ES2315391T3 - Acido nucleico y su correspondiente proteina llamada 121pza3 util en el tratamiento y la deteccion del cancer. - Google Patents

Abstract

Un método para diagnosticar cáncer en una muestra de ensayo de próstata o colon, que comprende: poner en contacto la muestra de ensayo con un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo que se una específicamente a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la mostrada en la Figura 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F ó 3G, y que no se una a un péptido o a una proteína que (a) no presenta una secuencia de aminoácidos idéntica a la mostrada en la Figura 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F ó 3G, o (b) no es un fragmento de una secuencia mostrada en la Figura 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F ó 3G; determinar el nivel de expresión de la proteína en la muestra de ensayo; y comparar el nivel determinado de ese modo con el nivel de expresión de la proteína en una muestra normal correspondiente; en donde un aumento del nivel de expresión de la proteína en la muestra de ensayo respecto a la muestra normal indica la presencia de cáncer.

Description

Ácido nucleico y su correspondiente proteína llamada 121P2A3 útil en el tratamiento y la detección del cáncer.

Campo de la invención

En la presente memoria se describe un gen y su proteína codificada, denominada 121P2A3, expresada en determinados cánceres. La invención se refiere a métodos útiles para la gestión de cánceres que expresan 121P2A3.

Antecedentes de la invención

El cáncer es la segunda causa de muerte en humanos muy cerca de las enfermedades coronarias. En todo el mundo, millones de personas mueren de cáncer cada año. Sólo en los Estados Unidos, según un informe de la Sociedad Americana del Cáncer, el cáncer causa la muerte de más de medio millón de personas al año, diagnosticándose más de 1,2 millones de nuevos casos cada año. Aunque las muertes por enfermedades coronarias han ido declinando significativamente, las producidas por cáncer de forma general se hayan en aumento. En la primera parte del próximo siglo, se prevé que el cáncer se convierta en la primera causa de muerte.

En todo el mundo existen varios cánceres que sobresalen como los principales "asesinos". En particular, los carcinomas de pulmón, de próstata, de pecho, de colon, de páncreas y de ovario representan las principales causas de muerte por cáncer. Estos y virtualmente todos los demás carcinomas comparten un característica letal común. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastática de un carcinoma es fatal. Además, incluso para aquellos pacientes de cáncer que sobreviven inicialmente a sus cánceres primarios, la experiencia común ha demostrado que sus vidas son alteradas drásticamente. Muchos pacientes de cáncer experimentan una fuerte ansiedad debida al conocimiento del potencial de recurrencia o de fallo del tratamiento. Muchos pacientes de cáncer experimentan debilidad física después del tratamiento. Adicionalmente, muchos pacientes de cáncer experimentan una recurrencia.

En todo el mundo, el cáncer de próstata es el cuarto tipo de cáncer más extendido en hombres. En Norte América y en el Norte de Europa es de lejos el cáncer más común en hombres y es la segunda causa de muerte por cáncer en hombres. Sólo en los Estados Unidos más de 30.000 hombres mueren anualmente por esta enfermedad, en segundo lugar únicamente por detrás del cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, todavía no existe un tratamiento eficaz para el cáncer metastático de próstata. La prostatectomía quirúrgica, la terapia con radiación, la terapia de ablación hormonal, la castración quirúrgica y la quimioterapia continúan siendo las principales modalidades de tratamiento. Desafortunadamente, dichos tratamientos son ineficaces para muchos y a menudo llevan asociadas consecuencias no deseadas.

En el campo de la diagnosis, la falta de un marcador de tumor de próstata que pueda detectar con precisión tumores localizados en sus estadios iniciales sigue siendo una importante limitación en la diagnosis y el tratamiento de esta enfermedad. Aunque el ensayo de suero de antígeno específico de próstata (PSA) ha sido una herramienta muy útil, su especificidad y utilidad general son ampliamente consideradas como limitadas en varios aspectos importantes.

El progreso en la identificación de marcadores específicos adicionales para el cáncer de próstata ha sido mejorado mediante la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata que pueden recapitular diferentes estadios de la enfermedad en ratones. Los xenoinjertos LAPC (Cáncer de Próstata de Los Ángeles, en sus siglas en inglés) son xenoinjertos de cáncer de próstata que han sobrevivido al traspaso a ratones deficientes inmunes combinados severos (SCID) y que han presentado la capacidad de imitar la transición entre dependencia de andrógenos a la independencia de andrógenos (Klein y col., 1997, Nat. Med. 3: 402). Marcadores de cáncer de próstata identificados más recientemente incluyen el PCTA-1 (Su y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252), el antígeno de membrana específico de próstata (PSM) (Pinto y col., Clin Cancer Res 1996 Sep 2 (9): 1445-51), el STEAP (Hubert y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999 Dic 7; 96(25): 14523-8) y el antígeno de célula madre de próstata (PSCA) (Reiter y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735).

Aunque los marcadores identificados previamente tales como PSA, PSM, PCTA y PSCA han facilitado esfuerzos para diagnosticar y tratar el cáncer de próstata, existe una necesidad para identificar marcadores y dianas terapéuticas adicionales para el cáncer de próstata y cánceres relacionados a fin de mejorar aún más la diagnosis y la terapia.

El carcinoma de célula renal (RCC) engloba aproximadamente el 3 por ciento de las malignidades en adultos. Una vez que los adenomas alcanzan un diámetros de 2 a 3 cm, existe un potencial maligno. En el adulto, los dos principales tumores renales malignos son el adenocarcinoma de célula renal y el carcinoma de célula transicional de la pelvis renal o del uréter. La incidencia del adenocarcinoma de célula renal se estima en más de 29.000 casos en los Estados Unidos, con una incidencia de aproximadamente 500 casos anuales en los Estados Unidos.

La cirugía ha sido la terapia primaria para el adenocarcinoma de célula renal durante muchas décadas. Hasta hace poco, la enfermedad metastática ha permanecido refractaria frente a cualquier terapia sistémica. Con los recientes desarrollos en terapias sistémicas, particularmente las inmunoterapias, el carcinoma de célula renal metastático puede ser abordado agresivamente en pacientes apropiados con una posibilidad de respuestas perdurables. Sin embargo, sigue existiendo una necesidad de terapias eficaces para estos pacientes.

De todos los nuevos casos de cáncer en los Estados Unidos, el cáncer de vejiga representa aproximadamente el 5 por ciento en hombres (quinto neoplasma más común) y el 3 por ciento en mujeres (octavo neoplasma más común). La incidencia está aumentando ligeramente, junto con el aumento de la población mayor. En 1998 había unos 54.500 casos estimados, que incluían 39.500 en hombres y 15.000 en mujeres. La incidencia ajustada por edades en los Estados Unidos es del 32 por 100.000 en hombres y del 8 por 100.000 en mujeres. La relación histórica hombre/mujer de 3:1 puede estar disminuyendo debido a los hábitos fumadores de la mujer. Se estimaron unas 11.000 muertes debidas a cáncer de vejiga en 1998 (7.800 en hombres y 3.900 en mujeres). La incidencia y la mortalidad del cáncer de vejiga aumen-
tan considerablemente con la edad y constituirán un problema creciente según la población vaya envejeciendo.

La mayoría de los cánceres de vejiga vuelven a presentarse en la vejiga. El cáncer de vejiga se trata con una combinación de resección transuretral de la vejiga (TUR) y de quimioterapia o inmunoterapia intravesical. La naturaleza multifocal y recurrente del cáncer de vejiga indica las limitaciones de la TUR. La mayoría de los cánceres invasivos de músculo no se curan únicamente con TUR. La cistectomía radical y el desvío urinario es el medio más eficaz para eliminar el cáncer pero conlleva un impacto innegable en la función urinaria y sexual. Sigue existiendo una necesidad significativa de modalidades de tratamiento que sean beneficiosas para los pacientes de cáncer de vejiga.

Se estima que se produjeron 130.200 casos de cáncer colorectal en 2000 en los Estados Unidos, que incluyen 93.800 casos de cáncer de colon y 36.400 de cáncer rectal. Los cánceres colorectales son la tercera causa más común de cánceres en hombres y mujeres. Las tasas de incidencia disminuyeron significativamente durante el periodo 1992-1996 (-2,1% al año). Las investigaciones sugieren que estas disminuciones han sido debidas a un aumento de las exploraciones y de las extracciones de pólipos, que evitan la progresión de pólipos a cánceres invasivos. Se estima que se produjeron unas 56.300 muertes en 2000 (47.700 de cáncer de colon, 8.600 de cáncer rectal), contabilizando aproximadamente el 11% de todas las muertes por cáncer en EE.UU.

Actualmente, la cirugía es la forma más común de terapia para el cáncer colorectal, y para los cánceres que no se han extendido con frecuencia es curativa. La quimioterapia, o quimioterapia más radiación, se administra antes o después de la cirugía a la mayoría de los pacientes cuyo cáncer haya perforado profundamente la pared intestinal o que se haya extendido hasta los nodos linfáticos. Ocasionalmente es necesaria una colostomía permanente (creación de una abertura abdominal para la eliminación de los residuos corporales) para el cáncer de colon, aunque para el cáncer rectal es infrecuente. Sigue existiendo una necesidad de un diagnóstico eficaz y de modalidades de tratamiento para el cáncer colorectal.

Se estima que se produjeron unos 164.100 nuevos casos de cáncer de pulmón y bronquial en 2000, contabilizando el 14% de todos los diagnósticos de cáncer en EE.UU. La tasa de incidencia del cáncer bronquial y de pulmón va disminuyendo significativamente en hombres, desde un valor máximo de 86,5 por cada 100.000 en 1984 hasta 70,0 en 1996. En los años 1990s, la tasa de aumento entre las mujeres comenzó a ralentizarse. En 1996, la tasa de incidencia en mujeres fue de 42,3 por cada 100.000.

Se estima que el cáncer bronquial y de pulmón provocó unas 156.900 muertes en 2000, contabilizando el 28% de todas las muertes por cáncer. Durante el periodo 1992-1996, la mortalidad en cáncer de pulmón disminuyó significativamente entre los hombres (-1,7% al año) mientras que las tasas en mujeres siguieron aumentando significativamente (0,9% al año). Desde 1987, han muerto más mujeres cada año de cáncer de pulmón que de cáncer de pecho, el cual había sido durante más de 40 años la principal causa de muerte por cáncer en mujeres. Las disminuciones en la incidencia de cáncer de pulmón y de mortalidad probablemente se debieron a menores tasas de fumadores en comparación con los 30 años anteriores; sin embargo, la disminución de hábitos de fumador entre mujeres está por detrás de la de los hombres. Aunque el descenso en el uso de tabaco por adultos se ha frenado, es preocupante que el uso del tabaco entre la población joven esté aumentando de nuevo.

Las opciones de tratamiento para el cáncer bronquial y de pulmón están determinadas por el tipo y el estadio del cáncer, e incluyen cirugía, terapia de radiación y quimioterapia. Para muchos cánceres localizados, la cirugía es habitualmente el tratamiento elegido. Debido a que la enfermedad normalmente ya se ha extendido cuando es descubierta, la terapia de radiación y la quimioterapia son a menudo necesarias en combinación con la cirugía. La quimioterapia por sí sola, o combinada con radiación, es el tratamiento elegido para el cáncer de pulmón de célula pequeña; con este tratamiento un elevado porcentaje de pacientes experimentan una remisión, que en algunos casos es duradera. Sin embargo, sigue existiendo una necesidad de tratamiento y de estrategias de diagnósticos eficaces para los cánceres bronquial y de pulmón.

Se estimó que se producirían unos 182.800 nuevos casos invasivos de cáncer de pecho entre mujeres en los Estados Unidos durante el año 2000. Adicionalmente, se esperaba que se diagnosticaran aproximadamente 1.400 nuevos casos de cáncer de pecho en hombres en 2000. Después de aumentar aproximadamente un 4% anual durante los 1980s, las tasas de incidencia del cáncer de pecho en mujeres se han nivelado en los 1990s hasta aproximadamente 110,6 casos por cada 100.000.

Sólo en los EE.UU., se estimaron unas 41.200 muertes (40.800 mujeres, 400 hombres) en 2000 debido a cáncer de pecho. El cáncer de pecho es la segunda causa de muerte por cáncer en las mujeres. Según los datos más recientes, las tasas de mortalidad disminuyeron significativamente durante el periodo 1992-1996 dándose las mayores disminuciones en las mujeres más jóvenes, tanto blancas como negras. Estas disminuciones probablemente fueron resultado de una detección más temprana y de un tratamiento mejorado.

Teniendo en cuenta las circunstancias médicas y las preferencias del paciente, el tratamiento del cáncer de pecho puede implicar una lumpectomía (eliminación local del tumor) y la extracción de los nodos linfáticos de la axila; una mastectomía (eliminación quirúrgica del pecho) y eliminación de los nodos linfáticos de la axila; terapia de radiación; quimioterapia; o terapia con hormonas. A menudo, se usan dos o más métodos combinados. Numerosos estudios han demostrado que, en el primer estadio de la enfermedad, las tasas de supervivencia a largo plazo tras lumpectomía más radioterapia son similares a las tasas de supervivencia después de una mastectomía radical modificada. Los avances significativos en las técnicas de reconstrucción proporcionan varias opciones para la reconstrucción del pecho después de una mastectomía. Recientemente, dicha reconstrucción se ha realizado simultáneamente a la mastectomía.

La escisión local de carcinoma ductal in situ (DCIS) con cantidades adecuadas de tejido de mama normal alrededor puede evitar la recurrencia local del DCIS. La radiación a la mama y/o tamoxifeno puede reducir la probabilidad de que se produzca DCIS en el resto del tejido de mama. Esto es importante porque el DCIS, si no es tratado, puede desarrollarse en un cáncer de pecho invasivo. En cualquier caso, existen varios efectos secundarios o secuelas a estos tratamientos. Existe, por ejemplo, una necesidad de tratamientos eficaces contra el cáncer de pecho.

Se estima que se produjeron unos 23.100 nuevos casos de cáncer de ovario en los Estados Unidos en 2000. Contabilizó el 4% de todos los cánceres entre mujeres y es el segundo entre los cánceres ginecológicos. Durante el periodo 1992-1996, las tasas de incidencia de cáncer de ovario fueron disminuyendo significativamente. Como consecuencia del cáncer de ovario se estimaron unas 14.000 muertes en 2000. El cáncer de ovario causa más muertes que cualquier otro cáncer del sistema reproductivo femenino.

La cirugía, la terapia con radiaciones y la quimioterapia son las opciones de tratamiento para el cáncer de ovario. La cirugía normalmente incluye la eliminación de uno o ambos ovarios, de las trompas de Falopio (salpingo-ooforrectomía), y del útero (histerectomía). En algunos tumores muy iniciales, sólo se extrae el ovario implicado, especialmente en mujeres jóvenes que desean tener niños. En la enfermedad avanzada, se realiza un intento de eliminar toda la enfermedad intra-abdominal para potenciar el efecto de la quimioterapia. Sigue existiendo una necesidad importante de opciones de tratamiento eficaces contra el cáncer de ovario.

Se estima que se produjeron 28.300 nuevos casos de cáncer pancreático en los Estados Unidos en 2000. En los últimos 20 años, las tasas de cáncer pancreático han disminuido entre los hombres. Las tasas entre mujeres han permanecido aproximadamente constantes pero pueden estar comenzando a declinar. Se estima que el cáncer pancreático causó unas 28.200 muertes en 2000 en los Estados Unidos. En los últimos 20 años, se ha producido un pequeño pero significativo descenso en las tasas de mortalidad en hombres (aproximadamente -0,9% al año) mientras que las tasas han aumentado ligeramente en mujeres.

La cirugía, la terapia con radiación y la quimioterapia son las opciones de tratamiento para el cáncer pancreático. Estas opciones de tratamiento pueden extender la supervivencia y/o aliviar los síntomas en muchos pacientes, pero probablemente no producirán una cura en la mayoría. Existe una necesidad significativa de opciones terapéuticas y diagnósticas adicionales para el cáncer pancreático.

Resumen de la invención

Ahora se ha descubierto que un gen, designado 121P2A3, está sobre-expresado en el(los) cáncer(es) enumerados en la Tabla I. El análisis de expresión mediante transferencia Northern de la expresión del gen 121P2A3 en tejidos normales muestra un modelo de expresión restringido en tejidos adultos. Se proporcionan las secuencias de nucleótidos (Figura 2) y de aminoácidos (Figura 2 y Figura 3) del 121P2A3. El perfil relativo a tejido del 121P2A3 en tejidos adultos normales, combinado con la sobre-expresión observada en los tejidos enumerados en la Tabla I, muestra que el 121P2A3 está sobre-expresado de forma aberrante en al menos algunos cánceres, y por tanto sirve como diana diagnóstica, profiláctica, pronóstica y/o terapéutica útil para cánceres de tejido(s) tales como los enumerados en la Tabla I.

En la presente memoria se describen anticuerpos que se unen a proteínas 121P2A3 y a fragmentos de polipéptido de las mismas, que incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos murinos y de otros mamíferos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y completamente humanos, y anticuerpos marcados con un marcador detectable.

- La invención proporciona un método para diagnosticar cáncer en una muestra de ensayo de próstata o de colon, que comprende:

- Poner en contacto la muestra de ensayo con un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la mostrada en la Figura 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F ó 3G y que no se une a un péptido o a una proteína que no tenga (a) una secuencia de aminoácidos idéntica a la mostrada en la Figura 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F ó 3G, ni (b) la secuencia de un fragmento de una secuencia mostrada en la Figura 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F ó 3G;

- Determinar el nivel de expresión de la proteína en la muestra de ensayo; y

- Comparar el nivel así determinado con el nivel de expresión de la proteína en una muestra normal correspondiente;

- En donde un nivel incrementado de expresión de la proteína en la muestra de ensayo respecto a la muestra normal indica la presencia de cáncer.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. La secuencia 121P2A3 SSH de 259 nucleótidos.

Figura 2A. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 121P2A3 v.1 clon 5. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 175-1569 incluyendo el codón de parada.

Figura 2B. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 121P2A3 v.2. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 533-1420 incluyendo el codón de parada.

Figura 2C. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 121P2A3 v.3. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 175-1569 incluyendo el codón de parada.

Figura 2D. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 121P2A3 v.4. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 175-1569 incluyendo el codón de parada.

Figura 2E. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 121P2A3 v.5. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 175-1569 incluyendo el codón de parada.

Figura 2F. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 121P2A3 v.6. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 175-1569 incluyendo el codón de parada.

Figura 2G. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 121P2A3 v.7. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 175-1569 incluyendo el codón de parada.

Figura 2H. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 121P2A3 v.8. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 175-1569 incluyendo el codón de parada.

Figura 2I. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de 121P2A3 v.9. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 175-1569 incluyendo el codón de parada.

Tal como se usa en el presente documento, una referencia a 121P2A3 incluye todas las variantes del mismo, que incluyen todas las mostradas en la Figura 10 y en la Figura 12, a menos que se especifique una variante.

Figura 3A. Secuencia de aminoácidos de 121P2A3 v.1 clon 5. La proteína 121P2A3 v.1 clon 5 tiene 464 aminoácidos.

Figura 3B. Secuencia de aminoácidos de 121P2A3 v.2. La proteína 121P2A3 v.2 tiene 295 aminoácidos.

Figura 3C. Secuencia de aminoácidos de 121P2A3 v.3. La proteína 121P2A3 v.3 tiene 464 aminoácidos.

Figura 3D. Secuencia de aminoácidos de 121P2A3 v.4. La proteína 121P2A3 v.4 tiene 464 aminoácidos.

Figura 3E. Secuencia de aminoácidos de 121P2A3 v.6. La proteína 121P2A3 v.6 tiene 464 aminoácidos.

Figura 3F. Secuencia de aminoácidos de 121P2A3 v.7. La proteína 121P2A3 v.7 tiene 464 aminoácidos.

Figura 3G. Secuencia de aminoácidos de 121P2A3 v.8. La proteína 121P2A3 v.8 tiene 464 aminoácidos.

Tal como se usa en la presente memoria, una referencia a 121P2A3 incluye todas las variantes del mismo, incluyendo las mostradas en la Figura 11, a menos que se especifique una variante.

Figura 4A. Alineamiento de aminoácidos de variantes de 121P2A3.

Figura 4B. Alineamiento de secuencia de Ácido Nucleico de 121P2A3 v.1 con la proteína hipotética FLJ10540.

