in various acidic environments, with pH values within the range of 3.0 to 8.0 at 37 ° C for 2 hours. Subsequently, the proteins Recombinants were analyzed by Western blotting. Be detected a faster migration polypeptide species after incubation at pH values of 4.0, 4.5 and 5.0. The migration of polypeptide remained unchanged after incubation in environments which were more acidic (pH 3.0 and 3.5) or more basic (pH 6.0, 7.0 and 8.0). Sequence analysis of this kind of migration more quickly revealed that it started exclusively on Ala 43, which is consistent with the elimination of a residual segment of 42 pro-peptide amino acids, induced by treatment of the pro-enzyme at pH 4.5. Sequence of predicted amino acids of the acid-processed form of Asp-1? (His) 6 se set as SEQ ID NO: 68.

Para purificar la forma activada por ácido de Asp-1\DeltaTM(His)_{6}, el combinado post-IMAC de Asp-1\DeltaTM(His)_{6} (generado de la manera descrita anteriormente) se dializó a pH 4,5 y, seguidamente, se sometió a cromatografía de afinidad en agarosa de pepstatina A o sulfolink-PHA-292593E. Después de aplicar la muestra, la columna se lavó con NaOAc 25 mM (pH 4,5) y se eluyó con Na-BO_{3} 50 mM (pH 9,5). Las fracciones positivas retiradas por elución de las columnas se dializaron con Hepes-Na 25 mM (pH 7,5) durante la noche a 4ºC, lo que dio como resultado la conversión cuantitativa de la pro-enzima en su forma procesada por ácido (SEQ ID NO:68) descrita anteriormente. El análisis por transferencia de Western del perfil de elución demostró una retención cuantitativa de la Asp-1\DeltaTM(His)_{6} inmunorreactiva en ambas resinas de afinidad, tal como se pone de manifiesto por la ausencia de Asp-1\DeltaTM(His)_{6} en la fracción no fijada, detectada por la inmunorreactividad de UP-199 en una transferencia de Western. La elución de fase con NaBO_{3} 50 mM a pH 9,5 dio como resultado la elución de Asp-1 TM(His)_{6} inmunorreactiva con recuperación variable.To purify the acid activated form of Asp-1? (His) 6, the post-IMAC combination of Asp-1 ΔTM (His) 6 (generated in the manner described above) was dialyzed at pH 4.5 and, Next, he underwent affinity chromatography on agarose pepstatin A or sulfolink-PHA-292593E. After Apply the sample, the column was washed with 25 mM NaOAc (pH 4.5) and eluted with 50 mM Na-BO3 (pH 9.5). The positive fractions removed by elution of the columns are dialyzed with 25 mM Hepes-Na (pH 7.5) during night at 4 ° C, which resulted in quantitative conversion of the pro-enzyme in its acid-processed form (SEQ ID NO: 68) described above. The analysis by Western transfer of the elution profile demonstrated a quantitative retention of Asp-1 ΔTM (His) 6 immunoreactive in both affinity resins, as it becomes manifested by the absence of Asp-1? (His) 6 in the fraction not fixed, detected by the immunoreactivity of UP-199 in a Western transfer. Elution phase with 50 mM NaBO 3 at pH 9.5 resulted in elution of immunoreactive Asp-1 ™ (His) 6 with variable recovery.

Asp1 sufre un procesamiento eficaz por la señal de peptidasa y el procesamiento adicional para eliminar dos residuos aminoácidos adicionales del extremo N-terminal. El procesamiento adicional de la pro-forma de Asp1 no se detectó a pH neutro.Asp1 undergoes efficient signal processing of peptidase and additional processing to eliminate two additional amino acid residues from the end N-terminal The additional processing of the Asp1 pro-form was not detected at neutral pH.

Además de proporcionar información valiosa sobre la actividad de Asp1, el descubrimiento de un sitio de aparente procesamiento autocatalítico de Asp1 ofrece una indicación de una secuencia de péptidos (alrededor de Ala^{43}) que podría ser útil para llevar a cabo ensayos de rastreo destinados a identificar moduladores de la actividad de Asp1. Esta idea se analiza con más detalle en el Ejemplo 7.In addition to providing valuable information about Asp1 activity, the discovery of an apparent site Autocatalytic processing of Asp1 offers an indication of a peptide sequence (around Ala 43) that could be useful to carry out tracing tests designed to identify modulators of Asp1 activity. This idea is analyzed with more detail in Example 7.

