ES2325285T3 - Metodos para introducir celulas heterologas en peces. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de análisis celular, comprendiendo: introducir una o más células heterólogas en una larva o pez cebra adulto; poner en contacto el pez cebra con un agente; y analizar una propiedad de las células o del pez cebra, en el que el análisis comprende determinar si la propiedad responde a la administración del agente, y en el que las células heterólogas no son células embrionarias humanas.

Description

Métodos para introducir células heterólogas en peces.

Antecedentes

En la actualidad el ratón es el sistema modelo de elección para los ensayos de trasplante celular (Greiner et al., 1998). Se inyectan células en ratones adolescentes o adultos, seguido de la inyección de compuestos y el examen de la viabilidad y el tamaño tumoral (Yang et al., 1997; Katsanis et al., 1998). Para evitar el rechazo celular, el trasplante de células humanas debe llevarse a cabo utilizando ratones inmunosuprimidos de líneas de ratón desnudo o SCID (Yang et al., 1997; Greiner et al., 1998; Katsanis et al., 1998). Sin embargo, debido a que estos ratones no muestran una respuesta inmunológica, resultan menos resistentes que los ratones normales y más susceptibles a efectos tóxicos de los compuestos. Además, estos animales resultan de desarrollo y mantenimiento caros. Además, debido a que los ratones se desarrollan en útero, no resulta posible someter a ensayo embriones de ratón, complicando mucho la evaluación del efecto de compuestos sobre los procesos del desarrollo. También se utiliza para el cribado de fármacos un modelo de fibras huecas, en el que se implantan minúsculos tubos llenos de células tumorales en ratones en una diversidad de sitios. Mediante el seguimiento de los efectos de eliminación de células tumorales de los fármacos sobre los implantes, los investigadores pueden someter a ensayo qué fármacos realmente alcanzan los sitios tumorales cuando los fármacos se administran por diferentes vías: por ejemplo por vía intravenosa comparado con por vía oral.

Las limitaciones de los modelos animales han estimulado al NCI y a otros a someter a ensayo también fármacos candidatos en cultivos de células humanas, y el Instituto en la actualidad se basa en un panel de 60 líneas celulares tumorales humanas, incluyendo muestras de todas las malignidades humanas principales. Los alimentos que deben someterse a ensayo se alimentan a subgrupos del panel, basados en el tipo de célula tumoral, y se realiza un seguimiento de la actividad de eliminación celular.

También se llevan a cabo ensayos clonogénicos. En este procedimiento, se cultivan líneas celulares o células de un tumor del paciente en placas de Petri o matraces de cultivo y se realiza un seguimiento de las respuestas celulares frente a diversos tratamientos anticáncer. Sin embargo, estos ensayos también resultan problemáticos. En ocasiones no funcionan debido a que las células simplemente no consiguen dividirse en cultivo. Además, los resultados no predicen cómo se comportará un fármaco anticáncer en el cuerpo.

En una búsqueda continua de modelos fidedignos de la carcinogénesis humana, el NCI recientemente ha iniciado la reclasificación de las células basándose en el tipo de tejido: cáncer de mama frente a cáncer de colon, por ejemplo, de acuerdo a los tipos de defectos genéticos que portan las células. Para permitir que los fármacos que contrarrestan defectos específicos se prescriban con mayor eficacia, los investigadores también están desarrollando tecnologías para analizar los defectos génicos en cada tumor del paciente con el fin de determinar si resulta posible identificar los fármacos que corrigen defectos específicos, ya que en este caso podrían hacerse corresponder a la constitución celular de cada tumor individual.

Para crear mejores modelos de desarrollo del cáncer en el ser humano, en la actualidad los investigadores se están basando en el creciente conocimiento de las mutaciones génicas relacionadas con cáncer en el ser humano. Están alterando genéticamente ratones de manera que porten los mismos tipos de cambios que llevan o a la activación anormal de oncogenes que inducen cáncer o la pérdida de genes supresores tumorales que llevan a cáncer en el ser humano. Se espera que los ratones desarrollen tumores que se comportan de la misma manera que los tumores humanos. Una cepa de ratón mutante por ejemplo carece de un gen APC funcional, un supresor tumoral que lleva al cáncer de colon cuando se pierde o se encuentra inactivo. Hasta el momento los resultados no han sido concluyentes.

Resumen de la invención que se reivindica

La invención proporciona procedimiento de análisis celular utilizando peces como está definido por la reivindicaciones. Tales procedimientos implican la introducción de una o más células heterólogas en un pez, y analizar una propiedad de las células o el pez. Los procedimientos resultan particularmente adecuados para la introducción de células heterólogas en embriones de peces, particularmente embriones de peces cebra. Las células introducidas permanecen viables por lo menos hasta llevar a cabo la etapa de análisis. Algunos tipos celulares experimentan proliferación en el pez receptor. En algunos procedimientos, el pez se pone en contacto con un agente, y el análisis determina si la propiedad es sensible a la administración del agente. Entre las propiedades de las células heterólogas o de peces que pueden analizarse se incluyen marcadores de diferenciación, r, supervivencia del pez, proliferación de las células heterólogas, movimiento de las células heterólogas respecto a un sitio inicial de introducción, muerte de las células heterólogas o de las células del pez, o proliferación de células heterólogas. En algunos procedimientos, las células heterólogas son células de cáncer. En algunos procedimientos, las células heterólogas son células humanas. En algunos procedimientos, las células heterólogas son células bacterianas o fúngicas. En algunos procedimientos, las células son células infectadas por virus. Algunos procedimientos además comprenden recuperar células heterólogas del embrión de pez receptor.

Asimismo, la invención proporciona procedimientos de cribado de un agente para actividad contra células cancerosas. Estos procedimientos implican introducir una o más células cancerosas en una población de peces, administrar el agente a la población de peces, y realizar un seguimiento del efecto del agente sobre el desarrollo de las células cancerosas en la población de peces. En algunos procedimientos, la etapa de seguimiento comprende determinar una EC50 para el efecto del agente sobre el desarrollo de las células cancerosas en los peces. En algunos procedimientos, la etapa de seguimiento comprende detectar una LD50 del agente sobre la población de peces. Opcionalmente, el procedimiento se repite para una pluralidad de agentes, y un agente con una proporción baja de EC50/LD50 se formula con un portador como composición farmacéutica.

Asimismo, la invención proporciona procedimientos de propagación de células. Estos procedimientos implican introducir una o más células heterólogas en pez, cultivar el pez bajo condiciones en las que las células proliferen, y recuperar las células proliferadas. En algunos procedimientos, las células se diferencian durante el curso de la proliferación, y las células se recuperan en forma de un tejido diferenciado. En algunos procedimientos, las células recuperadas se trasplantan a un paciente, opcionalmente el mismo paciente del que se obtuvieron las células heterólogas.

Asimismo, la invención proporciona procedimientos de diagnóstico de una muestra para una célula cancerosa o patógeno. Estos procedimientos implican obtener una muestra de un paciente que contiene una población de células, introducir la población de células en un pez, y detectar una propiedad de la población de células para indicar si la población comprende una célula cancerosa o un patógeno.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: veinticuatro horas después del trasplante, embriones en los que las células HepG2 eran visibles en forma de masas celulares (flechas) en el vitelo (Y). Excepto por la masa celular, los embriones presentan una apariencia bastante normal. El ojo (E) y la vesícula ótica (OT) se han etiquetado para su identificación.

Figura 2: cuarenta y ocho horas tras el trasplante, embriones en los que resultaban visibles células HepG2 en forma de células individuales (flechas) en el cuerpo. La aleta dorsal (DF), ventral (VF) y el vitelo (Y) se han etiquetado para su identificación.

Figura 3: veinticuatro horas tras el trasplante, resultaban visibles embriones en los que las células HepG2 resultan visibles en forma de una gran masa de células asociada a defectos morfológicos (flecha). La cola (T) y el vitelo se han etiquetado para su identificación.

Figura 4: cuarenta y ocho horas tras el trasplante, las células HepG2 pueden observarse en forma de masa grande en el pericardio del embrión (flecha larga). La presencia de las células HepG2 aparentemente ha provocado un efecto teratogénico sobre el corazón en desarrollo (flecha corta), que presenta un tamaño reducido y se observó que latía irregularmente, con toda probabilidad debido a la secreción de VEGF de las células HepG2. Se han etiquetado la aurícula (A), ventrículo (V) y el vitelo.

Figura 5: cuarenta y ocho horas tras el trasplante, las células HepG2 resultan visibles en forma de una masa de células sobre la parte dorsal de la cola. Se han incorporado células de pez cebra en la masa celular (flecha). El notocordio (No), aleta dorsal (DF), aleta ventral (VF) y el vitelo (Y) se han identificado para su identificación.

Figura 6: se llevaron a cabo trasplantes en tres regiones diferentes del embrión de estadio tardío (Em) sin conocimiento previo de la posición de las células trasplantadas en los huéspedes (flecha larga); en posiciones aleatorias en la célula vitelina (Y; punta de flecha) y en el margen (flecha corta) entre el embrión y la masa del vitelo.

Fig. 7: tinción con BrdU y con anticuerpo cK-18 de células HepG2 en embriones xenoinjertados 48 horas tras el trasplante (A). Imagen de campo oscuro que muestra el vitelo y la localización de la masa de células HepG2; (B) imagen de epifluorescencia del mismo embrión utilizando un juego de filtros de rodamina indica la localización de CK18 en la masa celular. No se observó tinción con CK18 en el tejido huésped ni en los embriones de control (la imagen de epifluorescencia CO del mismo embrión utilizando un filtro de fluoresceína muestra marcaje de BrdU en la masa de células HepG2. Debido a que el vitelo es esférico, la mayoría de las células marcadas con BrdU de la capa sincitial del vitelo se encuentran desenfocadas. La flecha blanca indica células huésped marcadas con BrdU.

