ES2318880T3 - Un animal transgenico defectuoso para el factor xiii de la coagulacion y su uso para prbar la cicatrizacion de herida y la hemorragia. - Google Patents

Un animal transgenico defectuoso para el factor xiii de la coagulacion y su uso para prbar la cicatrizacion de herida y la hemorragia. Download PDF

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Abstract

La invención proporciona un animal mamífero transgénico no humano, que es heterocigoto u homocigoto para un gen de factor XIII de coagulación parcialmente defectuoso.

Description

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Un animal transgénico defectuoso para el factor XIII de la coagulación y su uso para probar la cicatrización de herida y la hemorragia.
Esta invención se refiere a un animal mamífero transgénico no humano que es heterocigoto u homocigoto para el gen al menos parcialmente defectuoso para el factor XIII de la coagulación.
El factor XIII es una enzima de la cascada de la coagulación que se entrecruza con la fibrina y así promueve la estabilidad del tapón hemostático.
La coagulación es un sistema de enzimas proteolíticas en cascada con la activación posterior por proteólisis limitada. Después de la lesión se activan las rutas intrínsecas y extrínsecas de la coagulación. La activación intrínseca incluye los factores de coagulación XII, XI y IX que son enzimas proteolíticas (proteasas) y un cofactor enzimático (el factor VIII). El sistema extrínseco incluye el factor de tejido y el factor VII. Ambas rutas de activación resultan en la ruta común que contiene el factor de proteasa Xa y su cofactor (factor Va) que convierte la protrombina inactiva (factor II) a la trombina enzimáticamente activa (IIa, n.b.: los factores activados son marcados con un "a" después del número romano, el número romano sólo marca la enzima inactiva). La trombina se considera que es la proteasa principal del sistema de la coagulación. Esta divide al fibrinógeno (factor I) resultando en la fibrina que es el substrato para el cierre de la herida. Junto con las plaquetas de la sangre la fibrina forma el tapón hemostático. La trombina además activa el factor XIII de la coagulación por proteólisis limitada. A diferencia de otras proteasas de la cascada de la coagulación, el factor XIII es una transglutaminasa. El factor XIII se entrecruza con la molécula de fibrina mediante los residuos de lisina y glutamina, convirtiendo la fibrina soluble en la fibrina insoluble.
El FXIII como se encuentra en el plasma está compuesto por dos subunidades no-idénticas, la cadena a y la cadena b, con los pesos moleculares de aproximadamente 83.000 y 76.500 Da respectivamente (McDonagh J., en: Hemostasis y Trombosis, Colman RW, Hirsh J., March V.J. y Salzmann E.W. (eds), Lippincott, Filadelfia, 1994).
El complejo tetramérico en el plasma tiene la composición a_{2}b_{2} con un Mr de 320 000 Da. La concentración del tetrámero en el plasma es de alrededor de 0.07 \mumol/l. Durante el paso de activación, la trombina divide el enlace de Arg-Gly en las posiciones 37 y 38 de la cadena a liberando un péptido de activación de Mr 4500 a partir del amino terminal. El dímero de la cadena b se disocia a partir del complejo para liberar el dímero activo de la cadena a (a_{2}^{*}, FXIIIa). El FXIIIa es una glutamina-lisina transferasa. La reacción, catalizada es la formación de un enlace isopeptídico entre el grupo \gamma-carbonilo de la glutamina y el grupo \varepsilon-amino de la lisina entre las moléculas de fibrina, estabiliza la red de fibrina. De cuatro a seis entrecruzamientos de lisil-glutamil se forman por mol de fibrina.
La falta del factor XIII en los pacientes podría conducir a la diátesis hemorrágica y a daño en la cicatrización de la herida (Duckert F., Ann NY Acad Sci, vol. 202, 190-199, 1972). Los pacientes con una deficiencia congénita de FXIII padecen de tejido blando y hemorragia de la articulación después del trauma. La forma más grave de hemorragia está en el sistema nervioso central, en pacientes deficientes del FXIII que tienen una alta incidencia de hemorragia intracranial. Las mujeres con una deficiencia del FXIII sufren a menudo el aborto durante el embarazo. El FXIII estimula la proliferación de fibroblastos que es esencial para la cicatrización de la herida. De ese modo, los pacientes con deficiencia del FXIII fueron reportados por tener una cicatrización anormal.
En esta invención se describe la generación de un ratón transgénico defectuoso para el factor XIII de coagulación con alteración en los procesos de cicatrización de herida y trastornos hemorrágicos. Además, su uso es descrito para desarrollar fármacos que aceleren la cicatrización de la herida o fármacos que normalicen la coagulación.
Un animal transgénico no-humano que porte al menos un gen parcialmente defectuoso para el factor XIII de la coagulación puede ser preparado por manipulaciones genéticas conocidas, en las que el gen del factor XIII será inactivado por una inserción, supresión, sustitución o inversión u otras manipulaciones genéticas apropiadas. En la realización de la presente invención un animal transgénico no-humano con un gen defectuoso para el factor XIII de la coagulación ha sido preparado mediante una ruptura del gen seleccionado para la subunidad del factor XIIIa con una supresión del sitio activo que codifica para la secuencia del exón 7.
El ratón transgénico ha sido preparado como sigue:
Preparación de un ratón transgénico
La recombinación homóloga en las células embrionarias madre (ES) fue empleada para generar ratones con deficiencia del factor XIII.
Las secuencias genómicas de ratón para la subunidad del factor XIIIa fueron aisladas a partir de la cepa 129 de la biblioteca genómica usando una secuencia de cADN de rata como sonda. Una sonda específica para el sitio activo que codifica para el exón (exón 7) fue generada mediante PCR por amplificación de un fragmento relacionado de 110 pb de un cADN de rata. Esta sonda fue usada para aislar un clon lambda de 14kb (Figura 1). La presencia de la secuencia del exón 7 del factor XIII de ratón fue confirmada mediante secuenciación del ADN que reveló identidad de los nucleótidos 170/174 con la secuencia del exón 7 de rata (Figura 2 y la Listado de Secuencias). La secuencia de aminoácidos codificada es completamente idéntica a la secuencia de la proteína de rata.
