ES2323692T3 - Metodos y materiales para tratar afecciones inflamatorias usando un polipeptido que comprende un segmento de aminoacidos c5 autogenicos y un segmento de aminoacidos no autogenicos. - Google Patents

Metodos y materiales para tratar afecciones inflamatorias usando un polipeptido que comprende un segmento de aminoacidos c5 autogenicos y un segmento de aminoacidos no autogenicos. Download PDF

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Abstract

Uso de una composición que comprende un adyuvante y un polipéptido para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la artritis reumatoide en un mamífero, en que dicho polipéptido comprende un segmento de aminoácidos propio del factor C5a del complemento, con una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y un segmento de aminoácidos de la proteína ligante de maltosa (MBP) bacteriana, con una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y en que dicho polipéptido provoca una respuesta anti-factor C5a propio del complemento en dicho mamífero.

Description

Método y materiales para tratar afecciones inflamatorias usando un polipéptido que comprende un segmento de aminoácidos C5 autogénicos y un segmento de aminoácidos no autogénicos.
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional nº de Serie 60/430.278 de EE.UU., presentada el 2 de Diciembre de 2002.
Campo técnico
El invento se refiere a composiciones y medicamentos relativos al tratamiento de la artritis reumatoide.
Fundamentos
La artritis reumatoide (RA; del inglés, rheumatoid arthritis) es un estado inflamatorio autoinmune que afecta a las articulaciones periféricas. Modelos de artritis provocada con colágeno en animales han ayudado a definir genes relacionados con estados de RA. Se ha identificado un gen (Aq en el ratón) de la clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC; del inglés, major histocompatibility complex) que es importante para el inicio y el mantenimiento de estados de RA. Este gen corresponde funcionalmente al gen DR*0401 del HLA-DR en seres humanos, lo que sugiere que en la enfermedad está implicado el reconocimiento autoinmune, mediado por células T, de antígenos específicos de articulaciones.
Se ha hallado también que genes de regiones situadas fuera del MHC son importantes para el inicio y el mantenimiento de estados de RA. Una de estas regiones génicas está situada en el ratón en el cromosoma 2 y contiene un gen que codifica el factor C5 del complemento. Uno de los componentes activos de C5 es C5a, que se libera durante la unión del complemento a inmunocomplejos. La liberación de C5a desencadena diversas rutas diferentes que conducen a la inflamación reumatoide. El C5a producido localmente en una articulación inflamatoria puede unirse a receptores de macrófagos y granulocitos neutrófilos, lo que conduce a la infiltración de células inflamatorias en las articulaciones. El C5 también desempeña un papel central en procesos mediados por el complemento tales como sepsis, daño miocárdico por isquemia/reperfusión, síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, nefritis y rechazo de injertos, así como en estados inflamatorios mediados por el complemento tales como artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, arteriosclerosis y vasculitis.
El Documento WO 96/39503 se refiere a antagonistas del receptor de C5a que no tienen sustancialmente actividad agonista, y a métodos para las preparaciones.
David Carney et al., 1993, Protein Science, volumen 2, nº 9, páginas 1391-1399, describen mutaciones específicas del sitio en la región N-terminal del C5a humano que afectan a las interacciones de C5a con el receptor de C5a del neutrófilo.
Pellas et al., 1998, Journal of Immunology, volumen 160, nº 11, páginas 5616-5621, describen nuevos antagonistas del receptor de C5a que regulan funciones del neutrófilo in vitro e in vivo.
Michael Mulligan et al., 1996, Journal of Clinical Investigation, volumen 98, nº 2, páginas 503-592, describen la necesidad y el papel de C5a en el daño inflamatorio pulmonar agudo en ratas. En el Documento EP0300740 se describen anticuerpos monoclonales hacia el C5a del complemento.
Sumario
El invento se refiere a medicamentos y composiciones para uso en el tratamiento de un mamífero. Específicamente, el invento proporciona adyuvantes y polipéptidos para uso en el tratamiento de la artritis reumatoide. Los polipéptidos del invento pueden ser inmunogénicos. En un aspecto, el invento proporciona polipéptidos inmunogénicos que contienen segmentos de aminoácidos tanto propios como no propios. Por ejemplo, el invento proporciona un polipéptido que contiene un segmento de aminoácidos de C5a propio y uno o más epítopos de células T no propios.
En un aspecto, el invento proporciona el uso de un adyuvante y un polipéptido para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la artritis reumatoide en un mamífero, en que dicho polipéptido comprende un segmento de aminoácidos propio del factor C5a del complemento, con una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y un segmento de aminoácidos de la proteína ligante de maltosa (MBP; del inglés, maltose binding protein) bacteriana, con una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y en que dicho polipéptido provoca una respuesta anti-factor C5a propio del complemento en dicho mamífero.
En otro aspecto, el invento presenta una composición que comprende un adyuvante y un polipéptido, en que el polipéptido incluye un segmento de aminoácidos de C5a propio, con una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y un segmento de aminoácidos de la MBP bacteriana, y en que la longitud del segmento no propio es superior a 40 restos de aminoácido, para uso en el tratamiento de la artritis reumatoide. La administración del polipéptido a un mamífero provoca una respuesta anti-C5 en el mamífero, y el genoma del mamífero puede incluir un ácido nucleico que codifique el segmento de aminoácidos de C5 propio. El segmento de aminoácidos no propio puede ser un segmento de aminoácidos de C5. Puede que el segmento de aminoácidos de C5 no propio no se encuentre naturalmente. El segmento de aminoácidos de C5 no propio puede contener al menos dos epítopos de células T.
El polipéptido del invento incluye un segmento de aminoácidos de C5a propio y un segmento de aminoácidos de la MBP bacteriana, en que la longitud del segmento de aminoácidos de la MBP puede ser inferior a 350 (por ejemplo, inferior a 300, inferior a 250 o inferior a 200) restos de aminoácido. La administración del polipéptido a un mamífero puede provocar una respuesta anti-C5 en el mamífero, y el genoma del mamífero puede contener un ácido nucleico que codifique el segmento de aminoácidos de C5 propio.
El segmento de aminoácidos de mamífero no propio puede contener al menos dos epítopos de células T.
En aún otro aspecto, la composición del invento contiene un polipéptido, en que, con respecto al mamífero, el polipéptido contiene un segmento de aminoácidos de C5a propio y un segmento de aminoácidos de la MBP bacteriana, y en que el segmento de aminoácidos de C5a propio tiene una identidad de al menos 90 por ciento con respecto a una secuencia de C5a del mamífero.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por quien tiene una experiencia normal en la técnica a la que pertenece este invento. Aunque en la práctica o el examen del presente invento se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos, más adelante se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, tendrá el control.
Otras características y ventajas del invento resultarán evidentes a partir de la descripción detallada y los dibujos siguientes y a partir de las reivindicaciones.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 es una representación de una secuencia de DNA de pro-C5 de ratón (ID. SEC. nº 1).
La Figura 2 es una representación de la secuencia de aminoácidos de pro-C5 de ratón, incluyendo el péptido señal (ID. SEC. nº 2).
