ES2327217T5 - Cepa neurovirulenta del virus West-Nile y sus aplicaciones - Google Patents
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Abstract
Cepa aislada del virus West-Nile, caracterizada porque su genoma está constituido por la secuencia SEC ID Nº
Description
Cepa neurovirulenta del virus West-Nile y sus aplicaciones
La presente invención se refiere a una cepa neuroinvasiva y neurovirulenta del virus West-Nile (o virus del Nilo Occidental), denominada IS-98-ST1, a moléculas de ácido nucleico procedentes de su genoma, a las proteínas y péptidos codificados por dichas moléculas de ácido nucleico así como a sus aplicaciones.
La presente invención también se refiere a todas las variantes de la cepa viral IS-98-ST1 que tienen al menos una mutación en la secuencia nucleica correspondiente a NS5.
La familia de los Flaviviridae agrupa a los virus del género flavivirus responsables de patologías humanas graves tales como el dengue, la fiebre amarilla, encefalitis transmitidas por las garrapatas, la encefalitis japonesa, la encefalitis del Nilo Occidental y los virus de las hepatitis C y G. Si los flavivirus pueden provocar una morbilidad y una mortalidad importantes en el ser humano, la infección es generalmente asintomática y solamente una fracción de los individuos infectados desarrolla una enfermedad grave.
Los flavivirus son pequeños virus con envoltura. Su genoma es una molécula de ARN monocatenario de polaridad positiva de aproximadamente 11 000 bases. El ARN genómico se asocia a varias copias de la proteína de cápside C para formar la nucleocápside; esta está rodeada por una envoltura viral constituida por una doble capa lipídica procedente de las membranas del retículo endoplásmico (RE) en las que están ancladas la proteína de envoltura E y la proteína de membrana M. El ARN genómico de los flavivirus contiene un único marco de lectura abierto de aproximadamente 10.500 nucleótidos flanqueado por dos regiones cortas no codificantes en sus extremos 5’ y 3’. El genoma se traduce a una poliproteína de aproximadamente 3.400 aminoácidos que es el precursor de las proteínas estructurales C, prM (el precursor intracelular de M) y E en su parte N-terminal y de al menos siete proteínas no estructurales (NS) de NS1 a NS5 en su parte C-terminal.
Hasta hace muy poco, se reconocía al virus West-Nile como un virus poco patógeno, responsable de un síndromegripal y presente en África, en el sur de Europa y en Oriente Medio; se ha aislado en el transcurso de epidemias, ocurridas particularmente en Israel en los años 1950 y en Sudáfrica en los años 1970.
Muy recientemente, la epidemiología del virus West-Nile se ha modificado y se ha observado un número creciente de casos de encefalitis en el transcurso de las epidemias ocurridas en Rumanía en 1996, en Israel en 1998 y en los EE.UU. en 1999.
Se han aislado cepas patógenas durante estas epidemias (Anderson y col., y Lanciotti y col., Science, 1999, 286: 2331-2333, 2333-2337), en particular la cepa NY1999 (GenBank nº AF202541, Lanciotti y col., mencionado anteriormente), cuya patogenicidad se correlacionará con la presencia de un sitio de glucosilación NTS en la proteína de envoltura E (Jordan y col., Viral Immunol., 2000, 13, 4: 435-446).
Los factores virales mal identificados podrían ser responsables de la gravedad de la infección, mientras que la constitución genética del hospedador (humano o no humano) contribuiría a la resistencia a la infección.
Sin embargo, los datos relativos a estas cepas patógenas aisladas recientemente no han permitido determinar todos los factores virales y los genes del hospedador implicados en la sensibilidad/resistencia a la infección por los Flaviviridae.
Los modelos murinos han permitido establecer la existencia de una resistencia genética a la infección por los flavivirus. Se ha demostrado que algunas líneas de ratón recientemente derivadas del estado silvestre y que pertenecen a las especies Mus musculus musculus o Mus spretus (Det, BSVR, BRVR, PRI, CASA/Rk y CAST/Ei) son resistentes a la infección por los flavivirus, mientras que las líneas consanguíneas de laboratorio más habituales que derivan mayoritariamente de la especie Mus musculus domesticus, no la resisten (Sangster y col., J. Virol., 1993, 67: 340-347).
La resistencia está controlada por al menos un locus autosómico denominado Flv, localizado en el cromosoma 5, en el ratón y tres alelos Flvs, Flvr y Flvmr otorgan respectivamente la sensibilidad, la resistencia y la resistencia intermedia a la infección por los flavivirus. Usando una cepa del flavivirus de la encefalitis del Valle de Murray y de ratones procedentes del retrocruzamiento de la línea de ratón resistente C3H/RV con las líneas de ratón sensibles C3/He o BALB/c, el locus Flv se ha localizado en una región de 0,9 cM del cromosoma 5, en el ratón, entre los marcadores D5Mit68 y D5Mit242 (G.R. Shellam y col., Rev. Sci. Tech. Off. Epiz. 1998, 17: 231-248).
Los autores de la invención han aislado ahora una nueva cepa del virus West-Nile, a partir de muestras extraídas de cigüeñas en Israel (en la ciudad de Eilat) en septiembre de 1998, que se ha seleccionado para el estudio de la resistencia/sensibilidad de un hospedador (mamífero humano o no humano) a la infección por los virus de la familia de los Flaviviridae.
De acuerdo con la invención, dicha cepa neurovirulenta y neuroinvasiva del virus West-Nile aislada, denominada IS-98-ST1, se caracteriza porque su genoma está constituido por la secuencia SEQ ID Nº 1 que codifica una poliproteína que presenta la secuencia SEQ ID Nº 2.
Los autores de la invención demostraron particularmente que los ratones de laboratorio son extremadamente sensibles a la infección por la cepa IS-98-ST1 mientras que los ratones de las líneas SEG, WMP, STF y MAI que derivan de ratones silvestres que pertenecen a especies diferentes aunque del mismo género Mus, son completamente resistentes a la infección por esta cepa; una inoculación por vía intraperitoneal de 1.000 UFF (Unidades Formadoras de Focos; UFF: DL50 = 100) es mortal al 100% para los ratones de laboratorio, mientras que los ratones silvestres no presentan ningún síntoma; además, el virus se replica en estos ratones, como muestra la aparición de anticuerpos séricos específicos.