Fig. 8: las células HepG2 trasplantadas presentan morfología de célula tumoral. (A) Imagen de campo brillante de una sección sagital oblicua, aunque un embrión de xenoinjerto. El notocordio (NC) y el sistema nervioso central anterior (ANT.CNS) se han etiquetado para su identificación. (B) y (C) Imagen de magnificación más elevada de la masa célula y del CAN anterior. Los núcleos de las células HepG2 son de mayor tamaño y de color más pálido que los núcleos de las células del huésped. Las masas de células HepG2 comprenden células muy juntas que presentan poco o ningún espacio extracelular.

Fig. 9: formación de masa de células satélite en embriones xenoinjertados. Imágenes de fase y de fluorescencia del mismo embrión xenoinjertado 72 y 144 horas después del trasplante. A las 72 horas, las células de la masa primaria (P) aparentemente se dispersaron. Alcanzadas las 144 horas, se encontraban presentes masas de células satélite (s) en imágenes tanto de fase como de fluorescencia en toda la cola del embrión. Para su identificación, se ha etiquetado el ano.

Definiciones

Las células madre no se encuentran terminalmente diferenciadas, pueden dividirse sin límite y producen progenie, que pueden continuar dividiéndose o diferenciándose. Las células madre pueden ser totipotentes, pluripotentes o unipotentes. Las células madre totipotentes (por ejemplo las células madre embrionarias) pueden producir cada uno de los tipos celulares presentes en un organismo adulto. Las células madre pluripotentes pueden producir más de un tipo celular diferenciado. Una célula madre unipotente puede producir un solo tipo celular diferenciado. Las células madre generalmente se caracterizan por un tamaño reducido, baja granularidad, proporción citoplásmica a nuclear reducida y la falta de expresión de osteopontina, colágenos y fosfatasa alcalina. Se conocen células madre de epidermis, intestinales, epiteliales y hematopoyéticas. Las células madre para las células óseas, cartílago, tejido adiposo y tres tipos de músculo (liso, esquelético y cardiocitos) se cree que proceden de una célula madre mesenquimal precursora común (Owen et al., Ciba Fdn. Symp. 136:42-46, 1988; Owen et al., J. Cell Sci. 87:731-738, 1987).

Un conjunto de marcadores de diferenciación se refiere a una o más propiedades fenotípicas que resultan identificables y que son específicas de un tipo celular particular. Los marcadores de diferenciación pueden manifestarse transitoriamente en diversos estadios del linaje celular. Las células madre pluripotentes que pueden regenerarse sin compromiso de destino a un linaje expresan un conjunto de marcadores que podría perderse al producirse el compromiso de destino a un linaje celular. Las células precursoras expresan un conjunto de marcadores de diferenciación que pueden continuar o no expresándose a medida que las células progresan por la ruta del linaje celular hacia la maduración. Los marcadores de diferenciación que expresan exclusivamente las células maduras habitualmente son propiedades funcionales, tales como productos celulares, enzimas para producir productos celulares y
receptores.

A continuación se proporcionan algunos ejemplos de marcadores de diferenciación para tipos celulares específicos. La expresión de isozima de miosina cardíaca y el patrón específico del corazón de expresión del isozima creatina quinasa cuando se identifican conjuntamente en la misma célula o en una población clonal de células, son marcadores de células de músculo cardíaco. Los cardiocitos también se reconocen por su apariencia bifurcada bajo microscopía óptica y por su capacidad de formar uniones en hendidura. Estas células también pueden reconocerse formando un potencial eléctrico a través de células confluyentes y detectando la transferencia de señal de célula a célula. El ARNm de \alpha-actina muscular y la actina de células de músculo liso son marcadores de diferenciación de miocitos. La expresión de isozima miosina y un patrón específico de músculo de expresión de isozima creatina quinasa cuando se identifican en una célula o población clonal son marcadores de células de músculo esquelético. Las células osteoblásticas segregan material de matriz ósea. La ALP, la expresión de osteocalcina, la expresión de AMPc inducida por PTH y la capacidad de mineralización ósea identificados conjuntamente en una célula o población de células son marcadores de diferenciación de osteoblastos. Los condrocitos segregan cartílago. El agrecano y el colágeno de tipo IIB identificados en una célula o población clonal de células son marcadores de condrocitos. Los queratinocitos segregan queratina y pueden reconocerse utilizando tinciones disponibles comercialmente. Los adipocitos producen lípidos y pueden reconocerse mediante tinción con rojo aceite O.

Las células son heterólogas respecto a un pez individual si se obtienen de un individuo diferente. Típicamente, el individuo diferente es de una especie que no es un pez, por ejemplo de un mamífero.

Descripción detallada I. General

La invención proporciona procedimientos para introducir células heterólogas en peces para el posterior análisis o recuperación, como se define en las reivindicaciones. Los peces proporcionan un incubador in vivo en el que las células heterólogas pueden experimentar varios procesos fisiológicos, incluyendo la proliferación, diferenciación, expresión, secreción y metástasis. Los procedimientos presentan varias aplicaciones, incluyendo el cribado para fármacos potenciales para efectos sobre procesos celulares, la propagación de células para su utilización posterior en terapia celular o en ingeniería de tejidos, y el diagnóstico de biopsias de pacientes para la presencia de células en proliferación y/o en metástasis. Los procedimientos se basan en la premisa, en parte, de que las células de otras especies, particularmente el ser humano, pueden proliferar en peces, a pesar de las diferencias de temperatura corporal entre diferentes especies. Por ejemplo, la temperatura corporal humana es de \sim36ºC, mientras que el pez cebra normalmente se desarrolla a 27ºC y no puede cultivarse a temperaturas superiores a 32ºC. La presente aplicación proporciona evidencia de que las células heterólogas, sin embargo, pueden sobrevivir y/o proliferar en peces.

Existen varias ventajas de la utilización de peces para ensayos de trasplante respecto a animales de laboratorio, tales como los ratones. En primer lugar, los embriones tempranos de los peces todavía no han desarrollado un sistema inmunológico y se encuentran aislados de cualquier efecto del sistema inmunológico materno, de manera que las células heterólogas no se ven sometidas a rechazo inmunológico. En segundo lugar, debido al reducido tamaño de los embriones de peces, resulta posible analizar y/o recuperar un número relativamente reducido de células trasplantadas (por ejemplo 1, 10 ó 1.000 células por embrión). En tercer lugar, algunos tipos de embrión de pez son relativamente transparentes, facilitando la observación microscópica directa de varios procesos fisiológicos con las células. En cuarto lugar, los embriones de peces se cultivan en solución, facilitando el contacto de las células heterólogas con fármacos potenciales.

En general, las células que proliferan en su ambiente nativo (por ejemplo las células JK), también proliferan cuando se trasplantan a peces. Las células que no son capaces de proliferar en su ambiente nativo (por ejemplo las células de linfoma CCL37) habitualmente no proliferan en peces, aunque en algunos casos puede inducirse su proliferación mediante el tratamiento con factores de crecimiento apropiados u otros agentes. Las células introducidas típicamente siguen siendo viables durante un periodo suficiente para llevar a cabo diversos análisis descritos posteriormente (por ejemplo por lo menos una hora y típicamente por lo menos un día, y en ocasiones hasta tres días, una semana o más). Las células que experimentan proliferación preferentemente experimentan al menos 1, 5 ó 10 rondas de doblado como componentes de los peces receptores. En general, las células no diferenciadas experimentan diferenciación al introducirlos en peces, mientras que las células diferenciadas terminalmente siguen en ese estado. Las células heterólogas pueden obtenerse de una especie diferente que el pez receptor y típicamente se obtienen de mamíferos, tales como gatos, perros, caballos, bovinos, ratones, ratas, conejos, cobayas, primates y particularmente el ser humano; bacterias, plantas y aves.

Puede utilizarse cualquier tipo de pez como receptor para las células heterólogas. Entre los ejemplos de los peces adecuados se incluyen los teleósteos, particularmente el pez cebra, medaka, rerio gigante o pez erizo. Los procedimientos para cultivar los diferentes tipos de peces son similares y se describen en, por ejemplo, Medaka (killifish): Biology and Strains (Keigaku Pub. Co., Tokyo, Yamamoto T., editor, 1975). Típicamente se introducen células en una forma embrionaria de los peces. Los estadios preferentes de desarrollo embrionario para la introducción de células son el estadio de 128 células, el estadio de 256 células, los estadios de 1 k células, los estadios avanzados, caracterizados por un blastodisco elevado sobre las células vitelinas; células oblongas, a la altura de las cuales se acorta el eje animal-vegetal de la blástula, comprimiendo el blastodisco el vitelo, y el estadio de esfera, en el que la continuación del acortamiento a lo largo del eje animal-vegetal genera una blástula tardía de forma lisa y aproximadamente esférica. Típicamente se introducen por lo menos 1, 10, 100, 1.000, 10.000, 100.000, 1.000.000 de células en un pez receptor.

El pez cebra, y particularmente los embriones de pez cebra, son un receptor preferente para el trasplante de células heterólogas. La base molecular de la morfogénesis y desarrollo del pez cebra es idéntica o similar a la del ser humano (Chen y Fishman, 1996; Granto y Nusselien-Volhard, 1996, editor Wylie, 1996). Además, debido a que el timo se forma aproximadamente a las 72 horas, momento en el que no se ha desarrollado el sistema inmunológico, los embriones tempranos de pez cebra muestran una buena tolerancia a los heteroinjertos (o xenoinjertos). La tolerancia se manifiesta en que los homoinjertos son extremadamente bien tolerados en el pez cebra, y se han utilizado en experimentos de trasplante durante varios años. Además, debido a que el embrión es transparente, pueden examinarse con facilidad los cambios morfogénicos internos, incluyendo el desarrollo de órganos, la metástasis y el crecimiento de tumores, y los efectos de fármacos. Debido a que un solo apareamiento produce 100 a 200 huevos de fertilización externa, pueden inyectarse células en un gran número de embriones. Pueden añadirse compuestos químicos directamente a la solución en la que nada el pez, permeando el embrión intacto, haciendo que la exposición a fármaco y el posterior examen resulten comparativamente sencillos. El pez cebra también ofrece las ventajas de que el plan corporal, órganos, tejidos y otros sistemas del pez cebra se desarrollan mucho más rápidamente que componentes similares en otros modelos vertebrados (por ejemplo el ratón). El plan corporal vertebrado completo del pez cebra típicamente se ha establecido dentro de las 24 horas. Resulta evidente un sistema cardiovascular un sistema cardiovascular completamente funcional dentro de las primeras 24 horas del desarrollo (Stainier y Fishman, 1994). Los restantes órganos del pez cebra, incluyendo el intestino, hígado, riñones y vasculatura, se establecen dentro de las 48 horas. El embrión de pez cebra recién eclosionado completa prácticamente la morfogénesis dentro de las 120 horas, haciendo de esta manera que resulte altamente accesible a la manipulación y observación, y haciendo que resulten posibles los procedimientos automáticos de alto rendimiento de observación y detección.