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Un vector de sustitución tipo dirigido fue construido usando los métodos estándares de ADN recombinante. Una región de ADN genómico de aproximadamente 2.95 kb que abarca el exón 7 es suprimido en el constructo dirigido y sustituido por un promotor de actina-b conduciendo el cassette de marcador selectivo para neomicina fosfotransferasa (Figura 3). El constructo dirigido fue digerido con Sac 1 para eliminar las secuencias plasmídicas, luego introducidas por electroporación dentro de las células ES E14TG2a. Los transfectantes estables fueron aislados mediante selección en G418. Los recombinantes homólogos fueron identificados mediante hibridación Southern del ADN genómico con sondas externas tanto para las regiones de homología 5' como 3' (Figura 4). A partir de dos electroporaciones independientes 4 de cada 278 clones analizados dieron el patrón de hibridación previsto para el caso de sustitución homóloga. Dos de esos clones (FXIII-110 y FXIII-129) fueron microinyectados en blastocitos C57BL/6 para producir quimeras. Las quimeras fueron inicialmente sometidas a prueba cruzada con ratones suizos albinos mestizos. La transmisión de la línea germinal fue obtenida de ambos clones.
Las quimeras transmitidas fueron cruzadas con los ratones CBA/Ca para obtener la descendencia 1290la x CBA que porta el gen mutado para la subunidad del Factor IIIa. Seguidamente una generación de cruzamiento retrógrado para CBA/Ca, de ratones heterocigotos fueron entrecruzados. Animales homocigotos fueron identificados por hibridación Southern. La ausencia de la secuencia del exón 7 en los homocigotos fue confirmada usando una sonda específica para el exón 7.
Dicho ratón se ha caracterizado por su actividad transglutaminasa.
Caracterización del ratón defectuoso para el factor XIII mediante su actividad de transglutaminasa
Sangre venosa fue retirada y el citrato plasmático fue obtenido por centrifugación para la posterior prueba de actividad transglutaminasa. El ensayo usado fue el kit comercialmente disponible Berichrom F XIII, fabricado por Behring Diagnostics. Como material de referencia se ha usado el plasma humano estándar. La Tabla 1 muestra los resultados de las determinaciones plasmáticas de transglutaminasa de ratones normales con iguales antecedentes genéticos, pero sin el defecto en el gen FXIII, de ratones heterocigotos defectuosos para FXIII y de ratones homocigotos defectuosos para FXIII. Los niveles de transglutaminasa de los ratones normales determinado por Berichrom FXIII fue de 134%, para los animales heterocigotos con deficiencia el nivel determinado fue aproximadamente la mitad de éste (70%). Los niveles de transglutaminasa para los ratones homocigotos defectuosos para FXIII fue < 6%. Esto podría ser confirmado con otro ensayo de FXIII, un ensayo de la estabilidad del coágulo donde la actividad de FXIII se determina más específicamente por su actividad de entrecruzamiento hacia la fibrina que se hace insoluble en soluciones de urea o TCA. Con este ensayo la actividad de FXIII no fue detectable con un límite de detección del 2%.
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TABLA 1 Niveles de transglutaminasa en el plasma de ratones defectuosos para FXIII y ratones normales controles
1
- Uso del ratón defectuoso de FXIII - como un modelo para la afectación en la cicatrización de herida y hemorragia
Ratones defectuosos de FXIII fueron anestesiados con hexobarbital y fue afeitada la zona dorsal. Una incisión de máximo espesor en la línea media de la piel fue hecha con una cuchilla quirúrgica a lo largo de la columna vertebral. La herida fue cerrada con clips y a los ratones se les dejó despertar de la anestesia.
Dos días más tarde las pinzas fueron retiradas. En los días 7, 9, y 16 después de la herida la resistencia a la tensión de la herida cicatrizada fue investigada para cada animal.
Los ratones fueron sacrificados y la piel dorsal fue retirada. La piel fue luego cortada en piezas de exactamente un centímetro de ancho y 3 centímetros de longitud con incisiones centralmente localizadas. La pieza de piel fue luego introducida en un tensiómetro (Equipamiento de Prueba Hounsfield, Salford, Redhill, Inglaterra) y la resistencia a la tensión de la herida por incisión fue medida de acuerdo con el método descrito por Mustoe y otros (Science, vol. 237, 1333-1336, 1987). Una fuerza por desgarramiento con una velocidad constante fue aplicada a través de la incisión. La fuerza fue registrada gráficamente y la resistencia a la ruptura fue definida como el punto de máxima tensión antes de la separación de la herida.
La resistencia a la ruptura fue dada en Newton (N). Como control se usó una cepa de ratón con iguales antecedentes genéticos sin el gen defectuoso insertado (= ratones normales), que sufrió el mismo procedimiento experimental.
La Tabla 2 muestra los resultados del estudio de la cicatrización de la herida. En comparación con el control la resistencia a la ruptura fue inferior en ratones defectuosos para el FXIII en comparación con los ratones normales. Esto indica claramente una afectación en la cicatrización de la herida.
TABLA 2 Resistencia a la ruptura de las piezas de piel a partir de ratones defectuosos para FXIII y ratones normales controles (cepa CBA)
2
La prueba del tiempo de hemorragia sirve como medida de la función hemostática. Para el tiempo de hemorragia la cola fue extirpada a aproximadamente 2 mm a partir de la punta (hemorragia de la punta de la cola). El tiempo hasta el cese de la hemorragia fue monitoreado mediante el registro de la sangre proveniente de la herida con un papel del filtro. El tiempo de hemorragia fue dado en segundos para el cese de la hemorragia. La Tabla 3 indica los resultados del tiempo de hemorragia. Los ratones defectuosos para el FXIII tuvieron un tiempo de hemorragia significativamente prolongado comparado con los ratones normales.
TABLA 3 Tiempo de hemorragia en ratones defectuosos para FXIII y ratones normales controles
3 
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<110> Centeon Pharma GmbH
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<120> Un animal transgénico defectuoso para el factor XIII de la coagulación y su uso para probar la cicatrización de herida y la hemorragia
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<130> C9P11EP
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<140>
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<141>
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<160> 2
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<170> PatenteIn versión 2.1
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<210> 1
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<211> 174
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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<400> 1
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\hskip1cm
4 
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<210> 2
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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<400> 2
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Claims (8)

