ES2319242B1 - Aislado avirulento de neospora canimum y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Aislado avirulento de Neospora caninum y
sus usos.
La presente invención se refiere a un nuevo
aislado de Neospora caninum y a los extractos que pueden
obtener se del mismo. Dicho aislado presenta un alto grado de
atenuación, que lo hace apropiado para el desarrollo de vacunas
frente a la neosporosis, y de pruebas de diagnóstico para la
detección de la infección por Neospora caninum en animales.
También se describen composiciones farmacéuticas en las que se
emplean dicho aislado o extractos del mismo para la prevención y el
tratamiento de las infecciones causadas por Neospora caninum
en animales.
Description
Aislado avirulento de Neospora caninum y
sus usos.
La presente invención se refiere a un nuevo
aislado de Neospora caninum y a sus extractos, a
composiciones farmacéuticas para la prevención y el tratamiento de
la neosporosis en animales, y al desarrollo de pruebas de
diagnóstico para la detección de la infección por Neospora
caninum en los mismos.
Neospora caninum es un parásito de la
familia Sarcocystidae perteneciente al phylum Apicomplexa,
dentro del cual se agrupan algunos de los organismos causantes de
enfermedad más importantes conocidos por el hombre. En este grupo se
incluyen géneros como Plasmodium, Babesia, Cryptosporidium,
Eimeria y Toxoplasma.
N. caninum ha sido implicado como agente
productor de aborto y mortalidad neonatal en el ganado bovino,
aunque la infección también ha sido descrita en otros ungulados y
cánidos, como el coyote y el perro, que actúan como hospedadores
definitivos en el ciclo biológico de este parásito. Sin lugar a
dudas, destaca la importancia de esta enfermedad en el ganado bovino
y en el perro.
La neosporosis bovina está considerada como una
enfermedad parasitaria de distribución cosmopolita y representa una
de las causas más frecuentes de fallo reproductivo en los diversos
países donde se ha estudiado, entre ellos España.
La manifestación clínica más importante de la
infección es el aborto en las hembras gestantes que tiene lugar
generalmente entre el tercer y noveno mes de gestación. En relación
con la transmisión de la enfermedad, destaca la importancia de la
transmisión congénita y la importancia relativamente escasa de la
transmisión postnatal.
En cuanto al ciclo biológico de N.
caninum, hasta la fecha se han descrito tres estadios:
- -
- los ooquistes que son eliminados en las heces del hospedador definitivo, y que son capaces de infectar al hospedador tras su ingestión, al producirse un proceso de desenquistamiento y liberación de los esporozoítos infectivos.
- -
- los taquizoítos, responsables de la fase aguda de la infección que se multiplican en las células hospedadoras rápidamente, produciendo la lisis celular, lesiones tisulares y su propagación a otros tejidos, y
- -
- los bradizoítos, que se multiplican lentamente y se encuentran formando quistes tisulares en las células hospedadoras, y son responsables de la fase crónica de la infección.
Los métodos de diagnóstico utilizados para
detectar la infección por N. caninum, principalmente en
bovinos adultos, están constituidos por técnicas basadas en la
detección de anticuerpos séricos específicos frente al parásito.
Para ello, se han diseñado diferentes pruebas
serológicas que engloban la inmunofluorescencia indirecta (IFI),
ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) e inmunoblot.
Los antígenos utilizados en estas pruebas
serológicas proceden de taquizoítos obtenidos en cultivos celulares
de aislados bovinos y caninos de N. caninum. Dichos
taquizoítos se utilizan de diversas formas: enteros, extractos
celulares obtenidos a partir de los mismos, y proteínas antigénicas
recombinantes o purificadas por afinidad a partir de extractos
celulares de taquizoítos.
En la solicitud de patente PCT
WO-A-97/39009 se describe un método
para diagnosticar la neosporosis en el que se emplea una proteína
antigénica derivada de taquizoítos de N. caninum.
Se debe tener en cuenta que aunque un resultado
serológico positivo ayuda a identificar un animal adulto infectado,
un resultado negativo no descarta definitivamente la infección.
Diferentes estudios han demostrado que los
anticuerpos séricos frente a N. caninum pueden fluctuar en
función de la edad y el estado de gestación en bovinos, lo que
dificulta enormemente la interpretación de los resultados. Subsiste,
pues, la necesidad de disponer de métodos de diagnóstico
alternativos para detectar la infección por N. caninum.
En el estado de la técnica se describen diversos
productos vacunales para la protección frente a neosporosis que
incluyen vacunas inactivadas, vacunas desarrolladas a partir de
proteínas antigénicas recombinantes o de ADN, y vacunas vivas.
En la solicitud de patente
WO-A-99/20303 se describe una vacuna
que comprende taquizoítos inactivados y el adyuvante POLYGEN, que
genera una respuesta inmunológica en bovinos. En estudios
posteriores se ha visto que dicha vacuna era incapaz de proteger
frente al aborto en reproductoras gestantes experimentalmente
infectadas. Actualmente, es la única vacuna frente a N.
caninum registrada en los Estados Unidos de Norteamérica, y se
comercializa bajo el nombre de NEOGUARD.
En la solicitud de patente PCT
WO-A-95/25541 se describe una vacuna
contra neosporosis que comprende cultivos celulares de taquizoítos
de un aislado de Neospora caninum.
En la solicitud de patente
EP-A-0898969 se propone una vacuna
que incluye un homogeneizado de taquizoítos de N. caninum, en
el que no se encuentran células viables.
En la solicitud de patente
EP-A-0953641 se describe una vacuna
que contiene una proteína de Neospora caninum seleccionada
entre el grupo formado por GRA1, GRA2, SAG1, MIC1 o MAG1, o un
polinucleótido que codifica por dichas proteínas.
Como se describe en la solicitud de patente
WO-A-2004/026903, el principal
inconveniente de las vacunas inactivadas es que a menudo no
proporcionan una inmunidad celular suficiente, requieren agentes
adyuvantes, no proporcionan inmunidad local, y son peligrosas si la
inactivación no es total.
En la solicitud de patente
EP-A-0841392 se describe una vacuna
que comprende células vivas de mutantes termosensibles de N.
caninum que son capaces de prevenir el desarrollo de síntomas
clínicos asociados a la neosporosis en una prueba de desafío en un
modelo experimental murino.
Como se describe en la solicitud de patente
WO-A-2004/026903, las vacunas vivas
atenuadas presentan una serie de ventajas como son: la activación de
todas las fases del sistema inmunitario, la inducción de IgG
humorales y de IgA locales, la generación de respuestas
inmunológicas frente a múltiples antígenos protectores, y
proporcionar una inmunidad más duradera. Entre las desventajas cabe
destacar la dificultad para establecer el nivel apropiado de
atenuación y la posibilidad de reversión a la virulencia.
De ahí la importancia de la identificación y
aislamiento de parásitos que presentan un alto grado de atenuación
de forma natural.
En los estudios comparativos de las propiedades
biológicas de diferentes aislados se ha observado la existencia de
variabilidad, que incluye diferencias de patogenicidad y perfiles
genéticos, lo que implica que no todos los aislados de N.
caninum presentan las mismas propiedades o comportamiento
biológico.
Por ejemplo, en Atkinson et al., 1999,
Parasitology 118 (Pt 4):363-370, y en Miller et
al., 2002, Aust Vet J. 80(10):620-625, se
utilizó un modelo murino experimental que puso de manifiesto la
existencia de diferencias en la virulencia de los aislados
denominados Nc-SweB1, Nc-1 y
Nc-Nowra frente al aislado denominado
Nc-Liv, un parásito que produce signos clínicos más
graves.
En la solicitud de patente PCT
WO-A-02/103430 se describen vacunas
que comprenden taquizoítos vivos de un aislado de Neospora
denominado Nc-Nowra. Dicho parásito se aisló en
Australia, y presenta una patogenicidad atenuada de forma
natural.
Teniendo en cuenta que no se encuentra
disponible ningún tratamiento farmacológico eficaz de la
neosporosis, subsiste la necesidad de disponer de una vacuna que
pueda inducir una respuesta inmunológica apropiada para prevenir y
tratar la neosporosis, y que no presente los inconvenientes de las
vacunas mencionadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los autores de la invención han aislado e
identificado una nueva cepa de Neospora caninum que se
muestra atenuada de forma natural, y que resulta apropiada para la
preparación de composiciones farmacéuticas y el desarrollo de
métodos de diagnóstico.
El objeto de la presente invención es un
parásito aislado que presenta un alto grado de atenuación
natural.
En un segundo aspecto la invención tiene también
por objeto un cultivo celular biológicamente puro infectado por el
aislado de la invención.
En un tercer aspecto la invención tiene también
por objeto un anticuerpo que reacciona específicamente contra un
antígeno procedente del aislado de la invención.
En un cuarto aspecto la invención tiene también
por objeto un polipéptido obtenido a partir del aislado de la
invención.
En un quinto aspecto la invención tiene también
por objeto un polinucleótido obtenido a partir del aislado de la
invención.
En un sexto aspecto la invención tiene también
por objeto una vacuna que comprende el aislado de la invención, un
extracto del mismo, o una mezcla de ambos.
En un séptimo aspecto la invención tiene también
por objeto el uso del aislado de la invención para preparar una
vacuna para el tratamiento y/o prevención de la neosporosis en
animales.
En un octavo aspecto la invención tiene también
por objeto el uso de anticuerpos que reaccionan específicamente
contra un antígeno procedente del parásito aislado de la invención
para preparar un medicamento para el tratamiento de una infección
y/o enfermedad causada por Neospora caninum en animales.
En un noveno aspecto la invención tiene también
por objeto el uso de antígenos procedentes del aislado de la
invención para detectar la infección por el parásito Neospora
caninum en animales, a partir de una muestra biológica.
En un décimo aspecto la invención también tiene
por objeto el uso de anticuerpos que reaccionan específicamente
contra un antígeno procedente del parásito aislado de la invención
para detectar la infección por el parásito Neospora caninum
en animales, a partir de una muestra biológica.
En un undécimo aspecto la invención tiene
también por objeto el uso de polinucleótidos obtenidos a partir del
aislado de la invención para detectar la presencia de ácidos
nucleicos de Neospora caninum en animales, a partir de una
muestra biológica.
En las Figuras 1A a 1F se muestran las
secuencias nucleotídicas de ADN de cada uno de los 13
microsatélites amplificados y secuenciados del aislado objeto de la
invención Nc-Spain 1H. Figura 1A: A. MS1A (SEQ. ID.
NO.:1), B. MS1B (SEQ. ID. NO.:2); Figura 1B: C. MS2 (SEQ. ID.
NO.:3), D. MS3 (SEQ. ID. NO.:4); Figura 1C: E. MS4 (SEQ. ID.
NO.:5), F. MS5 (SEQ. ID. NO.:6); Figura 1D: G. MS6A y MS6B (SEQ.
ID. NO.:7), H. MS7 (SEQ. ID. NO.:8); Figura 1E: I. MS8 (SEQ. ID.
NO.:9), J. MS 10 (SEQ. ID. NO.: 10); y Figura 1F: K. MS 12 (SEQ.
ID. NO.:11) y M. MS21 (SEQ. ID. NO.:12).