El embrión de pez cebra puede sobrevivir por difusión de oxígeno del agua y nutrientes procedentes del vitelo y de esta manera incluso la ausencia de la totalidad del sistema circulatorio resulta bien tolerada durante el desarrollo temprano (Weinstein et al., 1995). Los embriones individuales de pez cebra pueden mantenerse en volúmenes de líquido de tan sólo 100 microlitros durante los primeros seis días de desarrollo; en consecuencia, pueden mantenerse embriones en cultivo en pocillos de microtitulación individuales o placas de multipocillos. Pueden añadirse directamente compuestos de ensayo a la solución en la que se sumergen los peces. Los compuestos de ensayo añadidos al embrión de pez cebra permean el embrión intacto directamente, haciendo que este formato multipocillo resulte particularmente atractivo para el cribado de compuestos automático de alto rendimiento.

Debido a que el pez cebra es de fertilización externa, la manipulación de los embriones resulta comparativamente sencilla. El trasplante de células se lleva a cabo mediante microinyección, una técnica bien establecida en el pez cebra (Ho y Kane, 1990; Hammerschmidt et al., 1996). Debido a que un solo apareamiento puede producir 100 a 300 embriones, la generación de un gran número de embriones huésped heteroinjertados resulta relativamente sencillo. Además, se encuentran disponibles cepas endogámicas y pueden criarse miles de peces económicamente en un cuarto de dimensiones reducidas con acuarios. Una ventaja importante del potencial de los ensayos con pez cebra es el coste. En la actualidad, el ensayo medio con ratones cuesta aproximadamente 1.630 cuando lo lleva a cabo el gobierno, y 2.900 cuando se lleva a cabo comercialmente. El elevado coste se debe al alto coste de generar y mantener los ratones, así como a la falta de automatización de las inyecciones, altamente manuales, y el posterior análisis. En contraste, el pez cebra resulta comparativamente económico de mantener y debido a que los embriones pueden introducirse en pocillos de microtitulación individuales, resulta posible el análisis automatizado con equipos de manipulación de líquidos estándar. A continuación se proporciona una comparación de las características clave de los sistemas de modelos vertebrados.

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II. Agentes para el tratamiento del cáncer

Los presentes procedimientos proporcionan un medio para cribar agentes para toxicidad para las células cancerosas y/o la capacidad de inhibir la proliferación y/o metástasis de las células cancerosas. Los procedimientos funcionan trasplantando células cancerosas en uno o más peces y administrando el agente que debe cribarse. Típicamente las células cancerosas también se trasplantan en uno o más peces de control que no reciben agente a fines comparativos, aunque también pueden utilizarse controles históricos. A continuación, se realiza un seguimiento del destino de las células cancerosas en los peces en comparación con animales de control contemporáneos o históricos. En los animales de control, las células cancerosas persisten, proliferan o se metastatizan. En los animales tratados, la actividad deseable de un agente se manifiesta mediante una inhibición de la proliferación de las células cancerosas y/o una inhibición de la metástasis y/o la completa eliminación de las células.

En algunos procedimientos, también se realiza un seguimiento del efecto de un agente sobre células de pez como medida de los efectos secundarios de un agente. La naturaleza transparente de peces, tales como los embriones de pez cebra, facilita la visualización de cualquier perturbación causada por el agente sobre el desarrollo de tejidos y órganos del pez. Además, puede realizarse el seguimiento de la composición y distribución del ARNm y de las proteínas dentro de los embriones de pez mediante hibridación in situ. Los efectos del agente sobre el pez tratado pueden compararse con controles contemporáneos o históricos como medida de los efectos secundarios del agente. Los agentes ideales muestran una elevada proporción entre la actividad frente a las células cancerosas y los efectos secundarios contra las células de pez.

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1. Agentes que deben cribarse

Los agentes que deben cribarse para actividad contra células cancerosas o en otros tipos de ensayo indicados posteriormente, pueden proceder de bibliotecas combinatoriales de péptidos o moléculas de tamaño reducido, hormonas, factores de crecimiento y citoquinas, o pueden ser moléculas de origen natural o pueden proceder de repertorios existentes de compuestos químicos sintetizados por la industria farmacéutica. Las bibliotecas combinatoriales pueden producirse para muchos tipos de compuesto que pueden sintetizarse por etapas. Entre estos compuestos se incluyen polipéptidos, miméticos de hélice beta, polisacáridos, fosfolípidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, benzodiacepinas, glicinas N-sustituidas oligoméricas y oligocarbamatos. Pueden construirse grandes bibliotecas combinatoriales de los compuestos mediante el procedimiento de las bibliotecas sintéticas codificadas (ESL) descrito en Affymax, patente WO nº 95/12608, Affymax, en la patente WO nº 93/06121, Columbia University, en la patente WO nº 94/08051, Pharmacopeia, en la patente WO nº 95/35503 y Scripps, en la patente WO nº 95/30642 (cada una de las cuales se incorpora como referencia a todos los fines). También se generan bibliotecas de péptidos mediante procedimientos de expresión fágica (ver, por ejemplo, Devlin, patente WO nº 91/18980). También pueden obtenerse compuestos que deben cribarse del National Cancer Institute's Natural Product Repository, Bethesda, D. Los compuestos o fármacos existentes con actividad antineoplásica conocida también pueden cribarse con el fin de determinar un perfil de actividad frente a efectos secundarios.

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2. Células cancerosas

Entre las células cancerosas se incluyen células primarias obtenidas de tejido canceroso en el ser humano y en otros mamíferos. Existen varios tipos de células cancerosas diferentes, incluyendo leucemias, que afectan a células sanguíneas, sarcomas que surgen en hueso, músculo o tejido conectivo, y carcinomas, que surgen en célula epiteliales, y entre los que se incluyen cánceres de mama, de colon y de pulmón, los tipos de cáncer más frecuentes. Entre las células cancerosas también se incluyen linfomas, blastomas, gliomas, teratomas y neurofibromatomas. Entre las células cancerosas también se incluyen líneas celulares que proliferan indefinidamente y dan lugar a tumores en animales de laboratorio, tales como ratones. Entre las células cancerosas también se incluyen células precancerosas que no dan lugar a tumores en animales de laboratorio, pero que portan por lo menos un marcador de diferenciación que distingue las células cancerosas de las células normales. Las células precancerosas con frecuencia se caracterizan además por la capacidad de proliferar indefinidamente.

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3. Ruta de administración de células

Típicamente se administran células cancerosas y otras células a los embriones de pez mediante microinyección. Los peces típicamente son de tipo salvaje, aunque también pueden utilizarse cepas mutantes de pez para el análisis de la interacción entre los agentes terapéuticos y defectos genéticos específicos. Los peces típicamente son embriones de estadio temprano, aunque también pueden utilizarse peces cebra en etapa larvaria o adultos. Las células pueden inyectarse en el vitelo o cuerpo de un embrión de pez, o en ambos. Las células pueden inyectarse en un solo o en múltiples sitios. Los embriones de pez típicamente se cultivan durante cierto tiempo antes de administrar agente para permitir que las células cancerosas se adapten al nuevo ambiente, proliferen y/o metastaticen. Cualquier pez que no sobreviva al trasplante de células cancerosas puede eliminarse antes de la administración de agente.

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4. Administración de agentes

Los agentes pueden administrarse antes, simultáneamente o después de la introducción de células cancerosas (u otras células) en los peces. Habitualmente, se administran agentes tras la introducción de células cancerosas y tras un periodo suficiente para que las células cancerosas empiecen a proliferar y/o metastatizar en los peces cebra. El intervalo típicamente es de entre 12 y 36 horas tras introducir las células, con preferencia aproximadamente 24 horas tras introducir las células. Tras la administración de agente, los peces se cultivan durante un periodo adicional, típicamente durante por lo menos aproximadamente 24 horas, y en ocasiones durante 1, 3 ó 6 meses, o hasta la muerte del pez. Un régimen de seguimiento típico es de 24 horas durante ocho días o hasta la muerte del pez. Seguidamente, se realiza un seguimiento de los peces cada 24 horas durante un mes más.

Pueden administrarse agentes simplemente añadiendo el agente al medio que contiene los peces. Este enfoque se ha utilizado desde hace mucho tiempo para introducir anestésicos y otros compuestos químicos a los embriones de pez (Westerfield, 1993). Alternativamente, pueden microinyectarse agentes en los peces en el mismo sitio que las células cancerosas, o en otro sitio.

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5. Evaluación de la actividad de los agentes

La actividad de un agente contra células cancerosas es su capacidad de eliminar o de reducir el número de células cancerosas inyectadas, de inhibir o de elimina su proliferación y/o de inhibir o prevenir su metástasis respecto a animales de control contemporáneos o de control que han recibido la misma dosis de células cancerosas sin tratamiento. Puede realizarse un seguimiento del destino de las células cancerosas trasplantadas y de su progenie mediante inmunotinción con un anticuerpo específico para un antígeno de célula cancerosas que no se encuentra en los peces receptores. Algunos tipos de células cancerosas pueden distinguirse visualmente de las células de pez en virtud de la naturaleza opaca de las células cancerosas. Las células cancerosas también pueden marcarse antes o después del trasplante. Entre los marcajes adecuados se incluyen los marcajes fluorescentes. Alternativamente, las células pueden marcarse con pigmentos incorporados específicamente por las células cancerosas. El seguimiento se lleva a cabo a intervalos tras la administración del agente. Por ejemplo, resultan adecuados intervalos de 24 horas. El patrón de tinción indica aproximadamente el número de células y sus posiciones en el embrión. El número de células es un indicador de proliferación. Los cambios en la localización de las células, tal como la dispersión de un grupo de células a lo largo del tiempo, son un indicador de metástasis celular. La actividad de un agente se puede expresar como una EC_{50}, que hace referencia a la dosis de agente necesaria para alcanzar un valor final de actividad deseado en el 50% de los peces tratados. Entre los ejemplos de parámetros de valoración se incluyen la eliminación de células cancerosas, la capacidad de inhibir significativamente la tasa de proliferación de las células cancerosas, y la capacidad de inhibir significativamente la metástasis de las células cancerosas.