Figura 4C. Alineamiento de secuencia de Ácido Nucleico de 121P2A3 v.1 con ADNc similar al gen RIKEN 1200008O12.

Figura 4D. Alineamiento de secuencia de aminoácidos de 121P2A3 v.1 con la proteína humana hipotética
FLJ10540.

Figura 4E. Alineamiento de secuencia de aminoácidos de 121P2A3 v.1 con la proteína XM_005908 similar al ADNc de RIKEN 1200008O12.

Figura 4F. Alineamiento de secuencia de aminoácidos de 121P2A3 v.1 con el clon de proteína putativa de ratón NT2RP2001245.

Figura 4G. Alineamiento de secuencia de aminoácidos de 121P2A3 v.1 con factor 1 humano asociado a nef.

Figura 4H. Alineamiento de secuencia de aminoácidos de 121P2A3 v.1 con proteína FLJ10540 de ratón.

Figura 4I. Alineamiento de secuencia de aminoácidos de 121P2A3 v.1 con citrón quinasa que interactúa con Rho/rac de ratón.

Figura 5. Perfil de aminoácidos de hidrofilicidad de 121P2A3 variante 1, determinado mediante algoritmo de análisis de secuencia por ordenador usando el método de Hopp y Woods (Hopp T.P., Woods K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828) accesible en la página web de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 6. Perfil de aminoácidos de hidropaticidad de 121P2A3 variante 1, determinado mediante algoritmo de análisis de secuencia por ordenador usando el método de Kyte y Doolittle (Kyte J., Doolittle R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132) accesible en la página web de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 7. Perfil de porcentaje de residuos de aminoácido accesibles de 121P2A3 variante 1, determinado mediante algoritmo de análisis de secuencia por ordenador usando el método de Janin (Janin J., 1979 Nature 277: 491-492) accesible en la página web de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 8. Perfil de flexibilidad media de aminoácidos de 121P2A3 variante 1, determinado mediante algoritmo de análisis de secuencia por ordenador usando el método de Bhaskaran y Ponnuswamy (Bhaskaran R. y Ponnuswamy P.K., 1988 Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255) accesible en la página web de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 9. Perfil de aminoácidos de giro beta de 121P2A3 variante 1, determinado mediante algoritmo de análisis de secuencia por ordenador usando el método de Deleage y Roux (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1: 289-294) accesible en la página web de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 10. Alineamiento esquemático de variantes SNP de 121P2A3. Las variantes de 121P2A3 v.3 a v.9 son variantes con diferencias de nucleótidos sencillas. Aunque estas variantes SNP se muestran por separado, también podrían existir en cualquier combinación y una cualquiera de las variantes de tránscritos que contienen los pares base. Los números corresponden a los de 121P2A3 v.1. Los recuadros en negro muestran secuencia igual al 121P2A3 v.1. Las SNPs se indican encima del recuadro.

Figura 11. Alineamiento esquemático de variantes de proteína de 121P2A3. Las variantes de proteína corresponden a variantes de nucleótidos. Las variantes de nucleótido 121P2A3 v.5 y v.9 de la Figura 10 codifican para la misma proteína que la 121P2A3 v.1. Los recuadros negros representan la misma secuencia que la 121P2A3 v.1. Las diferencias sencillas de aminoácidos se indican encima de los recuadros. Los números en "( )" debajo del recuadro corresponden a 121P2A3 v.1.

Figura 12. Composiciones de exones de las variantes de tránscritos de 121P2A3. La variante 121P2A3 v.2 es una variante de escisión cuyo exón 2 es 149 pb más corto que en el exón 2 de la 121P2A3 v.1. El recuadro vacío (blanco) muestra la porción de exón 2 en la 121P2A3 v.1 pero no en la 121P2A3 v.2. Los recuadros negros muestran la misma secuencia que en la 121P2A3 v.1. Los números se corresponden a los de la 121P2A3 v.1. La longitud de los intrones no es proporcional.

Figura 13. Predicción de estructura secundaria correspondiente a la proteína 121P2A3. La estructura secundaria de la proteína 121P2A3 se predijo usando el método HNN de Red Neural Jerárquica (en inglés "Hierarchical Neural Network") (Guermeur, 1997, URL pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html), accesible en el servidor de biología molecular ExPasy (URL www.expasy.ch/tools/). Este método predice la presencia y la localización de hélices alfa, de cadenas extendidas y de bobinas aleatorias a partir de la secuencia de proteína primaria. También se presenta el porcentaje de la proteína en una determinada estructura secundaria.

Figura 14. Expresión de 121P2A3 mediante RT-PCR. La primera cadena de ADNc se preparó a partir del conjunto vital 1 (hígado, pulmón y riñón), del conjunto vital 2 (páncreas, colon y estómago), del conjunto de xenoinjerto LAPC (LAPC-4AD, LAPC-4AI, LAPC-9AD y LAPC-9AI), de conjunto de cáncer de próstata, de conjunto de cáncer de vejiga, de conjunto de cáncer de riñón, de conjunto de cáncer de colon, de conjunto de cáncer de pulmón, de conjunto de cáncer de ovario, de conjunto de cáncer de pecho y de conjunto de metástasis de cáncer. La normalización se realizó mediante PCR usando cebadores para actina y GAPDH. La PCR semi-cuantitativa, usando cebadores para 121P2A3, se realizó a 26 y 30 ciclos de amplificación. Los resultados muestran una fuerte expresión de 121P2A3 en conjunto de xenoinjerto LAPC, en conjunto de cáncer de vejiga, en conjunto de cáncer de riñón, en conjunto de cáncer de colon, en conjunto de cáncer de pulmón, en conjunto de cáncer de ovario, en conjunto de cáncer de pecho y en conjunto de metástasis de cáncer. También se detectó expresión de 121P2A3 en conjunto de cáncer de próstata. En los conjuntos vitales 1 y 2 se detectó una expresión muy baja.

Figura 15. Expresión de 121P2A3 en tejidos normales. Se probaron dos análisis de transferencia de tejido múltiple (A y B; Clontech), ambos con 2 \mug de ARNm/banda, y un análisis de xenoinjerto LAPC con 10 \mug de ARN total/banda (C) con la secuencia SSH de 121P2A3. Los patrones de tamaño en kilobases (kb) están indicados al lado. Los resultados muestran la expresión de un transcrito de 121P2A3 de aproximadamente 2,7 kb en testículos. También se detectó un menor nivel de expresión en timo y en colon, pero no en otros tejidos normales evaluados. La expresión de 121P2A3 se demostró fuertemente en los 4 tejidos de xenoinjerto LAPC de próstata, pero no en próstata normal.

Figura 16. Expresión de 121P2A3 en líneas celulares de cáncer humano. Se extrajo ARN de una serie de líneas celulares de cáncer humano. Se probaron los análisis de transferencia Northern con 10 \mug de ARN total/banda con el fragmento SSH de 121P2A3. Los patrones de tamaño se indican al lado en kilobases (kb). Los resultados muestran expresión de 121P2A3 en todas las líneas celulares evaluadas.

Figura 17. Expresión de 121P2A3 en tejidos de pacientes con cáncer de vejiga. Se extrajo ARN de vejiga normal (Nb), de líneas celulares de cáncer de vejiga (CL: UM-UC-3, J82, SCaBER), de tumores de pacientes con cáncer de vejiga (T) y de tejido adyacente normal (N). Se probaron análisis de transferencia Northern con 10 \mug de ARN total con la secuencia SSH de 121P2A3. Los patrones de tamaño se indican al lado en kilobases. Los resultados muestran expresión de 121P2A3 en tejidos de pacientes de cáncer de vejiga, y en todas las líneas celulares de cáncer de vejiga evaluadas, pero no en la vejiga normal.

Figura 18. Expresión de 121P2A3 en tejidos de pacientes con cáncer de riñón. Se extrajo ARN de líneas celulares de cáncer de riñón (CL: 769-P, A498, SW839), de riñón normal (NK), de tumores de pacientes con cáncer de riñón (T) y de sus tejidos adyacentes normales (N). Se probaron análisis de transferencia Northern con 10 \mug de ARN total con la secuencia SSH de 121P2A3. Los patrones de tamaño se indican al lado en kilobases. Los resultados muestran expresión de 121P2A3 en tejidos de pacientes de cáncer de riñón, y en todas las líneas celulares de cáncer de riñón evaluadas, pero no en el riñón normal.

Figura 19. Expresión de 121P2A3 en especímenes de cáncer humano de estómago y recto. Se ensayó la expresión de 121P2A3 en un panel de cánceres humanos de estómago y de recto (T) y en sus respectivos tejidos normales (N) sobre análisis de transferencia de ARN, y en líneas celulares de cánceres humanos. Se observó expresión de 121P2A3 en cánceres de estómago y de recto. La expresión detectada en tejidos adyacentes normales (aislados de tejidos enfermos) pero no en tejidos normales (aislados de donantes sanos) puede indicar que estos tejidos no son completamente normales y que el 121P2A3 puede expresarse en tumores en etapa inicial. También se descubrió que el 121P2A3 está altamente expresado en las siguientes líneas celulares de cáncer; HeLa, Daudi, K562, HL-60, G361, A549, MOLT-4, SW480 y Raji.

Figura 20. Regulación de andrógenos de 121P2A3. Se inyectaron células tumorales LAPC-9AD en ratones macho. Cuando el tumor alcanzó un tamaño palpable (0,3-0,5 cm de diámetro), los ratones fueron castrados y los tumores fueron recolectados a diferentes tiempos después de la castración. Se aisló ARN a partir de los tejidos de xenoinjerto. Se probaron los análisis de transferencia Northern con 10 \mug de ARN total/banda con el fragmento SSH de 121P2A3. Los patrones de tamaño se indican al lado en kilobases (kb). Los resultados muestran que la expresión de 121P2A3 se regula a la baja a los 7 días de la castración. Las muestras experimentales fueron confirmadas ensayando la expresión del gen de cáncer de próstata regulado por andrógeno TMPRSS2 y el gen independiente de andrógeno PHOR-1 (B). Este experimento muestra que, como era de esperar, el nivel de expresión del TMPRSS2 decayó a los 7 días de la castración, mientras que la expresión del PHOR-1 no cambió. También se presenta una imagen de la tinción con bromuro de etidio del gel de ARN que confirma la cualidad del ARN.

Figura 21. Expresión de 121P2A3 en células 293T después de la transfección. Las células 293T fueron transfectadas con pcDNA3.1/mycHIS de 121P2A3. Cuarenta horas después se recolectaron los lisatos (L) celulares y el sobrenadante (S). Las muestras se evaluaron en SDS-PAGE de gel de acrilamida, se tiñeron con su anticuerpo. La tinción se desarrolló usando el kit BCL de quimioluminiscencia y se visualizó mediante autorradiografía. Los resultados muestran expresión del peso molecular esperado de 54 kDa de 121P2A3 de la construcción de expresión de mamífero pcDNA3.1/mycHIS en los lisatos de células transfectadas de pcDNA3.1/mycHIS, pero no en el sobrenadante.

Descripción detallada de la invención Índice de Secciones

I.) Definiciones.

II.) Proteínas relacionadas con 121P2A3.

III.) Anticuerpos de 121P2A3.

IV.) Métodos para la Detección de 121P2A3.

V.) Métodos para Monitorizar el Estado de Proteínas de 121P2A3.

VI.) Realizaciones Diagnósticas y Pronósticas de 121P2A3.

VII.) Kits.

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I.) Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos de la técnica, anotaciones y otros términos científicos o terminología usados en la presente memoria se usan con los significados comúnmente entendidos por los especialistas en la técnica a la que pertenece esta proteína. En algunos casos, algunos términos con significados comúnmente entendidos también se definen en la presente memoria para mayor claridad y/o facilidad de referencia, y la inclusión de dichas definiciones en este documento no debería necesariamente considerarse como una diferencia sustancial sobre lo que se entiende generalmente en la técnica. Muchas de las técnicas y procedimientos descritos o referidos aquí son bien conocidos y los especialistas en la técnica los emplean comúnmente usando una metodología convencional, tal como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Cuando sea apropiado, los procedimientos que impliquen el uso de kits y reactivos disponibles comercialmente se llevan a cabo generalmente según los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante, a menos que se indique lo contrario.

Las expresiones "cáncer de próstata avanzado", "cáncer de próstata avanzado localmente", "enfermedad avanzada" y "enfermedad avanzada localmente" significan cánceres de próstata que se han extendido a través de la cápsula prostática, y pretenden incluir la enfermedad en estadio C según el sistema de la American Urological Association (AUA), enfermedad en estadio C1-C2 según el sistema de Whitmore-Jewett, y enfermedad en estadio T3-T4 y N+ según el sistema TNM (tumor, nodo, metástasis). En general, no se recomienda la cirugía para pacientes con enfermedad avanzada localmente, y dichos pacientes presentan resultados sustancialmente menos favorables en comparación con pacientes que tienen cáncer de próstata localizado clínicamente (confinado en el órgano). La enfermedad avanzada localmente se identifica clínicamente mediante evidencias palpables de induración más allá del borde lateral de la próstata, o mediante asimetría o induración por encima de la base de la próstata. El cáncer de próstata localmente avanzado se diagnostica en la actualidad patológicamente después de una prostatectomía si el tumor invade o penetra en la cápsula prostática, se extiende en el margen quirúrgico o invade las vesículas seminales.

El término "análogo" se refiere a una molécula que es estructuralmente similar a otra o que comparte atributos similares o correspondientes con otra molécula (por ejemplo, una proteína relacionada con 121P2A3). Por ejemplo, un análogo de una proteína de 121P2A3 puede unirse específicamente a un anticuerpo o célula T que se una específicamente a 121P2A3.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio. Por tanto, un "anticuerpo" puede existir de forma natural o puede ser artificial tal como los anticuerpos monoclonales producidos mediante tecnología de hibridoma convencional. Los anticuerpos anti-121P2A3 comprenden anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos que contienen el dominio de unión de antígeno y/o una o más regiones determinantes de la complementariedad de dichos anticuerpos.

Un "fragmento de anticuerpo" se define como al menos una porción de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a su objetivo, es decir, la región de unión de antígeno. En una realización cubre específicamente anticuerpos anti-121P2A3 sencillos y clones de los mismos (que incluyen anticuerpos agonistas, antiagonistas y neutralizantes) y composiciones de anticuerpos anti-121P2A3 con especificidad poliepitópica.

El término "homólogo" se refiere a una molécula que exhibe homología con respecto a otra molécula, a través de, por ejemplo, la presencia de secuencias de residuos químicos que son iguales o similares en las posiciones correspondientes.

El término "mamífero" se refiere a cualquier organismo clasificado como mamífero, incluyendo ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y humanos. En una realización de la invención, el mamífero es un ratón. En otra realización de la invención, el mamífero es un humano.

Las expresiones "cáncer de próstata metastático" y "enfermedad metastático" significan cánceres de próstata que se han extendido a nodos linfáticos regionales o a sitios distantes, y pretenden incluir la enfermedad en estadio D según el sistema AUA y en estadio TxNxM+ según el sistema TNM. Como ocurre con el cáncer de próstata avanzado localmente, la cirugía generalmente no está indicada para pacientes con enfermedad metastático, y una modalidad de tratamiento preferida es la terapia hormonal (ablación de andrógenos). Los pacientes con cáncer de próstata metastático finalmente desarrollan un estado refractario a andrógenos a los 12-18 meses del inicio del tratamiento. Aproximadamente la mitad de estos pacientes refractarios a andrógenos mueren a los 6 meses de desarrollar el estado. El sitio más común para la metástasis de cáncer de próstata es el hueso. Las metástasis óseas de cáncer de próstata a menudo son osteoblásticas más que osteolíticas (es decir, dan como resultado la formación neta de hueso). Las metástasis óseas se dan más frecuentemente en la espina, seguida de fémur, pelvis, caja torácica, cráneo y húmero. Otros sitios comunes para la metástasis incluyen los nodos linfáticos, los pulmones, el hígado y el cerebro. El cáncer de próstata metastático se diagnostica típicamente mediante linfadenectomía pélvica abierta o laparoscópica, mediante escaneo de radionucleicos en el cuerpo, radiografía esqueletal y/o biopsia de lesión ósea.

La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos que forman la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que se den en pequeñas cantidades.

Una "estructura", como en estructura biológica de una proteína relacionada con 121P2A3, se refiere a cualquier modelo de aminoácidos que forman parte de la secuencia primaria de una proteína, que está asociada a una función particular (por ejemplo, interacción proteína-proteína, interacción proteína-ADN, etc.) o una modificación particular (por ejemplo, que esté fosforilada, glicosilada o amidada), o localización particular (por ejemplo, secuencia secretora, secuencia de localización nuclear, etc.) o una secuencia que esté correlacionada con ser inmunogénica, tanto humoral como celularmente. Una estructura puede ser contigua o capaz de ser alineada con determinadas posiciones que generalmente se correlacionan con una determinada función o propiedad.

Un "excipiente farmacéutico" comprende un material tal como un adyuvante, un vehículo, agentes de ajuste de pH y tamponantes, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, conservantes, y similares.

El término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares base de longitud, tanto ribonucleótidos como desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y pretende incluir formas de cadena sencilla y doble de ADN y/o ARN. En la técnica, este término se usa a menudo de forma intercambiable con el término "oligonucleótido". Un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos descrita en la presente memoria en la que timidina (T), tal como se muestra en el ejemplo de la Figura 2, también puede ser uracilo (U); esta definición pertenece a las diferencias entre las estructuras químicas del ADN y el ARN, en particular la observación de que una de las cuatro bases principales del ARN es uracilo (U) en lugar de timidina (T).

El término "polipéptido" significa un polímero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos. En esta especificación se usan las designaciones estándar de tres letras o de letra única para los aminoácidos. En la técnica, este término se usa a menudo de forma intercambiable con el término "péptido" o "proteína".

El término "variante" se refiere a una molécula que presenta una variación respecto a un tipo descrito, tal como una proteína que tiene uno o más residuos de aminoácido diferentes en la(s) posición(es) correspondiente(s) de una proteína descrita específicamente (por ejemplo, la proteína 121P2A3 mostrada en la Figura 2 o en la Figura 3). Un análogo es un ejemplo de proteína variante. Las isoformas de empalme y los polimorfismos de nucleótidos sencillos (SNPs) son otros ejemplos de variantes.

Las "proteínas 121P2A3" son aquellas identificadas específicamente en la Figura 3. Se pueden aislar/generar variantes alélicas, variantes de sustitución conservativa, análogos y homólogos, y se pueden caracterizar sin una excesiva experimentación siguiendo los métodos esbozados en la presente memoria o fácilmente disponibles en la técnica.

II.) Proteínas 121P2A3

Las proteínas 121P2A3 son polipéptidos que tienen toda la secuencia de aminoácidos de la 121P2A3 humana, tal como se muestra en la Figura 2 o en la Figura 3.

II.A.) Expresión de Proteínas 121P2A3

En una realización descrita en los ejemplos que se presentan a continuación, se puede expresar 121P2A3 convenientemente en células (tales como células 293T) transfectadas con un vector de expresión disponible comercialmente tal como un vector de expresión dirigido por CMV que codifica 121P2A3 con un 6XHis C-terminal y etiqueta MYC (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen ó Tag5, GenHunter Corporation, Nashville, TN). El vector Tag5 proporciona una señal de secreción IgGK que puede usarse para facilitar la producción de una proteína 121P2A3 secretada en células transfectadas. La 121P2A3 marcada con HIS secretada en el medio de cultivo puede ser purificada, por ejemplo, usando una columna de níquel empleando técnicas estándar.

II.B.) Usos de Proteínas 121P2A3

Los fragmentos/subsecuencias de proteína 121P2A3 son particularmente útiles en la generación y caracterización de anticuerpos específicos de dominio (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epítopo extracelular o intracelular de una proteína 121P2A3), para identificar agentes o factores celulares que se unan a 121P2A3 o a un dominio estructural particular de la misma, y en varios contextos terapéuticos y diagnósticos, que incluyen, aunque sin limitación, ensayos diagnósticos, vacunas de cáncer y métodos para preparar dichas vacunas.

Las proteínas codificadas por los genes de 121P2A3, o por análogos, homólogos o fragmentos de los mismos, tiene una serie de usos, que incluyen, aunque sin limitación, la generación de anticuerpos y el uso en métodos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a un producto génico de 121P2A3. Los anticuerpos activados contra una proteína 121P2A3, o fragmento de la misma, son útiles en ensayos diagnósticos y pronósticos, y las metodologías de imagen para el tratamiento de cánceres humanos que se caracterizan por la expresión de proteína 121P2A3, tal como los enumerados en la Tabla I.

