ES2315239T3 - Molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una hemocianina, y al menos una secuencia de intron. - Google Patents
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Abstract
Molécula de ácido nucleico, que comprende (i) una secuencia que codifica una hemocianina, un dominio de hemocianina o una variante según la reivindicación 1 (c) (ii) y al menos una secuencia de intrón, en donde la secuencia de ácido nucleico se selecciona de: (a) secuencias de ácido nucleico que se seleccionan del grupo de las secuencias de ADN dadas a continuación o de sus secuencias de ARN correspondientes, o que las contienen: SEC ID Nº: 9 (dominio b de HtH2 parcial) SEC ID Nº: 10 (dominio c de HtH2), SEC ID Nº: 11 (dominio d de HtH2), SEC ID Nº: 12 (dominio e de HtH2), SEC ID Nº: 13 (dominio f de HtH2), SEC ID Nº: 14 (dominio g de HtH2), SEC ID Nº: 15 (dominio h de HtH2), SEC ID Nº: 20 (dominio b de KLH2), SEC ID Nº: 21 (dominio c de KLH2), SEC ID Nº: 22 (dominio d de KLH2 parcial), SEC ID Nº: 23 (dominio g de KLH2), SEC ID Nº: 24 (dominio h de KLH2 parcial), SEC ID Nº: 50 (dominio a de HtH2 parcial), SEC ID Nº: 51 (dominio b'' de HtH2), SEC ID Nº: 52 (dominio d'' de HtH2), SEC ID Nº: 53 (dominio e'' de HtH2), SEC ID Nº: 57 (dominio b'' de KLH2), SEC ID Nº: 58 (dominio c'' de KLH2), SEC ID Nº: 59 (dominio d'' de KLH2), SEC ID Nº: 60 (dominio e de KLH2), SEC ID Nº: 61 (dominio f de KLH2), SEC ID Nº: 62 (dominio g'' de KLH2), SEC ID Nº: 88 (dominio a" de HtH2 parcial), SEC ID Nº: 89 (dominio b" de HtH2), SEC ID Nº: 90 (dominio c" de HtH2), SEC ID Nº: 91 (dominio d" de HtH2), SEC ID Nº: 92 (dominio e" de HtH2), SEC ID Nº: 93 (dominio f'' de HtH2), SEC ID Nº: 94 (dominio g" de HtH2), SEC ID Nº: 95 (dominio h" de HtH2), SEC ID Nº: 102 (dominio b" de KLH2), SEC ID Nº: 103 (dominio c" de KLH2), SEC ID Nº: 104 (dominio d" de KLH2), SEC ID Nº: 105 (dominio e" de KLH2), SEC ID Nº: 106 (dominio f'' de KLH2), SEC ID Nº: 107 (dominio g" de KLH2), SEC ID Nº: 108 (dominio h" de KLH2 parcial), SEC ID Nº: 157 (dominio a de KLH2 completa); (b)...
Description
Molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de ácido nucleico que codifica una hemocianina, y al
menos una secuencia de intrón.
La presente invención se refiere a una molécula
de ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácido nucleico
que codifica una hemocianina o un dominio de hemocianina, con al
menos una secuencia de intrón, construcciones que comprenden tales
moléculas de ácido nucleico, las secuencias de ácido nucleico o las
células huésped que comprenden construcciones, a procedimientos
para la preparación de polipéptidos de hemocianina y polipéptidos
de hemocianina recombinante. Las formas de realización de la
invención se definen en las reivindicaciones.
La hemocianina es una proteína de cobre azul,
que está presente libremente disuelta en la sangre de múltiples
moluscos y artrópodos y transporta el oxígeno. Entre los moluscos,
los cefalópodos, quitones, la mayor parte de los gasterópodos así
como algunos bivalvos, contienen hemocianina. En los artrópodos la
hemocianina es típica en arácnidos, xifosuros, crustáceos
malacostracos y Scutigera. Múltiples especies de insectos
presentan proteínas que se derivan de hemocianina. Las hemocianinas
están presentes fuera de la célula y flotan en la hemolinfa.
Mientras que la hemocianina de artrópodos en
estudio por microscopio electrónico tiene un diámetro máximo de 25
nm y una subunidad presenta un peso molecular de 75.000 Da, las
cianinas de moluscos son mucho mayores. Así por ejemplo la
hemocianina de Megathura tiene un diámetro de 35 nm y está
constituida por 2 subunidades. Cada subunidad tiene un peso
molecular de aproximadamente 400.000 Da y esta dividida en ocho
dominios que se unen a oxígeno, que tienen respectivamente un peso
molecular de aproximadamente 50.000 Da. Los dominios se diferencian
inmunológicamente. Estos dominios se pueden desprender de la
subunidad con proteolisis
limitada.
limitada.
La hemocianina de gasterópodos visible en el
microscopio electrónico tiene un peso molecular de aproximadamente
8 millones de Da y es un di-decámero. Por el
contrario la hemocianina de cefalópodos está dispuesta como decámero
aislado que se diferencia también en la estructura cuaternaria
claramente de la hemocianina de gasterópodos.
