ES2326174T3 - Gen quimerico que codifica los determinantes antigenicos de cuatro proteinas de l. infantum. - Google Patents
Gen quimerico que codifica los determinantes antigenicos de cuatro proteinas de l. infantum. Download PDFInfo
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Abstract
Composición farmacéutica para la prevención y tratamiento de la Leishmaniasis en humanos y animales comprendiendo: a. una proteína Q que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID Nº. 1 o que tiene al menos el 90% de identidad de los aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 1 y que genera una respuesta inmunitaria contra la Leishmaniasis combinada con b. la proteína LiHsp70 completa o fragmentada.
Description
Gen quimérico que codifica los determinantes
antigénicos de cuatro proteínas del L. Infantum.
La presente descripción se refiere a una
solicitud de Patente de Invención, que se refiere a un gen
quimérico formado por las secuencias de ADN que codifican los
determinantes antigénicos de cuatro proteínas de L.
infantum, y a proteínas codificadas por dicho gen quimérico,
útiles para la prevención o el tratamiento de la leishmaniasis, en
particular la leishmaniasis canina. El objetivo obvio de esta
invención se basa en usar la secuencia de genes o la proteína
obtenida del gen quimérico para suministrar composiciones
farmacéuticas para prevenir o tratar la leishmaniasis, en particular
la Leishmaniasis canina, que puede estar presente en el cuerpo de
un paciente, por ejemplo como una vacuna o una preparación del
anticuerpo monoclonal. Este paciente no tiene que ser un perro sino
que puede también ser un ser humano que padezca enfermedades que
implican la inmunodepresión. Para conseguir este objetivo, se
producirá un gen quimérico el cual codifica una proteína llamada PQ
que consiste en un producto quimérico que se origina a partir de
una síntesis "in vitro" de un gen quimérico construido
"ad hoc", que contiene cinco de los determinantes
antigénicos de cuatro proteínas diferentes. El producto está
configurado como altamente sensible y es específico para, por
ejemplo, generar una respuesta inmunológica protectora contra la
Leishmaniasis canina, o para preparar anticuerpos contra la
Leishmaniasis canina.
Esta invención es de utilidad dentro de la
industria dedicada a la producción de productos farmacéuticos en
general.
Los protozoos parasitarios del género de la
Leishmania son los agentes etiológicos que causan la Leishmaniasis,
una gama de enfermedades que tienen una distribución mundial y que
están caracterizadas porque dan lugar a una amplia variedad de
síntomas clínicos.
Las formas principales de Leishmaniasis son
zoonóticas en la naturaleza y los seres humanos están considerados
como huéspedes secundarios.
Las especies denominadas L. Infantum,
ampliamente distribuidas por muchas áreas mediterráneas es la causa
de la Leishmaniasis visceral (LV) en los seres humanos y
perros.
De hecho, los perros infectados con L.
Infantum son la principal reserva animal de este parásito,
particularmente durante el periodo de una larga incubación antes de
que los síntomas clínicos puedan ser observados.
Los datos epidemiológicos indican que hay una
correlación directa entre la prevalencia de la Leishmaniasis canina
y la transmisión del parásito a los seres humanos. Por esta razón,
es crucial detectar la enfermedad o infección pronto en campañas
emprendidas para controlar la extensión de la enfermedad.
El parásito es transmitido al huésped vertebrado
como un promastigoto flagelado, mediante la picadura de una mosca
de la familia "Phlebotominae", y el parásito introduce las
células de los fagos mononucleares en las cuales se diferencian y
se reproducen como amastigotos, dentro de la estructura
fagolisosómica.
Las células infectadas se acumulan en ciertos
tejidos, principalmente bazo, hígado y ganglios linfáticos. Se
estima que alrededor de 15 millones de personas están infectadas
por Leishmaniasis, y cada año en el mundo aparecen 500.000 casos
clínicos nuevos, principalmente en el mundo subdesarrollado y en
vías de desarrollo.
En los países sudoccidentales de Europa, la
Leishmaniasis visceral (VL), es una enfermedad zoonótica provocada
por las especies de L. Infantum, como se ha mencionado antes.
Los datos recientes derivados de estudios epidemiológicos indican
que hay una incidencia inquietante de esta infección.
En Italia los datos proporcionados sobre la
incidencia de LV varía entre el 14,4% y el 37% según la región.
En Portugal, más particularmente en la región
alrededor de Lisboa, se han encontrado índices seropositivos del
8,4% y en la región de los Alpes marítimos franceses se han
encontrado centros diferentes de prevalencia que varían entre el
3,2% y el 17,1%.
En España, la prevalencia de Leishmaniasis
depende de la zona en estudio. En Cataluña un índice de promedio de
incidencia del 9,3% ha sido observado aunque en algunos focos se ha
encontrado una prevalencia de perros infectados de hasta un
18%.
En la Isla de Mallorca, el indice de incidencia
es del 14%, y otros índices que han sido encontrados son: el 2,4%
en Murcia, el 8,8% en Granada, el 10 al 15% en Salamanca, el 5,25%
en la provincia de Madrid, y el 14% en Cáceres.
Aunque el número de casos de LV en seres humanos
provocado por L. Infantum puede ser considerado
relativamente bajo, el alto porcentaje de pacientes con
inmunodepresión que han sido infectados por Leishmania podría estar
relacionado con el nivel elevado de esta enfermedad en los
perros.
De hecho, en el sur de Europa, el 50% de los
adultos que son infectados por Leishmaniasis son también pacientes
infectados por el virus del VIH. En cambio, según estos datos de
coinfección de Leishmania y VIH, se ha estimado que el nivel de
infección (por parásitos) puede ser una o dos veces mayor que esta
figura debido a la existencia de un gran número de infecciones no
detectadas.
Una característica común de los diferentes tipos
de infección por Leishmania es que ésta induce una respuesta
humoral fuerte en el huésped. En consecuencia, se utilizan
habitualmente de forma más amplia los métodos diagnósticos basados
en técnicas serológicas.
Se ha descrito que estos anticuerpos son
detectados incluso durante la fase asintomática de la enfermedad en
infecciones naturales y experimentales.
La sensibilidad y especificidad de estos métodos
dependen del tipo, fuente y pureza del antígeno empleado en los
procesos inmunológicos que son comercializados habitualmente, los
promastigotos completos y las preparaciones más o menos preparadas
a partir de estos son usadas como una fuente de antígeno. Este
método normalmente conduce a reacciones cruzadas con suero de
pacientes que padecen lepra, tuberculosis, tripanosomiasis
africana, enfermedad de Chagas, malaria y otras parasitosis.
La sensibilidad y especificidad de los métodos
serológicos dependen del tipo, fuente y pureza del antígeno
empleado. Durante los últimos años un gran número de antígenos de
Leishmania han sido caracterizados, algunos de éstos pueden ser
considerados como proteínas específicas del parásito.
Entre estas proteínas específicas del parásito,
la proteasa de superficie GP63, la glicoproteína de superficie gp46
y la proteína KMP-11 asociada al lipofosfoglicano
merecen ser nombradas.
Un grupo adicional de antígenos de Leishmania se
forma a partir de proteínas conservadas evolutivamente, tales como
la quinesina, proteínas inducidas térmicamente, actina y
tubulina.
Como parte de una estrategia para desarrollar un
sistema diagnóstico serológico específico para la Leishmaniasis
canina, se ha emprendido un proyecto de laboratorio para
identificar los antígenos de L. Infantum, mediante una
búsqueda por inmunodetección de una genoteca de expresión para genes
de L. Infantum que usan suero de perro con Leishmaniasis
visceral activa.
Se ha observado que la mayor parte de los
antígenos aislados por este método pertenecen a la familia de
proteínas conservada durante el transcurso de la evolución. La
identificación de epítopos B de estos antígenos indican, no
obstante, que todos los casos los determinantes antigénicos estaban
localizados en regiones que no estaban bien conservadas.
En particular, las proteínas ribosómicas
acídicas LiP2a y LiP2b son reconocidas por más del 80% de los
sueros de VL.
Se ha confirmado que estas proteínas contienen
determinantes antigénicos específicos de enfermedades, y que las
proteínas recombinantes LiP2a y LiP2b, en las que se ha eliminado
un fragmento, podrían ser usadas como instrumento específico capaz
de distinguir entre LV y la enfermedad de Chagas.
