ES2318880T3 - Un animal transgenico defectuoso para el factor xiii de la coagulacion y su uso para prbar la cicatrizacion de herida y la hemorragia. - Google Patents
Un animal transgenico defectuoso para el factor xiii de la coagulacion y su uso para prbar la cicatrizacion de herida y la hemorragia. Download PDFInfo
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Abstract
La invención proporciona un animal mamífero transgénico no humano, que es heterocigoto u homocigoto para un gen de factor XIII de coagulación parcialmente defectuoso.
Description
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Un animal transgénico defectuoso para el factor
XIII de la coagulación y su uso para probar la cicatrización de
herida y la hemorragia.
Esta invención se refiere a un animal mamífero
transgénico no humano que es heterocigoto u homocigoto para el gen
al menos parcialmente defectuoso para el factor XIII de la
coagulación.
El factor XIII es una enzima de la cascada de la
coagulación que se entrecruza con la fibrina y así promueve la
estabilidad del tapón hemostático.
La coagulación es un sistema de enzimas
proteolíticas en cascada con la activación posterior por proteólisis
limitada. Después de la lesión se activan las rutas intrínsecas y
extrínsecas de la coagulación. La activación intrínseca incluye los
factores de coagulación XII, XI y IX que son enzimas proteolíticas
(proteasas) y un cofactor enzimático (el factor VIII). El sistema
extrínseco incluye el factor de tejido y el factor VII. Ambas rutas
de activación resultan en la ruta común que contiene el factor de
proteasa Xa y su cofactor (factor Va) que convierte la protrombina
inactiva (factor II) a la trombina enzimáticamente activa (IIa,
n.b.: los factores activados son marcados con un "a" después
del número romano, el número romano sólo marca la enzima inactiva).
La trombina se considera que es la proteasa principal del sistema de
la coagulación. Esta divide al fibrinógeno (factor I) resultando en
la fibrina que es el substrato para el cierre de la herida. Junto
con las plaquetas de la sangre la fibrina forma el tapón
hemostático. La trombina además activa el factor XIII de la
coagulación por proteólisis limitada. A diferencia de otras
proteasas de la cascada de la coagulación, el factor XIII es una
transglutaminasa. El factor XIII se entrecruza con la molécula de
fibrina mediante los residuos de lisina y glutamina, convirtiendo
la fibrina soluble en la fibrina insoluble.
El FXIII como se encuentra en el plasma está
compuesto por dos subunidades no-idénticas, la
cadena a y la cadena b, con los pesos moleculares de
aproximadamente 83.000 y 76.500 Da respectivamente (McDonagh J., en:
Hemostasis y Trombosis, Colman RW, Hirsh J., March V.J. y Salzmann
E.W. (eds), Lippincott, Filadelfia, 1994).
El complejo tetramérico en el plasma tiene la
composición a_{2}b_{2} con un Mr de 320 000 Da. La concentración
del tetrámero en el plasma es de alrededor de 0.07 \mumol/l.
Durante el paso de activación, la trombina divide el enlace de
Arg-Gly en las posiciones 37 y 38 de la cadena a
liberando un péptido de activación de Mr 4500 a partir del amino
terminal. El dímero de la cadena b se disocia a partir del complejo
para liberar el dímero activo de la cadena a (a_{2}^{*},
FXIIIa). El FXIIIa es una glutamina-lisina
transferasa. La reacción, catalizada es la formación de un enlace
isopeptídico entre el grupo \gamma-carbonilo de la
glutamina y el grupo \varepsilon-amino de la
lisina entre las moléculas de fibrina, estabiliza la red de
fibrina. De cuatro a seis entrecruzamientos de
lisil-glutamil se forman por mol de fibrina.
La falta del factor XIII en los pacientes podría
conducir a la diátesis hemorrágica y a daño en la cicatrización de
la herida (Duckert F., Ann NY Acad Sci, vol. 202,
190-199, 1972). Los pacientes con una deficiencia
congénita de FXIII padecen de tejido blando y hemorragia de la
articulación después del trauma. La forma más grave de hemorragia
está en el sistema nervioso central, en pacientes deficientes del
FXIII que tienen una alta incidencia de hemorragia intracranial.
Las mujeres con una deficiencia del FXIII sufren a menudo el aborto
durante el embarazo. El FXIII estimula la proliferación de
fibroblastos que es esencial para la cicatrización de la herida. De
ese modo, los pacientes con deficiencia del FXIII fueron reportados
por tener una cicatrización anormal.
