ES2323854T3 - Procedimiento de produccion de una fraccion purificada de lipoproteinas de baja densidad de yema de huevo y medio de conservacion que incorpora dichas lipoproteinas. - Google Patents
Procedimiento de produccion de una fraccion purificada de lipoproteinas de baja densidad de yema de huevo y medio de conservacion que incorpora dichas lipoproteinas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2323854T3 ES2323854T3 ES02290065T ES02290065T ES2323854T3 ES 2323854 T3 ES2323854 T3 ES 2323854T3 ES 02290065 T ES02290065 T ES 02290065T ES 02290065 T ES02290065 T ES 02290065T ES 2323854 T3 ES2323854 T3 ES 2323854T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- egg yolk
- lipoproteins
- low
- density
- fraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0608—Germ cells
- C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Procedimiento de producción de fracción purificada de lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo a partir de plasma de yema de huevo, caracterizado porque comprende por lo menos las etapas que consisten: - en añadir por lo menos una sal de amonio a plasma de yema de huevo con vistas a obtener, después de la eliminación del precipitado formado, una fracción de plasma enriquecida en lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo, y - en dializar la fracción de plasma enriquecida en lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo contra una disolución acuosa, preferentemente salina, con el fin de provocar, durante la eliminación de los iones amonio, una precipitación selectiva de las lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo, con vistas a la obtención de una fracción purificada de lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo.
Description
Procedimiento de producción de una fracción
purificada de lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo y
medio de conservación que incorpora dichas lipoproteínas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de producción de una fracción purificada de
lipoproteínas de baja densidad (LDL - Low Density Lipoprotein) de
yema de huevo, a un medio de conservación de células vivas que
contiene dichas lipoproteínas, así como al uso de estas
lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo como agente
crioprotector.
El desarrollo de tecnologías tales como la
inseminación artificial, la fecundación in vitro y la
procreación asistida, ha estado facilitado por la posibilidad de
congelar unas células vivas, tales como unas células reproductoras
de tipo espermatozoides o unas células embrionarias, en unas
condiciones que permiten que dichas células vuelvan a tener sus
funcionalidades después de la descongelación.
Sin embargo, para mejorar las prestaciones de
estos métodos, se han perfeccionado las técnicas de congelación con
vistas a reducir el efecto del choque térmico sobre las células.
Así, todos los diluyentes de congelación del semen incorporan en la
actualidad yema de huevo como agente crioprotector. Este
crioprotector desempeña una función determinante en la protección
de los espermatozoides contra el choque térmico y permite obtener
un mayor número de espermatozoides vivos después de la
descongelación y mejorar su poder fecundante. En cambio, la yema de
huevo es un buen medio de cultivo para todos los microorganismos, lo
que aumenta el riesgo de contaminación bacteriana.
Por lo tanto, se han empezado unos estudios
estos últimos años con vistas a sustituir la yema de huevo contenida
en particular en los medios de conservación de semen por otro
agente crioprotector cuya naturaleza es susceptible de limitar las
contaminaciones microbiológicas. Sin embargo, puesto que el
mecanismo de acción de la yema de huevo, como agente crioprotector,
no se ha elucidado en la actualidad a pesar de que se han emitido un
cierto número de hipótesis, estos estudios resultan difíciles.
Paralelamente, se han llevado a cabo unos
ensayos con vistas a aislar ciertos constituyentes de la yema de
huevo, en particular las lipoproteínas de baja densidad del plasma
de la yema de huevo de la cual forman el constituyente principal.
Sin embargo, todos los procedimientos descritos en la actualidad en
la técnica son unos procedimientos aplicables únicamente en
laboratorio y no permiten una producción industrial de dichos
procedimientos. Ciertos métodos han sido desarrollados en particular
sobre la base de técnicas de ultra-centrifugación
que necesitan, para el aislamiento de lipoproteínas de baja densidad
de yema de huevo, entre treinta y cuarenta horas de centrifugación
con una ultra-centrifugadora que constituye un
material caro no aplicable a una producción industrial.
