ES2323572T3 - Metodo de preparacion de agregados enzimaticos reticulados. - Google Patents
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Abstract
Método de preparación de agregados enzimáticos reticulados que comprende las etapas de a) precipitar una enzima disuelta presente en un medio líquido; y b) reticular con un reticulante, caracterizado porque, la etapa a) se realiza en presencia de un compuesto seleccionado entre un éter corona o un tensioactivo.
Description
Método de preparación de agregados enzimáticos
reticulados.
La presente invención se refiere a un método de
preparación de agregados enzimáticos reticulados que comprende las
etapas de
- a)
- precipitar una enzima disuelta presente en un medio líquido;
- b)
- reticular con un reticulante, y
- c)
- opcionalmente, lavar el agregado enzimático reticulado
Dicho método se conoce generalmente en la
técnica. Éste método se utiliza para preparar preparaciones
enzimáticas para realizar diversas reacciones catalizadas por
enzimas. Por ejemplo, Cao y otros, (Organic Letters vol. 2 (10) p.
1361-1364, 2000) describen la preparación de
agregados a base de penicilina acilasa. Los agregados reticulados
descritos son menos activos que la enzima nativa.
El objeto de la presente invención es dar a
conocer un método que haga posible conseguir agregados con una
mayor actividad enzimática.
Para ello, la presente invención se caracteriza
porque se realiza como mínimo, un tratamiento seleccionado entre el
grupo que comprende I) realizar la etapa a) en presencia de un
compuesto seleccionado entre el grupo que comprende i) un éter
corona y ii) un tensioactivo, y II) realizar la etapa c) con un
segundo líquido cuya composición orgánica difiere de la del
líquido.
Los Solicitantes han descubierto
sorprendentemente que dicho tratamiento puede dar como resultado un
agregado enzimático reticulado (CLEA) con una actividad mejorada.
Aunque la presente invención no garantiza esta actividad mejorada
para una enzima en particular usada para catalizar una reacción en
particular, ni permite la predicción de una actividad mejorada,
proporciona un parámetro extra a controlar para conseguir un
agregado mejor. Es decir, para una enzima particular, puede
investigarse con poco esfuerzo y usando experimentación sencilla y
rutinaria, si su capacidad catalítica puede mejorarse usando el
tratamiento. Entre una gama de enzimas capaces de catalizar la
reacción deseada, el mejor CLEA puede seleccionarse fácilmente y con
poco esfuerzo. Debido a que el CLEA es insoluble, puede lavarse con
un segundo líquido que sea completamente acuoso, orgánico o una
mezcla de los dos. Después del tratamiento, el CLEA puede
liofilizarse o almacenarse en forma de suspensión para un uso
futuro.
Overbeeke P.L.A. y otros, describen en el
documento J. of Mol. Cat. B: Enzymatic 10, p.
385-393 (2000) un método en el que una lipasa se
cristaliza bajo la influencia de PEG en presencia de
2-metil-2,4-pentanodiol
y los cristales formados se reticulan. Por el contrario, la
presente invención hace uso de un agente de precipitado para formar
agregados en lugar de cristales.
CAO L y otros, describen agregados reticulados
de penicilina acilasa: "Robust catalysts for the synthesis of
beta-lactam antibiotics". JOURNAL OF MOLECULAR
CATALYSIS B ENZYMATIC, vol. 11, Nº 4-6, 2001,
páginas
665-670, XP001079507 ISSN: 1381-1177.
665-670, XP001079507 ISSN: 1381-1177.
Además VAN UNEN, DRIK-JAN y
otros, se refieren a "Crown ether activation of
cross-linked subtilisin Carlsberg crystals in
organic solvents" JOURNAL OF THE CHEMICAL SOCIETY, PERKIN
TRANSACTIONS 1: ORGANIC AND BIO-ORGANIC CHEMISTRY
(20), 1998, páginas 3341-3343, XP002202482.
Finalmente, KHALAF y otros, dan a conocer
"Cross-linked enzyme crystals as highly catalysts
in organic solvents" J. AM. CHEM. SOC., vol. 118, 1996, páginas
5494-5495, XP002202483.
Preferentemente, la etapa a) y la etapa b) se
realizan simultáneamente.
Esto proporciona un procedimiento simplificado,
que requiere menos tiempo y esfuerzo.
Según una realización preferente, el compuesto
se retira después de la reticulación.
No es necesario que el tensioactivo y/o el éter
corona estén presentes durante la reacción catalítica a realizar
por el CLEA para mantener la alta actividad. Por lo tanto, el
compuesto puede retirarse, en caso en que pudiera interferir con la
reacción a catalizar o por otras razones. La retirada puede
conseguirse usando cualquier método conocido en la técnica, y en
particular a través de diálisis o lavado usando centrifugado.