En esta invención se describe la generación de
un ratón transgénico defectuoso para el factor XIII de coagulación
con alteración en los procesos de cicatrización de herida y
trastornos hemorrágicos. Además, su uso es descrito para
desarrollar fármacos que aceleren la cicatrización de la herida o
fármacos que normalicen la coagulación.
Un animal transgénico no-humano
que porte al menos un gen parcialmente defectuoso para el factor
XIII de la coagulación puede ser preparado por manipulaciones
genéticas conocidas, en las que el gen del factor XIII será
inactivado por una inserción, supresión, sustitución o inversión u
otras manipulaciones genéticas apropiadas. En la realización de la
presente invención un animal transgénico no-humano
con un gen defectuoso para el factor XIII de la coagulación ha sido
preparado mediante una ruptura del gen seleccionado para la
subunidad del factor XIIIa con una supresión del sitio activo que
codifica para la secuencia del exón 7.
El ratón transgénico ha sido preparado como
sigue:
La recombinación homóloga en las células
embrionarias madre (ES) fue empleada para generar ratones con
deficiencia del factor XIII.
Las secuencias genómicas de ratón para la
subunidad del factor XIIIa fueron aisladas a partir de la cepa 129
de la biblioteca genómica usando una secuencia de cADN de rata como
sonda. Una sonda específica para el sitio activo que codifica para
el exón (exón 7) fue generada mediante PCR por amplificación de un
fragmento relacionado de 110 pb de un cADN de rata. Esta sonda fue
usada para aislar un clon lambda de 14kb (Figura 1). La presencia
de la secuencia del exón 7 del factor XIII de ratón fue confirmada
mediante secuenciación del ADN que reveló identidad de los
nucleótidos 170/174 con la secuencia del exón 7 de rata (Figura 2 y
la Listado de Secuencias). La secuencia de aminoácidos codificada
es completamente idéntica a la secuencia de la proteína de rata.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Un vector de sustitución tipo dirigido fue
construido usando los métodos estándares de ADN recombinante. Una
región de ADN genómico de aproximadamente 2.95 kb que abarca el exón
7 es suprimido en el constructo dirigido y sustituido por un
promotor de actina-b conduciendo el cassette de
marcador selectivo para neomicina fosfotransferasa (Figura 3). El
constructo dirigido fue digerido con Sac 1 para eliminar las
secuencias plasmídicas, luego introducidas por electroporación
dentro de las células ES E14TG2a. Los transfectantes estables fueron
aislados mediante selección en G418. Los recombinantes homólogos
fueron identificados mediante hibridación Southern del ADN genómico
con sondas externas tanto para las regiones de homología 5' como 3'
(Figura 4). A partir de dos electroporaciones independientes 4 de
cada 278 clones analizados dieron el patrón de hibridación previsto
para el caso de sustitución homóloga. Dos de esos clones
(FXIII-110 y FXIII-129) fueron
microinyectados en blastocitos C57BL/6 para producir quimeras. Las
quimeras fueron inicialmente sometidas a prueba cruzada con ratones
suizos albinos mestizos. La transmisión de la línea germinal fue
obtenida de ambos clones.
Las quimeras transmitidas fueron cruzadas con
los ratones CBA/Ca para obtener la descendencia 1290la x CBA que
porta el gen mutado para la subunidad del Factor IIIa. Seguidamente
una generación de cruzamiento retrógrado para CBA/Ca, de ratones
heterocigotos fueron entrecruzados. Animales homocigotos fueron
identificados por hibridación Southern. La ausencia de la secuencia
del exón 7 en los homocigotos fue confirmada usando una sonda
específica para el exón 7.
Dicho ratón se ha caracterizado por su actividad
transglutaminasa.
Sangre venosa fue retirada y el citrato
plasmático fue obtenido por centrifugación para la posterior prueba
de actividad transglutaminasa. El ensayo usado fue el kit
comercialmente disponible Berichrom F XIII, fabricado por Behring
Diagnostics. Como material de referencia se ha usado el plasma
humano estándar. La Tabla 1 muestra los resultados de las
determinaciones plasmáticas de transglutaminasa de ratones normales
con iguales antecedentes genéticos, pero sin el defecto en el gen
FXIII, de ratones heterocigotos defectuosos para FXIII y de ratones
homocigotos defectuosos para FXIII. Los niveles de transglutaminasa
de los ratones normales determinado por Berichrom FXIII fue de
134%, para los animales heterocigotos con deficiencia el nivel
determinado fue aproximadamente la mitad de éste (70%). Los niveles
de transglutaminasa para los ratones homocigotos defectuosos para
FXIII fue < 6%. Esto podría ser confirmado con otro ensayo de
FXIII, un ensayo de la estabilidad del coágulo donde la actividad
de FXIII se determina más específicamente por su actividad de
entrecruzamiento hacia la fibrina que se hace insoluble en
soluciones de urea o TCA. Con este ensayo la actividad de FXIII no
fue detectable con un límite de detección del 2%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones defectuosos de FXIII fueron anestesiados
con hexobarbital y fue afeitada la zona dorsal. Una incisión de
máximo espesor en la línea media de la piel fue hecha con una
cuchilla quirúrgica a lo largo de la columna vertebral. La herida
fue cerrada con clips y a los ratones se les dejó despertar de la
anestesia.