Dicho ejemplo del uso de las técnicas de
centrifugación se describe en la patente
US-A-5.063.077. La patente DD
273.164 describe el uso de técnicas de ultrafiltración.
Otros métodos desarrollados usan unos
procedimientos cromatográficos nuevamente no aplicables a escala
industrial. Paralelamente, el artículo de OLLERO M et al.:
"Loss of plasma membrane proteins of bull spermatozoa through the
freezing-thawing process" THERIOGENOLOGY, vol.
49, nº 3, 1998, páginas 547-555 ilustra una técnica
de separación mediante electroforesis de las proteínas incorporadas
a la membrana de los espermatozoides con fines de análisis para
identificar la función de las lipoproteínas como agente
crioprotector. Sin embargo, este documento no describe la
separación de dicha fracción de lipoproteínas.
El artículo de Demianowicz y Strzezek: "The
effect of lipoprotein fraction from egg yolk on some of the
biological properties of boar spermatozoa during storage of the
semen in liquid state" Reproduction on domestic animals, vol.
31, nº 1, 1996, páginas 279-280, describe el uso de
LDL de yema de huevo como agente crioprotector para la obtención de
un medio de conservación de las células vivas.
El objetivo de la presente invención es por lo
tanto proponer un procedimiento de obtención de fracción purificada
de lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo a partir de
plasma de yema de huevo, comprendiendo este procedimiento unas
etapas susceptibles de ser realizadas de manera industrial para
permitir una producción en masa de dichas lipoproteínas.
Otro objetivo de la presente invención es
proponer un medio para la conservación, en el estado refrigerado o
congelado, de células vivas, permitiendo la composición de este
medio aumentar de manera significativa el porcentaje de
supervivencia y eventualmente la movilidad de las células tras la
descongelación.
Con este fin, la invención tiene por objeto un
procedimiento de producción de fracción purificada de lipoproteínas
de baja densidad de yema de huevo a partir de plasma de yema de
huevo, caracterizado porque comprende por lo menos las etapas que
consisten:
- -
- en añadir por lo menos una sal de amonio a plasma de yema de huevo con vistas a obtener, después de la eliminación del precipitado formado, una fracción de plasma enriquecida en lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo, y
- -
- en dializar la fracción de plasma enriquecida en lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo contra una disolución acuosa, preferentemente salina, con el fin de provocar, durante la eliminación de los iones amonio, una precipitación selectiva de las lipoproteínas de baja densidad de la yema de huevo, con vistas a la obtención de una fracción purificada de lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo.
El procedimiento descrito anteriormente, que se
basa en una separación de las diferentes partes de la yema de huevo
mediante adición y después eliminación de por lo menos una sal
seguida respectivamente de centrifugaciones suaves, es un
procedimiento fácilmente extrapolable a la escala industrial. La
etapa clave de este procedimiento reside en la etapa de diálisis
durante la cual los inventores han observado que, de manera
sorprendente, el uso de un medio de diálisis constituido
esencialmente por agua permitía obtener una precipitación selectiva
de las lipoproteínas de baja densidad del plasma enriquecido en
lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo. Esta precipitación
selectiva de las lipoproteínas de baja densidad durante la
eliminación de los iones amonio no se había observado nunca hasta
ahora.
La invención tiene asimismo por objeto un medio
para la conservación, en el estado refrigerado o congelado, de
células vivas, tales como semen o un embrión, estando el medio
constituido por un medio de base formado por constituyentes, tales
como un agente de nutrición y un antibiótico, que convienen para la
conservación de dichas células, caracterizado porque comprende
además, como agente crioprotector de las células, una fracción
purificada de lipoproteínas de baja densidad (LDL) de yema de huevo
para limitar, de manera significativa, el efecto del choque térmico
sobre las características funcionales de dichas células, presentando
esta fracción purificada de lipoproteínas de baja densidad (LDL) de
yema de huevo para limitar, de manera significativa, el efecto del
choque térmico sobre las características funcionales de dichas
células, obtenida según el procedimiento descrito anteriormente, un
porcentaje de pureza por lo menos igual a 97%.