Según una importante aplicación del método según
la presente invención, la enzima es una lipasa.
Por lo tanto, la presente invención también se
refiere a un método para realizar una reacción catalizada por
lipasa, seleccionándose dicha reacción entre el grupo que comprende
i) transesterificación; ii) interesterificación; iii) hidrólisis;
iv) esterificación; v) amoniolisis; vi) aminolisis; y vii)
perhidrólisis, dicho método se caracteriza porque se prepara un
agregado de lipasa reticulado según la presente invención y dicho
agregado de lipasa reticulado se pone en contacto con un
sustrato.
La presente invención se ilustrará a
continuación con referencia a los siguientes ejemplos.
Ejemplo
1
- -
- Lipozyme lipasa de R. miehei (Novo Nordisk)
- -
- SP525 lipasa B de Candida antarctica (Novo Nordisk)
- -
- Lipasa de P. alcaligenes (Gist-brocades)
Método
Ia)
Se disuelven 0,5 ml de solución madre enzimática
(Lipozyme o SP525, Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca) o 50 mg de
polvo de enzima PaL (PaL es lipasa de P. alcaligenes
(Gist-Brocades, Delft, Países Bajos)), en 1 ml de
tampón fosfato potásico (100 mM, pH 7) en un tubo de centrífuga de
10 ml. Se añadieron 550 mg de (NH_{4})_{2}SO_{4}
seguidos por 1 ml de una solución de precipitación A que consiste en
550 mg de (NH_{4})_{2}SO_{4} (el precipitante) en
tampón fosfato potásico (100 mM, pH 7) y se añaden 80 \mul de
glutardialdehído (solución al 25% en agua). La mezcla se deja en
agitación a 4ºC (temperatura ambiente para SP525) durante 17 horas.
Se añaden 3 ml de H_{2}O a la mezcla y a continuación se
centrifuga. El sobrenadante se decanta y el residuo se lava, se
centrifuga y se decanta 3 veces más con H_{2}O (5 ml cada vez). La
preparación enzimática final se mantiene en 5 ml de H_{2}O. Si
fuera necesario, el sólido se dispersa agitando con agitadores
magnéticos.
Método Ib y
Ic)
Se repitió el método Ia), con la diferencia de
que la solución de precipitación A contenía además 25 mg de
dodecilsulfato sódico (SDS) (método Ib) o 25 mg de Triton
X-100 (TR) (método Ic).
Método
Id)
Se introducen 0,5 ml de solución madre
enzimática (Lipozyme o SP525) o 50 g de polvo de enzima PaL en un
tubo de centrífuga de 10 ml, después de lo cual se añade 1 ml de
tampón fosfato potásico (100 mM, pH 7), 3 ml de DME y 80 \mul de
glutardialdehído. La mezcla se deja en agitación a 4ºC (temperatura
ambiente para SP525) durante 17 horas.
Se añade 1 ml de DME a la mezcla y a
continuación se centrifuga. El sobrenadante se decanta y el residuo
se lava, se centrifuga y se decanta 3 veces más con DME (5 ml cada
vez).
La preparación enzimática final se mantiene en 5
ml de DME. Si fuera necesario, el sólido se dispersa agitando con
agitadores magnéticos.
Método
Ie)
Se repitió el método Ie), excepto que también se
añadió una cantidad de 6,9 mg del éter corona
dibenzo-18-corona-6
junto con los 3 ml de DME.
Las preparaciones de lipasa reticuladas se
mantuvieron en suspensión, en agua o DME, denominadas preparaciones
Ia-e.
La actividad de los CLEA preparados según las
preparaciones Ia-e) se ensayó con tres reacciones.
Estas reacciones se realizaron en una solución acuosa o en una
solución orgánica.
Para los ensayos IIb e IIc, se siguió el
siguiente procedimiento general, antes de realizar el ensayo:
- -
- De suspensiones acuosas, muestras de 0,5 ml de suspensión de CLEA se liofilizaron cada una en tubos Eppendorf de 2 ml.
- -
- De suspensiones orgánicas, muestras de 0,5 ml de suspensión de CLEA se centrifugaron cada una en un tubo Eppendorf de 2 ml y el sobrenadante se decantó.
- -
- Enzima nativa, usada como control, se usó directamente de la solución madre (50 \mul) o en forma de polvo (5 mg), sin tratamiento adicional.
Para los ensayos IIb y IIc, se realizaron
análisis usando un cromatógrafo de gases GC Varian Star 3600
(Varian). Columna: CP WAX 52 CB 50 m x 0,53 mm. Gas transportador:
nitrógeno.
