ES2324011B1 - Procedimiento para la obtencion de celulas madre mesenquimales a partir de la fraccion mononuclear de la medula osea humana. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la obtención de células madre
mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de la médula ósea
humana.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de obtención de células madre mesenquimales a partir
de la fracción mononuclear de células de médula ósea humana que
utiliza como suplemento suero humano del tipo AB. Dicho
procedimiento comprende las etapas de obtención de dicha fracción
mononuclear de médula ósea, la etapa de recuperación y
pre-expansión de las células madre mesenquimales, y
la etapa de expansión de las células madres mesenquimales hasta la
obtención de la dosis clínica necesaria para su uso terapéutico.
Description
Procedimiento para la obtención de células madre
mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de la médula ósea
humana.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de células madre mesenquimales. Más
específicamente, la presente invención se refiere a un
procedimiento de obtención de células madre mesenquimales a partir
de la fracción mononuclear de células de médula ósea humana. Dicho
procedimiento comprende las etapas de obtención de dicha fracción
mononuclear de médula ósea, la etapa de recuperación y
pre-expansión de las células madre mesenquimales, y
la etapa de expansión de las células madres mesenquimales hasta la
obtención de la dosis clínica necesaria para su posible uso
terapéutico.
Las células madre mesenquimales (CMM) son
células multipotentes, que han mostrado su eficacia en el
tratamiento de lesiones musculoesqueléticas y en el mejoramiento de
la función cardiaca en enfermedades cardiovasculares (Le Blanc K.,
Pittenger M. Mesenchymal stem cells: progress toward promise.
Cytotherapy 2005;7:36-45). Las CMM pueden ser
aisladas de varios tejidos de adultos, entre los que se encuentran
la médula ósea, tejido adiposo y sangre del cordón umbilical.
Además, dichas células pueden ser expandidas ex vivo.
La fracción de mononuclear médula ósea (CMN) se
obtiene mediante una operación de separación basada en la
centrifugación de sangre proveniente de la médula ósea. La CMN es
un conjunto heterogéneo de células, entre las que se pueden
encontrar, además de las células madre mesenquimales, las células
hematopoyéticas progenitoras. Estas dos poblaciones se encuentran en
una concentración muy baja respecto a las células hematopoyéticas
maduras, también presentes en las CMN.
Fridenshtein y otros (Fridenshtein A. J.,
Deriglazova U. F., Kulagina N. N. et al. Precursors for
fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as
detected by the in vitro colony assay method. Exp. Hematol.
1974 Vol. 2. P. 83-92) obtuvieron por primera vez
células madre mesenquimales a partir de médula ósea, basándose en
la capacidad de las células madre mesenquimales para adherirse a
superficies plásticas, propiedad que no poseen la mayoría de las
células hematopoyéticas. La desventaja de este método es el bajo
rendimiento obtenido en la recuperación de células mesenquimales
atribuible a la baja prevalencia de este tipo celular en la médula
ósea, que se estima entre el 0,001 al 0,01% (Alhadlag A and Mao J.
Mesenchymal Stem Cells: Isolation and Therapeutics. Stem Cells and
Development. 2004. 13: 436-448 (3). Sin embargo, la
adhesión a plásticos se ha establecido como punto de partida para
seguir mejorando los métodos de obtención de células madre
mesenquimales.
Heynesworth y otros han logrado obtener células
madre mesenquimales con una alta capacidad de adherencia, elevada
tasa de proliferación y el mantenimiento de la multipotencialidad
durante un período de tiempo largo (Heynesworth S. E., Goshima J.,
Goldberg V. M., Calplan A. I. Characterization of cells with
osteogenic potential from the human bone marrow//Bone. 1995. Vol.
13. P. 81-85.) utilizando suero fetal bovino como
suplemento del medio de cultivo. La desventaja de este método
consiste en que el hecho de que la búsqueda de un lote adecuado para
el cultivo de las células y el análisis correspondiente del suero
fetal bovino conlleva mucho tiempo y es muy trabajoso. Además,
debido a la gran variación lote a lote que presenta el suero fetal
bovino, no es posible garantizar la reproducibilidad de los
resultados.
