ES2322327T3 - Vacuna multivalente contra el virus del dengue. - Google Patents
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Abstract
Una composición inmunogénica que comprende, en un vehículo fisiológicamente aceptable, la cepa atenuada del dengue-3 CH53489 PDK20 con ATCC Nº VR2647 y al menos otro virus atenuado del dengue seleccionado entre dengue-1 45AZ5 PDK 20 con ATCC Nº VR2648, dengue-2 S 16803 PDK50 con ATCC Nº VR2653, y dengue 4 341750 PDK20 con ATCC Nº VR265
Description
Vacuna multivalente contra el virus del
dengue.
La fiebre del dengue está causada por cualquiera
de los cuatro serotipos del virus del dengue,
dengue-1, dengue-2,
dengue-3, y dengue-4, que se
transmiten a los seres humanos por los mosquitos. En adultos, las
infecciones por dengue típicamente causan enfermedad aguda
auto-limitada pero incapacitante con fiebre, dolores
musculares, jaquecas y erupción ocasional. La enfermedad puede
complicarse por fiebre hemorrágica, que puede manifestarse por un
ensayo de torniquete positivo, petequias espontáneas, sangrado
evidente, y/o choque. La fiebre hemorrágica del dengue es fatal en
aproximadamente el 0,5% de los casos. Los pacientes que tienen
anticuerpos de una infección por dengue anterior que se infectaron
posteriormente por otra cepa de dengue han mostrado estar en mayor
riesgo de fiebre hemorrágica del dengue.
Los mosquitos vectores de virus del dengue se
encuentran en todas las áreas tropicales y
sub-tropicales del mundo y en algunas áreas
templadas de los Estados Unidos, Europa, África, y Oriente Medio. En
los últimos años, han existido infecciones por dengue endémicas y
epidémicas en América Central y del Sur, el Sudeste asiático,
India, África, las regiones del Caribe y el Pacífico. El control del
vector es poco práctico.
Se necesita una vacuna eficaz que debe conferir
protección contra los cuatro serotipos del dengue.
BHAMARAPRAVATI N, YOKOSAN S: "Live attenuated
tetravalent dengue vaccine" en: Gubler DJ, Kuno G, editors.
DENGUE AND DENGUE HEMORRHAGIC FEVER. Capítulo 17, 1997, páginas
367-377, Londres, RU describe vacunas tetravalentes
atenuadas vivas contra el dengue.
La presente invención satisface la necesidad
analizada anteriormente. La presente invención se refiere a
composiciones de vacuna que comprenden virus del dengue atenuado de
los cuatro serotipos. El virus atenuado se proporciona en una
cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune en un huésped
humano, junto con un vehículo fisiológicamente aceptable y puede
incluir opcionalmente un adyuvante para potenciar la respuesta
inmune del huésped.
De acuerdo con la presente invención se
proporciona una composición inmunogénica que comprende, en un
vehículo fisiológicamente aceptable, la cepa del
dengue-3 atenuada CH53489 PDK20 con ATCC Nº VR2647 y
al menos otro virus del dengue atenuado seleccionado entre
dengue-1 45AZ5 PDK 20 con ATCC Nº VR2648,
dengue-2 S16803 PDK50 con ATCC Nº VR2653, y
dengue-4 341750 PDK20 con ATCC Nº VR2652.
Figura 1: Aparición de síntomas de >Grado 1
como resultado de la administración de la vacuna.
Figura 2: Frecuencia de distribución del índice
de reactogenicidad por serotipo.
Figura 3: Tabla que muestra los resultados de
estudios de vacuna tetravalente contra el dengue de dosis
escalonada.
Figura 4: Tabla que muestra la inmunogenicidad
de la vacuna tetravalente contra el dengue de dosis completa en 10
sujetos.
Figura 5: Tabla que muestra detalles de
formulaciones seleccionadas de estudios de vacuna tetravalente.
Figura 6, A-H: Producción de
interferón \gamma por PBMC recogidas de voluntarios de vacuna y
estimulados con virus de serotipo específico. Todos los voluntarios
recibieron solamente un serotipo de vacuna. Los gráficos a la
izquierda (A-D) muestran los resultados de
voluntarios a los que se dio la segunda dosis aproximadamente en el
día 32. Los gráficos a la derecha (E-H) muestran los
resultados de voluntarios que recibieron la segunda dosis
aproximadamente en el día 92. Se observó una respuesta sobre 1000
pg/ml justo antes de la segunda dosis en la mayoría de los
voluntarios. Solamente cuatro voluntarios tuvieron una respuesta
sobre 1000 pg/ml en los primeros 15 días de recibir la primera
dosis de vacuna.
Figura 7, A-D: Producción de
interferón \gamma de PBMC recogidas de voluntarios de vacuna que
recibieron vacuna tetravalente. Las PBMC se estimularon
individualmente con cada serotipo de virus. Las líneas individuales
en cada gráfico representan respuestas de las PBMC de un voluntario
para serotipos individuales de virus. Como con los destinatarios de
la vacuna monovalente, se anotaron las últimas respuestas.
Figura 8, A y B: Producción de ARNm de granzima
B de PBMC recogidas de voluntarios de vacuna monovalente y
tetravalente. Las células se recogieron de todos los individuos
cuyas PBMC secretaban \geq 1000 pg IFN\gamma/ml en todo
momento. Ésta es una representación semicuantitativa de la cantidad
de ARNm detectada por RTPCR. El diagrama superior (A) describe la
intensidad de las bandas observadas para todas las muestras. El gel
inferior (B) es de voluntarios seleccionados para mostrar ejemplos
de ensayos de RTPCR positivos y negativos.
La presente invención proporciona virus del
dengue atenuado de los cuatro serotipos adecuado para su uso en
vacunas en seres humanos. Los virus del dengue descritos en este
documento se produjeron por pases seriados de un asilado de virus
del dengue infeccioso en una línea celular huésped adecuada tal como
células de riñón de perro primarias de modo que se acumulen
mutaciones que confieren atenuación en el aislado. El pase seriado
se refiere a la infección de una línea celular con un aislado viral,
la recuperación de la descendencia viral a partir de las células
huésped, y la posterior infección de células huésped con la
descendencia viral para generar el siguiente pase.
Los siguientes virus atenuados se usan en las
composiciones de la presente invención aunque puedan usarse otras
composiciones de virus, de cualquier serotipo, esté atenuado o
inactivado, en combinación con las cepas atenuadas descritas en la
presente invención. El virus del dengue-1 atenuado,
derivado del aislado 45AZ5, se depositó según los términos del
Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC) de
10801 University Boulevard, Manassas, Virginia
20110-2209, EEUU, y se le concedió el número de
acceso VR-2648.
El virus del dengue-2 atenuado
derivado del aislado S16803, se depositó según los términos del
Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC)
de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia
20110-2209, EEUU, y se le concedió el número de
acceso VR-2653.
El virus del dengue-3 atenuado
derivado del aislado CH53489, se depositó según los términos del
Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC)
de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia
20110-2209, EEUU, y se le concedió el número de
acceso VR-2647.
El virus del dengue-4 atenuado
derivado del aislado 341750, se depositó según los términos del
Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC)
de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia
20110-2209, EEUU, y se le concedió el número de
acceso VR-2652.
El pase seriado de una cepa virulenta (que causa
enfermedad) del dengue provoca el aislamiento de virus modificado
que puede estar atenuado, es decir, infeccioso, aunque incapaz de
causar enfermedad. Estos virus modificados se ensayan en monos para
la infectividad reducida. Aquellos que tienen infectividad reducida
se ensayan posteriormente en seres humanos. Los seres humanos son
el único primate que mostrará signos de enfermedad clínica. Los
virus que muestran reactividad de mínima a no clínica aunque aún
infectan e inducen una respuesta inmune están ate-
nuados.
nuados.
En una realización de la invención, se pasó de
forma seriada un aislado del dengue virulento de los cuatros
serotipos del dengue en células de riñón de perro primarias (PDK)
para obtener las cepas atenuadas. El pase seriado se realizó
infectando células PDK con la cepa virulenta, incubando las células
infectadas durante varios días, y recogiendo los fluidos de cultivo
sobrenadantes que contenían virus. El virus recogido después se
aplicó a células PDK frescas para generar el siguiente pase.
Se ensayaron diversos pases en las series para
el efecto clínico después del pase final en células pulmonares de
mono rhesus fetal (FRhL). Se usaron células FRhL para optimizar los
títulos virales en los que, en general, el pase 1 se consideró la
semilla maestra, el pase 2 se consideró la semilla de producción, y
el pase 3 se consideró el lote de vacuna. Las vacunas se prepararon
a diversos niveles de pase en PDK, y los productos de vacuna se
ensayaron para la atenuación en monos y seres humanos. La virulencia
de un virus pasado, es decir, la capacidad de causar enfermedad, se
evaluó por control diario de los síntomas tales como temperatura
(fiebre), jaqueca, sarpullido, por nombrar unos pocos. El pase se
consideró atenuado, juzgado por la incapacidad de este virus de
provocar signos clínicos de enfermedad dengue en vacunados.
La propagación de los virus atenuados de la
invención puede ser en varias líneas celulares que permitan el
crecimiento del virus del dengue. El virus del dengue crece en una
diversidad de células humanas y animales. Las líneas celulares
preferidas para la propagación de virus del dengue atenuados para su
uso en vacuna incluyen DBS-FRhL-2,
células Vero y otras células de mono. Las producciones más elevadas
de virus habitualmente se consiguen con líneas celulares
heteroploides tales como células Vero. Las células típicamente se
inoculan a una multiplicidad de infección que varía de
aproximadamente 0,01 a 0,005, y se cultivan en condiciones
permisivas para la replicación del virus, por ejemplo, a
aproximadamente 30-37ºC y durante aproximadamente
3-5 días, o todo el tiempo necesario para que el
virus alcance un título adecuado. El virus se retira del cultivo
celular y se separa de los componentes celulares, típicamente por
procedimientos de aclarado bien conocidos, por ejemplo,
centrifugación, y puede purificarse adicionalmente según se desee
usando procedimientos bien conocidos para los especialistas en la
técnica.
El aislamiento de un virus atenuado puede estar
seguido de un análisis de secuencia de su genoma para determinar la
base para el fenotipo atenuado. Esto se consigue secuenciando el ADN
viral e identificando los cambios de nucleótidos en el aislado
atenuado con relación a la secuencia genómica de un virus de
control. Por lo tanto, pueden caracterizarse los cambios
moleculares que confieren atenuación en una cepa virulenta.
Para su uso en vacuna, los virus atenuados de la
invención pueden usarse directamente en formulaciones de vacuna, o
liofilizarse, preferiblemente en un estabilizador (Hoke, 1990, Am J
Trop Med Hyg 43, 219-226), según se desee, usando
protocolos de liofilización bien conocidos para los especialistas.
El virus liofilizado típicamente se mantendrá a aproximadamente
4ºC. Cuando esté listo para su uso, el virus liofilizado se
reconstituye en agua, o si es necesario, en una solución
estabilizante, por ejemplo, solución salina o que comprenda
Mg^{++} y HEPES, con o sin adyuvante, como se describirá
adicionalmente a continuación.
Por tanto, las vacunas contra el virus del
dengue de la invención contienen como ingrediente activo una
cantidad inmunogenéticamente eficaz de más de un virus del dengue
atenuado elegidos entre el grupo constituido por
dengue-1, dengue-2,
dengue-3, y dengue-4 como se
describe en este documento. La composición de virus atenuado puede
introducirse en un sujeto, particularmente seres humanos, con un
vehículo fisiológicamente aceptable y/o adyuvante. Los vehículos
útiles son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo,
agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3%,
ácido hialurónico y similares. Las soluciones acuosas resultantes
pueden envasarse para su uso como tales, o liofilizadas,
rehidratándose la preparación liofilizada antes de la
administración, como se ha mencionado anteriormente. Las
composiciones pueden contener sustancias auxiliares
farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a
las condiciones fisiológicas, tales como agentes para ajustar y
tamponar el pH, agentes para ajustar la tonicidad, agentes
humectantes y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato
sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico,
monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, y
similares.
similares.
La administración de los virus atenuados vivos
descrita en este documento puede realizarse por cualquier medio
adecuado, incluyendo tanto inyección parenteral (tal como inyección
intraperitoneal, subcutánea, o intramuscular), por inyección in ovo
en pájaros, por vía oral como por aplicación tópica del virus
(típicamente transportada en la formulación farmacéutica) a una
superficie de las vías respiratorias. La aplicación tópica del virus
a una superficie de las vías respiratorias puede realizarse por
administración intranasal (por ejemplo, por el uso de un
cuentagotas, hisopo, o inhalador que deposita una formulación
farmacéutica por vía intranasal). La aplicación tópica del virus a
una superficie de las vías respiratorias también puede realizarse
por administración por inhalación, tal como creando partículas
respirables de una formulación farmacéutica (incluyendo tanto
partículas sólidas como partículas líquidas) que contiene el virus
en forma de una suspensión de aerosol, y después provocando que el
sujeto inhale las partículas respirables. Los procedimientos y
aparato para administrar partículas respirables de formulaciones
farmacéuticas son bien conocidos, y puede emplearse cualquier
técnica convencional. Como resultado de la vacunación el huésped
llega a ser parcial o completamente inmune a infección por virus
del dengue de los serotipos administrados, o resistente a
desarrollar infección viral por dengue moderada o grave.
La composición de vacuna que contiene los virus
del dengue atenuados de la invención se administra a una persona
susceptible a o de otro modo en riesgo de infección por el virus del
dengue para potenciar las capacidades de respuesta inmune del
propio individuo. Dicha cantidad se define como una "dosis
inmunogenéticamente eficaz". En este uso, la cantidad precisa
depende de nuevo del estado de salud y peso del sujeto, el modo de
administración, la naturaleza de la formulación, etc., pero
generalmente varía de aproximadamente 10^{2} a 10^{6} pfu de
cada serotipo de virus del dengue pos sujeto. La cantidad de vacuna
contra el virus de cada serotipo puede ajustarse, es decir
aumentarse o disminuirse, para producir una formulación que
proporcione suficiente protección de la infección con el virus del
dengue deseado. Cuando se combinan los cuatro serotipos, una
composición preferida comprende una cantidad igual de cada serotipo
del dengue. En cualquier caso, las formulaciones de vacuna deben
proporcionar una cantidad de virus del dengue atenuado de cada uno
de los serotipos suficientes para proteger de forma eficaz al
paciente contra infección por el virus del dengue grave o amenazante
de la vida de un serotipo en la formulación de vacuna, y
posiblemente otros serotipos su sucede protección cruzada.
Los virus del dengue atenuados de la invención
de un serotipo particular pueden combinarse con virus atenuados de
otros serotipos de virus del dengue para conseguir protección contra
múltiples virus del dengue. Típicamente los diferentes virus
modificados estarán en mezcla y se administrarán simultáneamente,
pero también pueden administrarse por separado.
En algunos casos puede ser deseable combinar las
vacunas contra el virus del dengue atenuado de la invención con
vacunas que inducen respuestas protectoras contra otros agentes.
Puede realizarse la administración sencilla o
múltiple de las composiciones de vacuna de la invención. Puede
requerirse la administración múltiple para provocar suficientes
niveles de inmunidad. Los niveles de inmunidad inducida pueden
controlarse midiendo la cantidad de anticuerpos secretados o séricos
neutralizantes, y pueden ajustarse las dosificaciones o repetirse
las vacunaciones según sea necesario para mantener los niveles
deseados de pro-
tección.
tección.
Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo
de ilustración, no limitación.
Los siguientes Materiales y procedimientos se
usaron en los siguientes ejemplos.
\newpage
Cepas virales. Los virus DEN se pasaron
en cultivos celulares de riñón de perro primarios (PDK) después del
aislamiento de fuentes humanas y mosquitos. La Tabla 1 enumera las
capas que se adaptaron y pasaron en células PDK. Después del pase
en células PDK, las cepas virales se adaptaron adicionalmente a
células FRhL para la producción de semilla y vacuna. Esto constaba
de 3-4 pases adicionales para la preparación del
lote de vacuna final. Las cepas virales precursoras, también
enumeradas en la Tabla 1, se obtuvieron de pases en cultivo
celulares, inferiores en células que eran permisivas para la
replicación del virus DEN.