La presente invención también tiene por objeto reactivos, derivados de la cepa IS-98-ST1, usados para el estudio y el diagnóstico de las infecciones por Flaviviridae, reactivos que se seleccionan entre el grupo constituido por los siguientes reactivos:
- (a)
- una molécula de ácido nucleico elegida entre la secuencia SEQ ID Nº 1, los fragmentos de al menos 15 nucleótidos de la secuencia SEQ ID Nº 1 y las secuencias complementarias de sentido y antisentido de las secuencias precedentes, con exclusión del fragmento que presenta la secuencia GENBANK AF205882.
- (b)
- un vector recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico tal como se define en (a),
- (c)
- una célula transformada por una molécula de ácido nucleico tal como se define en (a), un vector tal como se define en (b) o una cepa neurovirulenta del virus West-Nile tal como se define en (a),
- (b)
- o una cepa neurovirulenta del virus West-Nile tal como se define en (a),
- (d)
- una proteína o un péptido codificado por una molécula de ácido nucleico tal como se define en (a),
- (e)
- un anticuerpo policlonal, que puede obtenerse por inmunización de un mamífero no humano con la cepa IS-98-ST1 del virus West-Nile tal como se ha definido anteriormente; preferentemente, dicho mamífero no humano es un ratón homocigótico para el alelo Flvr, resistente a la infección por Flaviviridae, y
- (f)
- un anticuerpo policlonal o monoclonal, que puede obtenerse por inmunización de un mamífero no humano con un vector recombinante tal como se define en (b) o bien una proteína o un péptido, tal como se definen en (d).
Estos diferentes reactivos se preparan y usan de acuerdo con técnicas clásicas de biología molecular y de inmunología, siguiendo los protocolos convencionales tales como los descritos en Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and Son Inc, Library of Congress, EEUU) y en Current Protocols in Immunology (John E. Coligan, 2000, Wiley and Son Inc. Library of Congress. EEUU).
Los fragmentos de ácidos nucleicos tales como los definidos anteriormente, en particular los correspondientes a las secuencias SEQ ID Nº 3-11 se usan por ejemplo como sonda o como cebador para el diagnóstico de una infección por el virus West-Nile; la infección se detecta por ejemplo por PCR y/o por hibridación, a partir de los ácidos nucleicos extraídos de una muestra biológica tomada de un individuo que puede estar infectado o un animal de laboratorio inoculado con dicho virus.
De acuerdo con una realización ventajosa de dichos fragmentos, estos comprenden al menos 15 nucleótidos de la SEQ ID Nº 1 situados entre 10 y 100 nucleótidos en la dirección 5’ y en la dirección 3’ de uno de los codones en la siguiente posición:
- -
- codón Asparagina (N) en posiciones 2518-2520, correspondiente al resto en posición 17 de la proteína NS1 o en posición 808 de la secuencia SEQ ID Nº 2 (la secuencia de la proteína NS1 se extiende desde los codones en posición 792 a 1144 de la secuencia SEQ ID Nº 2, correspondientes a los nucleótidos 2470 a 3528 de la secuencia SEQ ID Nº 1),
- -
- codón Arginina (R) en posiciones 4018-4020, correspondiente al resto en posición 164 de la proteína NS2A o en posición 1308 de la secuencia SEQ ID Nº 2 (la secuencia de la proteína NS2A se extiende desde los codones en posición 1145 a 1374 de la secuencia SEQ ID Nº 2, correspondientes a los nucleótidos 3529 a 4218 de la secuencia SEQ ID Nº 1),
- -
- codones Glicina (G) en posiciones 4462-4464 y ácido glutámico (E) en posiciones 4465-4467, correspondientes respectivamente al resto en posición 82 y 83 de la proteína NS2B o en posición 1456 y 1457 de la secuencia SEQ ID Nº 2 (la secuencia de la proteína NS2B se extiende desde los codones en posición 1375 a 1505 de la secuencia SEQ ID Nº 2, correspondientes a los nucleótidos 4219 a 4611 de la secuencia SEQ ID Nº 1),
- -
- codones Prolina (P) en posiciones 6097-6099 y ácido glutámico en posiciones 6172-6174, correspondientes respectivamente al resto en posición 496 y 521 de la proteína NS3 o en posición 2001 y 2026 de la secuencia SEQ ID Nº 2 (la secuencia de la proteína NS3 se extiende desde los codones en posición 1506 a 2124 de la secuencia SEQ ID Nº 2, correspondientes a los nucleótidos 4612 a 6468 de la secuencia SEQ ID Nº 1), y
- -
- codones Serina (S) en posiciones 7840-7842, Asparagina (N) en posiciones 8518-8520 y Alanina (A) en posiciones 8794-8796, correspondientes respectivamente al resto en posición 54, 280 y 372 de NS5 o en posición 2582, 2808 y 2900 de la secuencia SEQ ID Nº 2 (la secuencia de la proteína NS5 se extiende desde los codones en posición 2529 a 3430 de la secuencia SEQ ID Nº 2, correspondientes a los nucleótidos 7681 a 10386 de la secuencia SEQ ID Nº 1).
Dichos cebadores son útiles para amplificar fragmentos que contienen dichos codones.
Dichos cebadores están situados entre 10 y 100 nucleótidos en la dirección 5’ o en la dirección 3’ de dichos codones.
De acuerdo con otra realización ventajosa de dichos fragmentos, estos están constituidos por los fragmentos que comprenden los codones mencionados anteriormente, preferentemente entre 50 y 200 nucleótidos, que se amplifican usando los cebadores tales como se han definido anteriormente.
Los autores de la invención también describen fragmentos que comprenden al menos 15 nucleótidos de la SEQ ID Nº 1 en la dirección 5’ o en la dirección 3’ del codón Alanina (A) en posiciones 1117-1119, correspondientes al resto en la posición 51 de la proteína E o en la posición 341 de la secuencia de la poliproteína viral de la secuencia SEQ ID Nº 2 (la secuencia de la proteína E se extiende desde los codones en posición 291 a 791 de la secuencia SEQ ID Nº 2, correspondientes a los nucleótidos 967 a 2469 de la secuencia SEQ ID Nº 1).