Es de especial interés inmunológico la
hemocianina de fisurela californiana Megathura crenulata, una
"Kayhole Limpet". La hemocianina se designa por tanto también
como hemocianina de Keyhole Limpet (KLH). Las hemocianinas son
antígenos muy fuertes. La inmunización de un vertebrado conduce a
una activación inespecífica poco entendida hasta ahora del sistema
inmunológico. Con la activación general del sistema inmunológico es
entonces posible también conseguir una reacción inmune frente a
otras estructuras extrañas hasta ahora toleradas. La KLH se usa
sobre todo como vehículo de hapteno para conseguir así la formación
de anticuerpos frente al
hapteno.
hapteno.
Además de Megathura crenulata pertenece
también la oreja de mar Haliotis tuberculata al grupo
relativamente viejo, en lo que respecta a la evolución, de los
arqueogasterópodos. Se sabe que también Haliotis produce
hemocianina.
La KLH es una mezcla de dos hemocianinas
distintas que se designan KLH1 y KLH2. La diferencia de KLH1 es un
polipéptido de 390 kDa, que se compone de ocho dominios globulares
que se designan en correspondencia a una secuencia en la subunidad
1a a 1h. La KLH2 por el contrario presenta un peso molecular de 350
kDa y contiene igualmente según los datos más recientes 8 dominios
que se designan 2a a 2h. In vivo cada tipo de subunidad
forma homo-oligómeros mientras que no se observaron
hetero-oligómeros.
Mediante proteolisis limitada e
inmunoelectroforesis cruzada de la subunidad de KLH1 y KLH2 se
obtuvieron dominios con terminal amino, interno y carboxi, cuya
secuencia de terminal amino fue determinada (Söhngen y col., Eur.
J. Biochem. 248 (1997), 602-614; Gebauer y col.,
Zoology 98 (1994), 51-68). Las secuencias obtenidas
no permiten sin embargo el diseño de cebadores y/o sondas
específicos de la secuencia, que aseguren el éxito de una
hibridación con ADN genómico. Por tanto aunque ambos tipos de KLH se
conocen desde 1991 y/o 1994 no se pudo aclara hasta ahora
estructura primaria alguna.
Sobre el plano del ADN se conoce hasta ahora en
lo que respecta a moluscos sólo la secuencia de ADNc de la
subunidad de hemocianina de los cefalópodos Octopus dofleini
(Millar y col., J. Mol. Biol. 278 (1988), 827-842).
Octopus dofleini está filogenéticamente muy lejos de los
arqueogasterópodos. Hasta hoy en día no se conoce en general una
secuencia génica de hemocianina de moluscos.
Como se describe por parte de Miller y col.
véase anteriormente, es tan difícil aislar un dominio funcional
individual (unidad funcional = dominio; denominado "dominio
funcional") como también obtener tejido que sea adecuado para la
purificación de ARNm para la secuenciación de ADNc.
En el análisis de la hemocianina de Megathura
crenulata una dificultad adicional consiste en que animales de
ensayo deben haber alcanzado una edad de 4 a 8 años para poder
extraer su hemolinfa por primera vez. Tras la extracción de la
hemolinfa no se produce hemocianina en estos animales. Hasta ahora
no se sabe como se podría estimular la síntesis de hemocianina.
Adicionalmente la cría de Megathura es extraordinariamente
costosa ya que se requieren para tal fin recipientes de corriente
especiales.
Se plantea por tanto un objetivo de la presente
invención en cuanto a proporcionar agentes y mecanismos para poder
producir hemocianina y/o dominios de la misma en cantidad suficiente
y a buen coste. Esto comprende el objetivo adicional de facilitar
un procedimiento con el que se pueda preparar esta hemocianina.
Este objetivo se consigue de acuerdo con la
invención mediante
1. Una molécula de ácido nucleico, que comprende
una secuencia que codifica una hemocianina, un dominio de
hemocianina o un fragmento funcional de la misma, en donde la
secuencia de ácido nucleico se selecciona de:
- (a)
- secuencias de ácido nucleico que se seleccionan del grupo de las secuencias de ADN dadas a continuación o de sus secuencias de ARN correspondientes, o que las contienen:
- \quad
- SEC ID Nº: 9 (dominio b de HtH2 parcial)
- \quad
- SEC ID Nº: 10 (dominio c de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 11 (dominio d de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 12 (dominio e de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 13 (dominio f de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 14 (dominio g de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 15 (dominio h de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 20 (dominio b de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 21 (dominio c de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 22 (dominio d de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 23 (dominio g de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 24 (dominio h de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 50 (dominio a de HtH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 51 (dominio b' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 52 (dominio d' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 53 (dominio e' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 57 (dominio b' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 58 (dominio c' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 59 (dominio d' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 60 (dominio e de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 61 (dominio f de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 62 (dominio g' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 88 (dominio a'' de HtH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 89 (dominio b'' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 90 (dominio c'' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 91 (dominio d'' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 92 (dominio e'' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 93 (dominio f' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 94 (dominio g'' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 95 (dominio h'' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 102 (dominio b'' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 103 (dominio c'' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 104 (dominio d'' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 105 (dominio e'' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 106 (dominio f' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 107 (dominio g'' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 108 (dominio h'' de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 157 (dominio a de KLH2 completa),
\vskip1.000000\baselineskip
- (b)
- secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del siguiente grupo:
- \quad
- SEC ID Nº: 33 (dominio b de HtH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 34 (dominio c de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 35 (dominio d de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 36 (dominio e de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 37 (dominio f de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 38 (dominio g de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 39 (dominio h de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 44 (dominio b de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 45 (dominio c de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 46 (dominio d de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 47 (dominio g de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 48 (dominio h de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 65 (dominio a de HtH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 156 (dominio a de HtH2 completa),
- \quad
- SEC ID Nº: 66 (dominio b' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 67 (dominio d' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 68 (dominio e' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 74 (dominio b' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 75 (dominio c' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 76 (dominio d' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 77 (dominio e de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 78 (dominio f de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 79 (dominio g' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 158 (dominio h de KLH2 parcial).