También se ha mostrado que la proteína
ribosómica PO de L. Infantum, muy conservada en la escala
evolutiva, está reconocida por un alto porcentaje de sueros de LV
de perro.
Además, los determinantes antigénicos son
encontrados exclusivamente en el C-término de la
proteína, es decir, en la región que ha sido mal conservada durante
el transcurso de la evolución.
Se ha observado que el 78% de los sueros de LV
de perro, anticuerpos contra la proteína H2A están también
presentes, y ha sido confirmado que a pesar de la identidad de las
secuencias en todas las proteínas H2A entre organismos
eucarióticos, la respuesta humoral para esta proteína en sueros de
LV está particularmente provocada por determinantes específicos para
la proteína H2A de Leishmania.
Los determinantes antigénicos reconocidos por
los sueros de LV de perro se encuentran en ambos terminales de la
proteína H2A.
La solución obvia para el problema encontrado de
forma habitual en esta técnica sería tener una invención que
permita el ensamblaje de un gen quimérico sintético que contenga
las regiones del ADN que codifican los determinantes antigénicos
específicos para las proteínas LiP2a, LiP2b, LiPO, y H2A, con el
propósito de construir una proteína rica en determinantes
antigénicos.
No obstante, por lo que el solicitante sabe, no
hay hasta ahora ninguna invención que contenga las características
descritas como ideales, con el propósito de alcanzar el objetivo
deseado. Este objetivo es la construcción de una proteína rica en
determinantes antigénicos, procedente del ensamblaje de un gen
sintético quimérico, que contiene las regiones del ADN que codifican
los determinantes antigénicos específicos para las proteínas
mencionadas.
En un primer aspecto, la invención se refiere a
un gen quimérico formado por las secuencias de ADN que codifica los
determinantes antigénicos de cuatro proteínas de L.
infantum, útiles para prevenir o tratar la Leishmaniasis
canina.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
proteína codificada por el gen quimérico, que contiene uno o más de
los determinantes antigénicos de cuatro proteínas de L.
infantum codificadas por el gen quimérico.
La invención también se refiere a un método para
prevenir y/o tratar la Leishmaniasis canina en un ser humano o en
un animal. En este método terapéutico, el gen quimérico de la
invención o la proteína codificada por éste pueden ser usados.
También, los anticuerpos contra la proteína codificada por el gen
quimérico de la invención, o una parte antigénica de la misma tal
como un epítopo, pueden ser usados.
En otros aspectos, la invención se refiere a
composiciones farmacéuticas para la prevención y el tratamiento, en
seres humanos o animales, de la Leishmaniasis, que comprende una
sustancia activa derivada de o dirigida contra el gen quimérico de
la invención y/o la proteína codificada por éste, o partes de la
misma. La sustancia activa es preferiblemente tal que puede ser
usada en una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la
prevención de la Leishmaniasis.
En particular, la composición farmacéutica
estará en forma de una vacuna, conteniendo la proteína codificada
por el gen quimérico de la invención, o una o varias partes de la
misma, conteniendo uno o varios determinantes antigénicos de la
proteína codificada por el gen quimérico de la invención.
Así, en un aspecto adicional, la invención se
refiere a una composición farmacéutica para la prevención y el
tratamiento, en un ser humano o animal, de la leishmaniasis
formada:
a) por la proteína Quimera Q, o una variante de
esta proteína conteniendo modificaciones o sustituciones de
aminoácidos conservados administrados a un sujeto (humano o
animal), o
b) por la proteína Q en una forma aislada o
combinada con un adyuvante fisiológico por la vía intraperitoneal,
subcutánea o intramuscular.
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La invención se refiere también a una vacuna que
es capaz de estimular la producción de anticuerpos que reconocen el
parásito de la Leishmania, formado
a) por la proteína Quimera Q o una variante de
esta proteína que difiere de la proteína Q en los aminoácidos
conservados, administrada a un sujeto (humano o animal), o
b) por la proteína Q en una forma aislada o
combinada con un adyuvante fisiológico por la vía intraperitoneal,
subcutánea o intramuscular.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, la invención se refiere a una
composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, humano o
animal, de la leishamiosis formada
a) por la proteína Q, o una variante de esta
proteína conteniendo modificaciones o sustituciones de los
aminoácidos conservados, combinada con la proteína LiHsp70,
completa o fragmentada, administrada a un sujeto (humano o animal),
o
b) por la proteína Q en forma aislada o
combinada con un adyuvante fisiológico por la vía intraperitoneal,
subcutánea o intramuscular.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición farmacéutica para la prevención y el tratamiento, en un
ser humano o animal, de la leishmaniasis, formada
a) por un vector de ADN que contiene la
secuencia que codifica para la proteína Quimera Q, o una variante
de esta secuencia que contiene modificaciones o sustituciones de
nucleótidos que codifican para los aminoácidos conservados,,
administrados a un sujeto (humano o animal), o
b) por un vector de ADN que contiene la proteína
Q combinada con un adyuvante fisiológico, administrado por la vía
intraperitoneal, subcutánea o intramuscular.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, humano o
animal, de la leishmaniasis, formada
a) por cualquier vector de ADN que contiene:
- 1)
- la secuencia que codifica para la proteína Quimera Q, o una variante de esta secuencia que contiene modificaciones o sustituciones de nucleótidos que codifican para los aminoácidos conservados, y
- 2)
- la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína LiHsp70 o variantes de la misma que difiere con respecto de los aminoácidos conservados, administrados a un sujeto (humano o animal), o
b) por cualquier vector que contiene la
secuencia de ADN que codifica para la proteína Q como se define
bajo a) administrado con un adyuvante fisiológico, por la vía
intraperitoneal, subcutánea o intramuscular.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización, la composición
farmacéutica de la invención comprende anticuerpos dirigidos a la
proteína codifica por el gen quimérico de la invención, o partes de
la misma.
Las preparaciones farmacéuticas de la invención
pueden además contener todos los adyuvantes conocidos, solventes,
tampones, etc. conocidos per se para composiciones
farmacéuticas y/o vacunas.
En otro aspecto adicional, la invención se
refiere a un método para el tratamiento o la prevención de la
Leishmaniasis, usando una composición farmacéutica o una vacuna
según la invención, o una preparación comprendiendo anticuerpos
dirigidos contra la proteína codificada por el gen quimérico de la
invención.
Este método generalmente comprenderá la
administración de una sustancia activa dirigida contra el gen
quimérico o la proteína a un ser humano o animal, tal como un pero,
en una cantidad farmacéuticamente activa.
Para la prevención de la Leishmaniasis, una
vacuna que comprende la proteína codificada por el gen quimérico, o
que codifica una o varias partes de dicha proteína comprendiendo
uno o varios de los determinantes antigénicos, será administrada a
un ser humano para obtener una respuesta inmunitaria
protectora.
La administración de las preparaciones,
anticuerpos y/o vacunas de la invención pueden ser realizadas en
cierto modo conocido per se, tal como por vía oral,
intramuscular, intravenosa, subcutánea, por infusión (goteo)
etc..
Preferiblemente, la preparación o una vacuna es
inyectada, mientras que con una preparación de anticuerpos, se
puede usar una infusión.
Debe ser notado que cuando se hace referencia en
la presente al gen gen quimérico de la invención, este término
también incluye las secuencias de ácidos nucleicos que pueden
hibridarse con la secuencia mencionada más abajo bajo condiciones
de hibridación moderadas o severas.
En este contexto, las condiciones de hibridación
heterólogas pueden ser las siguientes: hibridación en 6 x SSC
(20xSSC por 1000 ml: 175,3 g NaCl, D 107,1 g de citrato sódico.
5H2O, pH 7.0), 0,1% SDS, 0,05% pirfosfato sódico, 5* solución de
Denhart (100 x solución de Denhart por 500 ml: 10 g
Ficoll-400, 10 g de polivinilpirrolidona, 10 g de
Albúmina de Suero Bovino (Fracción V de Pentax) y 20 \mug/ml de
ADN esperma de arenque desnaturalizado a 56ºC durante
18-24 hrs seguido de dos lavados de 30 min. en 5 x
SSC, 0,1% SDS a 56ºC y dos lavados de 30 min. en 2 x SSC, 0,1% SDS a
56ºC.