Los vectores recombinantes tales como los definidos anteriormente, en particular los vectores de expresión y las células transformadas por dichos vectores de expresión se usan ventajosamente para la producción de las proteínas y de los péptidos correspondientes.
Dichas proteínas y dichos péptidos, que son adecuados para ser reconocidos y/o para inducir la producción de anticuerpos específicos del virus West-Nile, en particular de cepas neurovirulentas, son útiles para el diagnóstico de una infección por un virus West-Nile; la infección se detecta mediante una técnica apropiada, particularmente EIA, ELISA, RIA, inmunofluorescencia a partir de una muestra biológica extraída de un individuo que puede estar infectado o un animal de laboratorio inoculado con dicho virus. Las proteínas y los péptidos tales como los definidos anteriormente también se usan para la búsqueda de socios celulares de estas proteínas virales que pueden estar implicadas en la patogenicidad (neurovirulencia) del virus West-Nile; estos socios se identifican mediante técnicas de inmunoafinidad, por ejemplo por cromatografía en columna de inmunoafinidad.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención son útiles para el diagnóstico de una infección por un virus West-Nile, en particular de las cepas neurovirulentas; la infección se detecta mediante una técnica apropiada, particularmente EIA, ELISA, RIA, inmunofluorescencia a partir de una muestra biológica extraída de un individuo que puede estar infectado o un animal de laboratorio inoculado con dicho virus. Entre estos, los anticuerpos producidos mediante inmunización de ratones Flvr/Flvr con la cepa IS-98-ST1 poseen ventajosamente un valor cuantitativo elevado y una especificidad muy grande por el virus West-Nile.
Las células transformadas de acuerdo con la invención, en particular las células neurales (neuronas y células endoteliales) infectadas por una cepa neurovirulenta tal como se ha definido anteriormente, se usan para identificar los genes procedentes de estas células cuya expresión podría modularse en el transcurso de la infección vírica; estos genes se detectan por ejemplo mediante la tecnología de biochips, de acuerdo con los protocolos clásicos tales como los descritos en Atlas Mouse Arrays (#membranes) ATLASTM NYLON cDNA EXPRESSION ARRAYS (CLONTECH, EEUU).
La presente invención también se refiere a un modelo de estudio no humano de la sensibilidad/resistencia a la infección por un virus de la familia de los Flaviviridae, caracterizado porque comprende al menos una cepa neurovirulenta del virus West-Nile tal como se ha definido anteriormente.
De acuerdo con una realización ventajosa de dicho modelo, este comprende además un ratón homocigótico para el alelo Flvr o Flvs .
La presente invención también tiene por objeto un procedimiento de detección de una infección por un virus West-Nile, caracterizado porque comprende:
- -
- la amplificación de los ARN procedentes de una muestra biológica que se someterá a ensayo con ayuda de los cebadores tales como se han definido anteriormente, y
- -
- la secuenciación del producto de amplificación obtenido.
Dicha detección puede permitir ventajosamente el pronóstico de la gravedad de una encefalitis vírica por virus West-Nile.
La cepa neurovirulenta del virus West-Nile de acuerdo con la invención se usa para el cribado de genes celulares implicados en la resistencia de un mamífero a la infección por un virus de la familia de los Flaviviridae, preferentemente el virus de la hepatitis C.
De manera ventajosa, dicho procedimiento de cribado comprende las siguientes etapas:
-cultivo de células derivadas de un hospedador (humano o no humano) seleccionado por su resistencia o su
sensibilidad a la infección por un Flaviviridae,
-infección in vitro de dichas células por un Flaviviridae, y
-detección de genes expresados de manera diferencial en dichas células infectadas.
De acuerdo con la invención, dicha detección puede comprender el establecimiento del perfil de transcritos o de proteínas a partir de dichas células.
La presente invención también tiene por objeto el uso del modelo tal como se ha definido anteriormente para la clasificación de moléculas activas contra una infección vírica debida a un virus de la familia de los Flaviviridae.
La presente invención se refiere además a un procedimiento de clasificación de moléculas activas contra una infección por un Flavivirus, caracterizado por:
- -
- la puesta en contacto de un cultivo de células eucariotas, procedentes de un mamífero (humano o no humano) sensible a la infección por un Flaviviridae con una suspensión viral de la cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en presencia o en ausencia de la molécula que se va a someter a ensayo, y
- -
- la detección de la amplificación/replicación del virus, mediante cualquier procedimiento conocido (cuantificación del genoma, ARNm, -proteínas, partículas virales).
La presente invención tiene también por objeto una variante de la cepa viral tal como se ha definido anteriormente, caracterizada porque su genoma comprende al menos una mutación en la secuencia nucleotídica correspondiente a la proteína NS5.
Además de las disposiciones anteriores, la invención también comprende otras disposiciones, que se verán en la siguiente descripción, que se refiere a ejemplos de realización del objeto de la presente invención, con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
- -
- las figuras 1A a 1E representan la comparación de la secuencia de aminoácidos de las proteínas virales de la cepa IS-98-ST1 (SEQ ID Nº 2), aislada a partir de cigüeñas (CI) y de la cepa New York (NY99; Genbank AF196835) aislada a partir de flamencos rosa (FLA), durante la epidemia de 1999 en los Estados Unidos,
- -
- la figura 2 representa la cinética de mortalidad y la cinética de aparición de los anticuerpos séricos específicos en ratones sensibles Flvs/Flvs (BALB/c), infectados por la cepa IS-98-ST1 del virus West-Nile,
- -
- la figura 3 representa la cinética de propagación de la cepa IS-98-ST1 en el sistema nervioso central de los ratones sensibles Flvs/Flvs (BALB/c),
- -
- las figuras 4 (A, B y C) representan la cinética de aparición de los antígenos virales en las células Neuro 2a y las neuronas primarias de ratones sensibles (BALB/c) infectados por el virus West-Nile (cepa IS-98-ST1),
- -
- la figura 5 representa la muerte por necrosis de las células Neuro 2a infectadas por el virus West-Nile (cepa IS-98-ST1),
- -
- la figura 6 representa el protocolo experimental usado para precisar la localización del locus Flv en el cromosoma 5 del ratón,
- -
- la figura 7 representa el mapa genético del locus Flv, determinado a partir de ratones sensibles, procedentes del primer retrocruzamiento entre las líneas resistentes (MAI/Pas y MBT/Pas) y las líneas sensibles (C57BL/6 o BALB/c). Los cuadros blancos representan los alelos BALB/c o C57B1/6 y los cuadros negros representan los alelos MAI/Pas
o MBT/Pas,
- -
- la figura 8 representa el mapa genético del locus Flv determinado a partir de los ratones resistentes y sensibles, procedentes del primer retrocruzamiento (BC1) entre las líneas resistentes (MAI/Pas y MBT/Pas) y las líneas sensibles (C57BL/6 y BALB/c). Las líneas grises representan los alelos (BALB/c o C57B1/6) y las líneas negras representan los alelos MAI/Pas o MBT/Pas,
- -
- la figura 9 representa el mapa genético y el mapa físico del locus Flv y la posición del gen OAS en este locus, y
- -
- la figura 10 representa la distribución de los alelos Flv en ratones resistentes y sensibles procedentes del primer retrocruzamiento (BC1) entre las líneas resistentes (MAI/Pas y MBT/Pas) y las líneas sensibles (C57BL/6 y BALB/c).
