ES2323252T3 - Procedimiento de preparacion de un oligonucleotido antisentido. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para la preparación de un oligonucleótido antisentido o derivado del mismo que comprende los pasos de - seleccionar un ácido nucleico objetivo, dilucidando su secuencia si fuese necesario - sintetizar el oligonucleótido antisentido a dicha secuencia objetivo de una forma conocida per se en la que el oligonucleótido antisentido tiene las siguientes características - el oligonucleótido comprende al menos 8 residuos, - el oligonucleótido comprende como máximo doce elementos, que son capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con bases de citosina, - el oligonucleótido no contiene cuatro o más elementos consecutivos, capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con cuatro bases consecutivas de citosina (CCCC) en la molécula objetivo, o de manera alternativa cuatro o más consecutivos de GGGG, - el oligonucleótido tampoco contiene 2 o más series de tres elementos consecutivos, capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con tres bases consecutivas de citosina (CCC) en la molécula objetivo, o de manera alternativa 2 o más series de tres elementos consecutivos de GGG, y - la relación entre residuos que forman dos enlaces de hidrógeno por residuo (2H-enlace-R) con la molécula objetivo y aquellos residuos que forman tres enlaces de hidrógeno por residuo (3H-enlace-R) con la molécula objetivo, está regida por las siguientes especificaciones:

Description

Procedimiento de preparación de un oligonucleótido antisentido.
La presente invención está relacionada con un procedimiento para la preparación de oligonucleótidos antisentido y con un oligonucleótido o análogos funcionales o estructurales o derivados efectivos de los mismos, que forman enlaces de hidrógeno con ácidos desoxirribonucleicos (ADN) y/o ácidos ribonucleicos (ARN) o derivados de los mismos incluyendo, pero sin estar limitados a ello, la formación de enlaces de hidrógeno con las bases adenina (A), citosina (C), guanina (G), uracilo (U) o timidina (T) contenidas en dichas moléculas o formando enlaces de hidrógeno con residuos de una proteína particular, como una molécula capaz de alterar la estructura o función de expresión, de un gen, una molécula o una proteína de ARN o alterar el nivel de actividad de un gen, una molécula o una proteína de ARN. Además, la presente invención está relacionada con dicho ácido nucleico o análogos funcionales o estructurales o derivados efectivos de los mismos, acoplados o mezclados con ácido fólico, hormonas, hormonas esteroides como estrógeno, progesterona, corticosteroides, mineralocorticoides, andrógenos, péptidos, proteoglicanos, fosfolípidos, glicolípidos y derivados de los mismos.
Además, la invención está relacionada con el uso de dichos ácidos nucleicos o análogos funcionales o estructurales o derivados efectivos de los mismos, para analizar las propiedades funcionales de un gen en particular, ARN, o proteína al alterar su actividad, estructura, función o al alterar sus niveles de expresión.
Además, la invención está relacionada con ácidos nucleicos antisentido, capaces de modular la expresión o actividad funcional de las proteínas que regulan el crecimiento celular que lleva al aumento, inhibición o modulación del crecimiento celular o a la proliferación celular y/o la expansión de células primarias o células madre, por ejemplo, en cultivo o en el organismo vivo.
Además, la invención está relacionada con una composición farmacéutica que comprende dichos ácidos nucleicos o análogos funcionales o estructurales o derivados efectivos de los mismos, hibridándose con un área del ARN mensajero (ARNm) o el ADN de un gen objetivo o enlazándose a una proteína particular, al igual que el uso de dichos ácidos nucleicos, análogos estructurales y derivados de los mismos para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades en las que la alteración de la función de la estructura, actividad o expresión de un gen objetivo particular, un ARN objetivo particular o la actividad particular de las proteínas objetivo lleva a un beneficio terapéutico relacionado con el efecto del ácido nucleico o derivado del mismo.
La modulación de la expresión de los genes, las moléculas de ARN o las proteínas o de sus niveles de actividad con ácidos nucleicos o análogos funcionales o estructurales o derivados efectivos de los mismos es un medio potente para estudiar la función de las moléculas respectivas. Por ejemplo, la modulación, por ejemplo el silenciamiento génico o el aumento de la expresión de una proteína particular puede llevar a la identificación de su papel tanto fisiológico como patofisiológico en células cultivadas al igual que en organismos vivos in vivo.
Además, la expresión aberrante o la sobreexpresión de los genes, moléculas o proteínas de ARN, la expresión de ADN, ARN o proteínas foráneas, por ejemplo, derivadas de organismos infecciosos o la expresión de ADN, ARN y proteínas mutadas se encuentra en una variedad de enfermedades. La regulación a la baja de la expresión o de la actividad de dicho ADN, ARN y/o proteínas puede llevar a una inhibición de los procesos patológicos o a la inversión de los mismos en los que la expresión de un ADN, ARN y/o proteína particular desempeña un papel. Sin embargo, los ácidos nucleicos o derivados de los mismos utilizados para la regulación a la baja de la expresión del ADN, ARN y/o de las proteínas son a menudo ineficaces y/o tóxicos a las células o los organismos tratados con dichas
moléculas.
Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para diseñar y preparar oligonucleótidos o derivados de los mismos que evitan los inconvenientes de la técnica anterior, y proporcionar un procedimiento fiable para la preparación de oligonucleótidos que tienen una mayor efectividad y/o una toxicidad reducida y/o efectos no selectivos reducidos.
El objeto se logra por medio de un procedimiento que tiene las características de la reivindicación 1. Las realizaciones preferidas del procedimiento de la invención son aquellas conforme a las reivindicaciones 2 a 7.