Producción de vacuna. Las vacunas DEN
para los cuatro serotipos se prepararon en cultivo celular FRhL
usando un procedimiento similar. Las células FRhl, depositadas y
pre-ensayadas (véase la Tabla 2 para los resultados
de ensayo) se retiraron de almacenamiento en nitrógeno líquido y se
sembraron en matraces de 150 cm^{2} en medio esencial mínimo de
Eagle (EMEM) (Biowhittaker, Waldersville, MD) celular suplementado
con aminoácidos no esenciales, suero bovino fetal, FBS (2%)
(Biowhittaker, Waldersville, MD), y antibióticos. Después de que
los matraces alcanzaran confluencia, se retiró el medio y los
matraces se inocularon con la semilla de producción DEN diluida
para una aportación de 0,01 MOI, y se dejó que adsorbiera a 32ºC
durante 1 h. Después de la adsorción y el suministro de medio EMEM
fresco, los matraces se devolvieron a 32ºC durante 4 días. En el día
4 después de la inoculación, se desechó el medio de todos los
matraces y las monocapas celulares se lavaron 3 veces con 100 ml de
Hank BSS (Biowhittaker, Waldersville, MD). Después del lavado, se
suministró a los matraces medio EMEM que contenía albúmina sérica
humana al 0,25% (HSA, Alpha Therapeutic Corp, Los Angeles, CA)
remplazando el FBS. Después de dos días adicionales de incubación a
32ºC, se retiraron los fluidos de cultivo sobrenadantes de todos
los matraces y se combinaron. Después del muestreo para los ensayos
de seguridad, los fluidos de cultivo restantes se combinaron y
aclararon por filtración a través de un filtro de membrana de 0,45
micrómetros, que con se une a proteínas. Los fluidos filtrados se
combinaron y se mezclaron con un volumen igual de estabilizador que
contenía lactosa al 15% y HSA al 5%. Los fluidos estabilizados a
granel se almacenaron a -70ºC hasta que se secaron por congelación.
Para la introducción en viales final, los fluidos estabilizados a
granel se descongelaron rápidamente a 41ºC y se hicieron en
alícuotas en volúmenes de 3 ml en viales séricos. Las bandejas de
viales se congelaron a una temperatura de -40ºC en un liofilizador
Hull, seguido de secado durante 1 día. Después de taparlos, los
viales se almacenaron a -20ºC en un congelador controlado.
Ensayo de vacuna. Todos los depósitos
celulares usados para las preparaciones virales así como la semilla
y lotes de vacuna se ensayaron para la presencia de agentes
contaminantes. Los artículos de ensayo y los resultados se enumeran
en la Tabla 2. No se encontraron contaminantes detectables en
ninguno de los productos.
Inoculación en mono rhesus. Se
inmunizaron monos rhesus macho y hembra adultos
(6-15 kg) con los lotes de vacuna DEN o virus
precursores por inoculación subcutánea de 0,5 ml en el antebrazo. Se
extrajo sangre para el aislamiento de virus y los ensayos de
anticuerpo de la vena femoral antes de la inoculación y cada día
durante 14 días después de la inoculación. También se extrajo sangre
a los 30 y 60 días después de la inmunización. Se realizaron
exposiciones al virus de forma similar.
El aislamiento de virus por amplificación en
cultivo celular C6/36 se ha descrito en Putnak y col., 1996 (J.
Infect Dis 174, 1176-1184). En resumen, después de
la inoculación de los monos, se obtuvieron muestras sanguíneas
diarias del día 1 a 14. El suero se separó y se congeló a -80ºC.
Para la recuperación del virus de los sueros, los sueros
descongelados se diluyeron 1:3 en medio de cultivo celular y se
usaron para inocular matraces de 25 cm^{2} que contenían
monocapas de células de mosquito C6/36. Después de la adsorción del
virus, los matraces se mantuvieron a 28ºC en medio de mantenimiento
EMEM. Después de 7 días, se cambió el medio y los matraces se
incubaron 7 días adicionales. En el día 14 después de la
inoculación, se decantaron los fluidos de cultivo sobrenadantes y
se congelaron a -80ºC después de mezclar con un volumen igual de
suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor. Las muestras
congeladas después se ensayaron para virus infeccioso por ensayo de
placa.
Ensayos de placa. Se tituló el virus
infeccioso a partir de aislados de viremia amplificados o
directamente de sueros de mono por ensayo de placa en células de
riñón de mono rhesus (LLC-Mk_{2}, ATCC CCL7)
siguiendo el procedimiento de Sukhavachana y col. 1966 (Bull WHO
35, 65-66). Los ensayos en células C6/36 se
realizaron como se describe en Putnak y col. 1996,
supra.
Ensayos de neutralización. Los
anticuerpos neutralizantes DEN se midieron a partir de sueros de
mono usando un ensayo de neutralización de reducción de placa
similar al usado por Russell y col. 1967 (J Immunol 99,
285-290). Se usaron los virus precursores enumerados
en la Tabla 1 para medir el punto final de reducción de placa al
50% (PRNT50) en muestras de suero.
Las cepas de virus DEN seleccionadas para el
desarrollo de vacuna tenían una diversidad de historias de pases
antes del pase en PDK. En el caso de DEN-4
341750 tenía solamente un pase en mosquito antes de la inoculación
del cultivo celular PDK, mientras que la cepa DEN-1
West Pac 74 tenía una historia de veinte pases en células FRhL antes
del pase en PDK (Tabla 1). Con la excepción de
DEN-3, todas las cepas se adaptaron después de una
pequeña cantidad de pases en PDK. Para DEN-3, se
requirieron esfuerzos adicionales para aumentar la aportación viral
en los primeros pases para adaptar esta cepa a células PDK. Como
caso general después de la adaptación a células PDK, se descubrió
que los títulos de virus DEN estaban en el intervalo de
10^{4}-10^{5} PFU/ml. Los intentos por aumentar
los títulos no fueron satisfactorios y se buscaron sustratos
celulares alternativos para la producción de vacuna. Se
seleccionaron células DBS-FRhL-2
(FRhL) para este propósito por varias razones: 1) los virus DEN se
replican a títulos de aprox.10^{6} PFU/ml permitiendo la
fabricación de vacunas DEN en estas células; 2) las células se han
usado para la preparación de varias vacunas DEN que se han ensayado
en ensayos clínicos en Fase I sin reacciones adversas que puedan
relacionarse al sustrato celular de la vacuna; 3) las células FRhL
son células diploides pulmonares de mono rhesus, normales que no
tienen potencial tumorigénico y están libres de actividad
transcriptasa inversa y agentes contaminantes; 4) como las células
son células diploides "normales" no existen requisitos
reguladores u otros requisitos para purificar las vacunas; 5) pueden
establecerse depósitos de células FRhL a generaciones celulares
utilizables para la fabricación de vacunas partiendo con células de
pase inferior, disponibles. Por lo tanto el pase en PDK proporciona
un modelo excelente para aquellos que desean estudiar el proceso
empírico de la atenuación selectiva. Pero, como el pase seriado en
PDK ejerce un proceso de selección cumulativo, el pase adicional en
otro sustrato celular proporciona su propia presión selectiva. No
se sabe si el pase en FRhL aumenta o no o disminuye o no la
virulencia del virus para seres humanos. Es interesante el uso de
líneas celulares estables que deban caracterizarse completamente
sólo una vez. Sin embargo, la experiencia publicada con células
FRhL sugiere que estas células pueden revertir o desestabilizar las
propiedades biológicas adquiridas durante el pase seriado en PDK
(Halstead y col., 1984, Am J Trop Med Hyg 33,
654-665; Halstead y col., 1984, Am J Trop Med Hyg
33, 666-671; Halstead y col., 1984, Am J Trop Med
Hyg 33, 672-678; Halstead y col., 1984, Am J Trop
Med Hyg 33, 679-683; Eckels y col. 1984, Am J Trop
Med Hyg 33, 679-683).
La adaptación de virus pasado en PDK a FRhL fue
uniformemente satisfactoria para todas las cepas de virus DEN y no
fue dependiente del pase en PDK. Los títulos virales de
recolecciones de pases 1-4 en FRhL variaban de
10^{5}-10^{6} PFU/ml. En el
tercer-cuatro pase en FRhL, se prepararon lotes de
vacuna de todos los virus de la serie de cepas DEN y se ensayaron
como se enumera en la Tabla 2. También se proporcionan datos en la
Tabla 2 para el ensayo del depósito de células FRhL así como el
ensayo de la semilla maestra y de producción. Los resultados de
estos ensayos, necesarios para asegurar la seguridad y la ausencia
de contaminación, fueron negativos, o estaban dentro de las
especificaciones permisibles. Para la semilla de producción
DEN-4 341750 PDK-20, se realizaron
ensayos de neurovirulencia en monos. Los resultados de este estudio
pueden encontrarse en Hoke, 1990 (Am J Trop Med Hyg 43,
219-226). La semilla de producción
DEN-4 así como el virus precursor
DEN-4 que se usó para la comparación no eran
neuropatogénicos. Que las vacunas DEN candidatas restantes necesiten
evaluación para la neurovirulencia sigue siendo cuestionable en
base a los datos de esta experiencia así como otros ensayos de
neurovirulencia DEN en mono (comunicación personal).
\vskip1.000000\baselineskip
Se comparó la infectividad de virus DEN pasados
en células PDK y denominados "series de cepas" con virus no
modificados precursores para cada serotipo. La Tabla 3 enumera los
resultados de estos estudios donde se midió el grado de infectividad
para los monos por la cantidad de días de viremia que podía
encontrarse en suero extraído secuencialmente dos semanas después de
la inoculación. La inoculación de virus precursor en los monos
provocó 6,8, 5, 3, y 4,7 días de media de viremia en grupos de
3-4 monos inoculados con DEN-1,
DEN-2, DEN-3, y
DEN-4, respectivamente. Para DEN-2
precursor, datos adicionales (no mostrados) han corroborado que la
infección con viremia medible es muy reproducible en el tiempo
usando monos y técnicas de aislamiento similares.
Desafortunadamente, existen solamente datos parciales sobre títulos
virales en sueros de mono. La mayoría de los datos que existen
provienen de la experiencia con el virus DEN-2
precursor donde se tituló sangre viremia de mono en cultivo celular
de mosquito. Los picos de los títulos virales 4-8
días después de la inoculación produjeron títulos que alcanzaban
10^{5} PFU/ml de suero (Putnak y col. 1996, supra).
Para cada serie de cepas, el pase en PDK provoca
la modificación del virus DEN como se muestra por la capacidad
reducida del virus de infectar monos. Para varias de las series de
cepas esto se evidenciaba claramente por la ausencia completa de
viremia en el pase en PDK más elevado. La inoculación de monos con
DEN-1 en el pase 27 en PDK provocó 0 días de
viremia en 4 monos. Esto se traduce en 0 aislados de un total de 56
exanguinaciones ensayadas. Se halló un resultado similar para
DEN-3 PDK-20 y
PDK-30. En PDK-30 para este virus,
se perdieron todas las evidencias de infectividad en mono, es
decir, sin viremia y sin evidencias de seroconversión en los monos
inoculados con 10^{6} PFU de virus. La cepa DEN-2
requería la mayor cantidad de pases en PDK para obtener
modificación de la infectividad en mono. Con este virus, se
requirieron al menos 40 pases en cultivo celular PDK para viremia
reducida. Para contrastar esta experiencia, la cepa
DEN-4 341750 solamente requería 6 pases en células
PDK para una infección en mono modificada. Para otra cepa
DEN-1, 1009, incluso después de 50 pases en PDK no
había evidencias de infección modificada en mono cuando se comparaba
con el virus precursor (datos no mostrados). En conclusión, parece
que los pases en células PDK es un procedimiento empírico eficaz
para la modificación y atenuación de diversos aislados DEN. Éste es
un huésped no natural para DEN que probablemente establece una
presión de selección para las poblaciones virales que son adecuadas
para la replicación en PDK pero no necesariamente para la
replicación en células diana en monos y seres humanos.
Voluntarios. Se examinaron voluntarios
masculinos y femeninos sanos con edades de 18-45 y
se seleccionar por un panel de ensayos, incluyendo química
sanguínea, hematología, tiempo de protrombina, tiempo de
tromboplastina parcial, análisis de orina, anticuerpos por reaginas
plasmáticas rápidas, y serología para el antígeno superficial de la
hepatitis B y anticuerpos contra VIH. Los voluntarios se excluían en
base a una anormalidad significativa persistente o ensayo positivo.
Las mujeres voluntarias eran elegibles de participar si tenían una
prueba de embarazo negativa dentro de las 48 horas de vacunación y
deseaban formar un formulario de consentimiento que establece que
evitan la concepción usando anticonceptivos convencionales durante
los 3 meses después de la vacunación. Además, los voluntarios se
excluían si tenían inmunidad a flavivirus previa, que puede afectar
a las respuestas a las vacunas contra el dengue [Scott, 1983, J
Infect Dis 148, 1055-1060] o una historia de
alergia a la neomicina, estreptomicina, o gentamicina. La inmunidad
a flavivirus previa se definió como la no existencia de anticuerpos
de inhibición de hemaglutinación detectables (a una dilución sérica
de 1:10) contra los tipos 1-4 del dengue, la
encefalitis japonesa, o la fiebre amarilla y sin historia de vacuna
contra la fiebre amarilla o infección por flavivirus.
Los voluntarios puntuaron \geq 70% en un
examen escrito diseñado para probar el conocimiento de todos los
aspectos del ensayo clínico. Posteriormente se obtuvo el
consentimiento informado de cada voluntario en cumplimiento con el
US 21 CFR Parte 50-Protección de Sujetos Humanos. El
protocolo clínico cumplía todos los requisitos reguladores
relevantes, incluyendo la Declaración de Helsinki (Protocolo), y las
Regulaciones de la Armada 70-25-Uso
de Voluntarios como Sujetos de Investigación, y
40-7-Uso de Fármacos en
Investigación en Seres Humanos y el Uso de Sustancias Controladas
de Programa I. Los estudios se aprobaron por la Comisión de Revisión
de Investigaciones en Sujetos Humanos (Human Subject Research
Review Board), la Oficina del Inspector General de Sanidad (Office
of the Surgeon General), la Armada de EEUU, el Comité de
Investigación con Uso en Seres Humanos del WRAIR (WRAIR Human Use
Research Commitee), y la Comisión de Revisión Institucional
(Institutional Review Board), University of Mariland en
Baltimore.
Vacunas en Estudio. Las vacunas en
estudio se enumeran en la tabla 4. Los virus de vacuna se pasaron
repetidamente en células de riñón de perro primarias y después en
cultivo de células diploides continuas de pulmón de mono rhesus
fetal (FRhL) como res pases terminal para preparar la semilla y la
vacuna. Cada candidata, antes den ensayo en voluntarios, se
confirmó que provocaba viremia sustancialmente reducida en
comparación con su virus precursor de tipo silvestre en monos
rhesus vacunados. La atenuación adecuada medida por infección de
monos rhesus indicaba que las cepas de vacunas contra el dengue
eran vacunas apropiadas para ensayo en seres humanos.
Inmediatamente antes de la inmunización, se
reconstituyó un vial de vacuna liofilizada con agua estéril para
inyección (USP). Después de la inmunización, las partes no usadas de
vacuna rehidratada se mantuvieron en hielo y se titularon en 4
horas en monocapas celulares LLC-MK_{2}
(Sukhavachana y col. 1966, Bull WHO 35, 65-66).
Cada voluntario recibió entre 1,0 x 10^{5} y 4,5 x 10^{6} pfu de
virus, dependiendo de la vacuna candidata inyectada (Tabla 4). La
historia de pases de las vacunas en estudio individuales se resume a
continuación.