Se obtuvo un aislado del virus West-Nile (WN) a partir del sistema nervioso central de una cigüeña que manifestaba trastornos neuropatológicos graves, en septiembre de 1998, en Eilat (Israel). La infección de células VERO por este aislado es citolítica y la inmunofluorescencia indirecta con un líquido ascítico de ratón inmunoespecífico del virus West-Nile (suero inmune de referencia WN 8907) es positiva al 100%. El virus producido en células VERO se recogió y amplificó en células de mosquitos AP61 (Després y col., Virol., 1993, 196: 209-219).
El pase 1 (o P1) del virus WN por células AP61 se recogió 3 días después de la infección; posee un valor cuantitativo de 2,5 x 108 UFF/ml (Unidad Formadora de Foco) mediante la técnica de valoración cuantitativa en células AP61 descrita en Després y col. (mencionado anteriormente). El inóculo P1 del virus WN en células AP61 se identificó como la cepa IS-98-ST1.
Se obtuvo un P2 a partir de células AP61 infectadas por la cepa IS-98-ST1. P1 (valor cuantitativo: 6 x 107 UFF/ml). El inóculo P2 de IS-98-ST1 se usa para las pruebas de sensibilidad a la infección vírica en ratones adultos.
Un inóculo viral P3 de la cepa IS-98-ST1 con un valor cuantitativo de 5 x 107 UFF/ml se produjo en células AP61. Una preparación viral altamente purificada, preparada de acuerdo con el protocolo de purificación de flaviviriones descrito en Després y col., 1993) se obtuvo a partir de 20 placas de 150 cm2 de células AP61 recogidas 3 días después de la infección por el inóculo P3 del virus WN cepa IS-98-ST1 (multiplicidad de infección de 0,4). La cepa IS-98-ST1 purificada en gradientes de sacarosa tiene un valor cuantitativo final de 2 x 1010 UFF/ml. Los ARN extraídos de este virus purificado se usan para amplificar los ADNc correspondientes a las proteínas virales C, prM y NS1 o a las secuencias no codificantes en los extremos 5' y 3' del genoma viral.
El genoma viral se extrajo a partir del sobrenadante del cultivo de las células VERO infectadas del ejemplo 1 con ayuda del kit "QIAamp Viral RNA" (QIAGEN), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se amplificaron 6 productos de RT-PCR solapantes a partir de estos ARN usando los cebadores descritos por Lanciotti y col. (mencionado anteriormente). Los extremos 5' y 3' del genoma viral se amplificaron respectivamente con ayuda de los siguientes cebadores:
- -
- 5’ AGTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGACAAAC 3’ (SEQ ID Nº 5), y -5’ AGATCCTGTGTTCTCGCACCACCAGCCAC 3’ (SEQ ID Nº 6).
El ADNc que corresponde a la proteína viral E se amplificó con ayuda de los cebadores 5’ GGATGGATGCT(A/T)GG(G/T)AGCAAC 3’ (SEQ ID Nº 7) y 5’ CCATCCAAGCCTCCACATC 3’ (SEQ ID Nº 8), que hibridan respectivamente en el gen de la proteína M (posiciones 889 a 909 de la secuencia SEQ ID Nº 1) y en el gen de la proteína NS1 (posiciones 2539 a 2557 de la secuencia SEQ ID Nº 1).
Los ADNc obtenidos se purificaron por cromatografía de intercambio iónico y se precipitaron en 2 volúmenes de isopropanol. A continuación se secuenciaron los ADNc en las dos cadenas usando el kit "Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing" (PERKIN ELMER CORP./APPLIED BIOSYSTEM) y los cebadores se separaron por 400 pares de bases en el genoma viral (Lanciotti y col., mencionado anteriormente). La secuenciación se realizó con 0,2 pmoles de ADNc purificado y 30 pmoles de cebadores, siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. El alineamiento de las secuencias se realiza con ayuda del programa CLUSTAL W.
La secuencia genómica completa de la cepa IS-98-ST1 del virus West-Nile corresponde a la secuencia SEQ ID Nº 1.
El alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la cepa IS-98-ST1 (SEQ ID Nº 2) y de la cepa NY99, presentada en la figura 1, muestra que la cepa IS-98-ST1 aislada en Israel en 1998 y la cepa NY-99 aislada en Nueva York en 1999 son muy próximas (divergencia de menos del 0,2% en las secuencias de aminoácidos).
Sin embargo, las diferencias observadas en la cepa IS-98-ST1, respectivamente en las proteínas E (A51), NS1 (N17), NS2A (R164), NS2B (G82, E83), NS3 (P496, E521) y NS5 (S54, N280, A372) son potencialmente responsables de la neurovirulencia y de las propiedades neuroinvasivas observadas con esta cepa y pueden servir como marcador de virulencia del virus West-Nile.