Unos estudios efectuados a partir de este medio
han demostrado, de manera inesperada, que las lipoproteínas de baja
densidad poseen un efecto crioprotector superior a las lipoproteínas
incluidas en la yema de huevo completo, en particular sobre un
semen de toro refrigerado o congelado. Este efecto superior se
aprecia mediante la medición del porcentaje de supervivencia y de
la movilidad de los espermatozoides después del choque térmico.
La invención tiene asimismo por objeto el uso de
una fracción purificada de lipoproteínas de baja densidad de yema
de huevo que presenta un porcentaje de pureza por lo menos igual a
97% como agente crioprotector para la obtención de un medio de
conservación de células vivas en el estado refrigerado o
congelado.
La invención tiene asimismo por objeto el uso de
un medio de conservación del tipo citado anteriormente para la
conservación en el estado refrigerado o congelado de esperma de
vertebrados con vistas a la inseminación artificial.
La invención se pondrá más claramente de
manifiesto a partir de la lectura de la siguiente descripción de
ejemplos de realización, haciendo referencia a los dibujos adjuntos,
en los que:
la figura 1 representa de manera esquemática las
diferentes etapas del procedimiento de obtención de la fracción de
lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo;
la figura 2 representa un histograma que muestra
el efecto de las diferentes concentraciones de LDL de la yema de
huevo de gallina sobre la movilidad de los espermatozoides de toro
tras la conservación a +4ºC durante 24 horas; y
la figura 3 representa el efecto de diferentes
concentraciones de LDL de la yema de huevo de gallina sobre la
movilidad de los espermatozoides de toro tras la congelación y la
descongelación.
Tal como se ha mencionado anteriormente, los
únicos métodos que existen en la actualidad para purificar las
lipoproteínas de baja densidad (LDL) de yema de huevo son unos
métodos de laboratorio que presentan un bajo rendimiento y usan
unos procedimientos no extrapolables a la escala industrial. Estos
métodos se basan en particular en unas etapas de
ultracentrifugación y de cromatografía de exclusión estérica.
Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) forman
el constituyente principal del plasma de yema de huevo. Estas
lipoproteínas están organizadas en esferas de 17 nm a 60 nm de
diámetro, estando estas esferas a su vez constituidas por un núcleo
de lípidos neutros (triglicéridos y éster de colesterol) rodeado por
una película de fosfolípidos y de proteínas en contacto con la fase
acuosa. Estas LDL, que son los constituyentes principales de la yema
de huevo, contienen entre 83 y 89% de lípidos y entre 11 y 17% de
proteínas. Tienen un peso molecular comprendido entre 1.10^{6} Da
y 3.10^{6} Da. Los lípidos se reparten por su parte en 74% de
lípidos neutros (triglicéridos y colesterol) y en 26% de
fosfolípidos. Se sabe desde hace mucho tiempo que las lipoproteínas
de baja densidad están contenidas en el plasma de yema de
huevo.
La primera etapa de cualquier procedimiento de
producción de una fracción purificada de lipoproteínas de baja
densidad de yema de huevo consiste por lo tanto en separar, en la
yema de huevo, el plasma de los gránulos.
Evidentemente, antes de la separación del plasma
de los gránulos, conviene en primer lugar extraer la yema de huevo
del huevo. Para ello, se procede a cascar los huevos, procediendo
estos huevos generalmente de gallinas criadas en un criadero de
granja. Estos huevos se deben cascar como máximo 24 horas después de
su puesta. La yema se separa de la clara. Cada yema se hace rodar
delicadamente sobre un papel filtro para eliminar el albumen y las
chalazas que lo unen a la membrana vitelina. La membrana se corta a
continuación mediante una hoja de escalpelo y la yema se vierte en
una probeta mantenida en hielo machacado para evitar la
desnaturalización de las proteínas. La yema presenta un contenido
en materias secas de aproximadamente 52,5%. Evidentemente, esta
etapa de cascar los huevos y de separación de la yema de la clara de
huevo se podrá modificar para su realización a escala
industrial.