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Vacuna Dengue 1 45AZ5: La cepa
DEN-1 West Pac 74 se aisló de un caso humano de
fiebre DEN en la isla de Nairu (Pacífico Occidental) en 1974. El
aislado se pasó 20 veces en cultivo celular FrhL y se preparó un
lote de vacuna. Los pases incluyeron mutagenización y selección de
placa para recuperar un virus que estaba atenuado y era adecuado
para la vacunación de seres humanos. Después de la vacunación de dos
voluntarios humanos, se tomó la decisión de interrumpir el uso de
la vacuna debido a la enfermedad DEN en uno de los voluntarios. La
vacuna se atenuó adicionalmente por pase en cultivos celulares PDK y
FrhL. La vacuna candidata actual es DEN-1 45AZ5
PDK-20.
Vacuna Dengue 2 S16803: La cepa del virus
del dengue 2 S16803 se obtuvo de un aislado de virus Thai de un
paciente con fiebre del dengue. El virus se sometió a un total de 50
pases en PDK, con pase terminal en células diploides de pulmón de
mono rhesus fetal (DBS-FRhL-2) para
la producción de semilla y vacuna. Inicialmente se prepararon dos
vacunas candidatas en los niveles del pase 30 y 50 en PDK y se
seleccionaron para el ensayo. Se desarrolló otra vacuna candidata
en el WRAIR de la misma cepa precursora del virus del dengue 2
S16803 y se produjo en el nivel del pase 40 por el Salk Institute
(Swiftwater, PA).
Vacuna Dengue Tipo-3
CH53489: La cepa del virus del dengue tipo-3
CH53489 se obtuvo de una cepa Thai, pasada 30 veces en células de
riñón de perro primarias (PDK) después de un pase inicial en células
de riñón de mono verde primarias (PGMK) y de insecto C6/36. Se usó
el virus de los pases 10, 20, y 30 en PDK para inocular cultivos de
células diploides de pulmón de mono rhesus fetal.
Vacuna Dengue 4 341750 Carib: La vacuna
candidata contra el dengue 4 se obtuvo de una cepa del Caribe de
Dengue 4 (Colombia, 1982), pasada en la University of Hawaii, y
fabricada en el WRAIR [Marchette, 1990, Am J Trop Med Hyg 43,
212-218]. El anticuerpo contra el virus precursor
neutraliza otras cepas de virus del dengue 4 incluyendo
H-241, la cepa prototipo. La atenuación del aislado
humano se consiguió por pases 20 veces en cultivos celulares de
riñón canino primario (PDK).
Diseño del Estudio. Se usó un protocolo
clínico en pacientes hospitalizados, simple ciego, aleatorizado para
todos los estudios piloto. La mayoría de los estudios se realizó en
el Center for Vaccine Development, University of Mariland,
Baltimore MD. Los estudios piloto de la vacuna dengue 2 S16803 PDK
40 y la vacuna dengue 4 CH341750 PDK 20 se realizaron en la Medical
Division, United States Army Medical Research Institute of
Infectious Diseases (USAMRIID), Ft Detrick, MD.
En los estudios clínicos iniciales de una
vacuna, se ensayó primero el pase más elevado disponible para una
cepa particular en tres voluntarios. Los síntomas se controlaron muy
bien durante tres semanas, y si los voluntarios seguían bien, se
ensayaba el siguiente pase inferior. Si uno o más de los voluntarios
se ponía enfermo, no se realizaba el ensayo de pases inferiores de
la cepa de la vacuna, ya que se suponía que pases inferiores
probablemente estarían menos atenuados. Después de ensayar todos los
niveles de pases aceptables en tres voluntarios, se seleccionó el
nivel más bajo que no causaba enfermedad para ensayo adicional en
hasta siete voluntarios adicionales.
Para permitir una observación cuidadosa, evitar
la exposición a enfermedades infecciosas extrañas, y para evitar la
posible infección de mosquitos portadores, los voluntarios se
confinaron en la sala de investigación desde tres días antes de la
inoculación hasta 20 días después de la inmunización. Se registraron
todas las experiencias adversas que sucedieron en este periodo
después de la administración de cada vacuna, independientemente de
la gravedad o si se consideraban relacionadas o no con la
vacunación. La seguridad aceptable de una vacuna se definió con
antelación como la ausencia de los siguientes acontecimientos
adversos graves: cualquier enfermedad clínica grave no explicada
por un diagnóstico no relacionado con la vacunación; fiebre
persistente (temperatura oral de \geq 38,5ºC para 4
determinaciones en 24 horas, una temperatura oral diaria máxima de
\geq 38,5ºC en tres días sucesivos, o temperatura que excede 40ºC
en cualquier determinación individual); trombocitopenia (menos de
100.000 plaquetas/mm^{3}) o leucopenia (recuento absoluto de
neutrófilos <1000) en 2 determinaciones consecutivas; o nivel de
amino alanina transferasa (ALT) sérica de más de 4 veces lo normal
en 3 o más días sucesivos que no se explica de otro modo. Además,
cualquier experiencia que sugiriera cualquier efecto secundario
significativo que pueda estar asociado con el uso de la vacuna se
documentó como un acontecimiento grave.
A los voluntarios se les inoculó por vía
subcutánea 0,5 ml de vacuna no diluida en el día 0. Después de la
inmunización, se registraron los signos vitales cada 6 horas. Se
examinó el sitio de la inyección y el diámetro máximo de eritema y
la induración se midieron y registraron diariamente. Los signos
clínicos (fiebre [>37,8ºC], sarpullido, vómitos, petequias, y
aumento del hígado y el bazo) y los síntomas (malestar, jaqueca,
mialgia, artralgia, náuseas, y dolor ocular o fotofobia) se
evaluaron diariamente durante los primeros 20 días después de la
inmunización. Los síntomas se clasificaron como leves (síntoma
apreciado pero continúa la actividad en la sala) o graves (forzado
a estar en cama por el síntoma). Si lo solicitaba el voluntario, se
trataban los síntomas dolorosos con clorhidrato de propoxifeno; no
se usaron antipiréticos. Se registraron las observaciones en una
lista de control convencional de síntomas y hallazgos físicos. Se
dio el alta a los voluntarios de la sala de estudio en el día 21, y
les pidió que volvieran para los estudios serológicos 1, 6, 12, y 24
meses después de la inoculación.
Dos voluntarios inmunes a flavivirus sanos se
inmunizaron en USAMRIID con la cepa precursora de la vacuna dengue
1 45AZ5 y dos años después con la cepa precursora de la vacuna
dengue 3 CH53489. Los registros médicos del estudio se revisaron
para la presencia o ausencia de los siguientes signos y síntomas:
fiebre, sarpullido, malestar, jaqueca, mialgia, artralgia, y dolor
ocular o fotofobia. La viremia se midió diariamente. En contraste
con los presentes ensayos, los síntomas no se registraron
sistemáticamente, y no se clasificó la intensidad de los síntomas.
Además, se extrajo y se resumió la experiencia clínica con la vacuna
dengue 4 341750 Carib PDK 20, dada a 8 voluntarios en USAMRIID
durante un último estudio, para compararla con la de los vacunados
actuales [Hoke, 1990, supra].
Evaluación de Laboratorio. Se recogió
sangre de voluntarios en días alternos y en el día 31 para ensayos
médicos disponibles de forma rutinaria para la hemoglobina y el
hematocrito, recuento de glóbulos blancos con recuento diferencial,
recuento de plaquetas, y niveles de aspartato aminotransferasa (AST)
y alanina aminotransferasa (ALT). Además, se recogió sangre en días
alternos hasta el día 20 para estudios de aislamiento de virus y
anticuerpos. Se dejó que la sangre (20 ml) coagulara a 4ºC durante
\leq 2 horas, se decantaron los sueros en alícuotas de 1 ml, se
congelaron y se almacenaron a -70ºC hasta el estudio.
Aislamiento de Virus. Para la
determinación de viremia por dengue, se descongeló el suero y se
inoculó en monocapas de células de mosquito C6/36 y se incubaron a
28ºC durante 14 días. Las recolecciones de fluido de cultivo
sobrenadante se ensayaron para el virus por ensayo de placa en
células LLC-MK_{2} (Sukhavachana y col. 1966,
Bull WHO 35, 65-66). Para cuantificar la cantidad de
virus en el suero, se realizó un ensayo de placa en el clon C6/36
de células del mosquito Aedes albopictus [Hoke, 1990, supra].
Los matraces de cultivo celular se inocularon con diluciones de
plasma y adsorbieron a 35ºC durante 1-2 horas. Se
añadieron un medio de cubrimiento que consta de Solución Salina
Equilibrada de Hank y agarosa al 0,75%, hidrolizado de lactoalbúmina
al 5%, NaHCO_{3} 0,12 M, y antibióticos y todos los matraces se
incubaron a 35ºC. Después de 7 días, los matraces se tiñeron con
rojo neutro líquido al 5% durante 3-5 horas. Se
retiró el exceso de tinte y las placas se leyeron después de 18
horas.
Serología. Los ensayos de anticuerpo
incluyeron ELISA, HAI, y ensayos de neutralización de reducción de
placas (PRNT) realizados usando un virus del dengue del mismo
serotipo que la cepa de la vacuna que se está ensayando. La
detección de anticuerpos IgM anti-dengue se realizó
por modificación de un ELISA, donde valores >0,10 unidades DO se
consideraron positivos [Innis, 1989, supra]. El ensayo HAI se
realizó por la técnica convencional modificada para microvolúmenes
usando 4-8 unidades de antígenos individuales,
usando suero extraído con acetona para retirar los inhibidores
[Clarke y Casals, 1958, Am J Trop Med Hyg 7,
561-573]. Los ensayos PRNT se realizaron por el
procedimiento descrito por Russell y col. [Russell, 1967,
supra].
Análisis Estadístico. Se analizó la
relación entre el nivel de pase y la frecuencia y gravedad de la
reactogenicidad, para la vacuna dengue 2 S16803 (PDK 30, 40 y 50) y
para la vacuna dengue 3 CH53489 (PDK 10 y 20), usando el ensayo de
Cochran-Armitage para la tendencia y las
correlaciones de Spearman, respectivamente. Los síntomas y signos
analizados independientemente incluían la presencia o ausencia, y la
cantidad de días experimentando síntomas oculares, jaqueca,
malestar, mialgia, artralgia, sarpullido y fiebre (temperatura >
37,8ºC). La hipótesis nula, que un mayor nivel de PDK no estaba
asociado con menor reactogenicidad, se evaluó a una probabilidad
del cinco por ciento. Por inspección de los datos, se determinó el
nivel del pase óptimo para cada virus en base a las respuestas
clínicas e inmunológicas de cada voluntario. Se seleccionó el nivel
de pase que causaba efectos secundarios no inaceptable pero que
inmunizaba aproximadamente el 80% de los voluntarios para desarrollo
adicional por el U.S. Army Medical Research and Development
Command's Flavivirus Vaccine Steering Committee.
La infección por la vacuna se define como la
replicación del virus del dengue en el voluntario, detectada por la
presencia de anticuerpo neutralizante específico del tipo sérico o
anticuerpo IgM anti-dengue después de la
inmunización. La viremia no se incluyó como necesaria para el
diagnóstico de infección ya que nunca se detectaba en ausencia de
una respuesta de anticuerpos. Un fallo de la vacuna se define como
una respuesta clínica adversa inaceptable o fallo para desarrollar
anticuerpos IgM o PRNT convalecientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó la cepa del virus del dengue 2 S16803
producida a partir del pase 50 en células PDK en tres voluntarios.
Los voluntarios estuvieron bien, con temperaturas no orales >
38,0ºC. Dos de los 3 voluntarios tuvieron síntomas leves
transitorios de malestar, jaqueca, y síntomas oculares (dolor ocular
o fotofobia). Los hallazgos de laboratorio incluyeron elevaciones
leves de ALT (<2x normal) en 2 de 3, y leucopenia leve en 1 de 3
voluntarios. A causa del perfil de seguridad aceptable de la vacuna
PDK 50, se seleccionó el siguiente pase disponible inferior, PDK
30, para evaluación clínica.
La vacuna PDK 30, ensayada en 10 sujetos, estaba
subatenuada y producía síntomas compatibles con dengue de leve a
moderado. Cuatro voluntarios (40%) desarrollaron fiebre de bajo
grado, hasta Tmáx 38,5ºC, durante días 9 -14 después de la
vacunación (media de días 12). El ochenta por ciento desarrolló
sarpullido. La mayoría de los voluntarios experimentó síntomas
oculares (10/10), jaquecas (9/10), y malestar (9/10), mientras que
el 70 por ciento tubo \geq 1 síntoma grave de jaqueca, dolor
ocular y fotofobia, malestar, o mialgia. Tres voluntarios tuvieron
elevación leve de su nivel de alanina aminotransferasa (ALT), una
medida de la patología hepática.
\newpage
Como la vacuna PDK 30 se consideró demasiado
reactogénica para ensayo adicional en voluntarios, se produjo la
vacuna PDK 40 a partir de la semilla maestra. Dos de tres
voluntarios inoculados con PDK 40 desarrollaron un síndrome tipo
dengue leve 9-10 días después de la vacunación, con
temperaturas de bajo grado (<38,1ºC), sarpullido, mialgias, y
jaqueca. Los síntomas se resolvieron espontáneamente en varios días
sin discapacidad o requerimiento de medicación. Los síntomas
acompañantes eran una elevación imprevista en las enzimas hepáticas
séricas, hasta un nivel máximo de ALT de 199 IU/ml en uno (4 veces
lo normal) y 77 IU/ml de ALT máxima para el otro (elevación de 1,5
veces de lo normal). El tercer voluntario permaneció asintomático
pero también desarrolló elevaciones de factor dos en ALT (hasta un
máx. de 10^{2}). Todas las anormalidades de laboratorio se
resolvieron en días sin intervención, y se dio el alta a todos los
voluntarios en buena salud 21 días después de recibir la vacuna. A
causa de la frecuencia inusual de acontecimientos de hepatitis
asociados con la vacuna PDK 40, no se planea desarrollo adicional
para el producto.
La Tabla 5 resume la experiencia clínica inicial
con la vacuna del WRAIR dengue 2. La frecuencia disminuida de
signos de fiebre y sarpullido es evidente entre las vacunas de nivel
de pase 30 y 50. Además, hay una disminución en la temperatura oral
desde la Tmáx 38,5ºC hacia la normal con pase creciente, pero no hay
cambio en la duración de la fiebre más allá de un día. Para la
vacuna contra el dengue 2, la frecuencia y duración de los síntomas
oculares, sarpullido, jaqueca, malestar y mialgia se asociaron
significativamente con el nivel de pase.
\newpage
Vacuna Dengue 3 CH53489. Se administró
una vacuna contra el dengue 3 (CH53489, PDK 0) desarrollada en el
WRAIR a dos hombres voluntarios inmunes a la fiebre amarilla sanos
en forma de una inoculación subcutánea de 0,5 ml de 2 x 10^{4}
pfu de virus. El transcurso inmediato después de la inmunización fue
sin incidentes. En el día 6, ambos voluntarios estaban enfermos con
fiebre del dengue moderadamente grave caracterizada por fiebre
alta, escalofríos, mialgias, jaqueca, malestar, y un sarpullido
eritematoso difuso. Ambos voluntarios desarrollaron trombocitopenia
y leucopenia pero no hubo signos de fiebre hemorrágica. Después de
un periodo febril que duró cinco días, ambos hombre se recuperaron
rápidamente y estuvieron en el día 21. A causa de la enfermedad
grave experimentada por ambos sujetos, no se emprendió ensayo
adicional de este nivel de pase. Posteriormente, se prepararon los
niveles de pase PDK 10 y PDK 20 como vacunas candidatas.
La vacuna PDK 20 se dio a 6 voluntarios y
provocó reactogenicidad leve. Un sujeto experimentó una enfermedad
febril temprana el día 3 con fiebre transitoria (Tmáx. 38,2ºC),
faringitis, y linfadenopatía cervical. No se aisló virus del dengue
del suero del voluntario. Parece que este sujeto ha tenido una
enfermedad recurrente con fiebre, que no estaba directamente
relacionada con la vacunación. Cuatro de los 6 voluntarios
desarrollaron síntomas de dengue leves de corta duración sin
sarpullido; la artralgia, el dolor ocular, y la jaqueca fueron las
dolencias más frecuentes. Sin embargo, un voluntario tuvo síntomas
más graves de jaqueca, malestar, y dolor ocular durante tres días.