Por ejemplo, las secuencias que pueden
hibridarse con la secuencia mencionada más abajo incluyen las
secuencias mutantes de ADN que codifican las proteínas con la misma
función biológica que la proteína codificada por la secuencia
mencionada más abajo.
Tales secuencias mutantes pueden comprender una
o más delaciones de nucleótidos, sustituciones y/o adiciones a la
secuencia mencionada más abajo. Preferiblemente, las secuencias
mutantes continúan teniendo al menos el 50%, más preferiblemente al
menos el 70%, incluso más preferiblemente más del 90% de homología
de nucleótidos con la secuencia dada a continuación.
El término gen quimérico como se utiliza en este
caso también incluye secuencias de ácidos nucleicos que comprenden
una o más partes de la secuencia mencionada a continuación.
Preferiblemente, tales secuencias comprenden al
menos 10%, más preferiblemente al menos 30%, más preferiblemente al
menos 50% de la secuencia de nucleótidos dada a continuación. Tales
secuencias pueden comprender un fragmento contiguo de la secuencia
mencionada a continuación, o dos o más fragmentos de la secuencia
dada abajo que ha sido combinada en y/o incorporada en una
secuencia de ADN única.
Debe ser notado que cuando aquí, se hace
referencia a una proteína codificada por el gen quimérico de la
invención, este término también incluye proteínas mutantes que
además tienen esencialmente la misma función biológica. Tales
proteínas mutantes pueden comprender una o más deleciones,
sustituciones y/o adiciones de aminoácidos en comparación con la
proteína codificada por la secuencia mencionada más abajo.
Preferiblemente, las proteínas mutantes
continúan teniendo al menos el 50%, más preferiblemente al menos el
70%, incluso más preferiblemente más del 90% homología de
aminoácidos con la secuencia dada a continuación.
El término proteína también incluye fragmentos
de la proteína codificada por el gen quimérico de la invención.
Tales fragmentos preferiblemente continúan
mostrando la actividad biológica de la proteína completa.
Preferiblemente, tales proteínas comprenden al menos el 30%, más
preferiblemente al menos el 50% de la secuencia de aminoácidos de
la proteína completa. También, dos o más fragmentos de la proteína
completa codificados por el gen quimérico de la invención pueden ser
combinados para formar una proteína única.
Más específicamente, la invención se refiere a
un gen quimérico formado por las secuencias de ADN que codifican
los determinantes antigénicos de cuatro proteínas de L.
Infantum, que codifican una proteína útil para fines
farmacológicos, en particular para la prevención y/o tratamiento de
Leishmaniasis, en particular la Leishmaniasis canina, y obteniendo
el producto final o la construcción del gen quimérico que codifica
un polipéptido que contiene todos los determinantes antigénicos
seleccionados, caracterizado porque éste usa una estrategia de
clonación en la que el clon que expresa la proteína
rLiPO-Ct-Q se usa como vector
inicial, y para este vector, mediante el uso de lugares de
restricción adecuados, se añaden de forma secuencial fragmentos de
ADN que codifican las proteínas LiP2a-Q,
LiP2b-Q, LiH2A-Ct-Q,
LiH2A-Nt-Q, y después de cada fase
de clonación se deduce la orientación correcta de cada uno de los
insertos y el tamaño de los productos de la expresión, la secuencia
deducida completa de aminoácidos de la proteína de fusión final,
pPQV, expresada en el vector pMal es:
La invención también se refiere a una
composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, en seres
humanos o animales, de Leishmaniasis formada:
a) por la proteína Quimera Q, o una variante de
esta proteína que contiene modificaciones o sustituciones de
conservado aminoácidos, administradas a un sujeto (humano o
animal), bien
b) en forma aislada o junto con cualquier
adyuvante fisiológico por medio de las vías intraperitoneal,
subcutánea o intramuscular.
\vskip1.000000\baselineskip
También, la invención se refiere a una vacuna
capaz de estimular la producción de anticuerpos que reconocen el
parásito de Leishmania, formado
a) por la proteína Quimera Q o una variante de
esta proteína que difiere de la proteína Q en aminoácidos
conservados administrados a un sujeto (humano o animal), bien
b) en forma aislada o junto con cualquier
adyuvante fisiológico por medio de las vías intraperitoneal,
subcutánea o intramuscular.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la invención comprende una
composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, en seres
humanos o animales, de Leishmaniasis formada:
a) por la proteína Q, o una variante de esta
proteína que contiene modificaciones o sustituciones de aminoácidos
conservados, vinculadas a la proteína LiHsp70, completa o
fragmentada, administrada a un sujeto (humano o animal), bien
b) en forma aislada o junto con cualquier
adyuvante fisiológico por medio de las vías intraperitoneal,
subcutánea o intramuscular.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra composición farmacéutica de la invención
para la prevención y tratamiento, en seres humanos o animales, de
leishmaniasis puede estar formada:
a) por cualquier vector de ADN que lleva la
secuencia que codifica la quimera de proteína Q, o una variante de
esta secuencia que contiene modificaciones o sustituciones de
nucleótidos que codifican para aminoácidos conservados,
administrados a un sujeto (humano o animal), bien
b) por las vías intramuscular o subcutánea.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto adicional, la invención se
refiere a una composición farmacéutica para la prevención y
tratamiento, en seres humanos o animales, de Leishmaniasis
formada:
a) por cualquier vector de ADN que lleva
1-la secuencia que codifica la proteína Quimera Q,
o una variante de esta secuencia que contiene modificaciones o
sustituciones de nucleótidos que codifican para aminoácidos
conservados, y 2- la secuencia que codifica la proteína LiHsp70, o
variantes de la misma que difieren en los aminoácidos conservados,
que se administra a un sujeto (humano o animal), bien
b) por la vía intramuscular, subcutánea o
intramuscular.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también se refiere a una secuencia
de nucleótidos y a una proteína útil para fines farmacológicos, en
particular para la prevención y/o tratamiento de Leishmaniasis, en
particular Leishmaniasis canina, que tiene la secuencia de ADN y de
aminoácidos como se muestra abajo expresada en el vector PQ31. La
secuencia de aminoácidos contiene un fragmento del vector (AA
1-37). El resto de la secuencia de aminoácido es
idéntica a aquella de la SEC ID NO 3 excepto en la fracción MBP y
los siete primeros aminoácidos (AA 1-7):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página
siguiente)
SEC ID Nº1 Y SEC ID Nº
2
o un mutante o fragmento del mismo
que puede ser usado para generar una respuesta inmunitaria
protectora en un humano o animal contra la Leishmaniasis, y a una
composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, en seres
humanos o animales, de la Leishmaniasis, comprendiendo esta
proteína o un mutante o fragmento de la misma que se puede usar
para generar una respuesta inmunitaria protectora en un humano o
animal contra la Leishmaniasis. Esta proteína es derivada de la
inserción del gen PQV en el vector de expresión pQE31. Aquí dicho
gen quimérico preferiblemente codifica un polipéptido generado con
un peso molecular de 38 kD y un punto isoeléctrico de
7.37.
\vskip1.000000\baselineskip
También, la invención se refiere a una vacuna
capaz de estimular la producción de anticuerpos que reconocen el
parásito de Leishmania, que comprende la proteína mencionada arriba
o un mutante o fragmento de la misma que pueden ser usados para
generar una respuesta inmunitaria protectora en un humano o animal
contra la Leishmaniasis.
Otro aspecto de la invención comprende una
composición farmacéutica para la prevención y tratamiento, en seres
humanos o animales, de Leishmaniasis, comprendiendo anticuerpos
dirigidos contra la proteína mencionada arriba o un mutante o
fragmento de la misma, preferiblemente conteniendo uno o varios
determinantes antigénicos tal como un epítopo.
\newpage
La invención también se refiere a un método para
la prevención o tratamiento de la Leishmaniasis en un humano o
animal, comprendiendo la administración al humano o animal de una
composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente, o a un
método para prevenir la Leishmaniasis en un humano o animal,
comprendiendo la administración al humano o animal de una vacuna
como se ha descrito anteriormente.