En la Figura 2 se muestra la valoración de la
respuesta inmune humoral en el modelo de infección experimental
murino del aislado Nc-Spain 1H. En ordenadas se
representan los títulos de IgG determinados por la técnica IFI en
los días 8, 16 y 32 post-inoculación en ratones que
fueron inoculados con 10^{5}, 10^{6} y 10^{7} taquizoítos del
aislado Nc-Spain 1H. Las barras representan la
mediana, y los cuartiles 25% y 75% para cada caso.
En las Figuras 3A, 3B y 3C se presenta la
valoración de la respuesta inmune humoral en el modelo de infección
experimental murino del aislado Nc-Spain 1H. En
ordenadas se representa la densidad óptica determinada a 450 nm, y
que es una medida de los anticuerpos IgG1 e IgG2a específicos frente
a N. caninum determinados por ELISA en los días 8, 16 y 32
post-inoculación producidos en los ratones de los
Grupos A (Figura 3A), B (Figura 3B), y C (Figura 3C) que fueron
inoculados con 10^{5}, 10^{6} y 10^{7} taquizoítos del
aislado Nc-Spain 1H, respectivamente. Las barras
representan la mediana, y los cuartiles 25% y 75%.
En la Figura 4 se muestra la valoración de la
respuesta inmune celular en el modelo de infección experimental
bovino del aislado Nc-Spain 1H. En ordenadas se
encuentra la densidad óptica determinada a 450 nm, que es una medida
de los valores de IFN-\gamma producidos por los
animales inoculados con 10^{7} taquizoítos del aislado de
referencia Nc-1, del aislado
Nc-Spain 1H y PBS (grupo testigo). En abscisas se
muestran los días post-inoculación.
En la Figura 5 se presenta la valoración de la
respuesta inmune humoral en el modelo de infección experimental
bovino del aislado Nc-Spain 1H. En ordenadas se
representa la densidad óptica determinada a 450 nm (OD), que es una
medida de los valores medios de los anticuerpos IgG anti-N.
caninum producidos por los animales bovinos inoculados con
10^{7} taquizoítos del aislado de referencia Nc-1,
del aislado Nc-Spain 1H y PBS (grupo testigo). En
abscisas se muestran los días post-inoculación.
En las Figuras 6A y 6B se muestra la valoración
de la respuesta inmune humoral en el modelo de infección
experimental bovino del aislado Nc-Spain 1H. En
ordenadas se representa la densidad óptica determinada a 450 nm
(OD), que corresponde a los valores medios de los anticuerpos IgG1
(Figura 6A) e IgG2 (Figura 6B) anti-N. caninum producidos
por los animales inoculados con 10^{7} taquizoítos del aislado de
referencia Nc-1, del aislado
Nc-Spain 1H y PBS (grupo testigo). En abscisas se
muestran los días post-inoculación.
En esta descripción cuando se habla del parásito
aislado o simplemente aislado de la invención se refiere a la cepa
aislada de Neospora caninum en cualquier estadio de su ciclo
biológico que incluye taquizoítos, bradizoítos y esporozoítos.
Del mismo modo cuando se habla de extractos,
lisados celulares, polipéptidos y polinucleótidos obtenidos del
aislado se refiere a extractos, lisados celulares, polipéptidos y
polinucleótidos obtenidos del aislado de la invención en cualquier
estadio de su ciclo biológico que incluye taquizoítos, bradizoítos
y esporozoítos.
El objeto de la presente invención es una nueva
cepa de Neospora caninum aislada a partir de tejido nervioso
de una ternera de la raza Frisona-Holstein
congénitamente infectada.
El nuevo aislado se ha denominado
Nc-Spain 1H.
Dicho aislado se ha identificado y caracterizado
mediante diferentes estudios in vitro e infecciones
experimentales in vivo como un nuevo aislado de Neospora
caninum.
El aislado de la invención presenta un alto
grado de atenuación natural, es decir, manifiesta atenuación sin
haber sido manipulado, y por ello es un candidato apropiado para el
desarrollo de vacunas frente a la neosporosis, y para el desarrollo
de pruebas de diagnóstico para detectar la presencia del parásito o
de la infección causada por el mismo a partir de muestras
biológicas de animales.
Una muestra del aislado Nc-Spain
1H se ha depositado el día 20.09.2005, de acuerdo con las
provisiones del Tratado de Budapest sobre reconocimiento
internacional del depósito de microorganismos a fines del
procedimiento en materia de patentes, en la Colección de Cultivos de
Algas y Protozoos (Culture Collection of Algae and Protozoa, CCAP)
situada en el Dunstaffnage Marine Laboratory, Dunbeg, OBAN,
Ar-gyll PA37 1QA, Escocia, Gran Bretaña, que le ha
otorgado el número de acceso CCAP 2051/2.
Este aislado fue obtenido a partir de
homogenizados del tejido nervioso (encéfalo y médula espinal) de
una ternera de aptitud láctea congénitamente infectada, tal como se
describe en el Ejemplo 1.
Para su identificación y caracterización se
procedió a la extracción del ADN genómico de una muestra de tejido
nervioso, que se sometió a una PCR anidada desarrollada para la
detección específica del ADN del parásito en muestras clínicas. La
amplificación específica de la región ITS-1, según
se describe en Buxton et al., 1998, J. Comp Pathol. 118:
267-279, confirmó la presencia de parásitos de
Neospora en dicha muestra.
La caracterización genética del aislado de la
invención se realizó empleando la tecnología de microsatélites, que
resulta ser una herramienta adecuada para ser aplicada en la
identificación y discriminación de los diferentes aislados de N.
caninum, como se describe en el Ejemplo 2 de esta
descripción.
Los microsatélites están constituidos por
secuencias nucleotídicas sencillas de 2 a 5 nucleótidos que se
repiten en tándem y que se caracterizan por un elevado
polimorfismo, principalmente en función del número de repeticiones
del motivo nucleotídico que presentan. Este tipo de secuencias ha
sido descrito en multitud de organismos procariotas y eucariotas,
incluyendo protozoos, y han sido extensamente utilizadas para el
genotipado de diferentes parásitos apicomplejos como Toxoplasma
gondii (Ajzenberg et al., 2002, Int. J. Parasitol.
32:27-38), Cryptosporidium parvum y
Cryptosporidium hominis (Mallon et al., 2003, Infect.
Genet. Evol. 3:207-218), Plasmodium
falciparum (Anderson et al., 2000, Mol. Biol. Evol.
17:1467-1482) y Theileria parva (Oura et
al., 2003, Int. J. Parasitol.
33:1641-1653).
33:1641-1653).
Los resultados obtenidos al comparar diez
aislados de Neospora, entre ellos el aislado
Nc-Spain 1H de la invención, permiten concluir que
todos son distintos.
La comprobación in vivo de que el
parásito era del género Neospora se llevó a cabo mediante la
inoculación de ratones atímicos de la estirpe BALB/c con diferentes
cantidades del tejido infectado, que condujo a la aparición de
signos clínicos compatibles con neosporosis. Finalmente el parásito
se aisló en cultivos celulares de la línea celular
MARC-145 (células de riñón de mono).
La patogenicidad del aislado de la invención se
ensayó en un modelo murino y bovino gestante tal como se describe
más adelante en los Ejemplos 3 y 4, respectivamente.
Los ratones se dividieron en cuatro grupos, tres
de los cuáles fueron inoculados con 10^{5}, 10^{6} y 10^{7}
taquizoítos del parásito Nc-Spain 1H obtenidos de
cultivo celular, y el cuarto grupo (testigo) inoculado con solución
tampón PBS.
Los ratones de los grupos infectados no
desarrollaron signos compatibles con la infección por
Neospora, ni mortalidad durante los 32 días que duró el
experimento. Ello demuestra el alto grado de atenuación de la cepa
Nc-Spain 1H.
Aunque en dichos ratones se detectó la presencia
de ADN de N. caninum en sangre, pulmón y encéfalo, la
persistencia de la misma en estos órganos fue muy inferior a la que
se observa cuando se inoculan cepas virulentas de N. caninum,
lo cual corrobora asimismo el alto grado de atenuación de esta
cepa.
En el modelo bovino gestante, se inocularon
novillas en el día 70 de gestación administrando por vía intravenosa
10^{7} taquizoítos del aislado de referencia de N. caninum,
Nc-1 (Dubey et al., 1988, J. Am. Vet. Med.
Assoc. 193:1259-63) (grupo 1),
Nc-Spain 1H (grupo 2) o PBS (grupo 3). En el grupo
infectado con Nc-1 se produjo la muerte fetal en 3
de las 5 novillas inoculadas. En los animales pertenecientes al
grupo infectado con Nc-Spain 1H, no se observó la
muerte fetal durante los 45 días que duró el experimento. Asimismo,
en el grupo 2 el ADN del parásito no se detectó en los tejidos
fetales y las lesiones observadas en placenta y órganos fetales
fueron más leves que las encontradas en los animales infectados con
Nc-1.
Los ensayos de inmunogenicidad se llevaron a
cabo en un modelo murino con ratones (Ejemplo 5), y en un modelo
bovino con vacas (Ejemplo 6).
En estos ensayos se pudo observar que, en los
animales infectados con taquizoítos del aislado de la invención
Nc-Spain 1H, se inducía la producción de anticuerpos
que reaccionaban con antígenos del aislado de referencia de N.
caninum, Nc-1. Ello demuestra la capacidad de
la cepa Nc-Spain 1H de inducir una respuesta inmune
específica frente a N. caninum.
La detección de anticuerpos específicos frente a
N. caninum en el plasma de ratones infectados con
taquizoítos procedentes del aislado de la invención se determinó
mediante las técnicas de IFI y ELISA.
Cuando se utilizó la técnica IFI, como antígenos
se emplearon taquizoítos inactivados del aislado de
referencia
Nc-1.
Nc-1.
La presencia de anticuerpos se detectó a partir
del día 8 post-inoculación (PI) en los grupos
inoculados con la dosis mayor (10^{7} taquizoítos), y los títulos
de IgG obtenidos por IFI variaron también en función de la dosis
infectiva, obteniéndose los más elevados (1:200 - 1:400) en los
ratones del grupo inoculado con la dosis mayor, tal como se observa
en la Figura 2.
La detección de las inmunoglobulinas de los
isotipos IgG1 e IgG2a específicas para N. caninum en el
plasma se llevó a cabo mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA)
indirecto empleando como antígeno proteína del extracto soluble de
taquizoítos del aislado de referencia Nc-1 de N.
caninum obtenido por sonicación.
Se observó un aumento de los isotipos IgG2a e
IgG1 a partir del día 8 PI, siendo más evidente el incremento de la
inmunoglobulina IgG2a en los grupos infecta- dos con 10^{5} y
10^{6} taquizoítos del aislado de la invención.
En los días 16 y 32 PI, los ratones inoculados
con 10^{5} y 10^{6} taquizoítos tuvieron mayor concentración de
IgG2a que IgG1. No obstante, en el grupo inoculado con 10^{7}
taquizoítos la producción de IgG1 fue predominante en el día 16.
En las Figuras 3A, 3B y 3C se muestran los
resultados de las lecturas de densidad óptica a 450 nm, que es una
medida de los anticuerpos IgG1 e IgG2, para los ratones infectados
con 10^{5}, 10^{6} y 10^{7} taquizoítos del aislado
Nc-Spain 1H, respectivamente.