El procedimiento de la invención comprende los pasos
-
de seleccionar un ácido nucleico objetivo, dilucidando su secuencia si fuese necesario
-
generar el oligonucleótido antisentido con la condición de que
-
el oligonucleótido comprende al menos 8 residuos,
-
el oligonucleótido comprende como mucho doce elementos, que son capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con bases de citosina,
\newpage
-
el oligonucleótido no contiene cuatro ni más elementos consecutivos, capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con cuatro bases de citosina (CCCC) dentro de la molécula objetivo o, de manera alternativa, cuatro o más elementos consecutivos de GGGG,
-
el oligonucleótido tampoco contiene 2 o más series de tres elementos consecutivos, capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con tres bases consecutivas de citosina (CCC) dentro de la molécula objetivo, o de manera alternativa, 2 o más series de tres elementos consecutivos de GGG, y
-
formando la relación entre residuos dos enlaces de hidrógeno por residuo (2H-enlace-R) con la molécula objetivo y formando esos residuos tres enlaces de hidrógeno por residuo (3H-enlace-R) con la molécula objetivo, está regida por las siguientes especificaciones:
1
-
y sintetizando el oligonucleótido generado de esta manera de forma conocida per se.
\vskip1.000000\baselineskip
El oligonucleótido antisentido generado comprende al menos 8 residuos para tener una interacción suficiente con la molécula objetivo y tiene preferiblemente hasta 30, más preferiblemente hasta 24 y más preferiblemente aún hasta 18 residuos. Se prefiere una menor longitud de cadena sobre las mayores para aumentar la especificidad y/o reducir los efectos no específicos.
El oligonucleótido comprende como mucho 12 elementos que son capaces de formar 3 enlaces de hidrógeno cada uno con bases de citosina. En el caso de generar un oligonucleótido, un elemento está representado por un residuo; de esta manera, un nucleótido del oligonucleótido. En los casos de generar un derivado un elemento se considera como una parte de la molécula capaz de formar enlaces de hidrógeno. Se prefiere que el oligonucleótido comprenda como máximo 10 elementos y se prefiere más que tenga como máximo 8 elementos que son capaces de formar 3 enlaces de hidrógeno cada uno con bases de citosina.
El oligonucleótido antisentido generado preferiblemente no contiene 4 o más bases consecutivas de guanina y no contiene 2 o más series de 3 bases consecutivas de guanina.
Preferiblemente, la relación entre residuos que forman 2 enlaces de hidrógeno por residuo (2H-enlace-R) con su molécula objetivo y los residuos que forman 3 enlaces de hidrógeno por residuo (3H-enlace-R):
2
se encuentra en el rango mayor que 0,33 y menor que 0,86, más preferiblemente menor que 0,79 y aún más preferiblemente menor que 0,72.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización los oligonucleótidos generados por el procedimiento de la invención están modificados para una mayor resistencia de la nucleasa que los nucleótidos que se dan naturalmente. Se conocen en la técnica los procedimientos para sintetizar oligonucleótidos y derivados de los mismos, véase por ejemplo "Oligonucleotides and Analogues", F. Eckstein (Ed.), 1991, IRL Press Oxford o "Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties", Sudhir Agrawal (Ed.), 1993, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey.
Los oligonucleótidos de la invención también contienen residuos de ARN y ADN en sus cadenas.
Se pueden llevar a cabo modificaciones en las bases, los azúcares o los enlaces de los nucleótidos. Preferiblemente, las modificaciones son enlaces internucleótidos de fosforotioato (S-ODN), y/o enlaces internucleótidos de metilfosfato, enlaces de fosforamidato N'3 -> P'5, enlaces de péptidos o modificaciones 2'-metoxietoxi de la mitad de azúcar o modificaciones de las bases. En una realización preferida el nucleótido tiene al menos dos tipos distintos de modificaciones y más preferiblemente al menos dos tipos distintos de enlaces internucleótidos. En otra realización preferida, los oligonucleótidos están enlazados o mezclados con ácido fólico, hormonas como hormonas esteroides o corticosteroides, péptidos, proteoglicanos, glicolípidos, fosfolípidos o derivados de los mismos.
Sorprendentemente las moléculas, que se pueden obtener conforme al procedimiento de la invención podían reducir fuertemente o evitar la toxicidad y/o los efectos no específicos de dichas moléculas y/o tenían una actividad significativamente mayor que las secuencias seleccionadas de otra manera. Preferiblemente, las moléculas conforme a la invención tienen las siguientes características: no contienen cuatro o más residuos consecutivos de guanosina (N_{a}GGGGN_{b}) o de inosina (N_{a}IIIIN_{b}) y el oligonucleótido no contiene dos o más series de tres o más residuos de guanosina (N_{a}GGGN_{c}GGGN_{b}) y no contiene dos o más series de tres o más residuos consecutivos de inosina (N_{a}IIIN_{c}IIIN_{b}), en las que N_{a}, N_{b}, N_{c} representan oligonucleótidos independientemente de cualquier secuencia que tiene de 0 a 20 residuos.
En una realización preferida, la molécula contiene un mínimo de 10 residuos capaces de formar ya sean dos o tres enlaces de hidrógeno por residuo. Además, la molécula contiene un máximo de 24 residuos consecutivos enlazados por enlaces de fosforotioato capaces de formar ya sean dos o tres enlaces de hidrógeno por residuo. En las moléculas conforme a la invención que contienen más de 18 residuos, los enlaces adicionales consisten preferiblemente de enlaces de metilfosfonato o enlaces de fosfodiéster.
En la figura 1 se muestran las estructuras químicas de los oligodesoxirribonucleótidos antisentido.
En la figura 2 se muestran las estructuras químicas de los oligorribonucleótidos antisentido. Se debe entender el oligonucleótido como un detalle de una cadena mayor de nucleótidos.
Por supuesto, los oligonucleótidos pueden estar compuestos de elementos de cualquiera de las figuras.
En las figuras 1 y 2, la letra B representa una base orgánica como adenina (A), guanina (G), citosina (C), inosina (I), uracilo (U) y timina (T) que están acopladas a la desoxirribosa. Los enlaces entre los nucleótidos son enlaces de fosfodiéster como en el ADN que se da naturalmente o enlaces que separan los nucleótidos de forma que se permita la hibridación con su ácido nucleico objetivo o el enlace a una proteína para regular su actividad, como por ejemplo, enlaces de fosforotioato, enlaces de metilfosfonato, enlaces de fosforamidato o enlaces de péptidos.
R_{2} y R_{3} representan residuos adicionales del oligonucleótido o derivado.
R_{4} representa OH o una modificación como un derivado de 2'-metoxi etoxi.