La Figura 3 es un diagrama que representa un vector de ácido nucleico diseñado para que exprese un polipéptido de fusión que contenga proteína ligante de maltosa (MBP) y C5a de ratón.
La Figura 4 es la secuencia del ácido nucleico de un producto MBP-C5a de PCR (ID. SEC. nº 3).
La Figura 5 es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido MBP-C5a de fusión (ID. SEC. nº 4).
La Figura 6 es un gráfico en que se ha trazado la incidencia de artritis provocada con colágeno en ratones testigo (rombos claros) y en ratones vacunados con un polipéptido MBP-C5a de fusión (círculos oscuros). *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,005.
La Figura 7 es un gráfico en que se ha trazado la calificación media de artritis para la artritis provocada con colágeno en ratones testigo (círculos claros) y en ratones vacunados con un polipéptido MBP-C5a de fusión (círculos oscuros). *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,005.
La Figura 8 es un gráfico en que se ha trazado la calificación media de artritis máxima para la artritis provocada con colágeno en ratones testigo y en ratones vacunados con un polipéptido MBP-C5a de fusión. **: p < 0,01.
La Figura 9 es un gráfico en que se ha trazado el área bajo la curva de los datos de calificación de artritis obtenidos de ratones a los que se ha inyectado colágeno y han sido luego tratados con PBS (testigo) o con un polipéptido MBP-C5a de fusión. ***: p < 0,005.
La Figura 10 es un gráfico en que se ha trazado el porcentaje de incidencia de artritis crónica provocada con colágeno en ratones testigo (círculos oscuros) y en ratones vacunados con un polipéptido MBP-C5a de fusión (rombos claros). *: p < 0,05; **: p < 0,01.
La Figura 11 es un gráfico en que se ha trazado la calificación media de la artritis crónica provocada con colágeno en ratones testigo (círculos oscuros) y en ratones vacunados con un polipéptido MBP-C5a de fusión (círculos claros). *: p < 0,05.
Descripción detallada
El invento proporciona medicamentos y composiciones para tratar la artritis reumatoide. Como aquí se utiliza, la expresión "estado inflamatorio" se refiere a una enfermedad, estado morboso, síndrome u otro estado que da lugar a inflamación. Por ejemplo, la artritis reumatoide y el asma son estados inflamatorios. Otros ejemplos de estados inflamatorios incluyen, sin limitación, sepsis, daño miocárdico por isquemia/reperfusión, síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, nefritis, rechazo de injertos, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, arteriosclerosis y vasculitis. El invento proporciona polipéptidos para provocar una respuesta de anticuerpos contra un antígeno, tal como C5 o C5A, en un mamífero. Por ejemplo, los medicamentos y composiciones aquí descritos se pueden utilizar para reducir los efectos de C5a en un mamífero al reducir la cantidad de C5a total y/o unido a receptor.
Polipéptidos
El invento proporciona polipéptidos que pueden ser utilizados para tratar la artritis reumatoide. Dichos polipéptidos pueden ser inmunogénicos. Un polipéptido "inmunogénico" es cualquier polipéptido que provoca eficazmente una respuesta de anticuerpos en un mamífero. Por ejemplo, un polipéptido inmunogénico puede ser un polipéptido que provoque eficazmente la producción de un anticuerpo anti-C5 propio en un mamífero.
Los polipéptidos del invento contienen al menos un segmento de aminoácidos de MBP bacteriana que sería considerado no propio por el mamífero concreto que recibiera el polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido que provoca la producción de un anticuerpo anti-C5 propio puede contener un segmento de aminoácidos de C5a propio y un segmento de aminoácidos no propio (por ejemplo, un segmento de aminoácidos de C5 no propio). El segmento de aminoácidos de C5 propio puede conferir la especificidad de la respuesta de anticuerpos anti-C5 propio, y el segmento de aminoácidos no propio puede potenciar la inmunogenicidad del polipéptido. El segmento de aminoácidos no propio (por ejemplo, un segmento de aminoácidos de C5 no propio) puede contener al menos dos epítopos de células T. Alternativamente, el segmento de aminoácidos no propio puede estabilizar un polipéptido inmunogénico de modo que se provoque la respuesta específica de anticuerpos anti-C5 propio. El segmento de aminoácidos de C5 propio de un polipéptido es una porción de C5 que interacciona directamente con un receptor de C5a. Los ejemplos de dichos segmentos de aminoácidos de C5 propios incluyen, sin limitación, C5a y fragmentos de C5a.
Cómo se utiliza aquí, la expresión "segmento de aminoácidos" se refiere a un tramo de aminoácidos contiguos de un polipéptido. El segmento de aminoácidos puede tener cualquier longitud superior a cuarenta restos de aminoácido (por ejemplo, superior a aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 o más restos de aminoácido). De esta manera, el segmento de aminoácidos puede ser la región C5a completa de C5, o una porción de C5a. En algunas realizaciones, el segmento de aminoácidos puede tener una longitud inferior a 1000 restos de aminoácido (por ejemplo, inferior a 500, inferior a 400, inferior a 300, inferior a 200 o inferior a 100 restos de aminoácido). En otras realizaciones, el segmento de aminoácidos puede tener una longitud de aproximadamente 40 a aproximadamente 150 restos de aminoácido.
El término "propio", como aquí se utiliza con respecto a un segmento de aminoácidos y a un mamífero concreto, se refiere generalmente a cualquier segmento de aminoácidos que posee endógenamente el mamífero concreto. Si un segmento de aminoácidos procede de un miembro de una especie y se introduce en otro miembro de la misma especie que posee endógenamente el segmento de aminoácidos, ese segmento de aminoácidos concreto es entonces considerado un segmento de aminoácidos propio. Por ejemplo, un segmento de aminoácidos de C5 procedente de un ratón es un segmento de aminoácidos de C5 propio cuando se introduce en ese mismo ratón, un ratón genéticamente idéntico, o un ratón no genéticamente idéntico que posee endógenamente el mismo segmento de aminoácidos.
La expresión "no propio", como aquí se utiliza con respecto a un segmento de aminoácidos y a un mamífero concreto, se refiere generalmente a cualquier segmento de aminoácidos que no posee endógenamente el mamífero concreto. Si un segmento de aminoácidos procede de un miembro de una primera especie y se introduce en un miembro de una segunda especie que no posee endógenamente el segmento de aminoácidos, ese segmento de aminoácidos concreto puede ser entonces considerado un segmento de aminoácidos no propio. Por ejemplo, un segmento de aminoácidos de C5 procedente de un ratón puede ser considerado un segmento de aminoácidos de C5 no propio cuando se introduce en un ser humano. En otro ejemplo, si un polipéptido contiene un segmento de aminoácidos de C5a procedente de un ratón y un segmento de aminoácidos de C5b procedente de un ser humano y se introduce ese polipéptido en un ratón, el segmento de aminoácidos de C5a puede ser entonces considerado un segmento de aminoácidos de C5a propio, y el segmento de aminoácidos de C5b puede ser entonces considerado un segmento de aminoácidos de C5b no propio. Alternativamente, si se introduce el mismo polipéptido en un ser humano, el segmento de aminoácidos de C5a puede ser considerado un segmento de aminoácidos de C5a no propio, y el segmento de aminoácidos de C5b puede ser considerado un segmento de aminoácidos de C5b propio. Si un segmento de aminoácidos de un miembro de una especie es considerado polimórfico con respecto a otro miembro de la misma especie, ese segmento de aminoácidos puede ser entonces considerado un segmento de aminoácidos no propio para un miembro de la especie que no posea ese polimorfismo. Por ejemplo, si un segmento de aminoácidos de C5 de un ser humano que tiene un tipo de polimorfismo en el segmento de aminoácidos es introducido en un segundo ser humano que no tiene ese tipo concreto de polimorfismo, el segmento de aminoácidos de C5 puede ser considerado un segmento de aminoácidos no propio para el segundo ser humano. También se entenderá que epítopos de células T ocultos (es decir, péptidos propios que no se expresan bajo condiciones normales en moléculas del MHC hasta el nivel requerido para el reconocimiento por células T) pueden ser considerados no propios.
