ES2323252T3 - Procedimiento de preparacion de un oligonucleotido antisentido. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la preparación de un oligonucleótido antisentido o derivado del mismo que comprende los pasos de - seleccionar un ácido nucleico objetivo, dilucidando su secuencia si fuese necesario - sintetizar el oligonucleótido antisentido a dicha secuencia objetivo de una forma conocida per se en la que el oligonucleótido antisentido tiene las siguientes características - el oligonucleótido comprende al menos 8 residuos, - el oligonucleótido comprende como máximo doce elementos, que son capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con bases de citosina, - el oligonucleótido no contiene cuatro o más elementos consecutivos, capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con cuatro bases consecutivas de citosina (CCCC) en la molécula objetivo, o de manera alternativa cuatro o más consecutivos de GGGG, - el oligonucleótido tampoco contiene 2 o más series de tres elementos consecutivos, capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con tres bases consecutivas de citosina (CCC) en la molécula objetivo, o de manera alternativa 2 o más series de tres elementos consecutivos de GGG, y - la relación entre residuos que forman dos enlaces de hidrógeno por residuo (2H-enlace-R) con la molécula objetivo y aquellos residuos que forman tres enlaces de hidrógeno por residuo (3H-enlace-R) con la molécula objetivo, está regida por las siguientes especificaciones:
Description
Procedimiento de preparación de un
oligonucleótido antisentido.
La presente invención está relacionada con un
procedimiento para la preparación de oligonucleótidos antisentido y
con un oligonucleótido o análogos funcionales o estructurales o
derivados efectivos de los mismos, que forman enlaces de hidrógeno
con ácidos desoxirribonucleicos (ADN) y/o ácidos ribonucleicos (ARN)
o derivados de los mismos incluyendo, pero sin estar limitados a
ello, la formación de enlaces de hidrógeno con las bases adenina
(A), citosina (C), guanina (G), uracilo (U) o timidina (T)
contenidas en dichas moléculas o formando enlaces de hidrógeno con
residuos de una proteína particular, como una molécula capaz de
alterar la estructura o función de expresión, de un gen, una
molécula o una proteína de ARN o alterar el nivel de actividad de un
gen, una molécula o una proteína de ARN. Además, la presente
invención está relacionada con dicho ácido nucleico o análogos
funcionales o estructurales o derivados efectivos de los mismos,
acoplados o mezclados con ácido fólico, hormonas, hormonas
esteroides como estrógeno, progesterona, corticosteroides,
mineralocorticoides, andrógenos, péptidos, proteoglicanos,
fosfolípidos, glicolípidos y derivados de los mismos.
Además, la invención está relacionada con el uso
de dichos ácidos nucleicos o análogos funcionales o estructurales o
derivados efectivos de los mismos, para analizar las propiedades
funcionales de un gen en particular, ARN, o proteína al alterar su
actividad, estructura, función o al alterar sus niveles de
expresión.
Además, la invención está relacionada con ácidos
nucleicos antisentido, capaces de modular la expresión o actividad
funcional de las proteínas que regulan el crecimiento celular que
lleva al aumento, inhibición o modulación del crecimiento celular o
a la proliferación celular y/o la expansión de células primarias o
células madre, por ejemplo, en cultivo o en el organismo vivo.
Además, la invención está relacionada con una
composición farmacéutica que comprende dichos ácidos nucleicos o
análogos funcionales o estructurales o derivados efectivos de los
mismos, hibridándose con un área del ARN mensajero (ARNm) o el ADN
de un gen objetivo o enlazándose a una proteína particular, al igual
que el uso de dichos ácidos nucleicos, análogos estructurales y
derivados de los mismos para la fabricación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de enfermedades en las que la
alteración de la función de la estructura, actividad o expresión de
un gen objetivo particular, un ARN objetivo particular o la
actividad particular de las proteínas objetivo lleva a un beneficio
terapéutico relacionado con el efecto del ácido nucleico o derivado
del mismo.
La modulación de la expresión de los genes, las
moléculas de ARN o las proteínas o de sus niveles de actividad con
ácidos nucleicos o análogos funcionales o estructurales o derivados
efectivos de los mismos es un medio potente para estudiar la función
de las moléculas respectivas. Por ejemplo, la modulación, por
ejemplo el silenciamiento génico o el aumento de la expresión de una
proteína particular puede llevar a la identificación de su papel
tanto fisiológico como patofisiológico en células cultivadas al
igual que en organismos vivos in vivo.
Además, la expresión aberrante o la
sobreexpresión de los genes, moléculas o proteínas de ARN, la
expresión de ADN, ARN o proteínas foráneas, por ejemplo, derivadas
de organismos infecciosos o la expresión de ADN, ARN y proteínas
mutadas se encuentra en una variedad de enfermedades. La regulación
a la baja de la expresión o de la actividad de dicho ADN, ARN y/o
proteínas puede llevar a una inhibición de los procesos patológicos
o a la inversión de los mismos en los que la expresión de un ADN,
ARN y/o proteína particular desempeña un papel. Sin embargo, los
ácidos nucleicos o derivados de los mismos utilizados para la
regulación a la baja de la expresión del ADN, ARN y/o de las
proteínas son a menudo ineficaces y/o tóxicos a las células o los
organismos tratados con dichas
moléculas.
moléculas.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para diseñar y preparar
oligonucleótidos o derivados de los mismos que evitan los
inconvenientes de la técnica anterior, y proporcionar un
procedimiento fiable para la preparación de oligonucleótidos que
tienen una mayor efectividad y/o una toxicidad reducida y/o efectos
no selectivos reducidos.
El objeto se logra por medio de un procedimiento
que tiene las características de la reivindicación 1. Las
realizaciones preferidas del procedimiento de la invención son
aquellas conforme a las reivindicaciones 2 a 7.
El procedimiento de la invención comprende los
pasos
- -
- de seleccionar un ácido nucleico objetivo, dilucidando su secuencia si fuese necesario
- -
- generar el oligonucleótido antisentido con la condición de que
- -
- el oligonucleótido comprende al menos 8 residuos,
- -
- el oligonucleótido comprende como mucho doce elementos, que son capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con bases de citosina,
\newpage
- -
- el oligonucleótido no contiene cuatro ni más elementos consecutivos, capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con cuatro bases de citosina (CCCC) dentro de la molécula objetivo o, de manera alternativa, cuatro o más elementos consecutivos de GGGG,
- -
- el oligonucleótido tampoco contiene 2 o más series de tres elementos consecutivos, capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con tres bases consecutivas de citosina (CCC) dentro de la molécula objetivo, o de manera alternativa, 2 o más series de tres elementos consecutivos de GGG, y
- -
- formando la relación entre residuos dos enlaces de hidrógeno por residuo (2H-enlace-R) con la molécula objetivo y formando esos residuos tres enlaces de hidrógeno por residuo (3H-enlace-R) con la molécula objetivo, está regida por las siguientes especificaciones:
- -
- y sintetizando el oligonucleótido generado de esta manera de forma conocida per se.