Las modificaciones del enlace de fosfodiéster, mostrado en las figuras 1 y 2, puede estar seleccionado, pero sin estar limitado a ello, de entre:
1. Oligodesoxirribonucleótidos u oligorribonucleótidos sustituidos por
1.1 R1 = O
1.2 R1 = S
1.3 R1 = F
1.4 R1 = CH_{3}
1.5 R1 = OEt
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2. Oligodesoxirribonucleótidos en los que R1 varía en los fosfatos internucleótidos en un oligonucleótido
3
en la que la letra p representa el enlace de fosfodiéster o de fosforamidato, modificado mediante el acoplamiento de un R1a, R1b o R1c o para un enlace peptídico, o para enlaces que separan los nucleótidos de tal forma que se permita la hibridación con su ácido nucleico objetivo o el enlace con una proteína para regular su actividad, estructura, función o nivel de expresión.
en el que la letra B = cualquier desoxirribonucleótido o ribonucleótido, dependiendo de la secuencia de genes conforme a la invención.
n, m, x, y = números enteros 0-20.
\newpage
La longitud máxima preferida del número total de bases es 30.
4 
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Preferiblemente, el oligonucleótido comprende un mínimo de 10 elementos y un máximo de 24 elementos capaces de formar ya sean 2 o 3 enlaces de hidrógeno por elemento. Los oligonucleótidos de la invención pueden tener modificaciones en la base, el azúcar o la mitad de fosfato. Las modificaciones preferidas son enlaces internucleótidos de fosforotioato (S-ODN), y/o enlaces internucleótidos de metilfosfonato, enlaces de fosforamidato N'3 -> P5', enlaces de péptidos o modificaciones de 2'-metoxietoxi del azúcar o modificaciones de las bases. En una realización muy preferida los oligonucleótidos antisentido comprenden las secuencias 41 a 73, 74 a 106, 154 a 172, 173 a 203, 298 a 380, 476 a 506, 519 a 556 y 597 a 641 de la figura 3 y 1273-1764 de la figura 5. Un aspecto adicional de la invención es el uso de los oligonucleótidos de la invención para la inhibición de los genes p53, rb, junD, junB, TGF-\beta1,
TGF-\beta2 para influenciar la proliferación celular, en particular de los cultivos celulares primarios como células de hígado, células de riñón, osteoclastos, osteoblastos y/o queratinocitos y/o células de linaje sanguíneo, como células madre de la médula ósea, y/o células progenitoras de células rojas y blancas de sangre y/o células madre de
órganos.
Las Secuencias 41-73 y/o 74-106 y/o 154-203 y/o 519-556 y/o 597-641 y/o 1273-1277 y/o 1481-1490 y/o 1532-1549 y/o 1656 son útiles para el tratamiento y/o la prevención de trastornos inmunosupresores incluyendo, pero no limitados a la inmunosupresión en enfermedades neoplásticas -incluyendo gliomas y otros tumores cerebrales, sarcomas, carcinomas y linfomas- y/o inmunosupresión como un efecto secundario de fármacos, incluyendo, pero no limitados a efectos secundarios de agentes citotóxicos y/o inmunosupresión en pacientes con SIDA.
En una realización adicional de la invención, estas secuencias también son útiles para el tratamiento y/o la prevención de hipoproliferación de células normales, incluyendo, pero no limitadas a células inmunes, células madre de la médula ósea, células endoteliales, células madre de órganos y células proliferantes del intestino.
Las Secuencias 41-73 y/o 74-106 y/o 298-380 y/o 476-506 y/o 519-556 y/o 1273-1480 y/o 1596-1614 y/o 1657-1658 y/o 1690 y/o 1696-1712 y/o 1751 y/o 1753 y/o 1757 son útiles para el tratamiento o la prevención de trastornos hiperproliferativos, incluyendo pero no limitados a tumores cerebrales, sarcomas, carcinomas y linfomas, restenosis, hiperplasia, fibrosis pulmonar, angiogénesis y soriasis.
Las Secuencias 1278-1480 y/o 1491-1531 y/o 1582-1592 y/o 1615-1655 y/o 1691-1694 y/o 1697-1750 y/o 1759-1764 son útiles para el tratamiento y/o prevención de enfermedades caracterizadas por hiperfunción del sistema inmune y/o de trastornos inflamatorios y/o trastornos autoinmunes, incluyendo, pero no limitados a asma (siendo aplicadas moléculas conforme a la invención por inhalación y/o vías parenterales y/u oralmente), esclerosis múltiple, trastornos del intestino, incluyendo yeyunitis, ileítis y/o colitis, al igual que trastornos inflamatorios caracterizados por la hiperproliferación y/o hiperfunción de las células de linaje esinófilo y/o glomerulonefritis y/o rechazo de trasplantes.
Las Secuencias 476-506 y/o 1550-1581 y/o 1582-1595 y/o 1658-1689 y/o 1691-1694 y/o 1713-1752 son útiles para el tratamiento y/o prevención de enfermedades asociadas con la degeneración celular, incluyendo, pero no limitadas a la neurodegeneración, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, Parkinson, trastornos isquémicos, incluyendo isquemia de miocardio y/o isquemia del sistema nervioso, incluyendo apoplejía.
Un aspecto adicional de la presente invención es un medicamento que comprende un oligonucleótido conforme a la invención junto con aditivos. Los oligonucleótidos de la invención se pueden utilizar para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de neoplasma, hipoproliferación, hiperproliferación, enfermedades degenerativas, enfermedades neurodegenerativas, isquemia, trastornos del sistema inmune y/o enfermedades infecciosas y se pueden utilizar para el análisis de la función de los genes o validación de objetivos de fármacos.
Se pueden utilizar las moléculas conforme a la invención para estudiar la función de las moléculas objetivo y sus transcripciones codificadas y/o productos de traslación, incluyendo moléculas y proteínas de ARN. Se pueden utilizar regulaciones a la baja de una proteína o de una molécula de ácido nucleico que utiliza moléculas conforme a la invención para estudiar la función de la molécula. También es una característica de la invención que las moléculas conforme a la invención puedan ser utilizadas para estudiar si la modulación del producto tiene un efecto deseado, incluyendo efectos terapéuticos y utilizar esta información para desarrollar una molécula distinta, para modular la función de la proteína.