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Ejemplo 7Example 7 Desarrollo de un ensayo enzimático para Asp-1\DeltaTM(His)_{6}Development of an enzymatic assay for Asp-1 ΔTM (His) 6

Se investigó la relación entre Asp1 y el procesamiento de APP mediante la determinación de si los sustratos peptídicos de \alpha-secretasa de APP, \beta-secretasa de APP o \gamma-secretasa de APP resultan escindidos por Asp-1\DeltaTM(His)_{6} recombinante. Estos sustratos peptídicos incluyeron los sustratos \alpha-secretasa específicos A\beta_{10-20} y A\beta_{12-28}, los sustratos \beta-secretasa específicos PHA-95812E (SEVKMDAEFR; SEQ ID NO:64) y PHA-24757E (SEVNLDAEFR; SEQ ID NO:63) y el sustrato \gamma-secretasa específico PHA-179111E (RRGGVVIATVIVGER; SEQ ID NO:76). Cada reacción consistió en la incubación de un sustrato peptídico (100 mM) con Asp-1\DeltaTM(His)_{6} recombinante durante 15 horas a pH 4,5 a 37ºC. Los productos de reacción se cuantificaron por HPLC de fase inversa a A^{214 \ nm}. Los perfiles de elución de Asp-1\DeltaTM(His)_{6} se compararon con los obtenidos en experimentos paralelos con Asp1. La identidad de los productos de escisión se determinó por espectrometría de masa MADLI-TOF. La Tabla 4 resume los sustratos de Asp1 e indica el sitio de escisión.The relationship between Asp1 and the APP processing by determining whether the substrates APP α-secretase peptides, APP? -secretase or APP? secretase are cleaved by Asp-1 ΔTM (His) 6 recombinant These peptide substrates included the substrates specific α-secretase A? 10-20} and A? 12-28, the substrates specific β-secretase PHA-95812E (SEVKMDAEFR; SEQ ID NO: 64) and PHA-24757E (SEVNLDAEFR; SEQ ID NO: 63) and the substrate γ-secretase specific PHA-179111E (RRGGVVIATVIVGER; SEQ ID NO: 76). Every reaction consisted of the incubation of a peptide substrate (100 mM) with Asp-1? (His) 6 recombinant for 15 hours at pH 4.5 at 37 ° C. The products of reaction were quantified by reverse phase HPLC at A 214 \ nm}. Elution profiles of Asp-1? (His) 6 se compared with those obtained in parallel experiments with Asp1. The Identity of cleavage products was determined by MADLI-TOF mass spectrometry. Table 4 summarizes Asp1 substrates and indicates the cleavage site.

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TABLA 4TABLE 4 Preferencia de Sustratos de Asp-1\DeltaTMSubstrate Preference Asp-1 \ DeltaTM

77

Los péptidos de la Tabla 4 se describen utilizando la nomenclatura de Schechter y Berger (Biochem. Biophys. Res. Commun. 27:157 (1967) y Biochem. Biophys. Res. Commun. 32:898 (1968)), en la que los residuos aminoácidos en el sustrato peptídico que sufre la escisión se definen como P_{1}....P_{n} hacia el extremo N-terminal, y P_{1}'.......P_{n}' hacia el extremo C-terminal. Por lo tanto, el enlace escindible se encuentra entre el residuo P_{1} y P_{1}' de las subunidades peptídicas y se señala en este caso con un guión entre P_{1} y P_{1}'.The peptides of Table 4 are described. using the nomenclature of Schechter and Berger (Biochem. Biophys. Res. Commun. 27: 157 (1967) and Biochem. Biophys Res. Commun. 32: 898 (1968)), in which the amino acid residues in the substrate peptide that undergoes cleavage are defined as P_ {1} .... P_ {n} towards the N-terminal end, and P_ {1} '....... P_ {n}' towards the C-terminal end. Therefore, the cleavable link is between the residue P_ {1} and P_ {1} 'of the peptide subunits and is indicated in this case with a hyphen between P_ {1} and P_ {1} '.

