ES2318485T3 - Metodo para la produccion de microrredes quimicas. - Google Patents
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Abstract
Método de producción de una microrred, comprendiendo el método los pasos siguientes: (a) síntesis, en dos o más etapas, de moléculas sonda sobre un soporte polímero, formándose enlaces entre las moléculas sonda y el soporte polímero; (b) disolución del soporte polímero que tiene las moléculas sonda sintéticas de acuerdo con el paso (a), reteniéndose los enlaces entre el soporte polímero y las moléculas sonda; (c) aplicación de la solución que contiene el soporte polímero que tiene las molécula sonda unidas en la forma de microgotas a una superficie plana.
Description
Método para la producción de microrredes
químicas.
La presente invención se refiere a un método de
producción de una microrred, a una microrred para detectar
interacciones entre moléculas sonda y moléculas de analito de una
muestra y al uso de la microrred para dicha detección.
En el lenguaje científico, se hace referencia a
las colecciones de un gran número de compuestos de test diferentes
dispuestos sobre una superficie plana como "redes". Se hace
referencia también a menudo a los compuestos de test como sondas o
moléculas sonda, que están fijadas o inmovilizadas sobre la
superficie plana. Tales redes permiten el testado rápido y
simultáneo de todas las moléculas sonda con respecto a su
interacción con un analito o una mezcla de analitos en una muestra.
Se hace referencia a menudo a los analitos de la muestra como
moléculas (diana). La ventaja de una red plana sobre un test
(ensayo) que tiene moléculas sonda inmovilizadas sobre elementos
móviles, tales como, por ejemplo, cuentas, es que en una red la
estructura química y/o la identidad de las moléculas sonda
inmovilizadas está definida precisamente por su localización en la
superficie de la red. Por lo tanto, una señal de test específica
local, que es producida, por ejemplo, por una interacción entre la
molécula sonda y la molécula analito, puede asignarse inmediatamente
a un tipo de molécula o a una molécula sonda. Como prueba de una
interacción entre una molécula sonda y una molécula analito es
posible también utilizar la conversión enzimática de la sonda por
la biomolécula, con el resultado de que una señal de test local
puede desaparecer también y en consecuencia sirve como prueba
directa. Particularmente
en forma miniaturizada, las redes que contienen moléculas sonda biológicas se conocen también como biochips.
en forma miniaturizada, las redes que contienen moléculas sonda biológicas se conocen también como biochips.
Ejemplos de tales redes en la técnica anterior
son redes de ácido nucleico de fragmentos de DNA, cDNAs, RNAs,
productos de PCR, plásmidos, bacteriófagos y oligómeros sintéticos
de PNA, que se seleccionan por medio de hibridación, con formación
de una molécula bicatenaria, para dar analitos de ácido nucleico
complementarios. Adicionalmente, redes proteínicas de anticuerpos,
proteínas expresadas en células o proteínas de fusión de fago
(presentación de fago) juegan un papel importante. Adicionalmente,
se conocen redes compuestas de péptidos sintéticos, análogos de los
mismos, tales como peptoides, oligocarbamatos o compuestos químicos
orgánicos en general que se seleccionan, por ejemplo, por medio de
fijación a analitos proteínicos estrechamente afines u otros
analitos por medio de reacción enzimática. Además, se han descrito
redes de quimeras y conjugados de dichas moléculas sonda.
Tales redes se producen corrientemente de
acuerdo con dos principios diferentes por aplicación de las
moléculas sonda a las superficies de materiales que se han
preparado especialmente de antemano, por ejemplo superficies de
chips. Una revisión en este contexto ha sido realizada por Wölfl en:
Transcript Laborwelt 3 (2000), 13-20.
Los dos principios diferentes se refieren en
primer lugar a una aplicación en un solo paso de soluciones de
moléculas sonda preparadas previamente sobre la superficie y/o en
segundo lugar a la aplicación seriada repetida de soluciones de
bloques fundamentales para la síntesis química en paralelo de las
moléculas sonda in situ sobre la superficie.
La superficie que tiene las moléculas sonda
fijadas se ponen luego en contacto, en toda su área, con la solución
de las moléculas de analito de una muestra, de tal manera que
cuando la interacción específica y selectiva entre la molécula
sonda y una molécula analito se ha completado, se genera una señal
en la localización de la molécula sonda. Dicha señal puede, o bien
producirse directamente, por ejemplo por fijación de una biomolécula
marcada por fluorescencia, o puede generarse en tratamientos
ulteriores con reactivos de detección, por ejemplo en la forma de
una señal óptica o radiactiva. Después que el exceso de moléculas de
analito ha sido eliminado por lavado, se lee la señal. Los muchos
detalles técnicos diferentes relativos a procedimiento y detección
se describen en Bowtell & Sambrook, DNA Microarrays: A Cloning
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
Nueva York, (2003), ISBN
0-87969-624-9.
La miniaturización creciente de las redes para
formar microrredes presenta grandes ventajas, especialmente para el
análisis de muestras biológicas, verbigracia en diagnósticos
médicos. Por ejemplo, cuantas más moléculas sonda pueden disponerse
por unidad de superficie, tanto mayor es el número de señales de
test (resultados) que se obtienen con la misma cantidad de muestra
biológica. Dado que en ciertos casos, tales como, por ejemplo, en
biopsias humanas, únicamente está disponible una cantidad muy
pequeña de material de partida, es únicamente por dicha
miniaturización como pueden realizarse análisis diagnósticos dentro
de un campo extenso y puede responderse a las interrogantes
subyacentes.