El segmento o segmentos propios de los polipéptidos aquí proporcionados tienen típicamente una identidad de al menos 90 por ciento (por ejemplo, una identidad de al menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento) con respecto a una secuencia de un polipéptido hallado en el mamífero al cual se administrará el polipéptido. En algunas realizaciones, el segmento propio puede tener una identidad de 100 por ciento con respecto a una secuencia de un polipéptido hallado en el mamífero al cual se administrará el polipéptido. De este modo, el invento proporciona polipéptidos que contienen un segmento de aminoácidos que tiene (1) una longitud, y (2) un porcentaje de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de un mamífero concreto) en toda esa longitud. El invento también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene un segmento de aminoácidos que tiene (1) una longitud, y (2) un porcentaje de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos de un mamífero en toda esa longitud. Típicamente, a la secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de mamífero se hace mención como "secuencia de referencia", y a la secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico que se compara con la secuencia de mamífero se hace mención como "secuencia diana". Por ejemplo, una secuencia de mamífero puede ser la secuencia de referencia que tiene la secuencia expuesta en la ID. SEC. nº 2.
La longitud y el porcentaje de identidad en toda esa longitud para cualquier secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico se determinan del modo siguiente. En primer lugar, se compara una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico con una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico del mamífero al cual se administrará, utilizando el programa de secuencias BLAST 2 (B12seq) de la versión independiente de BLASTZ que contiene la versión 2.0.14 de BLASTN y la versión 2.0.14 de BLASTP. Esta versión independiente de BLASTZ se puede obtener de la página web de Fish & Richardson (www.fr.com/blast), la página web del National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov) del gobierno de EE.UU., o la Old Westbury Library de la State University of New York (QH 497.m6714). En el archivo "readme" que acompaña a BLASTZ se pueden hallar instrucciones que explican cómo utilizar el programa B12seq.
B12seq lleva a cabo una comparación entre dos secuencias utilizando el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se utiliza para comparar secuencias de ácido nucleico, mientras que BLASTP se utiliza para comparar secuencias de aminoácidos. Para comparar dos secuencias de ácido nucleico, se ajustan las opciones del modo siguiente: -i se ajusta a un archivo que contiene la primera secuencia de ácido nucleico que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se ajusta a un archivo que contiene la segunda secuencia de ácido nucleico que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se ajusta a blastn; -o se ajusta a cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); -q se ajusta a -1; -r se ajusta a 2; y todas las demás opciones se dejan en sus ajustes por defecto. Por ejemplo, se puede usar la siguiente orden para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias: C:\B12seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. Para comparar dos secuencias de aminoácidos, se ajustan las opciones de B12seq del modo siguiente: -i se ajusta a un archivo que contiene la primera secuencia de aminoácidos que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se ajusta a un archivo que contiene la segunda secuencia de aminoácidos que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se ajusta a blastp; -o se ajusta a cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); y todas las demás opciones se dejan en sus ajustes por defecto. Por ejemplo, se puede utilizar la siguiente orden para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias de aminoácidos: C:\B12seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Si la secuencia diana comparte homología con cualquier porción de la secuencia de mamífero, el designado archivo de salida presentará entonces las regiones de homología como secuencias alineadas. Si la secuencia diana no comparte homología con porción alguna de la secuencia de mamífero, el designado archivo de salida no presentará entonces secuencias alineadas.
Tras la alineación, se determina la longitud contando el número de nucleótidos o restos de aminoácido consecutivos de la secuencia diana presentados en alineación con la secuencia de mamífero. Una posición correspondiente es cualquier posición en que se presenta un nucleótido o resto de aminoácido idéntico tanto en la secuencia diana como en la de mamífero. Los huecos presentados en la secuencia diana no se cuentan ya que los huecos no son nucleótidos ni restos de aminoácido. Asimismo, los huecos presentados en la secuencia de mamífero no se cuentan ya que se cuentan los nucleótidos o restos de aminoácido de la secuencia diana, no los nucleótidos ni los restos de aminoácido de la secuencia de mamífero.
El porcentaje de identidad en relación con una longitud determinada se determina contando el número de posiciones correspondientes en esa longitud y dividiendo ese número por la longitud y multiplicando luego el valor resultante por 100. Por ejemplo, si (1) se compara una secuencia diana de 300 aminoácidos con una secuencia de referencia, (2) el programa B12seq presenta 200 aminoácidos consecutivos de la secuencia diana alineados con una región de la secuencia de referencia, y (3) el número de correspondencias a lo largo de esos 200 aminoácidos alineados es 180, esa secuencia diana de 300 aminoácidos contiene entonces un segmento de aminoácidos que tiene una longitud de 200 y un porcentaje de identidad de 90 [es decir, (180/200) x 100 = 90] en toda esa longitud.
Se advierte que el porcentaje del valor de identidad de secuencias se redondea a la décima más próxima. Por ejemplo, 75,11, 75,12, 75,13 y 75,14 se redondean hacia abajo hasta 75,1, mientras que 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 y 75,19 se redondean hacia arriba hasta 75,2. También se advierte que el valor de longitud será siempre un número entero.
El segmento o segmentos no propios de los polipéptidos aquí proporcionados tienen típicamente una identidad inferior a 95 por ciento (por ejemplo, una identidad inferior a 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 ó 50 por ciento) con respecto a una secuencia de un polipéptido hallado en el mamífero al cual se administrará el polipéptido.
Para preparar un polipéptido se puede utilizar cualquier método, incluyendo, por ejemplo, la expresión por sistemas procarióticos, la expresión por sistemas eucarióticos, y técnicas de síntesis química. Para purificar un polipéptido se puede utilizar cualquier método, incluyendo, sin limitación, el fraccionamiento, la centrifugación y la cromatografía. Por ejemplo, los polipéptidos que contienen proteína ligante de maltosa (MBP) pueden ser purificados utilizando cromatografía de afinidad sobre amilosa.
Ácidos nucleicos
Como se utiliza aquí, la expresión "ácido nucleico" abarca tanto RNA como DNA, incluyendo cDNA, DNA genómico y DNA sintético (por ejemplo, químicamente sintetizado). El ácido nucleico puede ser de cadena doble o de cadena sencilla. Cuando es de cadena sencilla, el ácido nucleico puede ser la cadena sentido o la cadena antisentido. Además, el ácido nucleico puede ser circular o lineal.