La digestión del sustrato de \alpha-secretasa (A_{12-28}) demostró la existencia de dos sitios de escisión de Asp1. El producto principal se escindió en Phe^{20}, Ala^{21} y el producto menor lo hizo en el péptido Phe^{19}Phe^{20} (en relación con la numeración convencional en A\beta de APP). El análisis de los productos de escisión obtenidos a partir de los sustratos peptídicos de \beta-secretasa demostró que tanto el sustrato natural (PHA-95812E) como el afectado por la mutación sueca (PHA-247574E) fueron hidrolizados exclusivamente en el sitio de \beta-secretasa. Igualmente, las velocidades relativas de hidrólisis dependiente de Asp-1 del sustrato peptídico de \beta-secretasa que contuvo la mutación sueca fueron al menos 10 veces más rápidas que para el péptido natural correspondiente. Bajo estas condiciones de reacción, no se detectó conversión del sustrato peptídico de \gamma-secretasa correspondiente.The substrate digestion of α-secretase (A 12-28) demonstrated the existence of two Asp1 cleavage sites. He main product was cleaved in Phe 20, Ala 21 and the minor product did it in the Phe 19 Phe 20 peptide (in relationship with the conventional numbering in A? of APP). He analysis of the cleavage products obtained from the β-secretase peptide substrates demonstrated that both the natural substrate (PHA-95812E) and the affected by the Swedish mutation (PHA-247574E) were hydrolyzed exclusively at the site of β-secretase. Likewise, the speeds relative hydrolysis-dependent Asp-1 of the β-secretase peptide substrate containing the Swedish mutation were at least 10 times faster than for the corresponding natural peptide. Under these reaction conditions, no conversion of the peptide substrate of corresponding γ-secretase.

La medición de la escisión de los sustratos de \alpha-secretasa y \beta-secretasa se puede llevar a cabo también con sustratos que comprenden marcas detectables tales como marcas radioactivas, enzimáticas, quimioluminiscentes o fluorescentes. Por ejemplo, el sustrato peptídico podría comprender marcas extinguidas internamente que dan como resultado una mayor capacidad de detección tras la escisión de los sustratos peptídicos, debido a la separación de las marcas después de la escisión. Los sustratos peptídicos se pueden modificar para tener fijado una sonda de flúor apareada y un extintor tal como 7-amino-4-metil cumarina y dinitrofenol, respectivamente.The measurement of the cleavage of the substrates of α-secretase and β-secretase can also be carried out with substrates comprising detectable marks such as brands radioactive, enzymatic, chemiluminescent or fluorescent. By For example, the peptide substrate could comprise extinguished labels internally that result in a greater ability to detection after cleavage of the peptide substrates, due to the separation of the marks after excision. Substrates peptides can be modified to have a fluoride probe attached paired and a fire extinguisher such as 7-amino-4-methyl Coumarin and Dinitrophenol, respectively.

Este ejemplo ilustra la actividad de \alpha-secretasa y \beta-secretasa que exhibe Asp-1, lo que confirma la actividad de procesamiento de Asp1 que se muestra en el Ejemplo 5. Los sustratos descritos en este caso se pueden utilizar en combinación con Asp1 recombinante para medir la actividad proteolítica de Asp-1 en los sitios de procesamiento de \alpha-secretasa y \beta-secretasa. Estos sustratos son de utilidad en los ensayos de rastreo para la identificación de moduladores de la actividad proteolítica de Asp1.This example illustrates the activity of α-secretase and β-secretase exhibiting Asp-1, which confirms the processing activity of Asp1 that shown in Example 5. The substrates described in this case are can be used in combination with recombinant Asp1 to measure the Asp-1 proteolytic activity at the sites of α-secretase processing and β-secretase. These substrates are useful in tracing tests for the identification of modulators of the proteolytic activity of Asp1.

De manera particular, la producción de especies de A\beta a través del procesamiento de APP en los sitios de \beta- y \gamma-secretasa puede jugar un papel fundamental en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer, y el procesamiento en el sitio de la \alpha-secretasa puede desempeñar una función protectora y puede prevenir la producción de A\beta. De esta forma, existe una indicación terapéutica y/o profiláctica para moléculas capaces de incrementar la actividad de la \alpha-secretasa de Asp1 y/o reducir la actividad de la \beta-secretasa de Asp1 in vivo.In particular, the production of Aβ species through the processing of APP at the β- and γ-secretase sites can play a fundamental role in the pathogenesis of Alzheimer's disease, and the processing at the site of α-secretase can play a protective role and can prevent the production of Aβ. Thus, there is a therapeutic and / or prophylactic indication for molecules capable of increasing the activity of Asp1? -Secretase and / or reducing the activity of Asp1? -Secretase in vivo .