Esto incluye, por ejemplo, validación de objetivos de fármacos con una molécula conforme a la invención, para contestar a la pregunta de si el desarrollo de un agente capaz de modular la estructura, función o expresión de una molécula objetivo potencial, por ejemplo, un agonista o antagonista de la molécula objetivo tiene el efecto deseado y puede, por ejemplo, ser de uso terapéutico o diagnóstico.
Así, también es una característica de la invención que las moléculas conforme a la invención puedan ser utilizadas para validación de objetivos de fármacos, incluyendo pero no limitadas a estudiar si la modulación de una proteína o de una molécula de ácido nucleico tiene un efecto deseado, incluyendo efectos terapéuticos y utilizar esta información para desarrollar un compuesto, por ejemplo, un compuesto terapéutico capaz de modular la estructura, función o expresión de la molécula, función que fue estudiada previamente con moléculas conforme a la invención.
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Ejemplo 1 Tratamiento de Células mononucleares de sangre periférica con oligonucleótidos antisentido TGF-\beta1 de fosforotioato
\quad
Las células mononucleares humanas de sangre periférica (PBMC) producen factor de crecimiento transformador \beta1 (TGF-\beta1). El TGF-\beta1 producido por estas células regula de manera negativa la proliferación de células inmunes de una forma autóloga. Esta regulación autóloga negativa de la proliferación de células inmunes podría ser invertida con moléculas antisentido TGF-\beta1 conforme a la invención, que lleva a una estimulación de la proliferación de células inmunes. En contraste con las moléculas conforme a la invención, las moléculas antisentido escogidas de manera convencional, incluyendo las publicadas por Hatzfeld et al. (1991) no estimularon la proliferación de células inmunes. Aún más sorprendente es que, varias secuencias, escogidas de manera convencional, incluso redujeron la proliferación de células inmunes.
Se aislaron las Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la sangre venosa de donantes sanos al mezclar con un volumen idéntico de medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1 mM de L-glutamina, seguido de estratificación sobre gradientes de Ficoll-Hypaque (Pharmacia) y centrifugado a 400 g durante 30 min. Se extrajeron los PBMC de la interfaz de plasma-Ficoll y se lavaron en el anterior medio. Se pusieron las células (2 \times 104 en 100 \mul de medio) en placas de microtitración de fondo plano de 96 pocillos (Nunc) en medio completo suplementado con suero. Se activaron las células con 3 \mug/ml de fitohemaglutina y se incubaron bien sin oligodesoxinucleótido (células de control sin tratar) o con 8 \muM de distintos oligodesoxinucleótidos antisentido de fosforotioato, complementario a distintas regiones del ARNm TGF-\beta1 humano durante 4 días. Entonces se tiñeron las células con azul de tripano para determinar la viabilidad de las células y se contaron en una cámara de recuento Neubauer.
Las secuencias de oligonucleótido fueron bien de 33 secuencias conforme a la invención, denominadas las secuencias TGF-\beta1-1 - TGF-\beta1-33 o bien la secuencia TGF-\beta1 antisentido de Hatzfeld et al. (1991), J. Exp. Med. , 174, pp. 925-929 u otras 39 secuencias antisentido escogidas de manera convencional complementarias al ARNm TGF-\beta1 humano, denominadas N1-N39 (véase la figura 3).
Sorprendentemente, las moléculas conforme a la invención fueron mucho más efectivas que las moléculas TGF-\beta1 antisentido que fueron escogidas de manera convencional.
Las Secuencias TGF-\beta1-1 - TGF-\beta1-33 (véase la figura 3) aumentaron la proliferación de linfocitos hasta entre el 135 y el 213% de los controles sin tratar. En contraste, el tratamiento con la secuencia antisentido del documento Hatzfeld et al. redujo la proliferación hasta el 62,8%.
Sorprendentemente, las células tratadas con las secuencias antisentido TGF-\beta1 N1-N39 escogidas de manera convencional no solo no aumentaron la proliferación de linfocitos, sino que incluso varias de estas secuencias revelaron una inhibición pronunciada de proliferación celular de entre el 51,4% y el 77% de los controles (secuencias N1-N14, N20, N26 y N30-N39). Las secuencias antisentido TGF-\beta1 N15-N19, N21-N25, N28 y N29 no mostraron ningún aumento significativo ni una inhibición significativa de la proliferación de células con valores de entre el 94% y el 103%. La secuencia N27 mostró una ligera toxicidad con una reducción en la proliferación celular hasta el 88%.
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La inhibición de la proliferación de células por algunas secuencias TGF-\beta1 sugiere que pueden no ser meramente ineficaces, sino también tóxicas. El análisis de las 26 secuencias N1-N14, N20, N26 y N30-N39 revelaron que 23 de ellas contenían 2 o más motivos de secuencia con tres G consecutivas (más adelante denominadas motivos GGG) o al menos un motivo con 4, 5 o 6 G (motivos GGGG, GGGGG o GGGGGG). El análisis de la secuencia de Hatzfeld et al., que también inhibió la proliferación de PBMC, mostró sorprendentemente que también contiene un GGGGG más un motivo GGG. Se descubrió que las 3 secuencias tóxicas que no contenían ni 2 motivos GGG ni un motivo de 4 o más G consecutivas, es decir, las secuencias N8, N26 y N35 tenían un contenido de bases con 11-13 bases de G por secuencia.
En contraste con las secuencias de Hatzfeld et al., N1-N14, N20, N26 y N30-N39, las secuencias TGF-\beta1-1 - TGF-\beta1-33 mostraron un contenido de G de cómo máximo 6 bases de G, ninguna combinación de dos motivos GGG en una única secuencia y ningún motivo GGGG, GGGGG o GGGGGG. Dado que el ARNm TGF-\beta1 contiene más de 85 regiones objetivo para un motivo GGG antisentido y más de 34 regiones objetivo para un motivo GGGG antisentido, este hallazgo en las secuencias conforme a la invención era muy poco probable estadísticamente.