Dos días más tarde las pinzas fueron retiradas.
En los días 7, 9, y 16 después de la herida la resistencia a la
tensión de la herida cicatrizada fue investigada para cada
animal.
Los ratones fueron sacrificados y la piel dorsal
fue retirada. La piel fue luego cortada en piezas de exactamente un
centímetro de ancho y 3 centímetros de longitud con incisiones
centralmente localizadas. La pieza de piel fue luego introducida en
un tensiómetro (Equipamiento de Prueba Hounsfield, Salford, Redhill,
Inglaterra) y la resistencia a la tensión de la herida por incisión
fue medida de acuerdo con el método descrito por Mustoe y otros
(Science, vol. 237, 1333-1336, 1987). Una fuerza por
desgarramiento con una velocidad constante fue aplicada a través de
la incisión. La fuerza fue registrada gráficamente y la resistencia
a la ruptura fue definida como el punto de máxima tensión antes de
la separación de la herida.
La resistencia a la ruptura fue dada en Newton
(N). Como control se usó una cepa de ratón con iguales antecedentes
genéticos sin el gen defectuoso insertado (= ratones normales), que
sufrió el mismo procedimiento experimental.
La Tabla 2 muestra los resultados del estudio de
la cicatrización de la herida. En comparación con el control la
resistencia a la ruptura fue inferior en ratones defectuosos para el
FXIII en comparación con los ratones normales. Esto indica
claramente una afectación en la cicatrización de la herida.
La prueba del tiempo de hemorragia sirve como
medida de la función hemostática. Para el tiempo de hemorragia la
cola fue extirpada a aproximadamente 2 mm a partir de la punta
(hemorragia de la punta de la cola). El tiempo hasta el cese de la
hemorragia fue monitoreado mediante el registro de la sangre
proveniente de la herida con un papel del filtro. El tiempo de
hemorragia fue dado en segundos para el cese de la hemorragia. La
Tabla 3 indica los resultados del tiempo de hemorragia. Los ratones
defectuosos para el FXIII tuvieron un tiempo de hemorragia
significativamente prolongado comparado con los ratones
normales.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Centeon Pharma GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Un animal transgénico defectuoso
para el factor XIII de la coagulación y su uso para probar la
cicatrización de herida y la hemorragia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> C9P11EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatenteIn versión 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 174
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (8)
1. Un animal transgénico
no-humano que es heterocigoto u homocigoto para un
gen al menos parcialmente defectuoso para el factor XIII de la
coagulación.
2. Un animal transgénico de acuerdo con la
reivindicación 1 en el cual el gen defectuoso ha sido inactivado
mediante una inserción, supresión, sustitución o inversión u otra
manipulación genética apropiada.
3. Un animal transgénico de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 en el cual el gen defectuoso para el factor
XIII de la coagulación ha sido preparado mediante una ruptura del
gen seleccionado para el factor XIIIa con supresión del sitio
activo que codifica para la secuencia del exón 7.
4. Un animal transgénico de acuerdo con la
reivindicación 1 a 3 el cual es un roedor.
5. Un animal transgénico de acuerdo con la
reivindicación 4 el cual es un ratón.
6. Un ratón transgénico defectuoso para el
factor XIII caracterizado por la supresión de la secuencia
del exón para el factor XIIIa.
7. Un método para probar las propiedades
farmacológicas de un compuesto en relación con su actividad de
factor XIII de coagulación, el método comprendiendo el contacto de
un animal transgénico como el reivindicado en las reivindicaciones
1 a 6 con dicho compuesto y el monitoreo de su efecto en las
alteraciones del proceso de cicatrización de la herida y los
trastornos hemorrágicos.
8. Uso de una animal transgénico como el
reivindicado en las reivindicaciones 1 a 6 para la investigación de
fármacos administrados oral y parenteralmente en cicatrización de
herida, hemorragia, u otras enfermedades asociadas con una
deficiencia del factor XIII.
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