\vskip1.000000\baselineskip
El oligonucleótido antisentido generado
comprende al menos 8 residuos para tener una interacción suficiente
con la molécula objetivo y tiene preferiblemente hasta 30, más
preferiblemente hasta 24 y más preferiblemente aún hasta 18
residuos. Se prefiere una menor longitud de cadena sobre las mayores
para aumentar la especificidad y/o reducir los efectos no
específicos.
El oligonucleótido comprende como mucho 12
elementos que son capaces de formar 3 enlaces de hidrógeno cada uno
con bases de citosina. En el caso de generar un oligonucleótido, un
elemento está representado por un residuo; de esta manera, un
nucleótido del oligonucleótido. En los casos de generar un derivado
un elemento se considera como una parte de la molécula capaz de
formar enlaces de hidrógeno. Se prefiere que el oligonucleótido
comprenda como máximo 10 elementos y se prefiere más que tenga como
máximo 8 elementos que son capaces de formar 3 enlaces de hidrógeno
cada uno con bases de citosina.
El oligonucleótido antisentido generado
preferiblemente no contiene 4 o más bases consecutivas de guanina y
no contiene 2 o más series de 3 bases consecutivas de guanina.
Preferiblemente, la relación entre residuos que
forman 2 enlaces de hidrógeno por residuo
(2H-enlace-R) con su molécula
objetivo y los residuos que forman 3 enlaces de hidrógeno por
residuo (3H-enlace-R):
se encuentra en el rango mayor que
0,33 y menor que 0,86, más preferiblemente menor que 0,79 y aún más
preferiblemente menor que
0,72.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización los oligonucleótidos
generados por el procedimiento de la invención están modificados
para una mayor resistencia de la nucleasa que los nucleótidos que se
dan naturalmente. Se conocen en la técnica los procedimientos para
sintetizar oligonucleótidos y derivados de los mismos, véase por
ejemplo "Oligonucleotides and Analogues", F. Eckstein (Ed.),
1991, IRL Press Oxford o "Protocols for Oligonucleotides and
Analogs, Synthesis and Properties", Sudhir Agrawal (Ed.), 1993,
Humana Press, Totowa, Nueva Jersey.
Los oligonucleótidos de la invención también
contienen residuos de ARN y ADN en sus cadenas.
Se pueden llevar a cabo modificaciones en las
bases, los azúcares o los enlaces de los nucleótidos.
Preferiblemente, las modificaciones son enlaces internucleótidos de
fosforotioato (S-ODN), y/o enlaces internucleótidos
de metilfosfato, enlaces de fosforamidato N'3 -> P'5, enlaces de
péptidos o modificaciones 2'-metoxietoxi de la mitad
de azúcar o modificaciones de las bases. En una realización
preferida el nucleótido tiene al menos dos tipos distintos de
modificaciones y más preferiblemente al menos dos tipos distintos de
enlaces internucleótidos. En otra realización preferida, los
oligonucleótidos están enlazados o mezclados con ácido fólico,
hormonas como hormonas esteroides o corticosteroides, péptidos,
proteoglicanos, glicolípidos, fosfolípidos o derivados de los
mismos.
Sorprendentemente las moléculas, que se pueden
obtener conforme al procedimiento de la invención podían reducir
fuertemente o evitar la toxicidad y/o los efectos no específicos de
dichas moléculas y/o tenían una actividad significativamente mayor
que las secuencias seleccionadas de otra manera. Preferiblemente,
las moléculas conforme a la invención tienen las siguientes
características: no contienen cuatro o más residuos consecutivos de
guanosina (N_{a}GGGGN_{b}) o de inosina (N_{a}IIIIN_{b}) y
el oligonucleótido no contiene dos o más series de tres o más
residuos de guanosina (N_{a}GGGN_{c}GGGN_{b}) y no contiene
dos o más series de tres o más residuos consecutivos de inosina
(N_{a}IIIN_{c}IIIN_{b}), en las que N_{a}, N_{b}, N_{c}
representan oligonucleótidos independientemente de cualquier
secuencia que tiene de 0 a 20 residuos.
En una realización preferida, la molécula
contiene un mínimo de 10 residuos capaces de formar ya sean dos o
tres enlaces de hidrógeno por residuo. Además, la molécula contiene
un máximo de 24 residuos consecutivos enlazados por enlaces de
fosforotioato capaces de formar ya sean dos o tres enlaces de
hidrógeno por residuo. En las moléculas conforme a la invención que
contienen más de 18 residuos, los enlaces adicionales consisten
preferiblemente de enlaces de metilfosfonato o enlaces de
fosfodiéster.
En la figura 1 se muestran las estructuras
químicas de los oligodesoxirribonucleótidos antisentido.
En la figura 2 se muestran las estructuras
químicas de los oligorribonucleótidos antisentido. Se debe entender
el oligonucleótido como un detalle de una cadena mayor de
nucleótidos.
Por supuesto, los oligonucleótidos pueden estar
compuestos de elementos de cualquiera de las figuras.
En las figuras 1 y 2, la letra B representa una
base orgánica como adenina (A), guanina (G), citosina (C), inosina
(I), uracilo (U) y timina (T) que están acopladas a la
desoxirribosa. Los enlaces entre los nucleótidos son enlaces de
fosfodiéster como en el ADN que se da naturalmente o enlaces que
separan los nucleótidos de forma que se permita la hibridación con
su ácido nucleico objetivo o el enlace a una proteína para regular
su actividad, como por ejemplo, enlaces de fosforotioato, enlaces de
metilfosfonato, enlaces de fosforamidato o enlaces de péptidos.
R_{2} y R_{3} representan residuos
adicionales del oligonucleótido o derivado.
R_{4} representa OH o una modificación como un
derivado de 2'-metoxi etoxi.