También desarrolló leucopenia y elevación sostenida de los niveles
de ALT; estas anormalidades de laboratorio se habían resuelto en el
seguimiento del día 31. Otro voluntario tuvo elevación leve y
reversible de ALT solo, a menos de 2x lo normal. Como la vacuna PDK
20 era segura con reactogenicidad marginalmente aceptable, se
ensayó el siguiente virus de vacuna de pase disponible más bajo (PDK
10).
El virus PDK 10 demostró ser demasiado
reactogénica en los destinatarios. Uno de los tres voluntarios
desarrolló fiebre de bajo grado en los días 10 y 11 (Tmáx. 38,3ºC),
y un sarpullido rojizo durante 13 días. Otro voluntario desarrolló
pruritus asociada con urticaria creciente y decreciente en los días
6 a 9 después de la vacunación, y ganglios linfáticos cervical y
axilar sensibles. Posteriormente desarrolló un sarpullido
maculopapular con malestar, jaqueca, y mialgia en los días
10-12. Este voluntario puede haber tenido una
reacción alérgica idiosincrásica a la vacuna, seguido de una
enfermedad tipo dengue típica. Estos dos voluntarios también
tuvieron anormalidades de laboratorio de leucopenia y elevación de
los niveles de ALT hasta <2x lo normal, que estuvieron resueltos
en el seguimiento del día 31.
La Tabla 6 resume la respuesta a las vacunas
dengue 3 CH53489. Aunque hubo una tendencia a signos y síntomas
menos frecuentes y de duración más corta con el pase, ningún pase
alcanzó significado estadístico en ningún análisis.
Vacuna Dengue 4 341750. Ocho voluntarios
recibieron 10^{5} PFU de vacuna PDK 20 [Hoke, 1990 supra].
Cinco voluntarios desarrollaron un sarpullido palidecido, macular
apenas apreciable y elevación mínima de la temperatura (máx.
38,1ºC). También se desarrollaron viremia y respuesta de anticuerpos
en estos cinco voluntarios (63%).
Se preparó una nueva vacuna candidata
DEN-4 341750 a partir del pase 15 en PDK, previendo
que el pase inferior podría ser más infectivo. Tres voluntarios
recibieron esta vacuna y dos experimentaron síntomas mínimos. El
tercer voluntario enfermó bruscamente en el día 8 con fiebre,
hinchazón edematosa de la cara y las extremidades, lasitud severa,
sarpullido, dolor ocular, fotofobia, y artralgias. Durante los
siguientes tres días, persistió la fiebre con Tmáx. de 39,6ºC, pero
los signos y síntomas se resolvieron espontáneamente. A causa de
esta grave reacción adversa a la vacunación, se terminó el uso
adicional de la vacuna PDK-15 y se eligió
PDK-20 para evaluación adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 7 describe la viremia y las respuestas
inmunes con las vacunas contra el dengue del WRAIR. La infectividad
de las vacunas individuales se resume a continuación.
Vacuna Dengue 2 S16803. Ningún
destinatario de la vacuna PDK 50 desarrolló viremia, aunque dos de
los 3 desarrollaron anticuerpo neutralizante de bajo título en el
día 60. Estos hallazgos sugirieron que el virus de vacuna era de
infectividad disminuida para seres humanos. Por el contrario, dos de
los 3 vacunados con dengue 2 PDK 40 tuvieron viremia demostrable, y
todos desarrollaron anticuerpos de elevado título después de la
vacunación. Como se esperaba, la infectividad de la vacuna dengue 2
PDK 30 fue la más elevada: se detectó viremia en los 10 voluntarios
y todos los sujetos ser seroconvirtieron con títulos de anticuerpos
neutralizantes de >1:60 en el día 60.
Vacuna Dengue 3 CH53489. Se recuperó el
virus del dengue-3 que retiene sensibilidad a la
temperatura y fenotipo de placa pequeña del virus de vacuna durante
6 y 7 días en los 2 destinatarios de la vacuna dengue 3 PDK 0
inmunes a fiebre amarilla. Posteriormente, se midieron los
anticuerpos PRNT50 y de inhibición de hemaglutinación (HAI) de
título elevado con una reactividad cruzada tipo infección secundaria
en el suero recogido en los días 30 y 60 de ambos voluntarios. La
infectividad fue similar en sujetos que recibieron la vacuna
atenuada dengue 3 PDK 10: 2 de los 3 desarrollaron viremia y la
vacunación indujo anticuerpos neutralizantes en todos. En
contraste, 2 de los 6 vacunados con dengue 3 PDK 20 tuvieron viremia
detectable y tres voluntarios se seroconvirtieron posteriormente,
reflejando la infectividad disminuida.
\newpage
Vacuna Dengue 4 341750. Ocho voluntarios
recibieron 10^{5} PFU de la vacuna PDK 20, y desarrollaron
viremia y respuesta de anticuerpos en cinco (63%). La vacuna
preparada a partir de un pase inferior de esta candidata, PDK 15,
fue más infectiva. Se aisló el virus de un único voluntario, en los
días 8 y 10 después de la vacunación, con un título máximo de 15
pfu/ml. Este voluntario desarrolló posteriormente un título de
anticuerpo neutralizante de 450 con una respuesta HAI secundaria, y
se descubrió que había estado expuesto previamente al virus de la
encefalitis de St. Louis (título PRNT 1:20 antes de la vacunación).
Los dos voluntarios sin viremia detectable desarrollaron títulos
neutralizantes de 1:10 y 1:40 en el día 30 después de la
vacunación.
\vskip1.000000\baselineskip
El programa ampliado de ensayo de seguridad de
vacunas atenuadas PDK del WRAIR se muestra en la Tabla 8, que
enumera las características principales de las vacunas para cada
serotipo. El pase creciente en PDK produjo un valor medio de
enfermedad decreciente, que evalúa la duración y cantidad de
síntomas por voluntario. Además, la elevación del pase en PDK
también se asoció con la media disminuida de días de viremia, con la
excepción de las vacunas contra el dengue 4. De las vacunas contra
el dengue 2, 3, y 4 ensayadas, solamente un nivel de pase se
consideró seguro y aceptablemente reactogénico, y adecuado para
estudio clínico ampliado: dengue 2 PDK 50, dengue 3 PDK 20, y
dengue 4 PDK 20. Sin embargo, el porcentaje de destinatarios
infectados disminuyó con un nivel de pase en PDK creciente. La
seroconversión, definida como el porcentaje con un título de
anticuerpo neutralizante \geq 1:10 disminuyó de forma similar
dentro de amplios intervalos de confianza.
El WRAIR tiene una implicación desde hace tiempo
en el desarrollo de vacunas vivas atenuadas contra el dengue. Los
programas de vacuna contra el dengue tanto del WRAIR como de Mahidol
han desarrollado varias vacunas vivas por atenuación a través de
varios pases (cultivo repetido en cultivo tisular) en células de
riñón de perro (PDK). Los resultados del ensayo piloto en
cantidades pequeñas de voluntarios establecieron la seguridad de
las vacunas candidatas del WRAIR. Ningún voluntario entre los 65
destinatarios requirió tratamiento urgente de una lesión grave
sostenida. Tres voluntarios sufrieron reacciones idiosincrásicas
transitorias asociadas con la vacunación contra el dengue, que
provocaron la retirada de las vacunas que recibieron del desarrollo
clínico adicional. La infección experimental con vacunas
subatenuadas, aunque incómoda, fue tolerable.
La experiencia clínica mostró que el pase
creciente en PDK de virus de vacuna aumentaba la atenuación para
los voluntarios. Este efecto se observa mejor con los virus del
dengue 1 y dengue 3, donde los virus precursores sin pases
provocaban fiebre del dengue no modificada y los posteriores 20
pases en PDK reactogenicidad aceptable. Sin embargo, el aumento de
pase en PDK disminuía la infectividad de los virus de vacuna,
provocando una inmunogenicidad disminuida. Además, la viremia
disminuida con virus de vacuna en seres humanos parece
correlacionarse con la de monos rhesus (con la excepción de dengue
4 PDK 15). Estos hallazgos sugieren que la capacidad de infección
de una vacuna atenuada contra el virus del dengue en voluntarios
demostró ser equivalente a la inmunogenicidad. La relación entre el
nivel de pase y la reactogenicidad debe interpretarse con cuidado,
porque sujetos que experimentaron un síntoma tenían probabilidad de
experimentar varios síntomas. Como estos procedimientos analíticos
suponen independencia de estos síntomas, las interpretaciones
basadas en valores p independientes pueden ser poco fundadas.
Además, se cree que el sarpullido mostraba una fuerte asociación con
el nivel de pase (independiente p = 0,009 para la presencia, p =
0,01 para la duración). Esto está reforzado por una ausencia de
correlación significativa entre el sarpullido y otros síntomas,
para la vacuna contra el dengue 2 ó 3 (ensayos de Spearman).
Solamente las vacunas con perfiles de seguridad
aceptables se seleccionaron para ensayo clínico ampliado: dengue 1
45AZ5 PDK 20, dengue 2 S16803 PDK 50, dengue 3 CH53489 PDK 20, y
dengue 4 341750 PDK 20. A causa de los amplios intervalos de
confianza en la seroconversión debido a las pequeñas cantidades de
voluntarios, los estudios posteriores buscaban aumentar la cantidad
de destinatarios de cada una de las cuatro vacunas seleccionadas.
Además, se buscarán ensayos adicionales para determinar si la
inmunogenicidad de estas vacunas atenuadas puede reforzarse a
través de la administración de dos dosis en lugar de la única dosis
usada para estos estudios.
\vskip1.000000\baselineskip
Diseño del Estudio: Los objetivos de esto eran
evaluar la seguridad e inmunogenicidad de las cuatro vacunas
monovalentes dadas en forma de una única dosis y después por
programas de vacunación de dos dosis. Posteriormente se evaluó la
seguridad e inmunogenicidad de la vacuna tetravalente de
combinación. Los sujetos se reclutaron por separado de dos sitios,
University of Mariland en Baltimore y el WRAIR, Washington DC. El
primer grupo de 22 sujetos se dividió en 4 grupos de 4 ó 5 personas
que recibieron, cada una, una dosis única de virus del dengue
monovalente o virus de la fiebre amarilla 17D (Connaught). Los
vacunados de fiebre amarilla 17D sirvieron como control y punto de
referencia para la reactogenicidad. Otros 31 sujetos se dividieron
en 4 grupos de 7-8 personas a las que se dieron dos
dosis de una vacuna monovalente, la mitad en el mes 1 y la otra
mitad en el mes 3. Finalmente a 10 voluntarios se les dieron 2 ó 3
dosis de la vacuna tetravalente. Los primeros 4 destinatarios de la
tetravalente recibieron vacunación en el mes 0 y 1. Los 6 últimos
destinatarios de la tetravalente se vacunaron en los meses 0, 1 y
4. A todos los sujetos excepto los 10 destinatarios de vacuna
tetravalente se les dio un serotipo de vacuna de un modo aleatorio y
doble ciego.
Sujetos: Los sujetos eran adultos sanos normales
con edades de 18-50. Todos los sujetos eran
seronegativos para hepatitis B, C y VIH. Todos los sujetos eran
seronegativos para dengue 1-4, JE, SLE, e YF por
ensayo de inhibición de hemaglutinación antes de entrar en el
estudio.
Vacunas: Las cuatro vacunas candidatas de
serotipo se aislaron originalmente de seres humanos con enfermedad
clínica. Cada una se modificó después por pases seriados en células
de riñón de perro primarias (PDK) y después en células pulmonares
de mono rhesus fetal como se ha descrito anteriormente. Estas
candidatas se seleccionaron en base a pequeños estudios piloto
previos en voluntarios humanos. Cada vacuna monovalente liofilizada
se reconstituyó con agua estéril y se dio en un volumen de 0,5 cc.
Las dosis de los serotipos 1-4 fueron 10^{6},
10^{6}, 10^{5} y 10^{5} pfu de dengue 1, 2, 3, y 4
respectivamente. La dosis de vacuna tetravalente se preparó
mezclando 0,25 cc de cada vacuna monovalente reconstituida y se dio
en un volumen final de 1 cc. La dosis de la vacuna tetravalente fue
1,1-2,8 x 10^{6} pfu. Todas las vacunaciones se
hicieron por vía subcutánea en el antebrazo.
Seguridad clínica: Se evaluaron las reacciones a
las vacunaciones por combinación de las agendas de síntomas diarias
y las evaluaciones clínicas periódicas durante las 3 semanas después
de cada vacunación. Los sujetos se alojaron en cuatros de estudio
para la observación cercana durante 5-7 días pasado
el periodo de incubación de 1 semana después de la vacunación, un
periodo de tiempo durante el cual eran más proclames las reacciones
y la viremia. Los sujetos se examinaron y se les preguntó
específicamente por los síntomas de febrilidad, escalofríos,
jaqueca, dolor retro-orbital, mialgia, artralgia,
sarpullido y otros. Cada síntoma se clasificó en una escala de 0
(ninguno), 1 (no afectaba a la actividad normal; no requería
medicaciones), 2 (requería medicación o cambio en la actividad), o
3 (requería reposo en capa o no aliviado por la medicación). Los
síntomas más comunes se agruparon en cuatro categorías. Estas
categorías eran: 1) fiebre subjetiva y escalofríos, 2) jaqueca y
dolor retro-orbital, 3) mialgia y artralgia y 4)
dolencias gastrointestinales que incluían náuseas, vómitos y dolor
abdominal. Se calculó un índice de síntomas de cada categoría por el
producto del mayor grado del síntoma para cada día y la duración
del síntoma expresada en días. Si el síntoma sucedía en total
durante 24 horas se le asignaba la duración de 1 día. El Índice de
Reactogenicidad (RI) es simplemente la suma de los índices de
sintamos para cada categoría. El RI resumen las reacciones de la
vacuna de cada sujeto. Los índices de la categoría de síntomas y el
RI permiten la comparación semi-cuantitativa de las
reacciones a la vacuna entre sujetos y serotipos de vacuna.
Se controló a los sujetos para las toxicidades
hematológicas y hepáticas por CBC seriada, recuentos de plaquetas,
AST y ALT durante el estudio.
Los acontecimientos adversos graves se
definieron como enfermedad grave que carece de otros causas
probables, fiebre >38,5ºC continuamente durante más de 24 horas
o Tmáx. >38,5ºC durante 3 días consecutivos o una única
temperatura oral >104ºC, neutropenia de <1.000/ml o
trombocitopenia de <90.000/ ml en 2 determinaciones
consecutivas, o ALT o AST sérico >5 veces lo normal.
Inmunogenicidad: Se hizo el procedimiento de
ensayo de inhibición de hemaglutinación por el procedimiento de
Clarke y Cassals, 1958 (Am J Trop Hyg 7, 561-573).
Se midieron las IgM e IgG contra el dengue por ELISA de captura en
todos menos los últimos 6 sujetos tetravalentes. Se midieron los
anticuerpos neutralizantes contra el dengue y la fiebre amarilla en
el Día 0 y 30 después de cada vacunación por el ensayo de
neutralización de reducción de placas. La determinación del
criterio de valoración del estudio fue la medición de cualquier
anticuerpo neutralizante 30 días después de la última vacunación. La
seroconversión de anticuerpos neutralizantes se define como una
reducción en las placas del 50% a una dilución sérica mínima de 1:5.
La viremia se determinó en los sueros de los días
7-14 después de la vacunación inicial y la segunda
vacunación. El procedimiento usado para el aislamiento de virus fue
un procedimiento de placa retardada adaptado de Yuill, 1968 (Am J
Trop Med Hyg 17, 441-448) usando células
LLC-MK_{2} o C6/36 para la amplificación y Vero
para la formación de placas.
Se combinaron los datos de los estudios de una
dosis y dos dosis para esta memoria. Las características
consideradas se muestran en la Tabla 9. A un total de cincuenta y
nueve sujetos normales se les dieron vacunas contra el virus del
dengue; cuarenta y nueve recibieron artículos de ensayo monovalentes
y diez recibieron vacuna tetravalente. Cuatro recibieron vacunación
autorizada contra la fiebre amarilla 17D (Connaught).