Para permitir a continuación la separación del
plasma y de los gránulos, la yema pura se diluye en una disolución
de cloruro de sodio (NaCl 0,17 M en una relación de 1:1 peso:peso) y
después se somete a una agitación moderada a 4ºC durante 1 hora en
un agitador magnético que permite equilibrar la disolución. Esta
dilución se centrifuga después a 10.000 g durante 45 minutos a una
temperatura de 4ºC. El sobrenadante líquido que constituye el
plasma se recoge y se centrifuga en las mismas condiciones. El
plasma purificado se recupera y se conserva a 4ºC. Se elimina el
poso de centrifugación constituido por los gránulos. Esta etapa de
separación del plasma de los gránulos es una etapa habitual bien
conocida en la técnica.
La segunda etapa consiste en obtener una
fracción de plasma enriquecida en lipoproteínas de baja densidad,
eliminando en particular del plasma las livetinas contenidas en este
plasma. Para ello, se añade por lo menos una sal de amonio al
plasma de yema de huevo con vistas a obtener, después de la
eliminación del precipitado formado, una fracción enriquecida en
lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo. La adición de sal
de amonio se efectúa en frío manteniendo el pH constante cerca de
8,7. La sal de amonio usada es preferentemente sulfato de amonio
por lo menos al 30% de saturación. En el procedimiento ilustrado en
la figura 1, el sulfato de amonio usado es sulfato de amonio al 40%
de saturación, es decir, 20,5 g de sulfato de amonio para 100 ml de
plasma. El sulfato de amonio debe ser añadido muy lentamente a fin
de evitar la desnaturalización de las proteínas. Se necesita a
continuación una agitación de una hora para equilibrar la
disolución. Esta agitación se efectúa a 4ºC. Después, la mezcla se
centrifuga a 10.000 g durante 45 minutos, lo que permite obtener un
poso y un sobrenadante. El sobrenadante corresponde a la fracción de
plasma enriquecida en lipoproteínas de baja densidad de la yema de
huevo mientras que el poso corresponde a la fracción de plasma
enriquecida en livetinas. Este poso de centrifugación se eliminará,
mientras que el sobrenadante se someterá a continuación a una etapa
de diálisis.
La diálisis se efectúa durante diez horas
aproximadamente. El baño de diálisis está constituido por agua
destilada que contiene entre 0 y 50 mM de NaCl. Este baño de
diálisis se cambia cada dos horas y se asegura una agitación
constante. Así, en el ejemplo representado en la figura 1, se
dializan 200 ml de sobrenadante contra 7,51 de agua salada durante
10 horas con cinco cambios de baño de diálisis. Se aumenta la
concentración de NaCl en cada cambio de baño de diálisis para
evitar una destrucción de las micelas de las lipoproteínas. La
membrana usada es una membrana MCL 8x100 CLR. La membrana se hierve
al baño maría durante 15 minutos previamente a la diálisis. Durante
la diálisis, la eliminación de los iones amonio provoca una
precipitación selectiva de un poso rico en lipoproteínas de baja
densidad. Después de la diálisis, la mezcla se centrifuga a 10.000 g
durante 45 minutos y se obtiene un poso de lipoproteínas de baja
densidad puro al 97% y se conserva a 4ºC.
El procedimiento descrito anteriormente permite
así obtener en 24 horas aproximadamente 9 g de poso a partir de 16
ml de yema de huevo. Tal como se ha mencionado anteriormente, este
poso presenta unas características muy parecidas a las de las
lipoproteínas de baja densidad puras con un grado de pureza por lo
menos igual a 97% y parecida en realidad un 97,3% que permite
prever una producción industrial. Por otro lado, el rendimiento de
dicho procedimiento es particularmente bueno, por lo menos igual a
60%.
A partir de estas fracciones purificadas de
lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo obtenidas, se han
realizado unos ensayos con vistas a demostrar que el uso de estas
fracciones en unos medios útiles para la conservación, en el estado
refrigerado o congelado, de células vivas permitía obtener unos
resultados inesperados.
