ES2324011B1

ES2324011B1 - Procedimiento para la obtencion de celulas madre mesenquimales a partir de la fraccion mononuclear de la medula osea humana.

Info

Publication number: ES2324011B1
Application number: ES200900005A
Authority: ES
Inventors: Joan GARCIA LOPEZ; Luciano Rodriguez Gomez; Jordi Joan Cairo Badillo; Arnau PLA CALVET; Francesc Godia Casablancas
Original assignee: Banc de Sang i Teixits
Current assignee: Banc de Sang i Teixits
Priority date: 2009-01-02
Filing date: 2009-01-02
Publication date: 2010-03-15
Anticipated expiration: 2029-01-02
Also published as: US20110201111A1; MX2011003899A; CO6341651A2; WO2010076349A2; WO2010076349A3; ES2324011A1; CN102388129A

Abstract

Procedimiento para la obtención de células madre mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de la médula ósea humana.

La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de células madre mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de células de médula ósea humana que utiliza como suplemento suero humano del tipo AB. Dicho procedimiento comprende las etapas de obtención de dicha fracción mononuclear de médula ósea, la etapa de recuperación y pre-expansión de las células madre mesenquimales, y la etapa de expansión de las células madres mesenquimales hasta la obtención de la dosis clínica necesaria para su uso terapéutico.

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de células madre mesenquimales. Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de células madre mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de células de médula ósea humana. Dicho procedimiento comprende las etapas de obtención de dicha fracción mononuclear de médula ósea, la etapa de recuperación y pre-expansión de las células madre mesenquimales, y la etapa de expansión de las células madres mesenquimales hasta la obtención de la dosis clínica necesaria para su posible uso terapéutico.

Las células madre mesenquimales (CMM) son células multipotentes, que han mostrado su eficacia en el tratamiento de lesiones musculoesqueléticas y en el mejoramiento de la función cardiaca en enfermedades cardiovasculares (Le Blanc K., Pittenger M. Mesenchymal stem cells: progress toward promise. Cytotherapy 2005;7:36-45). Las CMM pueden ser aisladas de varios tejidos de adultos, entre los que se encuentran la médula ósea, tejido adiposo y sangre del cordón umbilical. Además, dichas células pueden ser expandidas ex vivo.

La fracción de mononuclear médula ósea (CMN) se obtiene mediante una operación de separación basada en la centrifugación de sangre proveniente de la médula ósea. La CMN es un conjunto heterogéneo de células, entre las que se pueden encontrar, además de las células madre mesenquimales, las células hematopoyéticas progenitoras. Estas dos poblaciones se encuentran en una concentración muy baja respecto a las células hematopoyéticas maduras, también presentes en las CMN.

Fridenshtein y otros (Fridenshtein A. J., Deriglazova U. F., Kulagina N. N. et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp. Hematol. 1974 Vol. 2. P. 83-92) obtuvieron por primera vez células madre mesenquimales a partir de médula ósea, basándose en la capacidad de las células madre mesenquimales para adherirse a superficies plásticas, propiedad que no poseen la mayoría de las células hematopoyéticas. La desventaja de este método es el bajo rendimiento obtenido en la recuperación de células mesenquimales atribuible a la baja prevalencia de este tipo celular en la médula ósea, que se estima entre el 0,001 al 0,01% (Alhadlag A and Mao J. Mesenchymal Stem Cells: Isolation and Therapeutics. Stem Cells and Development. 2004. 13: 436-448 (3). Sin embargo, la adhesión a plásticos se ha establecido como punto de partida para seguir mejorando los métodos de obtención de células madre mesenquimales.

Heynesworth y otros han logrado obtener células madre mesenquimales con una alta capacidad de adherencia, elevada tasa de proliferación y el mantenimiento de la multipotencialidad durante un período de tiempo largo (Heynesworth S. E., Goshima J., Goldberg V. M., Calplan A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from the human bone marrow//Bone. 1995. Vol. 13. P. 81-85.) utilizando suero fetal bovino como suplemento del medio de cultivo. La desventaja de este método consiste en que el hecho de que la búsqueda de un lote adecuado para el cultivo de las células y el análisis correspondiente del suero fetal bovino conlleva mucho tiempo y es muy trabajoso. Además, debido a la gran variación lote a lote que presenta el suero fetal bovino, no es posible garantizar la reproducibilidad de los resultados.