Las modificaciones del enlace de fosfodiéster,
mostrado en las figuras 1 y 2, puede estar seleccionado, pero sin
estar limitado a ello, de entre:
1. Oligodesoxirribonucleótidos u
oligorribonucleótidos sustituidos por
- 1.1 R1 = O
- 1.2 R1 = S
- 1.3 R1 = F
- 1.4 R1 = CH_{3}
- 1.5 R1 = OEt
\vskip1.000000\baselineskip
2. Oligodesoxirribonucleótidos en los que R1
varía en los fosfatos internucleótidos en un oligonucleótido
en la que la letra p representa el
enlace de fosfodiéster o de fosforamidato, modificado mediante el
acoplamiento de un R1a, R1b o R1c o para un enlace peptídico, o para
enlaces que separan los nucleótidos de tal forma que se permita la
hibridación con su ácido nucleico objetivo o el enlace con una
proteína para regular su actividad, estructura, función o nivel de
expresión.
en el que la letra B = cualquier
desoxirribonucleótido o ribonucleótido, dependiendo de la secuencia
de genes conforme a la invención.
n, m, x, y = números enteros
0-20.
\newpage
La longitud máxima preferida del número total de
bases es 30.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, el oligonucleótido comprende un
mínimo de 10 elementos y un máximo de 24 elementos capaces de formar
ya sean 2 o 3 enlaces de hidrógeno por elemento. Los
oligonucleótidos de la invención pueden tener modificaciones en la
base, el azúcar o la mitad de fosfato. Las modificaciones preferidas
son enlaces internucleótidos de fosforotioato
(S-ODN), y/o enlaces internucleótidos de
metilfosfonato, enlaces de fosforamidato N'3 -> P5', enlaces de
péptidos o modificaciones de 2'-metoxietoxi del
azúcar o modificaciones de las bases. En una realización muy
preferida los oligonucleótidos antisentido comprenden las secuencias
41 a 73, 74 a 106, 154 a 172, 173 a 203, 298 a 380, 476 a 506, 519 a
556 y 597 a 641 de la figura 3 y 1273-1764 de la
figura 5. Un aspecto adicional de la invención es el uso de los
oligonucleótidos de la invención para la inhibición de los genes
p53, rb, junD, junB, TGF-\beta1,
TGF-\beta2 para influenciar la proliferación celular, en particular de los cultivos celulares primarios como células de hígado, células de riñón, osteoclastos, osteoblastos y/o queratinocitos y/o células de linaje sanguíneo, como células madre de la médula ósea, y/o células progenitoras de células rojas y blancas de sangre y/o células madre de
órganos.
TGF-\beta2 para influenciar la proliferación celular, en particular de los cultivos celulares primarios como células de hígado, células de riñón, osteoclastos, osteoblastos y/o queratinocitos y/o células de linaje sanguíneo, como células madre de la médula ósea, y/o células progenitoras de células rojas y blancas de sangre y/o células madre de
órganos.
Las Secuencias 41-73 y/o
74-106 y/o 154-203 y/o
519-556 y/o 597-641 y/o
1273-1277 y/o 1481-1490 y/o
1532-1549 y/o 1656 son útiles para el tratamiento
y/o la prevención de trastornos inmunosupresores incluyendo, pero no
limitados a la inmunosupresión en enfermedades neoplásticas
-incluyendo gliomas y otros tumores cerebrales, sarcomas, carcinomas
y linfomas- y/o inmunosupresión como un efecto secundario de
fármacos, incluyendo, pero no limitados a efectos secundarios de
agentes citotóxicos y/o inmunosupresión en pacientes con SIDA.
En una realización adicional de la invención,
estas secuencias también son útiles para el tratamiento y/o la
prevención de hipoproliferación de células normales, incluyendo,
pero no limitadas a células inmunes, células madre de la médula
ósea, células endoteliales, células madre de órganos y células
proliferantes del intestino.
Las Secuencias 41-73 y/o
74-106 y/o 298-380 y/o
476-506 y/o 519-556 y/o
1273-1480 y/o 1596-1614 y/o
1657-1658 y/o 1690 y/o 1696-1712 y/o
1751 y/o 1753 y/o 1757 son útiles para el tratamiento o la
prevención de trastornos hiperproliferativos, incluyendo pero no
limitados a tumores cerebrales, sarcomas, carcinomas y linfomas,
restenosis, hiperplasia, fibrosis pulmonar, angiogénesis y
soriasis.
Las Secuencias 1278-1480 y/o
1491-1531 y/o 1582-1592 y/o
1615-1655 y/o 1691-1694 y/o
1697-1750 y/o 1759-1764 son útiles
para el tratamiento y/o prevención de enfermedades caracterizadas
por hiperfunción del sistema inmune y/o de trastornos inflamatorios
y/o trastornos autoinmunes, incluyendo, pero no limitados a asma
(siendo aplicadas moléculas conforme a la invención por inhalación
y/o vías parenterales y/u oralmente), esclerosis múltiple,
trastornos del intestino, incluyendo yeyunitis, ileítis y/o colitis,
al igual que trastornos inflamatorios caracterizados por la
hiperproliferación y/o hiperfunción de las células de linaje
esinófilo y/o glomerulonefritis y/o rechazo de trasplantes.
Las Secuencias 476-506 y/o
1550-1581 y/o 1582-1595 y/o
1658-1689 y/o 1691-1694 y/o
1713-1752 son útiles para el tratamiento y/o
prevención de enfermedades asociadas con la degeneración celular,
incluyendo, pero no limitadas a la neurodegeneración, por ejemplo,
enfermedad de Alzheimer, Parkinson, trastornos isquémicos,
incluyendo isquemia de miocardio y/o isquemia del sistema nervioso,
incluyendo apoplejía.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un medicamento que comprende un oligonucleótido conforme a la
invención junto con aditivos. Los oligonucleótidos de la invención
se pueden utilizar para la preparación de un medicamento para la
prevención o el tratamiento de neoplasma, hipoproliferación,
hiperproliferación, enfermedades degenerativas, enfermedades
neurodegenerativas, isquemia, trastornos del sistema inmune y/o
enfermedades infecciosas y se pueden utilizar para el análisis de la
función de los genes o validación de objetivos de fármacos.
Se pueden utilizar las moléculas conforme a la
invención para estudiar la función de las moléculas objetivo y sus
transcripciones codificadas y/o productos de traslación, incluyendo
moléculas y proteínas de ARN. Se pueden utilizar regulaciones a la
baja de una proteína o de una molécula de ácido nucleico que utiliza
moléculas conforme a la invención para estudiar la función de la
molécula. También es una característica de la invención que las
moléculas conforme a la invención puedan ser utilizadas para
estudiar si la modulación del producto tiene un efecto deseado,
incluyendo efectos terapéuticos y utilizar esta información para
desarrollar una molécula distinta, para modular la función de la
proteína.