1. Un animal transgénico no-humano que es heterocigoto u homocigoto para un gen al menos parcialmente defectuoso para el factor XIII de la coagulación.
2. Un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 1 en el cual el gen defectuoso ha sido inactivado mediante una inserción, supresión, sustitución o inversión u otra manipulación genética apropiada.
3. Un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en el cual el gen defectuoso para el factor XIII de la coagulación ha sido preparado mediante una ruptura del gen seleccionado para el factor XIIIa con supresión del sitio activo que codifica para la secuencia del exón 7.
4. Un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 1 a 3 el cual es un roedor.
5. Un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 4 el cual es un ratón.
6. Un ratón transgénico defectuoso para el factor XIII caracterizado por la supresión de la secuencia del exón para el factor XIIIa.
7. Un método para probar las propiedades farmacológicas de un compuesto en relación con su actividad de factor XIII de coagulación, el método comprendiendo el contacto de un animal transgénico como el reivindicado en las reivindicaciones 1 a 6 con dicho compuesto y el monitoreo de su efecto en las alteraciones del proceso de cicatrización de la herida y los trastornos hemorrágicos.
8. Uso de una animal transgénico como el reivindicado en las reivindicaciones 1 a 6 para la investigación de fármacos administrados oral y parenteralmente en cicatrización de herida, hemorragia, u otras enfermedades asociadas con una deficiencia del factor XIII.
ES99118346T 1998-09-23 1999-09-16 Un animal transgenico defectuoso para el factor xiii de la coagulacion y su uso para prbar la cicatrizacion de herida y la hemorragia. Expired - Lifetime ES2318880T3 (es)

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