Así, los ensayos han demostrado que un medio que
comprende además de un medio de base habitual formado por
constituyentes, tales como un agente de nutrición y un antibiótico,
que convienen para la conservación de las células vivas, una
fracción de lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo como
agente crioprotector de las células en sustitución de la yema de
huevo, permitía obtener un aumento significativo de la duración de
vida y de la movilidad de las células en particular cuando estas
células están constituidas por unos espermatozoides.
Se ha demostrado que esta actividad del medio de
conservación se obtenía más particularmente cuando la fracción de
lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo está presente en el
medio de conservación a una concentración P/V (peso/volumen)
comprendida en el intervalo [2,5% - 15%] y preferentemente en el
intervalo [5% - 10%].
El ejemplo descrito a continuación se aplica a
un medio de conservación en el que el medio de base es un diluyente
de congelación constituido en particular por lo menos por un
antibiótico, por un agente de nutrición y por un tampón, siendo este
medio de base conveniente para la dilución de esperma de una especie
animal determinada.
El medio de base está constituido por el medio
Triladyl usado habitualmente como diluyente de congelación. La
composición de este medio de base es tal como sigue: 100 ml de este
medio Triladyl contiene 2,42 g de Tris, 1,48 g de ácido cítrico,
1,00 g de fructosa, 6,4 ml de glicerol. La concentración por ml de
antibiótico es de 250 \mug de gentamicina y de 150 \mug de
penicilina.
\newpage
A partir de este medio de base, se han preparado
siete medios de conservación tal como se ilustra en la tabla
siguiente.
En esta tabla, se usan como medios de control el
medio Triladyl que contiene 20 ml de yema de huevo y el medio
Biociphos comercializado por la compañía Instruments de Médecine
Vétérinaire 61302, L'Aigle, Francia. Se debe observar que la
composición del medio Biociphos es desconocida. El único dato
relativo a este medio se refiere al uso de agente crioprotector a
base de lecitina de soja. Paralelamente a estos dos medios de
control, se preparan cinco medios LDL1 a LDL5. Cada medio está
constituido por el medio de base (Triladyl) y por una fracción de
lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo a unas
concentraciones (P/V) comprendidas entre 2,5 y 20%. Evidentemente,
esta fracción de lipoproteínas de baja densidad se obtiene
preferentemente de acuerdo con el procedimiento citado
anteriormente.
A partir de estos medios, se han llevado a cabo
dos experimentos de manera que se demuestra la influencia de la
fracción LDL de la yema de huevo a diferentes concentraciones
durante la conservación de espermatozoides de toro en el estado
refrigerado y en el estado congelado.
Experimento nº 1: Dos eyaculaciones recogidas se
diluyen en los medios de conservación preparados anteriormente. Se
procede de la siguiente manera. Se disponen siete tubos de ensayo al
baño maría a 34ºC, cada tubo recibe
0,5 ml de uno de los medios citados anteriormente y 0,5 ml de esperma para obtener un volumen final de 1 ml. Los tubos se dejan durante 10 minutos a 34ºC. Durante este tiempo, la concentración en espermatozoides se calcula de manera que se diluye de nuevo la mezcla para obtener una concentración final de 120.10^{6} espermatozoides por ml.
0,5 ml de uno de los medios citados anteriormente y 0,5 ml de esperma para obtener un volumen final de 1 ml. Los tubos se dejan durante 10 minutos a 34ºC. Durante este tiempo, la concentración en espermatozoides se calcula de manera que se diluye de nuevo la mezcla para obtener una concentración final de 120.10^{6} espermatozoides por ml.
Un ml de cada tubo que contiene 120.10^{6}
espermatozoides por ml se dispone entonces en un criotubo y se
conserva durante 24 horas a +4ºC antes de ser analizado. El sistema
de análisis elegido es el sistema ATS 20 (J.C. Diffusion
Internationale, La Ferté Fresnet, Francia).