El gen quimérico formado de las secuencias de
ADN que codifican los determinantes antigénicos de cuatro proteínas
de L. Infantum y la proteína, obtenida útil para prevenir
y/o tratar la Leishmaniasis, que la invención propone, en su propio
derecho constituye una evidente novedad dentro de su ámbito de
aplicación, ya que, según la invención, un gen sintético quimérico
es producido el cual como es obtenido por ensamblaje, conteniendo
la región de ADN que codifica los determinantes antigénicos
específicos a las proteínas LiP2a, LiP2b, LiPO y H2A, así
construyendo una proteína rica en determinantes antigénicos. El gen
quimérico obtenido es expresado en Escherichia coli y el
producto ha sido analizado con respecto a sus propiedades
antigénicas. Los resultados confirman que esta proteína quimérica
mantiene todos los determinantes antigénicos de las proteínas
parentales y que ello constituye un elemento pertinente
farmacéuticamente útil para la LV canina, con una sensibilidad que
oscila entre el 80% y el 93%, y una especificidad de entre el 96% y
el 100%.
Más particularmente, el gen quimérico formado
por las secuencias de ADN que codifican los determinantes
antigénicos de cuatro proteínas de L. Infantum y la proteína
codificada por él, útil para la prevención y/o el tratamiento de la
Leishmaniasis canina y la proteína obtenida objeto de la invención,
es producido mediante los estadios siguientes, es decir:
- -
- Construcción del gen quimérico. Metodología.
- Estrategia de clonación.
- Clonación de las secuencias de ADN que codifican los determinantes antigénicos de la proteína histona H2A.
- Clonación de las secuencias que codifican rLiP2a-Q y rLiP2b-Q.
- Clonación de la secuencia rLiPO-Q.
- Clonación del gen quimérico.
- -
- construcción del gen quimérico a partir de la construcción de productos intermedios.
- Clonación de epítopos específicos para los antígenos de L. infantum.
- -
- Construcción del producto final
- Construcción del gen quimérico que codifica un polipéptido que contiene todos los determinantes antigénicos seleccionados.
- -
- opcionalmente expresión de la secuencia así obtenida.
- -
- Evaluación del producto final.
- \quad
- Sueros.
- \quad
- Purificación de proteínas
- \quad
- Electroforesis de proteínas e inmunoanálisis.
- \quad
- Mediciones por Fast-ELISA
- -
- Evaluación del producto final.
- \quad
- Propiedades antigénicas.
\vskip1.000000\baselineskip
La sensibilidad y especificidad de la proteína
quimérica CP en la diagnosis del suero de LV canina.
La estrategia seguida de la clonación de las
secuencias de ADN que codifican cada uno de los determinantes
antigénicos seleccionados es la misma en cualquier caso, y en una
primera fase, la secuencia de interés es amplificada mediante una
PCR y el uso de oligonucleótidos específicos que contienen
objetivos para las enzimas de restricción en los extremos.
Para la fase de clonación, el producto
amplificado es dirigido mediante la enzima de restricción apropiada
y es insertado en el centro de restricción correspondiente del
plásmido pUC18.
Después de la secuenciación del ADN, el inserto
es recuperado y subclonado para el centro de restricción
correspondiente del plásmido modificado denominado
pMAL-c2. La modificación se hace por la inserción de
un codón de terminación descendente del objetivo HindIII en el
poliligador de pMal-c2, denominando al plásmido
resultante pMAL-c2*.
Con respecto a la clonación de la secuencia de
ADN que codifica los determinantes antigénicos de la proteína
histona H2A, debe ser señalado que el ADNc del clon cL71, que
codifica la histona H2A de L. Infantum, se usa como molde
para las reacciones de la PCR, y para la amplificación del ADN, que
codifica la región N-terminal de la histona H2A, más
exactamente rLiH2A-Nt-Q, los
oligonucleótidos siguientes son usados:
Las secuencias que están incluidas en los
oligonucleótidos para la clonación y que no están presentes en la
secuencia madre cL-71 están marcadas con letras en
negrita.
El fragmento de ADN amplificado es clonado
directamente a partir del centro de restricción XmnI de
pMAI-c2*.
El fragmento es ordenado mediante el iniciador
#1234 malE y la región C-terminal antigénica de la
histona H2A, en particular
rLiH2A-Ct-Q, es amplificada con los
oligonucleótidos siguientes. Estos son:
Un triplete que codifica prolina (indicado como
GGG después de las letras subrayadas) está incluido en el
oligonucleótido sin sentido, el sitio de restricción EcoRI incluido
en ambos oligonucleótidos para la clonación está indicado por
subrayado.
Con respecto a la clonación de las secuencias
que codifican rLiP2a-Q, debe ser señalado que las
regiones de interés son amplificadas por PCR de los ADNcs que
codifican LiP2a y LiP2b.
Los oligonucleótidos que son usados para
construir el clon de expresión LiP2a-Q, son los
siguientes.
Se debe señalar que los sitios de restricción
SalI añadidos a los extremos 5' de los oligonucleótidos han sido
subrayados.
Al construir el clon de expresión
LiP2b-Q, los oligonucleótidos usados fueron:
En los extremos 5' de los oligonucleótidos los
sitios de restricción son incluidos para la enzima XbaI
(subrayada), y debido a la clonación necesita un triplete adicional
que codifique un residuo de prolina, incluido hacia abajo del sitio
de restricción.
\newpage
Con respecto a la clonación de la secuencia
rLiPO-Q, debe ser señalado que se realiza la
clonación de la secuencia de ADN de la región
C-terminal de la proteína PO de L. Infantum
amplificando un clon de ADNc llamado L27 y los oligonucleótidos
siguientes:
El clon resultante es denominado pPQI y se debe
destacar que el sitio de restricción PstI está incluido en el
nucleótido con sentido (secuencia subrayada) y que el objetivo de
restricción HindIII está presente en el L27 de ADNc.
Con respecto a la clonación del gen quimérico,
se debe señalar que las secuencias de ADN que codifican los cinco
determinantes antigénicos están ensamblados en un gen quimérico, y
este ensamblaje se realiza en el clon pPQI, al cual se añaden las
regiones de codificación para las regiones antigénicas
LiP2a-Q de forma secuencial en la dirección 3'
(llamando a los resultados de la clonación pPQII),
LiP2b-Q (clon pPQIII),
LiH2a-Ct-Q (clon pPQIV) y
LiH2A-Nt-Q (clon pPQV).
Finalmente, el inserto obtenido después de la
digestión con SacI+HindIII del clon final pPQV es insertado en el
plásmido de expresión pQE31, llamando al clon resultante pPQ.
Para completar la descripción que está siendo
realizada y con el fin de ayudar a la comprensión de las
características de la invención, la presente descripción está
acompañada, como parte íntegra de la misma, por un grupo de planos
de naturaleza ilustrativa sin ser limitativos. Lo siguiente está
representado:
Fig 1. Corresponde a la expresión (A), la
purificación en columnas de amilosa (b) y la antigenicidad (C:
Western blot; D: ELISA) de cada una de las proteínas recombinantes
fusionadas a la proteína de enlace a la maltosa. La figura D
también presenta la reactividad en ELISA de cada una de las
proteínas recombinantes con respecto a la proteína completa.
Fig 2. Representación gráfica de los vectores
diferentes considerados para obtener el gen quimérico objeto de la
invención, donde la proteína pertinente destinada a llevar a cabo
un diagnóstico preciso en animales o seres humanos que muestran
síntomas de Leishmaniasis será extraída.
Fig 3. Corresponde a la identificación de la
proteína obtenida del gen quimérico fusionado a la proteína MBP,
cuya preparación está representada en la figura 2.
Fig 4. Corresponde a la expresión (A), la
purificación en columnas de amilosa (B) y la antigenicidad (C:
Western blot; F: ELISA) de los productos intermedios y de la
proteína quimérica final fusionada a proteína de enlace a la maltosa
(PQI- PGV). La figura también representa la expresión de la
proteína quimérica (D fila 1), purificación en columnas de agarosa
Ni-Nt (D fila 2) y la antigenicidad de la proteína
purificada contra un suero de LV (E: Western blot) y contra una
recogida de sueros (F: PQ en ELISA).