<110> Pharmacia & Upjohn<110> Pharmacia & Upjohn

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<120> SECRETASA DE LA ENFERMEDAD DE ALZEHIMER, SUSTRATOS DE APP DE LA MISMA Y PARA LA MISMA<120> SECRETASE OF DISEASE OF ALZEHIMER, SUBSTRATES OF APP OF THE SAME AND FOR THE SAME

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<130> 28341/6280.1<130> 28341 / 6280.1

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<140><140>

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<141><141>

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<150> 60/169.232 <151> 12-06-1999<150> 60 / 169.232 <151> 06-12-1999

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<150> 09/416.901 <151> 13-10-1999<150> 09 / 416.901 <151> 10-13-1999

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<150> 60/155.493 <151> 23-09-1999<150> 60 / 155,493 <151> 09-23-1999

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<150> 09/404.133 <151> 23-09-1999<150> 09 / 404.133 <151> 09-23-1999

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<150> PCT/US99/20881 <151> 23-09-1999<150> PCT / US99 / 20881 <151> 09-23-1999

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<150> 60/101.594 <151> 24-09-1998<150> 60 / 101,594 <151> 09-24-1998

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<160> 76<160> 76

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<170> PatentIn Ver. 2.0<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1<210> 1

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<211> 1804<211> 1804

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 1<400> 1

88

99

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<210> 2<210> 2

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 518<211> 518

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 2<400> 2

1010

11eleven

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<210> 3<210> 3

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<211> 2070<211> 2070

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 3<400> 3

1212

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<210> 4<210> 4

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<211> 501<211> 501

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 4<400> 4

1313

1414

15fifteen

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<210> 5<210> 5

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<211> 1977<211> 1977

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 5<400> 5

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1616

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<210> 6<210> 6

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<211> 476<211> 476

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 6<400> 6

1717

1818

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<210> 7<210> 7

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<211> 2043<211> 2043

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Mus musculus <213> Mus musculus

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<400> 7<400> 7

1919

190190

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<210> 8<210> 8

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 501<211> 501

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Mus musculus <213> Mus musculus