\vskip1.000000\baselineskip
- (c)
- Secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos, que son al menos 60% idénticas a una secuencia de la forma de realización 1b, calculándose la identidad de secuencia en 90 aminoácidos.
2. Molécula de ácido nucleico según la forma de
realización 1, caracterizada porque la secuencia de intrón se
selecciona de:
- (i)
- secuencias de ácido nucleico que se seleccionan del grupo de las secuencias de ADN dadas a continuación o de las secuencias de ARN correspondientes, o que las contienen:
- \quad
- SEC ID Nº: 147 (intrón 2B/2C de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 148 (intrón 2C/2D de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 149 (intrón 2D/2E de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 150 (intrón 2E/2F de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 151 (intrón 2B/2C de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 152 (intrón 2F-2/2G de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 153 (intrón 2G-1/2G-2 de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 154 (intrón 2G-2/2G-3 de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 155 (intrón 2G/2H de KHL2);
\vskip1.000000\baselineskip
- (ii)
- secuencias de ácido nucleico, que se hibridan con la contrahebra de una secuencia de ácido nucleico según (i);
- (iii)
- secuencias de ácido nucleico que son idénticas al menos en el 60% con una de las secuencias de ácido nucleico dadas en (i);
- (iv)
- variantes de las secuencias dadas en (i) a (iii), en donde las variantes presentan frente a las secuencias dadas en (i) a (iii), adiciones, deleciones, inserciones o inversiones; y
- (v)
- combinaciones de varias de las secuencias de ADN dadas en (i) a (iv).
3. Molécula de ácido nucleico según una de las
formas de realización 1 y 2, caracterizada porque es una molécula
de ácido desoxirribonucleico.
4. Construcción que comprende una molécula de
ácido nucleico según una de las formas de realización 1 a 3.
5. Construcción según la forma de realización 4,
que comprende además uno de los promotores adecuados para el
control de expresión, en donde la secuencia de ácido nucleico que
codifica una hemocianina, un dominio de hemocianina o un fragmento
funcional de la misma se encuentra bajo el control del promotor.
6. Construcción según la forma de realización 4
ó 5, que comprende además una secuencia de ácido nucleico que
codifica un antígeno, que está unida directamente con la secuencia
de ácido nucleico que codifica una hemocianina, un dominio de
hemocianina o un fragmento funcional de la misma.
7. Construcción según la forma de realización 6,
en donde el antígeno se selecciona de: antígenos tumorales,
antígenos de virus y antígenos de agentes patógenos bacterianos o
parasitarios.
8. Construcción según una de las formas de
realización 4 a 7, en donde la construcción contiene al menos una
parte de un vector, en donde el vector se selecciona de:
bacteriófagos, andenovirus, virus de vacunas, baculovirus, virus
SV-40 y retrovirus.
9. Construcción según una de las formas de
realización 4 a 8, en donde la construcción comprende además una
secuencia de ácido nucleico que codifica His-Tag y
la expresión de la construcción conduce a la formación de una
proteína de fusión con un His-Tag.
10. Célula huésped, que contienen una
construcción según una de las formas de realización 4 a 9, en donde
la célula huésped es una célula procariótica o eucariótica adecuada
para la expresión de la construcción.
11. Célula huésped según la forma de realización
10, caracterizada porque la célula huésped procariótica se
selecciona de E. coli y Bacillus subtilis.
12. Célula huésped según la forma de realización
10, caracterizada porque la célula huésped eucariótica se
selecciona de células de levadura, células de plantas, células de
insectos y células de mamíferos, preferiblemente de células CHO,
células COS y células HeLa.
A continuación se aclaran más detalladamente
algunos términos para dejar claro como se deben entender en lo que
respecta a la presente solicitud.
El término "hemocianina", tal cual, como se
usa en lo sucesivo en la descripción, comprende hemocianina
completa, dominios de hemocianina y/o fragmentos, mutantes de
hemocianina y proteínas de fusión. En lo referente a las proteínas
de fusión están comprendidas particularmente aquellas en las que la
fusión comprende hemocianina y antígenos.
Con "dominios" se entienden secuencias
parciales funcionales de subunidades de hemocianina, que se pueden
separar unas de otras, por ejemplo, mediante proteolisis limitada.
Adicionalmente estas pueden presentar distintas propiedades
inmunológicas.