\vskip1.000000\baselineskip
Reacción local. Diecinueve de 59 (32%)
destinatarios de la vacuna contra el dengue presentaron dolor leve
del brazo en el sitio de inyección. De éstos 7 recibieron
DEN-1, 4 DEN-2, 1
DEN-3, 1 DEN-4 y 5 recibieron la
tetravalente. Solamente 5 presentaban algo de dolor en el sitio de
inyección después de 24 horas. Ninguno comprometió el uso del
brazo.
Reacciones sistémicas. El 20% de los 59
destinatarios del dengue no presentaron síntomas en absoluto con su
primera vacunación mientras que el 70% de los sujetos fueron
asintomáticos con la segunda vacunación. Los cuatro sujetos que
recibieron una tercera dosis no presentaron síntomas asociados con
la misma. Las reacciones más habitualmente presentadas de la
vacunación contra el dengue fueron jaqueca y mialgias. Sucedieron en
gravedad variada. La Figura 1 muestra la existencia de síntomas de
> Grado 1 a partir de la primera vacunación causando cambio en
las actividades diarias o tomando medicaciones para su alivio.
Después de la primera dosis de vacuna, cinco (8%) sujetos, un
serotipo 1, un serotipo 4, y tres tetravalentes, presentaron un
síntoma de grado de gravedad 3 de escalofríos, mialgia, jaqueca o
náuseas durante menos de 1 día de duración. Ningún sujeto presentó
ningún síntoma de grado 3 con la revacunación.
El RI varió de 0 a 35. La Tabla 10 compara la
reactogenicidad presentada de cada vacuna. Las vacunas
DEN-1 monovalente y tetravalente se asociaron con
más reactogenicidad. La segunda o tercera dosis de todas las vacunas
contra el dengue causaron uniformemente pocas reacciones, incluso
en aquellos sujetos con síntomas de moderados a graves a partir de
la vacunación inicial.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 2 muestra la distribución de
frecuencia de RI por serotipo. Ocho sujetos (14%) desarrollaron
fiebre (>38ºC (100,4ºF)). De los ocho 4 recibieron
DEN-1, 1 DEN-2, 1
DEN-3 y 2 tetravalente. La fiebre más elevada y más
larga sucedió en un destinatario de DEN-1 con Tmáx.
de 39,61ºC (103,3ºF) y fiebre de 3 días. Solamente un sujeto
diferente, que también recibió DEN-1, tuvo más de un
día de fiebre. Siete de los ocho episodios de fiebre sucedieron
después de la primera vacunación.
Dieciséis sujetos (27%) desarrollaron un
sarpullido generalizado, que implicaba el tronco y las extremidades
desde su primera vacunación. El sarpullido habitualmente era
eritematoso, macular papular y levemente prurítico. Solamente 7 de
los 16 con sarpullido generalizado tuvieron fiebre. De los 16
sujetos con sarpullido cinco recibieron DEN-1, dos
DEN-2, uno DEN-3, tres
DEN-4 y cinco tetravalente. El sarpullido
típicamente llegó a ser apreciable en el día 8-10
después de la vacunación y se resolvió en 3-4 días.
Ningún sujeto desarrolló ninguna petequia, púrpura o cicatrización.
Ningún sujeto desarrolló sarpullido a partir de la revacunación.
Los síntomas gastrointestinales fueron
relativamente comunes, sucediendo en un tercio de los sujetos, pero
fueron leves y breves, durando menos de 24 horas. Un destinatario de
DEN-4 desarrolló náuseas graves asociadas con dolor
abdominal en retortijones durante un día.
Seis sujetos (10%), 5 destinatarios de dengue y
1 de fiebre amarilla 17D, desarrollaron neutropenia transitoria con
un recuento absoluto de neutrófilos menor de 1000/ml. El inferior
fue 288 en un sujeto DEN-1. La neutropenia
típicamente se resuelve en 2-3 días. Ningún sujeto
desarrolló trombocitopenia. No hubo elevaciones clínicamente
significativas en AST o ALT.
Como se esperaba de este grupo de adultos no
inmunes que recibieron su primera exposición al virus del dengue
ninguno desarrolló ninguna evidencia clínica de fiebre hemorrágica
del dengue.
Se detectó viremia en 10 sujetos (17%), uno
recibió DEN-2, cuatro DEN-3, uno
DEN-4 y cuatro tetravalente. No se detectó viremia
DEN-1. El(los) serotipo(s) del virus
aislado de los sujetos tetravalentes aún tiene(n) que
identificarse. Todas las viremias detectadas sucedieron después de
la primera dosis de virus. Curiosamente sucedió fiebre con viremia
solamente en 3 destinatarios de tetravalente. Todos los sujetos
virémicos desarrollaron anticuerpos neutralizantes. Uno no
desarrolló respuesta IgM o IgG incluso con viremia.
La Tabla 11 resume las respuestas de anticuerpos
contra la vacunación monovalente. Se detectaron anticuerpos
neutralizantes más frecuentemente que los IgM e IgG. No se detectó
seroconversión por IgM o IgG que tampoco se encontró por el
PRNT_{50} de dilución sérica 1:10. Cuando estaban presentes, las
IgM eran positivas en el 41% en 14 días después de la vacunación,
en el 17% en 21 días y el 42% en 30 días. La IgM típicamente era
máxima en el día 30 después de la primera vacunación. Hubo una única
excepción en un destinatario de tetravalente cuya IgM era máxima
tres días después de su segunda vacunación. Las IgM pueden persistir
durante más de 3 meses. Los índices de seroconversión por
anticuerpos neutralizantes fueron del 100%, 92%, 54% y 58% para los
serotipos monovalentes 1, 2, 3 y 4 respectivamente. Cuando estaba
presente, el anticuerpo neutralizante era típicamente detectable en
el día 30 después de la primera vacunación. No se evaluaron momentos
puntuales entre el día 0 y 30 para el anticuerpo neutralizante. La
segunda dosis de vacuna reforzó el GMT de DEN-2 en
más de cuatro veces, que no se observó con los otros serotipos. Dos
sujetos DEN-3 se seroconvirtieron después de una
segunda dosis de vacuna, una a 1 mes y la otra a 3 meses. No habían
desarrollado anticuerpo neutralizante después de una dosis. Es
interesante observar que los patrones de IgM/IgG de estos dos
sujetos sugieren una respuesta secundaria después de su segunda
dosis que sugiere que estaban inmunológicamente sensibilizados por
la primera dosis.
A pesar del ensayo de inhibición de
hemaglutinación negativo previo a la entrada para dengue, SLE, JE e
YF, 5 de 53 (9%) sujetos ensayados desarrollaron un patrón de
respuesta de anticuerpos secundario con una proporción IgM a IgG de
<1,8. Los 5 eran negativos para anticuerpo neutralizante contra
el dengue homólogo antes de la vacunación. Esto sugiere una
exposición oculta previa a flavivirus. No se halló diferencia
significativa entre los RI medios de respuestas de anticuerpos
secundarias y primarias (9,6 vs 5,8, p=0,19).
Hubo 12 sujetos monovalentes que no
desarrollaron IgM/IgG o anticuerpo neutralizante. Uno recibió
DEN-2, seis DEN-3 y cinco
DEN-4. El índice de reactogenicidad medio para este
grupo sin respuesta de anticuerpos era menor de 1 que era
significativamente diferente del RI medio de repuestas de anticuerpo
neutralizante de tipo 2,3 y 4. (0,9 vs 4,9, p<0,003).
Estos estudios incluyeron 25 sujetos negros y 31
caucásicos. No hubo diferencia significativa entre los RI medios de
estos dos grupos raciales. Esto es de interés porque hay algunas
evidencias epidemiológicas que sugieren gravedad más leve de la
enfermedad del dengue entre los negros.
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La Tabla 12 muestra los resultados de
seroconversión por PRNT a partir de diez sujetos de vacuna
tetravalente. Los 4 primeros sujetos recibieron dos vacunaciones en
el mes 0 y 1. Un sujeto perdió su segunda vacunación en el día 30 y
se vacunó en el día 60. Seis sujetos más fueron vacunados en el mes
0 y 1 y si la respuesta era incompleta se administraba una tercera
vacunación en el mes 4. Dos sujetos desarrollaron anticuerpo
neutralizante contra los 4 serotipos después de una única dosis.
Otros dos destinatarios de tetravalente se seroconvirtieron a los 4
serotipos después de la vacunación en 4 meses. Otros dos
desarrollaron respuestas trivalentes. Una segunda dosis de la
tetravalente dada en los meses 1 ó 2 no aumentó significativamente
las seroconversiones. Los índices de seroconversión global en estos
10 sujetos tetravalentes fueron del 100%, 80%, 80% y 40% para
DEN-1, 2, 3 y 4 respectivamente.
Se diseñó un estudio para evaluar la interacción
de cada componente de serotipo en la vacuna tetravalente por un
diseño factorial 2^{4} de 2 niveles.
A cincuenta y cuatro sujetos se les dieron 15
permutaciones de 2 niveles de dosis de cada serotipo. Los resultados
se muestran en la Figura 3. H, dosis elevada, indica la vacuna sin
diluir, que varía entre 10^{5}-10^{6} pfu/ml;
L, dosis baja, indica una dilución 1:30 de la vacuna sin diluir que
produce aproximadamente 10^{3,5}-10^{4,5}
pfu/ml.
A seis sujetos se les dio la vacuna tetravalente
de dosis completa en el mes 0 y 1. Si el sujeto no producía una
respuesta de anticuerpo neutralizante tetravalente, se daba una
tercera dosis a los 4 meses. Los resultados se muestran en la
Figura 4.
A cuatro sujetos humanos se les dio vacuna
tetravalente de dosis completa mezclada en jeringa a tiempo 0 y 1
mes. Los criterios de valoración fuero seguridad clínica y
anticuerpo neutralizante 1 mes después de la segunda vacunación.
Las respuestas de células T se midieron en los primeros 4 sujetos.
Los resultados se muestran en la Figura 5.
Los resultados indican que la vacuna
tetravalente (16 formulaciones) se hallaba segura en 64 voluntarios
americanos no inmunes. La reactogenicidad variaba. Cuatro
formulaciones provocaban respuestas de anticuerpo neutralizante
trivalente o tetravalente en todos los voluntarios. De acuerdo con
la experiencia monovalente, una segunda dosis de vacuna
tetravalente a 1 mes no inducía reactogenicidad significativa pero
tampoco aumentaba las respuestas de anticuerpo neutralizante. La
titulación final de respuestas de anticuerpo neutralizante está en
progreso. Las respuestas de interferón gamma de memoria en células
T pueden medirse en ausencia de anticuerpo neutralizante.
Intervalos de dosificación \geq4 meses pueden provocar
seroconversión tetravalente mejorada.
Estas vacunas parecen atenuadas en seres humanos
cuando se comparan con las descripciones históricas de infecciones
experimentales con dengue de tipo silvestre. (Simmons y col., 1931,
Manila Bureau of Printing) Se usó una escala numérica basada en la
duración y la gravedad de los síntomas
auto-presentados para cuantificar la
reactogenicidad. Dicho procedimiento tiende a
sobre-estimar las reacciones relacionadas con la
vacuna. De forma ideal debe validarse con casos de infección
natural por dengue. Sin embargo, el RI imprecise permitió comparar
razonablemente los síntomas entre individuos y grupos. Los
resultados del ensayo de las vacunas monovalentes mostraron que el
grado de atenuación era variable entre las cuatro vacunas candidatas
contra el dengue. 45AZ5 PDK20 es la menos atenuada, de título más
elevado y produjo seroconversión uniforme. La candidata
DEN-2, S16803 PDK50, provocó de forma similar casi
un 100% de seroconversión con un perfil de reactogenicidad benigno.
La Den-3 y Den-4 tuvieron perfiles
de baja reactogenicidad pero los índices de seroconversión fueron
solamente del 50-60%. Debe apreciarse que las dosis
de tipo 3 y 4, las cepas menos inmunogénicas, son diez veces menores
que las de los tipos 1 y 2.
La segunda dosis de virus se asoció con
reacciones remarcadamente pequeñas. Sin embargo, el beneficio de una
segunda dosis de vacuna monovalente en el mes 1 ó 3 es pequeño.
Den-1 y 2 ya eran casi uniformemente inmunogénicas
de modo que una dosis adicional puede ser superflua. No obstante el
GMT de Den-2 se reforzó en cuatro veces. Esto puede
evidenciar la replicación viral de bajo nivel después de la segunda
dosis o la dosis contiene suficiente masa antigénica para provocar
una respuesta más reforzada. Este patrón de respuesta de anticuerpo
neutralizante también se ha observado con la segunda vacunación con
17D YF. (Wisseman, 1962, Am J Trop Med Hyg 11,
570-575) La primera dosis de Den-3
puede haber sensibilizado a los dos sujetos monovalentes que se
seroconvirtieron después de la segunda dosis con un patrón de
respuesta de anticuerpos secundaria. Esto sugiere que el presente
ensayo de anticuerpo neutralizante puede no ser suficientemente
sensible para detectar la respuesta inmune apropiada contra las
vacunas candidatas de tipo 3. La segunda dosis no añadió ninguna
nueva seroconversión a tipo 4. No hubo beneficio adicional obvio en
dar una segunda dosis de DEN-1 o
DEN-4 monovalente con la dosis y programa
ensayados.
Doce sujetos monovalentes que no produjeron
respuesta de anticuerpo neutralizante contra las vacunas
monovalentes tampoco respondieron con IgM o IgG medible contra el
dengue. Todos estos sujetos sin respuesta recibieron virus viable
del mismo vial que se replicaba claramente en otros sujetos. No
desarrollaron reacciones a las vacunaciones. Por tanto, por todos
los indicios no hubo evidencias de replicación viral en estos
sujetos. El mecanismo para esta ausencia de respuesta es
desconocido. Puede ser el resultado de la ausencia de sustrato del
huésped necesario para la infección o una inmunidad innata
eficaz.
El valor de dosificación múltiple puede ser más
evidente en vacunas atenuadas vivas de combinación como una
estrategia para sortear la interferencia viral. Aquí la dosis de
cada componente así como el intervalo de dosificación pueden ser
importantes. La interferencia y la potenciación pueden suceder
potencialmente cuando se dan virus del dengue en combinación.
Cuatro sujetos desarrollaron anticuerpo neutralizante contra los 4
serotipos, dos después de la primera dosis, y dos después de una
tercera dosis a los 4 meses. Cuatro de cinco voluntarios que
recibieron revacunación a los 4 meses se seroconvirtieron a 3 o más
serotipos. La explicación de esta diferencia puede ser que un mes
después de la vacunación hay suficientes anticuerpos neutralizantes
de reactividad cruzada para suprimir la replicación de virus
heterotípicos en la vacuna. Sabin descubrió que existía dicha
protección cruzada transitoria que dura hasta 3 meses cuando a los
sujetos humanos se les daba un virus de serotipo. (Sabin, 1959,
Viral and Rickettsial Infections of Man. Philadelphia: JB Lippincott
Company). Los futuros estudios tetravalentes usarán un programa de
vacunación de 0,6 meses.
La mala inmunogenicidad de DEN-3
y 4 puede ser que a 10^{5} pfu/ml las dosis de
Den-3 y Den-4 están en desventaja
replicativa en comparación con DEN-1 y 2, ambas
cuales están a 10^{6} pfu en la formulación tetravalente. Se
están explorando estrategias de producción alternativa para aumentar
los títulos de DEN-3 y DEN-4.
Sin detectar viremia de los 4 virus en los
sujetos con respuesta tetravalente no se puede estar seguro de que
la presencia de anticuerpo neutralizante implique necesariamente la
replicación de los 4 serotipos. Los anticuerpos neutralizantes
medidos pueden ser de reactividad cruzada y de baja avidez. Este
problema debe abordarse examinando la persistencia a largo plazo de
anticuerpo contra cada serotipo. Sería útil un ensayo de
RT-PCR sensible y específico de serotipo para
determinar viremia polivalente como evidencia de replicación
viral.