Ensayo
IIa)
La preparación enzimática (50 \mul) se
suspendió en 0,5 ml de agua (1,5 ml en el caso de SP525) y 200
\mul (50 \mul en el caso de SP525) de la suspensión se
añadieron a 2,5 ml de solución de éster (propionato de
p-nitrofenilo 0,4 mM en agua a 25ºC). La medición
del aumento de absorbancia a 348 nm (aparición de
p-nitrofenol) en la hidrólisis de propionato de
p-nitrofenilo se supervisó usando un
espectrofotómetro UV Cary 3-Bio de Varian. Los
valores se dan como porcentaje de la actividad de la enzima
nativa.
El resultado se resume en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
IIb)
Se añaden 0,5 ml de éter diisopropílico al tubo
Eppendorf que contiene la enzima. Se añaden 50 mg de zeolita NaA
activada (Aldrich). Se añade una solución de 0,5 ml de octanoato de
etilo 86 mM, octanol 400 mM y decano 50 mM en éter diisopropílico y
se deja agitar a temperatura ambiente. En el momento especificado,
la mezcla de reacción se centrifuga, se extrae una alícuota (100
\mul), se disuelve en 0,5 ml de DME y se analiza mediante
cromatografía de gases (GC).
El resultado se resume en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
IIc)
Se añaden 50 \mul de H_{2}O y 0,95 ml de
solución de octanoato de etilo 43 mM y decano 25 mM a un tubo
Eppendorf que contiene la enzima y se deja agitar a temperatura
ambiente. En el momento especificado, se añade Na_{2}SO_{4}
anhidro a la mezcla de reacción, se agita y se centrifuga. A
continuación, se extrae una alícuota (100 \mul), se disuelve en
0,5 ml de DME y se analiza mediante GC.
El resultado se resume en la tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Como muestran los anteriores resultados, la
adición de un tensioactivo o un éter corona según la presente
invención, puede tener un efecto beneficioso sobre la actividad
enzimática.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repitió el método Ia usando SP525. El
sobrenadante se decanta y el sedimento se resuspende en 5 ml de
agua, se centrifuga y el sobrenadante se decanta.
El sedimento obtenido se somete al mismo
procedimiento de lavado con 3*5 ml de agua o DME. Después de la
última etapa de lavado, el CLEA se mantiene en 5 ml del mismo
disolvente.
Los dos CLEA se ensayaron usando la
transesterificación de octanoato de etilo con octanol (como se ha
descrito en el ensayo IIc).
Se añaden 0,5 ml de DME a 50 \mul de
preparación enzimática en un Eppendorf de 2 ml. La enzima lavada
solamente con agua se liofilizó previamente en el tubo Eppendorf.
Se añaden 50 mg de zeolita NaA activada. Se añaden 0,5 ml de
solución de octanoato de etilo 86 mM, octanol 400 mM y decano 50 mM
en DME y se deja agitar a temperatura ambiente. Después de 1 hora,
la mezcla de reacción se centrifuga, se extrae una alícuota (100
\mul), se disuelve en 0,5 ml de DME y se analiza mediante GC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon CLEAs de lipasa según el
procedimiento descrito en el ejemplo 1 y se ensayaron en la
hidrólisis de mandelato de metilo. La enzima se añadió a una
solución de mandelato de metilo 50 mM en tampón
dimetoxietano-fosfato potásico pH 7 (95:5 v/v).
Después de 48 horas, la conversión y el exceso enantiomérico del
sustrato (ee_{s}) se analizaron usando HPLC (véase Tabla 5).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de la tabla 5 puede observarse que la
Proporción enantiomérica puede aumentar usando el método según la
presente invención.
Claims (6)
1. Método de preparación de agregados
enzimáticos reticulados que comprende las etapas de
- a)
- precipitar una enzima disuelta presente en un medio líquido; y
- b)
- reticular con un reticulante,
caracterizado porque,
la etapa a) se realiza en presencia de un
compuesto seleccionado entre un éter corona o un tensioactivo.
2. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque el agregado enzimático reticulado se
lava con un segundo líquido de composición orgánica diferente a la
del líquido usado en la etapa a).
3. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque las etapas a) y b) se realizan
simultáneamente.
4. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el
compuesto se retira después de la reticulación.
5. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la enzima
es una lipasa.
6. Método para realizar una reacción catalizada
por lipasa, seleccionándose dicha reacción entre el grupo que
comprende i) transesterificación; ii) hidrólisis; y iii)
amoniolisis, caracterizado porque se prepara un agregado de
lipasa reticulado, según la reivindicación 5, y dicho agregado de
lipasa reticulado se pone en contacto con un sustrato.
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