Los resultados se proporcionan en la figura 2 en
la que se representa en abscisas cada medio de conservación citado
anteriormente y en las ordenadas la movilidad de los espermatozoides
en dicho medio. Estos resultados demuestran claramente el efecto
beneficioso de la fracción LDL de la yema de huevo sobre la
movilidad de las células a una concentración P/V comprendida en el
intervalo (5% - 10%).
Experimento nº 2: Después de este descenso de
temperatura en una hora y media a +4ºC, se preparan cinco escamas
de 0,5 ml a partir de cada uno de los siete tubos. Los siete lotes
de cinco escamas se mantienen a +4ºC para el equilibrio durante dos
horas y después se congelan. La congelación se realiza en los
vapores de nitrógeno líquido bajando progresivamente la rampa que
soporta las escamas hacia el nitrógeno líquido. La sonda de un
termopar dispuesta en la rampa permite controlar la curva de
enfriamiento. Cuando la temperatura alcanza -150ºC, las escamas se
sumergen en el nitrógeno líquido a -196ºC. El almacenamiento se
efectúa en cuba, en el nitrógeno líquido, a -196ºC.
Para permitir la descongelación de las escamas
así congeladas, se sumergen tres escamas de cada concentración de
la fracción LDL de la yema de huevo durante 45 segundos al baño
maría a 37ºC. Al final de esta descongelación, se seca cada escama,
se seccionan sus extremos con unas tijeras y después se vacían en un
criotubo dispuesto al baño maría calentado a 37ºC. Después de 10
minutos a 37ºC, el semen se analiza con la ayuda del sistema ATS
20.
Los resultados sobre la movilidad de los
espermatozoides de toro tras la congelación y la descongelación se
ilustran en la figura 3, en la que se representa en las abscisas
cada medio de conservación citado anteriormente y en las ordenadas
la movilidad de los espermatozoides en dicho medio.
Se observa así que la movilidad de los
espermatozoides aumenta a partir de una concentración de 2,5% de
lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo en el medio de base
y alcanza un máximo entre 5 y 10% de lipoproteínas de baja
densidad, y después empieza a disminuir a partir de 15% de
lipoproteínas de baja densidad con relación al control
independientemente de las condiciones de enfriamiento.
\newpage
Estos resultados demuestran claramente que la
fracción de lipoproteínas de baja densidad posee un efecto
beneficioso sobre la movilidad y las características de los
movimientos de los espermatozoides refrigerados a +4ºC o congelados
con relación a la yema de huevo no tratada contenida en el control.
Estos resultados pueden parecer asombrosos sabiendo que la yema de
huevo contiene el equivalente a 6,6% de lipoproteínas de baja
densidad.
Claims (9)
1. Procedimiento de producción de fracción
purificada de lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo a
partir de plasma de yema de huevo, caracterizado porque
comprende por lo menos las etapas que consisten:
- -
- en añadir por lo menos una sal de amonio a plasma de yema de huevo con vistas a obtener, después de la eliminación del precipitado formado, una fracción de plasma enriquecida en lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo, y
- -
- en dializar la fracción de plasma enriquecida en lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo contra una disolución acuosa, preferentemente salina, con el fin de provocar, durante la eliminación de los iones amonio, una precipitación selectiva de las lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo, con vistas a la obtención de una fracción purificada de lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se efectúa la adición de la sal de
amonio, constituida por sulfato de amonio por lo menos al 30% de
saturación, en frío manteniendo el pH constante próximo a 8,7,
porque se equilibra bajo agitación la disolución formada, y porque
se centrifuga dicha disolución para permitir fraccionar el plasma
de yema de huevo en un poso y en un sobrenadante, siendo el
sobrenadante, que corresponde a la fracción de plasma enriquecida
en lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo, sometido
ulteriormente a una etapa de diálisis.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque se efectúa la
diálisis durante diez horas aproximadamente, estando el baño de
diálisis constituido por agua que contiene entre 0 y 50 mM de NaCl
cambiado aproximadamente cada dos horas, y porque se somete, después
de la diálisis, la mezcla a una centrifugación suave para obtener
un poso de centrifugación constituido por lipoproteínas de baja
densidad puro por lo menos al 97%.