Esto incluye, por ejemplo, validación de
objetivos de fármacos con una molécula conforme a la invención, para
contestar a la pregunta de si el desarrollo de un agente capaz de
modular la estructura, función o expresión de una molécula objetivo
potencial, por ejemplo, un agonista o antagonista de la molécula
objetivo tiene el efecto deseado y puede, por ejemplo, ser de uso
terapéutico o diagnóstico.
Así, también es una característica de la
invención que las moléculas conforme a la invención puedan ser
utilizadas para validación de objetivos de fármacos, incluyendo pero
no limitadas a estudiar si la modulación de una proteína o de una
molécula de ácido nucleico tiene un efecto deseado, incluyendo
efectos terapéuticos y utilizar esta información para desarrollar un
compuesto, por ejemplo, un compuesto terapéutico capaz de modular la
estructura, función o expresión de la molécula, función que fue
estudiada previamente con moléculas conforme a la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Las células mononucleares humanas de sangre periférica (PBMC) producen factor de crecimiento transformador \beta1 (TGF-\beta1). El TGF-\beta1 producido por estas células regula de manera negativa la proliferación de células inmunes de una forma autóloga. Esta regulación autóloga negativa de la proliferación de células inmunes podría ser invertida con moléculas antisentido TGF-\beta1 conforme a la invención, que lleva a una estimulación de la proliferación de células inmunes. En contraste con las moléculas conforme a la invención, las moléculas antisentido escogidas de manera convencional, incluyendo las publicadas por Hatzfeld et al. (1991) no estimularon la proliferación de células inmunes. Aún más sorprendente es que, varias secuencias, escogidas de manera convencional, incluso redujeron la proliferación de células inmunes.
Se aislaron las Células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) de la sangre venosa de donantes sanos al mezclar
con un volumen idéntico de medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con
10% de suero fetal bovino y 1 mM de L-glutamina,
seguido de estratificación sobre gradientes de
Ficoll-Hypaque (Pharmacia) y centrifugado a 400 g
durante 30 min. Se extrajeron los PBMC de la interfaz de
plasma-Ficoll y se lavaron en el anterior medio. Se
pusieron las células (2 \times 104 en 100 \mul de medio) en
placas de microtitración de fondo plano de 96 pocillos (Nunc) en
medio completo suplementado con suero. Se activaron las células con
3 \mug/ml de fitohemaglutina y se incubaron bien sin
oligodesoxinucleótido (células de control sin tratar) o con 8 \muM
de distintos oligodesoxinucleótidos antisentido de fosforotioato,
complementario a distintas regiones del ARNm
TGF-\beta1 humano durante 4 días. Entonces se
tiñeron las células con azul de tripano para determinar la
viabilidad de las células y se contaron en una cámara de recuento
Neubauer.
Las secuencias de oligonucleótido fueron bien de
33 secuencias conforme a la invención, denominadas las secuencias
TGF-\beta1-1 -
TGF-\beta1-33 o bien la secuencia
TGF-\beta1 antisentido de Hatzfeld et al.
(1991), J. Exp. Med. , 174, pp. 925-929 u otras 39
secuencias antisentido escogidas de manera convencional
complementarias al ARNm TGF-\beta1 humano,
denominadas N1-N39 (véase la figura 3).
Sorprendentemente, las moléculas conforme a la
invención fueron mucho más efectivas que las moléculas
TGF-\beta1 antisentido que fueron escogidas de
manera convencional.
Las Secuencias
TGF-\beta1-1 -
TGF-\beta1-33 (véase la figura 3)
aumentaron la proliferación de linfocitos hasta entre el 135 y el
213% de los controles sin tratar. En contraste, el tratamiento con
la secuencia antisentido del documento Hatzfeld et al. redujo
la proliferación hasta el 62,8%.
Sorprendentemente, las células tratadas con las
secuencias antisentido TGF-\beta1
N1-N39 escogidas de manera convencional no solo no
aumentaron la proliferación de linfocitos, sino que incluso varias
de estas secuencias revelaron una inhibición pronunciada de
proliferación celular de entre el 51,4% y el 77% de los controles
(secuencias N1-N14, N20, N26 y
N30-N39). Las secuencias antisentido
TGF-\beta1 N15-N19,
N21-N25, N28 y N29 no mostraron ningún aumento
significativo ni una inhibición significativa de la proliferación de
células con valores de entre el 94% y el 103%. La secuencia N27
mostró una ligera toxicidad con una reducción en la proliferación
celular hasta el 88%.
\newpage
La inhibición de la proliferación de células por
algunas secuencias TGF-\beta1 sugiere que pueden
no ser meramente ineficaces, sino también tóxicas. El análisis de
las 26 secuencias N1-N14, N20, N26 y
N30-N39 revelaron que 23 de ellas contenían 2 o más
motivos de secuencia con tres G consecutivas (más adelante
denominadas motivos GGG) o al menos un motivo con 4, 5 o 6 G
(motivos GGGG, GGGGG o GGGGGG). El análisis de la secuencia de
Hatzfeld et al., que también inhibió la proliferación de
PBMC, mostró sorprendentemente que también contiene un GGGGG más un
motivo GGG. Se descubrió que las 3 secuencias tóxicas que no
contenían ni 2 motivos GGG ni un motivo de 4 o más G consecutivas,
es decir, las secuencias N8, N26 y N35 tenían un contenido de bases
con 11-13 bases de G por secuencia.
En contraste con las secuencias de Hatzfeld
et al., N1-N14, N20, N26 y
N30-N39, las secuencias
TGF-\beta1-1 -
TGF-\beta1-33 mostraron un
contenido de G de cómo máximo 6 bases de G, ninguna combinación de
dos motivos GGG en una única secuencia y ningún motivo GGGG, GGGGG o
GGGGGG. Dado que el ARNm TGF-\beta1 contiene más
de 85 regiones objetivo para un motivo GGG antisentido y más de 34
regiones objetivo para un motivo GGGG antisentido, este hallazgo en
las secuencias conforme a la invención era muy poco probable
estadísticamente.