Se usan varios ensayos inmunológicos útiles para la detección de proteínas 121P2A3, que incluyen, aunque sin limitación, varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzima (ELIFA), métodos inmunocitoquímicos, y otros similares. Los anticuerpos pueden marcarse y usarse como reactivos de imagen inmunológicos capaces de detectar células que expresan 121P2A3 (por ejemplo, en métodos de imagen radioescintigráficos). Las proteínas 121P2A3 también son particularmente útiles en la generación de vacunas contra cáncer, como se describe con más detalle en la presente memoria.

III.) Anticuerpos de 121P2A3

Los anticuerpos que se unen a proteínas 121P2A3 son descritos en la presente memoria. Los anticuerpos usados en el método de la invención se unen específicamente a proteína 121P2A3 y no se unen (o se unen débilmente) a péptidos o proteínas que no son proteínas 121P2A3, o fragmentos de las mismas.

Los anticuerpos de 121P2A3 son particularmente útiles en los ensayos diagnósticos y pronósticos de cáncer (veáse, por ejemplo, la Tabla I), y en metodologías de imagen. De forma similar, dichos anticuerpos son útiles en la diagnosis y/o prognosis de otros cánceres, en tanto en cuanto el 121P2A3 también esté expresado o sobrexpresado en dichos cánceres.

En el presente documento también se describen ensayos inmunológicos útiles para la detección y cuantificación de proteínas 121P2A3. Dichos ensayos pueden comprender uno o más anticuerpos de 121P2A3 capaces de reconocer y unirse a proteína 121P2A3, según sea apropiado. Dichos ensayos se llevan a cabo en varios formatos de ensayo inmunológico bien conocidos en la técnica, que incluyen, aunque sin limitación, varias etapas de radioinmunoensayos, ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzima (ELIFA), y otros similares.

Los ensayos inmunológicos sin anticuerpos también comprenden ensayos de inmunogenicidad de células T (de inhibición o de estimulación) así como ensayos de unión de complejo de hiscompatibilidad principal (MHC).

Además, la invención también proporciona métodos de imagen inmunológicos capaces de detectar cáncer de próstata y otros cánceres que expresan 121P2A3, que incluyen, aunque sin limitación, métodos de imagen radioescintigráficos con anticuerpos de 121P2A3 marcados. Dichos ensayos son clínicamente útiles en la detección, monitorización y prognosis de cánceres que expresan 121P2A3, tales como el cáncer de próstata.

Los anticuerpos de 121P2A3 también se usan en métodos para purificar una proteína 121P2A3 y para aislar homólogos de 121P2A3 y moléculas relacionadas. Por ejemplo, un método para purificar una proteína 121P2A3 comprende la incubación de un anticuerpo de 121P2A3, que ha sido acoplado a una matriz sólida, con un lisato u otra disolución que contenga una proteína 121P2A3 en las condiciones que permitan al anticuerpo de 121P2A3 unirse a la proteína 121P2A3; lavar la matriz sólida para eliminar impurezas; y eluir la proteína 121P2A3 del anticuerpo acoplado. Otros usos de anticuerpos de 121P2A3 incluyen la generación de anticuerpos anti-idiotípicos que imiten a una proteína 121P2A3.

En la técnica se conocen varios métodos para la preparación de anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden preparar inmunizando un anfitrión mamífero adecuado con una proteína, péptido o fragmento de 121P2A3, en forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow y Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Además, también se pueden usar proteína de fusión de 121P2A3, tal como la proteína de fusión 121P2A3-GST. En una realización particular, se produce una proteína de fusión GST que comprende toda, o la mayor parte, de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 o de la Figura 3, a continuación se usa como inmunógeno para generar los anticuerpos apropiados. En otra realización, se sintetiza una proteína 121P2A3 y se usa como inmunógeno.

La secuencia de aminoácidos de una proteína 121P2A3 tal como se muestra en la Figura 2 ó en la Figura 3 puede analizarse para seleccionar regiones específicas de la proteína 121P2A3 para generar anticuerpos. Por ejemplo, se usan análisis de hidrofobicidad y de hidrofilicidad de una secuencia de aminoácidos de 121P2A3 para identificar regiones hidrofílicas de la estructura de 121P2A3. Las regiones de una proteína 121P2A3 que muestran estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, pueden ser fácilmente identificadas usando diversos métodos conocidos en la técnica, tal como los análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Los perfiles de hidrofilicidad pueden generarse usando el método de Hopp, T.P. y Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828. Los perfiles de hidropaticidad pueden generarse usando el método de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132. El porcentaje (%) de Residuos Accesibles se puede generar usando el método de Janin J., 1979, Nature 277: 491-492. Los perfiles de Flexibilidad Media pueden generarse usando el método de Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255. Los perfiles de giro beta pueden generarse usando el método de Deleage, G., Roux B., 1987. Protein Engineering 1: 289-294. Por tanto, se puede usar cada región identificada mediante cualquiera de estos programas o métodos. Los métodos para la generación de anticuerpos de 121P2A3 se ilustran con más detalle en los ejemplos proporcionados en el presente documento. Los métodos de preparación de una proteína o polipéptido para su uso como inmunógeno son bien conocidos en la técnica. También son conocidos en la técnica los métodos para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un vehículo, tal como BSA, KLH u otra proteína vehículo. En algunas circunstancias, se usa la conjugación directa usando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros ejemplos es eficaz la unión de reactivos tales como los suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administración de un inmunógeno de 121P2A3 a menudo se lleva a cabo mediante inyección a lo largo de un periodo de tiempo adecuado y con el uso de un adyuvante adecuado, y es conocida en la técnica. Durante el calendario de inmunización, se pueden obtener los títulos de anticuerpos para determinar la adecuación de la formación de anticuerpos.

Los anticuerpos monoclonales de 121P2A3 pueden producirse mediante varios medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado son preparadas usando la tecnología de hibridoma estándar de Kohler y Milstein, o modificaciones que inmortalizan células B productoras de anticuerpos, como es generalmente conocido. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados son escrutadas mediante inmunoensayo para determinar en cuál el antígeno es una proteína 121P2A3. Cuando se identifica el cultivo celular inmortalizado apropiado, las células pueden expandirse y los anticuerpos pueden producirse a partir de cultivo in vitro o de fluido ascites.

Los anticuerpos o fragmentos también se pueden producir mediante medios recombinantes. También se pueden producir regiones que se unan específicamente a las regiones deseadas de una proteína 121P2A3 en el contexto de anticuerpos anclados quiméricos o de región determinante de la complementariedad (CDR) de origen de múltiples especies. También se pueden producir anticuerpos de 121P2A3 humanizados o humanos, y se prefieren para su uso en contextos terapéuticos. Los métodos para humanizar anticuerpos murinos y otros anticuerpos no humanos, sustituyendo una o más de las CDRs del anticuerpo no humano por las correspondientes secuencias de anticuerpos humanos, son bien conocidos (véase por ejemplo, Jones y col., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann y col., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen y col., 1988, Science 239: 1534-1536). Véase también, Carter y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285, y Sims y col., 1993, J. Immunol. 151: 2296.

Los métodos para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos incluyen métodos de presentación de fagos y métodos transgénicos (para una revisión, véase Vaugban y col., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539). Se pueden generar anticuerpos monoclonales de 121P2A3 completamente humanos usando tecnologías de clonación que emplean una gran cantidad bibliotecas combinatorias de genes Ig humanos (es decir, presentación de fagos) (Griffiths y Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. En: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pág. 45-64 (1993); Burton y Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries, ídem, pág. 65-82). También se pueden producir anticuerpos monoclonales de 121P2A3 completamente humanos usando ratones transgénicos modificados para que contengan las posiciones de gen de inmunoglobulina humana tal como se describe en la Solicitud de Patente PCT WO98/24893. Kucherlapati y Jakobovits y col., publicado el 3 de diciembre de 1997 (véase también Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614; patentes de EE.UU. 6.162.963 publicada el 19 de diciembre de 2000; 6.150.584 publicada el 12 de noviembre de 2000; y 6.114.598 publicada el 5 de septiembre de 2000). Este método evita la manipulación in vitro requerida con la tecnología de presentación de fagos y produce eficientemente anticuerpos humanos auténticos de alta afinidad.

La reactividad de anticuerpos de 121P2A3 con una proteína 121P2A3 puede establecerse a través de una serie de métodos bien conocidos, que incluyen los análisis de transferencia Western, de inmunoprecipitación, ELISA y FACS, usando cuando sea apropiado proteínas relacionadas con la 121P2A3, células que expresan 121P2A3 o extractos de las mismas. Un anticuerpo de 121P2A3 o fragmento del mismo puede ser marcado con un marcador detectable o puede conjugarse con una segunda molécula. Los marcadores detectables adecuados incluyen, aunque sin limitación, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante metálico o una enzima. Además, los anticuerpos bi-específicos para dos o más epítopos de 121P2A3 se generan usando métodos conocidos generalmente en la técnica. También pueden generarse anticuerpos homodiméricos mediante técnicas de reticulado conocidas en la técnica (por ejemplo, Wolff y col., Cancer Res. 53: 2560-2565).

IV.) Métodos para la Detección de 121P2A3

En la presente memoria se describen los métodos para detectar proteínas 121P2A3. El perfil de expresión de 121P2A3 la convierte en un marcador de diagnosis para la enfermedad metastizada. Por consiguiente, el estado de los productos génicos de 121P''A3 proporciona información útil para predecir una variedad de factores que incluyen la susceptibilidad a enfermedad en estado avanzado, la velocidad de progresión y/o la agresividad del tumor.

En la presente memoria también se describen los ensayos para detectar la presencia de una proteína 121P2A3 en un tejido o en otra muestra biológica tal como suero, semen, hueso, próstata, orina, preparaciones celulares, y otros similares. Los métodos para detectar una proteína 121P2A3 también son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímico, análisis de transferencia Western, ensayos de unión molecular, ELISA, ELIFA, y otros similares. Por ejemplo, un método para detectar la presencia de una proteína 121P2A3 en una muestra biológica comprende en primer lugar poner en contacto la muestra con un anticuerpo de 121P2A3, con un fragmento del mismo reactivo con 121P2A3, o con una proteína recombinante que contenga una región de unión de proteína de un anticuerpo de 121P2A3; y a continuación detectar la unión de la proteína 121P2A3 en la muestra.

V.) Métodos para Monitorizar el Estado de Proteínas 121P2A3

Se sabe que la oncogénesis es un proceso multietapa en la que el crecimiento celular se vuelve progresivamente desregularizado y las células evolucionan desde un estado fisiológico normal a estados precancerosos y después cancerosos (véase, por ejemplo, Alers y col., Lab Invest. 77(5): 437-438 (1997) e Isaacs y col., Cancer Surv. 23: 19-32 (1995)). En este contexto, el examen de una muestra biológica para determinar evidencias de crecimiento celular desregularizado (tal como la expresión aberrante de 121P2A3 en cánceres) permite una detección temprana de dichas fisiología aberrante, antes de que un estado patológico como el cáncer haya progresado a un estadio en el que las opciones terapéuticas están más limitadas y/o en el que la prognosis es peor. En dichos exámenes, el estado de 121P2A3 en una muestra biológica de interés puede compararse, por ejemplo, con el estado de 121P2A3 en una muestra correspondiente normal (por ejemplo, una muestra de dicho individuo o alternativamente de otro individuo que no esté afectado por una patología). Una alteración del estado de 121P2A3 en la muestra biológica (en comparación con la muestra normal) proporciona una evidencia de crecimiento celular desregularizado. Además de usar una muestra biológica que no esté afectada por una patología como muestra normal, uno también puede usar un valor normativo predeterminado tal como un nivel normal predeterminado de expresión de ARNm (véase, por ejemplo, Grever y col., J. Comp. Neurol. 1996, 9 de diciembre; 376(2): 306-14, y Patente de EE.UU. Nº 5.837.501) para comparar el estado de 121P2A3 en una muestra.

El término "estado" en este contexto se usa de acuerdo con su significado aceptado en la técnica y se refiere a la condición o estado de un gen y sus productos. Normalmente, los especialistas en la técnica usan una serie de parámetros para evaluar la condición o estado de un gen y sus productos. Estos incluyen, aunque sin limitación, la localización de los productos génicos expresados (que incluye la localización de células que expresan 121P2A3) así como el nivel de expresión, y la actividad biológica de los productos génicos expresados (tal como polipéptidos 121P2A3). Normalmente, una alteración del estado de 121P2A3 comprende un cambio en la localización de 121P2A3 y/o de células que expresan 121P2A3 y/o un aumento en la expresión proteica de 121P2A3.

El estado de 121P2A3 de una muestra puede analizarse a través de una serie de métodos bien conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, análisis inmunohistoquímico, análisis de transferencia Western y análisis de conjunto de tejidos. Los protocolos típicos para evaluar el estado de una proteína 121P2A3 pueden encontrarse, por ejemplo, en Ausubel y col., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (Transferencia Western), 4 (Transferencia Southern), 15 (Inmunotinción) y 18 (Análisis PCR). Por tanto, el estado de 121P2A3 en una muestra biológica se evalúa a través de varios métodos utilizados por los especialistas en la técnica que incluyen, aunque sin limitación, análisis de transferencia Western y/o inmunoquímicos (para examinar, por ejemplo, alteraciones en las secuencias de polipéptidos, alteraciones en la localización de polipéptidos dentro de una muestra, alteraciones en los niveles de expresión de proteínas 121P2A3 y/o asociaciones de proteínas 121P2A3 con parejas de unión de polipéptido).

El perfil de expresión de 121P2A3 la convierte en un marcador de diagnosis para enfermedad local y/o metastizada, y proporciona información sobre el crecimiento o el potencial oncogénico de una muestra biológica. En particular, el estado de 121P2A3 proporciona información útil para predecir la susceptibilidad frente a estados de enfermedad particulares, la progresión y/o la agresividad del tumor. La invención proporciona métodos y ensayos para determinar el estado de 121P''A3 y para diagnosticar cánceres que expresan 121P2A3, tal como cánceres de los tejidos enumerados en la Tabla I. Por ejemplo, debido a que el ARNm de 121P''A3 está tan altamente expresado en el cáncer de próstata y en otros cánceres respecto al tejido normal de próstata, los ensayos que evalúan los niveles de tránscritos de ARNm o de proteínas de 121P2A3 en una muestra biológica pueden usarse para diagnosticar una enfermedad asociada a la desregulación de 121P2A3, y pueden proporcionar información pronóstica útil para definir las opciones terapéuticas apropiadas.

El estado de expresión de 121P2A3 proporciona información que incluye la presencia, el estadio y la localización de células displásticas, precancerosas y cancerosas, prediciendo la susceptibilidad frente a diversos estadios de la enfermedad, y/o para determinar la agresividad del tumor. Además, el perfil de expresión la hace útil como reactivo de imagen para la enfermedad metastizada. Por consiguiente, un aspecto de la invención está dirigido a los diversos métodos moleculares de prognosis y diagnosis para examinar el estado de 121P2A3 en muestras biológicas tales como las de individuos que padecen, o que se sospecha padecen, una patología que se caracteriza por un crecimiento celular desregularizado, tal como el cáncer.

Tal como se ha descrito antes, el estado de 121P2A3 en una muestra biológica puede ser examinado mediante una serie de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el estado de 121P2A3 en una muestra biológica tomada de una localización específica del cuerpo puede examinarse evaluando la muestra para determinar la presencia o la ausencia de células que expresan 121P2A3 (por ejemplo, aquellas que expresan ARNms o proteínas de 121P2A3). Este examen puede proporcionar evidencias de crecimiento celular desregularizado, por ejemplo, cuando se descubren células que expresan 121P2A3 en una muestra biológica que normalmente no contiene dichas células (tal como un nodo linfático), debido a que las alteraciones en el estado de 121P2A3 en una muestra biológica a menudo están asociadas a un crecimiento celular desregularizado. Específicamente, un indicador de crecimiento celular desregularizado es la metástasis de células cancerígenas de un órgano de origen (tal como la próstata) a un área diferente del cuerpo (tal como un nodo linfático). En este contexto, una evidencia de crecimiento celular desregularizado es importante, por ejemplo, porque se puede detectar una metástasis oculta a nodo linfático en una proporción sustancial de pacientes con cáncer de próstata, y dicha metástasis está asociada a predictores conocidos de la progresión de la enfermedad (véase, por ejemplo, Murphy y col., Prostate 42(4): 315-317 (2000); Su y col., Semen. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) y Freeman y col., J. Urol. 1995, agosto, 154(2 Pt. 1): 474-478).

En un aspecto, en el presente documento se describen métodos para monitorizar productos génicos de 121P2A3 determinando el estado de productos génicos de 121P2A3 expresados por células de un individuo que se sospecha padece una enfermedad asociada a un crecimiento celular desregularizado (tal como hiperplasia o cáncer) y a continuación comparar el estado determinado de este modo con el estado de productos génicos de 121P2A3 en una muestra normal correspondiente. La presencia de productos génicos de 121P2A3 aberrantes en la muestra de ensayo respecto a la muestra normal proporciona una indicación de la presencia de crecimiento celular desregularizado en las células del individuo.

En el presente documento se describen ensayos útiles para determinar la presencia de cáncer en un individuo, que comprenden detectar un aumento significativo en la expresión de proteína 121P2A3 en una muestra de célula o tejido de ensayo respecto a los niveles de expresión del correspondiente tejido o célula normal. La presencia de expresión significativa de 121P2A3 en cualquiera de los tejidos enumerados en la Tabla I es útil para indicar la emergencia, presencia y/o gravedad de un cáncer, ya que los tejidos correspondientes normales no expresan ARNm de 121P2A3 o lo expresan en niveles inferiores.

El estado de 121P2A3 se determina a nivel de proteína más que a nivel de ácido nucleico. Por ejemplo, dicho método comprende la determinación del nivel de proteína 121P''A3 expresada por las células en una muestra de tejido de ensayo y comparar el nivel determinado de ese modo con el nivel de 121P2A3 expresado en una muestra normal correspondiente. En una realización, la presencia de proteína 121P2A3 se evalúa, por ejemplo, usando métodos inmunohistoquímicos. Se usan anticuerpos de 121P2A3 o compañeros de unión capaces de detectar expresión de proteína 121P2A3 en una variedad de formatos de ensayo bien conocidos en la técnica para este propósito.

En una realización adicional, uno puede evaluar el estado de secuencias de aminoácido de 121P2A3 en una muestra biológica a fin de identificar perturbaciones en la estructura de dichas moléculas. Estas perturbaciones pueden incluir inserciones, eliminaciones, sustituciones y otras similares. Dichas evaluaciones son útiles porque se observan perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos en un gran número de proteínas asociadas al fenotipo de crecimiento desregularizado (véase, por ejemplo, Marrogi y col., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378). Por ejemplo, una mutación en la secuencia de 121P2A3 puede ser indicativa de la presencia o promoción de un tumor. Dichos ensayos, por tanto, tienen valor diagnóstico y predictivo ya que una mutación de 121P2A3 indica una pérdida potencial de función o un incremento del tamaño del tumor.

En la técnica se conoce bien una amplia variedad de ensayos para observar perturbaciones en secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el tamaño y la estructura de secuencias de aminoácidos de los productos génicos de 121P2A3 son observados mediante los protocolos discutidos en la presente memoria. Adicionalmente, en la técnica se conocen otros métodos para observar perturbaciones en secuencias de aminoácidos tales como el análisis de polimorfismo de conformación de cadena sencilla (véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nº 5.382.510 publicada el 7 de septiembre de 1999, y 5.952.170 publicada el 17 de enero de 1995).

En la presente memoria también se describe la determinación de la susceptibilidad que presenta un individuo a desarrollar cáncer. En una realización, un método para predecir la susceptibilidad al cáncer comprende la detección de proteína 121P2A3 en una muestra de tejido, indicando su presencia susceptibilidad al cáncer, en donde el grado de expresión de 121P2A3 se correlaciona con el grado de susceptibilidad. En una realización específica, la presencia de 121P2A3 en la próstata o en otro tejido examinado, proporcionando la presencia de 121P2A3 en la muestra una indicación de susceptibilidad a cáncer de próstata (o la emergencia o existencia de un tumor de próstata). De forma similar, uno puede evaluar la integridad de las secuencias de aminoácido de 121P2A3 en una muestra biológica, con el objetivo de identificar perturbaciones en la estructura de dichas moléculas, tales como inserciones, eliminaciones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones en los productos génicos de 121P2A3 de la muestra es una indicación de susceptibilidad a cáncer (o emergencia o existencia de un tumor).