Se descubrió que las secuencias no efectivas N15-N19, N21-N25, N28 y N29 contenían un contenido de bases distinto tanto de las secuencias tóxicas como efectivas: El contenido de las bases A y T tomados en conjunto (contenido A/T) varió desde el 14,3% hasta el 28,5%. Estas secuencias ni aumentaron ni inhibieron la proliferación de PBMC. Por lo tanto, no parecían ni efectivas ni tóxicas. En contraste a estas secuencias no efectivas con un contenido A/T del 14,3%-28,5%, se descubrió que las secuencias efectivas TGF-\beta1-1 - TGF-\beta1-33 tenían un contenido A/T de entre el 33%-71,40%.
Se descubrió una diferencia adicional entre las secuencias de la invención y dos tercios de las otras secuencias con respecto a un enlace de proteína no específico: Se descubrió que las secuencias del documento de Hatzfeld et al., y N1-N14, N20, N26 y N30-N39 mostraban de manera pronunciada un aumento no específico de enlace de proteínas en comparación con las secuencias de la invención.
En la figura 3 se muestran las secuencias de Hatzfeld et al., (H) y N1-N39 al igual que las secuencias antisentido TGF-\beta1 conformes a la invención.
El descubrimiento de que, mientras que las secuencias TGF-\beta1-1 - TGF-\beta1-33 estimulaban la proliferación de células inmune PBMC, la secuencia de Hatzfeld et al. y las secuencias N1-N39 eran bien no efectivas con poca alteración en la proliferación de PBMC o tenían efectos tóxicos y la proliferación de PBMC inhibido se extendió a secuencias antisentido adicionales tanto de TGF-\beta2 como de otros genes como se detalla en los siguientes ejemplos 2-7.
Las secuencias de los oligonucleótidos relacionados con TGF-\beta1 están listadas en la figura 3 para el propósito de una fácil legibilidad.
Para ciertas aplicaciones, incluyendo, pero no limitadas a la aplicación en la división de células, incluyendo células tumorales, se acopló ácido nucleico o análogos funcionales o estructurales o derivados efectivos de los mismos conforme a la invención a ácido fólico, en uno de los grupos carboxi o en uno de los átomos de nitrógeno del ácido fólico.
Además, para ciertas aplicaciones, el ácido nucleico o los análogos funcionales o estructurales o derivados efectivos de los mismos conforme a la invención están mezclados con y/o acoplados con hormonas, hormonas esteroides como estrógeno, progesterona, corticosteroides, mineralocorticoides, andrógenos, fosfolípidos, péptidos, proteoglicanos,
glicolípidos y derivados de los mismos. Preferiblemente, se da un acoplamiento en R^{2} y/o R^{3} de las figuras 1 y 2.
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Ejemplo 2 Ácidos nucleicos antisentido de p53 (la figura 3 muestra los oligonucleótidos respectivos)
p53 es un gen supresor de tumores que regula de manera negativa la proliferación de células. Ciertas mutaciones en el gen pueden alterar la función de p53 de tal forma que se vuelve un oncogén. Se analizaron los efectos de los oligonucleótidos antisentido p53 en las células que contienen p53 de tipo salvaje y subsiguientemente también el efecto de estas secuencias sobre células con p53 mutado.
En las células con p53 de tipo salvaje los ácidos nucleicos antisentido efectivos llevarán a una regulación a la baja de la proteína p53 de tipo salvaje y de esta manera a un aumento de la proliferación de las células tratadas. Las moléculas conforme a la invención se denominan p53-1 - p53-33. Las secuencias antisentido no efectivas de p53 se denominaron p53-N-1 - p53-N-18. Las secuencias tóxicas, que inhibieron la proliferación en vez de aumentarla como hacen las secuencias antisentido de p53 se denominaron p53-T-1 - p53-T-29.
Se cultivaron fibroblastos humanos normales en un medio RPMI suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FCS) y se colocaron 2500 células/pocillo en placas de microtitración de 96 pocillos. Se añadieron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato con una concentración de 2 \muM después de 2 h.
Se llevaron a cabo dos ensayos para determinar la proliferación celular:
-
Para determinar la incorporación de 3H-timidina, se incubaron las células antes de la recogida con 0,15 \muCi 3H-timidina/pocillo durante 6 h. Se lisaron las células mediante congelación, se pusieron sobre filtros de vidrio y se determinó la cantidad de tritio incorporado por medio de un recuento de destellos en líquido.
-
Para determinar el número de células, se tiñeron las células con azul de tripano y se contaron en una cámara de recuento Neubauer.
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Sorprendentemente, solo el tratamiento de las células con secuencias antisentido conforme a la invención (p-53-1 - p53-33) dio como resultado un aumento en la incorporación de timidina desde entre 3 y 9 veces más.
En contraste, el tratamiento con secuencias no efectivas (p53-N-.1 - p53-N-18) no resultó en alteraciones significativas en la incorporación de timidina.
Además, el tratamiento con secuencias antisentido tóxicas de p53 (p53-T-1 - p53-T-29) dio como resultado una disminución en la proliferación en vez de un aumento.
En resumen, las 33 secuencias antisentido conforme a la invención dieron como resultado una regulación a la baja efectiva del control de crecimiento negativo por p53 y aumentaron la proliferación celular, mientras que las otras 47 secuencias antisentido no tuvieron un efecto significativo sobre la proliferación celular o incluso suprimieron la proliferación celular.
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Ejemplo 3 Ácidos nucleicos antisentido junB (la figura 3 muestra los oligonucleótidos respectivos)
junB y junD, dos genes que codifican factores de transcripción de la familia jun de genes son reguladores negativos de crecimiento celular, como el p53. Se analizaron los efectos de los distintos oligodesoxinucleótidos antisentido junB y junD.
Los ácidos nucleicos antisentido efectivos de junB y junD llevará a una regulación a la baja de las proteínas JunB y JunD, respectivamente, y de esta manera a un aumento de la proliferación de las células tratadas. Las moléculas antisentido conforme a la invención se denominaron JunB-1 - JunB-19 y JunD-1 - JunD-31. Las secuencias antisentido no efectivas de junB se denominaron JunB-N-1 - JunB-N-57. Las secuencias tóxicas, que inhibieron la proliferación en vez de aumentarla se denominaron JunB-T-1 - JunB-T-20 y JunD-T-1 - JunD-T-17.