Se descubrió que las secuencias no efectivas
N15-N19, N21-N25, N28 y N29
contenían un contenido de bases distinto tanto de las secuencias
tóxicas como efectivas: El contenido de las bases A y T tomados en
conjunto (contenido A/T) varió desde el 14,3% hasta el 28,5%. Estas
secuencias ni aumentaron ni inhibieron la proliferación de PBMC. Por
lo tanto, no parecían ni efectivas ni tóxicas. En contraste a estas
secuencias no efectivas con un contenido A/T del 14,3%-28,5%, se
descubrió que las secuencias efectivas
TGF-\beta1-1 -
TGF-\beta1-33 tenían un contenido
A/T de entre el 33%-71,40%.
Se descubrió una diferencia adicional entre las
secuencias de la invención y dos tercios de las otras secuencias con
respecto a un enlace de proteína no específico: Se descubrió que las
secuencias del documento de Hatzfeld et al., y
N1-N14, N20, N26 y N30-N39 mostraban
de manera pronunciada un aumento no específico de enlace de
proteínas en comparación con las secuencias de la invención.
En la figura 3 se muestran las secuencias de
Hatzfeld et al., (H) y N1-N39 al igual que
las secuencias antisentido TGF-\beta1 conformes a
la invención.
El descubrimiento de que, mientras que las
secuencias TGF-\beta1-1 -
TGF-\beta1-33 estimulaban la
proliferación de células inmune PBMC, la secuencia de Hatzfeld et
al. y las secuencias N1-N39 eran bien no
efectivas con poca alteración en la proliferación de PBMC o tenían
efectos tóxicos y la proliferación de PBMC inhibido se extendió a
secuencias antisentido adicionales tanto de
TGF-\beta2 como de otros genes como se detalla en
los siguientes ejemplos 2-7.
Las secuencias de los oligonucleótidos
relacionados con TGF-\beta1 están listadas en la
figura 3 para el propósito de una fácil legibilidad.
Para ciertas aplicaciones, incluyendo, pero no
limitadas a la aplicación en la división de células, incluyendo
células tumorales, se acopló ácido nucleico o análogos funcionales o
estructurales o derivados efectivos de los mismos conforme a la
invención a ácido fólico, en uno de los grupos carboxi o en uno de
los átomos de nitrógeno del ácido fólico.
Además, para ciertas aplicaciones, el ácido
nucleico o los análogos funcionales o estructurales o derivados
efectivos de los mismos conforme a la invención están mezclados con
y/o acoplados con hormonas, hormonas esteroides como estrógeno,
progesterona, corticosteroides, mineralocorticoides, andrógenos,
fosfolípidos, péptidos, proteoglicanos,
glicolípidos y derivados de los mismos. Preferiblemente, se da un acoplamiento en R^{2} y/o R^{3} de las figuras 1 y 2.
glicolípidos y derivados de los mismos. Preferiblemente, se da un acoplamiento en R^{2} y/o R^{3} de las figuras 1 y 2.
\vskip1.000000\baselineskip
p53 es un gen supresor de tumores que regula de
manera negativa la proliferación de células. Ciertas mutaciones en
el gen pueden alterar la función de p53 de tal forma que se vuelve
un oncogén. Se analizaron los efectos de los oligonucleótidos
antisentido p53 en las células que contienen p53 de tipo salvaje y
subsiguientemente también el efecto de estas secuencias sobre
células con p53 mutado.
En las células con p53 de tipo salvaje los
ácidos nucleicos antisentido efectivos llevarán a una regulación a
la baja de la proteína p53 de tipo salvaje y de esta manera a un
aumento de la proliferación de las células tratadas. Las moléculas
conforme a la invención se denominan p53-1 -
p53-33. Las secuencias antisentido no efectivas de
p53 se denominaron p53-N-1 -
p53-N-18. Las secuencias tóxicas,
que inhibieron la proliferación en vez de aumentarla como hacen las
secuencias antisentido de p53 se denominaron
p53-T-1 -
p53-T-29.
Se cultivaron fibroblastos humanos normales en
un medio RPMI suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FCS) y
se colocaron 2500 células/pocillo en placas de microtitración de 96
pocillos. Se añadieron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato
con una concentración de 2 \muM después de 2 h.
Se llevaron a cabo dos ensayos para determinar
la proliferación celular:
- -
- Para determinar la incorporación de 3H-timidina, se incubaron las células antes de la recogida con 0,15 \muCi 3H-timidina/pocillo durante 6 h. Se lisaron las células mediante congelación, se pusieron sobre filtros de vidrio y se determinó la cantidad de tritio incorporado por medio de un recuento de destellos en líquido.
- -
- Para determinar el número de células, se tiñeron las células con azul de tripano y se contaron en una cámara de recuento Neubauer.
\vskip1.000000\baselineskip
Sorprendentemente, solo el tratamiento de las
células con secuencias antisentido conforme a la invención
(p-53-1 - p53-33)
dio como resultado un aumento en la incorporación de timidina desde
entre 3 y 9 veces más.
En contraste, el tratamiento con secuencias no
efectivas (p53-N-.1 -
p53-N-18) no resultó en alteraciones
significativas en la incorporación de timidina.
Además, el tratamiento con secuencias
antisentido tóxicas de p53 (p53-T-1
- p53-T-29) dio como resultado una
disminución en la proliferación en vez de un aumento.
En resumen, las 33 secuencias antisentido
conforme a la invención dieron como resultado una regulación a la
baja efectiva del control de crecimiento negativo por p53 y
aumentaron la proliferación celular, mientras que las otras 47
secuencias antisentido no tuvieron un efecto significativo sobre la
proliferación celular o incluso suprimieron la proliferación
celular.
\vskip1.000000\baselineskip
junB y junD, dos genes que codifican factores de
transcripción de la familia jun de genes son reguladores negativos
de crecimiento celular, como el p53. Se analizaron los efectos de
los distintos oligodesoxinucleótidos antisentido junB y junD.
Los ácidos nucleicos antisentido efectivos de
junB y junD llevará a una regulación a la baja de las proteínas JunB
y JunD, respectivamente, y de esta manera a un aumento de la
proliferación de las células tratadas. Las moléculas antisentido
conforme a la invención se denominaron JunB-1 -
JunB-19 y JunD-1 -
JunD-31. Las secuencias antisentido no efectivas de
junB se denominaron JunB-N-1 -
JunB-N-57. Las secuencias tóxicas,
que inhibieron la proliferación en vez de aumentarla se denominaron
JunB-T-1 -
JunB-T-20 y
JunD-T-1 -
JunD-T-17.