A la vista de los resultados se puede concluir
que la infección de ratones con taquizoítos del aislado de la
invención induce la producción de anticuerpos que reaccionan
específicamente con antígenos de un aislado de referencia de N.
caninum como es el aislado Nc-1.
En los ensayos con novillas se determinó la
producción de interferón gamma (IFN-\gamma) como
indicador de la respuesta inmune celular generada en los animales
debido a la infección con taquizoítos del parásito aislado
Nc-Spain 1H, y se evaluó la respuesta inmune
humoral mediante la determinación por ELISA de las inmunoglobulinas
IgG, IgG1 e IgG2.
En los grupos infectados se detectó un
incremento en los niveles de IFN-\gamma frente a
los del grupo control en los días 5 y 12
post-inoculación, como se puede observar en la
Figura 4.
En cuanto a la inmunoglobulina IgG total
específica, los valores del grupo de animales infectados con
taquizoítos del parásito aislado de la invención fueron superiores
a los del grupo testigo, pero las diferencias no fueron
significativas. Los resultados se muestran en la Figura 5.
Los isotipos IgG1 e IgG2 se valoraron a partir
del día en el que se observó un aumento significativo de los valores
de IgG con respecto al grupo testigo.
A partir del día 12
post-inoculación, se produjo un aumento
significativo de IgG1, y los mayores niveles se alcanzaron a partir
del día 34, siendo estos valores estadísticamente diferentes a los
valores del grupo testigo.
Los valores de IgG2 permanecieron ligeramente
por encima de los del grupo testigo, pero no se encontraron
diferencias significativas entre ambos. Los resultados
correspondientes al isotipo IgG1 se muestran en la Figura 6A, y los
del isotipo IgG2 se muestran en la Figura 6B.
A la vista de los resultados se puede concluir
que la infección de novillas con taquizoítos del aislado de la
invención induce la producción de anticuerpos que reaccionan
específicamente con antígenos de un aislado de referencia de N.
caninum como es el aislado Nc-1.
Consecuentemente, el aislado
Nc-Spain 1 H es una cepa N. caninum de alto
grado de atenuación que induce la producción de anticuerpos que
reaccionan específicamente contra antígenos de N.
caninum.
\vskip1.000000\baselineskip
También es un objeto de la invención un cultivo
celular biológicamente puro infectado por el aislado de la
invención.
La expresión "cultivo celular biológicamente
puro" del aislado de N. caninum se refiere a un cultivo
del aislado Nc-Spain 1H mantenido de forma continua
sustancialmente libre de otros organismos salvo las células
hospedadoras donde el parásito Neospora crece. Se considera
que un cultivo es sustancialmente libre de otros organismos si tras
los procedimientos de recuperación normalizados del aislado dan como
resultado una preparación con al menos el 95% y, preferiblemente el
99% o más del organismo.
Preferiblemente el cultivo celular infectado es
de células de riñón de mono. Entre ellas se pueden mencionar las
líneas celulares MA-104, Vero, y los clones
celulares C8 y MARC-145.
\vskip1.000000\baselineskip
Forma parte también del objeto de la invención
un anticuerpo que reacciona específicamente contra un antígeno
procedente del aislado de la invención.
El término "anticuerpo" se refiere a una
molécula de inmunoglobulina producida por un organismo animal capaz
de unirse a un epítopo específico en un antígeno. Los anticuerpos
pueden estar constituidos por una mezcla policlonal o ser
anticuerpos monoclonales. También pueden estar constituidos por
inmunoglobulinas intactas de origen natural o de naturaleza
recombinante o fragmentos de estos anticuerpos que retienen su
capacidad de reconocimiento y unión del antígeno diana y que
incluyen la Fv, F(ab), y F(ab)_{2}, así como
cadenas simples. También se pueden emplear anticuerpos formados por
cadenas simples en los cuales la cadena pesada o la cadena ligera
pueden estar combinadas con otras moléculas.
Preferiblemente el antígeno procedente del
aislado Nc-Spain 1H se selecciona entre el grupo
formado por el propio aislado, taquizoítos, bradizoítos,
esporozoítos, lisados celulares, polipéptidos antigénicos, o sus
mezclas.
Más preferiblemente el antígeno se selecciona
entre el grupo formado por taquizoítos y polipéptidos
antigénicos.
Los polipéptidos antigénicos pueden ser
obtenidos a partir del propio aislado, o bien mediante tecnología
recombinante a partir de polinucleótidos obtenidos a partir del
aislado de la invención.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monoclonales o estar constituidos por una mezcla policlonal.
Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos
idénticos porque son producidos por un solo tipo de célula del
sistema inmune.
Preferiblemente el anticuerpo de la invención es
monoclonal.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser
obtenidos por diferentes técnicas bien descritas en el estado de la
técnica, como por ejemplo, en Harlow y Lane, 1988, "Antibodies: A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor.
Los anticuerpos de la invención son apropiados
para detectar la presencia del parásito Neospora caninum o
de la infección causada por el mismo en animales, a partir de
muestras biológicas.
También forma parte del objeto de la invención
un polipéptido obtenido a partir del parásito aislado de la
invención.
En esta descripción, el término
"polipéptido" incluye los polipéptidos obtenidos de los
cultivos del parásito aislado de la invención, y también los
polipéptidos recombinantes producidos en sistemas de expresión
heterólogos tras la transcripción y traducción de polinucleótidos
obtenidos a partir del parásito aislado de la presente invención en
cualquier estadio de su ciclo biológico.
Para el aislamiento de polipéptidos antigénicos
del nuevo aislado se pueden emplear las técnicas habitualmente
empleadas para la purificación de proteínas o polipéptidos, tal
como se describe en Scopes, 1994, "Protein Purification:
Principles and Practice", Springer-Verlag, 3rd.
Ed. Entre las mismas se incluyen la precipitación selectiva
utilizando agentes como el sulfato amonio, la cromatografía de
columna, y métodos de inmunopurificación.
La secuenciación de polipéptidos y/o fragmentos
de los mismos permite obtener polinucleótidos y oligonucleótidos de
interés para el desarrollo de pruebas de diagnóstico, y para la
expresión de polipéptidos recombinantes. Éstos se pueden modificar
mediante la realización de defecciones, inserciones y sustituciones
en su secuencia aminoacídica, dando lugar a polipéptidos distintos,
pero que conservan su capacidad inmunogénica. Para ello se pueden
emplear técnicas bien conocidas y descritas por ejemplo en Sambrook
et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbour Publish, Cold Spring Harbourd, Nueva York 2nd
Ed.
Las secuencias polipeptídicas de la invención
incluyen no solamente a aquellas secuencias idénticas, sino también
a aquéllas sustancialmente idénticas a las mismas.
En esta descripción el término "idénticas"
se refiere a dos o más secuencias que son la misma, mientras que la
expresión "porcentaje de identidad" de secuencias para dos o
más polinucleótidos y polipéptidos se refiere a dos o más secuencias
que presentan un porcentaje concreto de nucleótidos o residuos
aminoacídicos que son iguales, cuando éstas son alineadas para la
máxima correspondencia, comparadas y este porcentaje es calculado
mediante el uso de algoritmos utilizados en su comparación o por
inspección visual.
La expresión "substancialmente idénticas"
se refiere a secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas que
tienen al menos un 60%, preferiblemente un 80% y más
preferiblemente entre un 90-95% de identidad en los
nucleótidos o residuos aminoacídicos, cuando son comparadas,
alineadas para la máxima correspondencia y su porcentaje de
identidad calculado por los métodos ya mencionados. Para la
comparación de secuencias, habitualmente una secuencia actúa como
secuencia de referencia con la que el resto de las secuencias en
estudio son comparadas. Generalmente, las secuencias son comparadas
utilizando programas informáticos que calculan el porcentaje de
identidad de las secuencias en estudio respecto a la secuencia de
referencia en función de los parámetros establecidos en el programa.
El programa BLAST es un ejemplo de los programas utilizados para
calcular el porcentaje de identidad y similitud entre secuencias.
El software del programa BLAST es de acceso público a través del
National Center for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Los polipéptidos de la invención pueden ser de
interés diagnóstico o inmunogénico. En el primer caso pueden formar
parte de pruebas de inmunoensayo como antígeno para la detección de
anticuerpos específicos frente a N. caninum, y en el segundo
caso pueden formar parte de composiciones inmunogénicas para la
prevención y el tratamiento de las infecciones causadas por
Neospora.
En otro aspecto, el objeto de la invención
también comprende un polinucleótido obtenido a partir del parásito
aislado de la invención.
En esta descripción el término
"polinucleótido" hace referencia a moléculas de los ácidos
nucleicos ADN o ARN.
Los polinucleótidos de la invención también
incluyen aquellas moléculas nucleotídicas que pueden ser
"sustancialmente idénticas" a las secuencias de los mismos,
como ya se ha descrito anteriormente.
De hecho, un número variable de secuencias
polinucleotídicas que son transcritas y traducidas pueden producir
polipéptidos funcionales idénticos debido a la degeneración del
código genético.
Dos secuencias polinucleotídicas también se
consideran substancialmente idénticas si hibridan la una con la
otra en condiciones de alta especificidad. Estas condiciones
dependen normalmente de la secuencia y serán diferentes en función
de las condiciones ensayadas. Por ejemplo, las condiciones
habituales para Southern blot incluyen el lavado a
temperatura ambiente con el tampón 2xSSC, 0.1% SDS.
Los polinucleótidos de la invención se pueden
obtener a partir del parásito aislado en cualquier estadio del ciclo
del parásito mediante el empleo de técnicas descritas en el estado
de la técnica, y bien conocidas por el experto en la materia.
Por ejemplo el ADN genómico o ARN total o
mensajero se pueden extraer y purificar mediante la lisis celular y
su posterior extracción con fenol/cloroformo.
Se pueden elaborar genotecas representativas de
ADN genómico o ADN complementario a partir del tratamiento del ADN
genómico con enzimas de restricción, o bien mediante la producción
de ADN complementario a partir del ARN mensajero y su posterior
inserción en vectores de amplificación de células procariotas, como
por ejemplo Escherichia coli.
Como se describe en Innis et al., 1990,
"PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic
Press, San Diego, es bien conocido que la tecnología de la reacción
de la polimerasa en cadena (PCR) se puede emplear, entre otras
aplicaciones, para amplificar las secuencias nucleotídicas de los
genes requeridos a partir de ARN mensajero, ADN genómico o
genotecas para su posterior expresión heteróloga, o bien como
método de diagnóstico mediante la amplificación de ADN específico de
Neospora a partir del ADN de una muestra biológica, o bien
para la obtención de sondas nucleotídicas que permitirán detectar la
presencia de ARN mensajero o ADN del parásito en muestras
biológicas.
Los polinucleótidos obtenidos a partir de los
cultivos del nuevo aislado se pueden emplear para la expresión de
proteínas recombinantes. Las secuencias polinucleotídicas utilizadas
en la expresión heteróloga de polipéptidos pueden ser modificadas
con el fin de obtener variaciones en estos polipéptidos para
facilitar su expresión y/o purificación.