Se cultivaron fibroblastos humanos normales en un medio RPMI suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FCS) y se colocaron 2500 células/pocillo en placas de microtitración de 96 pocillos. Se añadieron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato con una concentración de 2 \muM después de 2 h.
Se llevaron a cabo dos ensayos para determinar la proliferación celular:
-
Para determinar la incorporación de 3H-timidina, se incubaron las células antes de la recogida con 0,15 \muCi 3H-timidina/pocillo durante 6 h. Se lisaron las células mediante congelación, se pusieron sobre filtros de vidrio y se determinó la cantidad de tritio incorporado por medio del recuento de destellos en líquido.
-
Para determinar el número de células, se tiñeron las células con azul de tripano y se contaron en una cámara de recuento Neubauer.
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Sorprendentemente, de nuevo únicamente el tratamiento de las células con secuencias antisentido conforme a la invención (JunB-1 - JunB-19 y JunD1 - JunD31) dio como resultado un aumento en la incorporación de timidina desde entre 2 y 7 veces más.
En contraste, el tratamiento con secuencias no efectivas (JunB-N-1 - JunB-N-57) no resultó en alteraciones significativas en la incorporación de timidina.
Además, el tratamiento con secuencias antisentido tóxicas de junB o JunD (JunB-T-1 - JunB-T-20 y JunD-T-1 - JunD-T-17) dio como resultado una disminución en la proliferación en vez de un aumento.
En resumen, las 50 secuencias antisentido conforme a la invención dieron como resultado una regulación a la baja efectiva del control de crecimiento negativo por JunB y JunD, mientras que las otras 94 secuencias antisentido no tuvieron un efecto significativo sobre la proliferación celular o incluso eran tóxicas.
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Ejemplo 4
(La figura 3 muestra los oligonucleótidos respectivos)
erbB-2 es una molécula transmembrana con una actividad intracelular de tirosina quinasa que se amplifica y/o se sobreexpresa por células de carcinoma en una variedad de neoplasmas incluyendo cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer esofágico y gástrico, carcinoma de los conductos biliares, cáncer de vejiga, cáncer pancreático y cáncer ovárico.
En varios de estos tumores, se ha demostrado que una amplificación y sobreexpresión del gen c-erbB-2 en el tejido tumoral se correlaciona con un pronóstico clínico malo. Se ha demostrado que la sobreexpresión de p185erbB-2 en carcinoma pulmonar de células no pequeñas imparte resistencia a un número de agentes quimioterapéuticos.
Los ácidos nucleicos antisentido efectivos de erbB-2 llevarán a una regulación a la baja de la proteína erbB-2 y los líneas celulares tumorales de sobreexpresión llevarán a una proliferación celular reducida de las células tratadas. Las moléculas antisentido conforme a la invención se denominan erbB-2-1 - erbB-2-83. Las secuencias antisentido no efectivas de erbB-2 se denominaron erbB-2-N-1 - erbB-2-95.
Se cultivaron células humanas de carcinoma mamario erbB-2 que sobreexpresaban SK-Br-3 en un medio RPMI suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FCS) y se colocaron 2500 células/pocillo en placas de microtitración de 96 pocillos. Se añadieron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato con una concentración de 2 \muM después de 2 h.
Para determinar la expresión de la proteína erbB-2 se recogieron células con un raspador celular y se sometieron a una determinación de proteínas ELISA.
Únicamente el tratamiento de las células con secuencias antisentido conforme a la invención (erbB-2-1 - erbB-2-83) dio como resultado una reducción significativa en la expresión de la proteína erb-2 del 40-95%.
En contraste, el tratamiento con secuencias no efectivas (erbB-2-N-1 - erbB-2-N-95) no resultó en alteraciones significativas en la expresión de la proteína erbB-2.
Para determinar el número de células, se tiñeron las células con azul de tripano y se contaron en una cámara de recuento Neubauer.
Únicamente el tratamiento de las células con las secuencias antisentido conforme a la invención (erbB-2-1 - erbB-2-83) dio como resultado una reducción del número de células del 35-70%.
En contraste, el tratamiento con secuencias no efectivas (erbB-2-N-1 - erbB-2-N-95) no dio como resultado alteraciones significativas en la proliferación celular.
Las secuencias antisentido erbB-2 se muestran en las figuras 3-8 a 3-11.
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Ejemplo 5
(La figura 3 muestra los oligonucleótidos respectivos)
El gen c-fos codifica un factor de transcripción de genes de tipo temprano inmediato. Los ácidos nucleicos antisentido efectivos de c-fos llevará a una regulación a la baja de la proteína c-Fos.
Las moléculas antisentido conforme a la invención se denominan c-fos-1 - c-fos-31. Las secuencias antisentido no efectivas de c-fos se denominaron c-fos-N-1 - c-fos-N-12.
Se cultivaron fibroblastos humanos en un medio RPMI suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FCS) y se colocaron 2500 células/pocillo en placas de microtitración de 96 pocillos. Se añadieron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato con una concentración de 2 \muM después de 2 h.
La expresión de la proteína c-Fos se determinó por medio de ELISA en lisatos celulares.
Únicamente el tratamiento de las células con las secuencias antisentido conforme a la invención (c-fos-1 - c-fos-31) dio como resultado una reducción significativa en la expresión de la proteína c-fos del 45-95%.
En contraste, el tratamiento con secuencias no efectivas (c-fos-N-1 - c-fos-N-12) no dio como resultado alteraciones significativas en la expresión de la proteína c-Fos.
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Ejemplo 6
(La figura 3 muestra los oligonucleótidos respectivos)
TGF-\beta2, como TGF-\beta1 es un miembro de la familia del factor de crecimiento transformador-\beta de citoquinas.
La sobreexpresión de TGF-\beta1 y TGF-\beta2 está vinculada a una progresión maligna, la inmunosupresión y la evitación de la vigilancia de los tumores por parte del sistema inmune.
Los ácidos nucleicos antisentido efectivos de TGF-\beta2 llevará a una regulación a la baja del factor de crecimiento TGF-\beta2.