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<400> 8<400> 8

20twenty

21twenty-one

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<210> 9<210> 9

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<211> 2088<211> 2088

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 9<400> 9

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2222

220220

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<210> 10<210> 10

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 695<211> 695

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 10<400> 10

232. 3

2424

2525

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 11<210> 11

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<211> 2088<211> 2088

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 11<400> 11

2626

260260

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<210> 12<210> 12

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<211> 695<211> 695

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 12<400> 12

2727

2828

2929

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<210> 13<210> 13

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 2088<211> 2088

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 13<400> 13

3030

300300

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<210> 14<210> 14

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<211> 695<211> 695

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 14<400> 14

3131

3232

3333

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<210> 15<210> 15

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<211> 2094<211> 2094

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 15<400> 15

343. 4

340340

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<210> 16<210> 16

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<211> 697<211> 697

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 16<400> 16

3535

3636

3737

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<210> 17<210> 17

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<211> 2094<211> 2094

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 17<400> 17

3838

380380

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<210> 18<210> 18

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<211> 697<211> 697

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 18<400> 18

3939

4040

4141

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<210> 19<210> 19

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<211> 2094<211> 2094

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 19<400> 19

4242

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 20<210> 20

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<211> 697<211> 697

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 20<400> 20

4343

4444

45Four. Five

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 21<210> 21

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 1341<211> 1341

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 21<400> 21

4646

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<210> 22<210> 22

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<211> 446<211> 446

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 22<400> 22

4747

4848

4949

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<210> 23<210> 23

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<211> 1380<211> 1380

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 23<400> 23

50fifty

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<210> 24<210> 24

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<211> 459<211> 459

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 24<400> 24

5151

5252

5353

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 25<210> 25

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<211> 1302<211> 1302

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 25<400> 25

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5454

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<210> 26<210> 26

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<211> 433<211> 433

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 26<400> 26

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5555

5656

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<210> 27<210> 27

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<211> 1278<211> 1278

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 27<400> 27

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5757

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<210> 28<210> 28

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<211> 425<211> 425

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 28<400> 28

5858

5959

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<210> 29<210> 29

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<211> 1362<211> 1362

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 29<400> 29

6060

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<210> 30<210> 30

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<211> 453<211> 453

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 30<400> 30

6161

6262

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<210> 31<210> 31

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<211> 1380<211> 1380

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 31<400> 31

6363

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<210> 32<210> 32

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<211> 459<211> 459

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 32<400> 32

6464

6565

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<210> 33<210> 33

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<211> 25<211> 25

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 33<400> 33

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<211> 19<211> 19

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 34<400> 34

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<211> 29<211> 29

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 35<400> 35

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<211> 36<211> 36

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<211> 39<211> 39

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<211> 39<211> 39

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 38<400> 38

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<210> 39<210> 39

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<211> 77<211> 77

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Hu-Asp2<223> Sequence Description Artificial: Hu-Asp2

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<400> 39<400> 39

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7272

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<210> 40<210> 40

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<211> 77<211> 77

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Hu-Asp2<223> Sequence Description Artificial: Hu-Asp2

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<400> 40<400> 40

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7373

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<210> 41<210> 41

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<211> 51<211> 51

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Caspasa 8<223> Sequence Description Artificial: Caspasa 8

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Sitio de Escisión

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Excision Site

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<400> 41<400> 41

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7474

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<210> 42<210> 42

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<211> 51<211> 51

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Caspasa 8<223> Sequence Description Artificial: Caspasa 8

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Sitio de Escisión

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Excision Site

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<400> 42<400> 42

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<210> 43<210> 43

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<211> 32<211> 32

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 43<400> 43

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<210> 44<210> 44

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<211> 36<211> 36

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 44<400> 44

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<210> 45<210> 45

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<211> 24<211> 24

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: 6-His tag<223> Sequence Description Artificial: 6-His tag

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<400> 45<400> 45

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<210> 46<210> 46

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<211> 24<211> 24

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: 6-His tag<223> Sequence Description Artificial: 6-His tag

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<400> 46<400> 46

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<210> 47<210> 47

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<211> 22<211> 22

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador<223> Sequence Description Artificial: Primer

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<400> 47<400> 47

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8080

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<210> 48<210> 48

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<211> 51<211> 51

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador<223> Sequence Description Artificial: Primer

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<400> 48<400> 48

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8181

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<210> 49<210> 49

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<211> 26<211> 26

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador<223> Sequence Description Artificial: Primer

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<400> 49<400> 49

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8282

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<210> 50<210> 50

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<211> 1287<211> 1287

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Hu-Asp2(b)<223> Sequence Description Artificial: Hu-Asp2 (b)

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<400> 50<400> 50

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8383

830830

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<210> 51<210> 51

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<211> 428<211> 428

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Hu-Asp2(b) delta TM<223> Sequence Description Artificial: Hu-Asp2 (b) Delta TM

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<400> 51<400> 51

8484

8585

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<210> 52<210> 52

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<211> 1305<211> 1305

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Hu-Asp2 (b) delta TM<223> Sequence Description Artificial: Hu-Asp2 (b) Delta TM

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<400> 52<400> 52

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8686

860860

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<210> 53<210> 53

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<211> 434<211> 434

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Hu-Asp2(b) delta TM<223> Sequence Description Artificial: Hu-Asp2 (b) Delta TM

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<400> 53<400> 53

8787

8888

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<210> 54<210> 54

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<211> 2310<211> 2310

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 54<400> 54

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8989

890890

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<210> 55<210> 55

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<211> 770<211> 770

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 55<400> 55

9090

9191

9292

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<211> 2253<211> 2253

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 56<400> 56

9393

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<210> 57<210> 57

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<211> 751<211> 751

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 57<400> 57

9494

9595

9696

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<210> 58<210> 58

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<211> 2316<211> 2316

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 58<400> 58

9797

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<210> 59<210> 59

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<211> 772<211> 772

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 59<400> 59

9898

9999

100100

101101

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<210> 60<210> 60

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<211> 2259<211> 2259

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<212> ADN<212> DNA

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 60<400> 60

102102

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<210> 61<210> 61

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<211> 753<211> 753

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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<400> 61<400> 61