Con "propiedades inmunológicas de al menos un
dominio de hemocianina" se indica la propiedad de un polipéptido
para inducir, al igual que al menos un dominio de hemocianina, una
respuesta inmunológica del receptor que se inmuniza con el
polipéptido. Con "respuesta inmunológica" se entienden aquí
respuestas de células T y/o B frente a epítopos de hemocianina
como, por ejemplo, una producción de anticuerpos. La reacción
inmunológica se puede observar, por ejemplo, con inmunización de un
mamífero como, por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo con el
correspondiente polipéptido y comparación de la respuesta inmune
para el polipéptido usado para la inmunización con la respuesta
inmune para la hemocianina natural.
El término "secuencia de intrón" representa
tanto una secuencia intermedia en un gen eucariótico como también
la secuencia intermedia correspondiente en el transcripto de ARN.
La(s) secuencia(s) de intrón y la(s)
secuencia(s) de codificación se transcriben conjuntamente;
el transcripto de intrón o los transcriptos de intrón se separan
luego para obtener el ARN funcional.
El término "antígeno" comprende de acuerdo
con la invención tanto haptenos como también antígenos débiles y
fuertes. Haptenos se caracterizan porque se trata de sustancias de
bajo peso molecular (inferior a 4000 Da), pero que no pueden
desencadenar una reacción inmunológica sin acoplarse a una molécula
vehículo. Antígenos débiles son sustancias que pueden desencadenar
ya por sí mismas una reacción inmunológica, cuyo potencial puede
desencadenar una reacción inmunológica pudiendo aumentarse aún más
con acoplamiento con una molécula vehículo sobre planos de la
proteína y/o del ADN.
"His-Tag" significa una
secuencia de al menos 6 aminoácidos de histidina que conduce
mediante clonación y fusión correspondientes con una secuencia que
se puede expresar a una proteína de fusión con al menos 6 restos
His en el término NH_{2}, que se puede purificar fácilmente
mediante complejación con una columna de Ni^{2+}.
"Clonación" debe comprender todos los
procedimientos de clonación conocidos en el estado de la técnica que
podrían ser de utilidad en esta invención pero que no se describen
todos detalladamente ya que se sobreentiende pertenecen a las
habilidades del especialista en la técnica.
"Variantes" de un ácido nucleico comprenden
adiciones, deleciones, inserciones o inversiones y codificación de
un polipéptido que presenta las propiedades inmunológicas de al
menos un dominio de hemocianina. Las variantes pueden ser
artificiales o naturales. Un ejemplo de variantes naturales lo
representan las variantes alélicas.
Con "expresión recombinante en una célula
huésped adecuada" se deben entender procedimientos de expresión
conocidos en el estado de la técnica en sistemas de expresión
conocidos, que podrían ser de utilidad en esta invención pero que
no se describen todos detalladamente ya que se sobreentiende
pertenecen a las habilidades del especialista en la técnica.
La secuencia de ácido nucleico contenida en la
molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede ser
ADN genómico o ADN sintético, en donde con secuencias de ADN
sintético también se entienden aquellas que contienen enlaces
internucleosídicos modificados. Además las secuencias de ácido
nucleico pueden tratarse de secuencias de ARN que, por ejemplo, se
pueden requerir para la expresión mediante sistemas de vector
recombinantes. Las secuencias de ácido nucleico se pueden obtener,
por ejemplo, con uso de una sonda marcada detectable, que
corresponde a una de las secuencias dadas o a un fragmento o su
contrahebra, para el rastreo de bibliotecas de ADNc/ADN genómico de
moluscos o artrópodos. El ARNm en que se basa la biblioteca de ADNc
se obtiene preferiblemente de tejidos de moluscos que expresan
hemocianina de forma especialmente fuerte como, por ejemplo, tejido
de la envoltura de gasterópodos y tejidos de glándula branquial de
cefalópodos.
La identificación de clones de ADN genómicos
positivos se realiza según procedimientos convencionales. Véase,
Maniatis y col., Molecular Cloning (1989) Cold Spring Harbor
Laboratory Press.
Condiciones de hibridación estrictas son, por
ejemplo, 68ºC durante la noche en 0,5 x SSC; 1% de reactivo de
bloqueo (Boehringer Mannheim); 0,1% de laurilsarcosinato de sodio y
a continuación lavado con 2 x SSC, 0,1% de SDS.
En una forma de realización preferida adicional
se proporcionan secuencias de ácido nucleico que comprenden al
menos una secuencia de intrón, que es al menos un 60% homóloga con
una de las secuencias de ácido nucleico dadas en (i). Se prefiere
(o se prefieren) la(s) secuencia(s) de intrón al menos
80% homólogas con una de las secuencias de ácido nucleico dadas en
2(a). Se prefiere (o se prefieren) especialmente la(s)
secuencia(s) de intrón al menos 90% homólogas con una de las
secuencias de ácido nucleico dadas en 2(a). De forma
particular es (o son) la(s) secuencia(s)
de intrón al menos un 95% homólogas a una de las secuencias de ácido nucleico dadas en 2(a).
de intrón al menos un 95% homólogas a una de las secuencias de ácido nucleico dadas en 2(a).