Las tecnologías para preparación de microrredes
y biochips con densidades de sonda mayores que 100 sondas por
cm^{2} utilizan usualmente como la superficie soportes de vidrio
planos no porosos, aplicándose las sondas en la forma de una capa
cuasi-monomolecular (Southern et al., Nature
Genetics Suppl. No. 1 (1999), 5-9; Xu et
al., Molecular Diversity (2004), 1-10). Los
requisitos más importantes para la detección satisfactoria y
sensible de las moléculas de analito son selectividad alta de los
sucesos de fijación así como estabilidad y afinidad altas del
complejo entre la molécula sonda y la molécula analito. En el caso
de la última, es un factor decisivo en particular una constante de
disociación baja k_{off} lo que determina la rapidez con que se
descompone de nuevo el complejo resultante. Únicamente cuando la
constante de disociación es suficientemente baja, la molécula
analito, después de la captura, se mantiene de hecho durante un
periodo de tiempo suficiente en la localización de la molécula
sonda cuando se eliminan por lavado las soluciones en exceso.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Tales condiciones ventajosas de fijación pueden
conseguirse casi siempre en el caso de ácidos nucleicos cuya
detección se efectúa por medio de hibridación para formar cadenas de
ácido nucleico. Cuando las cadenas complementarias son
suficientemente largas, se obtienen estabilidades y selectividades
extremadamente altas. Dicha situación ventajosa tiende a ser rara
para otras moléculas sonda, tales como, por ejemplo, péptidos,
oligosacáridos o compuestos químicos en general, y sus complejos
con moléculas de analito, tales como, por ejemplo, proteínas. Los
problemas analíticos a investigar incluyen una extensa gama de
estabilidades de los complejos, con constantes de disociación que
van desde pM, tales como, por ejemplo, estreptavidina con biotina,
hasta mM para las interacciones proteína/ingrediente activo.
Para análisis de microrredes con complejos de
estabilidad baja se ha propuesto aumentar la concentración local de
las moléculas sonda. Como resultado, las moléculas diana disociadas
durante el proceso de lavado pueden fijarse de nuevo más
rápidamente a otras moléculas sonda en proximidad espacial
("re-fijación"). Un aumento significativo en
la concentración local de la sonda se obtiene, sin embargo,
únicamente cuando se utiliza una capa 3D en lugar de una capa
molecular plana 2D. Ejemplos de ello son el uso de capas porosas en
las cuales puede utilizarse también la superficie interior.
Ejemplos de ello desde el punto de vista
práctico son la síntesis SPOT sobre membranas de celulosa,
polipropileno o Teflón (The SPOT-Synthesis
Technique: Synthetic Peptide Arrays on Membrane Supports. In:
Methods of parallel peptide synthesis and their contributions to
deciphering molecular interactions in the immune system. Editor
invitado: C. Granier, Parte 3, The SPOT method of peptide synthesis:
the role of arrayed peptides in revealing key features of
antigen-antibody recognition. Special Issue of the
Journal of Immunological Methods; Frank, J. Immunol. Meth. 267
(2002), 13-26). Los complejos proteína/péptido en
tales soportes de membrana pueden detectarse todavía hasta una
constante de disociación de aproximadamente 1 mM (Hoffmüller et al.,
Angew. Chem. Int. Ed. 38 (1999) 2000-2003).
Ejemplos adicionales son las denominadas redes
de parches con pastillas o porciones elevadas extremadamente
pequeñas de poliacrilamida que está presente unida de modo covalente
a vidrio (Yershov et al., PNAS 93 (1996),
4913-4918). Alternativamente, es también posible
utilizar pequeñas polimerizaciones especialmente separadas, de tipo
injerto en polipropileno (DE 103 40 429). Se han descrito también
redes de píxeles que tienen porciones elevadas extremadamente
pequeñas de injerto de ácido poliacrílico sobre polipropileno (WO
02/066984).
Adicionalmente, capas de nitrocelulosa o nailon
que están fijadas a soportes de vidrio están disponibles
comercialmente de Schleicher & Schüll, Alemania, siendo la
densidad de aplicación recomendada o densidad de puntos 100 puntos
por cm^{2}. Esto no puede miniaturizarse mucho más debido al alto
poder de absorción de la capa y habida cuenta de la difusión de las
moléculas sonda aplicadas.
Adicionalmente, se han descrito materiales
planos que tienen poros alineados en paralelo, a los que se hace
referencia también como chips de flujo continuo (Benoit et
al., Anal. Chem. 73 (2001), 2412-2420).