También pueden cribarse agentes para la capacidad de inhibir significativamente la angiogénesis inducida por tumor. Tras el trasplante en peces, las células cancerosas segregan factores de crecimiento, tales como VEGF, que estimulan el crecimiento de nuevos vasos en células endoteliales de pez circundantes. Los peces cebra resultan particularmente adecuados para analizar la angiogénesis debido a que su naturaleza transparente permite visualizar directamente los vasos sanguíneos bajo el microscopio. Los procedimientos para el seguimiento de la angiogénesis en el pez cebra se describen en detalle en la patente WO nº 99/03852. En breve, los embriones de huésped se tiñen de la manera siguiente: se fijan embriones en paraformaldehído al 4% y se tiñen para actividad endógena de fosfatasa alcalina. Tras la fijación, los embriones se tratan con metanol al 100% durante la noche a -20ºC. Los embriones se rehidratan y se equilibran en tampón NTMT (Tris-HCl 0,1 M; MgCl_{2} 50 mM; NaCl 0,1 M; Tween 20 al 0,1%) a temperatura ambiente y después se tiñen con NBT 75 mg/ml y X-fosfato 50 mg/ml. Opcionalmente, pueden determinarse los perfiles de expresión de las células tumorales y de las células de pez antes y después del tratamiento con un potencial agente anti-angiogénesis. Se idéntica un perfil de genes expresados diferencialmente. Este perfil puede utilizarse para ensayos de fármacos en otros animales o sujetos humanos en el que no resultan tan fácilmente observables los vasos sanguíneos nuevos.

Los procedimientos de cribado anteriormente descritos pueden llevarse a cabo en paralelo en múltiples peces utilizando un formato de microplaca de pocillos andar, con un pez completo, típicamente en una etapa embrionaria, en uno o más pocillos de la microplaca. El formato puede utilizarse para cribar el mismo agente en múltiples peces o para cribar múltiples agentes en múltiples peces. Los procedimientos tanto de manipulación como de detección pueden automatizarse utilizando instrumentación comercialmente disponible y sistemas de software para la aplicación reproducible rápida de pigmentos y compuestos y el cribado automatizado de compuestos diana.

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6. Evaluación de efectos secundarios

Una de las dificultades asociadas con la identificación de compuestos que pueden utilizarse como terapéuticos anticáncer es que muchos de los compuestos utilizados para detener la proliferación de células cancerosas también presentan efectos perjudiciales sobre las células no cancerosas en proliferación. Esto resulta especialmente problemático cuando se tratan de cánceres que afectan a niños, debido a que muchos de sus órganos y tejido todavía se encuentran creciendo y desarrollando. Los efectos secundarios de la administración de agente sobre las células de peces y/o la embriogénesis pueden seguirse a intervalos tras la administración del agente. Típicamente se llevan a cabo mediciones simultáneamente las mediciones para evaluar la actividad de los agentes administrados.

Se describen procedimientos para analizar tejido necrótico en la solicitud correspondiente WO nº 99/03852. Puede detectarse tejido necrótico mediante una diversidad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, microscopía de fluorescencia, microscopía óptica, colorimetría, quimioluminiscencia, análisis de imágenes digitales o técnicas estándar de lectura de microplacas. Por ejemplo, pueden teñirse embriones de peces con un pigmento impermeabilizante de membranas de tinción nuclear, que permite la detección de actividad de muerte celular (por ejemplo apoptosis o necrosis). Entre los pigmentos preferentes se incluyen aquellos de la familia de pigmentos quinolio, tales como los pigmentos benzotiazolio-4-quinolio (Sondas Moleculares), algunos de los cuales se encuentra disponible comercialmente. El benzotiazolio-4-quinolio no puede pasar a través de las membranas intactas de las células de los embriones vivos. Sin embargo, este pigmento puede entrar en células muertas o moribundas cuyas membranas han perdido continuidad o se han roto (una característica de las células que experimentan muerte celular, Liepins y Bustamante, 1994), intercalándose en el ADN de las células muertas o moribundas. Tras intercalarse en el ADN, el pigmento adquiere una fluorescencia intensa, permitiendo la rápida detección de las células marcadas utilizando microscopía fluorescente simple. La magnitud de la señal sirve como medida del número de células necróticas. El pigmento fluorescente típicamente se administra a los peces mediante la adición del pigmento al medio que contiene los peces. Alternativamente, el pigmento puede inyectarse directamente en los peces.

Además de llevar a cabo cribados visuales, pueden detectarse cambios moleculares específicos en los tejidos de los peces mediante hibridación in situ de ARN o la tinción con anticuerpos de proteínas específicas. La hibridación in situ de ARNm es un enfoque molecular rutinario en peces (Westerfield, 1993). Puede utilizarse un kit de marcaje con digoxigenina de Boehringer Mannheim para marcar las sondas de ARN. Puede llevarse a cabo hibridación in situ de embriones enteros de la manera siguiente: se fijan los embriones con paraformaldehído al 4% en PBS, se digieren ligeramente con proteinasa K y se hibridan a 65ºC. Se utiliza anticuerpo anti-digoxenina conjugado con fosfatasa alcalina para detectar las señales. Tras teñir con NBT/X-fosfatasa (Boehringer Mannheim), se blanquean en metanol al 100%, se fijan nuevamente en paraformaldehído al 4% y se almacenan en PBS. Pueden llevarse a cabo múltiples hibridaciones in situ simultáneamente en diferentes peces en placas multipocillo.

Puede utilizarse un procedimiento rápido de tinción basado en la utilización de enzima informador, tal como peroxidasa, conjugado con estreptavidina (avidina), para detectar enzimas carboxilasa en el hígado de embriones enteros. Estos enzimas se encuentran naturalmente biotinilados. Estos enzimas que contienen biotinil-lisina, tales como acetil-CoA carboxilasa y otras carboxilasas, se encuentran localizadas predominantemente en el hígado. Debido a que este grupo de enzimas se encuentran concentrados en el hígado, la tinción es órgano-específica.

A título de ejemplo, se fijan embriones (de 3, 4, 5 ó 8 días de edad) con paraformaldehído 1ora a temperatura ambiente y se tratan con metanol al 100% durante la noche a -20ºC. Los embriones se rehidratan con PBST y se tratan con solución blanqueante (H_{2}O_{2} al 10%) durante 20 minutos. Tras lavar con PBST, los embriones se incuban en solución de bloqueo (BSA al 3%, NaCl 100 mM en PBST). Los embriones se incuban con peroxidasa conjugada con estreptavidina (Pierce) (dilución 1:100 en solución de boqueo) bajo agitación a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, se lavan durante veinte minutos tres veces con PBST y se tiñen para peroxidasa con solución de tinción de diaminobencidina (DBA) (1 ml de solución madre de DBA [5 g de diaminobencidina/l en PBS, pH 7,4], 9 ml de PBS, 10 \mul de H_{2}O_{2} [30%]. Normalmente, la tinción específica del hígado se visualiza en 1 a 5 minutos. La tinción se detiene mediante varios lavados con agua.

Además, puede determinarse un valor de mediana de concentración letal (LC_{50}) mediante la administración de diluciones seriadas de un compuesto y determinando qué proporción de los peces muere con cada dilución. LC_{50} es la concentración necesaria para causar letalidad en el 50% de los embriones. Los compuestos que muestran una Ventana Terapéutica (LC_{50}/EC_{50}) elevada, tal como 100 ó 1.000, son buenos candidatos potenciales de fármaco debido a que la toxicidad a la concentración terapéutica es reducida.

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7. Otros ensayos de cribado

Pueden utilizarse una estrategia y principios estrechamente análogos a aquellos utilizado para cribar agentes para la actividad contra células cancerosas, para llevar a cabo una diversidad de ensayos para agentes sobre otros tipos celulares. Por ejemplo, pueden cribarse agentes para citotoxicidad contra células patogénicas trasplantadas, tales como células bacterianas o fúngicas. También pueden cribarse agentes para la capacidad de inhibir infecciones víricas o la patogénesis de células trasplantadas. En estos procedimientos, pueden ponerse en contacto células heterólogas con virus antes o después del trasplante en peces. El virus habitualmente es un virus que infecta las células heterólogas trasplantadas sin infectar el pez receptor. El procedimiento resulta particularmente útil para propagar virus que no pueden replicarse en cultivo, tales como HBV, HCV y algunas cepas de HPV (ver, por ejemplo, Rosen y Gretch, Mol. Med. Today 5:393-399, 1999). Los procedimientos también resultan útiles para estudiar la infección por VIH y por los virus herpes de células humanas trasplantadas. Pueden administrarse agentes antes o después de la introducción del virus para someter a ensayo para actividad profiláctica y terapéutica, respectivamente.