Como aquí se utiliza con referencia a un ácido nucleico, el término "aislado" se refiere a un ácido nucleico naturalmente presente que no está inmediatamente contiguo a una o las dos secuencias a las que está inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y otra en el extremo 3') en el genoma naturalmente presente del organismo del cual procede. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado puede ser, sin limitación, un DNA recombinante de cualquier longitud con tal de que esté eliminada o ausente una de las secuencias de ácido nucleico normalmente halladas flanqueando inmediatamente ese DNA recombinante en un genoma presente en la naturaleza. De esta manera, un ácido nucleico aislado incluye, sin limitación, un DNA recombinante que es independiente de otras secuencias (por ejemplo, un cDNA o un fragmento de DNA genómico producido mediante PCR o mediante tratamiento con endonucleasas de restricción), así como DNA recombinante que está incorporado a un vector, un plásmido autónomamente replicante, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus o herpesvirus) o el DNA genómico de un procarionte o eucarionte. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir un DNA recombinante que sea parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión.
Como aquí se utiliza con referencia a un ácido nucleico, el término "aislado" también incluye cualquier ácido nucleico que no aparece naturalmente ya que las secuencias de ácido nucleico que no aparecen naturalmente no se encuentran en la naturaleza y no tienen secuencias inmediatamente contiguas en un genoma que aparece naturalmente. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico que no aparece naturalmente, tal como un ácido nucleico diseñado, es un ácido nucleico aislado. Se puede preparar un ácido nucleico diseñado utilizando técnicas de clonación molecular o de síntesis química de ácido nucleico. El ácido nucleico aislado que no aparece naturalmente puede ser independiente de otras secuencias o estar incorporado a un vector, un plásmido autónomamente replicante, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus o herpesvirus) o el DNA genómico de un procarionte o eucarionte. Además, un ácido nucleico que no aparece naturalmente puede incluir un ácido nucleico que sea parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión.
No se ha de considerar un ácido nucleico aislado el ácido nucleico que existe entre de cientos a millones de otros ácidos nucleicos en, por ejemplo, bancos de cDNA o genómicos, ni los cortes de geles que contienen fragmentos de digestión de DNA genómico con enzimas de restricción.
Como se utiliza aquí con referencia a un ácido nucleico y a una célula concreta, el término "exógeno" se refiere a cualquier ácido nucleico que no tiene su origen en esa célula concreta como se encuentra en la naturaleza. De esta manera, se considera que cualquier ácido nucleico que no aparece naturalmente es exógeno para una célula una vez introducido en la célula. Es importante advertir que un ácido nucleico que no aparece naturalmente puede contener secuencias de ácido nucleico o fragmentos de secuencias de ácido nucleico que se encuentran en la naturaleza, con tal de que el ácido nucleico en su totalidad no exista en la naturaleza. Por ejemplo, un ácido nucleico que contiene una secuencia de DNA genómico en un vector de expresión es un ácido nucleico que no aparece naturalmente y, por lo tanto, es exógeno para una célula una vez introducido en la célula ya que el ácido nucleico en su totalidad (DNA genómico más DNA vector) no existe en la naturaleza. De este modo, se considera que cualquier vector, plásmido autónomamente replicante o virus (por ejemplo, retrovirus, adenovirus o herpesvirus) que en su totalidad no exista en la naturaleza es un ácido nucleico que no aparece naturalmente. De esto resulta que los fragmentos de DNA genómico producidos por PCR o por tratamiento con endonucleasas de restricción así como los cDNAs son considerados ácidos nucleicos que no aparecen naturalmente ya que existen como moléculas independientes no halladas en la naturaleza. También resulta que cualquier ácido nucleico que contenga una secuencia promotora y una secuencia codificadora de polipéptido (por ejemplo, cDNA o DNA genómico) en una disposición no hallada en la naturaleza es un ácido nucleico que no aparece naturalmente.
Un ácido nucleico que se encuentra en la naturaleza puede ser exógeno para una célula concreta. Por ejemplo, un cromosoma completo aislado de una célula de la persona X es un ácido nucleico exógeno con respecto a una célula de la persona Y una vez que se introduce ese cromosoma en la célula de Y.
Se pueden obtener ácidos nucleicos aislados utilizando cualquier método, incluyendo, sin limitación, las técnicas comunes de clonación molecular y de síntesis química de ácido nucleico. Por ejemplo, se puede utilizar la PCR para obtener un ácido nucleico aislado que contenga una secuencia de ácido nucleico que presente similitud con respecto a la secuencia expuesta en la ID. SEC. nº 1. La PCR se refiere a un procedimiento o técnica con que se multiplica un ácido nucleico diana de un modo similar al descrito en la Patente de EE.UU. nº 4.683.195, y a las subsiguientes modificaciones del procedimiento en ella descrito. Generalmente, se utiliza información sobre la secuencia desde los extremos de la región de interés o más allá para diseñar cebadores oligonucleotídicos que tengan una secuencia idéntica o similar a la de las cadenas opuestas de un posible molde que se va a multiplicar. Usando la PCR, se puede multiplicar una secuencia de ácido nucleico a partir de RNA o DNA. Por ejemplo, se puede aislar una secuencia de ácido nucleico mediante multiplicación por PCR a partir de RNA celular total, DNA genómico total o cDNA, así como a partir de secuencias de bacteriófagos, secuencias de plásmidos, secuencias víricas, y similares. Cuando se utiliza RNA como fuente del molde, se puede utilizar la transcriptasa inversa para sintetizar cadenas de DNA complementarias.
También se pueden obtener ácidos nucleicos aislados mediante mutagénesis. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado que contenga una secuencia expuesta en la ID. SEC. nº 1 puede ser mutado usando técnicas de clonación molecular habituales (por ejemplo, una mutagénesis dirigida al sitio). Las mutaciones posibles incluyen, sin limitación, deleciones, inserciones y sustituciones, así como combinaciones de deleciones, inserciones y sustituciones.
Además, se pueden utilizar bases de datos de ácidos nucleicos y aminoácidos (por ejemplo, GenBank®) para obtener un ácido nucleico aislado. Por ejemplo, se puede utilizar cualquier secuencia de ácido nucleico que presente cierta homología con una secuencia expuesta en la ID. SEC. nº 1, o cualquier secuencia de aminoácidos que presente cierta homología con una secuencia expuesta en la ID. SEC. nº 2, como sujeto de búsqueda en GenBank®.
Además, se pueden utilizar técnicas de hibridación de ácido nucleico para obtener un ácido nucleico aislado. En pocas palabras, cualquier ácido nucleico que presente cierta homología con una secuencia expuesta en la ID. SEC. nº 1 puede ser utilizado como una sonda para identificar un ácido nucleico similar mediante hibridación bajo unas condiciones de rigurosidad moderada a elevada. Una vez identificado, el ácido nucleico puede ser purificado, secuenciado y analizado para determinar si está dentro del alcance del invento como aquí se describe.