Se cultivaron fibroblastos humanos normales en
un medio RPMI suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FCS) y
se colocaron 2500 células/pocillo en placas de microtitración de 96
pocillos. Se añadieron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato
con una concentración de 2 \muM después de 2 h.
Se llevaron a cabo dos ensayos para determinar
la proliferación celular:
- -
- Para determinar la incorporación de 3H-timidina, se incubaron las células antes de la recogida con 0,15 \muCi 3H-timidina/pocillo durante 6 h. Se lisaron las células mediante congelación, se pusieron sobre filtros de vidrio y se determinó la cantidad de tritio incorporado por medio del recuento de destellos en líquido.
- -
- Para determinar el número de células, se tiñeron las células con azul de tripano y se contaron en una cámara de recuento Neubauer.
\vskip1.000000\baselineskip
Sorprendentemente, de nuevo únicamente el
tratamiento de las células con secuencias antisentido conforme a la
invención (JunB-1 - JunB-19 y JunD1
- JunD31) dio como resultado un aumento en la incorporación de
timidina desde entre 2 y 7 veces más.
En contraste, el tratamiento con secuencias no
efectivas (JunB-N-1 -
JunB-N-57) no resultó en
alteraciones significativas en la incorporación de timidina.
Además, el tratamiento con secuencias
antisentido tóxicas de junB o JunD
(JunB-T-1 -
JunB-T-20 y
JunD-T-1 -
JunD-T-17) dio como resultado una
disminución en la proliferación en vez de un aumento.
En resumen, las 50 secuencias antisentido
conforme a la invención dieron como resultado una regulación a la
baja efectiva del control de crecimiento negativo por JunB y JunD,
mientras que las otras 94 secuencias antisentido no tuvieron un
efecto significativo sobre la proliferación celular o incluso eran
tóxicas.
\vskip1.000000\baselineskip
(La figura 3 muestra los
oligonucleótidos
respectivos)
erbB-2 es una molécula
transmembrana con una actividad intracelular de tirosina quinasa que
se amplifica y/o se sobreexpresa por células de carcinoma en una
variedad de neoplasmas incluyendo cáncer de mama, cáncer de pulmón,
cáncer esofágico y gástrico, carcinoma de los conductos biliares,
cáncer de vejiga, cáncer pancreático y cáncer ovárico.
En varios de estos tumores, se ha demostrado que
una amplificación y sobreexpresión del gen
c-erbB-2 en el tejido tumoral se
correlaciona con un pronóstico clínico malo. Se ha demostrado que la
sobreexpresión de p185erbB-2 en carcinoma pulmonar
de células no pequeñas imparte resistencia a un número de agentes
quimioterapéuticos.
Los ácidos nucleicos antisentido efectivos de
erbB-2 llevarán a una regulación a la baja de la
proteína erbB-2 y los líneas celulares tumorales de
sobreexpresión llevarán a una proliferación celular reducida de las
células tratadas. Las moléculas antisentido conforme a la invención
se denominan erbB-2-1 -
erbB-2-83. Las secuencias
antisentido no efectivas de erbB-2 se denominaron
erbB-2-N-1 -
erbB-2-95.
Se cultivaron células humanas de carcinoma
mamario erbB-2 que sobreexpresaban
SK-Br-3 en un medio RPMI
suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FCS) y se colocaron
2500 células/pocillo en placas de microtitración de 96 pocillos. Se
añadieron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato con una
concentración de 2 \muM después de 2 h.
Para determinar la expresión de la proteína
erbB-2 se recogieron células con un raspador celular
y se sometieron a una determinación de proteínas ELISA.
Únicamente el tratamiento de las células con
secuencias antisentido conforme a la invención
(erbB-2-1 -
erbB-2-83) dio como resultado una
reducción significativa en la expresión de la proteína
erb-2 del 40-95%.
En contraste, el tratamiento con secuencias no
efectivas
(erbB-2-N-1 -
erbB-2-N-95) no
resultó en alteraciones significativas en la expresión de la
proteína erbB-2.
Para determinar el número de células, se tiñeron
las células con azul de tripano y se contaron en una cámara de
recuento Neubauer.
Únicamente el tratamiento de las células con las
secuencias antisentido conforme a la invención
(erbB-2-1 -
erbB-2-83) dio como resultado una
reducción del número de células del 35-70%.
En contraste, el tratamiento con secuencias no
efectivas
(erbB-2-N-1 -
erbB-2-N-95) no dio
como resultado alteraciones significativas en la proliferación
celular.
Las secuencias antisentido
erbB-2 se muestran en las figuras
3-8 a 3-11.
\vskip1.000000\baselineskip
(La figura 3 muestra los
oligonucleótidos
respectivos)
El gen c-fos codifica un factor
de transcripción de genes de tipo temprano inmediato. Los ácidos
nucleicos antisentido efectivos de c-fos llevará a
una regulación a la baja de la proteína c-Fos.
Las moléculas antisentido conforme a la
invención se denominan c-fos-1 -
c-fos-31. Las secuencias antisentido
no efectivas de c-fos se denominaron
c-fos-N-1 -
c-fos-N-12.
Se cultivaron fibroblastos humanos en un medio
RPMI suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FCS) y se
colocaron 2500 células/pocillo en placas de microtitración de 96
pocillos. Se añadieron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato
con una concentración de 2 \muM después de 2 h.
La expresión de la proteína
c-Fos se determinó por medio de ELISA en lisatos
celulares.
Únicamente el tratamiento de las células con las
secuencias antisentido conforme a la invención
(c-fos-1 -
c-fos-31) dio como resultado una
reducción significativa en la expresión de la proteína
c-fos del 45-95%.
En contraste, el tratamiento con secuencias no
efectivas (c-fos-N-1
- c-fos-N-12) no dio
como resultado alteraciones significativas en la expresión de la
proteína c-Fos.
\newpage
(La figura 3 muestra los
oligonucleótidos
respectivos)
TGF-\beta2, como
TGF-\beta1 es un miembro de la familia del factor
de crecimiento transformador-\beta de
citoquinas.
La sobreexpresión de
TGF-\beta1 y TGF-\beta2 está
vinculada a una progresión maligna, la inmunosupresión y la
evitación de la vigilancia de los tumores por parte del sistema
inmune.
Los ácidos nucleicos antisentido efectivos de
TGF-\beta2 llevará a una regulación a la baja del
factor de crecimiento TGF-\beta2.