1-La proteína C
El ARN genómico extraído de los viriones IS-98-ST1 purificados en gradientes de sacarosa descritos en el ejemplo 1, con ayuda de la solución RNA PLUS 2 (Q. BIOGEN), se usa como matriz para amplificar la secuencia que codifica la proteína C (aminoácidos 1 a 123) mediante la técnica RT-PCR (kit Titan One Tube RT-PCR; Roche Biochemicals #1939 823).
El par de cebadores usado en la matriz de ARN es el siguiente:
- •
- 5’C/WNV (secuencia de nt 81-117 de la secuencia SEQ ID Nº 1) 5’ TAG CAC GAA GAA TTC GAT GTC TAA AAA CCA GGA GGG 3’ (SEQ ID Nº 11) que contiene el sitio de restricción EcoRI,y
- •
- 3’C/WNV (secuencia anti-sentido de nt 433 a 482 de la secuencia SEQ ID Nº 1) 5’ AAGTTAGCCCGGGTTAATGCTCCTACGCTGGCGATCAGGCCAATCAGGAC 3’ (SEQ ID Nº 4) que contiene el sitio de restricción SmaI.
El ADNc de la proteína C de la cepa IS-98-ST1 (aminoácidos 1 a 123) del virus WN se clonó, por un lado entre los sitios EcoRI y SmaI del plásmido pCI-neo (Promega # E1841) y, por otro lado, entre los sitios KspI y SmaI del plásmido pIVEX 2.4a (Roche).
El plásmido recombinado pCI-C/WN (depositado el 21 de junio 2001 en la Collection Nationale de Culture de Microorganismes del Instituto Pasteur de París, 28, rue du Docteur Roux, 75724, PARIS Cedex 15 con el número 12688) contiene la secuencia completa del gen de la proteína C de la cepa IS-98-ST1 del virus WN entre los promotores T7 y T3. La transcripción in vitro de pCI-C/WN linealizada con NheI bajo la dependencia del promotor T3 sintetiza un ARN de aproximadamente 350 bases complementarias de la secuencia viral genómica. La ribosonda marcada con DIG (digoxigenina) se usa para la detección de los ARN virales de sentido positivo presentes en las células infectadas por el virus WN, mediante la técnica de hibridación in situ, de acuerdo con el protocolo descrito en Després y col. (J. Virol., 1998, 72: 823-829).
El plásmido recombinante pIVEX-C/WN se usa para la producción masiva de la proteína C (aminoácidos 1 a 123) del virus WN en lisado bacteriano (sistema RTS 500 de Roche). La proteína recombinante C producida in vitro posee en su extremo N-terminal una secuencia [His]6 y el sitio de escisión reconocido por la proteasa Xa para permitir, por un lado, su purificación en columna de Ni y, por otro lado, la eliminación de los restos de histidina. La proteína C de la cepa IS-98-ST1 del virus WN producida de este modo se usa para estudios estructurales, para la búsqueda de socios celulares de esta proteína en columna de inmunoafinidad, y para la producción de anticuerpos monoespecíficos en conejo.
2-La proteína M
Los ADNc de la cepa IS-98-ST1 del virus WN que codifican la proteína M (aminoácidos 215 a 290 de la poliproteína viral) o su ectodominio de 41 aminoácidos (aminoácidos 215 a 255; acrónimo ectoM) se clonan:
- (1)
- en fase con el extremo C-terminal de la EGFP en el plásmido p[95-114]EGFP, derivado del plásmido pEGFP-N1 (Clontech) que comprende los restos 95-114 de la proteína C del virus del dengue de tipo 1 (cepa BR/90) fusionados en fase con la secuencia N-terminal de la proteína EGFP[215-290]WNV, para dar el plásmido p [95-114]EGFP[215-290]WNV,
- (2)
- en el plásmido pIVEX (sistema RTS 500 de Roche) para dar el plásmido pIVEX[EGFP][215-255]WNV,
- (3)
- en el vector retroviral TRIPdeltaU3CMV, para dar el plásmido TRIPdeltaU3CMV[95-114]EGFP[215-255] WNV.
El plásmido pIVEX[EGFP][215-255]WNV permite la síntesis acelular y la purificación de la proteína quimérica EGFPectoM WNV que se usa, por un lado, para la producción de anticuerpos monoespecíficos dirigidos contra la proteína M del virus WN y, por otro lado, para la búsqueda de socios celulares de la molécula ectoM WNV en columna de inmunoafinidad.
El plásmido TRIPdeltaU3CMV[95-114]EGFP[215-255]WNV se cotransfecta en células 293T con los plásmidos 8.7 y G-VSV para producir partículas virales pseudotipadas por la envoltura G del virus de estomatitis vesicular (VSV), que contiene las proteínas internas del virus de la inmunodeficiencia adquirida (VIH) y moléculas de ARN quiméricas CMV[95-114]EGFP[215-255]WNV. La infección de las células diana por el vector recombinado no replicativo permite la integración en el genoma celular del ADN CMV[95-114]EGFP[215-255]WNV y la expresión estable del ectodominio de la proteína M-WN bajo el control del promotor CMV.
3-La proteína NS 1
El ARN genómico extraído de los viriones IS-98-ST1 purificados se amplifica mediante la técnica RT-PCR (kit Titan One Tube RT-PCR; Roche Biochemicals #1939 823) con ayuda del siguiente par de cebadores:
- -
- 5’TGGATGGGATCCAATATGCGTGATAGGTCC 3’ (SEQ ID Nº 9) que contiene el sitio de restricción BamHl, y
- -
- 3’AAAAGGGTCAATGGTACCAGCATTTTAAGCATTCACGTT 3’ (SEQ ID Nº 10) que contiene el sitio de restricción KpnI.
El ADNc que codifica la glucoproteína NS1 con su péptido señal (aminoácidos 767 a 1143 de la poliproteína viral) se clona entre los sitios BamHly KpnI del vector retroviral TRIPdeltaU3 para producir el plásmido recombinado TRIPdeltaU3-CMV-NS1-WN (depositado el 9 de enero de 2002 en la Collection Nationale de Culture de Microorganismes del Instituto Pasteur de París, 28 rue du Docteur ROUX, 75724, PARIS Cedex 15 con el número I2770). El plásmido TRIPdeltaU3-CMV-NS1-WN se cotransfecta en células 293T con los plásmidos 8.7 y G-VSV para producir partículas virales pseudotipadas por la envoltura G del virus de estomatitis vesicular (VSV), que contiene las proteínas internas del virus de la inmunodeficiencia adquirida (VIH) y moléculas de ARN quiméricas CMV-NS1-WN. La infección de las células diana por el vector recombinado no replicativo permite la integración en el genoma celular del ADN CMV-NS1-WN y la expresión estable de la proteína NS1 del virus WN bajo el control del promotor CMV. La proteína NS1 de la cepa IS-98-ST1 del virus WN producida de este modo se usa para estudios estructurales, para la búsqueda de socios celulares de esta proteína en columna de inmunoafinidad, y para la producción de anticuerpos monoespecíficos en conejo.