De acuerdo con métodos conocidos en el estado de
la técnica, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de
interés son introducidos en sistemas heterólogos de expresión
adecuados, seguido de la inducción del sistema para producir grandes
cantidades de proteína. Entre los sistemas heterólogos se incluyen
células procariotas, como por ejemplo E. coli, levaduras,
como por ejemplo Sacharomyces cerevisiae, Schizosacharomyces
pombe, y Pichia pastoris, y líneas celulares de
mamíferos, como por ejemplo CHO, HEK, COS, o de insecto, las cuales
pueden expresar grandes cantidades del polipéptido de interés que
posteriormente es sometida a un proceso de purificación.
La introducción del material genético en la
célula hospedadora o sistema de expresión del polipéptido se puede
llevar a cabo por multitud de técnicas entre las que se encuentran:
transfección con sales de calcio, esferoplastos, electroporación,
liposomas, y vectores víricos.
El vector utilizado para la inclusión del
material genético dentro de la célula, puede ser cualquiera de los
vectores de expresión convencionales desarrollados para la
expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas. Éstos
presentan una unidad de transcripción o cassette de expresión
requerido para la transcripción y posterior traducción del ADN que
codifica el polipéptido de interés por la célula hospedadora.
Tras el crecimiento de las células con el ADN
recombinante y la expresión del polipéptido, tanto el medio de
cultivo como las células pueden ser recogidas para la purificación
del polipéptido heterólogo. Los métodos de purificación y
concentración del polipéptido expresado incluyen entre otros
adsorción, ultrafiltración, ultracentrifugación, fraccionamiento
mediante sulfato amónico, cromatografía de afinidad, cromatografía
de intercambio iónico, y cromatografía de afinidad por cola de
Histidinas (His6).
Los polipéptidos obtenidos por tecnología
recombinante, una vez purificados se pueden emplear para la
obtención de anticuerpos, para el desarrollo de pruebas de
diagnóstico y para la elaboración de formulaciones farmacéuticas
inmunogénicas.
Los polinucleótidos de la invención pueden
emplearse en la expresión heteróloga de polipéptidos de
Neospora de interés diagnóstico o inmunogénico, y como sondas
de diagnóstico para detectar la presencia de ADN de Neospora
en muestras biológicas.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también tiene por objeto una vacuna
que comprende el aislado de la invención depositado con el número de
acceso CCAP 2051/2, un extracto del mismo, o una mezcla de
ambos.
Dicha vacuna es una composición farmacéutica que
puede ser utilizada para el tratamiento y la prevención de
infecciones y enfermedades provocadas por N. caninum.
En las vacunas, el aislado de la invención
preferiblemente está en forma de aislado vivo atenuado, inactivado,
o fijado, en cualquier estadio de su ciclo biológico.
La cepa de Neospora caninum de la
invención se puede emplear directamente para preparar las vacunas
frente a neosporosis, ya que presenta un alto grado de atenuación.
No obstante, también se puede atenuar adicionalmente empleando
técnicas de atenuación que son bien conocidas por el experto en la
materia.
El extracto del aislado de la invención se puede
obtener en cualquier estadio de su ciclo biológico.
Preferiblemente dicho extracto se selecciona
entre el grupo formado por lisados celulares, polipéptidos
antigénicos y polinucleótidos que codifican polipéptidos
antigénicos.
Los lisados celulares se pueden obtener mediante
técnicas bien conocidas por el experto en la materia, como son por
ejemplo, la sonicación, y la homogeneización.
Los polipéptidos antigénicos se pueden extraer
del aislado de la invención, y pueden estar purificados de forma
parcial o total, como ya se ha descrito anteriormente.
Como ya se ha descrito, los polipéptidos
antigénicos también se pueden preparar mediante técnicas de ADN
recombinante, de la misma forma que los polinucleótidos que
codifican polipéptidos antigénicos.
Además, dichos polinucleótidos pueden ser
donados en vectores víricos capaces de transfectar células huésped
en animales. Los virus atenuados vivos, de la familia vaccinia o
adenovirus, son alternativas convenientes para la generación de
vacunas de ADN debido a su bajo coste de producción y la facilidad
de su transporte y administración. Los polinucleótidos también
pueden ser incorporados a vectores de vacunas no virales.
Las vacunas que contienen el aislado de la
invención o un extracto del mismo como agente inmunógeno son
habitualmente preparadas como inyectables en soluciones líquidas o
suspensiones, o en forma sólida, para su posterior reconstitución
en solución o suspensión previamente a su administración.
La vacuna también puede ser formulada como
emulsión o se puede encapsular el agente inmunógeno en liposomas, o
cualquier sistema apropiado. En su formulación el agente inmunógeno
puede ir combinado con excipientes de uso farmacéutico habitual
compatibles con el mismo, como por ejemplo: agua, solución salina,
dextrosa, glicerol, etanol o similares, y sus combinaciones.
La vacuna también puede llevar agentes
humectantes o emulsionantes, reguladores del pH, conservantes y/o
adyuvantes que aumentan la efectividad de la vacuna como por
ejemplo: compuestos de aluminio (como por ejemplo hidróxido de
aluminio, fosfato de aluminio, y sulfato potásico de aluminio),
sulfato de berilio, sílice, caolín, carbón, emulsiones agua/aceite
o aceite/agua, endotoxina bacteriana, Corynebacterium parvum
(Propionobacterium acnes), Bordetella pertussis,
poliribonucleótidos, alginato sódico, lanolina, vitamina A,
saponinas, liposomas, DEAE-dextrano, copolímeros, y
otros adyuvantes sintéticos.
También se pueden incorporar a la vacuna
citoquinas y/u otros inmunomoduladores como
IFN-\gamma.
La concentración del agente inmunógeno y del
compuesto adyuvante puede variar dentro de un amplio margen en
función de que la cantidad de ambos sea efectiva. Una vez preparada
la vacuna, ésta se puede envasar en contenedores estériles y ser
almacenada de la forma adecuada para su mantenimiento de forma
estable durante largos periodos de tiempo, por ejemplo a baja
temperatura o mediante un proceso de liofilización.
Las vacunas que se presentan como inyectables se
pueden administrar parenteralmente, mediante la inyección
subcutánea, intradérmica, endovenosa, o intramuscular.
También se pueden emplear otras formulaciones
para administrar la vacuna como por ejemplo supositorios o
formulaciones orales, por ejemplo cápsulas o comprimidos. En estos
casos las técnicas de formulación, los adyuvantes, y las sustancias
auxiliares apropiadas son bien conocidos por el experto en la
materia.
Las vacunas de la presente invención pueden ser
administradas de forma preventiva a animales sensibles a la
infección o la enfermedad con el fin de inducir una respuesta
inmune más eficaz frente al parásito.
También se puede administrar la vacuna para el
tratamiento de la infección o de la enfermedad una vez han aparecido
los primeros síntomas.
Para la inmunización de bovinos y otros animales
pueden ser efectivos diversos regímenes de vacunación. Así, por
ejemplo, el ganado bovino puede ser vacunado durante el periodo
reproductivo para prevenir el aborto y reducir la posibilidad de
infecciones congénitas.
También forma parte de la invención el uso del
aislado de la invención para preparar una vacuna para el
tratamiento y/o prevención de la neosporosis en animales.
Forma parte también del objeto de la invención
el uso de anticuerpos que reaccionan específicamente contra un
antígeno procedente de la cepa de la invención para preparar un
medicamento para el tratamiento de una infección y/o enfermedad
causada por N. caninum en animales.
En esta descripción "muestra biológica" se
refiere a cualquier muestra obtenida de organismos vivos o muertos.
Ejemplos de muestras biológicas son los fluidos biológicos (sangre,
suero, plasma, orina, semen, líquido ascítico, líquido
cerebroespinal y fluidos fetales), las muestras de tejidos
(originarios de encéfalo, médula espinal, pulmón, corazón, hígado,
y placenta) y los cultivos celulares.
Forma parte también del objeto de la invención
el uso de antígenos procedentes del aislado de la invención para
detectar la infección por el parásito Neospora caninum en
animales, a partir de una muestra biológica.
Preferiblemente el antígeno del parásito aislado
Nc-Spain 1H se selecciona entre el grupo formado por
el propio aislado, taquizoítos, bradizoítos, esporozoítos, lisados
celulares, polipéptidos antigénicos, o sus mezclas.
Más preferiblemente el antígeno empleado se
selecciona entre el grupo formado por taquizoítos y polipéptidos
antigénicos.
Los polipéptidos antigénicos pueden ser
obtenidos a partir del propio aislado, o bien mediante tecnología
recombinante a partir de polinucleótidos obtenidos a partir del
aislado de la invención.
Para detectar la infección por el parásito
Neospora en animales a partir de una muestra biológica se
pueden emplear procedimientos para la detección de la respuesta
inmunológica generada por la infección por Neospora, bien
descritos en textos de inmunología, como por ejemplo en Brostoff,
Male, y Roitt, 2000, Inmunología, 5ª Edición, Editorial Harcourt
Brace.
Así, por ejemplo, el antígeno de la invención se
puede inmovilizar en una superficie sólida, y el complejo
antígeno-anticuerpo se puede detectar usando
anticuerpos anti-inmunoglobulina de la especie de la
que procede la muestra en estudio marcados con moléculas
fluorescentes o que presentan actividad enzimática.
También forma parte del objeto de la invención
el uso de anticuerpos que reaccionan específicamente contra un
antígeno procedente del parásito aislado de la invención para
detectar la presencia del parásito Neospora en una muestra
biológica.
Como ya se ha descrito anteriormente,
preferiblemente el antígeno procedente del parásito aislado
Nc-Spain 1H se selecciona entre el grupo formado por
el propio aislado, taquizoítos, bradizoítos, esporozoítos, lisados
celulares, polipéptidos antigénicos obtenidos del mismo aislado,
polipéptidos antigénicos obtenidos mediante tecnología recombinante
a partir de polinucleótidos obtenidos del mismo aislado, o sus
mezclas.
Más preferiblemente el antígeno empleado se
selecciona entre el grupo formado taquizoítos y polipéptidos
antigénicos.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monoclonales o estar constituidos por una mezcla policlonal.
Preferiblemente el anticuerpo de la invención es
monoclonal.
Los inmunoensayos utilizados para medir los
anticuerpos anti-Neospora o antígenos del parásito pueden
emplear ensayos de unión antígeno-anticuerpo
competitivos o no competitivos.
En los ensayos competitivos, la muestra a
analizar (por ejemplo, anticuerpos anti-N. caninum) compite
con otro anticuerpo marcado (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal
anti-N. caninum) por su unión específica a un antígeno (por
ejemplo, proteína aislada de N. caninum) unida a una
superficie sólida. La concentración del anticuerpo marcado unido al
antígeno será inversamente proporcional a la cantidad de anticuerpo
libre presente en la muestra.
Los ensayos no competitivos son los más
habituales, y en ellos los componentes de la muestra a analizar que
indican la presencia del parásito se unen específicamente a dos
reactivos que forman parte de la prueba. Uno de ellos es utilizado
para la captura de los componentes de la muestra y permanece unido
a una superficie sólida. El segundo está marcado y es utilizado
para medir o detectar la presencia de los complejos previamente
formados.
En otra realización, el inmunoensayo se puede
llevar a cabo en fase líquida y mediante una variedad de métodos que
permiten separar el complejo formado de los componentes de la
muestra no unidos. Estos métodos incluyen por ejemplo
inmunoprecipitación, cromatografía de columna, adsorción, y adición
de partículas magnéticas tapizadas con un reactivo capaz de unirse
al complejo.