Las moléculas antisentido conforme a la invención se denominan TGF-\beta2-1 - TGF-\beta2-38. Las secuencias antisentido no efectivas se denominaron TGF-\beta2-N-1 - TGF-\beta2-N-40.
Se cultivaron células tumorales que sobreexpresaban TGF-\beta2 en un medio RPMI suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FCS) y se colocaron 2500 células/pocillo en placas de microtitración de 96 pocillos. Se añadieron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato con una concentración de 2 \muM después de 2 h.
La expresión de proteína de TGF-\beta2 se determinó por medio de ELISA, tanto en lisatos celulares como en sobrenadantes.
Únicamente el tratamiento de las células con las secuencias antisentido conforme a la invención (TGF-\beta2-1 - TGF-\beta2-38) dio como resultado una reducción significativa en la expresión de proteína de TGF-\beta2 del 35-80%.
En contraste, el tratamiento con secuencias no efectivas (TGF-\beta2-N-1 - TGF-\beta2-N-40) no dio como resultado alteraciones significativas en la expresión de proteína de TGF-\beta2.
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Ejemplo 7
(La figura 3 muestra los oligonucleótidos respectivos)
Ácidos nucleicos antisentido rb
rb es un gen supresor de tumores que regula negativamente la proliferación celular. Se analizaron los efectos de los oligodesoxinucleótidos antisentido rb sobre células que contienen rb de tipo salvaje.
En las células con rb de tipo salvaje los ácidos nucleicos antisentido efectivos llevará a una regulación a la baja de la proteína rb de tipo salvaje y de esta manera a un aumento de la proliferación de las células tratadas. Las moléculas conforme a la invención se denominan rb-1 - rb-45. Las secuencias antisentido no efectivas de rb se denominaron -1 - rb-N-168. Las secuencias tóxicas, que inhibieron la proliferación en vez de aumentarla como hacen las secuencias antisentido efectivas de rb se denominaron rb-T-1 - rb-T-16.
Se cultivaron fibroblastos humanos normales en un medio RPMI suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FCS) y se colocaron 2500 células/pocillo en placas de microtitración de 96 pocillos. Se añadieron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato con una concentración de 2 \muM después de 2 h.
Se llevaron a cabo dos ensayos para determinar la proliferación celular:
-
Para determinar la incorporación de 3H-timidina, se incubaron las células antes de la recogida con 0,15 \muCi 3H-timidina/pocillo durante 6 h. Se lisaron las células mediante congelación, se pusieron sobre filtros de vidrio y se determinó la cantidad de tritio incorporado por medio del recuento de destellos en líquido.
-
Para determinar el número de células, se tiñeron las células con azul de tripano y se contaron en una cámara de recuento Neubauer.
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Sorprendentemente, únicamente el tratamiento de las células con secuencias antisentido conforme a la invención (rb-1 - rb-45) dio como resultado un aumento en la incorporación de timidina desde entre 2 y 6 veces más.
En contraste, el tratamiento con secuencias no efectivas (rb-N-1 - rb-N-168) no resultó en alteraciones significativas en la incorporación de timidina.
Además, el tratamiento con secuencias antisentido tóxicas de rb (rb-T-1 - rb-T-16) dio como resultado una disminución en la proliferación en vez de un aumento.
En resumen, las 45 secuencias antisentido conforme a la invención dieron como resultado una regulación a la baja efectiva del control de crecimiento negativo por rb, mientras que las otras 184 secuencias antisentido no tuvieron un efecto significativo sobre la proliferación celular o incluso suprimió la proliferación celular.
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Ejemplo 8
Se sintetizaron las secuencias de oligonucleótidos conforme a la invención con diversas modificaciones distintas de la cadena principal. Los resultados ejemplares se dan a continuación.
Para la secuencia
erbB-2-42: CATCTGGAAACTTCCAGATG
se probaron las siguientes modificaciones químicas en células de carcinoma que sobreexpresaban erbB-2:
1. S-ODN erbB-2-42 (es decir, todos los enlaces de la cadena principal eran modificaciones de tioato).
6
2. Me-ODN/S-ODN/Me-ODN erbB-2-42 (es decir, los enlaces en el extremo 5' y 3' eran enlaces de metilfosfonato mientras que los enlaces en el medio eran modificaciones de tioato como sigue):
7
o
8
o
9
o
10 
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3. Me-ODN/S-ODN erbB-2-42 (es decir, enlaces en el extremo 5' eran enlaces de metilfosfonato mientras que los enlaces en el 3' eran modificaciones de tioato como sigue):
11
4. S-ODN/Me-ODN erbB-2-42 (es decir, los enlaces en el extremo 5' eran enlaces de metilfosfonato mientras que los enlaces en el 3' eran modificaciones de tioato como sigue):
12 
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5. Me-ODN erbB-2-42 (es decir, los enlaces son enlaces de metilfosfonato):
13 
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6. pN/S-ODN/pN erbB-2-42 (es decir, los enlaces en el extremo 5' y 3' eran enlaces de fosforamidato mientras que los enlaces en el medio eran modificaciones de tioato como sigue):
14
o
15
o
16
o
17
en las que
pS representa la sustitución de uno de los átomos de oxígeno no puenteantes del enlace de la cadena principal con un átomo de azufre, mientras que pMe representa la sustitución de uno de los átomos de oxígeno no puenteantes del enlace de la cadena principal con un grupo metilo.
pN representa un enlace de fosforamidato N3' -> P5'.
También, una combinación de enlaces (N-pS-N-pO-N-pO-N)_{n}-[pS-N]_{m} en la que n = 1-10 y m = 0-6, en la que N representa cualquier nucleótido o análogo estructural o funcional o derivado del mismo. Mientras que la modificación Me-ODN de la cadena principal redujo fuertemente la actividad de erbB-2 de la secuencia de erbB-2 hasta menos del 20%, las modificaciones 1.-4. de la cadena principal tenían una fuerte capacidad inhibidora de erbB-2 con una inhibición de la expresión de la proteína de erbB-2 de entre el 78% y el 89% a una concentración de 2\muM 48 h después del comienzo del tratamiento de las células de carcinoma que sobreexpresan. Aunque el S-ODN puro tenía la capacidad de supresión más elevada con un 89%, el Me-ODN/S-ODN/Me-ODN al igual que el Me-ODN/S-ODN y el S-ODN/Me-ODN y el pN/S-ODN/pN, mostraron un enlace reducido a proteínas y cuando fueron probados para una activación complementaria, mostraron una activación complementaria reducida. Estas características son ventajosas para ciertas aplicaciones, por ejemplo aplicación sistémica intravenosa in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9
Se obtuvieron efectos similares cuando se probaron otras secuencias conforme a la invención con las anteriores modificaciones de la cadena principal.