En la presente memoria también se describen métodos para medir la agresividad de un tumor. En una realización, un método para medir la agresividad de un tumor comprende determinar el nivel de proteína 121P2A3 expresada por las células tumorales, comparar el nivel determinado de este modo con el nivel de proteína 12P2A3 expresado en una muestra de tejido normal correspondiente tomada del mismo individuo o una muestra de tejido normal correspondiente, en donde el grado de expresión de proteína 121P2A3 en la muestra de tumor respecto a la muestra normal indica el grado de agresividad. En una realización específica, la agresividad de un tumor se evalúa determinando la extensión a la que se expresa 121P2A3 en las células tumorales, indicando los mayores niveles de expresión tumores más agresivos. Otra realización es la evaluación de la integridad de secuencias de aminoácidos de 121P2A3 en una muestra biológica, con el objetivo de identificar perturbaciones en la estructura de dichas moléculas tales como inserciones, eliminaciones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones indica tumores más
agresivos.

En la presente memoria también se describen métodos para observar la progresión de una malignidad en un individuo con el tiempo. En una realización, los métodos para observar la progresión de una malignidad en un individuo con el tiempo comprenden determinar el nivel de proteína 121P2A3 expresado por las células en una muestra del tumor, comparar el nivel determinado de este modo con el nivel de proteína 121P2A3 expresada en una muestra de tejido equivalente tomada del mismo individuo a un tiempo distinto, en donde el grado de expresión de proteína 121P2A3 de la muestra de tumor con el tiempo proporciona información de la progresión del cáncer. En una realización específica, la progresión de un cáncer se evalúa determinando la expresión de 121P2A3 en las células tumorales con el tiempo, en donde un aumento de la expresión con el tiempo indica una progresión del cáncer. Asimismo, uno puede evaluar la integridad de las secuencias de aminoácidos de 121P2A3 en una muestra biológica con el objetivo de identificar perturbaciones en la estructura de dichas moléculas tales como inserciones, eliminaciones, sustituciones y similares, en donde la presencia de una o más perturbaciones indica una progresión del cáncer.

Las anteriores estrategias diagnósticas pueden combinarse con uno cualquiera de una amplia variedad de protocolos pronósticos y diagnósticos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en el presente documento también se describen métodos para observar una coincidencia entre la expresión de productos génicos de 121P2A3 (o perturbaciones en productos génicos de 121P2A3) y un factor que está asociado a una malignidad, como medio para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido. Se puede utilizar una amplia variedad de factores asociados a malignidad, tales como la expresión de genes asociados a malignidades (por ejemplo, expresión de PSA, PSCA y PSM para el cáncer de próstata, etc.) así como observaciones citológicas (véase, por ejemplo, Bocking y col., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2): 74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2): 223-9; Thorson y col., 1998, Mod. Pathol. 11(6): 543-51; Baisden y col., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8): 918-24). Los métodos para observar una coincidencia entre la expresión de gen 121P2A3 y productos génicos de 121P2A3 (o perturbaciones en el gen 121P2A3 y en los productos génicos de 121P2A3) y otro factor asociado a la malignidad son útiles, por ejemplo, porque la presencia de una serie de factores específicos que coinciden con la enfermedad proporciona información crucial para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido.

En una realización, los métodos para observar una coincidencia entre la expresión de productos génicos de 121P2A3 (o perturbaciones de productos génicos de 121P2A3) y otro factor asociado a la malignidad abarca detectar la sobreexpresión de proteína 121P2A3 en una muestra de tejido, detectar la sobreexpresión de ARNm de PSA o proteína en una muestra de tejido (o la expresión de PSCA ó PSM), y observar una coincidencia de sobreexpresión de ARNm de proteína 121P2A3 y de PSA o proteína (o expresión de PSCA o PSM). En una realización específica, se examina la expresión de 121P2A3 y ARNm de PSA en tejido de próstata, en donde la coincidencia de sobreexpresión ARNm de 121P2A3 y PSA en la muestra indica la existencia de cáncer de próstata, susceptibilidad a cáncer de próstata o emergencia o estado de un tumor de próstata.

Los métodos para detectar y cuantificar la expresión de proteína 121P2A3 se describen en el presente documento, y en la técnica son bien conocidas las tecnologías estándares de detección y cuantificación de proteínas. En una realización específica, se pueden usar anticuerpos policlonales o monoclonales específicamente reactivos con la proteína 121P2A3 natural en un ensayo inmunohistoquímico de tejido biopsiado.

VI.) Realizaciones Diagnósticas y Pronósticas de 121P2A3

Tal como se describe en la presente memoria, se usan anticuerpos anti-polipéptido de 121P2A3 en ensayos diagnósticos y pronósticos bien conocidos que examinan las condiciones asociadas al crecimiento celular desregularizado tal como cáncer, en particular los cánceres enumerados en la Tabla I (véase, por ejemplo, su patrón específico de expresión en tejido así como su sobreexpresión en determinados cánceres, tal como se describe por ejemplo en el Ejemplo titulado "Análisis de Expresión de 121P2A3 en tejidos normales y especímenes pacientes normales").

La 121P2A3 se puede hacer análoga a un antígeno PSA asociado a la próstata, el marcador arquetípico que han usado los médicos durante años para identificar y monitorizar la presencia de cáncer de próstata (véase, por ejemplo, Cerril y col., J. Urol. 163(2): 503-512 (2000); Polascik y col., J. Urol. Agosto, 162(2): 293-306 (1999) y Fortier y col., J. Nat. Cancer Inst. 91(19): 1635-1640 (1999)). También se usa una serie de marcadores diagnósticos adicionales en contextos similares que incluyen el p53 y el K-ras (véase, por ejemplo, Tulchinsky y col., Int. J. Mol. Med. 1999, Julio, 4(1): 99-102 y Minimoto y col., Cancer Detect Prev 2000, 24(1): 1-12). Por tanto, esta descripción de anticuerpos anti-121P2A3 usada para identificar la presencia de estas moléculas y sus propiedades, permite a los especialistas en la técnica utilizar estas moléculas en métodos que son análogos a los usados, por ejemplo, en una variedad de ensayos diagnósticos dirigidos a examinar condiciones asociadas al cáncer.

Las realizaciones típicas de métodos diagnósticos que utilizan los anticuerpos de 121P2A3 son análogas a los métodos de ensayos diagnósticos bien establecidos que emplean, por ejemplo, anticuerpos de PSA. Por ejemplo, tal como los polipéptidos de PSA son usados para generar anticuerpos específicos para PSA que pueden ser usados entonces para observar la presencia y/o el nivel de proteínas de PSA en métodos de monitorización de sobreexpresión de proteína PSA (véase, por ejemplo, Stephan y col., Urology 55(4): 560-3 (2000)) o la metástasis de células de próstata (véase, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-7 (1996)), los polipéptidos de 121P2A3 descritos en la presente memoria también pueden utilizarse para generar anticuerpos para su uso en la detección de sobreexpresión de 121P2A3 o de metástasis de células de próstata y células de otros cánceres que expresan dicho gen.

Específicamente, debido a que la metástasis implica el movimiento de células cancerígenas desde un órgano de origen (tal como el pulmón o la glándula prostática, etc.) a un área diferente del cuerpo (tal como un nodo linfático), se pueden usar ensayos que examinan una muestra biológica para determinar la presencia de células que expresan polipéptidos de 121P2A3 para proporcionar una evidencia de metástasis. Por ejemplo, cuando se descubre que una muestra biológica, de un tejido que normalmente no contiene células que expresan 121P2A3 (nodo linfático), contiene células que expresan 121P2A3 tal como la expresión de 121P2A3 observada en LAPC4 y LAPC9, xenoinjertos aislados de nodos linfáticos y de metástasis ósea, respectivamente, dicho descubrimiento es indicativo de
metástasis.

Alternativamente, se pueden usar polipéptidos de 121P2A3 para proporcionar evidencias de cáncer, por ejemplo, cuando se descubre que células de una muestra biológica que normalmente no expresan 121P2A3, o que expresan 121P2A3 en un nivel diferente, expresan 121P2A3 o tienen una expresión aumentada de 121P2A3 (véase, por ejemplo, la expresión de 121P2A3 en los cánceres enumerados en la Tabla I y en muestras de pacientes mostradas en las Figuras acompañantes). En dichos ensayos, los especialistas pueden querer además generar una evidencia suplementaria de metástasis a través de la evaluación de la muestra biológica para determinar la presencia de un segundo marcador restringido a tejido (además del 121P2A3) tal como PSA, PSCA, etc. (véase, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)).

Además, en métodos de monitorización de PSA se usan polipéptidos de PSA que contienen un epítopo que puede ser reconocido por un anticuerpo o por una célula T que se une específicamente a dicho epítopo. También se pueden usar fragmentos de polipéptido de 121P2A3 y análogos o variantes de polipéptidos de un modo análogo. Esta práctica de usar fragmentos de polipéptido o variantes de polipéptidos para generar anticuerpos (tal como anticuerpos anti-PSA o células T) es típica en la técnica en una amplia variedad de sistemas tales como las proteínas de fusión usadas por los especialistas (véase, por ejemplo, Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 16, Frederick M., Ausubel y col., editores, 1995). En este contexto, cada epítopo funciona para proporcionar la arquitectura con la que es reactiva un anticuerpo o una célula T. Típicamente, los especialistas en la técnica crean una serie de diferentes fragmentos de polipéptido que pueden usarse con el objetivo de generar respuestas inmunes específicas para diferentes porciones de un polipéptido de interés (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.840.501 y la Patente de EE.UU. Nº 5.939.533). Por ejemplo, puede ser preferible utilizar un polipéptido que comprende una de las estructuras biológicas de 121P2A3 discutidas en la presente memoria o una sub-secuencia portadora de estructuras que sea fácilmente identificable por el especialista en la técnica en base a las estructuras disponibles en la técnica. Los fragmentos, variantes o análogos de polipéptidos son útiles en este contexto siempre que comprendan un epítopo capaz de generar un anticuerpo específico para un polipéptido de 121P2A3 mostrado en la Figura 3.

Tal como se muestra en la presente memoria, los polipéptidos de 121P2A3, así como los anticuerpos anti-121P2A3, usados para identificar la presencia de estas moléculas presentan propiedades específicas que los hacen útiles en el diagnóstico de cánceres tales como los enumerados en la Tabla I. Los ensayos diagnósticos que miden la presencia de productos génicos de 121P2A3, con el objetivo de evaluar la presencia o el inicio de una condición de enfermedad descrita en el presente documento, tal como el cáncer de próstata, son usados para identificar pacientes para adoptar medidas preventivas o realizar una monitorización, tal como se ha hecho con éxito con el PSA. Además, estos materiales satisfacen una necesidad que existe en la técnica por desarrollar moléculas que tengan características similares o complementarias al PSA en situaciones en las que, por ejemplo, no se pueda realizar una diagnosis de metástasis de origen prostático en base únicamente a un ensayo de PSA (véase, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)), y por consiguiente, es necesario emplear materiales tales como los anticuerpos anti-121P2A3 para confirmar una metástasis de origen prostático.

VII.) Kits

En la presente memoria también se describen kits para su uso en las aplicaciones diagnósticas descritas aquí. Dichos kits pueden comprender un vehículo, un paquete o un recipiente que está compartimentalizado para recibir uno o más recipientes tales como viales, tubos, y similares, comprendiendo cada recipiente(s) uno de los elementos separados que van a ser usados en el método. Por ejemplo, el(los) recipiente(s) puede(n) comprender una sonda que es o que puede ser marcada de forma detectable. Dicha sonda puede ser un anticuerpo específico para una proteína 121P2A3. El kit puede incluir toda la secuencia de aminoácidos, o una parte, de la Figura 2 o de la Figura 3, o análogos de la misma, o moléculas de ácido nucleico que codifiquen dichas secuencias de aminoácidos.

El kit de la invención comprenderá típicamente el recipiente descrito anteriormente y uno o más recipientes adicionales que comprenden materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, que incluyen tampones, diluyentes, rellenos, agujas, jeringas, y prospectos con instrucciones para su uso.

Puede haber presente una etiqueta en el recipiente para indicar que la composición se usa para una terapia específica o para una aplicación no terapéutica, y también puede indicar instrucciones para el in vivo o in vitro, tal como se ha descrito anteriormente. También se pueden incluir instrucciones y otra información en un prospecto que se incluya en el kit.

Ejemplos

Los diversos aspectos de la invención se describen y se ilustran con más detalle a través de varios ejemplos que se muestran a continuación, ninguno de los cuales pretende limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Aislamiento Generado por SSH de un Fragmento de ADNc del Gen 121P2A3

Para aislar genes que están implicados en la progresión del cáncer de próstata dependiente de andrógenos (AD) hacia un cáncer independiente de andrógenos (AI), se llevó a cabo un experimento con el xenoinjerto LAPC-9 AD en ratones SCID macho. Los ratones que recibieron xenoinjertos LAPC-9 AD fueron castrados cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 1 cm de diámetro. Los tumores retrocedieron en tamaño y pararon temporalmente de producir la proteína PSA dependiente de andrógeno. De siete a catorce días después de la castración, los niveles de PSA en la sangre de los ratones fueron detectables nuevamente. Finalmente los tumores desarrollan un fenotipo AI y comienzan a crecer de nuevo en los machos castrados. Los tumores fueron extraídos a diferentes tiempos después de la castración para identificar los genes que se activan o que se desactivan durante la transición a la independencia de andrógenos.

El gen 121P2A3 fue derivado de una sustracción de LAPC-9 AD menos LAPC-9 AD (28 días después de la castración). La secuencia de ADN SSH de 259 pb se presenta en la Figura 1. Se aisló un ADNc (clon 5 de 121P2A3) de 2473 pb a partir de una biblioteca de ADNc de LAPC-9 AD, que revela un ORF de 464 aminoácidos (Figuras 2 y 3). También se identificaron las variantes de 121P2A3 v.1, y se presentan en las Figuras 2 y 3.

La proteína 121P2A3 muestra homología con respecto a una nueva proteína hipotética FLJ10540 aislada a partir de la línea celular NT2 de teratocarninoma humano (Figura 4B y 4D). Las dos proteínas son idénticas en un 98% en la región de 223 aminoácidos que comienza en la posición 170 de la 121P2A3 v.1. La proteína 121P2A3 también muestra homología con respecto al gen XM_005908 (similar al ADNc RIKEN 1200008º12). El gen XM_005908 se aisló a partir de una biblioteca de ADNc de rabdomiosarcoma, lo que valida la expresión de 121P2A3 en cánceres humanos. Las proteínas 121P2A3 v.1 y XM_005908 son idénticas en un 99% en 464 aminoácidos (Figura 4B).

El análisis de secuencia de aminoácidos de la 121P2A3 revela un 75% de identidad en la región de 464 aminoácidos con respecto a una proteína putativa de ratón (Figura 4F). La 121P2A3 v.1 también muestra homología con respecto al factor-1 asociado a nef humano (naf-1). Las dos proteínas son idénticas en un 23% en la región de 339 aminoácidos (Figura 4G).

En el Ejemplo 44 se muestra un análisis adicional de homología.

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Materiales y Métodos Xenoinjertos de LAPC y Tejidos Humanos

Los xenoinjertos de LAPC se obtuvieron del Dr. Charles Sawyers (UCLA) y se generaron tal como se ha descrito (Klein y col., 1997, Nature Med. 3: 402-408; Craft y col., 1999, Cancer Res. 59: 5030-5036). Se cultivaron xenoinjertos dependientes e independientes de andrógeno LAPC-9 AD y AI en ratones SCID macho y fueron evaluados como pequeños trozos de tejido en machos receptores. Los xenoinjertos LAPC-9 AI fueron derivados de tumores LAPC-9 AD, respectivamente. Para generar xenoinjertos AI, los ratones machos que portaban tumores AD fueron castrados y mantenidos durante 2-3 meses. Después de que los tumores volvieran a crecer, fueron extraídos y trasladados a ratones SCID machos castrados o a hembras.

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Líneas Celulares

Las líneas celulares humanas (por ejemplo, HeLa) fueron obtenidas de la ATCC y fueron mantenidas en DMEM con suero fetal de ternero al 5%.

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Tejidos Humanos

Los tejidos normales y cancerosos pacientes fueron adquiridos en diferentes fuentes tales como la NDRI (Filadelfia, PA). El ARNm de algunos tejidos normales fue adquirido en Clontech, Palo Alto, CA.

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Aislamiento de ARN

Los tejidos fueron homogeneizados en reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) usando 10 mL/g de ARN total aislado de tejido. El ARN poli A fue purificado a partir del ARN total usando los Mini y Midi kits Oligotex mARN de Qiagen. El ARN total y el ARNm fueron cuantificados mediante análisis espectrofotométrico (D.O. 260/280 nm) y analizados mediante electroforesis de gel.

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Oligonucleótidos

Se usaron los siguientes oligonucleótidos purificados mediante HPLC.

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DPNCDN (cebador de síntesis de ADNc)

5' TTTTGATCAAGCTT_{30} 3'

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Adaptador I

5' CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG 3'

3' GGCCCGTCCTAG 5'

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Adaptador II

5' GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG 3'

3' CGGCTCCTAG 5'

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Cebador anidado (NP)1

5' TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA 3'

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Cebador anidado (NP)2

5' AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA 3'

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Hibridación Sustractiva de Supresión

La Hibridación Sustractiva de Supresión (SSH, de las siglas en inglés) se usó para identificar ADNcs correspondientes a genes que están expresados diferencialmente en el cáncer de próstata. La reacción SSH utiliza ADNc de dos xenoinjertos LAPC-9 AD. Específicamente, para aislar genes que están implicados en la progresión del cáncer de próstata dependiente de andrógenos (AD) hacia cáncer independiente de andrógenos (AI), se llevó a cabo un experimento con el xenoinjerto LAPC-9 AD en ratones SCID machos. Los ratones que recibieron xenoinjertos LAPC-9 AD fueron castrados cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 1 cm de diámetro. Los tumores retrocedieron en tamaño y pararon temporalmente de producir la proteína PSA dependiente de andrógeno. De siete a catorce días después de la castración, los niveles de PSA en la sangre de los ratones volvieron a ser detectables. Finalmente los tumores desarrollaron un fenotipo AI y comenzaron a crecer de nuevo en los ratones machos castrados. Se extrajeron los tumores a diferentes tiempos después de la castración para identificar los genes que se habían activado o desactivado durante la transición a la independencia de andrógenos.

El gen 121P2A3 se derivó de una sustracción de tumor LAPC-9 AD (cultivado en ratón macho intacto) menos tumor LAPC-9 AD (28 días después de la castración). Se identificó la secuencia de ADN SSH de 121P2A3 (Figura 1).

El ADNc derivado de un tumor LAPC-9 AD (28 días después de la castración) se usó como fuente de ADNc "conductor", mientras que el ADNc de un tumor LAPC-9 AD (cultivado en ratón macho intacto) se usó como fuente de ADNc "evaluador". Los ADNcs de cadena doble correspondientes a los ADNcs evaluador y conductor se sintetizaron a partir de 2 \mug de ARN poli(A)+ aislado del tejido de xenoinjerto relevante, tal como se ha descrito anteriormente, usando el Kit de Sustracción de ADNc PCR-Select de CLONTECH y 1 ng de oligonucleótido DPNCDN como cebador. Las síntesis de primera y segunda cadena se llevaron a cabo tal como describe el protocolo del manual de usuario del kit (CLONTECH, Nº de protocolo PT1117-1, Nº de catálogo K1804-1). El ADNc resultante fue digerido con Dpn II durante 3 horas a 37ºC. El ADNc digerido fue extraído con fenol/cloroformo (1:1) y precipitado
en etanol.

El ADNc conductor se generó combinando en una relación 1:1 ADNc digerido con Dpn II de la fuente de xenoinjerto relevante (ver anteriormente) con una mezcla de ADNcs digeridos a partir de las líneas celulares humanas HeLa, 293, A431, Colo205 e hígado de ratón.