Las moléculas antisentido conforme a la
invención se denominan
TGF-\beta2-1 -
TGF-\beta2-38. Las secuencias
antisentido no efectivas se denominaron
TGF-\beta2-N-1 -
TGF-\beta2-N-40.
Se cultivaron células tumorales que
sobreexpresaban TGF-\beta2 en un medio RPMI
suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FCS) y se colocaron
2500 células/pocillo en placas de microtitración de 96 pocillos. Se
añadieron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato con una
concentración de 2 \muM después de 2 h.
La expresión de proteína de
TGF-\beta2 se determinó por medio de ELISA, tanto
en lisatos celulares como en sobrenadantes.
Únicamente el tratamiento de las células con las
secuencias antisentido conforme a la invención
(TGF-\beta2-1 -
TGF-\beta2-38) dio como resultado
una reducción significativa en la expresión de proteína de
TGF-\beta2 del 35-80%.
En contraste, el tratamiento con secuencias no
efectivas
(TGF-\beta2-N-1 -
TGF-\beta2-N-40)
no dio como resultado alteraciones significativas en la expresión de
proteína de TGF-\beta2.
\vskip1.000000\baselineskip
(La figura 3 muestra los
oligonucleótidos
respectivos)
rb es un gen supresor de tumores que regula
negativamente la proliferación celular. Se analizaron los efectos de
los oligodesoxinucleótidos antisentido rb sobre células que
contienen rb de tipo salvaje.
En las células con rb de tipo salvaje los ácidos
nucleicos antisentido efectivos llevará a una regulación a la baja
de la proteína rb de tipo salvaje y de esta manera a un aumento de
la proliferación de las células tratadas. Las moléculas conforme a
la invención se denominan rb-1 -
rb-45. Las secuencias antisentido no efectivas de rb
se denominaron -1 - rb-N-168. Las
secuencias tóxicas, que inhibieron la proliferación en vez de
aumentarla como hacen las secuencias antisentido efectivas de rb se
denominaron rb-T-1 -
rb-T-16.
Se cultivaron fibroblastos humanos normales en
un medio RPMI suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FCS) y
se colocaron 2500 células/pocillo en placas de microtitración de 96
pocillos. Se añadieron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato
con una concentración de 2 \muM después de 2 h.
Se llevaron a cabo dos ensayos para determinar
la proliferación celular:
- -
- Para determinar la incorporación de 3H-timidina, se incubaron las células antes de la recogida con 0,15 \muCi 3H-timidina/pocillo durante 6 h. Se lisaron las células mediante congelación, se pusieron sobre filtros de vidrio y se determinó la cantidad de tritio incorporado por medio del recuento de destellos en líquido.
- -
- Para determinar el número de células, se tiñeron las células con azul de tripano y se contaron en una cámara de recuento Neubauer.
\vskip1.000000\baselineskip
Sorprendentemente, únicamente el tratamiento de
las células con secuencias antisentido conforme a la invención
(rb-1 - rb-45) dio como resultado un
aumento en la incorporación de timidina desde entre 2 y 6 veces
más.
En contraste, el tratamiento con secuencias no
efectivas (rb-N-1 -
rb-N-168) no resultó en alteraciones
significativas en la incorporación de timidina.
Además, el tratamiento con secuencias
antisentido tóxicas de rb (rb-T-1 -
rb-T-16) dio como resultado una
disminución en la proliferación en vez de un aumento.
En resumen, las 45 secuencias antisentido
conforme a la invención dieron como resultado una regulación a la
baja efectiva del control de crecimiento negativo por rb, mientras
que las otras 184 secuencias antisentido no tuvieron un efecto
significativo sobre la proliferación celular o incluso suprimió la
proliferación celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron las secuencias de
oligonucleótidos conforme a la invención con diversas modificaciones
distintas de la cadena principal. Los resultados ejemplares se dan a
continuación.
Para la secuencia
erbB-2-42:
CATCTGGAAACTTCCAGATG
se probaron las siguientes modificaciones
químicas en células de carcinoma que sobreexpresaban
erbB-2:
1. S-ODN
erbB-2-42 (es decir, todos los
enlaces de la cadena principal eran modificaciones de tioato).
2.
Me-ODN/S-ODN/Me-ODN
erbB-2-42 (es decir, los enlaces en
el extremo 5' y 3' eran enlaces de metilfosfonato mientras que los
enlaces en el medio eran modificaciones de tioato como sigue):
- o
- o
- o
\vskip1.000000\baselineskip
3. Me-ODN/S-ODN
erbB-2-42 (es decir, enlaces en el
extremo 5' eran enlaces de metilfosfonato mientras que los enlaces
en el 3' eran modificaciones de tioato como sigue):
4. S-ODN/Me-ODN
erbB-2-42 (es decir, los enlaces en
el extremo 5' eran enlaces de metilfosfonato mientras que los
enlaces en el 3' eran modificaciones de tioato como sigue):
\vskip1.000000\baselineskip
5. Me-ODN
erbB-2-42 (es decir, los enlaces son
enlaces de metilfosfonato):
\vskip1.000000\baselineskip
6. pN/S-ODN/pN
erbB-2-42 (es decir, los enlaces en
el extremo 5' y 3' eran enlaces de fosforamidato mientras que los
enlaces en el medio eran modificaciones de tioato como sigue):
- o
- o
- o
en las
que
pS representa la sustitución de uno de los
átomos de oxígeno no puenteantes del enlace de la cadena principal
con un átomo de azufre, mientras que pMe representa la sustitución
de uno de los átomos de oxígeno no puenteantes del enlace de la
cadena principal con un grupo metilo.
pN representa un enlace de fosforamidato N3'
-> P5'.
También, una combinación de enlaces
(N-pS-N-pO-N-pO-N)_{n}-[pS-N]_{m}
en la que n = 1-10 y m = 0-6, en la
que N representa cualquier nucleótido o análogo estructural o
funcional o derivado del mismo. Mientras que la modificación
Me-ODN de la cadena principal redujo fuertemente la
actividad de erbB-2 de la secuencia de
erbB-2 hasta menos del 20%, las modificaciones 1.-4.
de la cadena principal tenían una fuerte capacidad inhibidora de
erbB-2 con una inhibición de la expresión de la
proteína de erbB-2 de entre el 78% y el 89% a una
concentración de 2\muM 48 h después del comienzo del tratamiento
de las células de carcinoma que sobreexpresan. Aunque el
S-ODN puro tenía la capacidad de supresión más
elevada con un 89%, el
Me-ODN/S-ODN/Me-ODN
al igual que el Me-ODN/S-ODN y el
S-ODN/Me-ODN y el
pN/S-ODN/pN, mostraron un enlace reducido a
proteínas y cuando fueron probados para una activación
complementaria, mostraron una activación complementaria reducida.