Otra desventaja de este método es que para
obtener las cantidades suficientes de células madres mesenquimales
para su uso clínico, las células deben ser cultivadas entre 4 y 6
semanas, e incluso en algunas circunstancias, tales como en
pacientes con enfermedades del metabolismo óseo, el tiempo de
cultivo puede ser superior. La razón por la que se necesitan estos
tiempos tan elevados de cultivo, como se ha mencionado
anteriormente, es la poca cantidad de células mesenquimales que es
posible obtener de la médula ósea.
Un periodo largo de cultivo celular puede
aumentar el riesgo de contaminación y aumenta considerablemente los
costes de mantenimiento del cultivo. Además, a medida que aumenta
el número de duplicaciones se corre el riesgo de que las células
pierdan multipotencialidad o entren en senescencia, lo que
compromete su capacidad terapéutica.
La metodología utilizada habitualmente para
buscar una disminución de los tiempos de cultivo de células
mesenquimales centra su atención en factores tales como los
suplementos del medio de cultivo, el tipo de superficie plástica,
la dosis de siembra y los medios de cultivo empleados (Sotiropolou
PA, Pérez SA, Salagianni M, Baxevanis CN, Papamichail M.
Characterization of the optimal culture conditions for clinical
scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells 2006;
24: 462-471).
Un objetivo de la presente invención es dar a
conocer un procedimiento de cultivo ex vivo de células madre
mesenquimales a partir de médula ósea humana en el que se reduce el
tiempo y el número de duplicaciones necesarias para la obtención de
la dosis clínica de células madres mesenquimales, cuando se compara
con los métodos tradicionales. Este procedimiento se basa en el
efecto sinérgico a partir de combinar unas condiciones muy
específicas de aislamiento de células mesenquimales a partir de la
fracción mononuclear de médula ósea, con la utilización de suero
humano del grupo sanguíneo AB como suplemento del medio de cultivo.
Este se usa en sustitución de costoso y poco reproducible suero
fetal bovino. Además, el suero AB humano presenta las ventajas de
ser más económico y tener mayor reproducibilidad que el suero fetal
bovino. A su vez, las condiciones de aislamiento propuestas
facilitan la recuperación de un mayor número de células
mesenquimales de la fracción mononuclear con respecto a las
condiciones utilizadas en las estrategias convencionales. Este
hecho es de especial relevancia si se tiene en cuenta que cuando
más elevado sea el número inicial de células mesenquimales
aisladas disponibles menor es el tiempo y recursos necesarios para
la obtención de la dosis clínica requerida.
Dichas condiciones de aislamiento se han
obtenido mediante el estudio sistemático de la influencia sobre la
recuperación de células mesenquimales a partir del inóculo y el
tiempo de lavado de las células mononucleares de médula ósea en
medios de cultivo suplementados con suero humano AB.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento que permita disponer de una copia
idéntica de seguridad de las células madres mesenquimales, que
poseen las mismas características de las células madre
mesenquimales iniciales en cuanto a capacidad de proliferación y
diferenciación.
El procedimiento de la presente invención puede
ser aplicado para la obtención de células mesenquimales
provenientes de otras fuentes, tales como tejido adiposo, páncreas,
hígado, músculo esquelético, dermis, membrana sinovial, hueso
trabecular, sangre de cordón umbilical, tejido pulmonar, pulpa
dental y ligamento periodontal. En el caso que la fuente de células
mesenquimales sea diferente a la médula ósea, el tratamiento
inicial de la muestra será diferente, adecuándose para cada tipo
celular que se utilice como fuente.
En consecuencia, un objetivo de la presente
invención es dar a conocer un procedimiento para la obtención de
células madre mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de
médula ósea humana, obtenida mediante centrifugación en gradiente
de densidad, caracterizado porque comprende las etapas de:
a) Recuperación y pre expansión de las células
madre mesenquimales, mediante un cultivo primario, en el que las
células mononucleares de médula ósea se siembran en medio de
cultivo DMEM suplementado con suero AB humano (10%) siguiendo el
siguiente esquema de cultivo:
- -
- las células mononucleares del cultivo se lavan en el día 5 con solución salina y se añade medio de cultivo suplementado con suero humano AB (10%).
- -
- se recambia el medio de cultivo a los 9 días por el mismo medio anteriormente mencionado
- -
- se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 días. Estas células generan el cultivo de expansión (c).
b) Cultivo secundario: resiembra de las células
mononucleares lavadas en (a) en medio de cultivo suplementado con
suero AB humano (10%) siguiendo el siguiente esquema de
cultivo:
- -
- el cultivo se lava en el día 5 con solución salina y se añade medio de cultivo suplementado con suero humano AB (10%).