El ADNc evaluador fue generado diluyendo 1 \muL de ADNc digerido con Dpn II procedente de la fuente de xenoinjerto relevante (ver anteriormente) en 5 \muL de agua. El ADNc diluido (2 \muL, 160 ng) se ligó a continuación a 2 \muL de Adaptador 1 y Adaptador 2 (10 \muM), en reacciones de ligación separadas, en un volumen total de 10 \muL a 16ºC durante la noche, usando 400 u de ligasa de ADN T4 (CLONTECH). La ligación fue finalizada con 1 \muL de EDTA 0,2 M y calentando a 72ºC durante 5 minutos.

La primera hibridación se llevó a cabo añadiendo 1,5 \muL (600 ng) de ADNc conductor a cada uno de los dos tubos que contenían 1,5 \muL (20 ng) de ADNc evaluador ligado a Adaptador 1 y Adaptador 2. En un volumen final de 4 \muL, las muestras fueron revestidas con aceite mineral, desnaturalizadas en un ciclador térmico MI Research a 98ºC durante 1,5 minutos, y a continuación se dejó que hibridaran durante 8 horas a 68ºC. Entonces se mezclaron las dos hibridaciones con 1 \muL adicional de ADNc conductor desnaturalizado fresco, y se dejó que hibridaran durante la noche a 68ºC. La segunda hibridación se diluyó a continuación en 200 \muL de Hepes 20 mM, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calentó a 70ºC durante 7 minutos y se almacenó a -20ºC.

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Amplificación por PCR, Clonación y Secuenciamiento de Fragmentos Génicos Generados a partir de SSH

Para amplificar los fragmentos génicos resultantes de las reacciones de SSH, se llevaron a cabo dos amplificaciones PCR. En la reacción PCR primaria se añadió 1 \muL de la mezcla final de hibridación diluida a 1 \muL de cebador de PCR 1 (10 \muM), 0,5 \muL de mezcla dNTP (10 \muM), 2,5 \muL 10 x tampón de reacción (CLONTECH) y 0,5 \muL 50 x Mezcla de polimerasa de ADNc Advantage (CLONTECH) en un volumen final de 25 \muL. La PCR 1 se llevó a cabo usando las siguientes condiciones: 75ºC durante 5 minutos, 94ºC durante 25 segundos, a continuación 27 ciclos de 94ºC durante 10 segundos, 66ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1,5 minutos. Se llevaron a cabo cinco reacciones PCR primarias separadas para cada experimento. Los productos fueron reunidos y diluidos 1:10 con agua. Para la reacción PCR secundaria, se añadió 1 \muL del conjunto de reacción PCR primaria diluida a la misma mezcla de reacción usada para la PCR 1, excepto porque se usaron los cebadores NP1 y NP2 (10 \muM) en lugar del cebador de PCR 1. La PCR 2 se llevó a cabo usando 10-12 ciclos de 94ºC durante 10 segundos, 68ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1,5 minutos. Los productos PCR fueron analizados usando electroforesis sobre gel de agarosa al 2%.

Los productos PCR fueron insertados en pCR2.1 usando el kit de clonación de vector T/A (Invitrogen). Se sometieron E. coli transformadas a selección de azul/blanco y de ampicilina. Las colonias blancas fueron seleccionadas y dispuestas en placas de 96 pocillos, y se cultivaron en cultivo líquido durante una noche. Para identificar los injertos, se llevó a cabo una amplificación de PCR sobre 1 mL de cultivo bacteriano usando las condiciones de la PCR1 y como cebadores NP1 y NP2. Los productos de PCR fueron analizados usando electroforesis sobre gel de agarosa al 2%.

Los clones bacterianos fueron almacenados en glicerol al 20% en un formato de 96 pocillos. Se preparó ADN de plásmido, se secuenció y se sometió a búsquedas de homología de ácidos nucleicos con las bases de datos GenBank, dBest y NCI-CGAP.

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Análisis de Expresión RT-PCR

Se pueden generar ADNcs de primera cadena a partir de 1 \mug de ARNm con oligo (dT)12-18 imprimación usando el sistema de Preamplificación Gibco-BRL Superscript. Se usó el protocolo del fabricante, que incluía una incubación durante 50 minutos a 42ºC con transcriptasa inversa seguido de un tratamiento con ARNasa H a 37ºC durante 20 minutos. Después de completar la reacción, el volumen puede incrementarse hasta 200 \muL con agua antes de normalización. En Clontech se pueden obtener ADNcs de primera cadena de 16 tejidos humanos normales diferentes.

La normalización de los ADNcs de primera cadena a partir de tejidos múltiples se llevó a cabo usando los cebadores 5' atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa 3' y 5' agccacacgcagctcattgtagaagg 3' para amplificar \beta-actina. El ADNc de primera cadena (5 \muL) fue amplificado en un volumen total de 50 \muL que contenían cebadores 0,4 \muM, dNTPs 0,2 \muM, 1 X tampón de PCR (Clontech, Tris-HCl 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, pH 8,3) y 1 X polimerasa de ADN Klentaq (Clontech). Se pueden extraer cinco \muL de reacción PCR a 18, 20 y 22 ciclos y usarlos para electroforesis sobre gel de agarosa. La PCR se llevó a cabo usando un ciclador térmico MJ Research en las siguientes condiciones: la desnaturalización inicial puede ser a 94ºC durante 15 segundos, seguida de 18, 20 y 22 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 65ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 5 segundos. Se llevó a cabo una extensión final a 72ºC durante 2 minutos. Después de la electroforesis con gel de agarosa, se compararon las intensidades de las bandas de \beta-actina de 283 pb procedentes de múltiples tejidos mediante inspección visual. Se calcularon los factores de dilución de los ADNcs de primera cadena para dar lugar a intensidades de banda de \beta-actina iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR. Pueden requerirse tres rondas de normalización para lograr intensidades de banda iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR.

Para determinar los niveles de expresión del gen 121P2A3, se analizaron 5 \muL de ADNc normalizado de primera cadena mediante PCR usando 26 y 30 ciclos para la amplificación. Se puede lograr un análisis de expresión semicuantitativo comparando los productos de PCR en los números de ciclos que proporcionan elevadas intensidades de banda. Los cebadores usados para la RT-PCR fueron diseñados usando la secuencia SSH de 121P2A3 y se presentan a continuación:

\newpage

121P2A3.1

5'-TGTCAATCAAATGAGAGGGCTACA-3'

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121P2A3.2

5'-CTGTTTGAGGCATAATCTTAAGTGG-3'

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En la Figura 14 se muestra un estudio típico de expresión RT-PCR. Se preparó ADNc de primera cadena a partir del conjunto vital 1 (hígado, pulmón y riñón), conjunto vital 2 (páncreas, colon y estómago), conjunto de xenoinjerto LAPC (LAPC-4AD, LAPC-4AI, LAPC-9AD y LAPC-9AI), conjunto de cáncer de próstata, conjunto de cáncer de vejiga, conjunto de cáncer de riñón, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de ovario, conjunto de cáncer de pecho y conjunto de metástasis de cáncer. La normalización se llevó a cabo mediante PCR usando cebadores para actina y GAPDH. Se llevó a cabo una PCR semicuantitativa usando cebadores para 121P2A3 a 26 y 30 ciclos de amplificación. Los resultados muestran una fuerte expresión de 121P2A3 en conjunto de xenoinjerto LAPC, conjunto de cáncer de vejiga, conjunto de cáncer de riñón, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de ovario, conjunto de cáncer de pecho y conjunto de metástasis de cáncer. También se detectó expresión de 121P2A3 en el conjunto de cáncer de próstata. En los conjuntos vitales 1 y 2 se detectó una expresión muy baja.

Ejemplo 2 Clonación de Longitud Completa de 121P2A3

Para aislar los genes que están implicados en la progresión del cáncer de próstata dependiente de andrógenos (AD) hacia cáncer independiente de andrógenos (AI), se llevó a cabo un experimento con el xenoinjerto LAPC-9 AD en ratones SCID machos. Los ratones que recibieron xenoinjertos LAPC-9 AD fueron castrados cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 1 cm de diámetro. Los tumores retrocedieron en tamaño y pararon temporalmente de producir la proteína PSA dependiente de andrógenos. De siete a catorce días después de la castración, los niveles de PSA fueron detectables de nuevo en la sangre de los ratones. Finalmente los tumores desarrollaron un fenotipo AI y comenzaron a crecer de nuevo en los machos castrados. Los tumores fueron extraídos a diferentes tiempos después de la castración para identificar los genes que se activan o se desactivan durante la transición a la independencia de andrógenos.

El gen 121P2A3 fue derivado de una sustracción de LAPC-9 AD (sin castración) menos LAPC-9 AD (28 días después de la castración). La secuencia SHH de ADN (Figura 1) fue designada 121P2A3. El clon de ADNc 121P2A3-clon 5 (Figura 4) fue identificado monitorizando una biblioteca de ADNc de LAPC-9 AD (Lambda ZAP Express, Stratagene) usando el ADN SSH de 121P2A3 como sonda.

El ADNc del clon 5 de 121P2A3 fue depositado bajo los términos del Tratado de Budapest el 1 de Marzo de 2001, con la American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 EE.UU.) como plásmido 121P2A3-5, y se le ha asignado el Nº de Acceso PTA-3138.

Ejemplo 3 Cartografía Cromosómica del Gen 121P2A3

La localización cromosómica del 121P2A3 se determinó usando la página web de NCBI Genoma Humano (URL www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F= HsBlast.html&&ORG=Hs). El programa de mapeado colocó al
121P2A3 en el cromosoma 10q23.32, una región genómica de la que se sabe que se reestructura en determinados cánceres.

Ejemplo 4 Análisis de expresión de 121P2A3 en tejidos normales, líneas celulares cancerosas y muestras de pacientes

El análisis mediante RT-PCR demuestra que existe expresión de 121P2A3 en múltiples tejidos cancerosos humanos (Figura 14). Se preparó ADNc de primera cadena a partir de conjunto vital 1 (hígado, pulmón y riñón), conjunto vital 2 (páncreas, colon y estómago), conjunto de xenoinjerto LAPC (LAPC-4AD, LAPC-4AI, LAPC-9AD y LAPC-9AI), conjunto de cáncer de próstata, conjunto de cáncer de riñón, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de ovario, conjunto de cáncer de pecho y conjunto de metástasis de cáncer. La normalización se llevó a cabo mediante PCR usando cebadores para actina y GAPDH. Se llevó a cabo una PCR semicuantitativa usando cebadores para 121P2A3 a 26 y 30 ciclos de amplificación. Los resultados muestran una fuerte expresión de 121P2A3 en conjunto de xenoinjerto de LAPC, conjunto de cáncer de vejiga, conjunto de cáncer de riñón, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de ovario, conjunto de cáncer de pecho y conjunto de metástasis de cáncer. También se detectó expresión de 121P2A3 en el conjunto de cáncer de próstata. En los conjuntos vitales 1 y 2 se detectó una expresión muy baja.

Un análisis intensivo de transferencia Northern de 121P2A3 en 16 tejidos normales humanos y en tejidos de xenoinjerto confirma la expresión observada mediante RT-PCR (Figura 15). Se probaron con la secuencia SSH de 121P2A3 dos análisis de transferencia Northern de tejidos múltiples (A y B; Clontech), ambos con 2 \mug de ARNm/banda, y un análisis de xenoinjerto de LAPC con 10 \mug de ARN total/banda (C). Los patrones de tamaño se indican a un lado en kilobases (kb). Los resultados muestran expresión de un tránscrito de 121P2A3 de aproximadamente 2,7 kb en testículos. También se detectó un menor nivel de expresión en el timo y el colon pero no en otros tejidos animales evaluados. También se observa expresión de 121P2A3 en xenoinjertos de cáncer de próstata pero no en la próstata normal.

Se detectó expresión de 121P2A3 en todas las líneas celulares evaluadas (Figura 16). Se extrajo ARN de una serie de líneas celulares cancerosas humanas. Se probaron análisis de transferencia Northern con 10 \mug de ARN total/banda con el fragmento SSH de 121P2A3. Los resultados muestran expresión en líneas celulares cancerosas de próstata (LAPC 4AD, LAPC 4AI, LAPC 9AD, LAPC 9AI, LNCap, PC-3, DUI45, Tsu-Prl y LAPC-4 CL), vejiga (HTI197, SCaBER, UM-UC-3, TCCSUP, J82, 5637), línea celular 293T, de sarcoma de Swing (RD-ES), de páncreas (PANC-1, Bx PC-3, HPAC, Capan-1), de colon (SK-CO-1, Caco-2, LoVo, T84, Colo205), de pecho (CAMA-1, DU4475, MCF-7, MDA-MB-435s), testicular (NTERRA-2, NCCIT, TERA-1, TERA-2), cervical (A431), de ovario (OV-1063, PA-1, SW 626), de cerebro (PFSK-1, T98G) y de hueso (SK-ES-1, HOS, U-2 OS, RD-ES). Estos resultados sugieren que el 121P2A3 es un gen específico de testículos que se ve regulado al alza en múltiples cánceres.

La expresión de 121P2A3 en especímenes de cáncer de vejiga de pacientes se muestra en la Figura 17. Se extrajo ARN de vejiga normal (Nb), líneas celulares de cáncer de vejiga (CL; UM-UC-3, J82, SCaBER), tumores (T) de pacientes de cáncer de vejiga y tejido adyacente normal (N). Se probaron análisis de transferencia Northern con 10 \mug de ARN total con la secuencia SSH de 121P2A3. Los patrones de tamaño se indican a un lado en kilobases. Los resultados muestran expresión de 121P2A3 en tejidos de pacientes con cáncer de vejiga, y en todas las líneas de cáncer de vejiga evaluadas, pero no en la vejiga normal.

La Figura 18 muestra que la 121P2A3 se expresa en especímenes de pacientes con cáncer de riñón. Se extrajo ARN de líneas celulares de cáncer de riñón (CL: 769-P, A498, SW839), riñón normal (NK), tumores (T) de pacientes con cáncer de riñón y sus tejidos adyacentes normales (N). Los análisis de transferencia Northern fueron probados con 10 \mug de ARN total con la secuencia SSH de 121P2A3. Los patrones de tamaño están a un lado en kilobases. Los resultados muestran expresión de 121P2A3 en tejidos de pacientes con tumor de riñón y en todas las líneas celulares de cáncer de riñón evaluadas, pero no en el riñón normal.

La 121P2A3 también se expresa en muestras de pacientes con cáncer de estómago y de recto (Figura 19). La expresión detectada en los tejidos adyacentes normales (aislados a partir de tejidos enfermos) pero no en los tejidos normales (aislados de donantes sanos) indica que estos tejidos no son completamente normales y que la 121P2A3 se puede expresar en tumores en estadios iniciales. También se encontró 121P2A3 altamente expresada en las nueve líneas celulares cancerosas humanas evaluadas, el carcinoma cervical HeLa, la línea CML K562, la línea PML HL-60, la línea de melanoma G361, la línea de carcinoma de pulmón A549, la línea de leucemia linfoblástica MOLT-4, el carcinoma colorrectal SW480, y las líneas de linfoma de Burkitt Daudi y Raji.

Con el objetivo de ensayar la regulación de andrógenos de la expresión de 121P2A3, se inyectaron células tumorales LAPC-9AD en ratones machos (Figura 20). Cuando el tumor alcanzó un tamaño palpable (de 0,3 a 0,5 cm de diámetro), los ratones fueron castrados y los tumores extraídos a diferentes tiempos después de la castración. Se aisló el ARN de los tejidos de xenoinjerto. Se probaron los análisis de transferencia Northern con 10 \mug de ARN total/banda con el fragmento SSH de 121P2A3. Los patrones de tamaño se indican a un lado en kilobases (kb). Los resultados muestran que la expresión de 121P2A3 se regula a la baja a los 7 días de la castración. Las muestras experimentales fueron confirmadas determinando la expresión del gen de cáncer de próstata regulado por andrógenos TMPRSS2, y del gen independiente de andrógenos PHOR-1 (B). Este experimento muestra que, tal como era de esperar, el nivel de expresión de TMPRSS2 decae 7 días después de la castración, mientras que la expresión de PHOR-1 no cambia. También se presenta una imagen de la tinción con bromuro de etidio del gel de ARN que confirma la calidad del ARN.

La expresión de 121P2A3 es reminiscente de un gen de cáncer de testículos. Su expresión restringida en tejido normal y la regulación al alza detectada en los cánceres humanos indica que la 121P2A3 es una diana terapéutica y profiláctica, y un marcador diagnóstico y pronóstico para cánceres humanos.

Ejemplo 5 Variantes de Transcritos de 121P2A3

Las variantes de tránscritos son variantes de ARNm maduro procedentes del mismo gen que surge mediante transcripción alternativa o empalme alternativo. Los tránscritos alternativos son tránscritos del mismo gen pero que comienzan la transcripción en puntos diferentes. Las variantes de empalme son variantes de ARNm empalmadas diferentemente a partir del mismo tránscrito. En los eucariontes, cuando se transcribe un gen multi-exón a partir de un ADN genómico, el ARN inicial se empalma para producir ARNm funcional, que solo tiene exones y se usa para la traducción en una secuencia de aminoácidos. Por consiguiente, un gen dado puede tener de cero a muchos tránscritos alternativos y cada tránscrito puede tener de cero a muchas variantes de empalme. Cada variante de tránscrito tiene una única construcción de exón, y puede tener diferentes porciones codificadoras y/o no codificadoras (extremo 5' ó 3'), del tránscrito original. Las variantes de tránscrito pueden codificar para proteínas similares o diferentes con la misma o similar función o pueden codificar proteínas con diferentes funciones, y pueden expresarse en el mismo tejido al mismo tiempo, o en diferentes tejidos al mismo tiempo, o en el mismo tejido a tiempos distintos, o en diferentes tejidos a tiempos distintos. Las proteínas codificadas por variantes de tránscritos pueden tener localizaciones celulares o extracelulares diferentes, por ejemplo, secretadas frente a intracelulares.

Las variantes de tránscrito se identifican mediante una serie de métodos aceptados en la técnica. Por ejemplo, los variantes de tránscritos y de empalme se identifican mediante experimentos de clonación de longitud completa, o mediante el uso de tránscritos y de secuencias EST de longitud completa. En primer lugar, todos los ESTs humanos se agruparon en conjuntos que muestran identidad directa o indirecta unos con otros. En segundo lugar, los ESTs del mismo conjunto se agruparon adicionalmente en sub-conjuntos y se estructuraron en una secuencia de consenso. La secuencia génica original se compara con la(s) secuencia(s) de consenso o con las secuencias de longitud completa. Cada secuencia de consenso es una variante de empalme potencial para dicho gen (véase, por ejemplo, la URL \underbar{www.doublewist.com/products/c11\_agentsOverview.jhtml}). Incluso cuando se identifica una variante que no es un clon de longitud completa, dicha porción de la variante es muy útil para la generación de antígenos y para la posterior clonación de la variante de empalme de longitud completa, usando procedimientos conocidos en la técnica.

Además, se dispone de programas de ordenador en la técnica que identifican variantes de tránscrito en base a las secuencias genómicas. Los programas de identificación de variante de tránscrito basada en el genoma incluyen FgenesH (A. Salamov y V. Solovyev, "Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA", Genome Research, 2000, Abril, 10(4): 516-22); Grail (URL compbio.oml.gov/Grail-bin/EmptyGrailForm) y GenScan (URL genes.mit.edu/GENSCAN.html). Para una discusión general de los protocolos de identificación de variantes de empalme véase, por ejemplo, Southan, C., A genomic perspective on human proteases, FEBS Lett. 2001, 8 de junio, 498(2-3): 214-8; de Souza, S.J., y col., Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 7 noviembre de 2000, 97(23): 12690-3.

Para confirmar los parámetros de una variante de tránscrito, se dispone de una serie de técnicas, tales como la clonación de longitud completa, la validación proteómica, la validación basada en PCR, y la validación RACE 5', etc. (véase por ejemplo, Proteomic Validation: Brennan, S.O., y col., Albumin banks peninsula: a new termination variant characterized by electrospray mass spectroscopy, Biochem Biophys Acta, 17 de agosto de 1999, 1433(1-2): 321-6; Ferranti P. y col., Differential splicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(s1)-casein, Eur J Biochem. 1 de octubre de 1997; 249(1): 1-7. Para la validación basada en PCR: Wellmann S., y col., Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endotelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology, Clin Chem. Abril de 2001, 47(4): 654-60; Jia, H.P., y col., Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach, Gene. 24 de enero de 2001, 263(1-2): 211-8. Para la validación basada en PCR y RACE 5': Brigle, K.E., y col., Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 7 de agosto de 1997; 1353(2): 191-8).