La inhibición más elevada de la expresión del gen TGF-beta-1 con las secuencias efectivas para TGF-beta-1 conforme a la invención con S-ODN y las modificaciones Me-ODN/S-ODN/Me-ODN de la cadena principal y la más baja con la modificación Me-ODN, mientras que el enlace a proteínas y la activación complementaria se redujeron en las secuencias que contenían enlaces de Me-ODN.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10
Sorprendentemente, la efectividad de las secuencias conforme a la invención se mejoró significativamente en diversos tipos de célula al acoplar ácidos nucleicos conforme a la invención con ácido fólico:
\quad
La capacidad inhibidora de erbB-2 que era relativamente baja después de 24 h en comparación con 48 h con una inhibición de la síntesis de proteína erbB-2 del 24-37% se aumentó de manera pronunciada al acoplar secuencias conforme a la invención con ácido fólico hasta el 48-62% con una concentración de 2 \muM 24 h después del comienzo del tratamiento de las células de carcinoma que se sobreexpresaban.
Se obtuvieron efectos similares al acoplar secuencias conforme a la invención con derivados del ácido fólico incluyendo aminopterina y ametopterina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 11
Sorprendentemente, la efectividad de las secuencias conforme a la invención mejoró mucho al acoplar oligonucleótidos conforme a la invención a cortisol:
\quad
La captación celular y la capacidad inhibidora de las secuencias conforme a la invención, incluyendo las secuencias para TGF-beta-1, TGF-beta-2, c-fos, p53, erbB-2, rb, junB, junD, c-jun, MIP-1 alfa, JAK-2, bcl-2 y aumentaron de manera pronunciada al acoplar cortisol con los grupos hidroxilo 3' o 5' de las secuencias de oligonucleótidos conforme a la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 12
La efectividad de las secuencias conforme a la invención también mejoró mucho en diversos tipos de célula al acoplar ácidos nucleicos conforme a la invención a otras hormonas esteroides y sus derivados o mezclándolos con las mismas, incluyendo estrógenos, anti-estrógenos, prednisona, prednisolona, andrógenos, anti-andrógenos, gestágenos como la progesterona al igual que los péptidos, proteoglicanos, glicolípidos, fosfolípidos y derivados de los mismos.
Los andrógenos, en particular la androstendiona y la testosterona, al igual que los anti-andrógenos, incluyendo ciproteronacetato, flutamida, anandrona, enlazados con los ácidos nucleicos aumentó la efectividad de las moléculas en diversos tipos de células incluyendo células prostáticas de carcinoma.
Los estrógenos, anti-estrógenos y sus derivados, incluyendo fosfestrol, toremifeno, etinilestradiol, dietilestilbestrol y los derivados de estradiol, benzoato de estradiol, valerinato de estradiol y undecilato de estradiol, al igual que progesterona y sus derivados, incluyendo medroxiprogesteronacetato y megestrolacetato enlazados a los oligonucleótidos aumentaron mucho la actividad de las moléculas conforme a la invención en diversos tipos de células incluyendo las células mamarias de carcinoma.

Claims (6)

1. Un procedimiento para la preparación de un oligonucleótido antisentido o derivado del mismo que comprende los pasos de
-
seleccionar un ácido nucleico objetivo, dilucidando su secuencia si fuese necesario
-
sintetizar el oligonucleótido antisentido a dicha secuencia objetivo de una forma conocida per se en la que el oligonucleótido antisentido tiene las siguientes características
-
el oligonucleótido comprende al menos 8 residuos,
-
el oligonucleótido comprende como máximo doce elementos, que son capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con bases de citosina,
-
el oligonucleótido no contiene cuatro o más elementos consecutivos, capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con cuatro bases consecutivas de citosina (CCCC) en la molécula objetivo, o de manera alternativa cuatro o más consecutivos de GGGG,
-
el oligonucleótido tampoco contiene 2 o más series de tres elementos consecutivos, capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con tres bases consecutivas de citosina (CCC) en la molécula objetivo, o de manera alternativa 2 o más series de tres elementos consecutivos de GGG, y
-
la relación entre residuos que forman dos enlaces de hidrógeno por residuo (2H-enlace-R) con la molécula objetivo y aquellos residuos que forman tres enlaces de hidrógeno por residuo (3H-enlace-R) con la molécula objetivo, está regida por las siguientes especificaciones:
18
2. El procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido generado cumple la siguiente especificación:
19
3. El procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que los oligonucleótidos generados están modificados para una mayor resistencia de la nucleasa que los óligo o polinucleótidos que se dan de forma natural.
4. El procedimiento conforme a la reivindicación 3, en el que los oligonucleótidos generados son modificados en las bases, los azúcares o los enlaces de los oligonucleótidos, preferiblemente con enlaces internucleótidos de fosforotioato (S-ODN), y/o enlaces internucleótidos de metilfosfonato, enlaces de fosforamidato N'3 -> P5', enlaces de péptidos o modificaciones 2'-metoxietoxi del azúcar o modificaciones de las bases.
5. El procedimiento conforme a la reivindicación 3 y/o 4, en el que el oligonucleótido tiene al menos dos distintos tipos de modificaciones.
6. El procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se hacen reaccionar los oligonucleótidos con ácido fólico, hormonas como hormonas esteroides o corticosteroides o derivados de los mismos al enlazar los oligonucleótidos de manera covalente a, o mezclándolos con, ácido fólico, hormonas como hormonas esteroides o corticosteroides, péptidos, proteoglicanos, glicolípidos o fosfolípidos.
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