También pueden cribarse agentes para actividad de estimulación de la diferenciación y/o proliferación celular en células normales. Aunque puede utilizarse cualquiera de los tipos de agentes indicados anteriormente, resultan particularmente adecuados los factores de crecimiento, tales como citoquinas, GM-CF, EPO, FGF, PDGF, VEGF y factor de células madre. Un cambio del estado de diferenciación típicamente viene indicado por la observación de una modificación en un conjunto de uno o más marcadores de diferenciación. Estos agentes, tras su identificación, presentan valor terapéutico para estimular in situ la reparación de tejido dañado o necrótico o para estimular la diferenciación y/o propagación de células in vitro para la utilización posterior en terapia celular o en ingeniería de tejidos. Con frecuencia las células utilizadas en estos procedimientos son células madre, incluyendo células madre totipotentes, células madre pluripotentes y células madre mesenquimales. Por ejemplo, pueden someterse a ensayo agentes para la actividad de estimulación de la diferenciación de células madre neurales en neuronas. Puede realizarse un seguimiento de la actividad a partir de la transducción neural o de marcadores de diferenciación propias de células maduras. De manera similar, pueden someterse a ensayo agentes para la actividad de estimulación de la diferenciación de células madre cardíacas en miocitos, realizando un seguimiento de la actividad a partir del nivel de excitación, de la capacidad de latir o de marcadores de diferenciación propios de células maduras.

También pueden cribarse agentes par ala actividad de estimulación o inhibición de diversas funciones de células diferenciadas. Entre estas funciones se incluyen promover la expresión o secreción de proteínas. Los agentes que se identifica que presentan estas funciones resultan útiles en terapia para modular la expresión de proteínas endógenas o de proteínas exógenas cuyas secuencias codificantes han sido introducidas en un sujeto mediante terapia génica. Por ejemplo, pueden cribarse agentes para la capacidad de estimular la secreción de insulina desde células de los islotes. Alternativamente, pueden someterse a ensayo agentes para la capacidad de estimular la expresión de un enzima exógeno introducido mediante ingeniería genética en células madre humanas que van a utilizarse en terapia génica.

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8. Procedimientos de terapia celular y de ingeniería de tejidos

Los procedimientos de trasplante también resultan útiles para cultivar células que van a utilizarse en terapia celular o en ingeniería de tejidos. Estos procedimientos resultan particularmente útiles para células que no pueden propagarse in vitro, o cuyas propiedades resultan negativamente afectadas por la propagación in vitro. En algunos procedimientos, los peces sirven como incubadora para la propagación de células trasplantadas, permitiendo que el número de células se incremente significativamente sin alcanzar un estado de diferenciación terminal. A continuación, se recuperan estas células de los peces y se introducen en un paciente en el sitio en el que se requiere regeneración de tejido. A continuación, las células experimentan una propagación y diferenciación adicionales in situ en el receptor. Los procedimientos para la terapia celular ex vivo se describen en Mayhew et al., Tissue Eng. 4:325-34, 1998; Wakitani et al., Tissue Eng. 4:429-44, 1998. En otros procedimientos, la propagación de las células en los peces resulta en la diferenciación en un tipo de tejido heterólogo reconocible, tal como un parche de piel. Después, el tejido heterólogo se recoge de los peces y se trasplanta intacto en un sujeto. Por ejemplo, puede extirparse tejido heterólogo de un pez y utilizarse para sustituir un parche de piel dañada o ausente en un sujeto. Se comentan los procedimientos de trasplante de piel en Mansbridge et al., Tissue Eng. 4:403-14, 1998. En otros procedimientos, se transforman células heterólogas con una secuencia de ácidos nucleicos adecuada para la terapia génica. A continuación, las células heterólogas se introducen en peces para la amplificación previa a su introducción en un paciente. En otros procedimientos, se introducen células madre hematopoyéticas humanas en peces para la producción a gran escala de plaquetas y glóbulos rojos humanos, que pueden recolectarse para el tratamiento de pacientes. En otros procedimientos, se introducen células de médula ósea humana en un pez para la amplificación, y su posterior recolección y utilización en el trasplante de médula ósea autóloga o alogénica. Entre otras aplicaciones de estos procedimientos se incluyen la producción de andamiajes para la ingeniería de tejidos, la producción de cartílago, válvulas cardíacas, reparación de huesos, reparación de ligamentos, implantes de menisco, trasplante de condrocitos autólogos, vasculogénesis de regeneración de nervios y la propagación de células pancreáticas, hepáticas o gliales.

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9. Otros procedimientos terapéuticos

En algunos procedimientos, el pez proporciona un incubador para propagar células cancerosas para la utilización posterior como vacuna. En estos procedimientos, las células cancerosas se obtienen a partir de una biopsia de un paciente, se trasplantan en un embrión de pez y se propagan. Las células propagadas, en un número considerablemente incrementado respecto a las células trasplantadas, seguidamente se recolectan. A continuación, las células recolectadas se matan y se reintroducen en el paciente. Las células muertas portan antígenos tumorales que estimulan una respuesta inmunológica contra las células cancerosas vivas en el paciente (ver, por ejemplo, Eck et al., Cancer Immunol. Immunother. 6:336-41, 1999; Carr-Brendel et al., J. Immunother. 22:415-22, 1999). Las células recolectadas también pueden utilizarse como inmunógeno en un animal de laboratorio para generar anticuerpos para la inmunoterapia pasiva en el paciente.

En otros procedimientos, se obtienen de un paciente poblaciones mixtas de células cancerosas y no cancerosas. Las células se separan en aislados clonales, y se introducen diferentes aislados clonales en diferentes peces. A continuación, se propagan las células en los peces. Tras la propagación, se criban las células para la presencia de un antígeno específico de cáncer. Las células que carecen de este antígeno se recuperan de sus peces huésped y se trasplantan nuevamente en el paciente del que se obtuvieron. Estos procedimientos resultan particularmente útiles para distinguir células cancerosas de no cancerosas en pacientes de trasplante de médula ósea.

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10. Procedimientos diagnósticos

Los presentes procedimientos también pueden utilizarse para el diagnóstico de biopsias de sujetos. Las células biopsiadas se trasplantan en un pez y se siguen tal como se describe en la Sección II, particularmente para su proliferación y/o metástasis. La proliferación y/o metástasis de las células trasplantadas es una indicación de la malignidad del tumor y del prognóstico del paciente. Las células trasplantadas también pueden cribarse con diversos tratamientos antineoplásicos, tales como la radiación y la quimioterapia, con el fin de determinar qué tratamiento resulta más apropiado para las células cancerosas en un paciente particular. Mediante la utilización de este bioensayo, puede determinarse el potencial clonogénico de las células de linfoma residuales en médula ósea, sangre periférica y líquidos corporales. Pueden utilizarse procedimientos análogos para detectar patógenos celulares o víricos en muestras de tejidos procedentes de pacientes. El cultivo de células dentro de los peces receptores permite la amplificación, con la que se detecta con mayor facilidad el patógeno. Estos procedimientos resultan particularmente útiles para analizar biopsias de pacientes que han recibido tejido trasplantado (ver, por ejemplo, Cohen et al., Pediatr. Transplant. 3:322-7, 1999; Carman et al., J. Heptatol. 2:195-201, agosto de 1999).

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11. Aplicaciones de investigación

El trasplante de células en peces también presenta varias aplicaciones en investigación básica. Por ejemplo, los procedimientos pueden utilizarse para realizar un seguimiento de la diferenciación de un linaje celular separadamente de otros tipos celulares del mismo organismo. Ello puede conseguirse trasplantando células no terminalmente diferenciadas en una población de peces, y después siguiendo los marcadores de diferenciación en las células trasplantadas y/o en los peces huésped a lo largo del tiempo. Las series que contienen sondas complementarias al ARNm proporciona un medio adecuado para el seguimiento (ver, por ejemplo, la patente WO nº 97/10365). Mediante la selección apropiada de sondas, resulta posible distinguir el ARNm de peces de aquél de las células trasplantadas en la misma mezcla de ARNm. Alternativamente, puede utilizarse la micromanipulación de tejidos para preparar muestras separadas de tejido a partir de células heterólogas y células huésped. Estos patrones de expresión resultan útiles en sí mismos, así como en ensayos de cribado de fármacos. Por ejemplo, si se determina que un patrón particular es característico de un estado particular de diferenciación, ese patrón puede utilizarse como parámetro de valoración en el cribado de agentes para la capacidad de inhibir o estimular la diferenciación.

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Ejemplo 1

Trasplante de células Hep2

Para someter a ensayo la factibilidad de trasplantar células humanas en embriones de pez cebra, los presentes inventores trasplantaron células derivadas de tejido canceroso humano: células HepG2 (ATCC nº HB-8065) derivadas de un hepatoblastoma humano que previamente se ha demostrado que forman tumores letales cuando se inyectan en ratones desnudos (Wenger et al., 1995; Chin et al., 1997). Además de formar tumores, las células HepG2 también secretan algunos factores presentes en las células hepáticas normales, incluyendo la proteína inductora del crecimiento vascular, VEGF. Esto hizo posible someter a ensayo la viabilidad de las células HepG2 mediante el análisis de los efectos del VEGF, incluyendo la formación incrementada de vasos y los defectos cardíacos (Drake y Little, 1995; Feucht et al., 1997) de las células HepG2, tanto observando el crecimiento de los tumores como utilizando tinciones vitales que identifican las células muertas y moribundas. Además, los presentes inventores pudieron identificar las células HepG2 tanto por su apariencia visual como utilizando anticuerpos específicos que reconocen antígenos humanos pero no de pez cebra.

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A. Materiales y métodos 1. Cultivo celular

Se mantuvieron células HepG2 tal como se indica en los procedimientos de la American Type Culture Collection (ATCC). En breve, las células se cultivaron en MEM (medio esencial mínimo) suplementado con glutamina, aminoácidos esenciales y piruvato. Las células se cultivaron hasta el 80% de confluencia y se recolectaron añadiendo tripsina/EDTA, se lavaron dos veces con el mismo medio de cultivo y se resuspendieron en PBS inmediatamente antes de la inyección.