1-Las líneas de ratón y las células sensibles
a) Líneas de ratón sensibles
A ratones de líneas consanguíneas sensibles Flvs (BALB/c) de 6 semanas de edad se les inoculan por vía intraperitoneal 100 UFF de la cepa IS-98-ST1 del virus West-Nile (UFF: DL50 = 10), preparada como se describe en el ejemplo 1.
El 100% de estos ratones muere en un tiempo medio de mortalidad de 9 ± 2 días (Figura 2).
La cinética de propagación de la cepa IS-98ST1 en el sistema nervioso central del ratón sensible (BALB/c) se analizó a partir de extractos de cerebro de ratones infectados valorados cuantitativamente en células AP61, de acuerdo con la técnica descrita en Després y col. (J. Virol., 1998, 72, 823-829). Los resultados muestran que el virus se detecta en el sistema nervioso central (SNC) murino al 5º día de la infección y que la producción viral es máxima al 7º día (Figura 3). Al 9º día de la infección, el virus ya no se detecta en el SNC murino (Figura 3).
La replicación del virus WN en el SNC y los órganos periféricos de los ratones infectados por la cepa IS-98-ST1 también se detecta mediante inmunohistología, de acuerdo con los protocolos clásicos tales como los descritos en Després y col., 1998 (mencionado anteriormente) y mediante hibridación in situ, de acuerdo con los protocolos descritos en el ejemplo 3.
Los anticuerpos séricos específicamente dirigidos contra las proteínas del virus WN se valoran cuantitativamente mediante ELISA de acuerdo con el protocolo descrito en Després y col., 1993 (mencionado anteriormente), usando la cepa IS-98-ST1 purificada en gradiente de sacarosa tal como se describe en el ejemplo 1 como antígeno. Los resultados muestran que los anticuerpos séricos aparecen al 5º día de la infección y se detectan significativamente al 7º día (figura 2).
b) Células sensibles
b1) Cultivos primarios
Neuronas primarias y astrocitos del SNC de ratones sensibles homocigóticos para el alelo Flvs (ratón Swiss, Enero) se preparan de acuerdo con los protocolos clásicos. Las células son infectadas por la cepa IS-98-ST1 a una multiplicidad de infección de 20 UFF por célula (m.i. de 20). El efecto citopático se observa al microscopio óptico, la producción viral se analiza por valoración cuantitativa en células AP61 como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1 y la expresión de los antígenos virales se analiza por radioinmunoprecipitación con ayuda de un suero inmune de ratón anti-West-Nile, de acuerdo con los protocolos clásicos tales como los descritos en Duarte Dos Santos y col. (Virology, 2000. 274: 292-308).
Los resultados muestran que el 80% de las neuronas en cultivo producen los antígenos virales:
- -
- su perfil en gel de poliacrilamida-SDS se presenta en la figura 4A,
- -
- la producción viral es de [3,0 ± 1,5] x 106 UFF/ml después de 20 h de infección y de [7,0 ± 0,5] x 107 UFF/ml a 40 h,
- -
- los efectos citopáticos (ECP) de tipo necrótico se observan después de 48 h de infección vírica.
Por el contrario, los astrocitos del SNC murino no son permisivos a la replicación del virus WN cepa IS-98-ST1.
b2) Líneas celulares
Células de neuroblastoma murino Neuro 2a y células de hepatoma humano HepG2, cultivadas en condiciones clásicas tal como se describen en Marianneau y col. (J. Virol., 1996, 77: 2547-2554) se infectan a diferente multiplicidad de infección por el virus WN cepa IS-98-ST1, preparado como se describe en el ejemplo 1. El efecto citopático se observa al microscopio óptico, la producción viral se analiza mediante valoración cuantitativa en células AP61 como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1 y la expresión de los antígenos virales se analiza por radioinmunoprecipitación con ayuda de un suero inmune de ratón anti-West-Nile, de acuerdo con los protocolos clásicos tales como los descritos en Duarte Dos Santos y col., Virol., 2000, 274, 292-308.
Los resultados muestran que las células de neuroblastoma murino Neuro 2a son permisivas a la replicación de la cepa IS-98-ST1 del virus WN. Es necesaria una m.i. de 4 para infectar el 80% de las células Neuro 2a en monocapa. La producción viral es de 107 UFF/ml (m.i. de 4) después de 40 h de infección y la muerte celular por necrosis es masiva (Figura 5). La cinética de producción de los principales antígenos prM, E y NS1 a partir de la poliproteína viral presentada en la figura 4B muestra que el tiempo necesario para la formación de la mitad de la glicoproteína de la envoltura E es de aproximadamente 30 min. La proteína E de la cepa IS-98-ST1 parece poseer solamente un único resto N-glicano (figura 4C).
Los resultados muestran también que las células de hepatoma humano HepG2 son permisivas a la replicación de la cepa IS-98-ST1 del virus M/N. A una m.i. de 10, la producción viral es de [2 ± 1] x 106 UFF/ml después de 48 h de infección y los ECP se observan a partir de 72 h.
2-Los ratones resistentes
Las líneas de ratones resistentes (Flvr) que derivan de ratones silvestres de la especie Mus spretus (SEG/Pas y STF/Pas), Mus musculus musculus (MBT/Pas, MAI/pas) y Mus musculus domesticus (WMP/Pas), se inoculan por vía intraperitoneal con 1000 UFF (100 DL50) de la cepa IS-98-ST1 preparada de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 1.