En la técnica se sabe que las regiones genómicas están moduladas en los cánceres. Cuando la región genómica que mapea un gen es modulada en un cáncer concreto, los tránscritos alternativos o variantes de empalme del gen también están modulados. En la presente memoria se describe que la 121P2A3 tiene un perfil de expresión particular en relación al cáncer. Los tránscritos alternativos y las variantes de empalme de la 121P2A3 también pueden estar involucradas en cánceres en el mismo o en diferentes tejidos, sirviendo por tanto como marcadores/antígenos asociados al cáncer.

La composición de exones del tránscrito original, designado como 121P2A3 v.1, es muestra en la Tabla LIII. Usando las secuencias génicas y EST de longitud completa, se identificó una variante de tránscrito, designada 121P2A3 v.2. En comparación con la 121P2A3 v.1, la variante de tránscrito 121P2A3 v.2 tiene un exón 2 más corto, tal como se muestra en la Figura 12. Todos los demás exones son iguales a los correspondientes en la 121P2A3 v.1. En teoría, cada combinación diferente de exones en un orden espacial, por ejemplo exones 2 y 3, es una variante de empalme potencial. La Figura 12 muestra el alineamiento esquemático de los exones de las dos variantes de tránscrito.

La Tabla LIV muestra la secuencia de nucleótidos de la variante de tránscrito. La Tabla LV muestra el alineamiento de la variante de tránscrito con la secuencia de ácido nucleico de la 121P2A3 v.1. La Tabla LVI establece la traducción de aminoácidos de la variante de tránscrito para la orientación de marco de lectura identificada. La Tabla LVII presenta alineamientos de la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de empalme con la de la 121P2A3 v.1.

Ejemplo 6 Polimorfismos de Nucleótido Sencillo de 121P2A3

Un Polimorfismo de Nucleótido Sencillo (SNP) es una variación de un solo par base en la secuencia de nucleótidos en una localización específica. En cualquier punto dado del genoma, existen cuatro posibles pares base de nucleótido: A/T, C/G, G/C y T/A. El genotipo se refiere a la secuencia de pares base específica de una o más localizaciones en el genoma de un individuo. Haplotipo se refiere a la secuencia de pares base de más de una localización en la misma molécula de ADN (o en el mismo cromosoma en organismos superiores), a menudo en el contexto de un gen o en el contexto de varios genes íntimamente ligados. Los SNPs que se producen en un ADNc de denominan SNPcs. Dichos SNPcs pueden cambiar aminoácidos de la proteína codificada por el gen y de este modo cambiar las funciones de la proteína. Algunos SNPs son la causa de enfermedades hereditarias; otros contribuyen a variaciones cuantitativas en el fenotipo y a reacciones frente a factores ambientales que incluyen la dieta y los fármacos entre individuos. Por tanto, los SNPs y/o las combinaciones de alelos (llamadas haplotipos) tienen muchas aplicaciones, incluyendo la diagnosis de enfermedades hereditarias, la determinación de reacciones a fármacos y su posología, la identificación de genes responsables de enfermedades, y el análisis de la relación genética entre individuos (P. Nowotny, J. M. Kwon y A. M. Goate, "SNP analysis to dissect human traits", Curr. Opin. Neurobiol. Octubre 2001, 11(5): 637-641, M. Pirmohamed y B. K. Park, "Genetic susceptibility to adverse drug reactions", Trends Pharmacol. Sci. junio 2001, 22(6): 298-305; J. H. Riley, C. J. Allan, E. Lai y A. Roses, "The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes", Pharmacogenomics, Febrero 2000, 1(1): 39-47; R. Judson, J. C. Stephens y A. Windemuth, "The predictive power of haplotypes in clinical response", Pharmacogenomics, febrero 2000, 1(1): 15-26).

Los SNPs se identifican por una serie de métodos aceptados en la técnica (P. Bean, "The promising voyage of SNP target discovery", Am. Clin. Lab. Oct-Nov de 2001, 20(9): 18-20; K. M. Weiss, "In search of human variation", Genome Res. Julio de 1998, 8(7): 691-697; M. M. She, "Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies", Clin. Chem. Febrero de 2001, 47(2): 164-172). Por ejemplo, los SNPs se identifican secuenciando fragmentos de AND que muestran polimorfismo mediante métodos basados en gel tales como el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) y la electroforesis de gradiente de gel desnaturalizante (DGGE). También pueden descubrirse mediante secuenciamiento directo de muestras de ADN reunidas a partir de individuos diferentes o comparando secuencias de diferentes muestras de ADN. Con la rápida acumulación de datos de secuencias en bases de datos públicas y privadas, uno puede descubrir SNPs comparando secuencias mediante el uso de programas de ordenador (Z. Gu, L. Hillier y P. Y. Kwok, "Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace", Hum. Mutat. 1998, 12(4): 221-225). Los SNPs pueden verificarse y se puede determinar el genotipo o haplotipo de un individuo mediante una serie de métodos que incluyen el secuenciamiento directo y microsistemas de alto rendimiento (P. Y. Kwok, "Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms", Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001, 2: 235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moyniban, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines y A. Duesterhoeft,
"High-throughput SNP genotyping with the Masscode system", Mol. Diagn. Diciembre de 2000, 5(4): 329-340).

Usando los métodos descritos anteriormente, se identificaron siete SNPs en el tránscrito original, 121P2A3 v.1, en las posiciones 345 (C/G), 469 (G/A), 511 (A/C), 1175 (T/C), 1307 (A/T), 1478 (A/G) y 1911 (T/C). Los tránscritos o proteínas con alelos alternativos fueron designados como variantes 121P2A3 v.3, v.4, v.5, v.6, v.7, v.8 y v.9. La Figura 10 y la Figura 12 muestran el alineamiento esquemático de las variantes de nucleótidos. La Figura 11 muestra el alineamiento esquemático de variantes de proteína, correspondiente a variantes de nucleótidos. Las variantes de nucleótido que codifican para la misma secuencia de aminoácidos de la variante 1 no se muestran en la Figura 11. Estos alelos de los SNPs, aunque mostrados aquí por separado, pueden existir en diferentes combinaciones (haplotipos) y una cualquiera de las variantes de tránscrito (tal como 121P2A3 v.2) que contenga el contexto de secuencia de los SNPs. La Figura 4A y la Tabla LVIII muestran los alineamientos de secuencia detallados de las proteínas variantes; las localizaciones de las variantes están sombreadas.

Ejemplo 7 Producción de 121P2A3 Recombinante en Sistemas Procarióticos

Para expresar 121P2A3 recombinante y las variantes recombinantes de 121P2A3 en células procarióticas, se clonan las secuencias de ADNc de longitud completa o parcial de la 121P2A3 y de la variante de 121P2A3 en uno cualquiera de una serie de vectores de expresión conocidos en la técnica. Se expresan una o más de las siguientes regiones de variantes de la 121P2A3: la secuencia de longitud completa presentada en las Figuras 2 y 3, o cualesquier 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ó más aminoácidos contiguos de la 121P2A3, de sus variantes o análogos.

A. Transcripción in vitro y construcciones de traducción

pCRII: Para generar sondas de ARN sentido y antisentido de 121P2A3 para investigaciones in situ de ARN, se generan construcciones pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA) que codifican todo el ADNc, o un fragmento, de la 121P2A3. El vector pCRII tiene promotores Sp6 y T7 flanqueando el injerto para conducir la transcripción de ARN de 121P2A3 para su uso como sonda en experimentos de hibridación in situ de ARN. Estas sondas se usan para analizar la expresión en células y tejidos de 121P2A3 a nivel de ARN. El ARN de 121P2A3 trascrito que representa la región codificadora de aminoácidos de ADNc del gen 121P2A3 se usa en sistemas de traducción in vitro tales como el Sistema TnT^{TM} Coupled Reticulolysate (Promega, Corp., Madison, WI) para sintetizar proteína 121P2A3.

B. Construcciones Bacterianas

Construcciones pGEX: Para generar proteínas 121P2A3 recombinantes en bacterias se están fusionadas con la proteína Glutationa S-transferasa (GST), se clona la secuencia codificadora de proteína de ADNc de 121P2A3, por completo o en parte, en la familia pGEX de vectores de fusión GST (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Estas construcciones permiten una expresión controlada de secuencias de proteína 121P2A3 recombinante con GST fusionada en el extremo amino y en un epítopo de seis histidinas (6X His) en el extremo carboxilo. Las etiquetas GST y 6X His permiten la purificación de la proteína de fusión recombinante a partir de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteína de fusión con anticuerpos anti-GST y anti-His. La etiqueta 6X His se genera añadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonación en el extremo 3', por ejemplo, del marco de lectura abierta (ORF). Se puede emplear un sitio de ruptura proteolítica, tal como el sitio de reconocimiento PreScission^{TM} en el pGEX-6P-1, de tal modo que permita la ruptura de la etiqueta GST de la proteína relacionada con 121P2A3. El gen de resistencia a ampicilina y el origen pBR322 permiten la selección y el mantenimiento de los plásmidos pGEX en E. coli.

Construcciones pMAL: Para generar, en bacterias, proteínas 121P2A3 recombinantes que estén fusionadas a la proteína de unión de maltosa (MBP), se fusiona toda o parte de la secuencia codificadora de la proteína de ADNc de 121P2A3 al gen MBP mediante clonación en los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X (New England Biolabs, Beverly, MA). Estas construcciones permiten la expresión controlada de secuencias de proteína 121P2A3 recombinantes con MBP fusionada en el extremo amino y una etiqueta de epítopo 6X His en el extremo carboxilo. Las etiquetas GST y 6X His permiten la purificación de la proteína de fusión recombinante a partir de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteína de fusión con anticuerpos anti-GST y anti-His. La etiqueta de epítopo 6X His se genera añadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonación 3'. Un sitio de reconocimiento Factor Xa permite la ruptura de la etiqueta pMAL de 121P2A\cdot. Los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X se optimizan para expresar la proteína recombinante en el citoplasma o en el periplasma, respectivamente. La expresión en el periplasma potencia el plegamiento de proteínas con enlaces de disulfuro.

Construcciones pET: Para expresar 121P2A3 en células bacterianas, toda o parte de la secuencia codificadora de proteína de ADNc de 121P2A3 se clona en la familia pET de vectores (Novagen, Madison, WI). Estos vectores permiten una expresión estrechamente controlada de proteína 121P2A3 recombinante en bacterias con y sin fusión a proteínas que potencien la solubilidad, tal como NusA y tiorredoxina (Trx), y etiquetas de epítopo, tal como 6X His y S-Tag^{TM}, que ayudan a la purificación y a la detección de la proteína recombinante. Por ejemplo, las construcciones de fabrican utilizando el sistema de fusión NusA de pET 43.1 de tal modo que las regiones de la proteína 121P2A3 son expresadas como fusiones amino-terminales para NusA.

C. Construcciones de Levaduras

Construcciones pESC: Para expresar 121P2A3 en la especie de levadura Saccharomyces cerevisiae para la generación de proteína recombinante y para estudios funcionales, toda o parte de la secuencia codificadora de proteína de ADNc de 121P2A3 se clona en la familia pESC de vectores, que contiene cada uno de ellos 1 de 4 marcadores seleccionables, HIS3, TRP1, LEU2 y URA3 (Stratagene, La Jolla, CA). Estos vectores permiten una expresión controlada a partir del mismo plásmido de hasta 2 genes diferentes o de secuencias clonadas que contienen las etiquetas de epítopo Flag^{TM} o Myc en la misma célula de levadura. Este sistema es útil para confirmar las interacciones proteína-proteína de la 121P2A3. Además, la expresión en levaduras produce modificaciones post-traducción similares, tal como glicosilaciones y fosforilaciones, que se dan cuando se expresan en células eucarióticas.

Construcciones pESP: Para expresar 121P2A3 en la especie de levadura Saccharomyces pombe, toda o parte de la secuencia codificadora de proteína de ADNc de 121P2A3 se clona en la familia pESP de vectores. Estos vectores permiten un alto nivel controlado de expresión de una secuencia de proteína 121P2A3 que está fusionada en el extremo amino o en el extremo carboxilo con GST, lo que ayuda en la purificación de la proteína recombinante. Una etiqueta de epítopo Flag^{TM} permite la detección de la proteína recombinante con anticuerpos anti-Flag^{TM}.

Ejemplo 8 Producción de 121P2A3 Recombinante en Sistemas Eucarióticos A. Construcciones de Mamíferos

Para expresar 121P2A3 recombinante en células eucarióticas, las secuencias de longitud completa o parcial de ADNc de 121P2A3 pueden clonarse en uno cualquiera de una serie de vectores de expresión conocidos en la técnica. Una o más de las siguientes regiones de 121P2A3 son expresadas en estas construcciones, los aminoácidos 1 a 464 de la 121P2A3 v.1, v.3, v.4, v.6, v.7 y v.8, los aminoácidos 1 a 295 de la 121P2A3 v.2, o cualesquier 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 o más aminoácidos contiguos de la 121P2A3, sus variantes o sus análogos. En determinadas realizaciones, se expresa una región de una variante específica de 121P2A3 que codifica un aminoácido en una posición específica que difiere del aminoácido de cualquier otra variante que se dé en esa posición. En otras realizaciones, se expresa una región de una variante de 121P2A3 que recae parcial o totalmente dentro de una secuencia que es única para dicha variante.

Las construcciones pueden ser transfectadas en una cualquiera de una amplia variedad de células de mamífero, tal como en células 293 T. Los lisatos de células 293T transfectadas pueden ser probados con el suero policlonal anti-121P2A3 descrito en la presente memoria.

Construcciones pADNc4/HisMax: Para expresar 121P2A3 en células de mamíferos, se clona un ORF de 121P2A3, o porciones del mismo, en pADNc4/HisMax versión A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de proteína está conducida por el promotor de citomegalovirus (CMV) y el potenciador de traducción SP 16. La proteína recombinante tiene epítopos Xpress^{TM} y de seis histidinas (6X His) fusionados en el extremo amino. El vector pADNc4/HisMax también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para potenciar la estabilidad del ARNm junto con el origen SV 40 para replicación episomal y rescate de vector sencillo en las líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a zeocina permite la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli.

Construcciones pADNc3.1/MycHis: Para expresar 121P2A3 en células de mamíferos, se clona un ORF de
121P2A3, o porciones del mismo, con un sitio de traducción Kozak de consenso en pADNc3.1/MycHis versión A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de proteína es conducida por el promotor de citomegalovirus (CMV). La proteína recombinante tiene el epítopo myc y el epítopo 6X His fusionados al extremo carbonilo. El vector pADNc3.1/Mochis también contiene la señal de poliadenilación de hormona del crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para potenciar la estabilidad del ARNm, junto con el origen SV 40 para la replicación episomal y el rescate de vector sencillo en las líneas celulares que expresan el antígeno T grande. Se usó el gen de resistencia a Neomicina, ya que permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampicilina, y el origen ColE1 permite la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. Los resultados de expresión de la construcción 121P2A3.pADNc3.1/Mochis se muestran en la Figura 21.

Construcción pADNc3.1/CT-GFP-TOPO: Para expresar 121P2A3 en células de mamíferos y para permitir la detección de las proteínas recombinantes usando fluorescencia, se clona un ORF de 121P2A3, o porciones del mismo, con un sitio de inicio de la traducción Kozak de consenso en pADNc3.1/CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA). La expresión de proteína está conducida por el promotor de citomegalovirus (CMV). Las proteínas recombinantes tienen la Proteína Fluorescente Verde (GFP) fusionada al extremo carboxilo, lo que facilita la detección no invasiva in vivo y los estudios de biología celular. El vector pADNc3.1/CT-GFP-TOPO también contiene la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para potenciar la estabilidad del ARNm, junto con el origen SV40 para replicación episomal y rescate de vector sencillo en líneas celulares que expresan antígeno T grande. El gen de resistencia a Neomicina permite la selección de células de mamífero que expresen la proteína, y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. Se fabrican construcciones adicionales con una fusión GFP amino-terminal en la pADNc3.1/NT-GFP-TOPO ampliando la longitud completa de una proteína 121P2A3.

PAPtag: Se clona un ORF de 121P2A3, o porciones del mismo, en pAPtag-5 (GenHunter Corp., Nashville, TN). Esta construcción genera una fusión de fosfatasa alcalina en el extremo carboxilo de una proteína 121P2A3 a la vez que fusiona la secuencia señal IgGk con el extremo amino. También se generan construcciones en las que se fusiona fosfatasa alcalina que tiene una secuencia señal IgGk amino-terminal con el extremo amino de una proteína 121P2A3. Las proteínas recombinantes 121P2A3 resultantes están optimizadas para la secreción al medio de células de mamífero transfectadas, y pueden usarse para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con las proteínas 121P2A3. La expresión de proteína está conducida por el promotor CMV y las proteínas recombinantes también contienen epítopos myc y 6X His fusionados en el extremo carboxilo, lo que facilita la detección y la purificación. El gen de resistencia a Zeocina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína recombinante, y el gen de resistencia a ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.

ptag5: Se clona un ORF de 121P2A3, o porciones del mismo, en pTag-5. Este vector es similar al pAPtag pero sin la fusión de fosfatasa alcalina. Esta construcción genera proteína 121P2A3 con una secuencia señal IgGk amino-terminal y etiquetas de epítopo myc y 6X His en el extremo carboxilo que facilitan la detección y la purificación por afinidad. La proteína 121P2A3 recombinante resultante está optimizada para la secreción en el medio de células de mamífero transfectadas, y se usa como inmunógeno o ligando para identificar proteínas tales como los ligandos o receptores que interactúan con las proteínas 121P2A3. La expresión de proteína está conducida por el promotor CMV. El gen de resistencia a Zeocina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.

PsecFc: Se clona un ORF de 121P2A3, o porciones del mismo, en psecFc. El vector psecFc se ensambló mediante clonación de inmunoglobulina humana GI (IgG) Fc (regiones bisagra, CH_{2}, CH_{3}) en pSecTag2 (Invitrogen, California). Esta construcción genera una fusión IgG1 Fc en el extremo carboxilo de las proteínas 121P2A3, a la vez que fusiona la secuencia señal IgGK al extremo N. También se usan las fusiones 121P2A3 que utilizan la región IgG1 Fc murina. Las proteínas 121P2A3 recombinantes resultantes están optimizadas para la secreción en el medio de células de mamífero transfectadas, y pueden usarse como inmunógenos o para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con proteína 121P2A3. La expresión de proteína está conducida por el promotor CMV. El gen de resistencia a higromicina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína recombinante, y el gen de resistencia de ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.

Construcciones pSR\alpha: Para generar líneas celulares de mamífero que expresen 121P2A3 constitutivamente, se clona ORF de 121P2A3, o porciones del mismo, en construcciones pSR\alpha. Se generan virus anfotrópicos y ecotrópicos mediante transfección de construcciones pSR\alpha en la línea de empaquetamiento 293T-10A1 o mediante cotransfección de pSR\alpha y un plásmido colaborador (que contiene secuencias de empaquetamiento eliminadas) en las células 293, respectivamente. El retrovirus se usa para infectar una serie de líneas celulares de mamífero, lo que da como resultado la integración del gen clonado, 121P2A3, en las líneas celulares anfitrionas. La expresión de proteína está conducida por una repetición terminal larga (LTR). El gen de resistencia a Neomicina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. Por lo tanto, se pueden usar los vectores retrovirales para la infección y generación de varias líneas celulares usando, por ejemplo, células PC3, NIH 3T3, TsuPrl, 293 ó rat-1.

Se fabrican otras construcciones adicionales pSR\alpha que fusionan una etiqueta de epítopo como la etiqueta FLAG^{TM} al extremo carboxilo de las secuencias 121P2A3 para permitir la detección usando anticuerpos anti-Flag. Por ejemplo, la secuencia FLAG^{TM} 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' se añade al cebador de clonación en el extremo 3' del ORF. Se fabrican otras construcciones pSR\alpha adicionales para producir proteínas de fusión GFP y myc/6X His amino-terminales y carboxilo-terminales de las proteínas 121P2A3 de longitud completa.