La hibridación se puede hacer mediante un análisis Southern o Northern para identificar una secuencia de DNA o RNA, respectivamente, que se hibride con una sonda. La sonda puede ser marcada con biotina, digoxigenina, una enzima o un radioisótopo tal como ^{32}P. El DNA o RNA que se va a analizar puede ser sometido a separación electroforética en un gel de agarosa o poliacrilamida, transferido a nitrocelulosa, nailon u otra membrana adecuada, e hibridado con la sonda utilizando técnicas estándares bien conocidas en este campo, tales como las descritas en las secciones 7.39-7.52 de Sambrook et al. (1989), "Molecular Cloning", segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Ney York, EE.UU.
Además, se puede utilizar cualquier método para dirigir la transcripción o traducción de un ácido nucleico aislado concreto que codifica un polipéptido. Dichos métodos incluyen, sin limitación, la construcción de un ácido nucleico de modo que un elemento regulador promueva la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido. Típicamente, los elementos reguladores son secuencias de DNA que regulan la expresión de otras secuencias de DNA a nivel de transcripción. Por lo tanto, los elementos reguladores incluyen, sin limitación, promotores, potenciadores y similares.
Métodos para tratar estados inflamatorios
Los polipéptidos aquí proporcionados pueden ser utilizados en la fabricación de un medicamento o una composición para tratar la artritis reumatoide. La composición puede contener un polipéptido que actúe como un antígeno contra el que se desea una respuesta inmune. Además, la composición puede contener más de un polipéptido o cualquier combinación de diferentes polipéptidos. Se advierte que cada polipéptido de la composición puede tener una secuencia de aminoácidos idéntica. Además, los polipéptidos de la composición pueden contener diferentes segmentos de aminoácidos, cada uno de los cuales puede actuar como una unidad antigénica definida contra la que se desea una respuesta inmune. De esta manera, los polipéptidos de la composición pueden contener diferentes segmentos de aminoácidos que correspondan a cualquier región de un polipéptido, incluyendo, sin limitación, regiones de unión al receptor, regiones de unión al ligando, sitios activos de enzimas, sitios de sustratos polipeptídicos para escisión enzimática, regiones de anticuerpo que se unen al antígeno, y epítopos reconocidos por anticuerpos. Por ejemplo, los polipéptidos de la composición pueden incluir tres diferentes segmentos de aminoácidos, cada uno de los cuales corresponda a la secuencia de C5 que reconoce la convertasa de C5. Además, segmentos diferentes o idénticos de aminoácidos pueden estar en tándem o estar dispersos a lo largo del mismo polipéptido. Típicamente, la administración de un polipéptido da lugar a la formación de anticuerpos que presentan especificidad para un epítopo o una combinación de epítopos formados por los segmentos de aminoácidos situados dentro de uno o más de los polipéptidos de la composición.
Se puede preparar una composición combinando cualquiera de los polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos inmunogénicos) aquí proporcionados con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos pueden incluir, sin limitación, disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Los ejemplos de disolventes no acuosos incluyen, por ejemplo, aceite mineral, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales y ésteres orgánicos inyectables. Los vehículos acuosos incluyen, sin limitación, agua, alcohol, disolución salina y disoluciones tamponadas. También pueden estar presentes conservantes, agente saboreadores y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, y similares. Se apreciará que cualquier material aquí descrito que se va a administrar a un mamífero puede contener uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
La composición también incluye un adyuvante. Un "adyuvante" es un compuesto inmunológico que puede potenciar una respuesta inmune contra un antígeno concreto, tal como un polipéptido. Se pueden combinar adyuvantes tales como, por ejemplo, hidróxido de aluminio y otros compuestos basados en aluminio (por ejemplo, Al_{2}O_{3}) con un polipéptido que contiene un segmento de aminoácidos propio (por ejemplo, un segmento de aminoácidos de C5a propio) para formar una composición que provoque una respuesta anti-propio cuando se administra a un mamífero. Los compuestos basados en aluminio se pueden obtener de diversos proveedores comerciales. Por ejemplo, los adyuvantes REHYDRAGEL® se pueden obtener de Reheis Inc. (Berkeley Heights, New Jersey, EE.UU.). Los adyuvantes REHYDRAGEL® se basan en oxihidróxido de aluminio cristalino y son geles hidratados que contienen partículas cristalinas con una elevada superficie específica (aproximadamente 525 m^{2}/g). Su contenido de Al_{2}O_{3} varía típicamente de aproximadamente 2 por ciento a aproximadamente 10 por ciento. Por ejemplo, Rehydragel LG tiene un contenido de Al_{2}O_{3} de aproximadamente 6 por ciento y fluye fácilmente tras una ligera agitación. Además, Rehydragel LG tiene una capacidad ligante de proteínas de 1,58 (es decir, 1,58 mg de albúmina sérica bovina unida por 1 mg de Al_{2}O_{3}), un contenido de sodio de 0,02 por ciento, un contenido de cloruro de 0,28 por ciento, un nivel de sulfato indetectable, un nivel de arsénico inferior a 3 ppm, un contenido de metales pesados inferior a 15 ppm, un pH de 6,5 y una viscosidad de 1090 mPa\cdots. Se puede combinar Rehydragel LG con una disolución de polipéptido (por ejemplo, un polipéptido en PBS) para obtener Al(OH)_{3}. Además, se puede usar ALHYDROGEL^{TM}, un adyuvante de gel de hidróxido de aluminio (Alhydrogel 1,3%, Alhydrogel 2,0% o Alhydrogel "85") obtenido de Brenntag Stinnes Logistics.
Además, se puede combinar MN51 con los polipéptidos aquí proporcionados para formar una composición que provoque una respuesta anti-propio cuando se administra a un mamífero. MN51 {MONTANIDE® 51 [Adyuvante Incompleto de SEPPIC (ISA; del inglés, Incomplete SEPPIC Adjuvant)]} y también MN720 son asequibles de Seppic (París, Francia). MN51 contiene oleato de manida (MONTANIDE® 80, también conocido como octadecenoato de manitol anhidro) en una disolución de aceite mineral (Drakeol 6 VR). MONTANIDE® 80 es un líquido claro con un valor máximo de acidez de 1, un valor de saponificación de 164-172, un valor de hidroxilo de 89-100, un valor de yodo de 67-75, un valor máximo de peróxido de 2, un valor de metales pesados inferior a 20 ppm, un contenido máximo de agua de 0,35%, un valor máximo de color de 9, y una viscosidad de aproximadamente 300 mPa\cdots a 25ºC. MONTANIDE® asociado con aceite (por ejemplo, aceite mineral, aceite vegetal, escualano, escualeno o ésteres) es conocido como MONTANIDE® ISA. Drakeol 6 VR es un aceite mineral de calidad farmacéutica. Drakeol 6 VR no contiene hidrocarburos insaturados ni aromáticos y tiene una densidad A.P.I. de 36,2-36,8, una densidad relativa de 0,834-0,838 a 25ºC, una viscosidad de 59-61 SSU o 10,0-10,6\cdot10^{-6} m^{2}/s a 37,8ºC, un índice de refracción de 1,458-1,463 a 25ºC, y un valor de acidez mejor que el mínimo en la prueba de acidez, es negativo en cuanto a fluorescencia a 360 nm, es negativo en cuanto a materia suspendida visible, tiene un valor de -17,8 a -9,4ºC en la prueba de fluidez ASTM, tiene un punto mínimo de inflamabilidad ASTM de 146,1ºC, y cumple todos los requisitos RN para aceites minerales ligeros y en cuanto a absorción ultravioleta. MN51 contiene aproximadamente de 8 a 12 por ciento de octadecenoato de manitol anhidro y aproximadamente de 88 a 92 por ciento de aceite mineral. MN51 es un líquido amarillo claro que tiene un valor máximo de acidez de 0,5, un valor de saponificación de 16-20, un valor de hidroxilo de 9-13, un valor máximo de peróxido de 2, un valor de yodo de 5-9, un contenido máximo de agua de 0,5 por ciento, un índice de refracción de entre 1,455 y 1,465 a 25ºC, una densidad de aproximadamente 0,85 a 20ºC y una viscosidad de aproximadamente 50 mPa\cdots a 20ºC. La conductividad de una mezcla 50:50 de MN51 y disolución salina es inferior a 10 \muS/cm.