De acuerdo con la invención la expresión
"homología" significa homología en el plano de ADN, que se
puede determinar según procedimientos conocidos, por ejemplo, de
comparación de secuencias asistida informáticamente (Basic local
alignment search tool, S.F. Altschul y col., J. Mol. Biol. 215
(1990), 403-410).
La expresión "homología" conocida por el
especialista en la técnica designa el grado de analogía entre dos o
más moléculas de ácido nucleico que se determina mediante la
concordancia entre las secuencias. El porcentaje de
"homología" resulta del porcentaje de regiones idénticas en dos
o más secuencias considerando huecos u otras particularidades de la
secuencia.
La homología de moléculas de ácido nucleico
análogas se puede determinar con ayuda de procedimientos conocidos.
Por lo general se usan programas informáticos especiales con
algoritmos que incluyen los requerimientos especiales de
cálculo.
Los procedimientos preferidos para la
determinación de la homología dan en primer lugar la mayor
concordancia entre las secuencias investigadas. Programas
informáticos para la determinación de la homología entre dos
secuencias comprenden, pero sin limitarse a estos, el programa GCG,
incluyendo GAP ((Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12
(12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin,
Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. y col., J.
Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). El programa BLAST X
de Nacional Centre for Biotechnology Information (NCBI) y al que se
refieren otras fuentes (BLAST Handbuch, Altschul S., y col., NCB
NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S. y col., J. Mol. Biol.
215:403-410 (1990)). También se puede usar el
algoritmo de Smith Waterman conocido para la determinación de
homología.
Parámetros preferidos para la comparación de
secuencias de ácido nucleico comprenden los siguientes:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol.
48:443-453 (1970).
Matriz de comparación: concordancia (matches) =
+ 10 no concordancia (mismatch) = 0
Valor de huecos (Gap Penalty): 50
Valor de longitud de huecos (Gap Lenght
Penalty): 3
El programa GAP es también adecuado para el uso
con los parámetros precedentes. Los parámetros precedentes son
parámetros de error (parámetros de defecto) para comparación de
secuencia de ácido nucleico.
Se pueden usar por ejemplo otros algoritmos,
valores de huecos-aberturas (gap opening penalties),
valores de extensión de huecos (gap extension penalties), matrices
de comparación incluyendo el Wisconsin-Paket en el
Programm-Handbuch, versión 9, Septiembre 1997,
conocidos. La elección depende de la comparación que se va a llevar
a cabo y además de si se lleva a cabo la comparación entre pares de
secuencias, en donde se prefieren GAP o Best Fit, o entre una
secuencia y una base de datos de secuencia extensa, en donde se
prefieren FASTA o BLAST.
Una concordancia determinada con el algoritmo
anteriormente citado del 60% se designa en el marco de esta
solicitud como 60% de homología. Esto es correspondientemente válido
para grados de homología superiores.
En una forma de realización preferida la
secuencia de ADN de acuerdo con la invención es una combinación de
varias de las secuencias de ADN dadas en (a) a (f) y al menos una
secuencia de intrón, que se pueden obtener con la fusión conocida
por el especialista en la técnica y dado el caso clonación. Estas
combinaciones son de especial interés ya que los polipéptidos
codificados de estas son especialmente inmunógenos. De forma
particular son combinaciones preferidas las que presentan varios o
todos los dominios en las sucesión (a a h) de origen natural en la
subunidad. Son especialmente preferidas a este respecto formas de
realización en las que las secuencias de ácido nucleico que
codifican los dominios están acopladas entre ellas directamente en
la retícula, después de que se hubiesen separado la secuencia de
intrón o las secuencias de intrón.
Adicionalmente se proporcionan construcciones
que comprenden las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la
invención. En una forma de realización preferida la construcción de
acuerdo con la invención comprende un promotor adecuado para la
expresión, en donde la secuencia de ácido nucleico se encuentra bajo
el control del promotor. La elección del promotor depende del
sistema de expresión usado para la expresión. En general se
prefieren promotores constitutivos sin embargo son posibles también
promotores inducibles como, por ejemplo, el promotor de
metalotioneína.
En una forma de realización preferida adicional
la construcción comprende además una secuencia de ácido nucleico
que codifica el antígeno, que está unida directamente con el ácido
nucleico de hemocianina de acuerdo con la invención. La secuencia
que codifica el antígeno puede estar dispuesta tanto en 5' como
también en 3' respecto a la secuencia de hemocianina o también en
ambos extremos. Esta se adiciona en el mismo marco de lectura bien
directamente en la secuencia de hemocianina o bien se une con ella
mediante un ligador de ácido nucleico sin perjuicio del marco de
lectura. Mediante la fusión de la secuencia que codifica el antígeno
con la secuencia de hemocianina se pretende la formación de una
proteína de fusión, uniéndose la secuencia que codifica el antígeno
de forma covalente con la secuencia de hemocianina. El antígeno de
acuerdo con la invención es a este respecto un antígeno
medicinalmente relevante que se selecciona, por ejemplo, de:
antígenos tumorales, antígenos de virus y antígenos de agentes
patógenos bacterianos o parasitarios. Los antígenos tumorales pueden
ser a este respecto, por ejemplo, Rb y p53. Preferiblemente los
antígenos de virus derivan de virus de importancia inmunológica
como, por ejemplo, virus de la gripe, virus de hepatitis y VIH.