Vectores Víricos Adicionales: Se fabrican construcciones adicionales para la administración y expresión de
121P2A3 mediada por virus. Se alcanza un elevado título de virus que conduce a un alto nivel de expresión de 121P2A3 en los sistemas de administración vírica tales como los vectores adenovirales y los vectores de ampliación de herpes. Se amplifica mediante PCR una secuencia codificadora de 121P2A3, o sus fragmentos, y se subclona en el vector lanzadera AdEasy (Stratagene). La recombinación y el empaquetamiento de virus se llevan a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante para generar vectores adenovirales. Alternativamente, las secuencias codificadoras de 121P2A3, o sus fragmentos, son clonadas en el vector HSV-1 (Imgenex) para generar vectores víricos de herpes. Los vectores víricos son usados, por tanto, para la infección de varias líneas celulares tales como las células PC3, NIH 3T3, 293 ó rat-1.

Sistemas de Expresión Regulada: Para controlar la expresión de 121P2A3 en células de mamíferos, se clonan secuencias codificadoras de 121P2A3, o porciones de las mismas, en sistemas de expresión regulada de mamíferos tales como el Sistema T-Rex (Invitrogen), el Sistema GeneSwitch (Invitrogen) y el Sistema altamente regulado Ecdysone (Stratagene). Estos sistemas permiten el estudio de los efectos dependientes del tiempo y de la concentración de la 121P2A3 recombinante. Estos vectores, por tanto, son usados para controlar la expresión de 121P2A3 en varias líneas celulares, tales como células PC3, NIH 3T3, 293 ó rat-1.

B. Sistemas de Expresión de Baculovirus

Para generar proteínas 121P2A3 recombinantes en un sistema de expresión de baculovirus, se clona ORF de 121P2A3, o porciones del mismo, en el vector de transferencia de baculovirus pBlueBac 4.5 (Invitrogen), que proporciona una etiqueta His-tag en el extremo N. Específicamente, se cotransfecta pBlueBac-121P2A3 con plásmido colaborador pBac-N-Blue (Invitrogen) en células de insecto SF9 (Spodoptera frugiperda) para generar baculovirus recombinante (véase el manual de instrucciones de Invitrogen para más detalles). A continuación se recoge el baculovirus del sobrenadante celular y se purifica mediante ensayo de placas.

A continuación se genera proteína 121P2A3 recombinante mediante infección de células de insecto HighFive (Invitrogen) con baculovirus purificado. La proteína 121P2A3 recombinante puede detectarse usando anticuerpos anti-121P2A3 o anti-His-tag. La proteína 121P2A3 puede purificarse y usarse en varios ensayos basados en células o como inmunógeno para generar anticuerpos policlonales y monoclonales específicos para 121P2A3.

Ejemplo 9 Perfiles de Antigenicidad y Estructura Secundaria

La Figura 5, la Figura 6, la Figura 7, la Figura 8 y la Figura 9 muestran gráficamente cinco perfiles de aminoácidos de las variantes 1 y 2 de 121P2A3, disponibles accediendo a la página web de ProtScale (URL www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) en el servidor de biología molecular ExPasy.

Los siguientes perfiles: Figura 5, Hidrofilicidad, (Hopp T.P., Woods K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828); Figura 6, Hidropaticidad, (Kyte J., Doolittle R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132); Figura 7, Porcentaje de Residuos Accesibles (Janin J., 1979 Nature 277: 491-492); Figura 8, Flexibilidad Media, (Bhaskaran R. y Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255); Figura 9, Giro Beta (Deleage G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1: 289-294); y opcionalmente otros disponibles en la técnica, tales como los de la página web de ProtScale, fueron usados para identificar regiones antigénicas de la proteína 121P2A3. Todos los anteriores perfiles de aminoácidos de la 121P2A3 fueron generados usando los siguientes parámetros de ProtScale para el análisis: 1) Un tamaño de ventana de 9; 2) 100% en peso de los bordes de ventana en comparación con el centro de ventana; y 3) valores de perfil de aminoácidos normalizados para estar entre 0 y 1.

Los perfiles de Hidrofilicidad (Figura 5), Hidropaticidad (Figura 6) y Porcentaje de Residuos Accesibles (Figura 7) se usaron para determinar los tramos de aminoácidos hidrofílicos (es decir, valores mayores de 0,5 en el perfil de Hidrofilicidad y de Porcentaje de Residuos Accesibles, y valores inferiores a 0,5 en el perfil de Hidropaticidad). Dichas regiones son propensas a estar expuestas al entorno acuoso, a disponerse en la superficie de la proteína, y por tanto de forma disponible para un reconocimiento inmune, tal como el realizado por anticuerpos.

Los perfiles de Flexibilidad Media (Figura 8) y Giro Beta (Figura 9) determinan los tramos de aminoácidos (a saber, los de valores superiores a 0,5 en el perfil de Giro Beta y en el perfil de Flexibilidad Media) que no están incorporados a estructuras secundarias tales como láminas beta y hélices alfa. Dichas regiones también son más propensas a quedar expuestas sobre la proteína y por tanto a ser accesibles al reconocimiento inmune, tal como el realizado por anticuerpos.

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Las secuencias antigénicas de la proteína 121P2A3 indicadas, por ejemplo, mediante los perfiles establecidos en la Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8 y/o Figura 9 se usan para preparar inmunógenos, tanto péptidos como los ácidos nucleicos que los codifican, para generar anticuerpos anti-121P2A3 terapéuticos y diagnósticos. El inmunógeno pueden ser cualesquier 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ó más de 50 aminoácidos contiguos, o los correspondientes ácidos nucleicos que los codifican, de la proteína 121P2A3 o de las variantes enumeradas en las Figuras 2 y 3. En particular, los inmunógenos de péptido pueden comprender una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor superior a 0,5 en el perfil de Hidrofilicidad de la Figura 5; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor inferior a 0,5 en el perfil de Hidropaticidad de la Figura 6; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor superior a 0,5 en el perfil de Porcentaje de Residuos Accesibles de la Figura 7; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor superior a 0,5 en el perfil de Flexibilidad Media de la Figura 8; y una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor superior a 0,5 en el perfil de Giro Beta de la Figura 9. Los inmunógenos
peptídicos también pueden comprender ácidos nucleicos que codifiquen cualquiera de los anteriores.

Todos los inmunógenos, péptidos o ácidos nucleicos, pueden incorporarse en una forma de dosis unitaria humana, o pueden estar incorporados a una composición que incluye un excipiente farmacéutico compatible con la fisiología humana.

La estructura secundaria de la proteína 121P2A3, a saber la presencia y localización predichas de las hélices alfa, las cadenas extendidas y las bobinas aleatorias, se predice a partir de la secuencia de aminoácidos primaria usando el método HNN - Red Neural Jerárquica (Guermeur, 1997, URL pbil.ibcp.fr/cgi-bin/nosa_automat.pl?page=npsa_nn.
html), a la que se accede a través del servidor de biología molecular ExPasy (URL www.expasy.ch/tools/). El análisis indica que la proteína 121P2A3 está compuesta de un 63,79% de hélice alfa, un 4,74% de cadena extendida y un 31,47% de bobina aleatoria (Figura 13).

El análisis para determinar la presencia potencial de dominios transmembrana en las proteínas variantes de
121P2A3 se llevó a cabo usando una serie de algoritmos de predicción de transmembrana a los que se accede a través del servidor de biología molecular ExPasy (URL www.expasy.ch/tools/). Los programas no predicen la presencia de dominios transmembrana en la proteína 121P2A3, lo que sugiere que se trata de una proteína soluble.

Ejemplo 10 Generación de Anticuerpos Policlonales de 121P2A3

Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectará en el mamífero a través de múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. Además de inmunizar con una variante de proteína 121P2A3 de longitud completa, se emplean algoritmos de ordenador para diseñar los inmunógenos que, en base al análisis de secuencia de aminoácidos, contienen las características de ser antigénicos y de estar disponibles para el reconocimiento por el sistema inmune del anfitrión inmunizado (véase el Ejemplo titulado "Perfiles de Antigenicidad"). Se predice que dichas regiones son hidrofílicas, flexibles, en conformaciones de giro beta, y que están expuestas sobre la superficie de la proteína (véase, por ejemplo, la Figura 5, la Figura 6, la Figura 7, la Figura 8 ó la Figura 9 para los perfiles de aminoácidos que indican dichas regiones de proteína 121P2A3).

Por ejemplo, se usan proteínas o péptidos de fusión bacterianos recombinantes que contienen regiones hidrofílicas, flexibles, de giro beta de la proteína 121P2A3 como antígenos para generar anticuerpos policlonales en conejos Blancos de Nueva Zelanda. Por ejemplo, dichas regiones incluyen, aunque sin limitación, los aminoácidos 1-38, los aminoácidos 97-12, los aminoácidos 213-238 y los aminoácidos 284-330. Es útil conjugar el agente inmunizante con una proteína que se sabe es inmunogénica en el mamífero que se está inmunizando. Los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas incluyen, aunque sin limitación, la hemocianina de lapa de cerradura (KLH), la albúmina de suero, la tiroglobulina bovina y el inhibidor de tripsina de semilla de soja. En una realización, se conjuga un péptido que codifica los aminoácidos 1-38 de la variante 1 de 121P2A3 con KLH y se usa para inmunizar al conejo. Alternativamente, el agente inmunizante puede incluir las proteínas variantes de 121P2A3, sus análogos o sus proteínas de fusión, enteras o una parte de las mismas. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la variante 1 de 121P2A3 puede fusionarse usando técnicas recombinantes de ADN con una cualquiera de una serie de parejas proteínicas de fusión bien conocidas en la técnica, tales como las proteínas de fusión de glutationa-S-transferasa (GST) y la marcada con HIS. Dichas proteínas de fusión se purifican a partir de bacterias inducidas usando la matriz de afinidad apropiada.

En una realización, se produce, se purifica y se usa como inmunógeno una proteína de fusión GST que codifica los aminoácidos 1-150 de la variante 1 de 121P2A3. Otras proteínas de fusión bacterianas recombinantes que pueden ser usadas incluyen la proteína de unión de maltosa, LacZ, tiorredoxina, NusA o una región constante de inmunoglobulina (véase la sección titulada "Production of 121P2A3 in Prokaryotic Systems" y Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubul y col., editores, 1995; Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damie, N., y Ledbetter, L. (1991) J. Exp. Med. 174, 561-566).

Además de las proteínas de fusión derivadas de bacterias, también se pueden usar antígenos de proteínas expresadas en mamíferos. Dichos antígenos se expresan a partir de vectores de expresión de mamíferos tales como los vectores Tag5 y Fc-fusion (véase la sección titulada "Production of Recombinant 121P2A3 in Eukaryotic Systems"), y mantienen modificaciones post-traducción tales como las glicosilaciones que se dan en la proteína nativa. En una realización, los aminoácidos 1-464 de la variante 1 se clonan en el vector de secreción de mamífero Tag5. La proteína recombinante se purifica mediante cromatografía de quelato metálico a partir de sobrenadantes de cultivos de tejidos de células 293T que expresan de forma estable el vector recombinante. La proteína 121P2A3 Tag5 purificada se usa a continuación como inmunógeno.

Durante el protocolo de inmunización, es útil mezclar o emulsificar el antígeno con adyuvantes que potencien la respuesta inmune del animal anfitrión. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, aunque sin limitación, el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorinomicolato trehalosa sintética).

En un protocolo típico, los conejos son inmunizados inicialmente subcutáneamente con hasta 200 \mug, normalmente de 100 a 200 \mug, de proteína o péptido de fusión conjugado con KLH mezclado en adyuvante completo de Freund (CFA). A continuación se inyecta a los ratones subcutáneamente cada dos semanas con hasta 200 \mug, normalmente de 100 a 200 \mug, del inmunógeno en adyuvante incompleto de Freund (IFA). Se toman muestras de sangre aproximadamente a los 7-10 días después de cada inmunización y se usan para monitorizar el título de antisuero mediante ELISA.

Para evaluar la reactividad y la especificidad del suero inmune, tal como el suero de conejo derivado de la inmunización con la proteína 121P2A3 - Tag5, se clona ADNc de 121P2A3 de longitud completa en vector de expresión pADNc3.1 myc-his (Invitrogen, véase el Ejemplo titulado "Production of Recombinant 121P2A3 in Eukaryotic Systems"). Después de la transfección de las construcciones en células 293T, se prueban los lisatos celulares con el suero anti-121P2A3 y con anticuerpos anti-His (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) para determinar la reactividad específica con la proteína 121P2A3 desnaturalizada usando la técnica de transferencia Western. La Figura 21 muestra la expresión de variante 1 de 121P2A3 marcada con epítopo Myc His en células 293T detectada mediante un anticuerpo anti-His. Adicionalmente, se evalúa el suero inmune mediante microscopía de fluorescencia, citometría de flujo e inmunoprecipitación contra 293T y otras células que expresan 121P2A3 recombinante para determinar el reconocimiento específico de la proteína nativa. También se llevan a cabo técnicas de transferencia Western, inmunoprecipitación, microscopía fluorescente y citometría de flujo usando células que expresan 121P2A3 endógenamente para evaluar la reactividad y la especificidad.

Se purifica antisuero de conejos inmunizados con proteínas de fusión de variantes de 121P2A3, tales como proteínas de fusión GST y MBP, mediante agotamiento de anticuerpos reactivos a la secuencia pareja de fusión mediante pasaje sobre una columna de afinidad que contiene la pareja de fusión sola o en el contexto de una proteína de fusión irrelevante. Por ejemplo, primero se purifica antisuero derivado de una proteína de fusión variante 1 de 121P2A3 - GST que codifica los aminoácidos 1-150 mediante pasaje a través de una columna de proteína GST acoplada covalentemente a matriz AffiGel (BioRad, Hercules, California). A continuación el antisuero es purificado por afinidad mediante pasaje a través de una columna compuesta por una proteína de fusión MBP que también codifica los aminoácidos 1-150 acoplada covalentemente a matriz Affigel. A continuación se purifica el suero mediante cromatografía de afinidad de proteína G para aislar la fracción IgG. Los sueros de otros conejos inmunizados con antígenos y péptidos marcados con His, así como los sueros agotados en pareja de fusión, son purificados por afinidad mediante pasaje a través de una matriz de columna compuesta por el inmunógeno proteico o el péptido libre originales.

Ejemplo 11 Generación de Anticuerpos Monoclonales (mAbs) de 121P2A3

En una realización, los mAbs de variantes de 121P2A3 comprenden aquellos que reaccionan con epítopos específicos para cada proteína variante o específicos para las secuencias comunes entre las variantes que afectarían o modularían la función biológica de las variantes de 121P2A3, por ejemplo aquellas que afectarían a la interacción con ligandos y parejas de unión. Los inmunógenos para la generación de dichos mAbs incluye aquellos diseñados para codificar o contener la secuencia de proteína variante de 121P2A3 entera, regiones de las variantes de proteína 121P2A3 predichas como antigénicas a partir de un análisis por ordenador de la secuencia de aminoácidos (véase, por ejemplo, la Figura 5, la Figura 6, la Figura 7, la Figura 8 o la Figura 9, y el Ejemplo titulado "Perfiles de Antigenicidad"). Los inmunógenos incluyen péptidos, proteínas bacterianas recombinantes y proteínas Tag 5 expresadas en mamíferos y proteínas de fusión IgG FC humanas y murinas. Además, se usan células diseñadas para expresar altos niveles de una variante de 121P2A3 dada, tal como células Pre-B de murina 293T-variante 1 de 121P2A3 ó 300.19-variante 1 de 121P2A3, para inmunizar ratones.

Para generar mAbs de una variante de 121P2A3, en primer lugar se inmunizan los ratones intraperitonealmente (IP) con, normalmente, 10-50 \mug de inmunógeno proteico o con 10^{7} células que expresan 121P2A3 mezcladas en adyuvante completo de Freund. A continuación se inmunizan los ratones IP cada 2-4 semanas con, normalmente, 10-50 \mug de inmunógeno proteico o con 10^{7} células mezcladas en adyuvante incompleto de Freund. Alternativamente, se usa adyuvante MPL-TDM en las inmunizaciones. Además de las anteriores estrategias de inmunización basadas en proteínas y células, se emplea un protocolo de inmunización basado en ADN en el que se usa un vector de expresión de mamífero que codifica una secuencia de variante de 121P2A3 para inmunizar ratones mediante inyección directa del ADN plásmido. Por ejemplo, se clonan los aminoácidos 1-464 en el vector de secreción de mamífero Tag5 y se usa el vector recombinante como inmunógeno. En otro ejemplo, se clonan los mismos aminoácidos en un vector de secreción Fc-fusión en el que la secuencia de variante 1 de 121P2A3 se fusiona al extremo amino de una secuencia directora IgK y al extremo carboxilo de la secuencia codificadora de la región de IgG Fc humana o murina. Este vector recombinante se usa a continuación como inmunógeno. Se usan los protocolos de inmunización de plásmido en combinación con proteínas purificadas expresadas a partir del mismo vector y con células que expresan la correspondiente variante de 121P2A3.

Durante el protocolo de inmunización, se toman muestras de sangrado a los 7-10 días después de la inyección para monitorizar el título y la especificidad de la respuesta inmune. Una vez que se obtiene la reactividad y especificidad apropiadas, según se determina mediante análisis ELISA, de transferencia Western, de inmunoprecipitación, de microscopía de fluorescencia y de citometría de flujo, se lleva a cabo entonces la fusión y la generación de hibridoma empleando procedimientos establecidos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane,
1988).

En una realización para generar anticuerpos monoclonales de 121P2A3, se expresa y se purifica un antígeno Tag5 -variante 1 de 121P2A3, que codifica los aminoácidos 1-464, a partir de células 293T transfectadas de forma estable. Inicialmente se inmunizan ratones Balb C intraperitonealmente con 25 \mug de la proteína Tag5 - variante 1 de 121P2A3 mezclada en adyuvante completo de Freund. Posteriormente los ratones son inmunizados cada dos semanas con 25 \mug del antígeno mezclado en adyuvante incompleto de Freund para un total de tres inmunizaciones. La técnica ELISA usando el antígeno Tag5 determina el título de suero de ratones inmunizados. Se monitoriza la reactividad y la especificidad de suero respecto a la proteína de longitud completa variante 1 de 121P2A3 mediante transferencia Western, inmunoprecipitación y citometría de flujo usando células 293T transfectadas con un vector de expresión que codifica el ADNc de variante 1 de 121P2A3 (veáse por ejemplo el Ejemplo titulado "Production of Recombinant 121P2A3 in Eukaryotic Systems" y la Figura 21). También se usan otras células que expresan variante 1 de 121P2A3 recombinante u otras células que expresan endógenamente variante 1 de 121P2A3. Los ratones que muestran la reactividad más fuerte se dejan reposar y se les administra una inyección final de antígeno Tag5 en PBS, y entonces se sacrifican cuatro días después. Se extraen los bazos de los ratones sacrificados y se fusionan a células de mieloma SPO/2 usando procedimientos estándares (Harlow y Lane, 1988). Los sobrenadantes de pocillos HAT de cultivos seleccionados son escrutados mediante ELISA, análisis de transferencia Western, inmunoprecipitación, microscopía fluorescente y citometría de flujo para identificar clones que producen anticuerpos específicos
para 121P2A3.

La afinidad de unión de un anticuerpo monoclonal de 121P2A3 se determina usando tecnologías estándares. Las medidas de afinidad cuantifican la fortaleza de la unión de anticuerpo a epítopo y se usan para ayudar a definir que anticuerpos monoclonales de 121P2A3 son preferibles para uso diagnóstico o terapéutico, como podría apreciar un especialista en la técnica. El sistema BIAcore (Uppsala, Suecia) es un método preferido para determinar la afinidad de unión. El sistema BIAcore usa la resonancia de plasmón superficial (SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23: 1; Morton y Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268) para monitorizar interacciones biomoleculares en tiempo real. El análisis BIAcore genera convenientemente las constantes de velocidad de asociación, las constantes de velocidad de disociación, las constantes de equilibrio de disociación y las constantes de
afinidad.

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Ejemplo 12 Uso diagnóstico de Anticuerpos Anti-121P2A3 en Humanos

Los anticuerpos monoclonales anti-121P2A3 se usan de forma segura y eficaz con fines diagnósticos, profilácticos y/o pronósticos en humanos. Los análisis de transferencia Western e inmunohistoquímicos de tejidos de cáncer y de xenoinjertos de cáncer con mAb anti-121P2A3 muestran una fuerte tinción extensiva en el carcinoma, pero niveles significativamente menores o indetectables en tejidos normales. La detección de 121P2A3 en el carcinoma y en la enfermedad metastásica demuestra la utilidad de los mAb como indicadores diagnósticos y/o pronósticos. Por tanto, se usan anticuerpos anti-121P2A3 en aplicaciones diagnósticas tales como la inmunohistoquímica de especímenes de biopsia de riñón para detectar cáncer en pacientes sospechosos.