Otros adyuvantes incluyen complejos inmunoestimulantes (ISCOMs; del inglés, immune-stimulating complexes) que pueden contener componentes tales como colesterol y saponinas. Se pueden preparar matrices de ISCOMs y se pueden conjugar con Cu^{2+} usando métodos tales como los aquí descritos. Adyuvantes tales como FCA, FIA, MN51, MN720 y Al(OH)_{3} son comercialmente asequibles de compañías tales como Seppic, Difco Laboratories (Detroit, Michigan, EE.UU.) y Superfos Biosector A/S (VedBeak, Dinamarca).
En ciertas realizaciones, la composición puede contener también uno o más componentes inmunoestimuladores adicionales. Estos incluyen, sin limitación, muramil-dipéptido (por ejemplo, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina; MDP), monofosforil-lípido A (MPL), y tripéptidos que contienen formil-metionina tales como N-formil-Met-Leu-Phe. Dichos compuestos son comercialmente asequibles de, por ejemplo, Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, EE.UU.) y RIBI ImmunoChem Research, Inc. (Hamilton, Montana, EE.UU.).
Las composiciones aquí proporcionadas pueden contener cualquier relación de adyuvante a polipéptido. Por ejemplo, la relación adyuvante:antígeno puede ser 50:50 (volumen:volumen). Alternativamente, la relación adyuvante:antí-
geno puede ser, sin limitación, 90:10, 80:20, 70:30, 64:36, 60:40, 55:45, 40:60, 30:70, 20:80 ó 10:90.
Se puede administrar a un huésped una cantidad eficaz de cualquier composición aquí proporcionada. Como aquí se utiliza, el término "eficaz" se refiere a cualquier cantidad que provoca una respuesta inmune deseada sin producir una toxicidad significativa en el huésped. Dicha cantidad puede ser determinada evaluando la respuesta inmune del huésped después de la administración de una cantidad conocida de una composición concreta. Además, el nivel de toxicidad, si lo hubiera, puede ser determinado evaluando síntomas clínicos del huésped antes y después de la administración de una cantidad conocida de una composición concreta. Se advierte que la cantidad eficaz de una composición concreta administrada a un huésped puede ser ajustada de acuerdo con unos resultados deseados así como con la respuesta del huésped y el nivel de toxicidad. La toxicidad significativa puede variar para cada huésped particular y depende de múltiples factores que incluyen, sin limitación, el estado morboso, la edad y la tolerancia al dolor del huésped.
Además, cualquier composición aquí descrita puede ser administrada a cualquier parte del cuerpo del huésped. Se puede distribuir una composición, sin limitación, en las articulaciones, la mucosa nasal, la sangre, los pulmones, los intestinos, tejidos musculares, la piel o la cavidad peritoneal de un mamífero. Además, la composición se puede administrar mediante inyección intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intratecal o intradérmica, mediante administración oral o nasal, por inhalación, o por perfusión gradual a lo largo del tiempo. En un ejemplo más, se puede administrar una preparación de una composición en aerosol a un huésped por inhalación. La duración del tratamiento con cualquier composición aquí proporcionada puede ser cualquiera, desde tampoco como un día hasta tanto como la vida entera del huésped (por ejemplo, muchos años). Por ejemplo, se puede administrar un polipéptido una vez al mes durante tres meses o una vez al año durante un periodo de diez años. Se advierte también que la frecuencia del tratamiento puede ser variable. Por ejemplo, se puede administrar un polipéptido una vez (o dos veces, tres veces, etc.) al día, a la semana, al mes o al año.
Se puede utilizar cualquier método para determinar si se provoca una respuesta inmune concreta. Por ejemplo, se pueden determinar las respuestas de anticuerpos contra antígenos concretos utilizando un ensayo inmunológico (por ejemplo, un ensayo ELISA). En dicho ensayo, se pueden revestir los pocillos de una placa de microtitulación con C5 y se pueden incubar con suero de un mamífero tratado con una composición destinada a producir anticuerpos anti-C5 en ese mamífero, y se puede determinar la presencia o ausencia de anticuerpos anti-C5 utilizando anti-IgG de rata marcada. Además, se pueden utilizar métodos clínicos que permiten evaluar el grado de un estado morboso concreto, para determinar si se provoca una respuesta inmune deseada. Por ejemplo una reducción de la inflamación puede indicar una respuesta inmune deseada en un paciente tratado con una composición destinada a producir anticuerpos anti-C5. Para respaldar la indicación de una respuesta inmune deseada, se pueden medir los niveles de anticuerpos anti-C5 en una muestra de sangre de dicho paciente utilizando la técnica ELISA anteriormente descrita.
Artículos de fabricación
Los polipéptidos y composiciones aquí proporcionados se pueden utilizar en la fabricación de un medicamento (por ejemplo, un medicamento para tratar un estado inflamatorio). Además, el invento proporciona artículos de fabricación que pueden incluir polipéptidos y composiciones aquí proporcionados. Los componentes y métodos para producir artículos de fabricación son bien conocidos. Un artículo de fabricación del invento incluye uno o más polipéptidos que provocan la producción de un anticuerpo anti-C5 propio (uno o más polipéptidos que contienen un segmento de aminoácidos de C5a propio y un segmento de aminoácidos no propio de MBP bacteriana, tal como un segmento de aminoácidos de C5 no propio). Además, el artículo de fabricación puede incluir, por ejemplo, tampones u otros reactivos de control para tratar o verificar un estado inflamatorio. En algunas realizaciones, dichos artículos de fabricación pueden incluir una etiqueta o instrucciones que indiquen que los polipéptidos contenidos en ellos son eficaces para tratar un estado inflamatorio.
El invento será adicionalmente descrito en los ejemplos siguientes, los cuales no limitan el alcance del invento descrito en las reivindicaciones.