Fig 5. Muestra finalmente una representación
gráfica sintetizada de la reactividad de una amplia variedad de
sueros caninos, divididos en tres grupos. El primer grupo contiene
animales con verdadera infección por L. Infantum. El segundo
grupo incluye suero obtenido de perros con varios síntomas clínicos
pero que no están infectados con Leishmania, y un tercer grupo se
compone de quince sueros de control de perros saludables. Esta
figura demuestra el valor de la invención para llevar a cabo la
diagnosis serológica de LV.
El gen quimérico formado a partir de las
secuencias de ADN que codifican los determinantes antigénicos de
cuatro proteínas de L. Infantum, útiles para la diagnosis
serológica de la Leishmaniasis canina y la proteína obtenida
propuesta están constituidos por la construcción de productos
intermedios. En un primer ejemplo, se realiza la clonación de
epítopos específicos para los antígenos de L. Infantum, que
está configurada en base a estudios anteriores sobre las
propiedades antigénicas de cuatro antígenos de proteínas de L.
Infantum (LiP2a, PiPO, LiP2b, LiH2a), que permiten la
existencia de epítopos B para ser definidos para estas proteínas, y
que son reconocidos específicamente por los sueros caninos de
LV.
\newpage
Con el propósito de mejorar la especificidad
antigénica de estos antígenos con respecto a las proteínas de L.
Infantum, los determinantes antigénicos específicos son
clonados a partir de estas proteínas. Después de eliminar ciertas
regiones de estas proteínas, éstas pueden ser reconocidas por
sueros de animales que son portadores de LV y otras enfermedades
diferentes.
Usando los oligonucleótidos específicos y la
amplificación por PCR de regiones específicas para los genes LiP2a,
LiP2b, Po y H2A, diferentes clones son construidos los cuales
expresan las proteínas recombinantes
rLiPO-Ct-Q,
rLiP2a-Q, rLiP2b-Q,
rLiH2A-Ct-Q y
rLiH2A-Nt-Q, recién detalladas en la
descripción de la invención con respecto a la metodología, donde se
han descrito los detalles de la clonación.
Las proteínas recombinantes usadas son las
siguientes rLiPO-Ct-Q, que
corresponde a los 30 residuos C-terminales de la
proteína ribosómica LiPO.
- -
- rLiP2a-Q y rLiP2b-Q, que son derivados de las proteínas ribosómicas LiP2a y LiP2b respectivamente.
- -
- dos subregiones de la histona H2A, que corresponden a los 46 residuos del N-término (xLiH2A-Nt-Q), y a los 67 residuos del C-término (residuos (xLiH2A-Ct-Q).
Cada una de las proteínas recombinantes
fusionadas a la proteína de enlace a la maltosa (MBP) es expresada
en E. coli, según está representado en la figura número IA,
y éstas fueron purificadas por cromatografía de afinidad en una
columna de amilosa B. Después del proceso de purificación, se
efectuó la electroforesis en las proteínas recombinantes (filas 1 a
5).
Con el objetivo de analizar si las proteínas
recombinantes fueron reconocidas por sueros caninos de LV, se
incubó un Western blot, que contenía las proteínas recombinantes en
una mezcla de tres sueros caninos de LV. Suponiendo que todas estas
proteínas son reconocidas por los sueros, se concluye que los
determinantes antigénicos presentes en las proteínas madres se
mantienen en las proteínas recombinantes (C).
Las propiedades antigénicas de las proteínas
recombinantes son comparadas con los determinantes antigénicos de
los antígenos parentales mediante un FAST ELISA, realizando la
prueba contra una recogida de 26 sueros caninos de LV, justo como
está mostrado en la sección de la figura número 1D, y el hecho de
que los sueros mostrasen un valor de reactividad similar, contra
las regiones antigénicas seleccionadas y las proteínas completas
correspondientes, demuestra que no ha ocurrido ninguna alteración
en el epítopo antigénico durante el procedimiento de clonación.
Con respecto a la construcción del producto
final, más exactamente del gen quimérico que codifica un
polipéptido que contiene todos los determinantes antigénicos
seleccionados, se debe señalar que la estrategia de la clonación
está indicada según la figura 2 sección A.
Los productos intermedios generados durante el
proceso están mostrados.
Un clon que expresa las proteínas
rLiPO-Ct-Q (pPQI) se usa como el
vector inicial, y los fragmentos de ADN que codifican las proteínas
rLiPO-Ct-Q,
rLiP2a-Q, rLiP2b-Q,
rLiH2A-Ct-Q y
rLiH2A-Nt-Q son añadidos de forma
secuencial usando los sitios de restricción apropiados.
Después de cada fase de la clonación, la
orientación correcta de cada uno de los insertos es deducida a
partir del tamaño de los productos de la expresión, y finalmente la
secuencia de nucleótidos completa del clon final pPQV es
determinada y la secuencia de aminoácidos es deducida de la
secuencia representada en la figura número 3.
El polipéptido generado tiene una masa molecular
de 38 kD, con un punto isoeléctrico de 7,37, incluyendo las
secuencias separadoras que codifican la prolina, subrayadas en la
figura número 3.
El objetivo de hacer esto es separar eficazmente
los dominios antigénicos y prevenir conformaciones terciarias
posibles que podrían interferir con la estabilidad y la
antigenicidad del producto final.
La expresión y recuperación de cada uno de los
productos intermedios está mostrada en la figura número 4, cuadros
A y B. Según estaba previsto, después de cada adición, el tamaño
del producto de la expresión en el vector pMAL aumenta gradualmente
hasta alcanzar un peso molecular de 80 kDa, observando un cierto
grado de rotura durante la purificación.
El gen quimérico fue también clonado en el
plásmido pQE, un vector que permite la expresión de las proteínas
con un fragmento de 6 histidinas en el N-término
extremo. El clon resultante y las proteínas recombinantes se
denominan pPQ y PQ respectivamente.
El nivel de expresión de la proteína en las
bacterias transformadas con el plásmido pPQ y las proteínas
purificadas está mostrado en la figura número 4, referenciado en
particular con una D, con la proteína PQ, purificada por
cromatografía de afinidad en condiciones de desnaturalización es más
estable que con la proteína recombinante pPQV representada en la
figura número 4, en el cuadro D fila 2.
Para evaluar el producto final, se usó una serie
de materiales, y obviamente algunas técnicas, según está descrito a
continuación.
Se usan sueros de LV obtenidos de perros de
diferentes orígenes. Los animales son evaluados clínicamente y
analíticamente en el laboratorio pertinente, generalmente en un
Departamento de Parasitología, y todos los sueros positivos son
evaluados para la inmunofluorescencia indirecta (IIF).
La presencia de amastigotos de los parásitos de
estos animales está confirmada por observación directa de los
ganglios linfáticos poplíteos y preescapulares, y a un segundo grupo
de 33 sueros de LV originados en otras regiones, se le dio una
diagnosis positiva en la ELISA contra los extractos proteínicos del
parásito y/o por IIF.
Los sueros de perros afectados por enfermedades
diferentes distintas de la LV son obtenidos a partir de distintos
orígenes. Dentro de este grupo, se encuentran sueros de las
infecciones siguientes:
- Mesocestoides spp.
- Dyphylidium caninum
- Uncinaria stenocephala
- Toxocara canis
- Dipetalonema dranunculoides
- Demodex canis
- Babesia canis
- Ehrlichia cannis
- Ricketsia ricketsiae.
El resto de los sueros fueron obtenidos a partir
de perros que mostraron varios síntomas clínicos que no estaban
relacionados con ningún proceso infeccioso, y los controles del
suero fueron obtenidos a partir de quince animales saludables
controlados cuidadosamente.
La purificación de las proteínas recombinantes
expresadas por los clones pMAI-c2 se realiza por
cromatografía de afinidad en columnas de amilosa, y la purificación
de la proteína recombinante expresada por el clon pPQ fue realizada
en columnas de resina Ni-NTA en condiciones de
desnaturalización (Qiagen).
Para analizar las proteínas, se efectuó una
electroforesis en geles de poliacrimida al 10% en presencia de SDS
bajo condiciones estándares. El análisis inmunológico de las
proteínas separadas por electroforesis se efectuó en las membranas
de la nitrocelulosa a las que las proteínas habían sido
transferidas. Las proteínas transferidas fueron bloqueadas con el 5%
de leche desnatada en polvo en un tampón PBS con el 0,5% de Tween
20.