4. Medio para la conservación en el estado
refrigerado o congelado de células vivas tales como semen o un
embrión, estando el medio constituido por un medio de base formado
por constituyentes, tales como un agente de nutrición y un
antibiótico, que convienen para la conservación de dichas células,
caracterizado porque comprende además, como agente
crioprotector de las células, una fracción purificada de
lipoproteínas de baja densidad (LDL) de yema de huevo para limitar,
de manera significativa, el efecto del choque térmico sobre las
características funcionales de dichas células, presentando esta
fracción purificada de lipoproteínas de baja densidad de yema de
huevo, obtenida de acuerdo con el procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, un porcentaje de pureza por lo menos igual
a 97%.
5. Medio de conservación según la reivindicación
4, caracterizado porque la fracción de lipoproteínas de baja
densidad de yema de huevo está presente en el medio a una
concentración P/V comprendida en el intervalo [2,5% - 15%] y
preferentemente en el intervalo [5% - 10%].
6. Medio de conservación según una de las
reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque el medio de base
es un diluyente de congelación que conviene para la dilución de
esperma de una especie animal determinada, conteniendo además este
diluyente constituido por lo menos por un antibiótico, por un agente
de nutrición y por un tampón, como agente crioprotector, una
fracción de lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo.
7. Medio de conservación según una de las
reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque la yema de huevo
es una yema de huevo de gallina.
8. Uso de una fracción purificada de
lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo obtenida de acuerdo
con el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, que
presenta un porcentaje de pureza por lo menos igual a 97% como
agente crioprotector para la obtención de un medio de conservación
de células vivas en el estado refrigerado o congelado.
9. Uso de un medio de conservación según una de
las reivindicaciones 4 a 7, para la conservación en el estado
refrigerado o congelado de esperma de vertebrados con vistas a la
inseminación artificial.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0100292A FR2819264B1 (fr) | 2001-01-11 | 2001-01-11 | Procede de production d'une fraction purifiee de lipoproteines de faible densite de jaune d'oeuf et milieu de conservation incorporant de telles lipoproteines |
| FR0100292 | 2001-01-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2323854T3 true ES2323854T3 (es) | 2009-07-27 |
Family
ID=8858674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02290065T Expired - Lifetime ES2323854T3 (es) | 2001-01-11 | 2002-01-11 | Procedimiento de produccion de una fraccion purificada de lipoproteinas de baja densidad de yema de huevo y medio de conservacion que incorpora dichas lipoproteinas. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1223177B1 (es) |
| AT (1) | ATE425185T1 (es) |
| DE (1) | DE60231443D1 (es) |
| DK (1) | DK1223177T3 (es) |
| ES (1) | ES2323854T3 (es) |
| FR (1) | FR2819264B1 (es) |
| PT (1) | PT1223177E (es) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008138772A1 (en) * | 2007-05-09 | 2008-11-20 | Unilever Plc | Frozen aerated confection and its manufacturing process |
| EP2581386A1 (en) * | 2011-10-14 | 2013-04-17 | Philip Morris Products S.A. | Isolation of LDL from serum or plasma samples |
| CN103238585A (zh) * | 2012-02-10 | 2013-08-14 | 郑云胜 | 一种***冷冻稀释液的***保护剂-低密度脂蛋白 |
| CN104788558A (zh) * | 2014-01-22 | 2015-07-22 | 内蒙古农业大学 | 卵黄低密度脂蛋白的提取及与利福喷丁的融合技术 |
| CN109258625A (zh) * | 2018-10-14 | 2019-01-25 | 青海大学 | 一种用于提高牦牛冷冻***冻后品质的稀释液配方 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3185623A (en) * | 1960-05-31 | 1965-05-25 | Smith Fred | Preservation of animal semen |