Estas características son ventajosas para ciertas aplicaciones, por
ejemplo aplicación sistémica intravenosa in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron efectos similares cuando se
probaron otras secuencias conforme a la invención con las anteriores
modificaciones de la cadena principal.
La inhibición más elevada de la expresión del
gen TGF-beta-1 con las secuencias
efectivas para TGF-beta-1 conforme a
la invención con S-ODN y las modificaciones
Me-ODN/S-ODN/Me-ODN
de la cadena principal y la más baja con la modificación
Me-ODN, mientras que el enlace a proteínas y la
activación complementaria se redujeron en las secuencias que
contenían enlaces de Me-ODN.
\vskip1.000000\baselineskip
Sorprendentemente, la efectividad de las
secuencias conforme a la invención se mejoró significativamente en
diversos tipos de célula al acoplar ácidos nucleicos conforme a la
invención con ácido fólico:
- \quad
- La capacidad inhibidora de erbB-2 que era relativamente baja después de 24 h en comparación con 48 h con una inhibición de la síntesis de proteína erbB-2 del 24-37% se aumentó de manera pronunciada al acoplar secuencias conforme a la invención con ácido fólico hasta el 48-62% con una concentración de 2 \muM 24 h después del comienzo del tratamiento de las células de carcinoma que se sobreexpresaban.
Se obtuvieron efectos similares al acoplar
secuencias conforme a la invención con derivados del ácido fólico
incluyendo aminopterina y ametopterina.
\vskip1.000000\baselineskip
Sorprendentemente, la efectividad de las
secuencias conforme a la invención mejoró mucho al acoplar
oligonucleótidos conforme a la invención a cortisol:
- \quad
- La captación celular y la capacidad inhibidora de las secuencias conforme a la invención, incluyendo las secuencias para TGF-beta-1, TGF-beta-2, c-fos, p53, erbB-2, rb, junB, junD, c-jun, MIP-1 alfa, JAK-2, bcl-2 y aumentaron de manera pronunciada al acoplar cortisol con los grupos hidroxilo 3' o 5' de las secuencias de oligonucleótidos conforme a la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La efectividad de las secuencias conforme a la
invención también mejoró mucho en diversos tipos de célula al
acoplar ácidos nucleicos conforme a la invención a otras hormonas
esteroides y sus derivados o mezclándolos con las mismas, incluyendo
estrógenos, anti-estrógenos, prednisona,
prednisolona, andrógenos, anti-andrógenos,
gestágenos como la progesterona al igual que los péptidos,
proteoglicanos, glicolípidos, fosfolípidos y derivados de los
mismos.
Los andrógenos, en particular la androstendiona
y la testosterona, al igual que los anti-andrógenos,
incluyendo ciproteronacetato, flutamida, anandrona, enlazados con
los ácidos nucleicos aumentó la efectividad de las moléculas en
diversos tipos de células incluyendo células prostáticas de
carcinoma.
Los estrógenos, anti-estrógenos
y sus derivados, incluyendo fosfestrol, toremifeno, etinilestradiol,
dietilestilbestrol y los derivados de estradiol, benzoato de
estradiol, valerinato de estradiol y undecilato de estradiol, al
igual que progesterona y sus derivados, incluyendo
medroxiprogesteronacetato y megestrolacetato enlazados a los
oligonucleótidos aumentaron mucho la actividad de las moléculas
conforme a la invención en diversos tipos de células incluyendo las
células mamarias de carcinoma.
Claims (6)
1. Un procedimiento para la preparación de un
oligonucleótido antisentido o derivado del mismo que comprende los
pasos de
- -
- seleccionar un ácido nucleico objetivo, dilucidando su secuencia si fuese necesario
- -
- sintetizar el oligonucleótido antisentido a dicha secuencia objetivo de una forma conocida per se en la que el oligonucleótido antisentido tiene las siguientes características
- -
- el oligonucleótido comprende al menos 8 residuos,
- -
- el oligonucleótido comprende como máximo doce elementos, que son capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con bases de citosina,
- -
- el oligonucleótido no contiene cuatro o más elementos consecutivos, capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con cuatro bases consecutivas de citosina (CCCC) en la molécula objetivo, o de manera alternativa cuatro o más consecutivos de GGGG,
- -
- el oligonucleótido tampoco contiene 2 o más series de tres elementos consecutivos, capaces de formar tres enlaces de hidrógeno cada uno con tres bases consecutivas de citosina (CCC) en la molécula objetivo, o de manera alternativa 2 o más series de tres elementos consecutivos de GGG, y
- -
- la relación entre residuos que forman dos enlaces de hidrógeno por residuo (2H-enlace-R) con la molécula objetivo y aquellos residuos que forman tres enlaces de hidrógeno por residuo (3H-enlace-R) con la molécula objetivo, está regida por las siguientes especificaciones:
2. El procedimiento conforme a la reivindicación
1, en el que el oligonucleótido generado cumple la siguiente
especificación:
3. El procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 o 2, en el que los oligonucleótidos generados
están modificados para una mayor resistencia de la nucleasa que los
óligo o polinucleótidos que se dan de forma natural.
4. El procedimiento conforme a la reivindicación
3, en el que los oligonucleótidos generados son modificados en las
bases, los azúcares o los enlaces de los oligonucleótidos,
preferiblemente con enlaces internucleótidos de fosforotioato
(S-ODN), y/o enlaces internucleótidos de
metilfosfonato, enlaces de fosforamidato N'3 -> P5', enlaces de
péptidos o modificaciones 2'-metoxietoxi del azúcar
o modificaciones de las bases.
5. El procedimiento conforme a la reivindicación
3 y/o 4, en el que el oligonucleótido tiene al menos dos distintos
tipos de modificaciones.
6. El procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que se hacen reaccionar los
oligonucleótidos con ácido fólico, hormonas como hormonas esteroides
o corticosteroides o derivados de los mismos al enlazar los
oligonucleótidos de manera covalente a, o mezclándolos con, ácido
fólico, hormonas como hormonas esteroides o corticosteroides,
péptidos, proteoglicanos, glicolípidos o fosfolípidos.
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