- -
- se recambia el medio de cultivo por el mismo medio anteriormente mencionado el día 9.
- -
- se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 días. Se recuperan las células madre mesenquimales que son congeladas y almacenada en depósitos de nitrógeno.
c) Cultivo de expansión: expansión de las
células mesenquimales asiladas en (a) a los 12 días. Se resiembran
y expanden estas células en medio de cultivo suplementado con suero
AB humano (10%) siguiendo el siguiente esquema de cultivo:
- -
- se recambia el medio de cultivo a los 3 y 6 días por el mismo medio anteriormente mencionado.
- -
- se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 días. Estas células se acondicionan para su traslado a quirófano.
En una realización preferente en el cultivo
primario se siembran entre 200 000 y 400 000 células por centímetro
cuadrado de superficie. Además, preferentemente el medio de cultivo
utilizado, tanto en el cultivo primario como en el secundario
(etapa b), es Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con un suplemento
de suero AB humano al 10% (v/v).
El procedimiento de la presente invención es
ventajoso en cuanto a que se logra obtener un elevado número de
células madre mesenquimales, entre 40.10^{6} y 50.10^{6}, con
un número reducido de duplicaciones, entre 6 y 8, y un intervalo de
tiempo (alrededor de 20 días) menor que en los procesos
tradicionales.
Además, una ventaja adicional es que se logra,
mediante la congelación de las células madre mesenquimales
obtenidas en el cultivo secundario (etapa (b)), generar la dosis
requerida de células en caso de pérdida del proceso por causas
accidentales o de poseer una copia idéntica de seguridad células
madre mesenquimales.
El procedimiento de la presente invención
también posee las ventajas adicionales de una manipulación sencilla
y costes reducidos, al no necesitarse un cultivo extensivo, ni
utilizarse suero fetal bovino.
La presente invención es descrita en lo adelante
en más detalle en referencia a un ejemplo. Este ejemplo, sin
embargo, no está destinado a limitar el alcance técnico de la
presente invención.
Se inocularon 300 000 células mononucleares de
médula ósea por centímetro cuadrado, obtenidas mediante gradiente
de centrifugación de una extracción de sangre de médula ósea, en un
frasco de cultivo comercial de 636 cm^{2}, que contenía medio
DMEM suplementado con suero AB humano (10%). A los 5 días se lavó
el cultivo y el sobrenadante se resembró en un segundo frasco de
cultivo comercial de 636 cm^{2}, que contenía medio DMEM
suplementado con suero AB humano (10%). Al cultivo primario se le
añadió medio de cultivo (DMEM suplementado con suero AB humano
(10%)) con una relación área de cultivo/volumen de medio (3/1). A
los 9 días se cambió el medio de cultivo y se añadió medio de
cultivo (DMEM suplementado con suero AB humano (10%)) con una
relación área de cultivo/volumen de medio (3/1). A los 12 días se
realizó una tripsinización del cultivo y se obtuvieron entre
15.10^{6} y 20.10^{6} células madre mesenquimales con una
pureza de alrededor de 80%. Estas células se sembraron en dos
frascos de cultivo comercial de 636 cm^{2}, que contenían medio
DMEM suplementado con suero AB humano (10%), con una densidad de
4000 células/cm^{2}. Se cultivaron las células durante 8 días,
en los que se realizó dos recambios de medio (días 3 y 6),
empleando medio DMEM suplementado con suero AB humano (10%) con una
relación área de cultivo/volumen de medio (3/1).
Las células no adheridas en el cultivo primario,
que fueron sembradas en un cultivo secundario (etapa (b)), fuero
lavadas a los 5 días desde el inicio del cultivo secundario (etapa
(b)) y el lavado fue desechado. El día 9 se cambió el medio de
cultivo y se añadió medio de cultivo (DMEM suplementado con suero
AB humano (10%)) con una relación área de cultivo/volumen de medio
(3/1). A los 12 días se realizó una tripsinización del cultivo y se
obtuvieron entre 3.10^{6} y 6.10^{6} células madre
mesenquimales con una pureza de alrededor de 65%. Las células
obtenidas fueron congeladas en tanques de nitrógeno.