Los filtros fueron consecutivamente puestos en
contacto con antisuero primario y secundario en soluciones de
bloqueo y uno inmunoconjugado marcado con peroxidasa fue usado como
segundo anticuerpo, visualizando el enlace específico mediante un
sistema ECL. La Figura 4E muestra un Western blot de la proteína
PQ.
Se usó una Fast-ELISA en vez de
la ELISA clásica, y la activación del antígeno se efectuó durante
12 horas a la temperatura ambiente.
Las placas fueron sensibilizadas con 100 \mul
de antígeno cuya concentración en cualquier caso fue de 2
pg/ml.
Después de sensibilizar los pocillos las placas
fueron incubadas durante 1 hora con la solución de bloqueo (0,5% de
leche desnatada en polvo disuelta en PBS - 0,5% de Tween 20 y los
sueros fueron diluidos trescientas veces en la solución de
bloqueo).
Los pocillos fueron incubados con suero durante
2 horas a la temperatura ambiente, y después de la exposición de
los anticuerpos los pocillos fueron lavados con
PBS-Tween 20.
Los anticuerpos marcados con peroxidasa fueron
usados como segundos anticuerpos a una dilución de 1:2000 y el
color de la reacción fue desarrollado usando la ortofenilendiamina
del sustrato, midiendo la absorción a 450 nm.
En cuanto a la evaluación del producto final,
debe ser señalado que las propiedades antigénicas fueron
determinadas mediante el estudio pertinente de la reactividad de
los sueros caninos de LV contra la proteína quimérica y contra cada
uno de los productos intermedios en un ensayo "Western blot".
Todos los productos intermedios mantuvieron su antigenicidad al
igual que lo hizo el producto pPQV final, en todo el proceso de
clonación (Fig. 4C).
También debería ser señalado que la proteína
recombinante expresada por el plásmido pPQ fue reconocida por los
sueros de LV. Con el propósito de analizar con mayor precisión las
propiedades antigénicas de la proteína quimérica y los productos
intermedios, un análisis de la reactividad de una amplia variedad
de sueros caninos de LV fue realizado mediante una
fast-ELISA contra las proteínas recombinantes, como
se muestra en la sección F de la figura número 4. Se puede subrayar
que la sensibilidad de los diferentes productos intermedios de la
clonación aumenta después de cada fase de adición. También debería
ser señalado que la proteína pQI es reconocida por la mayor parte
de los sueros de LV y la proteína PQII igualmente por la mayor
parte de los sueros. Esta proporción es superior para la proteína
PQIII y las proteínas PQIV, PQV y PQ son reconocidas prácticamente
por todos los sueros.
Según lo mencionado anteriormente, el porcentaje
de reconocimiento mostrado por los sueros fue similar tanto en el
caso de la evaluación de las proteínas quiméricas PQV y PQ, como en
el de la evaluación de una mezcla de proteínas recombinantes rLiPO-
Ct-Q, rLiP2a, rLiP2b y rLiH2A. Se constató que las
propiedades antigénicas de cada una de las 5 regiones antigénicas
seleccionadas están presentes en el producto de la expresión PQ, y
en consecuencia este producto puede ser usado para el diagnóstico
en vez de una mezcla de los antígenos expresados
individualmente.
Para determinar si la proteína quimérica puede
ser usada para la diagnosis del suero de la LV canina, y según el
análisis pertinente de una amplia variedad de sueros caninos contra
esta proteína, teniendo en cuenta las características clínicas de
los animales, los sueros caninos han sido clasificados en tres
grupos. Un primer grupo consistió en sueros de perros con una
verdadera infección por L. infantum. Un segundo grupo estaba
compuesto por sueros de perros que tenían varios síntomas clínicos
sin estar infectados con Leishmania, incluyendo perros infectados
con parásitos diferentes a la Leishmania, y que podrían mostrar
síntomas clínicos que podrían ser confundidos con aquellos
observados durante la Leishmaniasis.
El tercer grupo estaba constituido por sueros de
control, originados a partir de perros saludables.
En la figura número 5 los valores de reactividad
de promedio están mostrados para cada grupo de sueros, la
reactividad de los sueros de la LV alcanzando un valor de
reactividad de promedio de 0,8 (S.D. = 0,4).
Dentro de este grupo la reactividad de 12 sueros
fue positiva pero inferior a 0,35, mientras que la reactividad de
10 sueros alcanza valores de entre 0,35 y 0,5. Se observó que la
reactividad de 23 sueros varía entre 0,5 y 1,0, con 14 sueros que
muestran una reactividad superior a 1,0.
El valor de absorción de promedio de los sueros
del segundo grupo, es decir, el grupo infectado con parásitos
diferentes a los parásitos de la Leishmania, es 0,2 (S.D. = 0,05) y
la reactividad de los sueros de control, es decir, el tercer grupo,
es 0,1 (S.D. = 0,003). Sólo dos sueros del grupo 2 mostraron
reactividad entre 0,35 y 0,40.
Los datos presentados arriba indican que la
proteína quimérica PQ en la FAST ELISA tiene una sensibilidad del
80% para la diagnosis de la LV, si se define el valor de corte como
el valor de la reactividad de promedio de los sueros del grupo 2
más tres S.D.'s (es decir 0,35).
La sensibilidad del grupo evaluado alcanza el
93%, si el valor de corte está definido por los valores de la
reactividad del grupo de control. La proteína Q tiene una
especificidad del 96% para la diagnosis de la LV, cuando el valor
de corte está definido por los sueros mencionados del grupo 2. El
100% de la especificidad en el ensayo fue alcanzado al considerar
los valores de la reactividad de perros saludables.
El proceso que se debe usar es el siguiente:
1. Las placas de microtitulación están cubiertas
con anticuerpos por 100 \mul incubados de una solución que
contiene 1 \mug/ml de antígeno disuelto en un tampón PBS - 0,5%
de Tween 20 - 5% de leche desnatada (Tampón A).
La incubación se realiza durante 12 horas a la
temperatura ambiente, y luego las placas son lavadas tres veces con
el mismo tampón que no contiene ningún antígeno. Las placas
antigenadas secas podrían ser mantenidas a la temperatura
ambiente.
2. Una primera incubación de los pocillos se
efectuó con el suero del animal a una dilución de 1/200 en el
Tampón A. La incubación duró 1 hora.
3. Los pocillos son lavados con el tampón A,
según se describe en el punto 1, tres veces con un matraz de
lavado.
4. Se incuban con un segundo anticuerpo (IgG
marcado con peróxido) diluido 1:2000 en el tampón A, llevando a
cabo la incubación durante 1 hora.
5. Los pocillos son lavados otra vez con el
tampón A tres veces, como se indicó en la tercera sección, es decir
con un matraz de lavado.
6. La reactividad es revelada usando la
ortofenilendiamina del sustrato y la absorción medida a 450 nm.
\newpage
La proteína usada para la diagnosis extraída del
gen quimérico es identificada, y la secuencia de nucleótidos que
codifica dicha proteína, siendo las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
(SEC ID Nº1 y SEC ID Nº
2)
\vskip1.000000\baselineskip
No se considera necesario el hecho de extender
esta descripción puesto que un experto en la técnica puede entender
el objetivo de la invención y las ventajas que ésta confiere.
Los materiales, forma, tamaño y disposición de
los elementos son susceptibles al cambio, siempre que ello no
suponga un cambio en la esencia de la invención.
Los términos en los cuales esta descripción ha
sido escrita deberían siempre ser considerados de naturaleza amplia
y no limitativos.
\vskip1.000000\baselineskip
La inmunidad intensa después de la recuperación
de Leishmaniasis cutánea ha supuesto un gran impulso para el
desarrollo de vacunas profilácticas contra esta enfermedad. Esta
inmunidad está derivada de la inducción de una respuesta T a la
cual se asocia la producción de citoquinas inflamatorias que
activan los macrófagos y destruyen los parásitos. La memoria
inmunológica en los casos de infección es probablemente mantenida
por la presencia persistente del parásito en el huésped en un
proceso conocido como inmunidad concomitante.