También se puede utilizar la técnica de
inmunoblot para detectar la presencia de anticuerpos específicos
frente a Neospora en una muestra biológica. Esta técnica es
aplicada habitualmente para detectar la presencia de anticuerpos
específicos de la muestra frente a una proteína en particular.
Dicha técnica implica la separación de las proteínas por
electroforesis en geles de acrilamida en función de su tamaño y/o
punto isoeléctrico en un gradiente de pH, la transferencia de las
proteínas separadas a una superficie sólida adecuada (membrana de
nitrocelulosa o nylon) y la incubación de las proteínas
transferidas con la muestra que contiene los anticuerpos. Esto
permite la unión específica de los anticuerpos presentes en la
muestra a las respectivas proteínas presentes, formando unos
complejos antígeno-anticuerpo que son detectados
mediante el empleo de anticuerpos
anti-inmunoglobulina marcados de los animales de
origen de la muestra.
El marcaje de los reactivos utilizados en las
pruebas anteriormente descritas puede efectuarse mediante marcaje
radiactivo con los isotopos H^{3}, I^{125}, C^{14} o P^{32}
o mediante la unión a ligandos fluoróforos, como por ejemplo,
fluoresceína y rodamina, quimioluminiscentes, como por ejemplo,
luciferasa, enzimas, como por ejemplo fosfatasas, esterasas,
peroxidasas, al complejo biotina-estreptavidina y
otros anticuerpos que pueden actuar como diana de unión para un
compuesto marcado. Aún así, en algunos ensayos no es necesario el
uso de compuestos marcados. Por ejemplo, en ensayos de aglutinación
desarrollados para detectar la presencia de anticuerpos, el antígeno
se presenta recubriendo partículas que se aglutinan si existe la
presencia de anticuerpos específicos frente a ese antígeno,
detectándose la formación de los complejos por la simple inspección
visual o visualización microscópica.
El objeto de la invención también incluye el uso
de polinucleótidos obtenidos a partir de la cepa de la invención
para detectar la presencia de ácidos nucleicos específicos de
Neospora caninum en animales, a partir de una muestra
biológica.
Existe una variedad de métodos para la detección
del ADN y ARN mediante técnicas de hibridación, entre las que se
encuentra la PCR, como se describe en Sambrook et al., 1989,
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour
Publish., Cold Spring Harbourd, Nueva York 2nd Ed.
Otro de los métodos utilizados es el Southern
blot, en el que el ADN genómico obtenido a partir de la muestra
es digerido con enzimas de restricción, separado en geles de
agarosa, desnaturalizado y transferido a membranas. Posteriormente,
la hibridación es llevada a cabo con polinucleótidos marcados que
actúan como sonda e hibridan específicamente con el ADN de
Neospora. La detección de los complejos de hibridación
formados permite determinar la presencia o ausencia de ADN de
Neospora en la muestra. De forma similar, la técnica de
Northern blot puede ser usada para la detección de mRNA de
Neospora en muestras de ARN.
Un método alternativo para la detección de
ácidos nucleicos de Neospora es mediante ensayos de
hibridación in situ (Angerer et al., 1987, Methods.
Enzymol. 152: 649-661). En este caso células o
muestras tisulares permanecen fijadas a una superficie sólida y tras
un proceso de desnaturalización de su ADN, la muestra es puesta en
contacto con la sonda específica marcada. La sensibilidad de los
ensayos de hibridación podría ser aumentada mediante la
amplificación de la molécula de ácido nucleico diana con técnicas
como la PCR.
La expresión de "hibridación específica" se
refiere a la hibridación entre la secuencia que actúa como sonda
con la secuencia diana únicamente. Aunque la sonda podría unirse a
otras secuencias no relacionadas, al menos el 90% y preferiblemente
el 95% o más de los complejos de hibridación formados serán con la
secuencia diana.
Los ejemplos que siguen a continuación se
exponen a efectos de proporcionar al experto en la materia una
explicación suficientemente clara y completa de la presente
invención, pero no deben ser considerados como limitaciones a los
aspectos esenciales del objeto de la misma, tal y como han sido
expuestos en los apartados anteriores de esta descripción.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo se describe el aislamiento del
parásito N. caninum Nc-Spain 1H a partir de
una ternera congénitamente infectada de la raza
Frisona-Holstein.
La ternera nació de una vaca que había dado
resultados positivos en las pruebas de detección para anticuerpos
específicos frente a Neospora mantenida en una explotación
lechera localizada en la provincia de Madrid, España. Desde el año
2001, la explotación fue sometida a diferentes estudios para
confirmar la presencia y prevalencia de la infección por
Neospora, estableciendo un patrón de infección endémico. En
los fetos abortados procedentes de la explotación se detectó la
presencia del ADN del parásito en el encéfalo mediante PCR anidada
de la región ITS-1.
En Marzo del 2003, de una de las vacas
identificada como seropositiva, nacieron dos terneros gemelos cuyo
suero precalostral fue extraído y analizado para la detección de
anticuerpos específicos frente a Neospora por la técnica de
IFI (Pare et al., 1995, J Vet Diagn Invest.
7(2):273-5), dando como resultado un título
de 1:500. Dos semanas después de su nacimiento, ambos terneros
permanecían saludables y sin mostrar ningún signo clínico. En esta
fecha, uno de los terneros de sexo hembra fue sacrificado mediante
una inyección de 20-40 ml de T-61
(Embutramida y Mebezonio yoduro, Intervet) por vía endovenosa e
inmediatamente después, el encéfalo y la porción superior de la
médula espinal fueron extraídos en condiciones asépticas y
mantenidos a 4ºC.
Se recogieron en condiciones asépticas
diferentes porciones de 5 a 15 gramos de peso procedentes de ambos
lóbulos y de la región anterior, media y posterior del encéfalo,
así como de la médula espinal, y se mantuvieron a 4ºC en una
solución de tampón PBS con antibióticos (Penicilina G 2000 UI/ml,
Estreptomicina 200 \mug/ml) hasta su posterior inoculación a
ratones de la estirpe Balb/c nu/nu atímicos.
En las muestras de encéfalo se procedió a la
detección de la presencia de N. caninum en las mismas
mediante PCR, antes de proceder al aislamiento del parásito.
Para ello se retiraron diferentes porciones de
unos 20 mg de todas las secciones recogidas y se procedió a la
extracción del ADN genómico, con el fin de llevar a cabo la
detección de la presencia del ADN de N. caninum mediante la
PCR anidada que amplifica la región ITS-1 del
parásito (Buxton et al., 1998, J.Comp Pathol. 118:
267-279).
Para la extracción del ADN se utilizó un kit
comercial: "Genomic-Prep cell and tissue ADN
isolation kit" (Amershan Biosciences) siguiendo las instrucciones
del fabricante y 5 \mul de la solución del ADN resultante
(100-200 ng) se utilizó como molde en la PCR
anidada de la región ITS-1 descrita a
continuación.
La amplificación de la región
ITS-1 del ADN ribosomal de N. caninum se
llevó a cabo en una primera reacción de PCR utilizando los oligos
NN1 (5'- TCAACCTTTGAATCCCAA) y NN2 (5'- CGAGCCAAGACATCCATT), y en
una segunda reacción empleando los oligos NP1 (5'-
TACTACTCCCTGTGAGTTG) y NP2 (5'- TCTCTTCCCT
CAACGCT). La mezcla de PCR (25 \mul) se compone por 0,15 \muM de cada oligo (Sigma), 200 \muM dNTPs (Sigma), 1 x tampón (75 mM Tris pH 9, 20 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}, 50 mM KCl), (Biotools, España), 2 mM MgCl_{2} (Biotools) y 0,625 unidades de ADN polimerasa (Biotools). En la primera reacción de amplificación se añade 5 \mul de ADN y en la segunda, 2 \mul del producto de la primera. Ambas reacciones se realizan en un termociclador según el siguiente programa: 94ºC durante 5 min y 25 ciclos de 94ºC/1 min, 48ºC/1 min y 72ºC/1,5 min y un último ciclo de 72ºC durante 5 min. Los productos resultantes de la segunda amplificación con un tamaño 210 pb, se visualizan en un gel de agarosa al 1,6% en TBE (tampón Tris-borato-EDTA) 0,5 x teñido con bromuro de etidio.
CAACGCT). La mezcla de PCR (25 \mul) se compone por 0,15 \muM de cada oligo (Sigma), 200 \muM dNTPs (Sigma), 1 x tampón (75 mM Tris pH 9, 20 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}, 50 mM KCl), (Biotools, España), 2 mM MgCl_{2} (Biotools) y 0,625 unidades de ADN polimerasa (Biotools). En la primera reacción de amplificación se añade 5 \mul de ADN y en la segunda, 2 \mul del producto de la primera. Ambas reacciones se realizan en un termociclador según el siguiente programa: 94ºC durante 5 min y 25 ciclos de 94ºC/1 min, 48ºC/1 min y 72ºC/1,5 min y un último ciclo de 72ºC durante 5 min. Los productos resultantes de la segunda amplificación con un tamaño 210 pb, se visualizan en un gel de agarosa al 1,6% en TBE (tampón Tris-borato-EDTA) 0,5 x teñido con bromuro de etidio.
La presencia del parásito fue detectada en la
mayoría de las porciones de encéfalo analizadas.
Una vez confirmada la presencia del parásito en
las muestras de encéfalo, las mismas se homogeneizaron con ciclos
de 1 min de duración en un digestor automático Masticator IUL hasta
su perfecta disgregación, se filtraron los macerados a través de
una malla de 150 \mum previamente esterilizada, y se
centrifugaron durante 10 minutos a 1350 g. El sobrenadante se
descartó y el precipitado equivalente a unos 5 gramos de tejido de
partida se inoculó intraperitonealmente con jeringa de insulina y
aguja de diámetro 0,5x16 mm a ratones de la estirpe Balb/c
nu/nu hembras con un peso aproximado de
20-25 gramos. Todo el proceso se realizó en
condiciones asépticas.
Los ratones inoculados se observaron diariamente
para detectar la aparición de signos clínicos atribuibles a
neosporosis que incluyen la pérdida de peso, desórdenes nerviosos,
parálisis de extremidades y letargia, tal como se describe en Yamane
et al., 1998, J. Vet. Diagn. Invest. 10:
364-368. Estos signos clínicos se observaron en
todos los ratones inoculados entre los 32-40 días
post-inoculación (PI). Tras la aparición de estos
síntomas, los ratones fueron sacrificados en atmósfera de CO_{2} y
utilizados para el aislamiento del parásito en cultivo celular,
mediante la inoculación del lavado peritoneal.
Posteriormente, el encéfalo de los ratones
eutanizados se retiró y se homogeneizó en solución de PBS con
antibióticos-antimicóticos (Gibco, BRL, UK) por
sucesivos pases de jeringa con agujas de 21 G y 25 G.
El homogeneizado equivalente a medio encéfalo se
inoculó a un nuevo ratón de la estirpe Balbc nu/nu que
igualmente se monitorizó hasta la aparición de los signos clínicos
descritos. El proceso se llevó a cabo hasta 7 pases consecutivos de
ratón a ratón, observándose la aparición de los signos clínicos ya
descritos en todos los ratones inoculados entre los 28 y 35 días PI.