Solamente dos de los vacunados con tetravalente
desarrollaron anticuerpo neutralizante contra los 4 serotipos
después de una vacunación. Dicha respuesta incompleta contra la
vacuna tetravalente genera preguntas acerca del riesgo de fiebre
hemorrágica del dengue en el establecimiento de exposición a
serotipos heterólogos virulentos. Si la potenciación dependiente de
anticuerpo es el mecanismo patofisiológico para DHF puede estar
presente el riesgo incluso cuando se producen anticuerpos de los
cuatro serotipos por vacunación pero uno o más anticuerpos de
serotipo disminuyen diferencialmente por debajo del umbral
neutralizante. A continuación se informa de que la respuesta de
células T TH1 puede medirse en estos vacunados con tetravalente
incluso en ausencia de anticuerpo neutralizante. ¿Sería suficiente
para proteger? Estas preguntas solamente pueden contestarse por
ensayo de campo a largo plazo de vacunas tetravalentes en áreas
endémicas.
En conclusión, los presentes resultados indican
que los cuatro serotipos son reactogénicos de forma variable como
vacunas monovalentes con tipo 1 más que los serotipos 2, 3 y 4. Los
serotipos 1 y 2 producían anticuerpo neutralizante en >90%
mientras que los serotipos 3 y 4 eran menos inmunogénicos. La
combinación tetravalente es segura, razonablemente bien tolerada e
inducía anticuerpo neutralizante contra los 4 serotipos en cuatro
de diez sujetos. Dos dosis de vacuna tetravalente no mejoraban los
índices de seroconversión a los intervalos de dosificación de uno o
dos meses ensayados. Un intervalo de dosificación mayor de más de 4
meses puede mejorar el índice de seroconversión.
Sujetos. Treinta y cinco voluntarios
adultos sanos con edades de 18-50 (21 hombres, 14
mujeres) participaron en un ensayo clínico en fase I, realizado por
el Walter Reed Army Institute of Research, que implica vacunas
candidatas contra el virus del dengue. Los participantes se
seleccionaron entre un grupo de voluntarios en base a la ausencia
de anticuerpos anti-flavivirus en la circulación.
Criterios de selección adicionales fueron el estado VIH negativo y
la buena salud en base a un examen físico y las respuestas a un
cuestionario.
Grupos de vacuna. Treinta individuos
recibieron aleatoriamente dos dosis de una vacuna viva atenuada
monovalente; cuatro recibieron dos dosis de una vacuna viva
atenuada tetravalente. Un destinatario de la monovalente (voluntario
ID 1) abandonó el estudio después de recibir solamente la primera
dosis. Antes de la vacunación, no había anticuerpo sérico inhibidor
de la hemaglutinación detectable contra el virus del dengue tipos
1-4, virus de la encefalitis japonesa, virus de la
encefalitis de St. Louis, o virus de la fiebre amarilla en ninguno
de los voluntarios. Cada dosis se dio en forma de una inyección
subcutánea de 0,5 ml de virus sin diluir.
Recogida de PBMC. Se recogió sangre
periférica (8 ml) de cada voluntario por venopunción en Tubos de
Preparación Celular Vacutainer (CPT)
[Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ] en el día 0 y
en cinco momentos puntuales después de la primera dosis pero antes
de la segunda dosis (días 3, 7, 9, 14, 28/30/31/60 ó 91). También
se recogió sangre en el día de la segunda dosis y en cuatro momentos
puntuales después de ello (días 3, 7, 9 y 14 después de la segunda
dosis). El tiempo de administración de la segunda dosis, dependiendo
del voluntario, por tanto fue aproximadamente de
1-3 meses después de la primera dosis. Sucedió una
variación en los tiempos de recogida de aproximadamente 1 mes
debido a la variación de la programación de los voluntarios. Las
células se separaron de la sangre completa por centrifugación a
1000 xg durante 30 minutos. Se recogieron las PBMC (la capa celular
por encima del gel en el tubo CPT) y se lavaron dos veces en
solución salina equilibrada de Hank (Life Technologies, Rockville,
MD) con centrifugaciones a 500 xg. Las PBMC aisladas se
resuspendieron en 4 ml (por tubo CPT) de Medio de Congelación
Celular/DMSO (Sigma, St. Louis, MO) y se congelaron en alícuotas de
1 ml durante una noche a -70ºC. Después las PBMC se transfirieron a
nitrógeno líquido en fase de vapor para almacenamiento a largo
plazo.
Virus de vacuna. Se usaron las siguientes
cepas de virus vivo atenuado del dengue descritas anteriormente en
las vacunas monovalentes: 45AZ5PDK20 (DEN 1), S16803PDK50 (DEN 2),
CH53489 (DEN 3), 341750PDK20 (DEN 4). La vacuna tetravalente era
una mezcla igualada de estas cuatro cepas.
Virus de cultivo celular. Se usaron los
siguientes virus del dengue, propagados en células Vero, para la
estimulación de PBMC en cultivo: Westpac 74 (DEN 1), S16803 (DEN
2), CH53489 (DEN 3), y TVP360 (DEN 4). Los cuatro serotipos los
proporcionó el Dr. Robert Putnak en alícuotas de 1 ml y se
almacenaron a -70ºC hasta su uso. Los títulos virales variaban de
0,30-2,4 x 10^{6} pfu/ml.
Cultivo a granel de PBMC y estimulación con
virus vivo. Se retiraron viales congelados de PBMC del
almacenamiento en nitrógeno líquido y se descongelaron suavemente a
37ºC. Las PBMC se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 (Life
Technologies, Rockville, MD) y se suspendieron en medio completo que
contenía suero AB masculino humano al 10% (Sigma) más suplementos
[penicilina (100 U/ml)-estreptomicina (0,1
mg/ml)-fungizona (0,25 mg/ml) [Sigma],
L-glutamina 2 mM (Life Technologies), y
2-mercaptoetanol 0,5 mM (Sigma)]. Las células se
suspendieron a una concentración de 2,5 millones de células/ml.
Algunos ensayos requirieron 3,25 millones de células/ml. Las PBMC
(100 ml) se añadieron a pocillos individuales de una placa con fondo
en V de 96 pocillos (Costar, Acton, MA). Se añadió un volumen igual
de virus del dengue 1, 2, 3 ó 4 diluido en medio completo al 10% a
una concentración de 3000 a 24000 pfu/100 ml a cada pocillo. Los
pocillos de control recibieron un volumen igual de medio sin virus.
Las células después se cultivaron a 37ºC en CO_{2} al 5% durante
cuatro días.
Se hizo un inmunoensayo quimioluminiscente para
determinar la cantidad de linfoquina secretada en el sobrenadante
de cultivo tisular al final de 4 días de cultivo. Se revistió una
placa de inmunoensayo de 96 pocillos, Microlite 2 (Dynatech
Laboratories, Inc., Chantilly, Virginia) durante una noche con 50
\mul/pocillo de 10 mg/ml de anticuerpo
anti-linfoquina (IL-4,
IL-10, o Interferón \gamma) no marcado (Pharmingin
San Diego, CA) en un tampón bicarbonato potásico 0,1 M. Las placas
se lavaron y se añadieron 100 \mul de tampón
I-block (Tropix, Bedford, MA) durante una hora. Los
patrones (IL-4, IL-10 e Interferón
\gamma recombinantes, Pharmingen, San Diego, CA) se
pre-diluyeron en I-block comenzando
con una concentración de 10 ng/ml. Se hicieron diluciones de factor
ocho-tres del patrón. Las muestras, los controles y
los patrones se diluyeron en un volumen igual de tampón
I-block. Se añadieron alícuotas de 50 \mul a cada
placa de ensayo. Las muestras se incubaron durante 1 hora a
temperatura ambiente. Las placas se lavaron. El anticuerpo
biotinilidado secundario se diluyó 1:1000 en
I-block y se añadieron 50 \mul/pocillo a las
placas de ensayo. Las placas se lavaron y se añadieron 50
\mul/pocillo de avidina-fosfatasa alcalina (Avidix
AP, Tropix, Bedford, MA) a las placas de ensayo. Las placas se
incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Las placas
lavadas se incubaron dos veces durante un minuto con tampón de
ensayo (Tropix). Se añadió el sustrato CDP-Star
(Tropix) a cada pocillo (100 \mul/pocillo). Después de 10
minutos, las placas se leyeron en un luminómetro MD2250 (Dyatech,
Chantilly, VA). Las primeras muestras se ensayaron usando un
protocolo modificado. En lugar de una etapa de detección usando
avidina-fosfatasa alcalina, se usó
avidina-aecuorina (Sealite Sciences, Atlanta, GA).
Este material quedó no disponible durante el estudio de modo que se
modificó el protocolo. Los resultados usando muestras patrón y de
control fueron idénticos para los dos formatos de ensayo.
Reactividad cruzada de serotipo. Para
examinar la especificidad de serotipo, se estimularon las PBMC
recogidas en los días 42, 45, ó 105 de destinatarios seleccionados
de las vacunas atenuadas monovalentes (véanse los resultados)
durante cuatro días a 250.000 células/pocillo con cada serotipo de
virus en cultivos independientes. Después se analizaron los
sobrenadantes de cultivo usando el ELISA de linfoquinas
quimioluminiscente.
Depleciones de subconjuntos de células T.
Para examinar la fuente celular específica de producción de
linfoquinas, se eliminaron los linfocitos T CD3+ o CD8+ de las PBMC
antes de la estimulación. Las PBMC seleccionadas se lavaron dos
veces con medio RPMI 1640 y se suspendieron a 3,25 millones de
células/ml en medio completo al 5% (se usó un 30% más de PBMC como
aportación para compensar las pérdidas celulares durante el
procedimiento de depleción). Para la depleción negativa, las
células (650.000 PBMC) se incubaron con perlas magnéticas revestidas
de anticuerpo lavadas. Se usaron dos tipos de perlas, perlas
M-450 anti CD3 y anti CD8 (Dynal, Oslo, Noruega).
Las pelas anti CD3 se usaron a una concentración de 5,2 millones de
partículas/tubo dando una proporción aproximada de perlas a células
diana de 20:1. Las pelas anti-CD8 se usaron a una
concentración de 4,0 millones de partículas por tubo dando una
proporción aproximada de perlas a células diana de 31:1.
DYNABEADS^{TM} (Dynal) en tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Las
células se incubaron a 4ºC durante 30 minutos con agitación
moderada. Se usaron PBMC sin depleción como controles. Usando un
concentrador de partículas magnéticas MPC-2 (Dynal)
se retiraron las células marcadas de la mezcla celular. Las PBMC
seleccionadas negativamente CD3+ y CD8+ se transfirieron a tubos de
microcentrífuga frescos. Para retirar cualquier célula no unida
residual, las Dynabeads concentradas se lavaron una vez con 200
\mul de medio completo. Después de la transferencia, el volumen
final (400 \mul) se dividió por igual en dos pocillos de una
placa de cultivo con fondo en V de 96 pocillos. Los sobrenadantes
de cultivo de PBMC con depleción y de control se analizaron después
de cuatro días usando el ELISA de linfoquinas quimioluminiscente.
Además, las PBMC cultivadas se ensayaron para el ARNm de granzima B
intracelular (véase a continuación). La depleción CD4+ se realizó
de forma simular pero la separación se hizo después de la
estimulación usando dynabeads M-450 CD4+ (28,6
ml/4,004 millones de partículas, una proporción aproximada de perlas
a células diana de 31:1). Las PBMC seleccionadas negativamente CD4+
se ensayaron solamente para el ARNm de granzima B intracelular.
Citometría de flujo. La eficacia de
depleción (medida como % de depleción) se determinó usando análisis
FACS después de tinción doble de una población de PBMC no
estimulada, seleccionada aleatoriamente (tanto series de control
sin depleción como series con depleción CD3+ o CD8+). Las células se
incubaron con anticuerpos anti-CD4+ o
anti-CD8+ marcados con PE y
anti-CD3+ marcados con FITC
(Becton-Dickinson) durante 30 minutos a 4ºC. Las
PBMC marcadas después se lavaron tres veces con tampón de
fluorescencia [PBS (Sigma), Azida Na al 0,05%, Suero Bovino Fetal
al 1% (Summit Biotechnology, Boulder, CO) y se conservaron en
fijativo de fluorescencia [PBS, Formalina al 1%, Azida Na al 0,05%]
antes del análisis. No se midió la eficacia de depleción, usando
Dynabeads CD4+.
Ensayo de granzima B. Se ensayaron PBMC
de control sin depleción y PBMC con depleción de subconjuntos de
células T para el ARNm de granzima B intracelular, después de
cuatro días de estimulación con virus de tipo silvestre. Se usó un
ensayo de Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa
Inversa (RT-PCR) en un formato de placa de 96
pocillos.
La purificación del ARNm se hizo usando el
Sistema de Aislamiento de ARNm "Straight A's" (Novagen,
Madison, WI). Después de centrifugación y retirada de los
sobrenadantes del cultivo de PBMC para el análisis ELISA de
linfoquinas, se lisaron las PBMC sedimentadas usando 200
\mul/pocillo de tampón de lisis que contenía ditiotreitol 10 mM y
después se incubaron con 200 mg/pocillo de perlas magnéticas oligo
dT lavadas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de
lavado minucioso de las perlas con ocho volúmenes de tampón de
lavado usando un concentrador de partículas magnéticas
MPC-96 (Dynal) para retirar el ADN, las proteínas,
y los desechos celulares, se eluyó el ARNm a 70ºC durante 20 minutos
con 200 \mul/pocillo de H_{2}O. El eluato se transfirió a un
tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se realizó una segunda ronda de
elución con 200 ml/pocillo adicionales de H_{2}O. Los 400 \mul
de eluato después se precipitaron usando 50 \mul de acetato
sódico 3 M (pH 5,2), 20 mg de glucógeno (Novagen), y 300 \mul de
isopropanol. Después de un lavado final con etanol frío al 70%, se
suspendió el sedimento de ARNm en 30 \mul de H_{2}O.
Las etapas de RT-PCR se
realizaron en placas de 96 pocillos. Los cebadores
oligonucleotídicos (22 pb), que corresponden a los exones de la
granzima B humana (CTLA-1) y amplifican una región
de 120 pb, los sintetizó el Dr. Stuart Cohen en el Walter Reed Army
Institute of Research. Los cebadores tenían las siguientes
secuencias: grb2a (con sentido) 5'AGC CGA CCC AGC AGT TTA TCC C
(SEC ID Nº 1), grb2b (anti-sentido) 5'C TCT GGT CCG
CTT GGC CTT TCT (SEC ID Nº 2).
Para cada reacción con transcriptasa inversa, El
volumen de reacción total fue 40 \mul e incluía los siguiente:
MgCl_{2} (5 mM), tampón II 10X (Tris-HCl 10 mM,
KCl 50 mM, pH 8,3), dNTP (1 mM cada uno), e inhibidor de RNasa (40
Unidades) [Perkin Elmer, Norwalk, CT], transcriptasa inversa AMV (10
Unidades) [Siekagaku], cebador grb2b (3 pmoles), sH_{2}O, y 4 ml
de molde de ARNm. Las etapas de incubación con RT se hicieron en un
termociclador 9600 (Perkin Elmer) con parámetros establecidos a
42ºC (90 minutos), 99ºC (5 minutos), 4ºC (indefinidamente). Para
cada PCR, el volumen de reacción total era de 50 \mul e incluía lo
siguiente: MgCl_{2} (2 mM), tampón II 10X (igual que
anteriormente), dNTP (0,4 mM cada uno), oro amplitaq (1,25
Unidades), cebadores grb2a y grb2b (1 pmol cada uno), sH_{2}O, y
5 \mul de molde de ADNc. Las etapas de incubación de PCR también
se hicieron en un termociclador 9600 con parámetros establecidos a
desnaturalización inicial/activación enzimática a 95ºC (10
minutos), 30 ciclos: [desnaturalización a 95ºC (30 segundos con un
desnivel de 10 segundos)/ hibridación a 60ºC (30 segundos con un
desnivel de 30 segundos)/extensión a 72ºC (30 segundos con un
desnivel de 30 segundos)], extensión final a 72ºC (7 minutos), 4ºC
(indefinidamente).