Ejemplos Ejemplo 1 Producción y purificación de un polipéptido C5a de ratón
En la Figura 1 se muestra una secuencia de DNA de pro-C5 de ratón (ID. SEC. nº 1), y en la Figura 2 se muestra la secuencia de aminoácidos de pro-C5 de ratón incluyendo el péptido señal (ID. SEC. nº 2). La región de codificación del C5a de ratón fue aislada mediante multiplicación por PCR a partir de un banco de cDNA total de hígado de ratón. El fragmento de PCR fue ligado en el vector de expresión bacteriano pMAL-p2x (Figura 3; New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, EE.UU.), adyacentemente a una secuencia que codifica una porción de la proteína ligante de maltosa (MBP). La región de codificación del polipéptido de fusión MBP-C5a fue luego multiplicada por PCR a partir de este vector. Para facilitar la purificación final del polipéptido de fusión, el cebador 5' de PCR también codificaba seis restos de histidina. Además, el cebador 5' contenía un sitio EcoRI, y el cebador 3' contenía un sitio SalI con fines de clonación. El producto de PCR (secuencia mostrada en la Figura 4) fue transferido a un vector de expresión de mamífero, el pCEP-Pu2 episomalmente mantenido, que contiene una secuencia señal de una región inmunoglobulínica variable. El sitio SalI del producto de PCR fue ligado en el sitio XhoI del vector pECP-Pu2, lo que dio lugar a la destrucción de ambos sitios. En la ID. SEC. nº 3 se expone la secuencia de nucleótidos del producto de PCR que codifica el polipéptido de fusión, y en la ID. SEC. nº 4 se expone la secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión.
Ejemplo 2 Expresión y purificación de MBP-C5a a partir de células de mamífero
Se transfectaron células 293-EBNA con la construcción pCEP-Pu2 que contenía el polipéptido de fusión 6His-MBP-C5a, para la sobreexpresión y purificación del polipéptido de fusión secretado. Las células EBNA-293 de mamífero fueron transfectadas por lipofección y fueron cultivadas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con suero de ternera fetal al 5%, 0,5 \mug/ml de puromicina, 50 \mug/ml de gentamicina y 100 \mug/ml de geneticina. Se desarrollaron las células en crecimiento y se recogieron los medios acondicionados cada 4-5 días. Se separaron las células y los fragmentos celulares mediante centrifugación.
El polipéptido de fusión contenía seis restos de histidina para permitir la purificación utilizando agarosa Ni-NTA. Se añadió una parte alícuota de 0,75 ml de una suspensión de agarosa Ni-NTA (QIAGEN GmbH, Alemania) que contenía \sim0,35 ml de glóbulos en etanol al 20%, por 500 ml de medio acondicionado. Después de una incubación durante la noche a 4ºC en un sacudidor, la agarosa Ni-NTA fue recogida como sedimento tras una centrifugación a aproximadamente 2000 g durante 10 minutos y fue transferida a columnas. Los glóbulos fueron lavados con PBS, pH de 7,4, en presencia de NaCl 1 M y Tween-20 al 01%, realizándose la elución con imidazol 100 mM (Merck, Alemania) en Tris 20 mM, pH de 8,0, con NaCl 0,1 M, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las fracciones que contenían el polipéptido fueron reunidas y fueron dializadas frente a PBS, pH de 7,4, utilizando una membrana con un corte de pesos moleculares de 12.000-14.000 Da (Spectra/Por Membranes, Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, California, EE.UU.). Si era necesario, las muestras eran concentradas usando un dispositivo centrífugo Macrosep 10K (PALL Gelman Laboratory). La concentración final de polipéptido fue estimada mediante un ensayo Bradford (Ensayo BIO-RAD para Proteínas, Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, EE.UU.). Las células producían el polipéptido de fusión 6His-MBP-C5a con un nivel de aproximadamente 2 mg/litro. Para la estimación del tamaño se usó un marcador Rainbow de pesos moleculares para proteínas (Amersham International, Buckinghamshire, Inglaterra). El polipéptido migraba hasta una posición correspondiente al tamaño esperado de 53 kDa. En la Figura 5 se muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión.
Ejemplo 3 Efecto de MBP-C5a sobre la artritis murina provocada con colágeno
El polipéptido purificado 6His-MBP-C5a en PBS fue combinado con adyuvante completo de Freund (CFA; del inglés, Complete Freund's Adjuvant) o adyuvante incompleto de Freund (IFA; del inglés, Incomplete Freund's Adjuvant) en una relación 1:1 inmediatamente antes de su uso. La disolución fue hecha subir y bajar repetidamente por una jeringa Hamilton (Hamilton Corp., Reno, Nebraska, EE.UU.) provista de una aguja 18G, realizándose el mezclamiento hasta que se formó una emulsión blanca con unas características reológicas similares a las de un ungüento. Para la administración de la mezcla se colocó una aguja 23G en la jeringa. También se preparó una mezcla testigo que contenía volúmenes iguales de PBS y CFA o IFA.
Se repartieron machos de ratón QB (Balb/c X B10.Q) F1, de doce semanas de edad, en dos grupos de 14 ó 16 animales cada uno y se les inyectó subcutáneamente la mezcla testigo o 100 \mug de MBP-C5a emulsionado en CFA el día -21 entre las escápulas. También se tomaron muestras de sangre el día -21, y se almacenaron los sueros a -20ºC. El día -3 y el día 28 los animales recibieron inyecciones de refuerzo de la mezcla testigo o de 50 \mug de MBP-C5a en IFA. Las inyecciones se administraron típicamente en un volumen de 100 a 200 \mul.
Para provocar la artritis, se inyectaron intradérmicamente 100 \mug de CII sometido a digestión con pepsina y emulsionado 1:1 en CFA, el día 0, en la base de la cola de los ratones. Se esperaba que la artritis se desarrollara entre los días 28 y 56. Los animales recibieron una inyección de refuerzo de CII emulsionado en IFA el día 35, y se tomaron muestras de sangre el día 35. Los animales fueron examinados al menos tres veces a la semana desde el día 14 hasta el día 90, cuando finalizó el experimento. Los animales fueron calificados a ciegas utilizando un sistema de calificación basado en el número de articulaciones inflamadas en cada pata. La inflamación fue definida por la tumefacción y el enrojecimiento. En este sistema de calificación, cada dedo o nudillo inflamado recibió un punto, mientras que una muñeca o tobillo inflamado recibió cinco puntos. Esto daba lugar a una calificación de 0-15 para cada pata (5 dedos + 5 nudillos + 1 muñeca/tobillo) y de 0-60 para cada ratón. El experimento finalizó el día 90 o cuando se juzgó apropiado basándose en el desarrollo de la artritis. Ningún ratón presentó indicios de estado anormal del pelaje, cambios estereotípicos o de conducta, infección ni otros efectos secundarios graves o inesperados aparte de los síntomas que aparecen normalmente en relación con la esperada enfermedad artrítica. Se anestesiaron los animales con enflurano (Forene®)/oxígeno y se obtuvo sangre mediante punción reorbital. Se recogió el suero y se almacenó a -20ºC. Utilizando un método ELISA, se evaluaron los niveles de anticuerpos anti-CII y anti-C5a en los sueros recogidos los días -21 y 35 y al final del estudio.