Otra desventaja de este método es que para obtener las cantidades suficientes de células madres mesenquimales para su uso clínico, las células deben ser cultivadas entre 4 y 6 semanas, e incluso en algunas circunstancias, tales como en pacientes con enfermedades del metabolismo óseo, el tiempo de cultivo puede ser superior. La razón por la que se necesitan estos tiempos tan elevados de cultivo, como se ha mencionado anteriormente, es la poca cantidad de células mesenquimales que es posible obtener de la médula ósea.

Un periodo largo de cultivo celular puede aumentar el riesgo de contaminación y aumenta considerablemente los costes de mantenimiento del cultivo. Además, a medida que aumenta el número de duplicaciones se corre el riesgo de que las células pierdan multipotencialidad o entren en senescencia, lo que compromete su capacidad terapéutica.

La metodología utilizada habitualmente para buscar una disminución de los tiempos de cultivo de células mesenquimales centra su atención en factores tales como los suplementos del medio de cultivo, el tipo de superficie plástica, la dosis de siembra y los medios de cultivo empleados (Sotiropolou PA, Pérez SA, Salagianni M, Baxevanis CN, Papamichail M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells 2006; 24: 462-471).

Un objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento de cultivo ex vivo de células madre mesenquimales a partir de médula ósea humana en el que se reduce el tiempo y el número de duplicaciones necesarias para la obtención de la dosis clínica de células madres mesenquimales, cuando se compara con los métodos tradicionales. Este procedimiento se basa en el efecto sinérgico a partir de combinar unas condiciones muy específicas de aislamiento de células mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de médula ósea, con la utilización de suero humano del grupo sanguíneo AB como suplemento del medio de cultivo. Este se usa en sustitución de costoso y poco reproducible suero fetal bovino. Además, el suero AB humano presenta las ventajas de ser más económico y tener mayor reproducibilidad que el suero fetal bovino. A su vez, las condiciones de aislamiento propuestas facilitan la recuperación de un mayor número de células mesenquimales de la fracción mononuclear con respecto a las condiciones utilizadas en las estrategias convencionales. Este hecho es de especial relevancia si se tiene en cuenta que cuando más elevado sea el número inicial de células mesenquimales aisladas disponibles menor es el tiempo y recursos necesarios para la obtención de la dosis clínica requerida.

Dichas condiciones de aislamiento se han obtenido mediante el estudio sistemático de la influencia sobre la recuperación de células mesenquimales a partir del inóculo y el tiempo de lavado de las células mononucleares de médula ósea en medios de cultivo suplementados con suero humano AB.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento que permita disponer de una copia idéntica de seguridad de las células madres mesenquimales, que poseen las mismas características de las células madre mesenquimales iniciales en cuanto a capacidad de proliferación y diferenciación.

El procedimiento de la presente invención puede ser aplicado para la obtención de células mesenquimales provenientes de otras fuentes, tales como tejido adiposo, páncreas, hígado, músculo esquelético, dermis, membrana sinovial, hueso trabecular, sangre de cordón umbilical, tejido pulmonar, pulpa dental y ligamento periodontal. En el caso que la fuente de células mesenquimales sea diferente a la médula ósea, el tratamiento inicial de la muestra será diferente, adecuándose para cada tipo celular que se utilice como fuente.

Descripción detallada de la invención

En consecuencia, un objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento para la obtención de células madre mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de médula ósea humana, obtenida mediante centrifugación en gradiente de densidad, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) Recuperación y pre expansión de las células madre mesenquimales, mediante un cultivo primario, en el que las células mononucleares de médula ósea se siembran en medio de cultivo DMEM suplementado con suero AB humano (10%) siguiendo el siguiente esquema de cultivo:

-: las células mononucleares del cultivo se lavan en el día 5 con solución salina y se añade medio de cultivo suplementado con suero humano AB (10%).