Antígenos patógenos son, entre otros, aquellos que derivan de
patógenos de mamíferos, particularmente organismos patógenos humanos
como, por ejemplo, Plasmodium. Antígenos bacterianos pueden
derivarse, por ejemplo, de Klebsiella, Pseudomonas, E. coli,
Vibrio cholerae, Chlamydia, estreptococos o
estafilococos.
estafilococos.
En una forma de realización preferida adicional
la construcción comprende además al menos una parte de un vector,
de forma particular regiones regulatorias, en donde el vector se
selecciona de: bacteriófagos como derivados \lambda, adenovirus,
virus de vacunas, baculovirus, virus SV40 y retrovirus,
preferiblemente MoMuLV (virus de la Leucemia Murina de
Moloney).
Además se prefiere una construcción que
comprenda adicionalmente una secuencia de ADN que codifique
His-Tag, que con la expresión de la construcción
conduzca a la formación de una proteína de fusión con un
His-Tag en el término NH_{2} de la hemocianina,
que facilita la purificación de la proteína en una columna de níquel
mediante formación de quelato.
Adicionalmente la invención proporciona células
huésped que contienen la construcción y son adecuadas para la
expresión de la construcción. En el estado de la técnica se conocen
múltiples sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos como
E. coli o B. subtilis, de células eucarióticas como
células de levadura, células de plantas, células de insectos y
células de mamíferos, por ejemplo, células CHO, células COS o
células HeLa, así como derivados de las mismas. En el estado de la
técnica se conocen, por ejemplo, determinadas líneas de producción
de CHO, cuyos modelos de glicosilación están modificados en
comparación con las células CHO. La hemocianina obtenida con el uso
de células huésped con déficit de glicosilación o de glicosilación
reducida se encuentran disponibles posiblemente en epítopos
adicionales que de otro modo con glicosilación completa no se
podrían alcanzar el sistema inmunológico del receptor, de modo que
la hemocianina con glicosilación reducida presenta en determinadas
circunstancias una inmunogenicidad elevada. De las células de
plantas transformadas con la construcción de acuerdo con la
invención se pueden preparar plantas transgénicas o cultivos de
células de plantas que producen el polipéptido hemocianina, por
ejemplo, plantas o cultivos de células de plantas de tabaco,
patata, tomate, remolacha azucarera, soja, café, guisantes, habas,
colza, algodón, arroz o maíz.
Es además objeto de la presente invención un
procedimiento para la preparación de un polipéptido de hemocianina.
A tal fin se expresa la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la
invención y/o la construcción en una célula huésped adecuada y se
aísla la proteína de la célula huésped o del medio con
procedimientos habituales. Son formas de realización de la
invención.
13. Procedimiento para la preparación de un
polipéptido de hemocianina, en donde la molécula de ácido nucleico
según una de las formas de realización 1 a 3 y/o la construcción
según una de las formas de realización 4 a 9 se expresa en una
célula huésped adecuada y la proteína se aísla dado el caso.
14. Procedimiento según la forma de realización
13, caracterizado porque el polipéptido de hemocianina preparado se
modifica de forma natural o química.
15. Procedimiento según la forma de realización
14, caracterizado porque la modificación es una reticulación
transversal o un enlace covalente en un antígeno.
16. Procedimiento según una de las formas de
realización 13 a 15, caracterizado porque la expresión se lleva a
cabo en una célula huésped según una de las formas de realización 10
a 12.
Para el especialista en la técnica son conocidos
múltiples procedimientos para la expresión de secuencias de ADN,
véanse Recombinant Gene Expression Protocols in Methods in Molecular
Biology, tomo 62, Humana Press Totowa New Jersey (1995). La
expresión puede ser tanto constitutiva como también inducible,
siendo conocidos por el especialista en la técnica inductores como
por ejemplo IPTG y Zn^{2+}. La hemocianina preparada se pudo
fusionar en caso de una His-Tag en el término
NH_{2} de la hemocianina, purificándose mediante formación de
quelato en una columna de níquel. Se encuentran procedimientos para
la purificación de hemocianina, de forma particular KLH, en Harris
y col., Micron 26 (1995), 201-212. Preferiblemente
se purifica la hemocianina mediante cromatografía de intercambio de
iones y/o cromatografía de filtración en gel. La realización de
estas técnicas es conocida por el especialista en la técnica.
En una forma de realización preferida adicional
se modifica la hemocianina preparada de acuerdo con la invención.
Las modificaciones comprenden a este respecto la di-, oligo- y
polimerización del producto de partida monomérico, por ejemplo,
mediante reticulación transversal, por ejemplo, con
diciclohexilcarbodiimida o pegilación o asociación
(auto-ensamblaje). Los di-, oligo- y polímeros así
preparados se pueden separar unos de otros mediante filtración en
gel. De forma particular se pretende la formación de decámeros,
didecámeros o multi-decámeros. Otras modificaciones
comprenden modificaciones de cadenas laterales, por ejemplo, de
restos de \varepsilon-amino-lisina
de hemocianina, o modificaciones de terminales amino o carboxi. Es
particularmente preferida la modificación de la hemocianina
mediante enlace covalente a un antígeno, en donde el antígeno puede
hacerse reaccionar estequiométricamente o no estequiométricamente
con la hemocianina. El antígeno se selecciona preferiblemente de
antígenos tumorales, antígenos de virus y antígenos de agentes
patógenos como se indicó anteriormente. Otras modificaciones
comprenden resultados post-traduccionales, por
ejemplo, la glicosilación o la desglicosilación parcial o completa
de la
proteína.
proteína.