Al contrario que los ratones de laboratorio, que son sensibles a la infección por la cepa IS-98-ST1 y mueren en diez días, estos ratones que derivan de ratones silvestres son resistentes a la inoculación de la cepa IS-98-ST1 y, sin embargo, permisivos a la replicación de la cepa IS-98-ST1. En efecto, la infección vírica de ratones que derivan de ratones silvestres es asintomática aunque el virus se multiplica in toto como demuestra la producción de anticuerpos séricos anti-WN a valoraciones cuantitativas altas; en ELISA, las valoraciones cuantitativas de los sueros a la dilución 1: 100 para 106 UFF de virión purificado IS-98-ST1 son superiores a 1 unidad de D.O. a 450 nm.
Los ratones resistentes a la infección vírica se usan para la producción de sueros inmunes específicamente dirigidos contra las proteínas de la cepa IS-98-ST1 del virus WN. Tres semanas después de la inoculación del virus WN, los sueros extraídos de ratones resistentes (0,045 ml por ratón) se mezclan, se descomplementan durante 30 min a 56ºC y después se diluyen a 1: 10 en DPBS* (V/V) suplementado con el 0,2% (V/V) de Albúmina de suero bovino (Life Technologies) y el 0,05% (P/V) de azida sódica. Los sueros diluidos se distribuyen en 0,2 ml y se conservan a -20ºC. Los sueros inmunes dirigidos contra la cepa IS-98-ST1 se usan a las diluciones finales de 1: 500 para la inmunofluorescencia indirecta y a 1: 1000 para la inmunoprecipitación de las proteínas virales radiomarcadas.
Ejemplo 5: Uso de la cepa IS-98-ST1 del virus West-Nile para identificar los genes celulares implicados en la sensibilidad del hospedador a la infección por los virus de la familia de los Flaviviridae.
1) Procedimientos
a) Modelo de análisis de la resistencia a la infección por Flaviviridae (figura 6)
Se cruzan ratones macho de las líneas resistentes MAI/Pas y MBT/Pas con ratones hembra de las líneas sensibles C57BL/6 y BALB/c. Los ratones macho de la generación F1 se retrocruzan con ratones hembra de las líneas sensibles C57BL/6 y BALB/c para dar una generación de ratones de primer retrocruzamiento (BC1).
A ratones BC1 de 5 semanas de edad se les inocula por vía intraperitoneal la cepa IS-98-ST1, preparada de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 1, en las condiciones descritas en el ejemplo 2.
Los animales se observan todos los días y las tasas de mortalidad y de supervivencia se determinan 14 días después de la infección.
b) Genotipado de los alelos Flv
Los alelos Flv de los individuos BC1 se mapearon mediante PCR genómica con ayuda de cebadores específicos de 16 microsatélites del cromosoma 5 (Catalogue Research Genetics) que rodean al locus Flv (figuras 7-9), de acuerdo con las técnicas habituales de biología molecular usando los protocolos convencionales tales como los descritos en Current Prolocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, EE.UU.).
El análisis de la distribución de los alelos Flv en los ratones BC1 sensibles y resistentes a la infección por la cepa IS98ST1 muestra que un alelo Flvr es suficiente para otorgar la resistencia a la infección (figura 10). Los resultados muestran también que en este modelo existe una correlación perfecta entre el fenotipo resistente y la presencia del alelo Flvr y una correlación casi perfecta entre el fenotipo sensible y la ausencia del alelo Flvr (figura 10).
El genotipado de los alelos Flv muestra que el locus Flv se localiza en una región de 0,2 cM que contiene el gen OAS 1 (figuras 7-9).
LISTA DE SECUENCIAS
- <
- 110 > INSTITUT PASTEUR KIMRON VETERINARY INSTITUTE DESPRES Philippe DEUBEL Vincent GUENET Jean-Louis DROUET Marie-Thérèse MALKINSON Mertyn BANET Caroline FRENKIEL Marie-Pascale COURAGEOT Marie-Pierre COULILABY Fasséli CATTEAU Adeline FLAMAND Marie WEBER Patrick CECCALDI Pierre-Emmanuel
- <
- 120 > CEPA NEUROVIRULENTA DEL VIRUS WEST NILE Y SUS APLICACIONES
- <
- 130 > 226CAS93EXT
- <
- 140 >
- <
- 141 >
- <
- 160 > 11
- <
- 170 > PatentIn Ver. 2.1
- <
- 210 > 1
- <
- 211 > 11029
- <
- 212 > ARN
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- 213 > Flavivirus sp.
- <
- 220 >
- <
- 221 > CDS
- <
- 222 > (97)..(10395)
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- 213 > Secuencia artificial
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- 220 >
- <
- 223 > Descripción de la secuencia artificial: CEBADOR OLIGONUCLEOTÍDICO
- <
- 400 > 3
- <
- 211 > 3433
- <
- 212 > PRT 5 < 213 > Flavivirus sp.
- <
- 400 > 2
- <
- 211 > 37
- <
- 212 > ADN
tagcacgaag aattcgatgt ctaagaaacc aggaggg 37
- <
- 210 > 4
- <
- 211 > 50
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- 212 > ADN
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- 213 > Secuencia artificial
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- 220 >
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- 223 > Descripción de la secuencia artificial: CEBADOR OLIGONUCLEOTÍDICO
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- 400 > 4
aagttagccc gggttaatgc tcctacgctg gcgatcaggc caatcaggac 50
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- 210 > 5
- <
- 211 > 28
- <
- 212 > ADN
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- 213 > Secuencia artificial
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- 220 >
- <
- 223 > Descripción de la secuencia artificial: CEBADOR
- <
- 400 > 5
agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaac 28
- <
- 210 > 6
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- 211 > 29
- <
- 212 > ADN
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- 213 > Secuencia artificial
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- 220 >
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- 223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador
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- 400 > 6 agatcctgtg ttctcgcacc accagccac 29
- <
- 210 > 7
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- 211 > 21
- <
- 212 > ADN
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- 213 > Secuencia artificial
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- 220 >
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- 223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador
- <
- 400 > 7 ggatggatgctwggkagc aac 21
- <
- 210 > 8
- <
- 211 > 19
- <
- 212 > ADN
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- 213 > Secuencia artificial
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- 220 >
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- 223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador
- <
- 400 > 8 ccatccaagc ctccacatc 19
- <
- 210 > 9
- <
- 211 > 30
- <
- 212 > ADN
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- 213 > Secuencia artificial
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- 220 >
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- 223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador
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- 400 > 9 tggatgggat ccaatatgcg tgataggtcc 30
- <
- 210 > 10
- <
- 211 > 39
- <
- 212 > ADN
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- 213 > Secuencia artificial
- <
- 220 >
- <
- 223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador
- <
- 400 > 10 aaaagggtca atggtaccag cattttaagc attcacgtt 39
- <
- 210 > 11
- <
- 211 > 36
- <
- 212 > ADN
- <
- 213 > Secuencia artificial
- <
- 220 >
- <
- 223 > Descripción de la secuencia artificial: cebador
- <
- 400 > 11 tagcacgaagaattcgatgtctaaaaaccaggaggg 36
Claims (20)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Cepa aislada del virus West-Nile, caracterizada porque su genoma está constituido por la secuencia SEQ ID Nº 1.