Se utilizó el test Mann-Whitney para analizar los datos de calificación, y se usaron las áreas bajo las curvas y los valores de chi-cuadrado para analizar la significación de la incidencia de la artritis. El día 28 después del primer tratamiento con colágeno, siete de los 14 ratones del grupo testigo (50%) presentaban inflamación, mientras que sólo 2 de los 16 ratones (12,5%) pretratados con MBP-C5a presentaban inflamación (Figura 6). Estos datos dieron lugar a un valor P en chi-cuadrado de 0,025. La incidencia acumulada de inflamación (a partir del día 67) fue 14 de 14 en el grupo testigo y 11 de 16 en el grupo pretratado con MBP-C5a (P = 0,022). Por lo tanto, la incidencia de artritis provocada con colágeno fue significativamente diferente entre los dos grupos.
Entre los días 1 y 90 se representó gráficamente para cada grupo la calificación media de artritis basada en la cantidad de inflamación (Figura 7). La calificación máxima de 1 ratón para cada grupo fue 60. Al final del estudio, la gravedad máxima dio como resultado un valor medio de 38,6 en el grupo testigo y de19,0 en el grupo pretratado con MBP-C5a (P = 0,0085; Figura 8). El área bajo la curva dio como resultado un valor medio de 485,9 en el grupo testigo y de 168,9 en el grupo pretratado con MBP-C5a (P = 0,0012; Figura 9). Estos resultados demostraron que el tratamiento con el polipéptido de fusión MBP-C5a daba lugar a disminuciones en la incidencia y la gravedad de la artritis provocada con colágeno en estos animales.
Ejemplo 4 Efecto de MBP-C5a sobre la artritis crónica provocada con colágeno en ratones QB-BC
El polipéptido purificado MBP-C5a en PBS fue combinado con CFA o IFA del modo anteriormente descrito. También se preparó una mezcla testigo que contenía volúmenes iguales de PBS y CFA o IFA.
Se inyectaron intradérmicamente 100 \mug de CII sometido a digestión con pepsina y emulsionado 1:1 en IFA en la base de la cola de machos y hembras de ratón QB-BC [B10.Q (Balb/c X B10.Q)] de ocho a diez semanas de edad. Después de 35 días, los ratones recibieron una segunda inyección con 50 \mug de CII sometido a digestión con pepsina, en IFA. Luego se calificaron los ratones al menos 3 veces a la semana durante el desarrollo de la artritis crónica. Muchos de los ratones, aunque no todos, desarrollaron un curso morboso crónico con recidivas, caracterizado por períodos de recurrencia de artritis activa. Estas recidivas aparecían sin predicción y duraban unas pocas semanas cada vez, y parecía que iban a producirse durante toda la vida. La variabilidad del efecto de la artritis en la cohorte se debía esencialmente a la heterogeneidad genética (los ratones eran animales N2, debido a un diseño experimental dirigido a reproducir la situación genética en seres humanos).
Para coordinar la recurrencia de las recidivas, los ratones fueron inmunizados de nuevo con CII durante la fase crónica de recidivas. Cuando los ratones tenían 12-14 meses de edad, los animales que presentaban enfermedad crónica con recidivas pero que no presentaban una recidiva morbosa activa en ese momento fueron aleatoriamente mezclados y repartidos en cuatro grupos de igual tamaño. Para provocar una recidiva de artritis controlada, se inyectó subcutáneamente PBS solo o 100 \mug de MBP-C5a en PBS (n = 24), cada uno emulsionado 1:1 en CFA (n = 12), a los ratones el día -21 (día 259 después de la primera inmunización con CII) entre las escápulas. Los animales recibieron una inyección de refuerzo de 50 \mug de MBP-C5a en PBS o de PBS solo (cada uno en CFA) el día -3. El día 0 (día 280 después de la primera inmunización con CII), se inyectaron intradérmicamente 50 \mug de CII sometido a digestión con pepsina y emulsionado 1:1 en IFA a los animales de ambos grupos en la base de la cola. Se administró una segunda inyección de refuerzo de 50 \mug de MBP-C5a en PBS o de PBS solo el día 21 (día 301 después de la primera inmunización con CII). Además, se obtuvieron muestras de sangre mediante punción reorbital el día -21 y el día 0.
Los animales fueron calificados a ciegas utilizando el sistema de calificación anteriormente descrito, el cual daba lugar a una calificación de artritis de 0-60 para cada ratón. El experimento finalizó el día 358 después de la primera inmunización con CII. Estos estudios revelaron que, aunque todos los ratones testigo presentaban síntomas de artritis, especialmente cerca del día 40, sólo el 50% de los ratones inmunizados con MBP-C5a presentaban artritis crónica (p < 0,05; Figura 10). Además, se determinó la calificación media de artritis para los dos grupos desde el comienzo del estudio (es decir, desde la primera inyección de CII) hasta el final del estudio, más de 358 días después y el día 78 después de la nueva provocación o recaída (Figura 11). La calificación media de artritis no fue significativamente diferente entre los dos grupos hasta la inmunización con MBP-C5a, después de la cual la calificación media de artritis para el grupo tratado fue significativamente menor que para el grupo testigo (P < 0,05; Figura 11). Estos resultados demuestran que el polipéptido MBP-C5a de fusión era capaz de reducir la incidencia de artritis crónica con recidivas en los animales tratados.
Otras realizaciones
Se ha de entender que, aunque el invento ha sido descrito conjuntamente con su descripción detallada, la descripción precedente está destinada a ilustrar y no a limitar el alcance del invento, el cual viene definido por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

1. Uso de una composición que comprende un adyuvante y un polipéptido para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la artritis reumatoide en un mamífero, en que dicho polipéptido comprende un segmento de aminoácidos propio del factor C5a del complemento, con una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y un segmento de aminoácidos de la proteína ligante de maltosa (MBP) bacteriana, con una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y en que dicho polipéptido provoca una respuesta anti-factor C5a propio del complemento en dicho mamífero.
2. El uso de la Reivindicación 1, en que dicho adyuvante es un compuesto basado en aluminio.
3. El uso de la Reivindicación 1, en que dicho adyuvante es hidróxido de aluminio.
4. El uso de la Reivindicación 1, en que dicho polipéptido carece de un sitio de escisión por factor Xa entre dicho segmento de aminoácidos de C5a y dicho segmento de aminoácidos de la proteína ligante de maltosa.
5. El uso de la Reivindicación 1, en que dicho mamífero es un ser humano.
6. Una composición para uso en el tratamiento de la artritis reumatoide en un mamífero, composición que comprende un adyuvante y un polipéptido, en que dicho polipéptido comprende un segmento de aminoácidos propio del factor C5a del complemento, con una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y un segmento de aminoácidos de la proteína ligante de maltosa (MBP) bacteriana, con una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y en que dicho polipéptido provoca una respuesta anti-factor C5a propio del complemento en dicho mamífero.
7. La composición para el uso de la Reivindicación 6, en que dicho adyuvante es un compuesto basado en aluminio.
8. La composición para el uso de la Reivindicación 6, en que dicho adyuvante es hidróxido de aluminio.
9. La composición para el uso de la Reivindicación 6, en que dicho polipéptido carece de un sitio de escisión por factor Xa entre dicho segmento de aminoácidos de C5a y dicho segmento de aminoácidos de la proteína ligante de maltosa.
10. La composición para el uso de la Reivindicación 6, en que dicho mamífero es un ser humano.
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