Adicionalmente, se ha descrito que las moléculas
sonda pueden acoplarse primeramente a un soporte polímero soluble,
tal como, por ejemplo, proteínas o polisacáridos, punteándose el
conjugado soluble resultante sobre, por ejemplo, superficies de
vidrio o plástico, utilizando un microalimentador. Con una elección
adecuada del soporte, el conjugado secado formará un precipitado
poroso que, sin embargo, se adhiere firmemente a la superficie del
chip. De este modo se crea una situación local similar a una capa de
membrana porosa (Xu et al., Molecular Diversity, (2004),
1-10, presentado para publicación). Para dicho
proceso, sin embargo, las moléculas sonda tienen que estar
presentes o producirse en una forma que permita la unión específica
al material soporte. En este contexto, los autores proponen la
ligación química entre un soporte polímero especial modificado con
cetona y sondas modificadas con
amino-oxil-acetilo. Sin embargo, es
especialmente una desventaja que ambos componentes se producen por
separado y se combinan únicamente en un paso de unión subsiguiente.
Además, éste debe llevarse a cabo en condiciones de seguridad y
fiablemente para muchos millares de sondas.
En la totalidad de los métodos de producción de
microrredes descritos en la técnica anterior, son especialmente
problemáticas las moléculas sonda que tienen un peso molecular bajo,
tales como, por ejemplo, péptidos o pequeñas moléculas orgánicas.
Las mismas tienen que producirse laboriosamente por síntesis química
combinatoria o en paralelo, lo que se realiza predominantemente
sobre la superficie de un soporte polímero. Una revisión de la
síntesis química en fase sólida de acuerdo con Merrifeld y sus
muchas modificaciones, especialmente para la producción
combinatoria y en paralelo de genotecas de compuestos, ha sido
descrita por Dörwald, Organic Synthesis on Solid Phase, (2000),
Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Alemania, ISBN
3-527-29950-5.
La presente invención está basada por tanto en
el problema de proporcionar un nuevo método de producción de
microrredes para moléculas sonda sintetizadas químicamente, que es
más simple de llevar a cabo, es capaz de utilizar todas las ventajas
de la síntesis en fase sólida, con inclusión de la automatización
del procedimiento, y es adecuado adicionalmente para moléculas sonda
que tengan un peso molecular bajo.
Dicho problema se resuelve por un método de
producción de una microrred, método que comprende los pasos
siguientes:
- (a)
- síntesis, en dos o más etapas, de moléculas sonda sobre un soporte polímero, formándose enlaces entre las moléculas sonda y el soporte polímero;
\global\parskip1.000000\baselineskip
- (b)
- dispersión del soporte polímero que tiene las moléculas sonda sintéticas de acuerdo con el paso (a), reteniéndose los enlaces entre el soporte polímero y las moléculas sonda;
- (c)
- purificación opcional de las molécula sonda unidas al soporte polímero;
- (d)
- disolución del soporte polímero que tiene las moléculas sonda unidas; y
- (e)
- aplicación de la solución que contiene el soporte polímero que tiene las moléculas sonda unidas en forma de microgotas a una superficie plana.
El método de acuerdo con la invención combina
por tanto una serie de pasos operativos de la técnica anterior; en
particular, combina la síntesis química y la conjugación, por
ejemplo, de acuerdo con Xu et al., en Molecular Diversity,
(2004), 1-10, utilizando el mismo material soporte
polímero para ambos pasos. Como resultado se consigue una
simplificación sustancial de la técnica anterior.
El problema se resuelve también por una
microrred de acuerdo con la reivindicación 15 que se ha producido de
acuerdo con el método de la invención.
El método de acuerdo con la invención utiliza
métodos de síntesis en paralelo y combinatoria para producir
moléculas sonda y genotecas de moléculas. Por la selección de un
soporte polímero adecuado es posible producir directamente
microrredes para análisis de interacción, cuyas calidad y
sensibilidad son equivalentes a los métodos de
macro-test descritos previamente. Para dicho método,
es asimismo posible utilizar cualesquiera compuestos químicos
empleados en los métodos de macro-test.
La ventaja particular del método de acuerdo con
la invención es que pueden producirse o imprimirse un gran número
de copias idénticas de microrredes a partir de un equipo de síntesis
muy pequeño. Dado que se utiliza la misma solución para todas las
copias, las copias de la red son de calidad muy comparable. Esto
constituye una diferencia muy importante con respecto a las redes
producidas por síntesis in situ, por ejemplo, en las cuales las
moléculas sonda tienen que sintetizarse por separado en cada copia.
Tomando como base los valores para la dispersión del soporte
polímero precipitado que se describen en la sección de ejemplos y
preferiblemente en las realizaciones específicas de la invención,
es posible producir hasta diez millones de bandejas, todas ellas de
la misma calidad, a partir de una síntesis de aproximadamente 50
nmol por sonda sobre los puntos de una membrana de celulosa.
En comparación con las microrredes descritas
previamente de moléculas sonda sintéticas que se producen por mera
movilización de las moléculas sonda después de la síntesis (Xu,
et al., (2004)), el método de acuerdo con la invención
presenta una ventaja adicional especialmente para la producción de
microrredes a partir de pequeñas moléculas orgánicas para la
búsqueda de ingredientes farmacéuticos activos. Además de la función
química de la molécula sonda para anclaje sobre el soporte de
síntesis, no se requiere para la conjugación función química
adicional alguna en la molécula, lo cual aumenta significativamente
el alcance para una diversidad de moléculas orgánicas pequeñas.