Con el fin de confirmar que los signos clínicos observados eran
consecuencia de la infección por N. caninum, se procedió a la
extracción del ADN a partir de 20 mg de muestra del encéfalo de los
ratones que mostraron la sintomatología y fueron sometidas a la
detección del producto de amplificación específico de la PCR anidada
de la región ITS-1 de ADN del parásito como hemos
descrito anteriormente.
En cuanto al aislamiento en cultivo celular se
llevó a cabo mediante la inoculación del lavado peritoneal de los
ratones sacrificados sobre un cultivo de células
MARC-145 en monocapa.
Para ello se realizó el lavado de la cavidad
peritoneal con aproximadamente 8 ml de medio Dulbeco's Modified
Essential Medium (DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 2% y
una solución de antibióticos-antimicóticos al 2%
(100 Ul/ml Penicilina G, 100 \mug/ml Estreptomicina and 250
ng/ml Anfotericina B) (Gibco BRL, UK), que inmediatamente después,
fue añadido sobre una monocapa de aproximadamente 10^{6} células
de la línea MARC-145 en un frasco de cultivo de 25
cm^{2}.
A las 24 horas, se retiró el medio y se
sustituyó por DMEM suplementado con suero equino al 2% y la misma
solución de antibióticos-antimicóticos al 2%.
Dependiendo del crecimiento celular, cada 4-7 días
el cultivo se resuspendió con el uso de un "raspador" celular,
se pasó por jeringa y aguja de 25 G y se añadió sobre un nuevo
cultivo de 5x10^{5} células MARC-145. Nuevamente,
a las 24 horas el medio se retiró y se sustituyó por DMEM
suplementado con suero equino al 2%.
Los cultivos se mantuvieron en estufa húmeda a
37ºC y atmósfera de CO_{2} al 5% y se observaron diariamente en
microscopio de contraste de fases para la visualización del
parásito.
A los 24 días PI y tras cuatro pases
consecutivos del cultivo se observa- ron taquizoítos en el cultivo
celular que a continuación fue mantenido por pases sucesivos según
el procedimiento descrito hasta obtener recuentos en cámara de
Neubauer igual o superior a 10^{6} taquizoítos.
A partir de este momento, el cultivo se mantuvo
según describe Perez-Zaballos et al., 2005,
J. Parasitol., 91(3):
507-10.
507-10.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo se describe la identificación y
caracterización genética del aislado Nc-Spain 1H,
junto con otros aislados obtenidos a partir de diversos hospedadores
y de diferente origen geográfico, permitiendo su identificación y
discriminación del resto de aislados. Para ello se amplificaron y
secuenciaron 13 secuencias microsatélites identificadas en el genoma
de N. caninum a partir de 10 aislados distintos, incluido el
que es objeto de la presente invención.
Para la identificación de secuencias
microsatélites en el genoma de N. caninum, aproximadamente
25.330 ESTs (Expression Sequences Tags) depositadas en
bancos de datos públicos derivadas de los aislados de N.
caninum Nc-1 y Nc-Liv fueron
analizadas con los programas informáticos Tandem Repeat
Occurrence Locator (TROLL) (Castelo et al., 2002.
Bioinformatics. 18:634-636) y Tandem Repeats
Finder (TRF) (Benson 1999, Nucleic Acids Res.
27:573-580) que permitieron la identificación de
181 secuencias micro- y minisatélites. Para evitar el análisis de
secuencias redundantes e identificar posibles secuencias homologas
en otros organismos, las 181 secuencias fueron analizadas
utilizando el programa informático BLASTN confirmando la presencia
de 40 secuencias redundantes. Así, fueron encontradas 126 secuencias
que contenían microsatélites resultantes de la repetición en tándem
del motivo (TA)_{n}, 2 del (AGA)_{n}, y 1 para
los motivos (TC)_{n}, (GT)_{n}, (GA)_{n},
(TTC)_{n}, (CCT)_{n}, (AAG)_{n},
(TACA)_{n} y (ATCT)_{n}.
De las 126 secuencias originales, se
seleccionaron 13 marcadores microsatélites en función de varios
criterios que incluían la posibilidad de diseño de cebadores para su
posterior amplificación por PCR y secuenciación, el número de
repeticiones en tándem que presentaban, seleccionando los de mayor
número, y su localización, fuera de regiones codificantes del
genoma, con la finalidad de seleccionar los más polimórficos. En la
Tabla I se describen los microsatélites utilizados en este estudio
como marcadores moleculares. Para cada microsatélite seleccionado,
que se denominaron como se especifica en la Tabla I, se diseñaron
cebadores específicos (Genotek, Bonsay Techonologies, España) para
la amplificación de productos de PCR de aproximadamente 300 pb, que
incluían el motivo de repetición y parte de las secuencias que lo
flanquean. Posteriormente, estos cebadores fueron aplicados para la
amplificación y secuenciación de los microsatélites seleccionados a
partir del ADN genómico de diez aislados de N. caninum de
diferentes hospedadores y origen geográfico, incluido el aislado
objeto de la invención, tal como se muestra en la
Tabla II.
Tabla II.
Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en
volúmenes de 50 \mul compuestos de 0.2 \muM de cada cebador,
200 \muM dNTPs (Sigma), 1x tampón (75 mM Tris pH 9, 20 mM
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 50 mM KCl,) (Biotools, España), 2
mM MgCl_{2} (Bio-tools), 2 unidades de ADN
polimerasa (Biotools) y 50 ng de ADN molde. Las condiciones de
reacción fueron las siguientes: 1 ciclo a 94ºC durante 5 min, 35
ciclos de 94ºC/1 min, 60ºC/1 min, y 72ºC/1 min, con un ciclo final
de 72ºC durante 10 min. En cada serie de amplificaciones como
control negativo ADN obtenido a partir de las células donde el
parásito era habitualmente mantenido y H2O fueron incluidas. Los
productos de PCR obtenidos fueron separados por electroforesis en
geles de agarosa-bromuro de etidio (NuSieve 3:1,
Cambrex BioScience, USA) al 2.5% y visualizados bajo luz UV.
Posteriormente, los productos fueron purificados con el
Exo-SAP IT kit (USB, USA), de acuerdo a las
instrucciones del fabricante, y directamente secuenciados en ambas
direcciones. Las secuencias fueron analizadas usando el programa
informático BioEdit Sequence Alignment Editor v.7.0.1 (Copyright©
1997-2004 Tom Hall, Ibis Therapeutics, Carlsbad CA
92008, USA) y depositadas en el banco de datos GenBank database
bajo los números de acceso AY935165-AY935200 y
AY937107-AY937178, excepto para el aislado
Nc-Spain 1H, que se recogen en la Figura 1.
Uno de los microsatélites fue monomórfico en los
10 aislados analizados (MS21). La presencia de polimorfismo para
los 13 microsatélites seleccionados variaba desde un bajo
polimorfismo con 3 alelos para cada microsatélite (MS1A, MS1B, MS12
y MS21) hasta 4 a 9 alelos para el resto de microsatélites. Además,
el MS7 mostró un alelo que portaba un SNP (Single Nucleotide
Polymorphism).
Para el análisis de los genotipos de cada
aislado en "multilocus", cada alelo fue designado con un
número de acuerdo a la longitud del motivo repetitivo y las
diferencias encontradas en su secuencia. El análisis en
"multilocus" aumentó considerablemente el poder discriminatorio
de las secuencias microsatélites y así, fueron obtenidos perfiles
genéticos únicos para cada aislado, indicando que todos los aislados
diferido significativamente entre ellos, como se puede observar en
la Tabla II.
\vskip1.000000\baselineskip
En este apartado se describen los experimentos
llevados a cabo para investigar la patogenicidad del aislado
Nc-Spain 1H en un modelo murino experimental.
Para ello, se inocularon ratones hembras BALB/c
de 6 semanas de edad por vía intraperitoneal con 10^{5} (grupo
A), 10^{6} (grupo B) y 10^{7} (grupo C) taquizoítos del aislado
Nc-Spain 1H obtenidos del cultivo celular preparado
en el Ejemplo 1. El grupo control (grupo D) consistió en ratones
BALB/c inoculados con 200 \mul de PBS por vía
intraperitoneal.
En el curso del experimento se sacrificaron
aleatoriamente en los días 1, 2, 4, 8, 16 y 32, tres animales de
cada grupo, con la excepción de los días 1, 2 y 4 en el grupo C que
se sacrificaron cuatro ratones por día.
Los animales se alojaron en jaulas de plástico,
en grupos de 5 animales por jaula, se mantuvieron a una temperatura
ambiente de 20-24ºC sometidos a un foto- periodo de
12 horas de luz y 12 de oscuridad. El pienso y el agua se
suministraron ad libitum.
Todos los ratones fueron examinados diariamente
para observar síntomas compatibles con la infección por N.
caninum en el ratón (Lindsay & Dubey, 1989, J. Parasitol.
75:772-779; Lindsay & Dubey, 1990, J. Parasitol.
76:410-413; Lindsay et al., 1995,
J.Parasitol. 81:313-315).
El sacrificio de los ratones se realizó en
campana de CO_{2}. Inmediatamente después del sacrificio se obtuvo
sangre mediante punción intracardíaca con jeringa de insulina y
aguja de diámetro 0,5x16 mm. Los ratones fueron pesados en el
momento del sacrificio con el fin de detectar una disminución
significativa del peso con respecto al grupo control. Las muestras
de sangre (200-500 \mul) se depositaron en tubos
de 1,5 ml con EDTA para al estudio de la parasitemia.
Posteriormente, se realizó la necropsia de cada individuo
procediendo a la apertura de las cavidades abdominal y torácica,
valorándose la presencia de lesiones macroscópicas y extrayéndose el
pulmón y el encéfalo, los cuales se congelaron a -80ºC en un tubo
de 1,5 ml estéril hasta la extracción del ADN con el objetivo de
detectar la presencia del parásito por PCR.
Las muestras de sangre se centrifugaron a 2000 g
durante 10 min, recogiéndose el sobrenadante (plasma) que se
conservó a -80ºC hasta el estudio de la respuesta inmune humoral
inducida por el parásito utilizando la técnica de IFI y ELISA.
El sedimento formado por las células sanguíneas,
obtenido tras centrifugar las muestras de sangre y retirar el
plasma, se destinó a la extracción del ADN utilizando el sistema
comercial: "Genomic-Prep cell and blood DNA
isolation kit" (Amershan Biosciences), que incluye los reactivos
necesarios y las instrucciones para su ejecución.
Las muestras de ADN se conservaron a -20ºC hasta
su posterior análisis por PCR.
La extracción del ADN de pulmón y encéfalo se
realizó a partir de 10-20 mg de tejido fresco
congelado, disgregado con bisturí, utilizando como método de
extracción el sistema comercial: "Genomic-Prep
cell and tissue DNA isolation kit" (Amershan Biosciences), que
incluye los reactivos necesarios y las instrucciones para su
ejecución.
Para la detección del parásito en las muestras
de sangre, pulmón y encéfalo recogidas de los animales sacrificados
se utilizó la técnica de PCR anidada de la región
ITS-1, siguiendo el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1. En todas las reacciones se utilizaron como testigo
positivo el ADN obtenido de taquizoítos de N. caninum y como
negativo agua ultrapura estéril.