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2. Trasplante

La técnica de trasplante utilizada es similar a la descrita por Ho y Kane, 1990. En breve, tras resuspender las células en PBS, se rellenó una micropipeta de vidrio estirado de diámetro de punta de 15 micrómetros d.i. y 18 micrómetros d.e. con las células. Ello permite la fácil penetración del embrión y la inyección de las células intactas. La micropipeta se unió a un micromanipulador y a un microinyector Cell Tram de aire comprimido (Eppendorf). Utilizando el micromanipulador, se insertó la punta de la micropipeta en el embrión y se expulsaron 10 a 50 células desde la punta utilizando presión positiva del Cell Tram. Se llevaron a cabo los trasplantes en tres regiones diferentes del embrión (figura 6):

1)

en la parte animal del embrión sin conocimiento a priori de la posición de las células trasplantadas en los huéspedes;

2)

en posiciones aleatorias en el vitelo;

3)

en el margen entre el embrión y la masa vitelina.

Además, se llevaron a cabo dos tipos de trasplante: a) trasplante en un único sitio; y b) inyecciones en múltiples sitios, en las que las células se dispersaron por todo el tejido en lugar de aglomerarse. Todos los trasplantes se llevaron a cabo en el estadio avanzado del desarrollo (1.000 a 2.000 células) o próximo al mismo.

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3. Manipulación de embriones

Se generaron embriones mediante apareamientos naturales entre los peces adultos de tipo salvaje. Previamente a la inyección, se trataron embriones en el estadio de 4 a 8 células con proteasa (1 mg/ml de medio para embriones) durante 5 minutos para eliminar los coriones. A continuación, los embriones se lavaron 5 veces en medio para embriones para eliminar tanto la proteasa como los coriones digeridos. Seguidamente, los embriones se dejó que se recuperasen en un vaso de vidrio durante varias horas en medio para embriones a 27ºC hasta que alcanzasen el estadio avanzado de desarrollo. Después, los embriones se introdujeron en un pocillo de reposo preparado a partir de agarosa al 1% en medio para embriones. Se alinearon 30 a 40 embriones lado a lado y se orientaron. Tras el trasplante, se extrajeron los embriones de la placa de soporte y se introdujeron en placas de cultivo recubiertas de ágar y se dejó que se recuperasen. Tras 24 horas, los embriones se transfirieron a nuevas placas de cultivo y se mantuvieron en agua para peces (Santa Cruz Technology) hasta la finalización del experimento.

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4. Marcaje celular

Antes de la recolección, las células se incubaron en una solución de marcaje Dil (Dil al 0,05% en sacarosa 0,3 M) durante 15 minutos. Dil es un trazador de carbocianina lipofílico (Molecular Probes) utilizado en una diversidad de aplicaciones de trazado celular de largo plazo, incluyendo estudios de migración de trasplantes (Serbedzija et al., 1992). Utilizando microscopía de epifluorescencia, se visualizó el marcaje de Dil tanto en células individuales trasplantadas como en masas celulares.

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5. Detección de anticuerpos en células trasplantadas

Las células HepG2 trasplantadas se inmunodetectaron utilizando un anticuerpo anti-queratinocito humano 18 (REF). La citoqueratina 18 es una proteína filamentosa intermediaria que se ha demostrado que se expresa en HepG2 bajo una diversidad de condiciones (Cruickshank et al., J. Hepatol. 29:550-8, 1998). Se fijaron embriones trasplantados con paraformaldehído durante 1 hora a temperatura ambiente y se trataron con metanol al 100% durante la noche a -20ºC. Los embriones se rehidrataron con PBST (Tween 20 al 0,1% en PBS) y se trataron con solución blanqueante (H2O2 al 10%) durante 20 minutos. Tras lavar con PBST, los embriones se incubaron en solución de bloqueo (suero bovino inactivado al 20%, DMSO al 1% en PBST) durante una hora a temperatura ambiente y bajo agitación. Seguidamente se añadió el primer anticuerpo, IgG monoclonal de ratón anti-queratinocito humano 18 (Santa Cruz Technology) (dilución 1:2.000) y se incubó durante dos horas a temperatura ambiente bajo agitación. Se llevaron a cabo cuatro lavados con la misma solución de bloqueo y después se añadió el segundo anticuerpo, IgG de conejo antiratón conjugado con fosfatasa alcalina (dilución 1:2.000) y se incubó durante dos horas a temperatura ambiente bajo agitación. Los embriones se lavaron dos veces con la misma solución de bloqueo y finalmente se equilibraron en solución NTMT (MgCl_{2} 50 mM, NaCl 100 mM, Tris/HCl 100 mM, pH 9,5). Finalmente, los embriones se tiñeron para fosfatasa alcalina utilizando NBT/BCIP y se visualizaron mediante microscopía óptica.

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6. Tinción de vasos

Se fijaron embriones en paraformaldehído al 4% y se tiñeron para actividad endógena de fosfatasa alcalina. Tras la fijación, los embriones se permeabilizaron en acetona a -20ºC, se equilibraron en tampón NTMT (Tris-HCl 0,1 M, MgCl 50 mM, NaCl 0,1 M, Tween-20 al 0,1%) a temperatura ambiente y después se tiñeron con 75 mg/ml de NBT y 50 mg/ml de X-fosfato.

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7. Análisis de transferencia western

Se resuspendieron embriones descorionados en tampón de carga de gel SDS, se sometieron a ebullición durante 2 minutos y se centrifugaron durante 10 minutos a 14.000 rpm. A continuación, las muestras de sobrenadante se cargaron en un gel de SDS al 10%-poliacrilamida. Se utilizaron como estándares proteínas caleidoscopio preteñidas (Bio-Rad). Tras la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (BA85, Schelicher y Schuell) durante 4 horas a 4ºC aplicando 120 a 200 mA. Los filtros se bloquearon con el primer anticuerpo (IgG monoclonal de ratón anti-queratinocito humano 18, Santa Cruz Technology, dilución 1:2.000) durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo agitación. Se llevaron a cabo cuatro lavados con la misma solución de bloqueo y después se añadió el segundo anticuerpo (IgG de conejo antiratón conjugado con fosfatasa alcalina, dilución 1:2.000) y se incubó durante dos horas a temperatura ambiente bajo agitación. La reacción de unión anti-queratinocito 18 se visualizó utilizando transferencia TMB de una etapa (3,3'-5,5'-tetra-metil-bencidina) (Pierce).

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8. Tinción con anticuerpos

Se recolectaron embriones 24 horas tras el trasplante y se tiñeron con anticuerpo monoclonal IgG de ratón anti-queratinocito humano 18, que reconoce las células HepG2 pero que no se une a ningún antígeno endógeno de pez. Con este anticuerpo los presentes inventores pudieron detectar las células marcadas tanto en tejido embrionario como en el vitelo. Además, observaron que estas células con frecuencia se encontraban en posición adyacente a los sitios de defectos morfológicos que se presumía habían sido inducidos por las células trasplantadas.

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9. Marcaje con BrdU

La 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) es un marcador de la etapa S mitótica. Para someter a ensayo para proliferación, se inyectó una solución 3 \muM de BrdU (Sigma) en embriones de pez cebra xenoinjertados de 24 horas en los que se había trasplantado previamente células. Se incubaron embriones durante 24 horas para permitir la incorporación del BrdU en el ADN de las células trasplantadas y en las células del huésped. A continuación, se recogieron los embriones, se fijaron con PFA al 4% a temperatura ambiente, y se deshidrataron hasta el metanol al 100%.

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B. Resultados

El 80% de los 357 embriones inyectados con células sobrevivieron 24 horas a la inyección. Se observaron células HepG2 opacas en aproximadamente el 10% de los animales supervivientes. No existía correlación evidente entre la localización de la inyección y la posterior observación de células en el embrión. Veinticuatro horas tras el trasplante, los embriones en los que eran visibles células HepG2 podían dividirse en tres grupos diferentes:

1.

embriones de apariencia normal pero que presentaban grandes masas celulares en el vitelo (figura 1),

2.

embriones de apariencia normal, pero que presentaban células individuales en el cuerpo (figura 2), y

3.

embriones que presentaban defectos morfológicos y una gran masa de células (figura 3).

Los grupos 1 y 3 proporcionan ejemplos de la capacidad de formación de tumores de las células HepG2. En ambos casos, las masas celulares observadas se agrandaron con el tiempo, sugiriendo que las células HepG2 estaban proliferando. Además, cuando las masas se encuentran en el cuerpo del embrión, los presentes inventores con frecuencia observaron un efecto teratogénico sobre los embriones que no pudo explicarse únicamente por la presencia mecánica de la masa celular (figura 4). Ello sugiere que las células HepG2 segregan factores que afectan al embrión. Además, los presentes inventores con frecuencia observaron células de pez cebra incorporadas en la masa celular (figura 5), sugiriendo que las células HepG2 podrían estar transformando las células de pez cebra. El segundo grupo también sugiere que las células HepG2 pueden experimentar metástasis en el embrión de pez. En varios casos, los embriones con grandes masas de células HepG2 murieron 48 a 72 horas tras el trasplante. En contraste, los embriones con masas de tamaño reducido o células individuales dispersas sobrevivieron 7 días, tiempo en el que se finalizó el experimento.

En los embriones, el VEGF exógeno (de pez cebra o de otras especies), que es conocido que segrega las células HepG2, causa tanto un incremento de la formación de vasos como defectos cardíacos (Drake y Little, 1995; Feucht et al., 1997). Ambos fenómenos se observaron en embriones que presentaban masas visibles de células HepG2. La figura 5 muestra un embrión en el que se encontraban presentes células HepG2 en el pericardio. El corazón presentaba claras malformaciones. La tinción con fosfatasa alcalina endógeno de los embriones con grandes masas celulares en el vitelo para la formación de vasos mostró un crecimiento extensivo de vasos sanguíneos en el vitelo y regiones circundantes, donde no se observan normalmente. Los presentes inventores también observaron un engrosamiento de los vasos grandes, incluyendo la aorta dorsal y la vena ventral.