La Figura 1 muestra los resultados de la
síntesis y un test de fijación de anticuerpos de una colección de
125 sondas peptídicas de acuerdo con el método de síntesis SPOT
sobre una membrana de celulosa que tiene una separación de puntos de
5 mm;
La Figura 1a muestra una imagen de las señales
de test MTT/BCIP;
La Figura 1b muestra la evaluación cuantitativa
de las señales de test y su representación en la forma de un mapa
2D;
La Figura 2 muestra un test de fijación de
anticuerpos de los mismos péptidos sonda que en la Figura 1, que se
produjeron de acuerdo con el método de síntesis SPOT sobre una
membrana soluble de celulosa, después de perforación, dispersión y
punteado sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio sin tratar,
siendo la separación SPOT 0,5 mm.
La Figura 2a muestra una imagen de las señales
de test de fluorescencia Cy5;
La Figura 2b muestra la evaluación cuantitativa
de las señales de test y su representación en la forma de un mapa
2D.
Para el método de acuerdo con la invención, las
moléculas sonda se producen por síntesis química combinatoria o en
paralelo sobre un soporte polímero adecuado, y permanecen
inmovilizadas en el mismo por la selección de un enlace químico
estable, que puede encontrarse especialmente en la forma de un
anclaje químico estable, por ejemplo en Frank y Overwin, en:
Methods in Molecular Biology, 66; Epitope Mapping Protocols (G.E.
Morris, compilador), The Humana Press Inc., Totowa, EE.UU. (1996),
149-169). La eliminación de todos los grupos
protectores es posible y es aconsejable la prepurificación de las
moléculas sonda por lavado. De esta manera, pueden aprovecharse
todas las ventajas de la síntesis en fase sólida, con inclusión de
la automatización del procedimiento. Si se desea, puede retirarse
una pequeña porción de las moléculas sonda del material soporte a
fin de comprobar la calidad de la síntesis con ayuda de técnicas
analíticas. Para dicha retirada tiene que proporcionarse un
enlazador adecuado; véase, por ejemplo, Frank y Overwin, loc.
cit. El material soporte cargado con las moléculas sonda se
dispersa luego en un disolvente por un tratamiento químico especial
que puede favorecerse opcionalmente por degradación parcial del
polímero. Sin embargo, las moléculas sonda propiamente dichas, así
como el enlace químico de las moléculas sonda con el material
soporte se retienen durante dichos pasos. Si se desea, las
soluciones resultantes de las moléculas sonda unidas al material
soporte pueden diluirse luego y puntearse utilizando un
microalimentador sobre superficies de vidrio o plástico, por
ejemplo. Las microgotas se secan en la superficie. Las microrredes
resultantes que tienen las moléculas sonda inmovilizadas se utilizan
luego para el análisis de interacción con las moléculas de
analito.
El material soporte polímero utilizado en el
método de acuerdo con la invención debería ser insoluble en la
mayoría de los disolventes orgánicos que se utilizan para síntesis
química. El mismo debería ser también inerte hacia la mayoría de
las reacciones de síntesis química que se emplean para la síntesis
química de las moléculas sonda. Es también ventajosa una carga
suficientemente alta con funcionalidades químicas para la
introducción de compuestos de anclaje/enlazadores utilizados para
la síntesis de las sondas químicas. Adicionalmente, el material
soporte polímero debería ser capaz de hacerse soluble en un
disolvente adecuado para micropunteado por un proceso que no es
destructivo para la molécula sonda. El material soporte polímero
debería permitir también la formación de un precipitado capaz de
adherirse satisfactoriamente a las superficies de vidrio o
plástico. La formación de un precipitado que no puede disolverse en
las condiciones del análisis de interacción es una ventaja crucial
o indispensable. Adicionalmente, se ha encontrado que es
especialmente ventajosa la formación de un precipitado poroso que
asegura que las moléculas diana o las moléculas de analito en las
muestras tienen acceso suficientemente satisfactorio a las moléculas
sonda inmovilizadas.
Se ha demostrado que es especialmente ventajoso
que las uniones entre las moléculas sonda y el soporte polímero
sean enlaces químicos, especialmente enlaces químicos covalentes.
Los enlaces covalentes son enlaces químicos muy fuertes que
permiten una unión estable y de larga duración entre las moléculas
sonda y el soporte polímero incluso durante la dispersión del
soporte polímero.
El soporte polímero se forma preferiblemente a
partir de un material poroso. Es particularmente adecuado el papel,
especialmente papel celulósico; véase, por ejemplo, Frank, Nucleic
Acids Res. 11 (1983), 4365-4377; Frank and Döring,
Tetrahedron 44, 19 (1988), 6031-6040; Frank,
Tetrahedron 48 (1992), 9217-9232; Dittrich et
al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 8 (1998),
2351-2356.
La dispersión del soporte polímero se efectúa,
por ejemplo, en una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA),
diclorometano, tri-isobutilsilano (TIBS) y agua. Al
mismo tiempo, dicha solución puede utilizarse para eliminar los
grupos protectores de cadena lateral presentes todavía en las
moléculas sonda, que pueden ser, por ejemplo, sondas peptídicas, de
tal modo que únicamente esté presente la molécula o péptido sonda no
protegido(a) unida al material soporte polímero
dispersado.