Los ratones de los grupos infectados (grupos A,
B y C) no desarrollaron signos compatibles con la infección ni
mortalidad, durante la duración del experimento. Durante la
necropsia se observó esplenomegalia y linfadenopatía en ganglios
mesentéricos e ilíacos en la mayoría de los ratones infectados con
el parásito desde el día 2 al día 16 PI.
El ADN de N. caninum se detectó en sangre
desde el día 1 al 5 PI (post-inoculación) y en
pulmón y encéfalo desde el día 1 al 16 PI. En lo que se refiere a la
frecuencia de detección de N. caninum se observó una mayor
detectabilidad del parásito al aumentar la dosis del inóculo. En el
Grupo D (grupo testigo) todas las muestras analizadas fueron
negativas, según lo esperado.
Los resultados obtenidos para la distribución
del parásito en los Grupos A, B y C se muestran en la Tabla
III.
\vskip1.000000\baselineskip
En dicha tabla se puede observar que a los 8
días post-inoculación el parásito ha desaparecido de
la sangre de los ratones, incluso de aquellos que fueron inoculados
con la dosis más alta, y a los 16 días
post-inoculación ha desaparecido de los pulmones y
del encéfalo de la mayoría de los ratones inoculados, incluso de
aquellos inoculados con las dosis más altas. Ello indica un alto
grado de atenuación de la cepa Nc-Spain 1H, objeto
de esta patente.
En este ejemplo se describen los estudios
llevados a cabo para estudiar la patogenicidad del aislado
Nc-Spain 1H en un modelo bovino gestante.
En este experimento se inocularon 13 novillas en
el día 70 de gestación administrando por vía endovenosa 10^{7}
taquizoítos del aislado Nc-1 (grupo 1),
Nc-Spain 1H (grupo 2) o PBS (grupo 3). Cada grupo
se compuso de cinco animales, con la excepción del grupo 3 que
fueron tres. Las 13 novillas gestantes fueron menores de 24 meses
de edad, seronegativas frente a N. caninum, Leptospira
spp. y Brucella abortus y vacunadas frente a VIBR, VBVD,
VPI 3 y VBRS.
Para las inoculaciones, los taquizoítos de los
aislados Nc-1 y Nc-Spain 1H se
obtuvieron mediante replicación en cultivo celular según se describe
en el Ejemplo 1.
Para el seguimiento de la gestación, se realizó
una ecografía transrectal una vez a la semana, tras la inoculación,
con fin de determinar la viabilidad del feto, procediéndose al
sacrificio de aquellos animales en los que se detectó por ecografía
la muerte fetal. En el día 45 post-inoculación (PI)
todas las restantes novillas fueron sacrificadas.
In vivo, se recogió sangre entera de la
vena coccígea en tubos con EDTA para el estudio de la parasitemia.
La extracción de ADN, a partir de sangre y tejidos de novillas y
fetos se realizó utilizando una prueba comercial (REALPURE, Durviz).
Una vez extraído el ADN, se midió la concentración de cada muestra
mediante espectrofotometría ajustándose la concentración a 60
ng/\mul en agua ultrapura estéril.
El estudio histológico de las muestras tomadas
en el post-mortem se basó en la observación
de las lesiones características de la infección por N.
caninum en la especie bovina. Las lesiones en encéfalo,
corazón, hígado, y placenta se graduaron según la extensión e
intensidad de la lesión que presentaban en ausentes (0), leves (1),
moderadas (2) o graves (3).
Los signos clínicos observados durante el
experimento fueron diarrea, fiebre y muerte fetal. La diarrea se
observó en los días 6 (animal 1776) y 7 PI (animales 8862 y 1776),
probablemente debida a la llegada de un nuevo lote de pienso.
Al comparar la temperatura entre los diferentes
grupos no se observó un incremento anormal de la temperatura en
ninguno de los días (P>0,05; Análisis de varianza
unifactorial).
La muerte fetal se diagnosticó por ecografía en
3 de los 5 animales pertenecientes al grupo 1. Los animales y días
en los que se diagnosticó la muerte fetal fueron los siguientes:
7848 en el día 26 PI, 1785 y 1767 en el día 34 PI. En el día 35 PI,
se observó la presencia de moco de color ambarino en vulva y cérvix
abierto en el animal 1785. El resto de los animales del grupo 1 y
todos los animales de los grupos 2 y 3 presentaron una imagen
ecográfica normal con movimiento fetal.
En cuanto a la parasitemia, en todos los
animales del grupo 1 se detectó la presencia del ADN del parásito
en algún momento del estudio, mientras que en el grupo 2, tres de
los cinco animales que lo forman presentaron parasitemia. En el
grupo 3, ningún animal resultó positivo durante el estudio según lo
esperado.
En la Tabla IV se muestra la detección de la
presencia de ADN de N. caninum en la sangre de los animales
infectados con el aislado Nc-1 (grupo 1) y
Nc-Spain 1H (grupo 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Durante el examen externo y necropsia de
aquellos animales en los que se diagnosticó la muerte fetal (7848,
1767 y 1785) se observó una hipertrofia ganglionar generalizada,
además de tonsilas reactivas con marcada activación de la pulpa
blanca esplénica e hiperplasia de folículos linfoides. En el animal
7848, el pulmón presentó una cantidad variable de espuma en la
tráquea (edema pulmonar) y en el abomaso e intestino delgado se
observó un edema de la mucosa, más evidente en los pliegues de la
zona antral en el caso del abomaso, acompañado de un aumento de
moco en el lumen
(abomasitis catarral). En el resto de las novillas, los pulmones no se colapsaron al desaparecer la presión negativa.
(abomasitis catarral). En el resto de las novillas, los pulmones no se colapsaron al desaparecer la presión negativa.
A la apertura de la placenta en los tres
animales sacrificados, se observó un contenido turbio de aspecto
hemorrágico Los placentomas estaban separados pudiendo observarse
las carúnculas hemorrágicas, siendo más intensas en el animal 7848.
El resto de novillas sacrificadas en el día 45 PI no presentaron
alteraciones macroscópicas reseñables, con líquido amniótico y
placentomas de aspecto normal.
En cuanto a los resultados del examen
histológico en el sistema nervioso central de las novillas, la
mayoría de las mismas no mostraron signos de inflamación a
excepción de una marcada congestión vascular. Sólo en el grupo de
animales que tuvieron muerte fetal (animales 7848, 1767 y 1785) se
observó la presencia de algunos manguitos perivasculares. En la
placenta, histológicamente se pueden diferenciar dos grupos. Por un
lado las lesiones observadas en el grupo de animales que tuvieron
muerte fetal en los que el placentoma presentó una extensa
hemorragia en la parte superior de la carúncula, así como múltiples
focos de necrosis en la placenta materna. La mayoría de las
vellosidades fetales aparecieron necróticas con una fuerte
descamación del epitelio que las recubre.
En relación con la intensidad de las lesiones en
las novillas las más graves se observaron en placenta y en los
animales que presentaron muerte fetal.
En la Tabla V se muestra la intensidad de las
lesiones observadas en las novillas en el sistema nervioso central
(SNC) y en placenta.
En relación con el examen macroscópico de los
fetos, sólo se observaron alteraciones macroscópicas en los tres
fetos que murieron antes del día 45 PI. Los fetos presentaban un
aspecto ligeramente autolítico caracterizado por un edema
generalizado, así como un marcado hemoperitoneo, hemotórax y
hemopericardias. El resto de los fe- tos de las novillas
sacrificadas en el día 45 PI no presentaron alteraciones
macroscópicas reseñables.
En el estudio histológico de los órganos
fetales, en el hígado de todos los fetos se observó una intensa
actividad hematopoyética y en algunos de ellos acúmulos focales de
células redondas intraparenquimatosos (linfocitos e histiocitos) que
forman pequeños granulomas y marcada congestión sinusal. En los
fetos correspondientes a los animales 7848, 1767 y 1785 se
observaron múltiples focos de necrosis intraparenquimatosos
(hepatitis necrotizante).
En el corazón, los fetos abortados mostraron una
miocarditis linfocítica, mientras que en el resto de los animales
se apreciaba una ligera infiltración difusa de células redondas y
presencia de manguitos perivasculares. En el SNC, las lesiones más
destacables fueron la presencia de microhemorragias, focos de
manguitos linfocíticos perivasculares y nódulos gliales.
En relación con la intensidad de las lesiones
las más graves se observaron en SNC y en los animales que
presentaron muerte fetal. Asimismo, se realizó una segunda
valoración de las lesiones histológicas en los grupos
infectados.
En la Tabla VI se muestra la intensidad de las
lesiones observadas en los fetos en hígado, corazón y sistema
nervioso central.
La presencia del ADN del parásito no se detectó
en ninguna de las muestras de encéfalo de las diferentes novillas
analizadas, sin embargo cuando se estudiaron las placentas,
aquellas procedentes de los animales abortados fueron positivas y
también la de la novilla 1638 (grupo Nc-Spain1H).
Asimismo, la presencia del parásito se detectó en el encéfalo,
corazón e hígado de los fetos abortados (fetos 7848, 1767 y 1767).
En el resto de los fetos los resultados fueron negativos.
La detección de anticuerpos específicos frente a
N. caninum en el plasma de los ratones infectados del
Ejemplo 3 se determinó mediante las técnicas de IFI y ELISA.
Para la técnica de IFI (Trees et al.,
1993. Vet.Rec. 132:125-126), inicialmente, se
depositaron 8 \mul de una suspensión de 10^{7} taquizoítos
formalinizados/ml del aislado de referencia Nc-1
(Dubey et al., 1988, J. Am. Vet. Med. Assoc.
193:1259-63), en cada pocillo de un portaobjetos de
inmunofluorescencia (Cultek) de 18 pocillos de 4 mm de diámetro.
Posteriormente, la preparación se dejó secar al aire, fijándose a
continuación con acetona durante 10 min a -20ºC. Tras la fijación,
se añadió el suero procedente de los ratones infectados (10
\mul/pocillo), y se incubó 30 min a 37ºC en una cámara húmeda.
Las diluciones de los sueros de los ratones se
realizaron en PBS comenzando por una dilución 1:25 y realizándose
diluciones seriadas hasta conseguir la última dilución en la cual
los sueros dejaron de ser positivos. Como testigo negativo de la
reacción se utilizaron los sueros de los ratones inoculados con PBS
y como blanco de la reacción se utilizó PBS. Posteriormente, los
portaobjetos se lavaron dos veces con PBS (10 min cada vez) y se
añadió la inmunoglobulina IgG de ratón unida al fluorocromo
isotiocianato de fluoresceína (Sigma, referencia
F-0257) a una dilución 1:128 en una solución
PBS-azul de Evans (1:10000), incubándose a 37ºC
durante media hora en una cámara húmeda. A continuación, los
pocillos se lavaron de nuevo con PBS (3 veces durante 10 min cada
vez) realizándose un último lavado de 10 min con agua destilada,
tras el cual, los pocillos se secaron al aire y se procedió al
montaje del portaobjetos con Fluoprep (Biomerieux) y un
cubreobjetos de 24 x 60 mm. Los pocillos fueron examinados con un
microscopio de fluorescencia a x 400 (Nikon, Lámpara de mercurio
modelo HB-10101AF).