Usando electroforesis, se separaron los
productos de PCR amplificados finales (10 \mul) en geles de
agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio (SeaKem)/1X TAE
(Tris-Acetato-EDTA) y se analizaron
usando una cámara digital (Scientific Imaging Systems, New Haven,
CT).
Se pensó que si podía demostrarse una respuesta
más reforzada a una dosis de refuerzo de vacuna viva, podría usarse
una vacuna de virus vivo más atenuada. La respuesta más reforzada
buscada era una respuesta tanto de anticuerpos como de células
T.
Aunque se han medido respuestas de células T
contra vacunas del dengue, se han hecho menos mediciones de
respuestas de células T que respuestas de anticuerpos. Por lo
tanto, la respuesta de células T a la administración de vacuna viva
contra el dengue está menos caracterizada. Un objetivo de este
estudio fue determinar la naturaleza de la respuesta de células T a
las vacunas en términos de respuesta T auxiliar, especificidad de
serotipo y potencial citotóxico.
La respuesta de células T predominante a estas
vacunas era una respuesta Th1. esto se determinó por la secreción
de interferón \gamma por células mononucleadas de sangre
periférica (PBMC) estimuladas por virus vivo del dengue en un
cultivo de cuatro días. El interferón \gamma se secretó por
células T CD3+CD8-. La respuesta de células T era específica del
serotipo del virus del dengue con alguna respuesta de reactividad
cruzada. Se apreció una respuesta anamnésica en algunos individuos
y otros no.
Se usó virus vivo del dengue para estimular
cultivos de PBMC. El serotipo del virus estimulante usado en cultivo
era el mismo que el serotipo del virus de la vacuna. Después de
cuatro días, se ensayaron los sobrenadantes de cultivo tisular para
la presencia de interferón \gamma, IL-4 e
IL-10. En todos los cultivos, IL-4 e
IL-10 eran sistemáticamente negativas. Se usaron
dos controles de ensayo para asegurar que el ensayo estaba
funcionando apropiadamente. Primero, la curva patrón usaba
linfoquina recombinante y segundo, se usó una muestra de control
para asegurar que las linfoquinas podían detectarse en presencia de
sobrenadante de cultivo tisular.
En contraste con la expresión negativa de
IL-4 e IL-10, se detectaron elevados
niveles de interferón \gamma en varios sobrenadantes de cultivo.
La Figura 6 muestra la cinética de la expresión de interferón
\gamma de células recogidas de voluntarios que recibieron vacunas
monovalentes. Globalmente, las respuestas más elevadas de
interferón \gamma fueron por PBMC recogidas de destinatarios de
las vacunas candidatas contra el dengue 1 y dengue 2, aunque hubo
unas pocas respuestas elevadas en destinatarios de dengue 3 y 4. Se
detectó ocasionalmente interferón \gamma en el día 14 después de
la primera inoculación pero a menudo la expresión no se detectaba
hasta justo antes de o justo después de la administración de la
segunda dosis. La cinética de secreción por lo tanto fue mucho más
lenta que la esperada. Con respecto a las respuestas de refuerzo
para los destinatarios de las monovalentes en este estudio, no hubo
patrones coherentes. Dependiendo del individuo, los niveles de
interferón \gamma aumentaban o disminuían después de la
administración de la segunda dosis.
Las PBMC no estimuladas de todos voluntarios en
los puntos de recogida mostraron niveles indetectables de
interferón \gamma. La expresión media de las células del
día cero estimuladas era de 127 pg/ml con una desviación típica de
230 pg/ml.
Para los destinatarios de vacuna monovalente,
hubo 16 sujetos con respuesta positiva de interferón \gamma y 14
con respuesta negativa (media \pm 3 desviaciones típicas).
Dieciséis de treinta destinatarios de vacuna monovalente tuvieron
cultivos de PBMC con resultados de interferón \gamma >1000
pg/ml para al menos un momento puntual. Doce tuvieron secreción
sostenida de interferón \gamma a >1000 pg/ml para dos o más
momentos puntuales consecutivos. Además, doce de treinta tuvieron
secreción >1000 pg/ml en el último momento puntual ensayado.
Cuatro voluntarios recibieron vacunas
tetravalentes (una mezcla igualada de las cuatro cepas
monovalentes). La Figura 7 muestra la producción de interferón
\gamma por PBMC recogidas de estos destinatarios de la
tetravalente. Las PBMC se estimularon en cultivos diferentes usando
uno de cada uno de los cuatro serotipos de virus del dengue. Las
PBMC de los voluntarios nº 33 y nº 36 secretaban cantidades
significativas de interferón \gamma, >1000 pg/ ml, para al
menos un momento puntual después de la estimulación con cada uno de
los cuatro serotipos. Las PBMC del voluntario nº 35 secretaban
cantidades significativas de interferón \gamma en respuesta a tres
de los cuatro serotipos (no dengue 3). Las PBMC del voluntario nº
34 secretaban solamente interferón-gamma
significativo en respuesta al virus del dengue 2. Las respuestas más
elevadas fueron predominantemente contra DEN 1 y 2. La cinética de
la producción de interferón \gamma se retardó en los voluntarios
de vacuna tetravalente como en los voluntarios de la monovalente.
Se detectaron elevados niveles de interferón \gamma justo antes
de y después de la inoculación de la segunda dosis. Con respecto a
las respuestas de refuerzo, como con los destinatarios de las
monovalentes, no hubo patrones coherentes de secreción de interferón
\gamma después de la administración de la segunda dosis.
Además, estos resultados indican que la
respuesta de linfocitos T predominante en destinatarios de vacuna
tanto monovalente como tetravalente era una respuesta Th1 específica
de antígeno.
Se examinaron las PBMC de doce de los
destinatarios de vacuna monovalente para la presencia de respuestas
específicas de serotipo del dengue y de reactividad cruzada. En base
a la cinética, se eligieron aquellos individuos que secretaban
>1000 pg/ml de interferón \gamma en sobrenadantes de cultivo
PBMC en el último momento puntual (después del último día de
recogida). Se estimularon las PBMC del último día de recogida en
cultivos independientes durante cuatro días con cada serotipo del
dengue seguido de análisis de interferón \gamma secretado en
sobrenadantes de cultivo. Aunque había algo de reactividad cruzada
de serotipo, la respuesta más elevada se observó siempre en PBMC
estimuladas con el mismo serotipo de virus que la vacunación
original (Tabla 14). Por tanto las respuestas de interferón \gamma
observadas en PBMC de estos destinatarios de vacuna monovalente
seleccionados eran específicas de serotipo del dengue.
Las respuestas de reactividad cruzada eran la
mitad (o menos) de la respuesta específica de serotipo. Para
destinatarios de la vacuna contra el dengue 2, la respuesta de
reactividad cruzada más elevada fue con virus del dengue 4. Para
destinatarios de la vacuna contra el dengue 4, la respuesta de
reactividad cruzada más elevada fue con virus del dengue 2. Para
destinatarios de la vacuna contra el dengue 1, las respuestas de
reactividad cruzada variaron. Había solamente un destinatario de la
vacuna contra el dengue 3 en este grupo y esa respuesta era
específica de serotipo.
Para verificar que ésta era una respuesta Th1,
se determinó la identidad de las células que secretaban el
interferón \gamma. Esto se hico por depleción de células T o
conjuntos de células T antes del cultivo. Las células usadas en
este estudio eran PBMC mixtas separadas de sangre completa usando
centrifugación en gradiente de densidad. Las células predominantes
en las poblaciones de PBMC incluyen células T, células B, monocitos
y células NK. Para esta evaluación, se eligió el momento puntual de
la respuesta de interferón \gamma más elevada en base a la
cinética en 13 voluntarios monovalentes y 3 tetravalentes.
Las células se retiraron de las PBMC usando
separación celular inmunomagnética. La eficacia de depleción se
evaluó usando citometría de flujo en depleciones de ensayo. No se
hizo el análisis de las PBMC cultivadas a causa de la pequeña
cantidad disponible. En las depleciones de ensayo, la retirada de
células CD3+ usando anticuerpo monoclonal CD3 provocó una reducción
del 92% de células CD3+ con relación a controles de PBMC sin
depleción. La depleción CD3 se controló usando marcadores dobles
para CD3 y CD4, marcadores dobles para CD3 y CD8, y marcador
sencillo para CD3. La depleción CD3 fue más rigurosa para células
CD4+ que células CD8+ eliminándose un 98% de las células T CD3/CD4
y eliminándose un 90% de las células CD3/CD8 en los grupos de
depleción CD3. LA retirada de células CD8+ usando anticuerpo
monoclonal CD8 provocó una reducción del 99,9% de células CD8+.
Las PBMC seleccionadas sufrieron depleción de
linfocitos T CD3+ o CD8+, se estimularon en cultivo con virus del
dengue durante cuatro días, y después se examinaron para interferón
\gamma secretado. Los resultados se compararon con los obtenidos
de controles de PBMC sin depleción cultivados al mismo tiempo. Los
linfocitos T CD4+ no se eliminaba antes de la estimulación porque
otras poblaciones celulares necesitan los auxiliares T CD4+ para la
producción de interferón \gamma.
La retirada de células CD3+ antes del cultivo
reducía sustancialmente la producción de interferón \gamma como
se muestra en la Tabla 15. El intervalo para la reducción en
interferón \gamma después de la depleción CD3+ era del
59-100%. Se observó producción de interferón
\gamma reducida pero significativa en algunos cultivos con
depleción CD3+. Esta producción residual indica que la pequeña
cantidad de células CD3+ residual que queda después de la
separación celular inmunomagnética está secretando interferón
\gamma y/u otra población de células también está secretando
interferón \gamma.
Excepto en un individuo, la retirada de células
CD8+ antes del cultivo no redujo la producción de interferón
\gamma. En 9 de los 16 cultivos, la retirada de células CD8+
realmente aumentó su producción, posiblemente debido a la retirada
de la supresión por estas células o por la reducción de la
eliminación de células presentadoras de antígeno infectadas por
linfocitos citotóxicos CD8+.
En conjunto, estos resultados indican que el
interferón \gamma observado en estos cultivos de PBMC está
secretado por linfocitos T CD4+ y/o por células influidas por los
linfocitos T CD4+. Esto apoya el hallazgo de una respuesta Th1.
Una respuesta Th1 está asociada con, entre otras
cosas, una respuesta de linfocitos citotóxicos. En un esfuerzo por
observar si estaban presentes células capaces de una eliminación
mediada por células en estos voluntarios de vacuna, se midió el
ARNm de granzima B en las PBMC cultivadas para los experimentos de
depleción. Después de la retirada de los sobrenadantes de cultivo
para el análisis de linfoquinas, las células se sedimentaron y se
lisaron para la extracción de ARNm. Se usaron cebadores específicos
de granzima B para RT-PCR. El producto de PCR se
analizó por electroforesis en gel de agarosa. La intensidad de
bandas del gel se convirtió en una escala +, - usando una
fotografía de referencia (Fig. 8) para la comparación. Se cultivaron
células adicionales de siete de los voluntarios sin virus. Las PBMC
no estimuladas, de estos siete voluntarios, tenían poca expresión
(- o +) de ARNm de granzima B. Con estimulación específica de
antígeno, la expresión estuvo sustancialmente regulada
positivamente en los 16 de los destinatarios de vacuna seleccionados
(Figura 8). La depleción de subconjuntos de células T usando
anticuerpo monoclonal CD8 no redujo significativamente la expresión
de granzima B con relación a las PBMC de control. Había 3 individuos
(ID 16, 22, y 33) cuya expresión de granzima B se redujo en el
grupo de depleción CD8. En uno (ID 33), la disminución fue
sustancial. En contraste, la depleción de subconjuntos de células T
usando anticuerpo monoclonal CD3 redujo la expresión en 14 de los
voluntarios. En 8 de los voluntarios monovalentes y en los 3
voluntarios tetravalentes, la disminución fue sustancial. También
se examinaron cuatro de los sujetos sin respuesta de interferón
\gamma para el ARNm de granzima B. Todos mostraron bajos niveles
de expresión (datos no mostrados).
En células de siete de los voluntarios, la
depleción de subconjuntos de células T usando anticuerpo monoclonal
CD4 se hizo después de cuatro días de cultivo. La depleción se hizo
después del cultivo para proporcionar actividad auxiliar T a todas
las células que necesitan ayuda durante el cultivo. La retirada de
células CD4+ después de la estimulación no afectó a la expresión de
granzima B con relación a los controles sin depleción en los siete
voluntarios analizados. Por tanto, aunque hay una producción
dependiente de antígeno de granzima B mediada por células Th1 CD4+,
las células reales que producen la granzima B parecen ser células
diferentes a células T. Si esta producción es por células NK o
macrófagos se desconoce.
Dos objetivos de este estudio fueron determinar
si había una respuesta de células T medible en los destinatarios de
la vacuna y si podía observarse una respuesta mediada por células
frente a la segunda dosis de vacuna. Para esos objetivos, se midió
la cinética de respuesta de células T reestimulando células
recogidas a intervalos entre las dos dosis. La reestimulación se
hizo con virus vivo en cultivos a granel de PBMC recogidas durante
el estudio.
Un tercer objetivo de este estudio era
determinar la naturaleza de la respuesta de células T en términos de
1, tipo celular definido por el repertorio de linfoquinas, 2,
respuestas específicas de serotipo del dengue y de reactividad
cruzada, y 3, una medida del potencial citotóxico, la producción de
granzima B. Estas respuestas se midieron en PBMC de destinatarios
de vacunas tanto monovalentes como tetravalentes. Con respecto a los
destinatarios de vacuna tetravalente, fue importante determinar si
podía detectarse una respuesta contra los cuatro serotipos de virus
del dengue.
Las respuestas T auxiliares humanas y de ratón
pueden dividirse en dos grupos en base a su patrón de expresión de
linfoquinas 5. Las células T auxiliares 1 (Th1) se caracterizan por
la secreción de IL-2 e interferón \gamma. De esas
dos linfoquinas, el interferón \gamma es la más importante en
términos de identificación de células Th1. Las células T auxiliares
2 (Th2) se caracterizan por la secreción de IL-4,
IL-5, IL-6 e IL-10.
En poblaciones mixtas de células o cultivo a granel de PBMC,
habitualmente predomina uno de los dos patrones de secreción.
Un factor que influye en la respuesta Th1 vs Th2
es la naturaleza de la infección agresora. Las infecciones virales,
y algunas infecciones bacterianas tales como Listeria y
Mycobacterium (Peters, 1996, Hepatology 23,
909-916) a menudo inducen una respuesta Th1 mientras
que algunas infecciones parasitarias inducirán una respuesta Th2
(Conrad y col., 1990, J Exp Med 171, 1497-1508). La
proporción de las dos respuestas puede variar dependiendo del
transcurso de la infección. Por ejemplo, aunque las infecciones
virales habitualmente empiezan con una respuesta Th1, puede
producirse una respuesta Th2 posteriormente en la infección. La
respuesta Th1 inicial puede aumentar las respuestas CTL y dirigir
el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas mientras que la
siguiente respuesta Th2 puede aumentar la producción de anticuerpos
por células B.
En una infección por dengue natural, un estudio
mostró una respuesta Th1 en la mayoría de los individuos. La
respuesta Th1 se asoció con una respuesta inmune eficaz sin
patogénesis grave asociada. En contraste, algunos individuos
desarrollaron una respuesta Th2 que estaba asociada con mayor
patogénesis.
A pesar de la asociación de una respuesta Th1
con una respuesta inmune anti-dengue eficaz, la
linfoquina clave de una respuesta Th1, el interferón \gamma,
tiene influencias tanto positivas como negativas sobre la respuesta
inmune. En Tailandia, Kurane encontró elevados niveles de interferón
\gamma en el suero de pacientes DHF en comparación con los
menores niveles en el suero de pacientes DF (Kurane y col., 1991, J
Clin Invest 88, 1473-1480). El interferón \gamma
aumentado puede ser una medida de la activación inmune. El
interferón \gamma es necesario para activar y mantener la
activación de células citotóxicas (células T CD4+, células T CD8+ y
células NK). Aunque este mecanismo puede contribuir a la patogénesis
en infecciones graves, la misma respuesta puede ser beneficiosa en
infecciones más leves por la reducción de la cantidad de células
infectadas por virus a través de citólisis específica de antígeno.