-
- 2.
- Molécula de ácido nucleico, caracterizada porque se selecciona entre el grupo constituido por la secuencia SEQ ID Nº 1 y la secuencia complementaria anti-sentido de la secuencia SEQ ID Nº 1.
-
- 3.
- Fragmento de la molécula de ácido nucleico de secuencia SEQ ID Nº 1, caracterizado porque se selecciona entre el grupo constituido por los cebadores que comprenden al menos 15 nucleótidos de dicha secuencia situados entre 10 y 100 nucleótidos más arriba o más abajo de uno de los codones correspondientes a las siguientes posiciones en la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1:
-codón Asparagina en posiciones 2518-2520 (posición 17 de la secuencia de aminoácidos de la proteína NS1), -codón Arginina en posiciones 4018-4020 (posición 164 de la secuencia de aminoácidos de la proteína NS2A), -codones Glicina en posiciones 4462-4464 y ácido glutámico en posiciones 4465-4467 (posiciones 82 y 83 de la secuencia de aminoácidos de la proteína NS2B), -codones Prolina en posiciones 6097-6099 y ácido glutámico en posiciones 6172-6174 (posiciones 496 y 521 de la secuencia de aminoácidos de la proteína NS3), y -codones Serina en posiciones 7840-7842, Asparagina en posiciones 8518-8520 y Alanina en posiciones 8794-8796 (posiciones 54, 280 y 372 de la secuencia de aminoácidos de la proteína NS5). -
- 4.
- Fragmento de la molécula de ácido nucleico de secuencia SEQ ID Nº 1, caracterizado porque se selecciona entre el grupo constituido por los fragmentos, preferentemente entre 50 y 200 nucleótidos, amplificados usando los cebadores de acuerdo con la reivindicación 3.
-
- 5.
- Vector recombinante, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
-
- 6.
- Célula eucariota aislada, caracterizada porque se transforma con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, un vector de acuerdo con la reivindicación 5 o una cepa neurovirulenta del virus West-Nile de acuerdo con la reivindicación 1.
-
- 7.
- Proteína o péptido, caracterizado porque está codificado por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
-
- 8.
- Uso de la cepa de acuerdo con la reivindicación 1, para la obtención de un anticuerpo policlonal, mediante inmunización de un mamífero no humano.
-
- 9.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque dicho mamífero no humano es un ratón homocigótico para el alelo Flvr de resistencia a la infección por los virus de la familia de los Flaviviridae.
-
- 10.
- Uso de un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 o bien de una proteína o de un péptido, de acuerdo con la reivindicación 7, para la obtención de un anticuerpo policlonal o monoclonal mediante inmunización de un mamífero no humano.
-
- 11.
- Modelo de estudio no humano de la sensibilidad/resistencia a la infección por un virus de la familia de los Flaviviridae, caracterizado porque comprende al menos una cepa neurovirulenta del virus West-Nile de acuerdo con la reivindicación 1.
-
- 12.
- Modelo de estudio de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende además un ratón homocigótico para el alelo Flvr o Flvs .
-
- 13.
- Procedimiento de detección de una infección por Flaviviridae, particularmente por el virus West Nile, caracterizado porque comprende:
- -
- la amplificación de los ARN procedentes de una muestra biológica que se someterá a ensayo usando como cebadores moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, y
- -
- la secuenciación del producto de amplificación obtenido.
-
- 14.
- Procedimiento de cribado de genes celulares implicados en la resistencia de un mamífero a la infección por un virus de la familia de los Flaviviridae, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
-cultivo de células derivadas de un hospedador (humano o no humano) seleccionado por su resistencia o su sensibilidad a la infección por un Flaviviridae, -infección in vitro de dichas células por la cepa neurovirulenta del virus West-Nile de acuerdo con la reivindicación 1, -detección de genes expresados de manera diferencial en dichas células infectadas. -
- 15.
- Uso del modelo de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, para la clasificación de moléculas activas contra una infección vírica debida a un virus de la familia de los Flaviviridae.
-
- 16.
- Procedimiento de clasificación de moléculas activas contra una infección por un Flavivirus, caracterizado por:
-la puesta en contacto de un cultivo de células eucariotas, procedentes de un mamífero sensible a la infección por un Flaviviridae con una suspensión viral de la cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en presencia o en ausencia de la molécula que se someterá a ensayo, y -detección de la replicación del virus. -
- 17.
- Variante de la cepa viral de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque su genoma comprende al menos una mutación solamente en la secuencia nucleotídica correspondiente a la proteína NS5.
-
- 18.
- Molécula de ácido nucleico, caracterizada porque se selecciona entre el grupo constituido por las secuencias SEQ ID Nº 3-11.
-
- 19.
- Procedimiento de detección de una infección por el virus West Nile, caracterizado porque comprende:
-la amplificación de los ARN o ADN procedentes de una muestra biológica que se someterá a ensayo usando como cebadores moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 3, -la detección del producto obtenido. -
- 20.
- Kit de detección de una infección por un flavivirus que comprende al menos: fragmentos de la molécula de ácido nucleico de SEQ ID Nº 1 tal como se definen en la reivindicación 3, -reactivos para visualizar la reacción de hibridación entre dichas moléculas de ácidos nucleicos y el ADN o el ARN presente en la muestra que se someterá a ensayo.
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