En una realización especialmente preferida de la
invención, la mezcla para dispersión del soporte polímero contiene
aproximadamente 60-100% en volumen, y especialmente
80-90% en volumen de ácido trifluoroacético, con
preferencia aproximadamente 85% en volumen, aproximadamente
0-15% en volumen y especialmente
5-15% en volumen de diclorometano, con preferencia
aproximadamente 7% en volumen, aproximadamente 0-5%
en volumen, y especialmente 2-5% en volumen de
tri-isobutilsilano, con preferencia aproximadamente
3% en volumen, y aproximadamente 0-5% en volumen y
especialmente 2-5% en volumen de agua, con
preferencia aproximadamente 5% en volumen.
Se ha encontrado que es ventajoso que el tiempo
de reacción para la dispersión del soporte polímero sea
aproximadamente 0,1-24 horas y especialmente
2-24 horas, con preferencia aproximadamente 16
horas.
El lavado del soporte polímero que tiene las
moléculas sonda unidas puede efectuarse preferiblemente en
dietil-éter, acetona o terc-butilmetil-éter. Es
especialmente preferido dietil-éter. Globalmente, es adecuado
cualquier agente precipitante en el cual es insoluble el soporte
polímero. Las impurezas y los grupos protectores eliminados, sin
embargo, deberían ser fácilmente solubles en el agente
precipitante/disolvente. Se ha demostrado que es adecuado el lavado
de 3 a 5 veces, pero generalmente son suficientes 3 lavados.
La disolución del material soporte polímero que
tiene las moléculas sonda inmovilizadas en él se efectúa, por
ejemplo, en agua, DMF, NMP o DMSO, dándose preferencia a DMSO. Es
adecuado cualquier disolvente en el cual el soporte polímero y las
moléculas sonda sean fácilmente solubles. Adicionalmente, el
disolvente debe ser adecuado para el paso subsiguiente de
micropunteado. En el caso de DMSO, se ha encontrado que el mismo
tiene el efecto solubilizante máximo y, a pesar de su punto de
ebullición muy alto, es muy adecuado para micropunteado. La
cantidad de disolvente utilizada depende especialmente del soporte
polímero utilizado. El factor de dilución es de 1:5 a 1:100,
preferiblemente 1:20. El factor de dilución depende del soporte
polímero utilizado y determina la morfología de puntos deseada en la
superficie plana.
En una realización preferida, las moléculas
sonda son péptidos de cadena corta, polipéptidos, polisacáridos o
ácidos nucleicos, moléculas de DNA o moléculas de RNA y
especialmente moléculas orgánicas pequeñas.
De acuerdo con la invención, se obtiene un
microchip, especialmente un biochip, cuando la solución que contiene
el material soporte polímero que tiene las moléculas sonda
inmovilizadas se puntea sobre una superficie plana.
Dado que el método de acuerdo con la invención
no requiere pre-tratamiento químico o físico alguno
de la superficie plana, puede utilizarse como la superficie
cualquier material imaginable. Se ha demostrado particularmente
ventajoso utilizar metal, vidrio, materias plásticas o materiales
cerámicos, especialmente un portaobjetos de microscopio de vidrio.
Por supuesto, son también imaginables otras superficies.
Alternativamente, es también posible utilizar
como soporte polímero una proteína en la cual se sintetizan
moléculas sonda (Hansen et al., Int. J. Peptide Protein Res.
41 (1993), 237-245). Las moléculas sonda se
sintetizan en paralelo en recipientes de reacción separados y el
material soporte se separa de la mezcla de reacción por
precipitación y centrifugación después de cada paso de síntesis. Los
pasos ulteriores de la síntesis de la sonda y la producción de
microrredes se llevan a cabo del mismo modo que en el caso en que se
utiliza celulosa como soporte polímero.
Como un material soporte adicional posible,
además de celulosa o proteínas, entra también en consideración por
ejemplo poliacrilato reticulado con disulfuro (Goddard et
al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. (1988),
1025-1027).
La presente invención se refiere también a una
microrred de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la microrred
se ha producido por el método de acuerdo con la invención.
En una microrred de este tipo, las moléculas
sonda son preferiblemente péptidos de cadena corta, polipéptidos,
polisacáridos o ácidos nucleicos, moléculas de DNA o moléculas de
RNA, especialmente moléculas orgánicas pequeñas.
En el contexto del método, una muestra incluye
cualquier tipo de solución de moléculas de analito que pueda entrar
en interacción o en reacción química o enzimática con las moléculas
sonda en la red. Éstas incluyen especialmente muestras biológicas
obtenidas por la extracción de fluidos biológicos tales como sangre,
suero, secreciones, linfa, dializado, líquido, savia, fluido
corporal de insectos, gusanos, cresas, etc. Se incluye también la
extracción de fuentes naturales tales como biopsias, órganos o
partes de animales y plantas, células, insectos, gusanos,
bacterias, microbios y material parasitario, así como sobrenadantes
de cultivos celulares y de cultivos bacterianos, microbianos o
parasitarios. La muestra puede ser también una muestra química
sintética que contiene, por ejemplo, oligonucleótidos, PNAs, RNAs,
péptidos y proteínas sintéticas, receptores orgánicos sintéticos,
reactivos y/o moléculas jaula.