Las células obtenidas en el cultivo primario
mostraron un perfil inmunofenotípico con
co-expresión de los marcadores 105, 90, 73 y falta
de expresión de los marcadores CD45, CD31, HLA-DR,
asociados habitualmente a las células madre mesenquimales
provenientes de médula ósea. Además, las células obtenidas
mostraron capacidad de diferenciación hacia el linaje óseo, hecho
que pone de manifiesto el mantenimiento de la capacidad
multipotencial. Por otro lado, las células obtenidas en el cultivo
secundario (etapa (b)) mostraron un perfil inmunofenotípico con
co-expresión de los marcadores 105, 90, 73 y falta
de expresión de los marcadores CD45, CD31, HLA-DR,
asociados habitualmente a las células madre mesenquimales
provenientes de médula ósea. Además, las células obtenidas mostraron
capacidad de diferenciación hacia el linaje óseo y adiposo,
manteniendo, por lo tanto, su capacidad multipotencial.
Si bien la invención se ha descrito con respecto
a ejemplos de realizaciones preferentes, éstos no se deben
considerar limitativos de la invención, que se definirá por la
interpretación más amplia de las siguientes reivindicaciones.
Claims (12)
1. Procedimiento para la obtención de células
madre mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de médula
ósea humana obtenida mediante centrifugación en gradiente de
densidad, caracterizado porque comprende las etapas de:
a) Recuperación y pre expansión de las células
madre mesenquimales, mediante un cultivo primario, en el que las
células mononucleares de médula ósea se siembran en medio de
cultivo DMEM suplementado con suero AB humano (10%) siguiendo el
siguiente esquema de cultivo:
- i.
- las células mononucleares del cultivo se lavan en el día 5 con solución salina y se añade medio de cultivo suplementado con suero humano AB (10%).
- ii.
- se recambia el medio de cultivo a los 9 días por el mismo medio anteriormente mencionado
- iii.
- se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 días. Estas células generan el cultivo de expansión (c).
b) Cultivo secundario: resiembra de las células
mononucleares lavadas en (a) en medio de cultivo suplementado con
suero AB humano (10%) siguiendo el siguiente esquema de
cultivo:
- iv.
- el cultivo se lava en el día 5 con solución salina y se añade medio de cultivo suplementado con suero humano AB (10%).
- v.
- se recambia el medio de cultivo por el mismo medio anteriormente mencionado el día 9.
- vi.
- se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 días. Se recuperan las células madre mesenquimales que son congeladas y almacenada en depósitos de nitrógeno.
c) Cultivo de expansión: expansión de las
células mesenquimales asiladas en (a) a los 12 días. Se resiembran
y expanden estas células en medio de cultivo suplementado con suero
AB humano (10%) siguiendo el siguiente esquema de cultivo:
- vii.
- se recambia el medio de cultivo a los 3 y 6 días por el mismo medio anteriormente mencionado.
- viii.
- se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 días. Estas células se acondicionan para su traslado a quirófano.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de células
mononucleares de médula ósea inoculadas en la etapa (a) es de entre
200 000 y 400 000 células por centímetro cuadrado de
superficie.
3. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de células madre
mesenquimales inoculadas en la etapa (b) es de entre 3 000 y 5 000
células por centímetro cuadrado de superficie.
4. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que en el cultivo primario de la
etapa (a) se obtienen entre 15.10^{6} y 20.10^{6} células madre
mesenquimales.
5. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que en el cultivo secundario
(etapa (b)) se obtienen entre 3.10^{6} y 6.10^{6} células madre
mesenquimales.
6. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la pureza de las células
madre mesenquimales obtenidas en el cultivo primario de la etapa
(a) es de 80%.
7. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la pureza de las células
madre mesenquimales obtenidas en el cultivo secundario (etapa (b))
es de 65%.
8. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que en la etapa (c) se obtienen
entre 40.10^{6} y 50.10^{6} de células madre mesenquimales.
9. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el número de duplicaciones
celulares se encuentra entre 6 y 8.
10. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el tiempo total de obtención
de las células madre mesenquimales no sobrepasa los 21 días.
11. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo secundario (etapa
(b)) se congela y se mantiene como copia de seguridad.
12. Uso del suero humano AB como suplemento del
medio de cultivo en la obtención de células madre mesenquimales
para uso terapéutico.
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MX2011003899A MX2011003899A (es) | 2009-01-02 | 2009-11-25 | Procedimiento para la obtencion de celulas madre mesenquimales a partir de la fraccion mononuclear de la medula osea humana. |
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