-: se recambia el medio de cultivo a los 9 días por el mismo medio anteriormente mencionado

-: se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 días. Estas células generan el cultivo de expansión (c).

b) Cultivo secundario: resiembra de las células mononucleares lavadas en (a) en medio de cultivo suplementado con suero AB humano (10%) siguiendo el siguiente esquema de cultivo:

-: el cultivo se lava en el día 5 con solución salina y se añade medio de cultivo suplementado con suero humano AB (10%).

-: se recambia el medio de cultivo por el mismo medio anteriormente mencionado el día 9.

-: se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 días. Se recuperan las células madre mesenquimales que son congeladas y almacenada en depósitos de nitrógeno.

c) Cultivo de expansión: expansión de las células mesenquimales asiladas en (a) a los 12 días. Se resiembran y expanden estas células en medio de cultivo suplementado con suero AB humano (10%) siguiendo el siguiente esquema de cultivo:

-: se recambia el medio de cultivo a los 3 y 6 días por el mismo medio anteriormente mencionado.

-: se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 días. Estas células se acondicionan para su traslado a quirófano.

En una realización preferente en el cultivo primario se siembran entre 200 000 y 400 000 células por centímetro cuadrado de superficie. Además, preferentemente el medio de cultivo utilizado, tanto en el cultivo primario como en el secundario (etapa b), es Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con un suplemento de suero AB humano al 10% (v/v).

El procedimiento de la presente invención es ventajoso en cuanto a que se logra obtener un elevado número de células madre mesenquimales, entre 40.10^{6} y 50.10^{6}, con un número reducido de duplicaciones, entre 6 y 8, y un intervalo de tiempo (alrededor de 20 días) menor que en los procesos tradicionales.

Además, una ventaja adicional es que se logra, mediante la congelación de las células madre mesenquimales obtenidas en el cultivo secundario (etapa (b)), generar la dosis requerida de células en caso de pérdida del proceso por causas accidentales o de poseer una copia idéntica de seguridad células madre mesenquimales.

El procedimiento de la presente invención también posee las ventajas adicionales de una manipulación sencilla y costes reducidos, al no necesitarse un cultivo extensivo, ni utilizarse suero fetal bovino.

La presente invención es descrita en lo adelante en más detalle en referencia a un ejemplo. Este ejemplo, sin embargo, no está destinado a limitar el alcance técnico de la presente invención.

Ejemplo 1

Se inocularon 300 000 células mononucleares de médula ósea por centímetro cuadrado, obtenidas mediante gradiente de centrifugación de una extracción de sangre de médula ósea, en un frasco de cultivo comercial de 636 cm^{2}, que contenía medio DMEM suplementado con suero AB humano (10%). A los 5 días se lavó el cultivo y el sobrenadante se resembró en un segundo frasco de cultivo comercial de 636 cm^{2}, que contenía medio DMEM suplementado con suero AB humano (10%). Al cultivo primario se le añadió medio de cultivo (DMEM suplementado con suero AB humano (10%)) con una relación área de cultivo/volumen de medio (3/1). A los 9 días se cambió el medio de cultivo y se añadió medio de cultivo (DMEM suplementado con suero AB humano (10%)) con una relación área de cultivo/volumen de medio (3/1). A los 12 días se realizó una tripsinización del cultivo y se obtuvieron entre 15.10^{6} y 20.10^{6} células madre mesenquimales con una pureza de alrededor de 80%. Estas células se sembraron en dos frascos de cultivo comercial de 636 cm^{2}, que contenían medio DMEM suplementado con suero AB humano (10%), con una densidad de 4000 células/cm^{2}. Se cultivaron las células durante 8 días, en los que se realizó dos recambios de medio (días 3 y 6), empleando medio DMEM suplementado con suero AB humano (10%) con una relación área de cultivo/volumen de medio (3/1).