| DD273164A3 (de) * | 1985-02-06 | 1989-11-08 | Saechsisches Serumwerk | Verfahren zur anreicherung von lipoproteinen |
| SU1690736A1 (ru) * | 1987-04-01 | 1991-11-15 | Институт биохимии им.А.В.Палладина | Способ криоконсервации спермы |
| DE3928258A1 (de) * | 1989-08-26 | 1991-02-28 | Sueddeutsche Kalkstickstoff | Verfahren zur entfernung von cholesterin bzw. cholesterinestern aus eigelb |
-
2001
- 2001-01-11 FR FR0100292A patent/FR2819264B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-01-11 PT PT02290065T patent/PT1223177E/pt unknown
- 2002-01-11 DE DE60231443T patent/DE60231443D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-11 EP EP02290065A patent/EP1223177B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-11 AT AT02290065T patent/ATE425185T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-01-11 ES ES02290065T patent/ES2323854T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-11 DK DK02290065T patent/DK1223177T3/da active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT1223177E (pt) | 2009-06-17 |
| ATE425185T1 (de) | 2009-03-15 |
| EP1223177A1 (fr) | 2002-07-17 |
| FR2819264B1 (fr) | 2004-04-30 |
| DE60231443D1 (de) | 2009-04-23 |
| FR2819264A1 (fr) | 2002-07-12 |
| EP1223177B1 (fr) | 2009-03-11 |
| DK1223177T3 (da) | 2009-07-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rall et al. | Ice-free cryopreservation of mouse embryos at− 196 C by vitrification | |
| US10687525B2 (en) | Enhancement of cell cryopreservation with glycolipids | |
| Sharma et al. | Effect of sperm storage and selection techniques on sperm parameters | |
| US20060257842A1 (en) | Cryopreservation media and molecules | |
| ES2538979T3 (es) | Método y aparato para reducir el contenido en proteínas en extendedores de células espermáticas | |
| JP2022528772A (ja) | Ｄｍｓｏフリーの凍結保存液及びその調製方法と応用 | |
| ES2323854T3 (es) | Procedimiento de produccion de una fraccion purificada de lipoproteinas de baja densidad de yema de huevo y medio de conservacion que incorpora dichas lipoproteinas. | |
| Diettrich et al. | Long-term storage in liquid nitrogen of an embryogenic cell strain of Digitalis lanata | |
| ES2376963T3 (es) | Procedimientos para la conservación del esperma y sus aplicaciones | |
| de Camargo | Biology of the spermatozoon of Apis mellifera. I. Influence of diluents and pH | |
| Yan et al. | Cryopreservation of Cynomolgus Macaque (Macaca fascicularis) Sperm by Using a Commercial Egg-Yolk–Free Freezing Medium | |
| JP2010248160A (ja) | 細胞延命効果を有するペプチド | |
| JP2008118997A (ja) | 低温保存された卵母細胞を蘇生するための方法および組成物 | |
| RU2577882C1 (ru) | Среда для криоконсервации семени быка и способ её приготовления | |
| Adams et al. | 19. Cryopreservation and fertility of geoduck (Panopea zelandica) sperm and oocytes | |
| Smith | Problem of prolonged storage of the cornea | |
| Arav et al. | Preservation of gametes and embryos | |
| JP7023519B2 (ja) | アフリカツメガエル卵抽出液の冷凍保存方法及び冷凍保存用キット、アフリカツメガエル卵濃縮抽出液、並びに細胞周期の分析方法 | |
| Hussein et al. | Cysteine enhance Holstein bull’s sperm assessment quality and conception rate when added to duck egg yolk low-density lipoproteins | |
| BR102015019457A2 (pt) | desenvolvimento de meio de cultura á base de água de coco em pó no processo de diluição e criopreservação de sêmen humano. | |
| Davidson et al. | The nucleoprotein content of fibroblasts growing in vitro: 3. The use of defatted media | |
| JP2008118998A (ja) | 卵母細胞を低温保存するための方法および組成物 | |
| Shamsollahi et al. | Effects of Centrifugation and Different Levels of Soybean Lecithin-Based Extender on Post-Thaw Sperm Quality of Ghezel Ram Semen | |
| BR102020026374A2 (pt) | Diluidor a base de suco de fruto do mandacaru e processo de criopreservação do sêmen | |
| El Mohr et al. | Oocytes and Embryos Cryopreservation |