En una forma de realización preferida la
hemocianina obtenida con expresión recombinante en organismos
procarióticos u organismos eucarióticos con déficit de
glicosilación no está glicosilada. Con igual consideración se hace
referencia a hemocianina de acuerdo con la invención que está
glicosilada mediante expresión recombinante en organismos
eucarióticos con capacidad de glicosilación como células de
levadura, células de plantas, células de insectos o células de
mamíferos como células CHO o células HeLa.
En una forma de realización adicional se ponen a
disposición polipéptidos de hemocianina que comprenden una
secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos es
codificada por una o varias moléculas de ácido nucleico de acuerdo
con la invención:
17. Polipéptido de hemocianina, que comprende
una secuencia de aminoácido que es codificada por una o varias
moléculas de ácido nucleico según una de las formas de realización 1
a 3.
18. Polipéptido de hemocianina según la forma de
realización 17, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos
seleccionada del siguiente grupo:
- \quad
- SEC ID Nº: 33 (dominio b de HtH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 34 (dominio c de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 35 (dominio d de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 36 (dominio e de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 37 (dominio f de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 38 (dominio g de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 39 (dominio h de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 44 (dominio b de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 45 (dominio c de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 46 (dominio d de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 47 (dominio g de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 48 (dominio h de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 65 (dominio a de HtH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 156 (dominio a de HtH2 completo),
- \quad
- SEC ID Nº: 66 (dominio b' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 67 (dominio d' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 68 (dominio e' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 74 (dominio b' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 75 (dominio c' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 76 (dominio d' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 77 (dominio e de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 78 (dominio f de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 79 (dominio g' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 158 (dominio h de KLH2 parcial).
- \quad
- o
- (b)
- un polipéptido de hemocianina, cuya secuencia es en una región parcial de al menos 90 aminoácidos, al menos 60% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a).
19. Polipéptido de hemocianina recombinante, que
se puede obtener mediante el procedimiento según una de las formas
de realización 13 a 16 o modificaciones de las mismas, en donde las
modificaciones son
- a)
- di-, oligo- y polímeros del polipéptido de hemocianina que se puede obtener mediante el procedimiento de acuerdo con una de las formas de realización 13 a 16,
- b)
- modificaciones de cadenas laterales del mismo,
- c)
- proteínas de fusión, obtenidas mediante unión a un antígeno o
- d)
- polipéptidos, obtenidos mediante episodio post-traduccional.
20. Polipéptido de hemocianina recombinante
según la forma de realización 18, caracterizado porque el
polipéptido de hemocianina comprende bien las secuencias SEC ID Nº:
44 a 48 o bien las secuencias SEC ID Nº: 44 a 46, 77, 78, 47, 48 y
KLH2 es de Megathura crenulata, pudiendo estar reemplazada
respectivamente la secuencia SEC ID Nº 44 por SEC ID Nº: 74, SEC ID
Nº: 45 por SEC ID Nº: 75, SEC ID Nº: 46 por SEC ID Nº: 76 y/o SEC ID
Nº: 47 por SEC ID Nº: 79.
21. Polipéptido de hemocianina recombinante
según la forma de realización 17 a 20, caracterizado porque está
unido de forma covalente a virus, constituyentes de virus,
bacterias, constituyentes de bacterias, ADN, constituyentes de ADN,
moléculas inorgánicas u orgánicas como, por ejemplo, péptidos de
hidratos de carbono y/o glicoproteínas.
22. Polipéptido de hemocianina recombinante
según una de las formas de realización 17 a 21, caracterizado
porque el polipéptido de hemocianina no está glicosilado.
23. Polipéptido de hemocianina recombinante
según una de las formas de realización 17 a 21, caracterizado
porque el polipéptido de hemocianina está glicosilado.
24. Composición farmacéutica, que contiene una
molécula de ácido nucleico según una de las formas de realización 1
a 3 y/o una construcción según una de las formas de realización 4 a
9 y aditivos fisiológicamente aceptables.
25. Composición farmacéutica según la forma de
realización 24, caracterizada porque se usa para el tratamiento de
tumores mediante terapia génica.
26. Composición farmacéutica, que contiene un
polipéptido de hemocianina según una de las formas de realización
17 a 23 y aditivos fisiológicamente aceptables.
27. Composición farmacéutica según la forma de
realización 26, caracterizada porque se usa como agente
antiparasitario, agente antivirus o como agente
anti-tumoral.
28. Composición farmacéutica según la forma de
realización 26, caracterizada porque se usa para el tratamiento de
una de las siguientes enfermedades: esquitosomiasis, hipertensión,
carcinomas superficiales de la vejiga urinaria, carcinomas
epiteliales, carcinoma de ovarios, carcinoma de mama, carcinoma de
bronquios y carcinoma colorrectal.