103103

104104

105105

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<210> 62<210> 62

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<211> 8<211> 8

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sintética<223> Sequence Description Artificial: synthetic

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<400> 62<400> 62

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106106

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<210> 63<210> 63

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<211> 10<211> 10

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sintética<223> Sequence Description Artificial: synthetic

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<400> 63<400> 63

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107107

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<210> 64<210> 64

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<211> 10<211> 10

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sintética<223> Sequence Description Artificial: synthetic

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<400> 64<400> 64

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108108

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<210> 65<210> 65

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<211> 15<211> 15

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sintética<223> Sequence Description Artificial: synthetic

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 65<400> 65

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         \hskip1cm\ hskip1cm
      

109109

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 66<210> 66

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<211> 518<211> 518

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<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 66<400> 66

110110

111111

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 67<210> 67

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<211> 475<211> 475

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

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<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 67<400> 67

112112

113113

114114

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 68<210> 68

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 413<211> 413

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 68<400> 68

115115

116116

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<210> 69<210> 69

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<211> 8<211> 8

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido<223> Sequence Description Artificial: Peptide

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 69<400> 69

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \hskip1cm\ hskip1cm
      

11601160

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 70<210> 70

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 8<211> 8

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido<223> Sequence Description Artificial: Peptide

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 70<400> 70

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \hskip1cm\ hskip1cm
      

117117

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 71<210> 71

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 8<211> 8

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido<223> Sequence Description Artificial: Peptide

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 71<400> 71

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \hskip1cm\ hskip1cm
      

118118

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 72<210> 72

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 8<211> 8

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido<223> Sequence Description Artificial: Peptide

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 72<400> 72

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \hskip1cm\ hskip1cm
      

119119

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 73<210> 73

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 8<211> 8

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

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<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido<223> Sequence Description Artificial: Peptide

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<400> 73<400> 73

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \hskip1cm\ hskip1cm
      

120120

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 74<210> 74

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 38<211> 38

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> ADN<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador<223> Sequence Description Artificial: Primer

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 74<400> 74

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \hskip1cm\ hskip1cm
      

121121

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 75<210> 75

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 57<211> 57

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> ADN<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador<223> Sequence Description Artificial: Primer

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 75<400> 75

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \hskip1cm\ hskip1cm
      

122122

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<210> 76<210> 76

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<211> 15<211> 15

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<212> PRT<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial<213> Artificial Sequence

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<220><220>

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido<223> Sequence Description Artificial: Peptide

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         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip
      

<400> 76<400> 76

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \hskip1cm\ hskip1cm
      

123123

Claims (16)

1. Un procedimiento para evaluar la actividad de la \alpha-secretasa de hu-Asp1, que comprende las etapas de:1. A procedure to evaluate the activity of the α-secretase of hu-Asp1, which comprises the stages of:

(a) (to)

poner en contacto un polipéptido hu-Asp1, que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 95% a un fragmento, que incluye los tripéptidos DTG y DSG del sitio activo de las aspartil proteasas, de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, en el que el polipéptido y el fragmento conservan una actividad de \alpha-secretasa, con el sustrato de la proteína precursora del amiloide (APP) que contiene un sitio de escisión de \alpha-secretasa, ycontact a polypeptide hu-Asp1, which comprises an amino acid sequence at least 95% identical to a fragment, which includes the DTG and DSG tripeptides of the active site of aspartyl proteases, of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, in which the polypeptide and fragment retain an activity of α-secretase, with the protein substrate amyloid precursor (APP) that contains a cleavage site of α-secretase, and

(b) (b)