Los primeros estudios con respecto a la
vacunación contra la Leishmania en la década de los 40
usaban parásitos vivos como inmunogenes. Estos estudios condujeron
a la producción de vacunas que producían una protección
significante contra una posterior reinfección. No obstante, el
conocimiento de la posibilidad de que los organismos vivos podrían
producir verdaderas infecciones condujo a que tales programas de
vacunación no se realizaran durante mucho tiempo y, por el
contrario, el interés se centró en vacunas basadas en parásitos
muertos. Estos estudios proporcionaron la primera evidencia de la
posibilidad de producir vacunas eficaces por inoculación de
parásitos.
Las vacunas de subunidades se han centrado
fuertemente en antígenos proteínicos porque estos son fáciles de
identificar, aislar y clonar. No obstante, es preciso tener en
cuenta que no todas las moléculas de la vacuna potencial han de ser
proteínas. De hecho, el lipofosfoglicano (LPG) juega un papel
esencial en el establecimiento de la infección.
Un problema más importante en el uso de
subunidades puede surgir a partir del hecho de que puede no haya
una respuesta a un único antígeno en una población diversa
genéticamente.
La vacunación con ácidos nucleicos portadores de
genes que codifican proteínas de Leishmania implica la
administración de material genético del parásito al huésped.
El primer vector de ADN para ser administrado
como vacuna contenía el gen gp63. También, el gen
PSA-2 ha sido introducido en un plásmido y se ha
observado que genera una respuesta Th-1 y la
inducción de protección.
Una proteína artificial denominada Q ha sido
recientemente descrita por nuestro grupo, la cual está compuesta
por diferentes fragmentos antigénicos de 4 proteínas de
Leishmania infantum (más específicamente, Lip2a, Lip2b, Po y
H2A), las cuales, después de ser usadas como antígeno, ha demostrado
tener un valor importante para la diagnosis de la Leishmaniasis
canina, con un 93% de sensibilidad y un 100% de especificidad en
comparación con sueros de animales de control sin infectar.
Igualmente, nuestro grupo ha demostrado que la proteína hsp70 de
Leishmania infantum es un objetivo importante de la
respuesta inmunitaria en infecciones provocadas por infección con
este parásito.
Con el objetivo de explorar la posibilidad de
que la proteína Q pueda ser usada para diseñar sistemas de
protección contra la infección por Leishmania infantum,
tanto por sí misma como en combinación con Hsp70, tres series de
experimentos fueron diseñadas usando el hámster como modelo. Un
experimento fue diseñado para controlar si la inmunización con la
proteína Q protegía a los animales contra la infección a corto
plazo, otro para comprobar si la inmunización los protegía a largo
plazo y el tercero fue realizado para comprobar este efecto
protector después de la inmunización con las dos proteínas juntas.
Después se observó tanto a partir del análisis a corto plazo como
del análisis a largo plazo, que la proteína Q era capaz de suscitar
una respuesta inmunitaria que reduce la carga parasitaria tanto en
el hígado como en el bazo tras la infección por Leishmania
Infantum en la mayor parte de los animales inmunizados, y que
la inmunización con las proteínas Q+Hsp70 también inducía una
respuesta significante contra ambas proteínas y conducía a una
reducción significante de la carga parasitaria en la mayoría de los
animales inmunizados.
4 animales fueron inmunizados con 5 microgramos
de proteína Q disueltos en 40 microlitros de adyuvante de Freund, y
otros 4 animales fueron inmunizados con la misma cantidad de
adyuvante emulsionada con 40 microlitros de solución salina PBS sin
la proteína. En la primera inmunización, el adyuvante de Freund
completo fue empleado combinado con la proteína, mientras que en
las dos inmunizaciones posteriores, se usó el adyuvante de Freund
incompleto mezclado con la proteína en la misma proporción de
proteína/adyuvante. Tres inmunizaciones intraperitoneales fueron
realizadas en intervalos de 15 días. Empezando desde la semana
después de cada inmunización y durante todo el periodo de
inmunización, se extrajeron muestras de sangre para medir la
respuesta humoral contra la proteína Q en ensayos ELISA. Se observó
que ya en la segunda semana después de la inmunización hubo una
respuesta IgG positiva contra la proteína Q, y que esta respuesta
fue alta después de la segunda semana tras la infección, y
aumentaba con el tiempo de inmunización alcanzando títulos de
1/100.000. Igualmente, se observó que la respuesta inmunitaria
contra la proteína Q no fue modificada significativamente después
de la infección con el parásito Fig. 1.
Quince días después de la inmunización, los
animales fueron infectados con una dosis de 105 parásitos
promastigotos, diferenciados de amastigotos infecciosos originados
a partir de un hámster infectado. Se ha comprobado previamente que
el inóculo era capaz de inducir una parasitemia fuerte con la
enfermedad cuatro meses después de haberse administrado a los
parásitos, en el 100% de los animales infectados. La Tabla 1 indica
el nivel de parasitemia por mg de tejido tanto en el hígado como en
el bazo del los animales de control y vacunados. Es posible
observar que en todos los animales vacunados la carga parasitaria en
el hígado decrece con respecto a los controles, y que esto ocurre
de forma muy significante en el 75% de ellos. Cuando la carga
parasitaria en el bazo es examinada, es posible observar que también
en el 75% de los animales esta carga fue inferior
significativamente que la de los animales de control,
la RPL alcanzando el 83%-86%. El animal donde la RPL fue del 20% en el hígado, tuvo una del 48% en el bazo.
la RPL alcanzando el 83%-86%. El animal donde la RPL fue del 20% en el hígado, tuvo una del 48% en el bazo.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
1
Carga parasitaria en el hígado y bazo de
hámsters vacunados con proteína Q por vía intraperitoneal. Después
de cuatro semanas de infección, la carga parasitaria fue medida por
el método de diluciones limites (corto plazo). La carga parasitaria
está expresada como parásitos por miligramo de tejido. RPL =
reducción en la carga parasitaria
en %.
en %.
Hámster inmunizado con la
proteína
Q
Para verificar el efecto de la vacunación con la
proteína Q en la reducción de la carga parasitaria a largo plazo,
usando otra vía de inoculación, 4 animales fueron inyectados
subcutáneamente con 5 microgramos de proteína Q disueltos en 40
microlitros de PBS y mezclados con 40 microlitros de adyuvante de
Freund. En la primera inmunización, se empleó adyuvante completo de
Freund, mientras que en las dos posteriores, se usó adyuvante de
Freund incompleto como se ha indicado anteriormente. La vacunación
fue administrada en tres dosis separadas en intervalos de 15 días.
Quince días después de la inmunización se les administró un inóculo
de 105 parásitos infecciosos. Durante todo el periodo de la
inmunización y durante toda la infección (cinco meses) se extrajo
sangre para determinar el tipo de respuesta humoral contra la
proteína Q y contra las proteínas totales del parásito. La Figura 2
muestra que ya después de la segunda semana de inmunización, la
respuesta contra la proteína Q fue positiva, como en el caso
anterior, en tres de los ratones, y que la respuesta contra la
proteína fue altísima después de dos semanas desde la primera
inmunización. La respuesta siguió siendo altísima después de las
inmunizaciones restantes, alcanzando una concentración de 1/75.000
en la semana después de la tercera inmunización. En uno de los
animales la respuesta contra la proteína Q fue más lenta en el
tiempo, aunque la respuesta alcanzó el nivel de los demás animales
hacia el final del experimento. Consecuentemente, a partir de los
datos derivados ambos del Ejemplo 1 y del Ejemplo 2, es posible
concluir que el grado de la respuesta inmunitaria contra la
proteína, por ambas vías, intraperitoneal y subcutánea, es muy
rápido, aunque la respuesta por vía intraperitoneal lograse títulos
más altos en los mismos periodos de tiempo (1/75.000 contra
1/30.000). La Figura 3 indica la respuesta contra la proteína Q en
los animales de control. Es posible observar que la reactividad
contra esta proteína está detectada en la 12-14ª
semana después de la infección, que es cuando los primeros síntomas
atribuibles a una leishmaniasis potencial empiezan a ser detectados
en los animales infectados. La Tabla 2 muestra los niveles de
parasitemia en el hígado y bazo de los animales de control y
vacunados. Se puede observar que el 50% de los animales fueron
protegidos al nivel del hígado, en cuanto a que la reducción en el
nivel de parasitemia fue muy elevada (87-89%). Uno
de los animales no fue protegido, mientras que en otro animal la
reducción de la carga parasitaria fue del 22%. Por el contrario, la
reducción de la carga parasitaria fue del 98-99% en
el 100% de los animales a nivel del bazo.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
2
Carga parasitaria en el hígado y bazo de
hámsters vacunados con proteína Q por vía subcutánea. Después de 20
semanas de infección, la carga parasitaria fue medida por el método
de diluciones limites (largo plazo). La carga parasitaria está
expresada como parásitos por miligramo de tejido. RPL = reducción en
carga parasitaria en %.