Para confirmar que las células HepG2 trasplantadas eran viables, los presentes inventores examinaron embriones xenoinjertados para la presencia de VEGF humana (VEGFh) y AFP humana (AFPh), dos proteínas secretadas normalmente por las células HepG2 en cultivo y que se encuentran presentes en la sangre de los pacientes diagnosticados con carcinoma hepatocelular (Huber, 1985; Eraiser et al., 1998; Louha et al., 1997). También se han correlacionado los niveles elevados de VEGFh con efectos negativos sobre el desarrollo del corazón en peces cebra y en otros vertebrados (Drake et al., 1995; Feucht et al., 1997; Serbedzija, 1999). Para estos experimentos, se tiñeron embriones xenoinjertados con anticuerpos humanos específicos para VEGFh o para AFPh, y estos anticuerpos se detectaron utilizando anticuerpos secundarios marcados con RPE. Debido a que los espectros de fluorescencia de Dil y de RPE son similares, los trasplantes se llevaron a cabo utilizando células HepG2 no marcadas. Se recolectaron embriones 24 a 72 horas después del trasplante. Las células trasplantadas mostraban características celulares apropiadas, incluyendo la producción de proteínas. El 100% de los embriones teñidos para VEGF (100) contenían células marcadas situadas en masas celulares. Además, en 50% de los embriones VEGFh-positivos, se detectaron células individuales marcadas con RPE en estrecha proximidad a la masa celular. Tal como se mostró mediante tinción de VEGFh, 100% de los embriones teñidos para AFPh presentaban células marcadas en las masas celulares (figura 5C y D). En contraste con la tinción de VEGFh en los embriones AFPh-positivos, no se observaron células fuera de la masa celular, con independencia del momento en que se recolectaron los embriones. Tanto para los anticuerpos de VEGFh como para los de AFPh, la tinción se encontraba restringida a las células HepG2. No se observó marcaje de VEGFh ni de AFPh en los embriones no xenoinjertados de control.

Para ensayar para la proliferación, se inyectó una solución 3 \muM de BrdU (Sigma) en embriones xenoinjertados de 24 horas de pez cebra en el que se habían trasplantado células previamente. Los embriones se incubaron durante 24 horas para permitir la incorporación de BrdU en el ADN de las células trasplantadas y en las células huésped. A continuación, se recolectaron los embriones, se fijaron con PFA al 4% a temperatura ambiente, y se deshidrataron hasta metanol al 100%. Marcaje doble anti-BrdU y anti-CK18: para identificar las células HepG2 que habían incorporado BrdU, los embriones se tiñeron doblemente utilizando anticuerpos contra BrdU y CK18. El protocolo era similar al protocolo de anticuerpos descrito anteriormente, con las modificaciones siguientes: 1) previamente a la incubación en solución de bloqueo, se sumergieron embriones marcados con BrdU en ácido hidroclórico 2 N durante 30 minutos para incrementar la accesibilidad del ADN para el anticuerpo; 2) tras la incubación con anti-CK18 y su anticuerpo secundario conjugado con RPE, se incubaron embriones con un anticuerpo monoclonal conjugado con FITC contra BrdU (Sigma). A continuación, los anticuerpos se visualizaron utilizando un microscopio de epifluorescencia.

Se marcaron todas las células en proliferación, incluyendo las células trasplantadas y las células huésped. Específicamente con el fin de identificar las células HepG2 en proliferación, los presentes inventores llevaron a cabo un experimento de doble marcaje utilizando anticuerpo anti-CK18 específico humano. Los presentes inventores detectaron BrdU y anti-CK18 utilizando un anticuerpo secundario conjugado con FITC y un anticuerpo secundario conjugado con RPE, respectivamente. Tal como se ha descrito anteriormente, se llevaron a cabo trasplantes utilizando células HepG2 no marcadas. 24 horas después del trasplante se recogieron 100 embriones xenoinjertados en los que resultaban visibles masas de células HepG2. A continuación, se inyectó una solución 3 \muM de BrdU en el vitelo de 80 de los embriones xenoinjertados. Seguidamente, se dejó que los embriones se desarrollaron durante 24 horas adicionales antes de su fijación y tinción. Aunque el anticuerpo anti-BrdU marcó células tanto HepG2 como del huésped, sólo las células HepG2 resultaron marcadas por ambos anticuerpos (fig. 7). Tras la inyección de BrdU, 72 de los 80 embriones xenoinjertados contenían células marcadas con ambos anticuerpos. En contraste, los embriones xenoinjertados de control, que no habían sido inyectados con BrdU, contenían únicamente células marcadas con anti-CK-18. Este experimento muestra claramente que las células HepG2 trasplantadas proliferan en el embrión de pez cebra. Las masas de células HepG2 en el embrión de pez cebra son histológicamente similares a los tumores de HepG2 xenoinjertados en ratones adultos. Para determinar si las masas de células HepG2 eran morfológicamente similares a tumores generados en los modelos de ratón y a sus contrapartidas humanas, los presentes inventores llevaron a cabo un examen histológico de los embriones xenoinjertados recogidos 24 y 48 horas después del trasplante. Aunque las masas celulares en el embrión de pez cebra eran de menor tamaño (100 a 300 \mum de diámetro) que los tumores observados en ratones (7 a 10 mm; Vucenik et al., 1998), la morfología general de las células HepG2 en las masas celulares era similar (Klein et al., 1989). Específicamente, las células HepG2 eran redondas y presentaban poco citoplasma (fig. 8). Las células HepG2 resultaban fácilmente identificables en secciones de tejido debido a que los núcleos de las células HepG2 eran de mayor tamaño y más compactos que los núcleos de las células de pez cebra. En contraste con las células huésped, las células HepG2 se encontraban estrechamente empaquetadas, con poco o ningún espacio extracelular entre las células. Las células con núcleos de menor tamaño, presumiblemente células de pez cebra, también se encontraban presentes en las masas de células HepG2. No se observó evidencia de espacio vacuolado en ninguna de las masas celulares, que sugeriría que las células trasplantadas se estarían muriendo.

Para confirmar la metástasis, los presentes inventores trasplantaron células marcadas que podían trazarse a lo largo de varios días. Previamente al trasplante, las células HepG2 se marcaron con Dil y después se recolectaron mediante la adición de tripsina/EDTA, se lavaron dos veces con medio de cultivo, y se resuspendieron en PBS antes de su trasplante en el embrión huésped. 24 horas después del trasplante, los embriones huésped se cribaron para identificar aquellos que presentaban una sola masa de células marcadas. Se continuó observando estos embriones, identificando las células que dejaban la masa y se diseminaban a otras regiones del embrión. Para confirmar que las células marcadas eran células HepG2, se tiñeron los embriones con anticuerpo anti-citoqueratina 18. Los presentes inventores trasplantaron 100 embriones; a las 24 horas del desarrollo, la totalidad de los 95 embriones supervivientes contenían masas celulares marcadas. A continuación, se seleccionaron 24 embriones que contenían una sola masa cohesiva de células marcadas para seguir observándolos. A las 48 horas del desarrollo, 22/24 embriones contenían células marcadas con Dil fuera de la masa celular original (fig. 9); a las 72 horas del desarrollo, la totalidad de los 22 embriones contenía células individuales marcadas con Dil asociadas con la vasculatura. Específicamente, se encontraron células individuales: 1) en el mesénquima de la cola contiguo a la arteria dorsal y/o la vena axial, 2) en toda la cabeza contiguo a los vasos craneales, y 3) dentro de la pared del corazón, en el miocardio o en el endocardio. A los 6 días, se observaron nuevas masas celulares en la cola (fig. 9) y en la cabeza, indicando que las células individuales HepG2 marcadas, observadas en dichas localizaciones en puntos del tiempo anteriores, estaban proliferando.

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C. Conclusión

El experimento anterior muestra que el conocimiento establecido de que las células cancerosas humanas no pueden sobrevivir a la temperatura de crecimiento del pez cebra (es decir 27ºC en la presente solicitud) es incorrecto. Además, las células aparentemente no sólo sobreviven, sino que forman masas que pueden resultar similar al tumor formando cuando se inyectan HepG2 en ratones desnudos. Además, algunas células tumorales aparentemente experimentan metástasis en el embrión del pez cebra. De esta manera, puede utilizarse el pez cebra para cribar para agentes para actividad contra las células cancerosas humanas.

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Ejemplo 2

Trasplante con otras líneas celulares humanas y células tumorales humanas

Se han trasplantado algunos otros tipos celulares humanos en pez cebra utilizando los mismos procedimientos descritos para las células HEP-2. Los resultados se resumen en la Tabla 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 1 Resumen de xenoinjertos con diversas líneas celulares

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Todas las propiedades se determinaron mediante observación microscópica. La presencia de masa celular indica cierta proliferación de las células trasplantadas. El crecimiento de masa celular indica una proliferación más extensiva. La presencia de células trasplantadas en todo el embrión, como es el caso de las células HepG2 y CCL-18, es indicativo de metástasis. La presencia de células NT2D, células madre neurales, en el SNC indica que las células trasplantadas responden a la señalización endógena desde dentro de los peces receptores.

Por todo lo anterior, debería quedar claro que la invención incluye un número de usos que pueden expresarse concisamente a continuación. La invención incluye la utilización de un pez como recipiente para mantener la viabilidad de y/o la propagación de células heterólogas. La invención incluye además la utilización de células heterólogas introducidas en un pez para cribar un medicamento potencial para una respuesta de las células. La invención incluye además la utilización de células heterólogas transplantadas en un pez para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente. La invención incluye además la utilización de células heterólogas transplantadas en un pez para el diagnóstico de una célula patógena o cancerosa en una muestra de tejido del paciente. Aunque la descripción anterior se ha descrito con cierto detalle por motivos de claridad y comprensión, será evidente para aquellos expertos en la materia a partir de una lectura de esta descripción que se pueden realizar varios cambios en la forma y en algunos detalles sin alejarse del verdadero ámbito de la invención. Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar la invención, pero no para limitar su ámbito de actuación; otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes a aquellos expertos en la materia y están acompañadas por las reivindicaciones de la invención. El ámbito de la invención debería determinarse, por tanto, no en referencia a la descripción anterior, sino que debería determinarse en referencia a las reivindicaciones adjuntas.

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Referencias

Chen and Fishman (1996) Development 123:293-302.