En particular, la muestra utilizada puede ser
una muestra humana y preferiblemente una muestra de una biopsia
humana.
La invención se refiere también al uso de la
microrred producible por el método de acuerdo con la invención para
detectar interacciones entre moléculas sonda y moléculas de analito
de una muestra.
El método de acuerdo con la invención se
describe más adelante en esta memoria utilizando el ejemplo de
péptidos sintéticos como moléculas sonda. Se describe la síntesis
química de los mismos sobre papel celulósico como el soporte
polímero de acuerdo con el método de filtración, el método de
punteado o el método de corte y combinación, la dispersión de los
segmentos de soporte polímero que tienen las sondas inmovilizadas
por medio de ácido trifluoroacético (TFA), la purificación de las
sondas inmovilizadas por precipitación en éter así como la
disolución del precipitado en dimetil-sulfóxido
(DMSO) y el punteado de las soluciones de DMSO sobre soportes de
vidrio. Después del secado y la incubación de las redes de vidrio
punteadas con la solución de un anticuerpo, los anticuerpos fijados
a las moléculas sonda individuales pueden detectarse utilizando un
anticuerpo secundario marcado por fluorescencia de acuerdo con el
principio ELISA.
Métodos de trabajo de biología molecular
utilizados comúnmente no se describen en detalle en esta memoria,
pero puede encontrarse referencia a ellos en Bowtell y Sambrook, en:
DNA Microarrays: A cloning manual. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, (2003), ISBN
0-87969-624-9; Frank
y Overwin, en: Methods in Molecular Biology, 66: Epitope Mapping
protocols (G. E. Morris, compilador), The Humana Press Inc.,
Totowa, USA (1996), 149-169; Harlow y Lane, en:
Antibo-dies: A laboratory manual. Cold Spring
Harbor, Nueva York, (1988); y Sambrook et al., Molecular Cloning: A
laboratory manual. Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), ISBN
0-87969-309-6.
Ejemplo
Paso
1
Se sintetizaron 120 péptidos de acuerdo con el
método SPOT (Frank, 1992). Partiendo de la secuencia
Ac-NYGKYE- del péptido epitópico para el anticuerpo
monoclonal anti-TTL 1D3, dichos 120 péptidos
representan un conjunto de sustitución completo. El anticuerpo
monoclonal anti-TTL 1D3 ha sido descrito por Erck
et al., Neurochem. Res. 25 (2000), 5-10.
Cada aminoácido de la secuencia se reemplazó por cualquier otro de
los 20 aminoácidos proteinógenos. La lista de 120 péptidos
sintetizados se da a continuación.
Se esterificó con
\beta-alanina una hoja de membrana celulósica
(Whatman 540). El método para esto se describe en Frank y Overwin,
en: Frank y Overwin, In: Methods in Molecular Biology, 66: Epitope
Mapping Protocols (G. E. Morris, compilador), The Humana Press
Inc., Totowa, USA (1996), 149-169. La carga
resultante después de la esterificación con
\beta-alanina era 1,05 \mumol/cm^{2}. La
síntesis gradual subsiguiente de péptidos para la síntesis de las
moléculas sonda siguió el método descrito por Frank y Overwin (véase
arriba). Para la síntesis, se utilizó el robot de síntesis
totalmente automático MultiPep, de Intavis Bioanalytische
Instruments AG de Colonia, Alemania, de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Después del acoplamiento del último aminoácido,
el grupo protector Fmoc N-terminal se eliminó con
una solución de piperidina al 20% en dimetilformamida (DMF). Los
grupos amino libres se tiñeron luego con azul de bromofenol. El
bloqueo de las funciones amino libres N-terminales
se llevó a cabo con una solución de anhídrido acético al 2% en DMF
hasta que hubo desaparecido la coloración azul. La membrana se lavó
luego durante un total de 3 x 10 min con 4 x DMF y 3 veces con
etanol durante 3 min cada vez. La membrana se secó luego al aire.
Las manchas individuales se punzonaron subsiguientemente y se
introdujeron en los pocillos (depresiones) de dos placas de
microtitulación de 96 pocillos profundos (2 ml por pocillo) hechas
de polipropileno. El diámetro de las manchas punzonadas
era 3,5 mm.