La presencia de anticuerpos se detectó a partir
del día 8 PI en los grupos inoculados con la dosis mayor (grupo C),
como se muestra en la Tabla VII.
\vskip1.000000\baselineskip
Los títulos obtenidos por IFI variaron también
en función de la dosis infectiva, obteniéndose los más elevados
(1:200-1:400) en los ratones del grupo C, como se
muestra en la Figura 2.
La detección de las inmunoglobulinas de los
isotipos IgG1 e IgG2a específicas para N. caninum en el
plasma se llevó a cabo mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA)
indirecto siguiendo procedimientos convencionales. Los resultados se
expresaron como densidad óptica. Como testigos de la prueba se
incluyeron en cada placa una muestra de suero de ratón negativa
(densidad óptica menor de 0,1) así como un suero de ratón infectado
experimentalmente con una densidad óptica mayor de 2,0.
En relación con los isotipos IgG2a e IgG1, se
observó un aumento de los mismos a partir del día 8 PI, siendo más
evidente el incremento de la inmunoglobulina IgG2a y en los grupos
B y C. En los días 16 y 32 PI, los ratones inoculados con 10^{5} y
10^{6} taquizoítos tuvieron mayor concentración de IgG2a que
IgG1. No obstante, en el grupo inoculado con 10^{7} taquizoítos la
producción de IgG1 fue predominante en el día 16 (Figuras 3A, 3B y
3C).
En este ensayo se utilizaron 13 novillas menores
de 24 meses de edad que eran seronegativas frente a N.
caninum, IBRv, BVDv, Leptospira spp. y Brucella
abortus.
En el día 70 de gestación se administraron por
vía intravenosa 10^{7} taquizoítos del aislado
Nc-1 (grupo1) a 5 animales, 10^{7} taquizoítos del
aislado Nc-Spain 1H (grupo 2) a otros 5 animales, o
PBS (grupo 3, grupo testigo) a otros tres animales.
Se recogió sangre entera de la vena coccígea en
tubos heparinizados para el estudio de producción de
IFN-\gamma y en tubos sin anticoagulante para la
obtención de suero que se utilizó en el estudio de la respuesta
inmune humoral (IgG, IgG1 e IgG2) frente a N. caninum por
ELISA. Las muestras se recogieron los días -2 y 0 y posteriormente 2
veces a la semana desde el día 3 hasta el día 41
post-inoculación (PI).
Para la determinación de producción de
IFN-\gamma por linfocitos periféricos
sensibilizados, las muestras de sangre se conservaron a temperatura
ambiente y se inició el proceso de cultivo inmediatamente después
de su obtención. Todo el proceso se realizó en una cabina de flujo
laminar utilizándose puntas de micropipeta con filtro.
La sangre en los tubos heparinizados se
homogenizó 10 veces, y se añadieron 900 \mul de sangre entera a
cada pocillo de una placa de cultivo con fondo plano (3 pocillos
por animal). Un pocillo se estimuló con Concanavalina A (100 \mul,
concentración final 10 \mug/ml, Sigma), un segundo con antígeno
soluble de Nc-1 (100 \mul, concentración final 1
\mug/ml) y el tercero con PBS estéril (100 \mul, 0,01M, pH 7,2).
Posteriormente, se homogenizaron las placas unas 20 veces y se
incubaron en estufa a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2}.
A las 20-24 h las placas se centrifugaron a 500 g,
10 min a temperatura ambiente y de cada pocillo se recogieron
200-400 \mul del sobrenadante que se guardaron en
tubos de 1,5 ml a -20ºC hasta el posterior análisis. La
determinación de IFN-\gamma se llevó a cabo a
partir de los sobrenadantes utilizando un ensayo ELISA comercial
(Bovigam, CSL, Ingenasa) según las indicaciones del fabricante. Los
resultados se expresaron como valores de densidad óptica (OD) a 450
nm.
En los grupos infectados se detectó un
incremento en los niveles IFN-\gamma frente a los
del grupo testigo (grupo 3) en el día 5 PI (P<0,05; Duncan). En
el grupo infectado con Nc-1 (grupo 1) se observaron
niveles altos de IFN-\gamma a lo largo de todo el
estudio, alcanzándose los máximos en el día 24 PI. En el grupo
infectado con Nc-Spain 1H (grupo 2), los valores
más altos se observaron en los días 5 y 12 PI, momento a partir del
cual se observó un descenso en los niveles de
IFN-\gamma, encontrándose sólo diferencias
significativas con respecto al grupo testigo en los días 19 y 34 PI
(P<0,05; Duncan).
Al comparar los dos grupos infectados los
valores obtenidos en el grupo 1 fueron significativamente
superiores a los del grupo 2 en los días 10, 12, 17, 19, 24, 31,
34, 39 y 41 PI (P<0,05; Duncan) como se puede observar en la
Figura 4.
La caracterización de la respuesta inmune
humoral (IgG total, IgG1 e IgG2a) se llevó a cabo utilizando un
ensayo ELISA indirecto con proteínas solubles de N. caninum
como antígeno.
Las muestras de suero se diluyeron a 1:100. Como
testigo positivo se empleó el suero de una reproductora con aborto
asociado a la infección por N. caninum con resultado de
serología positivo por WB e IFI (título
1:1600-3200). Como testigo negativo se utilizó el
suero de una reproductora procedente de una explotación sin
antecedentes de fallo reproductivo y con resultado de serología
negativo por WB e IFI.
Para la determinación de la IgG total, se
utilizó un anticuerpo monoclonal mAb anti bovine IgG1 y IgG2
(Laboratoire Service International, Francia) a una dilución de
1:2000 en PBS-Tween 0,05%. Los conjugados para la
valoración de IgG1 e IgG2 (Serotec) se usaron a una dilución
1:100000 y 1:40000, respectivamente. Los resultados se expresaron
como valores de densidad óptica a 450 nm (OD).
Al analizar los resultados obtenidos para IgG
total específica, en el grupo 1 (Nc-1) se observó
un aumento significativo de los valores de OD respecto al grupo
testigo en el día 10 PI, pero sobre todo a partir del día 17 PI
(P<0,05; Duncan), obteniéndose los valores más elevados en los
días 24 y 26 PI. En el grupo 2 (Nc-Spain1H), se
observó un incremento también a partir del día 17 PI con el máximo
valor en el día 19 PI.
Sin embargo, a pesar de que los valores del
grupo 2 fueron superiores a los del grupo testigo no se obtuvieron
diferencias significativas (P>0,05; Duncan). Al comparar los dos
grupos infectados, los valores obtenidos en el grupo 1 fueron
significativamente superiores a los del grupo 2 en los días 17, 24,
26, 31, 34, 39 y 41 PI (P<0,05; Duncan).
En la Figura 5 se presentan los valores de OD
para los tres grupos.
Los isotipos IgG1 e IgG2 se valoraron a partir
del día en el que se observó un aumento significativo de los valores
de OD de IgG respecto al grupo testigo (día 10 PI). Los niveles de
IgG1 permanecieron al mismo nivel que el grupo testigo durante los
primeros días PI analizados. En ambos grupos, se detectó un aumento
significativo versus el grupo testigo en el día 12 PI (P<0,05;
Duncan) y los mayores niveles se alcanzaron a partir del día 34 PI.
Respecto a los valores de IgG2, en el grupo 1 se detectó un aumento
significativo frente al grupo testigo en el día 17 PI (P<0,05;
Duncan), alcanzando los máximos niveles en los días 34 y 39 PI. En
el grupo 2, los valores de IgG2 permanecieron ligeramente por
encima de los del grupo testigo, no encontrándose, sin embargo,
diferencias significativas entre ambos (P>0,05; Duncan).
En los dos grupos infectados, la concentración
de IgG1 fue mayor que la de IgG2 durante todo el experimento. Al
comparar los dos grupos infectados, los valores de ambos isotipos
fueron más altos en el grupo 1 que en el 2 a partir del día 17 PI
(P<0,05, Duncan). Los animales testigos permanecieron
seronegativos a N. caninum durante todo el experimento.
En las Figuras 6A y 6B se representan los
valores medios de IgG1 e IgG2 anti-N. caninum en los
animales inoculados con el aislado Nc-1,
Nc-Spain 1H, y PBS.
Se puede observar en dichas figuras la
producción de anticuerpos contra proteínas de N. caninum en
los animales infectados con el aislado de la invención.
Claims (19)
1. Parásito aislado depositado en la
Colección de Cultivos de Algas y Protozoos (Culture Collection of
Algae and Protozoa, CCAP) con el número de acceso CCAP 2051/2.
2. Cultivo celular biológicamente puro
infectado por el aislado de reivindicación 1.
3. Cultivo celular de la reivindicación 2
caracterizado porque es de células de riñón de mono.
4. Anticuerpo que reacciona específicamente
contra un antígeno procedente del aislado de la reivindicación
1.
5. Anticuerpo según la reivindicación 4,
caracterizado porque el antígeno se selecciona entre el
grupo formado por el propio aislado, taquizoítos, bradizoítos,
esporozoítos, lisados celulares, polipéptidos antigénicos, y sus
mezclas.
6. Anticuerpo según la reivindicación 5
caracterizado porque el antígeno se selecciona entre el
grupo formado por taquizoítos y polipéptidos antigénicos.
7. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6 caracterizado porque es
monoclonal.
8. Polipéptido obtenido a partir del aislado
de la reivindicación 1.
9. Polinucleótido obtenido a partir del
aislado de la reivindicación 1.
10. Vacuna que comprende el aislado de la
reivindicación 1, un extracto del mismo, o una mezcla de ambos.
11. Vacuna según la reivindicación 10
caracterizada porque el aislado está en forma de aislado
vivo atenuado, inactivado, o fijado, en cualquier estadio de su
ciclo biológico.
12. Vacuna según la reivindicación 10
caracterizada porque el extracto se selecciona entre el
grupo formado por lisados celulares, polipéptidos antigénicos y
polinucleótidos que codifican polipéptidos antigénicos.
13. Uso del aislado de la reivindicación 1
para preparar una vacuna para el tratamiento y/o prevención de la
neosporosis en animales.
14. Uso de anticuerpos según cualquiera de
las reivindicaciones 4 a 7 para preparar un medicamento para el
tratamiento de una infección y/o enfermedad causada por Neospora
caninum en animales.
15. Uso de antígenos procedentes del aislado
de la reivindicación 1 para detectar la infección por el parásito
Neospora caninum en animales, a partir de una muestra
biológica.
16. Uso según la reivindicación 15
caracterizado porque el antígeno se selecciona entre el
grupo formado por el propio aislado, taquizoítos, bradizoítos,
esporozoítos, lisados celulares, polipéptidos antigénicos, y sus
mezclas.
17. Uso según la reivindicación 16
caracterizado porque el antígeno se selecciona entre el
grupo formado por taquizoítos y polipéptidos antigénicos.
18. Uso de anticuerpos de las
reivindicaciones 4 a 7 para detectar la infección por el parásito
Neospora caninum en animales, a partir de una muestra
biológica.
19. Uso de polinucleótidos según la
reivindicación 9 para detectar la presencia de ácidos nucleicos
específicos de Neospora caninum en animales, a partir de una
muestra biológica.
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