Las células no adheridas en el cultivo primario, que fueron sembradas en un cultivo secundario (etapa (b)), fuero lavadas a los 5 días desde el inicio del cultivo secundario (etapa (b)) y el lavado fue desechado. El día 9 se cambió el medio de cultivo y se añadió medio de cultivo (DMEM suplementado con suero AB humano (10%)) con una relación área de cultivo/volumen de medio (3/1). A los 12 días se realizó una tripsinización del cultivo y se obtuvieron entre 3.10^{6} y 6.10^{6} células madre mesenquimales con una pureza de alrededor de 65%. Las células obtenidas fueron congeladas en tanques de nitrógeno.

Las células obtenidas en el cultivo primario mostraron un perfil inmunofenotípico con co-expresión de los marcadores 105, 90, 73 y falta de expresión de los marcadores CD45, CD31, HLA-DR, asociados habitualmente a las células madre mesenquimales provenientes de médula ósea. Además, las células obtenidas mostraron capacidad de diferenciación hacia el linaje óseo, hecho que pone de manifiesto el mantenimiento de la capacidad multipotencial. Por otro lado, las células obtenidas en el cultivo secundario (etapa (b)) mostraron un perfil inmunofenotípico con co-expresión de los marcadores 105, 90, 73 y falta de expresión de los marcadores CD45, CD31, HLA-DR, asociados habitualmente a las células madre mesenquimales provenientes de médula ósea. Además, las células obtenidas mostraron capacidad de diferenciación hacia el linaje óseo y adiposo, manteniendo, por lo tanto, su capacidad multipotencial.

Si bien la invención se ha descrito con respecto a ejemplos de realizaciones preferentes, éstos no se deben considerar limitativos de la invención, que se definirá por la interpretación más amplia de las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Procedimiento para la obtención de células madre mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de médula ósea humana obtenida mediante centrifugación en gradiente de densidad, caracterizado porque comprende las etapas de:

i.: las células mononucleares del cultivo se lavan en el día 5 con solución salina y se añade medio de cultivo suplementado con suero humano AB (10%).

ii.: se recambia el medio de cultivo a los 9 días por el mismo medio anteriormente mencionado

iii.: se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 días. Estas células generan el cultivo de expansión (c).

iv.: el cultivo se lava en el día 5 con solución salina y se añade medio de cultivo suplementado con suero humano AB (10%).

v.: se recambia el medio de cultivo por el mismo medio anteriormente mencionado el día 9.

vi.: se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 días. Se recuperan las células madre mesenquimales que son congeladas y almacenada en depósitos de nitrógeno.

vii.: se recambia el medio de cultivo a los 3 y 6 días por el mismo medio anteriormente mencionado.

viii.: se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 días. Estas células se acondicionan para su traslado a quirófano.

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2. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de células mononucleares de médula ósea inoculadas en la etapa (a) es de entre 200 000 y 400 000 células por centímetro cuadrado de superficie.

3. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de células madre mesenquimales inoculadas en la etapa (b) es de entre 3 000 y 5 000 células por centímetro cuadrado de superficie.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que en el cultivo primario de la etapa (a) se obtienen entre 15.10^{6} y 20.10^{6} células madre mesenquimales.

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que en el cultivo secundario (etapa (b)) se obtienen entre 3.10^{6} y 6.10^{6} células madre mesenquimales.

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la pureza de las células madre mesenquimales obtenidas en el cultivo primario de la etapa (a) es de 80%.

7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la pureza de las células madre mesenquimales obtenidas en el cultivo secundario (etapa (b)) es de 65%.

8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que en la etapa (c) se obtienen entre 40.10^{6} y 50.10^{6} de células madre mesenquimales.

9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el número de duplicaciones celulares se encuentra entre 6 y 8.

10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tiempo total de obtención de las células madre mesenquimales no sobrepasa los 21 días.

11. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo secundario (etapa (b)) se congela y se mantiene como copia de seguridad.

12. Uso del suero humano AB como suplemento del medio de cultivo en la obtención de células madre mesenquimales para uso terapéutico.