Hámsters inmunizados con la
proteína
Q
Con el fin de evaluar si la proteína Q podría
ser usada para diseñar sistemas de protección en formulaciones que
contenían la proteína LiHsp70 de Leishmania infantum, se
efectuó un experimento en ratones Balb/C. Se observó que después de
la inmunización, la carga parasitaria tanto en el hígado como en el
bazo fue reducida significativamente, siendo en algunos animales,
cuatro órdenes de magnitud inferior.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada uno de los 4 hámsters fue inyectado
intraperitonealmente con 5 microgramos de proteína Q y 5
microgramos de proteína LiHsp70 disueltos en 40 microlitros de PBS
y emulsionados en 40 microlitros de adyuvante de Freund. En la
primera inmunización, se empleó adyuvante de Freund completo,
mientras que en las dos posteriores, se usó adyuvante de Freund
incompleto como se ha indicado anteriormente. La vacunación fue
administrada en tres dosis separadas en intervalos de 15 días.
Quince días después de la inmunización se les
administró un inóculo de 106 parásitos infecciosos por vía
intracardíaca y fueron sacrificados en la semana 22. Cada dos
semanas, a pesar del periodo de inmunización y durante toda la
infección, se extrajo sangre de ellos para determinar el grado de
respuesta humoral contra la proteína Q y contra la proteína
LiHsp70.
La carga parasitaria relativa entre los ratones
inmunizados con la proteína Q más LiHsp70 está mostrada en la tabla
3, Se observó que todos los animales fueron altamente protegidos y
en algunos de ellos, en el bazo, la reducción fue próxima a
dos-tres órdenes de magnitud.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
3
Carga parasitaria relativa de ratones Balb/C
inmunizados con la proteína Q más LiHsp70 después de 4 meses de
infección.
Ratones inmunizados con la
proteína Q y
LiHsp70
Las Tablas 4 y 5 muestran que todos los animales
de los ejemplos 1 y 2 responden immunológicamente a la proteína Q,
y que empezando desde la segunda semana después de la inmunización,
la respuesta contra la proteína Q fue alta y esta respuesta aumentó
después de la segunda inmunización (semana 4). La Tabla 6 muestra
que la respuesta contra la proteína LiHsp70 durante toda la
duración del experimento fue también positiva, aunque más baja que
la respuesta en el ejemplo 3 contra la proteína Q.
Las Tablas 4 y 5. Muestran la respuesta
inmunitaria en 4 hámsters inyectados intraperitonealmente con 5
microgramos de proteína Q (TABLA 4- ejemplo 1, corto plazo) y la
respuesta inmunitaria en 4 hámsters inyectados subcutáneamente con
5 microgramos de proteína Q (TABLA 5 - ejemplo 2, largo plazo).
\vskip1.000000\baselineskip
Los sueros (diluidos 1/200) que mostraban una
densidad óptica de 3 tenían un título superior a 1/45.000.
Respuesta inmunitaria contra la proteína Q
(corto plazo).
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
6
Muestra la respuesta inmunitaria en 4 hámsters
inyectados intraperitonealmente con 5 microgramos de proteína Q más
5 microgramos de proteína LiHSP 70 (ejemplo 3, largo plazo).
\vskip1.000000\baselineskip
Cuatro ratones Balb/C fueron inyectados cada uno
intraperitonealmente con 5 microgramos de proteína Q y 10^{6}
Unidades de Formación de Colonias (CFU) de BCG (Bacille
Calmette-Gu-rin) disueltas en 40
microlitros de PBS. La inmunización fue efectuada en tres dosis,
después de 15 días. 15 días después de la inmunización, se les
administró un inóculo de parásitos infecciosos de 10^{5} BCN150
de L. Infantum por vía intracardíaca. Cada dos semanas,
durante toda la duración de la inmunización y durante toda la
infección, se tomaron muestras de sangre de ellos para examinar el
grado de respuesta humoral a la proteína Q. Los animales fueron
sacrificados 8 semanas después de la infección.
La Tabla 7 (a y b) muestra que los animales
inmunizados responden positivamente a la proteína Q empezando desde
la segunda semana y que la respuesta aumenta progresivamente hasta
que en muchos casos alcanza valores de 400,000. La Tabla 8 muestra
la diferencia de carga parasitaria entre el hígado y bazo de los
animales vacunados y de control.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Tabla
7
Respuesta inmunitaria a la proteína Q en ratones
Balb/C inmunizados con 5 microgramos de proteína Q y 106 CFU de BCG
Ratones 1, 2, 3, 4 inmunizados Ratones 5, 6, 7, 8 controles no
inmunizados.
\newpage
Tabla
8
Carga parasitaria en el hígado y bazo de ratones
Balb/C vacunados con proteína Q subcutáneamente + 10^{6} de BCG.
8 semanas después de la infección, la carga parasitaria fue medida
por microscopía óptica de impresiones tisulares mediante la
medición de distintos campos que contienen 7000 células nucleadas.
La carga parasitaria está representada como la cantidad de
parásitos por miligramo de tejido, habiendo calculado previamente
que 1 parásito por 1000 células nucleadas es equivalente a una
cantidad aproximada de 210 parásitos por miligramo de tejido. RPB =
reducción de carga parasitaria, %.
<110> CBF-Leti, SA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Gen quimérico formado por secuencias
de ADN que codifican los determinantes antigénicos de cuatro
proteínas de L. Infantum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P042418EP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-12-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 412
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:proteína Q expresada en PQ31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1436
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
ADN que codifica la proteína Q
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 328
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia
artificial:proteína Q expresada en pMAL 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
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<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
Claims (10)
1. Composición farmacéutica para la prevención y
tratamiento de la Leishmaniasis en humanos y animales
comprendiendo:
a. una proteína Q que tiene la secuencia de
aminoácidos como se muestra en la SEC ID Nº. 1 o que tiene al menos
el 90% de identidad de los aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº. 1 y que genera una respuesta
inmunitaria contra la Leishmaniasis combinada con
b. la proteína LiHsp70 completa o
fragmentada.
2. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, donde la proteína Q está enlazada a la proteína
LiHsp70.
3. Composición farmacéutica para la prevención y
tratamiento de la leishmaniasis en seres humanos y animales
comprendiendo:
a. un vector que lleva la secuencia que codifica
para la proteína Q según está definido en la reivindicación 1 y
b. un vector que lleva la secuencia que codifica
para la proteína LiHsp70 según está definido en la reivindicación
1.
4. Composición farmacéutica según la
reivindicación 3, donde un mismo vector lleva ambas secuencias
según se ha definido en la reivindicación 3.
5. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, adecuada para la administración
intraperitoneal, subcutánea o intramuscular.
6. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende un adyuvante
fisiológico adecuado para la administración intraperitoneal,
subcutánea o intramuscular.
7. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, que es una vacuna.
8. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, para el uso para la generación de una
respuesta inmunológica.
9. Uso de una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la preparación de un
medicamento para la prevención o tratamiento de la leishmaniasis en
un ser humano o animal.
10. Uso según la reivindicación 9, donde el
medicamento es una vacuna.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11382598P | 1998-12-23 | 1998-12-23 | |
| CA2256124 | 1998-12-23 | ||
| US113825P | 1998-12-23 | ||
| CA2256124A CA2256124C (en) | 1998-12-23 | 1998-12-23 | Chimeric gene formed of the dna sequences that encode the antigenic determinants of four proteins of l. infantum, and protein encoded by said gene, and pharmaceutical composition useful for preventing and/or treating leishmaniosis in animals or humans |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| ES2326174T3 true ES2326174T3 (es) | 2009-10-02 |
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