La función positiva del interferón \gamma en el control de la
infección por virus del dengue se demuestra en un modelo knockout de
ratón reciente deficiente en interferones \alpha, \beta y
\gamma. Los ratones knockout eran susceptibles a infección letal
por el virus del dengue en contraste con controles adultos normales
que eran resistentes a la infección (Johnson y Roehrig, 1999, J
Virol 73, 783-786).
\newpage
Como alternativa, el interferón \gamma puede
contribuir a la patogénesis de la infección por virus del dengue.
Un mecanismo para la patogénesis puede ser por potenciación inmune
debido al aumento de la infección de una célula diana principal, el
macrófago. En cultivo, el interferón \gamma aumentaba la infección
mediada por anticuerpos de una línea celular de macrófagos U937
aumentando la cantidad de receptores Fc en la superficie de las
células (Kontny y col., 1988, J Virol 62,
3928-3933). Aunque otro estudio usando macrófagos
cultivados normales mostró un efecto opuesto de disminución de la
infección (Sittisombut y col., 1995, J Med Virol 45,
43-49). Dados estos resultados conflictivos, no está
claro si el interferón \gamma contribuye a una infección
aumentada de los macrófagos.
En este estudio, la respuesta Th1 era la
respuesta predominante. Los ensayos para IL-4 y
IL-10 eran sistemáticamente negativos lo que indica
una ausencia de respuesta TH2. Se detectaron elevados niveles de
interferón \gamma en los sobrenadantes de muchos de los cultivos,
lo que indica la presencia de una respuesta Th1 en esos
cultivos.
Como las células estimuladas eran PBMC
completas, tenían que determinarse las células responsables de la
secreción del interferón \gamma. Esto se hizo eliminando
subconjuntos de células T usando un procedimiento inmunomagnético.
La depleción negativa se hizo antes del cultivo con anticuerpos que
reconocen CD3 o CD8. Como la depleción CD3 produjo la rescisión de
la secreción de interferón \gamma y la depleción CD8 no, se
concluyó que los linfocitos CD3+ CD8- eran la población celular que
secretaba el interferón \gamma o al menos controlaba la secreción
de interferón \gamma. Esto confirma que el interferón \gamma era
el resultado de una respuesta Th1. Puede haber interferón \gamma
residual en algunos cultivos después de la depleción debido a
algunos linfocitos T CD4+ restantes después de la depleción u otras
células en el cultivo, posiblemente células Natural Killer
(asesinas naturales) o macrófagos.
La respuesta máxima de interferón \gamma era
específica de serotipo. Cuando se estimulaban células de
destinatarios de vacuna monovalente por separado por cada uno de
los cuatro serotipos de virus del dengue, la producción máxima de
interferón \gamma era en respuesta a estimulación por virus del
dengue homólogo al virus de la vacuna. Se observaron respuestas de
reactividad cruzada menores contra otros virus del dengue en varios
de los cultivos. Esto es similar a los resultados obtenidos por
otros usando una medición diferente, la proliferación de
linfocitos. En un estudio, las células de individuos que recibieron
una vacuna contra el dengue 2 mostraron la mayor respuesta contra
el virus del dengue 2 pero se observaron respuestas de reactividad
cruzada (Dharakul, J Infect Dis 170, 27-33). Esto
se confirmó a nivel clonal donde la mayoría de los clones obtenidos
de un destinatario de la vacuna contra el dengue 3 respondían mejor
al antígeno del dengue 3 pero tenían respuestas de reactividad
cruzada contra los otros tres antígenos (Kurane y col., 1989, J Exp
Med 170, 763-775). La conclusión del último estudio
fue que la infección primaria por virus del dengue produce
predominantemente respuestas de linfocitos CD4+ de reactividad
cruzada (proliferación y producción de interferón \gamma).
En este estudio, las respuestas de reactividad
cruzada de las PBMC de los destinatarios de la vacuna monovalente
eran habitualmente la mitad o menos de la respuesta específica de
serotipo. En los destinatarios de la vacuna tetravalente, la
secreción de interferón \gamma en respuesta a serotipos
individuales de virus del dengue era significativa en tres de los
cuatro destinatarios de la vacuna tetravalente. Las respuestas
variaban en los destinatarios individuales de la vacuna suficiente
para que no fuera posible determinar si las respuestas menores eran
respuestas específicas de serotipo o respuestas de reactividad
cruzada.
La cinética de la activación de células T
indicada por la secreción de interferón \gamma era más lenta que
la esperada. En unos pocos casos, las respuestas podían detectarse
en el día 14. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las
respuestas no se detectaban hasta justa antes de la administración
de la segunda dosis de vacuna. No está claro cuál es la razón para
la cinética retardada. Una explicación podría ser que la producción
de antígeno por las células infectadas por el virus de la vacuna es
lenta y persistente. Sin embargo, es igualmente posible que los
procedimientos detectaran preferentemente respuestas de memoria en
lugar de respuestas agudas. Por ejemplo, si las células CD8+
activas estaban inhibiendo una respuesta CD4+ en las PBMC recogidas
durante la infección temprana, puede estar atenuada la respuesta
medible. En cultivos en los que estaban eliminados los linfocitos
CD8+, la secreción de interferón \gamma por los linfocitos
restantes estaba aumentada en más de la mitad de los cultivos. Esta
inhibición puede haber sido mayor durante la infección temprana.
Otros han observado una cinética de producción
de linfoquinas más aguda. Se midieron las linfoquinas séricas,
incluyendo interferón \gamma sérico durante 17 días después de la
inoculación con una vacuna atenuada contra el dengue. Se observó
una respuesta aguda en ese estudio que tenía su pico durante el
tiempo de viremia (Kurane y col., 1995, J Clin Lab Immunol 46,
35-40).
La respuesta a la segunda dosis era mixta.
Algunos individuos mostraron un aumento en la producción de
interferón \gamma mientras que otros mostraron una disminución.
La producción de interferón \gamma por células recogidas de
destinatarios de la vacuna justo antes de la segunda dosis era
suficientemente elevada para poder enmascarar cualquier respuesta
anamnésica contra la segunda dosis. Además, la respuesta de
interferón \gamma tardía puede haber hecho que la medición de una
respuesta de células T anamnésica sea más difícil. Está claro que
algunos individuos respondían a la segunda dosis. Esto puede indicar
que hay algo de crecimiento viral localizado en presencia de una
respuesta inmune activa.
En resumen, la respuesta de células T
predominante contra la administración de estos virus vivos atenuados
del dengue era una respuesta Th1. Esto se demostró por la secreción
de interferón \gamma por PBMC reestimuladas recogidas de
destinatarios de vacuna. Ninguno de los cultivos de PBMC de células
de destinatarios de vacuna tenía secreción significativa de
IL-4 o IL-10 en el sobrenadante de
cultivo después de la reestimulación. La respuesta Th1 se verificó
mostrando que linfocitos CD3+ CD8- secretaban interferón \gamma.
La respuesta Th1 era predominantemente específica de serotipo del
dengue pero se observaron respuestas de reactividad cruzada más
pequeñas.
El objetivo principal de este estudio es
caracterizar las respuestas clínicas contra cada uno de los 4 virus
candidatos de exposición del dengue en voluntarios susceptibles e
inmunes para juzgar su idoneidad como cepas de exposición para
estudios de eficacia de vacuna en seres humanos. El objetivo
secundario del estudio es generar hipótesis con respecto a los
equivalentes inmunes de protección para la fiebre del dengue.
Dosis, Programa y Vía: Todos los voluntarios
recibirán 1 de 4 virus de exposición del dengue o placebo en una
única dosis de 0,5 ml por vía subcutánea en la región deltoide en el
día del estudio 0.
Grupos de Estudio:
Serie de Voluntarios nº 1 (susceptible): recibe
DEN-1, DEN-2, DEN-3,
DEN-4 o placebo. Serie de Voluntarios nº 2
(inmune): recibe virus DEN (serotipo correspondiente a la vacuna
previamente recibida) o placebo.
Criterios de Elegibilidad Generales: Edad
18-35, salud excelente sin ninguna afección médica
crónica, valor de >75% en el examen de comprensión del estudio
por escrito, consentimiento informado, disponibilidad durante el
periodo del estudio, carta de aprobación para la participación de la
cadena de mando (solamente militares), conversión serológica en
respuesta a vacunación previa contra el dengue (serie de voluntarios
nº 2 solamente).
Estadística: El análisis de los datos será
principalmente descriptivo en este estudio piloto dada la pequeña
cantidad de voluntarios en cada grupo de artículo de ensayo. La
preocupación principal será documentar la frecuencia de
acontecimiento clínicos (pre-especificados e
inesperados) dentro de los cuatro grupos de estudio en comparación
con el placebo.
Se compararán las medidas inmunes
pre-exposición y las respuestas inmunes
post-exposición de todos los voluntarios expuestos
que desarrollan fiebre del dengue con las de todos los voluntarios
expuestos que permanecen bien, para desarrollar hipótesis acerca de
los equivalentes inmunes de protección.
Aplicación del Modelo de Exposición al Dengue
Humano: En contraste con la mayoría de los experimentos históricos
de exposición humana al dengue que se diseñaron para caracterizar la
enfermedad del dengue o para evaluar la atenuación de vacunas vivas
candidatas, este estudio de exposición se dirigirá a 1) validar 4
virus del dengue como cepas de exposición en voluntarios sin
tratamiento previo a flavivirus (serie de voluntarios nº 1), y 2)
identificar equivalentes de inmunidad en los destinatarios de vacuna
monotípica contra el dengue cuando se exponen posteriormente con
virus del dengue homotípico (serie de voluntarios nº 2).
Si la respuesta clínica en la serie de
voluntarios nº 1 sugiere que estas cepas son adecuadas para la
exposición, entonces en futuros experimentos controlados, se
administrarán estas cepas de exposición a los destinatarios de
vacunas candidatas contra el dengue o placebo para seleccionar las
vacunas candidatas más prometedoras para desarrollo adicional.
Si la respuesta inmunológica en la serie de
voluntarios nº 2 sugiere que algún aspecto de la inmunidad
pre-exposición (anticuerpos y/o células T de
memoria) se correlaciona con protección, dichos equivalentes de
protección podrían simplificar el desarrollo de la vacuna contra el
dengue.
Criterios de Definición Para Virus del Dengue a
Ensayar como Cepas de Exposición: Un virus de exposición del dengue
adecuado 1) causará de forma reproducible fiebre del dengue no
complicada que dura 3-7 días en la serie de
voluntarios nº 1, 2) se producirá en cumplimiento de las Buenas
Prácticas de Fabricación (GMP) y estará libre de agentes extraños o
componentes no virales reactogénicos, y 3) estará disponible en
forma de virus liofilizado en cantidad suficiente (>100 dosis).
Los Virus de Exposición incluyen DEN-1 45AZ5
(PDK-0) inactivado, DEN-2 S16803
(PDK-10), DEN-3 cl 24/28
(PDK-0), DEN-4 341750
(PDK-6) (PDK = células de riñón de perro
primarias).
primarias).
La dosis de cada virus de exposición en unidades
formadoras de placa (pfu.) será de 0,5 x título.
Los virus de exposición del estudio cumplen los
dos últimos criterios. Este estudio está dirigido a demostrar que
las cepas de exposición candidatas del estudio cumplen el primer
criterio. Se tienen algunas evidencias de que los 4 virus de
exposición a ensayar en este estudio son apropiadamente patogénicos.
Los virus de exposición DEN-1 y
DEN-3 ya han demostrado causar enfermedad febril no
complicada en voluntarios. Aunque los virus de exposición
DEN-2 y DEN-4 a administrar en este
estudio están sin ensayar en voluntarios, se cree que son
patogénicos, ya que son los precursores de las vacunas candidatas
contra el virus del dengue que se rechazaron porque causaban
enfermedad febril en voluntarios. La única razón para rechazar
cualquiera de los 4 virus candidatos de exposición del dengue es si
no causan enfermedad en voluntarios sin tratamiento previo para
flavivirus (serie de voluntarios nº 1) o causan enfermedad excesiva
en cualquier voluntario (series de voluntarios nº 1 y nº 2).
Serie de Voluntarios nº 1: Se asignaron
aleatoriamente diez voluntarios sin tratamiento previo para
flavivirus sanos para recibir exposición al virus del dengue con 1
de 4 serotipos (2 voluntarios por serotipo) o placebo. Los
voluntarios y los investigadores permanecerán ciegos al inóculo. Se
espera que los 8 voluntarios que reciben virus de exposición del
dengue lleguen a estar moderadamente enfermos con
3-7 días de fiebre, jaqueca grave y mialgias. La
recuperación completa puede tardar tanto como 14 días desde la
aparición de la enfermedad. Cada virus de exposición se considerará
adecuado en base a las respuestas clínicas de los 2 destinatarios y
debe satisfacer la definición del estudio de fiebre del dengue. La
fiebre del dengue se define como: una enfermedad con: 2 o más de lo
siguiente: jaqueca, mialgia, sarpullido eritematoso, dolor
retro-orbital, artralgias, y fiebre sostenida
durante 48 horas o más que permite periodos de temperatura
disminuida debido al uso de acetaminofeno, y respuesta tisular
durante el periodo de fiebre y los días después de ello manifiesta
por neutropenia o trombocitopenia o lesión hepática, y evidencias
de viremia del dengue durante el periodo de fiebre.
Serie de Voluntarios nº 2: Hasta doce
voluntarios inmunes, sanos y jóvenes recibirán virus de exposición
del dengue homotípico (N=10, independientemente del serotipo) o
placebo (N=2). Los voluntarios inmunes son destinatarios previos de
vacunas monovalentes, atenuadas vivas contra el dengue que tenían
una respuesta de anticuerpo neutralizante primaria. Se espera que
los voluntarios inmunes permanezcan bien. Las medidas de su estado
inmune pre-exposición o activación inmune
intra-exposición puede identificar equivalentes de
protección.
5'AGC CGA CCC AGC AGT TTA TCC C
(SEC ID Nº
1),
\vskip1.000000\baselineskip
grb2b
(anti-sentido) 5'C TCT GGT CCG CTT GGC CTT TCT (SEC
ID Nº
2).
Claims (8)
1. Una composición inmunogénica que comprende,
en un vehículo fisiológicamente aceptable, la cepa atenuada del
dengue-3 CH53489 PDK20 con ATCC Nº VR2647 y al menos
otro virus atenuado del dengue seleccionado entre
dengue-1 45AZ5 PDK 20 con ATCC Nº VR2648,
dengue-2 S 16803 PDK50 con ATCC Nº VR2653, y dengue
4 341750 PDK20 con ATCC Nº VR2652.
2. Una composición inmunogénica de acuerdo con
la reivindicación 1, que comprende dengue-1 45AZ5
PDK20 con ATCC Nº VR2648, dengue-2 S 16803 PDK50
con ATCC Nº VR-2653, dengue-3
CH53489 PDK20 con ATCC Nº VR2647, y dengue-4 341750
PDK20 con ATCC Nº VR-2652.
3. La composición inmunogénica de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 que comprende adicionalmente un adyuvante para
potenciar la respuesta inmune.
4. La composición inmunogénica de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, formulada en una dosis de
10^{2} a 10^{6} PFU de virus atenuado.
5. La composición inmunogénica de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho virus del
dengue se produce en células de vertebrados.
6. La composición inmunogénica de la
reivindicación 5, en la que dichas células son células Vero.
7. La composición inmunogénica de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho virus del
dengue-1 está en una cantidad de 10^{2} a 10^{7}
pfu/ml, dicho virus del dengue-2 está en una
cantidad de 10^{2} a 10^{7} pfu, dicho virus del
dengue-3 está en una cantidad de 10^{2} a 10^{7}
pfu, y dicho virus del dengue-4 está en una
cantidad de 10^{2} a 10^{7} pfu/ml.
8. La composición inmunogénica de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 formulada para
administración subcutánea.
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