medir la escisión del sustrato de APP en el sitio de escisión de la \alpha-secretasa de hu-Asp1.measure the cleavage of the APP substrate at the site of α-secretase cleavage of hu-Asp1.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido hu-Asp1 se produce en una célula transformada o transfectada con un polinucleótido que codifica un polipéptido hu-Asp1, según se ha definido en la reivindicación 1.2. A method according to claim 1, in which the hu-Asp1 polypeptide is produced in a cell transformed or transfected with a polynucleotide that encodes a hu-Asp1 polypeptide, as has been defined in claim 1. 3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que el polipéptido hu-Asp1 se purifica y aísla a partir de dicha célula.3. A method according to claim 2, in which the hu-Asp1 polypeptide is purified and isolated from said cell. 4. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de poner en contacto comprende cultivar una célula transfectada o transformada con un polinucleótido que codifica un polipéptido hu-Asp1, según se ha definido en la reivindicación 1, bajo condiciones en las que la célula expresa el polipéptido hu-Asp1 en presencia del sustrato APP.4. A method according to claim 1, in which the step of contacting involves cultivating a cell transfected or transformed with a polynucleotide that encodes a hu-Asp1 polypeptide, as has been defined in claim 1, under conditions in which the cell expresses the hu-Asp1 polypeptide in the presence of the APP substrate. 5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que la célula expresa un sustrato APP que contiene un sitio de escisión de \alpha-secretasa, y en el que el cultivo se lleva a cabo bajo condiciones en las que la célula expresa el polipéptido hu-Asp1 y el sustrato APP.5. A method according to claim 4, in which the cell expresses an APP substrate that contains a site α-secretase cleavage, and in which the culture is carried out under conditions in which the cell expresses the hu-Asp1 polypeptide and the substrate APP 6. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido hu-Asp1 es codificado por un polinucleótido que hibrida bajo condiciones rigurosas con el complemento de SEQ ID NO:1, en el que las condiciones rigurosas son la incubación durante la noche a aproximadamente 42ºC durante aproximadamente 2,5 horas en SSC 6x/SDS al 0,1%, seguido por el lavado de los filtros 4 veces durante 15 minutos en SCC 1,0x a 65ºC, SDS al 0,1%.6. A procedure according to any previous claim, wherein the polypeptide hu-Asp1 is encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with the complement of SEQ ID NO: 1, in which the stringent conditions are incubation during overnight at approximately 42 ° C for approximately 2.5 hours in 6x SSC / 0.1% SDS, followed by washing the filters 4 times for 15 minutes in SCC 1.0x at 65 ° C, 0.1% SDS. 7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido hu-Asp1 carece de un dominio trans-membrana.7. A procedure according to any of the claims 1 to 6, wherein the polypeptide hu-Asp1 lacks a domain trans-membrane 8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que el polipéptido hu-Asp1 carece de los aminoácidos 469-492 de SEQ ID NO:2.8. A method according to claim 7, in which the hu-Asp1 polypeptide lacks the amino acids 469-492 of SEQ ID NO: 2. 9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que el polipéptido hu-Asp1 carece, además, del dominio citoplasmático de los aminoácidos 493-518 de la SEQ ID NO:2.9. A method according to claim 8, in which the hu-Asp1 polypeptide also lacks cytoplasmic domain of amino acids 493-518 of SEQ ID NO: 2. 10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el polipéptido hu-Asp1 carece de los aminoácidos 1-62 de SEQ ID NO:2.10. A procedure according to any of the claims 1 to 9, wherein the polypeptide hu-Asp1 lacks amino acids 1-62 of SEQ ID NO: 2. 11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el sitio de escisión comprende la secuencia de aminoácidos LVFFAEDF o KLVFFAED.11. A procedure according to any of the claims 1 to 10, wherein the cleavage site comprises the amino acid sequence LVFFAEDF or KLVFFAED. 12. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el sustrato APP comprende una isoforma de APP humana, y comprende, además, una di-lisina carboxi-terminal.12. A procedure according to any of the claims 1 to 11, wherein the APP substrate comprises a human APP isoform, and also includes a carboxy-terminal di-lysine. 13. Un procedimiento según la reivindicación 12, en el que la isoforma de APP humana tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:57.13. A method according to claim 12, in which the human APP isoform has a sequence of amino acids selected from SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 57. 14. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el sustrato APP comprende una marca detectable.14. A procedure according to any of the claims 11 to 13, wherein the APP substrate comprises a detectable mark. 15. Un procedimiento según la reivindicación 14, en el que la marca detectable se selecciona de marcas radioactivas, marcas enzimáticas, marcas quimioluminiscentes y marcas fluorescentes.15. A method according to claim 14, in which the detectable mark is selected from radioactive marks, enzymatic brands, chemiluminescent marks and brands fluorescent 16. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el sustrato APP comprende una isoforma de APP humana, y la etapa de medición comprende medir la producción del péptido alfa-amiloide.16. A procedure according to any of the claims 1 to 15, wherein the APP substrate comprises a human APP isoform, and the measurement stage comprises measuring the production of the alpha-amyloid peptide.