era 3,5 mm.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
2
Se aplicaron 300 \mul de una solución de TFA a
cada mancha individual (aproximadamente 0,1 cm^{2}, 50 nmol de
sonda). Las placas de microtitulación de pocillos profundos se
cerraron y se trataron con ultrasonidos durante 10 min. Se agitaron
luego las placas durante una hora. Después de un segundo periodo de
10 min de tratamiento con ultrasonidos, las placas de
microtitulación de pocillos profundos se agitaron durante una noche
a la temperatura ambiente hasta que todas las manchas se habían
dispersado por completo. Al mismo tiempo, se utilizó dicha solución
para eliminar los grupos protectores de las cadenas laterales
presentes todavía en las sondas peptídicas, con lo que únicamente
estaba presente todavía péptido no protegido sobre el material
soporte polímero dispersado. La solución de TFA contenía 85% en
volumen de ácido trifluoroacético, 7% en volumen de diclorometano,
3% en volumen de tri-isobutilsilano y 5% en volumen
de agua. El tiempo total de reacción durante la noche fue
aproximadamente 16 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
3
Se introdujo 1 ml de dietil-éter en cada pocillo
individual de la placa de microtitulación de 96 pocillos profundos
que contenía las manchas disueltas en solución de TFA con objeto de
precipitar el soporte polímero disuelto. Las placas de
microtitulación se agitaron luego durante 10 min y se dejaron
después en reposo en el frigorífico durante 15 min a 4ºC. Se llevó
a cabo luego centrifugación a 3000 rev/min durante 6 min. El
sobre-nadante, que contenía inter alia los
grupos protectores que se habían eliminado, se retiró cuidadosamente
con una pipeta. El soporte polímero que tenía las moléculas sonda
localizadas en el mismo quedó como residuo en los pocillos de las
placas de microtitulación. El residuo se lavó 3 veces con éter. Para
dicho propósito, se añadió primeramente 1 ml de éter al precipitado
en cada pocillo, se agitaron las placas de microtitulación durante
10 min y se centrifugaron luego a 3000 rev/min durante 10 min, y se
retiró la solución del sobrenadante por medio de una pipeta.
Después del último paso de lavado, las placas de microtitulación se
dejaron en reposo al aire para separar por evaporación los restos
del éter.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
4
A partir de la solución con TFA obtenida en el
Paso 2, se retiró una porción correspondiente a 5 nmol de sonda y
se trató por separado como se describe en los Pasos 2 y 3. El
residuo precipitado y seco se trató a 80ºC en un tubo de test
Eppendorf fuertemente cerrado que contenía 20 \mul de una solución
acuosa de amoníaco al 33% durante 4 horas. De este modo se escindió
el enlace éster de la sonda de celulosa a la amida, y la sonda se
desprendió del soporte de celulosa. Se mezclaron luego 0,5 \mul de
dicha solución con 0,5 \mul de ácido
\alpha-cinámico y se aplicaron a un soporte MALDI.
La sonda y los sub-productos de la síntesis se
identificaron por medida del peso molecular mediante espectrometría
de masas
Matrix-Assisted-Laser-Desorption
Ionisation (MALDI) y de este modo se determinó la identidad y
pureza del producto de síntesis.
\newpage
Paso
5
Se introdujeron 500 \mul de DMSO en cada
pocillo individual de la placa de microtitulación de polipropileno
con pocillos profundos que contenía los residuos secos del Paso 3 y
se trataron con ultrasonidos durante 10 min. La placa se agitó luego
durante una noche hasta que el soporte polímero precipitado que
tenía la molécula sonda localizada en él se hubo disuelto por
completo. Se separaron pequeños residuos del precipitado por
centrifugación durante 10 min a 3000 rev/min. Se retiraron porciones
de 3 \mul de las soluciones así obtenidas y se diluyeron cada una
en una placa de microtitulación estándar de 96 pocillos diluida con
57 \mul de DMSO, con lo que se obtuvo una dilución 1:20. Dichas
soluciones se utilizaron luego para el punteado.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
6
Las gotas, de 1-20 nl de tamaño,
de las diluciones 1:20 se aplicaron a una superficie plana
utilizando un microalimentador (MicroGrid II de BioRobotics; v.g.
Gilson Model 231; GeSiM Nano-Plotter). Portaobjetos
de vidrio superenfriados de Menzel, Braunschweig, Alemania, 76 x 26
mm de diámetro, con borde tallado (sic). Se punteó una rejilla de
25 x 5 puntos, correspondiente a 125 puntos. Dado que sólo estaban
presentes 120 péptidos, los últimos 5 puntos en la red se puntearon
con la secuencia original Ac-NYGKYE para propósitos
de control. Se puntearon 9 réplicas de la red de 25 x 5 sobre cada
portaobjetos de vidrio, utilizándose para el punteado un
instrumento de 64 agujas que tenía una aguja dividida
(aproximadamente 1 nl de transferencia) para el punteado. La
separación entre los puntos de uno a otro era 0,5 mm. Los
portaobjetos de vidrio punteados se secaron durante 2 horas a 50ºC y
se guardaron luego a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso
7
El test de fijación con el anticuerpo 1D3 se
llevó a cabo de acuerdo con el método descrito por Frank y Overwin,
1996 (véase arriba). La incubación con el anticuerpo 1D3 y un
segundo anticuerpo de detección se llevó a cabo por aplicación de
la solución de anticuerpos (60 \mul de solución que contenía 10
\mug/ml de anticuerpo 1D3) gota a gota sobre el portaobjetos de
vidrio y se cubrió luego con un vidrio de reloj. El anticuerpo de
detección utilizado era el anticuerpo anti-ratón de
cabra descrito por Frank y Overwin, 1996, pero que se había marcado
con el tinte fluorescente Cy5. La marcación se llevó a cabo de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences,
producto número PA25001). Con ello, fue posible evaluar el test de
microrred utilizando un detector de fluorescencia. La lectura de
las señales fluorescentes se llevó a cabo con un escáner ArrayWorx
de Applied Precision utilizando los intervalos de longitud de onda
para la longitud de onda de estimulación y emisión preajustada para
marcación con Cy5 por el fabricante.