Chin, Kurashima, Ogura, Tajiri, Yoshida and Esumi (1997) Oncogene 24; 15(4):437-42.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9512608 A [0024]

\bullet WO 9306121 A [0024]

\bullet WO 9408051 A [0024]

\bullet WO 9535503 A [0024]

\bullet WO 9530642 A [0024]

\bullet WO 9118980 A [0024]

\bullet WO 9903852 A [0030] [0033]

\bullet WO 9710365 A [0045]

Documentos que no son patentes citados en la descripción

\bulletOWEN et al.Ciba Fdn. Symp., 1988, vol. 136, 42-46 [0011]

\bulletOWEN et al. J. Cell Sci., 1987, vol. 87, 731-738 [0011]

\bullet Medaka(killifish): Biology and Strains. Keigaku Pub. Co, 1975 [0018]

\bulletROSEN; GRETCH. Mol. Med. Today, 1999, vol. 5, 393-399 [0038]

\bulletMAYHEW et al. Tissue Eng., 1998, vol. 4, 325-34 [0041]

\bulletWAKITANI et al. Tissue Eng, 1998, vol. 4, 429-44 [0041]

\bulletMANSBRIDGE et al. Tissue Eng, 1998, vol. 4, 403-14 [0041]

\bulletECK et al. Cancer Immunol. Immunother., 1999, vol. 6, 336-41 [0042]

\bulletCARR-BRENDEL et al. J. Immunother., 1999, vol. 22, 415-22 [0042]

\bulletCOHEN et al. Pediatr. Transplatn., 1999, vol. 3, 322-7 [0044]

\bulletCARMAN et al. J. Heptatol., August 1999, vol. 2, 195-201 [0044]

\bulletCRUICKSHANK et al. J. Hepatol., 1998, vol. 29, 550-8 [0052]

\bulletCHEN;FISHMAN. Development, 1996, vol. 123, 293-302 [0068]

\bulletCHIN; KURASHIMA; OGURA; TAJIRI; YOSHIDA; ESUMI. Oncogene, 1997, vol. 15 (4), 437-42 [0068]

\bulletDRAKE; LITTLE. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, vol. 92 (17), 7657-61 [0068]

\bulletFEUCHT; CHRIST; WILTING. Am JPathol, November 1997, vol. 151 (5), 1407-16 [0068]

\bulletGRANATO; NUSSELIEN-VOLHARD. Cur. Op. Gen. Dev., 1996, vol. 6, 461-468 [0068]

\bulletGREINER; HESSELTON; SHULTZ. Stem Cells, 1998, vol. 16 (3), 166-177 [0068]

\bulletHAMMERSCHMIDT; SERBEDZIJA; MCMAHON. Genes and Devel., 1996, vol. 10, 2452-2461 [0068]

\bulletHO; KANE. Nature, 1990, vol. 348, 728-730 [0068]

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\bulletWESTERFIELD. The Zebrafish Book. 1993 [0068]

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\bulletYANG; TANG; ZHANG; CHENG; MACK. Cancer Letters, 1997, vol. 117, 93-98 [0068]

Claims (65)

1. Procedimiento de análisis celular, comprendiendo:

introducir una o más células heterólogas en una larva o pez cebra adulto; poner en contacto el pez cebra con un agente; y

analizar una propiedad de las células o del pez cebra, en el que el análisis comprende determinar si la propiedad responde a la administración del agente, y en el que las células heterólogas no son células embrionarias humanas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células heterólogas permanecen viables por lo menos hasta la etapa de análisis.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además cultivar los peces cebra de manera que las células heterólogas proliferan en el pez cebra.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la propiedad es un perfil de expresión de ARNm de las células o de los peces cebra.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el análisis comprende ensayar para la presencia de un conjunto de marcadores de diferenciación en las células heterólogas o en los peces cebra.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente es un factor de crecimiento, una hormona, una citoquina, un producto natural o un elemento de una biblioteca combinatorial.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el agente es citotóxico.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la propiedad es un marcador de diferenciación, supervivencia de los peces cebra, movimiento de las células heterólogas respecto a un sitio inicial de introducción, muerte de células heterólogas o de células de los peces cebra, o proliferación de las células
heterólogas.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la propiedad es la proliferación de las células heterólogas.

10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la propiedad es una respuesta teratogénica de los peces frente a la introducción de células heterólogas.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la propiedad es la expresión de una proteína dentro de las células heterólogas.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la propiedad es la secreción de una proteína desde las células heterólogas.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células son células madre.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que las células son células madre pluripotentes o mesenquimales.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que las células son células diferenciadas.

16. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células son miocitos.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que las células son condrocitos.

18. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células son células pancreáticas, células renales, hepáticas, gliales, endoteliales o epidérmicas.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células heterólogas son células humanas no embrionarias.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además recuperar las células heterólogas de los peces cebra.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que las células heterólogas se recuperan tras la proliferación en los peces cebra.

22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las células heterólogas procedente de una biopsia de un paciente.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que la propiedad es la proliferación o metástasis de las
células.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que el análisis indica el prognóstico del paciente.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 7 y 9 a 12, en el que las células heterólogas son células bacterianas.

26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, que comprende además infectar las células heterólogas con un virus antes o después de introducir las células en los peces cebra.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que el virus infecta las células heterólogas sin infectar las células de los peces cebra.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que las células son células cancerosas.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que el análisis comprende realizar un seguimiento de un efecto del agente sobre las células cancerosas.

30. Procedimiento según la reivindicación 28 ó 29, en el que las células cancerosas son células humanas.

31. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que las células cancerosas procedente de una línea celular humana.

32. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que las células cancerosas proceden de un tumor humano.

33. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, en el que las células cancerosas se seleccionan de entre el grupo que consiste de leucemias, sarcomas, blastomas, teratomas, gliomas, neurofibromatomas y carcinomas.

34. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que el análisis comprende determinar un efecto del agente sobre la angiogénesis inducida por tumor.

35. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de introducción comprende microinyectar las células heterólogas en el embrión de pez.

36. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente se introduce en el medio que contiene los peces cebra.

37. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células heterólogas se introducen antes de que el pez cebra entre en contacto con el agente.

38. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 y 28 a 33, en el que las células heterólogas proliferan en el pez cebra antes de que el pez cebra entre en contacto con el agente.

39. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 y 28 a 33, en el que las células heterólogas experimentan metástasis en los peces cebra antes de administrar el agente.

40. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, en el que el agente se administra antes de la introducción de las células heterólogas.

41. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 y 28 a 33, en el que el efecto del agente es una inhibición de la proliferación de las células heterólogas respecto a la proliferación en un pez cebra de control en el que se han introducido las células heterólogas sin el agente.

42. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, en el que el efecto del agente es una inhibición de la metástasis de las células cancerosas respecto a la metástasis que se produce en un pez cebra de control en el que se han introducido las células cancerosas sin el agente.

43. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el análisis comprende llevar a cabo un ensayo para determinar si el agente presenta actividad contra células en el pez cebra.

44. Procedimiento según la reivindicación 43, en el que el ensayo comprende realizar un seguimiento del desarrollo de uno o más órganos en una larva de pez cebra.

45. Procedimiento según la reivindicación 43, en el que el seguimiento comprende detectar un defecto morfológico en una larva de pez cebra.

46. Procedimiento según la reivindicación 43, en el que el ensayo comprende detectar células necróticas en el pez cebra.

47. Procedimiento según la reivindicación 43, en el que el ensayo comprende llevar a cabo hibridación in situ para detectar ARNm en el pez cebra.

48. Procedimiento según la reivindicación 43, en el que el ensayo comprende teñir con un anticuerpo marcado para detectar una proteína en el pez cebra.

49. Procedimiento según la reivindicación 43, en el que las células cancerosas se marcan con un marcador.

50. Procedimiento según la reivindicación 49, en el que el marcador es un marcador fluorescente.

51. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el análisis comprende la observación visual de las células heterólogas o de los peces cebra.

52. Procedimiento según la reivindicación 53, en el que la observación visual se lleva a cabo utilizando un microscopio o un lector de microplacas.

53. Procedimiento de cribado de un agente para actividad contra células cancerosas, que comprende:

introducir una o más células cancerosas en una población de larvas o peces cebra adultos;

administrar el agente a la población de peces cebra; y

realizar un seguimiento del efecto del agente sobre el desarrollo de las células cancerosas en la población peces cebra.

54. Procedimiento según la reivindicación 53, en el que el seguimiento comprende determinar una EC50 para el efecto del agente sobre el desarrollo de las célula cancerosas en los peces cebra.

55. Procedimiento según la reivindicación 53, que comprende además detectar una LD50 del agente sobre la población de peces cebra.

56. Procedimiento de propagación de células, que comprende:

introducir una o más células heterólogas en una larva o pez cebra adulto; cultivar el pez cebra bajo condiciones en que las células proliferan; y

recuperar las células proliferadas, en el que las células no son células embrionarias humanas.

57. Procedimiento según la reivindicación 56, en el que las células se diferencian durante el curso de la proliferación, y las células se recuperan en forma de tejido diferenciado.

58. Procedimiento según la reivindicación 56, en el que las células son células madre.

59. Procedimiento según la reivindicación 56, en el que las células son células humanas.

60. Procedimiento según la reivindicación 56, en el que las células heterólogas se seleccionan de entre el grupo que consiste de osteoblasto, osteoclasto, condrocitos, miocitos, neuronas, células pancreáticas, células hepáticas, células gliales y células renales.

61. Procedimiento de diagnóstico de una muestra para una célula cancerosa o patógeno, que comprende:

introducir una población de células obtenidas de un paciente en una larva o pez cebra adulto; y

detectar una propiedad de la población de células para indicar si la población comprende una célula cancerosa o un patógeno.

62. Procedimiento de análisis celular, que comprende:

introducir una o más células heterólogas en una larva o pez cebra adulto;

analizar una propiedad de las células o del pez cebra; y

recuperar las células heterólogas del pez cebra, en el que las células heterólogas no son células embrionarias humanas.

63. Procedimiento según la reivindicación 62, en el que las células heterólogas se recuperan tras la proliferación en los peces cebra.

64. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el pez cebra es un pez cebra de tipo salvaje.

65. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 52, en el pez cebra es un pez cebra mutante.