Tal como se determina mediante citometría de flujo, los mAb anti-121P2A3 se unen específicamente a las células de carcinoma. Por tanto, se usan los anticuerpos anti-121P2A3 en aplicaciones diagnósticas de imagen de cuerpo completo, tales como la radioinmunocintigrafía y la radioinmunoterapia (véase, por ejemplo, Potamianos S., y col., Anticancer Res 20(2A): 925-948 (2000)) para la detección de cánceres localizados o metastáticos que presentan expresión de 121P2A3. La liberación de un dominio extracelular de 121P2A3 al medio extracelular, tal como la observada para la fosfodiesterasa alcalina B10 (Meerson, N. R., Hepatology 27: 563-568 (1998)), permite la detección diagnóstica de 121P2A3 mediante anticuerpos anti-121P2A3 en muestras de suero y/u orina de los pacientes sospechosos.

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Ejemplo 13 Ensayos Clínicos en Humanos para la Diagnosis de Carcinomas Humanos mediante el uso de Anticuerpos Anti-121P2A3 Humanos In vivo

De acuerdo con la presente invención, se usan anticuerpos que reconocen un epítopo sobre 121P2A3, y se usan en el tratamiento de determinados tumores tales como los descritos en la Tabla I. En base a una serie de factores, que incluyen los niveles de expresión de 121P2A3, los tumores como los presentados en la Tabla I son actualmente las indicaciones preferidas.

A través de la unión de un radionucleótido (por ejemplo, yodo o itrio (^{131}I, ^{98}Y)) a anticuerpos de 121P2A3, los anticuerpos radiomarcados se utilizan como agente de diagnosis y/o de imagen. En dicha función, los anticuerpos marcados localizan tumores sólidos así como lesiones metastáticos de células que expresan 121P2A3. En relación al uso de los anticuerpos anti-121P2A3 como agentes de imagen, los anticuerpos se usan como adjuntos al tratamiento quirúrgico de los tumores sólidos, ya que se necesita una monitorización pre-quirúrgica y una de post-operatorio para determinar qué tumor permanece y/o regresa. En una realización, se usa un anticuerpo de 121P2A3 marcado con ^{111}In como agente de imagen en un ensayo clínico con humanos de Fase I con pacientes que tienen un carcinoma que expresa 121P2A3 (por analogía véase, por ejemplo, Divgi y col. J. Natl. Cancer Inst. 83: 97-104 (1991)). Se realiza un seguimiento de los pacientes con cámara gamma estándar anterior y posterior. Los resultados indican que se identifican lesiones primarias y lesiones metastáticas.

Dosis y Ruta de Administración

Como apreciarán los especialistas en la técnica, las consideraciones de dosificación se pueden determinar a través de la comparación con productos análogos que existen en la clínica. De este modo, se pueden administrar anticuerpos anti-121P2A3 con dosis en el intervalo de 5 a 400 mg/m^{2}, usándose las dosis más bajas, por ejemplo, en relación a estudios de seguridad. La afinidad de anticuerpos anti-121P2A3 relativa a la afinidad de un anticuerpo conocido para su diana es un parámetro usado por los especialistas en la técnica para determinar regímenes análogos de dosis. Además, los anticuerpos anti-121P2A3 que son anticuerpos completamente humanos, en comparación con los anticuerpos quiméricos, presentan una eliminación más lenta; por consiguiente, la dosis en pacientes con dichos anticuerpos anti-121P2A3 completamente humanos puede ser menor, quizás en el intervalo de 50 a 300 mg/m^{2}, y aún así seguir siendo eficaz. La dosis en mg/m^{2}, en contraposición a la medida convencional de la dosis en mg/kg, es una medida basada en el área superficial y es una medida de dosis adecuada que está diseñada para incluir pacientes de todos los tamaños, desde niños a adultos.

Tres estrategias de administración distintas son útiles para la administración de anticuerpos anti-121P2A3. La administración intravenosa convencional es una técnica estándar de administración para muchos tumores. Sin embargo, en relación a tumores en la cavidad peritoneal, tales como los tumores de ovarios, del conducto biliar, de otros conductos, y similares, la administración intraperitoneal puede resultar favorable para obtener una alta dosis de anticuerpos en el tumor y también para minimizar la eliminación de anticuerpos. De un modo similar, determinados tumores sólidos poseen una vasculatura que es apropiada para la perfusión regional. La perfusión regional permite una elevada dosis de anticuerpos en el sitio del tumor y minimiza la eliminación a corto plazo de los anticuerpos.

Plan de Desarrollo Clínico (PDC)

Visión general: el PDC sigue y desarrolla tratamientos de anticuerpos anti-121P2A3 como agentes de imagen. Los ensayos demuestran inicialmente la seguridad y después confirman la eficacia en dosis repetidas. Los ensayos son quimioterapia estándar de comparación de marca abierta con terapia estándar más anticuerpos anti-121P2A3. Como puede apreciarse, un criterio que puede usarse en relación al reclutamiento de pacientes es el nivel de expresión de 121P2A3 en sus tumores, determinado mediante biopsia.

Como con cualquier terapia basada en infusión de proteínas o anticuerpos, los temas de seguridad se refieren principalmente a (i) el síndrome de liberación de citoquina, es decir, hipotensión, fiebre, temblores, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (es decir, desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente frente al anticuerpo terapéutico, o respuesta HAHA); y (iii) toxicidad de células normales que expresan 121P2A3. Se utilizan ensayos estándares y seguimientos para monitorizar todos estos aspectos de seguridad. Se ha descubierto que los anticuerpos anti-121P2A3 son seguros para la administración en humanos.

Ejemplo 14 Ensayo Clínico en Humanos: Imagen Diagnóstica con Anticuerpos Anti-121P2A3

Por tanto, como la terapia adjunta discutida anteriormente es segura dentro de los criterios de seguritos discutidos anteriormente, se lleva a cabo un ensayo clínico con humanos en relación al uso de anticuerpos anti-121P2A3 como agente de imagen diagnóstica. El protocolo se diseña de un modo sustancialmente similar a los descritos en la técnica, tal como en Divgi y col., J. Natl. Cancer Inst. 83: 97-104 (1991). Se ha descubierto que los anticuerpos son seguros y eficaces cuando se usan como una modalidad diagnóstica.

La luminiscencia de la reacción se sigue con un luminómetro. Además, la proteína 121P2A3 contiene varias posiciones de fosforilación (Tabla XX), lo que indica su asociación con cascadas de señalización específicas.

Los mecanismos de señalización activados por la 121P2A3 son mapeados y usados para la identificación y validación de dianas terapéuticas. Cuando la 121P2A3 está implicada en la señalización celular, se usa como diana con fines diagnósticos, pronósticos, preventivos y terapéuticos.

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Ejemplo 15 Implicación en la Progresión Tumoral

El gen 121P2A3 puede contribuir al crecimiento de las células cancerosas. El papel del 121P2A3 en el crecimiento tumoral se investiga en una serie de líneas celulares primarias y transfectadas que incluyen líneas celulares de próstata, colon, vejiga y riñón, así como células NIH 3T3 diseñadas para expresar de forma estable 121P2A3. Las células parenterales que carecen de 121P2A3 y las células que expresan 121P2A3 son evaluadas para determinar el crecimiento celular usando un ensayo de proliferación bien documentado (Fraser SP, Grimes JA, Djamgoz MB. Prostate. 2000, 44: 61, Jonson DE, Ochieng J, Evans SL. Anticancer Drugs. 1996, 7: 288).

Para determinar la función de la 121P2A3 en los procesos de transformación, se investiga su efecto en ensayos de formación de colonia. Las células NIH 3T3 parenterales que carecen de 121P2A3 son comparadas con las células NHI 3T3 que expresan 121P2A3, usando un ensayo de agar suave en condiciones restrictivas y más permisivas (Song Z, y col. Cancer Res. 2000; 60: 6730).

Para determinar la función de la 121P2A3 en la invasión y en la metástasis de las células cancerosas, se usa un ensayo bien establecido, por ejemplo, el ensayo de Transwell Insert System (Becton Dickinson) (Cancer Res. 1999; 59: 6010). Se comparan las células que expresan 121P2A3 con células de control, que incluyen líneas celulares de próstata, colon, vejiga y riñón que carecen de 121P2A3. Las células se cargan con el colorante fluorescente, calceína, y se colocan en el pocillo superior del injerto Transwell recubierto con una base de análogo de membrana. La invasión se determina mediante fluorescencia de las células en la cámara inferior referida a la fluorescencia de toda la población celular.

La 121P2A3 también desempeña un papel en el ciclo celular y en la apoptosis. Se comparan células parenterales y células que expresan 121P2A3 para determinar diferencias en la regulación del ciclo celular usando un ensayo BrdU bien establecido (Andel-Malek ZA. J Cell Physiol. 1988, 136: 247). Resumiendo, las células son cultivadas en condiciones óptimas (suero completo) y limitantes (suero bajo), a continuación son marcadas con BrdU y teñidas con anti-BrdU Ab y yoduro de propidio. Las células son analizadas para determinar la entrada en las fases G1, S y G2M del ciclo celular. Alternativamente, se evalúa el efecto de estrés en la apoptosis en células parenterales de control y en células que expresan 121P2A3, incluyendo células normales y tumorales de próstata, colon y pulmón. Las células modificadas y las parenterales son tratadas con diversos agentes quimioterapéuticos, tales como etopósido, flutamida, etc., y con inhibidores de la síntesis proteica, tales como la cicloheximida. Las células son teñidas con anexina V-FITC y se mide la muerte celular mediante análisis FACS. La modulación de la muerte celular mediante 121P2A3 puede desempeñar un papel crítico en la regulación de la progresión tumoral y de la carga de tumor.

Cuando la 121P2A3 desempeña un papel en el crecimiento, transformación, invasión o apoptosis de las células, se usa como diana con fines diagnósticos o pronósticos.

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Ejemplo 16 Implicación en la Angiogénesis

La angiogénesis o formación de nuevos vasos sanguíneos capilares es necesaria para el crecimiento del tumor (Hanahan D, Folkman J. Cell. 1996, 86: 353; Folkman J. Endocrinology. 1998, 139: 441). Se han desarrollado varios ensayos para medir la angiogénesis in vitro e in vivo, tales como los ensayos de cultivo de tejidos de formación de tubo celular endotelial y de proliferación celular endotelial. Usando estos ensayos, así como la neo-vascularización in vitro, se determina si la 121P2A3 potencia o inhibe la angiogénesis.

Por ejemplo, las células endoteliales diseñadas para expresar 121P2A3 se evalúan usando ensayos de formación y proliferación de tubo. El efecto de la 121P2A3 también se puede evaluar en modelos animales in vivo. Por ejemplo, se implantan células que expresan o que carecen de 121P2A3 subcutáneamente en ratones inmunocomprometidos. Se evalúa la migración celular endotelial y la angiogénesis 5-15 días después usando técnicas de inmunohistoquímica. Cuando la 121P2A3 afecta a la angiogénesis, se usa como diana con fines diagnósticos o pronósticos.

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Ejemplo 17 Regulación de la Transcripción

La localización de 121P2A3 en el núcleo y su similitud con NAF-1 indican que la 121P2A3 desempeña una función en la regulación transcripcional de genes eucarióticos. Se evalúa la regulación de la expresión génica, por ejemplo, estudiando la expresión génica en células que expresan o que carecen de 121P2A3. Para este propósito, se llevan a cabo dos tipos de experimentos.

En la primera tanda de experimentos, se extrae ARN de células parenterales y de células que expresan 121P2A3 y se hibrida con conjuntos de genes disponibles comercialmente (Clontech) (Smid-Koopman E, y col., Br J Cancer. 2000, 83: 246). Se comparan células en reposo con células tratadas con FBS o andrógenos. Los genes expresados diferencialmente son identificados de acuerdo a procedimientos conocidos en la técnica. Los genes expresados diferencialmente son mapeados a continuación a mecanismos biológicos (Chen K y col. Thyroil. 2001. 11: 41).

En la segunda tanda de experimentos, se evalúa la activación de mecanismo transcripcional específico usando construcciones informadoras de luciferasa disponibles comercialmente (Stratagene), que incluyen: NFkB-luc, SRE-luc, ELK1-luc, ARE-luc, p53-luc y CRE-luc. Estos informadores transcripcionales contienen posiciones de unión de consenso para factores de transcripción conocidas que se encuentran por debajo de los mecanismos de transducción de señal bien caracterizados, y representan una buena herramienta para establecer la activación del mecanismo y para monitorizar moduladores positivos y negativos de la activación del mecanismo.

Cuando la 121P2A3 desempeña un papel en la regulación de genes, se usa como diana con fines diagnósticos o pronósticos.

Ejemplo 18 Implicación en la Adhesión Celular

La adhesión celular desempeña un papel crítico en la colonización y en la metástasis de tejidos. En base a su homología con CLIP-190, la 121P2A3 puede participar en la organización celular, y como consecuencia en la adhesión y movilidad celulares. Para determinar que la 121P2A3 regula la adhesión celular, se comparan células de control que carecen de 121P2A3 con células que expresan 121P2A3, usando técnicas descritas previamente (véase, por ejemplo, Haier y col., Br. J. Cancer. 1999, 80: 1867; Lehr y Pienta, J. Natl. Cancer Inst. 1998, 90: 118). Resumiendo, en una realización, se incuban células marcadas con un indicador fluorescente, tal como calceína, en pocillos de cultivo de tejido recubiertos solo con medio o con proteínas de matriz. Las células adherentes son detectadas mediante análisis fluorimétrico y se calcula el porcentaje de adhesión. En otra realización, las células que carecen o que expresan 121P2A3 son analizadas para determinar su capacidad para mediar en la adhesión célula-célula usando técnicas experimentales similares a las descritas anteriormente. Ambos sistemas experimentales se usan para identificar proteínas, anticuerpos y/o pequeñas moléculas que modulan la adhesión celular a la matriz extracelular y la interacción célula-célula. Puesto que la adhesión desempeña un papel crucial en el crecimiento, progresión y colonización del tumor, cuando la 121P2A3 está implicada en dicho proceso sirve como modalidad para diagnosis, prevención y terapia.

Ejemplo 19 Implicación de 121P2A3 en el Tráfico de Proteínas

Debido a su similitud con CLIP-190, la 121P2A3 puede regular el tráfico intracelular. El tráfico de proteínas puede estudiarse usando métodos bien establecidos (Valetti C, y col. Mol Biol Cell. 1999, 10: 4107). Por ejemplo, la \alpha2-macroglobulina conjugada a FITC se incuba con células que expresan 121P2A3 y con células negativas en 121P2A3. La localización y la captación de FITC-\alpha2-macroglobulina se visualizan usando un microscopio fluorescente. En otro conjunto de experimentos, se evalúa la co-localización de 121P2A3 con proteínas vesiculares mediante técnicas de co-precipitación y de transferencia Western y mediante microscopía fluorescente.

Alternativamente, células que expresan 121P2A3 y células que carecen de 121P2A3 son comparadas usando albúmina de suero bovino marcada con bodipy-ceramide (Huber L. y col., Mol. Cell. Biol. 1995, 15: 918). Resumiendo, se deja que las células ingieran el BSA marcado y se colocan intermitentemente a 4ºC y a 18ºC para permitir que se produzca el tráfico. Las células son examinadas mediante microscopía fluorescente a diferentes tiempos para determinar la presencia de BSA marcado en los compartimentos vesiculares específicos, que incluyen Golgi, retículo endoplasmático, etc. En otra realización, se examina el efecto de la 121P2A3 sobre el transporte a través de la membrana usando complejos de biotina-avidina. Se incuban temporalmente con biotina células que expresan o que carecen de 121P2A3. Las células son llevadas a 4ºC o son calentadas temporalmente hasta 37ºC durante varios periodos de tiempo. Las células se fraccionan y se examinan mediante precipitación de afinidad de avidita para determinar la presencia de biotina en compartimentos celulares específicos. Usando dichos sistemas de ensayo, se identifican proteínas, anticuerpos y pequeñas moléculas que modifican el efecto de la 121P2A3 sobre el transporte vesicular. Cuando la 121P2A3 desempeña un papel en el tráfico intracelular, la 121P2A3 es una diana para fines diagnósticos o pronósticos.

Ejemplo 20 Asociación Proteína-Proteína

Se ha demostrado que la proteína Naf-1 homóloga a 121P2A3 interacciona con otras proteínas, formando con ello un complejo proteico que puede regular la división celular, la transcripción génica y la transformación celular (Renkema GH y col., Curr Biol. 1999; 9: 1407; Baur AS y col., Immunity. 1997, 6: 283; Karakesisoglou I, Yang Y, Fuchs E. J Cell Biol. 2000, 149: 195). Usando técnicas de inmunoprecipitación y dos sistemas híbridos de levaduras, se identifican las proteínas que se asocian a la 121P2A3. Los inmunoprecipitados de las células que expresan 121P2A3 y de las células que carecen de 121P2A3 son comparados para determinar asociaciones proteína-proteína específicas.

Se llevan a cabo estudios para determinar si la 121P2A3 se asocia a moléculas efectoras, tales como las proteínas adaptadoras y las proteínas que contienen SH2. Los estudios que comparan células positivas en 121P2A3 y células negativas en 121P2A3, así como los estudios que comparan células no estimuladas/en reposo y células tratadas con activadores celulares epiteliales, tales como citoquinas, factores de crecimiento, andrógenos y Ab anti-integrina, revelan interacciones únicas. Además, se estudian las interacciones proteína-proteína usando la metodología de dos híbridos de levadura (Curr Opin Chem Biol. 1999, 3: 64). Se introduce un vector que porta una biblioteca de proteínas fusionadas al dominio de activación de un factor de transcripción en levadura que expresa proteína de fusión de dominio de unión de ADN-121P2A3 y una construcción informadora. La interacción proteína-proteína es detectada a través de la actividad calorimétrica del informador. La asociación específica con moléculas efectoras y factores de transcripción indica el modo de acción de la 121P2A3, y por tanto identifica dianas terapéuticas, preventivas y/o diagnósticas para el cáncer. Este ensayo, y otros similares, también pueden usarse para identificar y escrutar moléculas pequeñas que interactúen con 121P2A3.

Cuando la 121P2A3 se asocia con proteínas o moléculas pequeñas, se usa como diana con fines diagnósticos o pronósticos.

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TABLA I Tejidos que Expresan 121P2A3 Cuando son Cancerígenos

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\bullet

Próstata

\bullet

Vejiga

\bullet

Riñón

\bullet

Colon

\bullet

Pulmón

\bullet

Ovario

\bullet

Pecho

\bullet

Estómago

\bullet

Recto

\bullet

Páncreas

\bullet

Testículos

\bullet

Cerebro

\bullet

Hueso

\bullet

Cerviz

TABLA II Abreviaturas de Aminoácidos

1

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TABLA III Composiciones de exones de 121P2A3 v.1

2

TABLA IV Secuencia de nucleótidos de la variante de tránscrito 121P2A3 v.2

3

TABLA V Alineamiento de secuencia de nucleótidos de la 121P1F1 v.1 y la 121P2A3 v.2

4

5

6

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TABLA VI Secuencias de péptidos de proteína codificadas por 121P2A3 v.2

7

TABLA VII Alineamiento de secuencia de aminoácidos de la 121P1F1 v.1 y la 121P2A3 v.2

8

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TABLA VIII Alineamiento de secuencia de aminoácidos de las variantes de 121P2A3 (las variantes 5 y 9 presentan la misma secuencia que la variante 1)

9

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Claims (3)

1. Un método para diagnosticar cáncer en una muestra de ensayo de próstata o colon, que comprende:

poner en contacto la muestra de ensayo con un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo que se una específicamente a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la mostrada en la Figura 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F ó 3G, y que no se una a un péptido o a una proteína que (a) no presenta una secuencia de aminoácidos idéntica a la mostrada en la Figura 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F ó 3G, o (b) no es un fragmento de una secuencia mostrada en la Figura 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F ó 3G;

determinar el nivel de expresión de la proteína en la muestra de ensayo; y

comparar el nivel determinado de ese modo con el nivel de expresión de la proteína en una muestra normal correspondiente;

en donde un aumento del nivel de expresión de la proteína en la muestra de ensayo respecto a la muestra normal indica la presencia de cáncer.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se marca con un marcador detectable.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el marcador detectable es un isótopo radiactivo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un quelante de metales o una enzima.