Alternativamente, es posible también utilizar
como anticuerpo de detección el conjugado con fosfatasa alcalina
mencionado por Frank y Overwin, 1996, de tal modo que es posible la
detección por tinción con MTT y BCIP. La evaluación se lleva a cabo
luego de la manera usual utilizando un escáner convencional.
\vskip1.000000\baselineskip
- DMF
- Dimetilformamida
- NMP
- N-metilpirrolidona
- MDSO
- Dimetil-sulfóxido
- EtOH
- Etanol
- TFA
- Ácido trifluoroacético
- TIBS
- Tris-isobutilsilano
- DCM
- Diclorometano
- MTT
- Bromuro de metiltiazolildifeniltetrazolio
- BCIP
- Fosfato de bromo-cloro-indolilo
\vskip1.000000\baselineskip
La posición indicada se refiere a la posición de
los péptidos en la red sobre el soporte plano/portaobjetos de
vidrio, como puede verse en las Figuras 1A y 2A.
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<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
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<400> 5
\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\newpage
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<400> 8
\hskip1cm
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<210> 9
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 9
\hskip1cm
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Secuencia peptídica sintética
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<400> 10
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia peptídica sintética
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<400> 11
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia peptídica sintética
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<400> 12
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\newpage
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<223> Secuencia peptídica sintética
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<400> 13
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<223> Secuencia peptídica sintética
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<223> Secuencia peptídica sintética
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<400> 15
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<223> Secuencia peptídica sintética
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<400> 16
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia peptídica sintética
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<400> 17
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<223> Secuencia peptídica sintética
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<400> 18
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia peptídica sintética
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<400> 19
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<210> 20
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia peptídica sintética
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<210> 22
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 22
\hskip1cm
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<210> 23
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 23
\hskip1cm
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<210> 24
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 107
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\hskip1cm
Claims (15)
1. Método de producción de una microrred,
comprendiendo el método los pasos siguientes:
- (a)
- síntesis, en dos o más etapas, de moléculas sonda sobre un soporte polímero, formándose enlaces entre las moléculas sonda y el soporte polímero;
- (b)
- disolución del soporte polímero que tiene las moléculas sonda sintéticas de acuerdo con el paso (a), reteniéndose los enlaces entre el soporte polímero y las moléculas sonda;
- (c)
- aplicación de la solución que contiene el soporte polímero que tiene las molécula sonda unidas en la forma de microgotas a una superficie plana.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado por la purificación de las moléculas sonda
unidas al soporte polímero disuelto de acuerdo con el paso (b).
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, caracterizado por dilución de la
solución del soporte polímero que tiene las moléculas sonda
unidas.
4. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, siendo las uniones entre la molécula sonda y
el soporte polímero enlaces químicos, preferiblemente enlaces
covalentes.
5. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, yendo seguido el paso (a) por un paso
(a1):
(a1):
- (a1)
- pre-purificación de las moléculas sonda por lavado y opcionalmente eliminación de los grupos protectores.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el cual el soporte polímero se disuelve
en el paso (b) en una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA),
diclorometano, tri-isobutilsilano (TIBS) y
agua.
agua.
7. Método de acuerdo con la reivindicación 6, en
el que la mezcla contiene aproximadamente 60-100% en
volumen y en especial aproximadamente 80-90% en
volumen de ácido trifluoroacético, con preferencia aproximadamente
85% en volumen, aproximadamente 0-15% en volumen, y
en especial aproximadamente 5-15% en volumen de
diclorometano, con preferencia aproximadamente 7% en volumen,
aproximadamente 0-15% en volumen y en especial
aproximadamente 2-5% en volumen de
triisobutilsilano, con preferencia aproximadamente 3% en volumen, y
aproximadamente 0-5% en volumen, y en especial
aproximadamente 2-5% en volumen de agua, con
preferencia aproximadamente 5% en volumen.
8. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, siendo el tiempo de reacción para la
disolución del soporte polímero en el paso (b) aproximadamente
0,1-24 horas, en especial aproximadamente
2-24 horas, y con preferencia aproximadamente 16
horas.
9. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 8, en el que los compuestos se purifican por
lavado 3-5 veces, preferiblemente 3 veces, en
dietil-éter, acetona o terc-butilmetiléter.
10. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el material soporte polímero que
tiene las moléculas sonda unidas se disuelve en agua, DMF, NMP o
DMSO, preferiblemente DMSO.
11. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que las moléculas sonda son péptidos
de cadena corta, polipéptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos,
moléculas de DNA o moléculas de RNA, o especialmente moléculas
orgánicas pequeñas.
12. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que la superficie plana en el Paso
(c) es la superficie de un microchip.
13. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que la superficie plana está
constituida por metal, vidrio, material plástico o material
cerámico.
14. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que el soporte polímero es proteína,
poliacrilato reticulado con disulfuro o papel, especialmente papel
celulósico.
15. Microrred para una biopsia humana,
caracterizada por
- -
- un material de metal, vidrio, materia plástica o cerámica que tiene una superficie plana,
- -
- con un precipitado en la forma de microgotas secas que se adhieren al mismo,
- -
- en donde el precipitado es un soporte polímero que tiene moléculas sonda que están unidas covalentemente al mismo,
producida de acuerdo con el método de una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
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