29. Composición farmacéutica según la forma de
realización 24, caracterizada porque se usa como vacuna.
30. Composición farmacéutica según la forma de
realización 25, caracterizada porque se usa para la prevención de
abuso de cocaína.
31. Uso de polipéptido de hemocianina según una
de las formas de realización 17 a 23 como vehículo para
medicamentos.
32. Liposoma, que comprende una molécula de
ácido nucleico según una de las formas de realización 1 a 3, una
construcción según una de las formas de realización 4 a 9 y/o un
polipéptido de hemocianina según una de las formas de realización
17 a 23.
33. Liposoma según la forma de realización 32,
caracterizado porque el liposoma comprende además moléculas de
reconocimiento de células.
34. Anticuerpos, que se pueden obtener mediante
inmunización de un animal de ensayo con un polipéptido de
hemocianina recombinante que se selecciona de al menos una de las
siguientes secuencias de aminoácidos:
SEC ID Nº: 33 (dominio b de HtH2 parcial),
SEC ID Nº: 34 (dominio c de HtH2),
SEC ID Nº: 35 (dominio d de HtH2),
SEC ID Nº: 36 (dominio e de HtH2),
SEC ID Nº: 37 (dominio f de HtH2),
SEC ID Nº: 38 (dominio g de HtH2),
SEC ID Nº: 39 (dominio h de HtH2),
SEC ID Nº: 44 (dominio b de KLH2),
SEC ID Nº: 45 (dominio c de KLH2),
SEC ID Nº: 46 (dominio d de KLH2 parcial),
SEC ID Nº: 47 (dominio g de KLH2),
SEC ID Nº: 48 (dominio h de KLH2 parcial),
SEC ID Nº: 65 (dominio a de HtH2 parcial),
SEC ID Nº: 156 (dominio a de HtH2 completo),
SEC ID Nº: 66 (dominio b' de HtH2),
SEC ID Nº: 67 (dominio d' de HtH2),
SEC ID Nº: 68 (dominio e' de HtH2),
SEC ID Nº: 74 (dominio b' de KLH2),
SEC ID Nº: 75 (dominio c' de KLH2),
SEC ID Nº: 76 (dominio d' de KLH2),
SEC ID Nº: 77 (dominio e de KLH2),
SEC ID Nº: 78 (dominio f de KLH2),
SEC ID Nº: 79 (dominio g' de KLH2),
SEC ID Nº: 158 (dominio h de KLH2 parcial).
\vskip1.000000\baselineskip
35. Procedimiento de rastreo para la
identificación de ADN específico de tumor en una célula que
comprende:
- a)
- poner en contacto ADN celular y/o proteínas celulares con una sonda que comprende la secuencia de ácido nucleico según una de las formas de realización 1 a 3 y/o del anticuerpo según la forma de realización 34 y
- b)
- la detección de unión específica.
36. Procedimiento de rastreo según la forma de
realización 35, caracterizado porque el tumor que se va a detectar
es carcinoma de vejiga urinaria, carcinoma epitelial, carcinoma de
ovarios, carcinoma de mama, carcinoma de bronquios o carcinoma
colorrectal.
Igualmente están comprendidos en la invención
polipéptidos de hemocianina cuya secuencia presenta en una región
parcial de al menos 90 aminoácidos al menos un 60% o 70%,
preferiblemente al menos un 80%, con especial preferencia al menos
un 90% o 95% de homología con una de las secuencias de aminoácidos
según SEC ID Nº: 33 a 48 y SEC ID Nº: 63 a 79.
A este respecto la expresión "al menos un 70%,
preferiblemente al menos 80%, con especial preferencia al menos un
90% de homología" se refiere a la concordancia en el plano de la
secuencia de aminoácidos, que se puede determinar según
procedimientos conocidos, por ejemplo, de comparación de secuencias
asistida informáticamente (Basic local alignment search tool, S.F.
Altschul y col., J. Mol. Biol. 215 (1990).
403-410).
La expresión "homología" conocida por el
especialista en la técnica designa en esta invención el grado de
analogía entre dos o más moléculas de polipéptido, que se determina
con la concordancia entre las secuencias, en donde con concordancia
se debe entender tanto concordancia de igualdad como también
intercambio de aminoácidos conservativo. El porcentaje de
"homología" resulta del porcentaje de regiones concordantes en
dos o más secuencias considerando huecos u otras particularidades
de la secuencia.
El término "intercambio de aminoácidos
conservativo" se refiere a un intercambio de un resto aminoácido
con otro resto de aminoácido, sin que el intercambio lleve a una
modificación de la polaridad o carga. Un ejemplo de un intercambio
de aminoácidos conservativo es el intercambio de un resto aminoácido
no polar con otro resto aminoácido no polar.
La homología entre moléculas de polipéptido
análogas se puede determinar con ayuda de procedimientos conocidos.
Por lo general se usan programas informáticos especiales con
algoritmos que incluyen los requerimientos especiales de cálculo.
Procedimientos preferidos para la determinación de la homología dan
en primer lugar la mayor concordancia entre las secuencias en
estudio. Programas informáticos para la determinación de homología
entre dos secuencias comprenden, sin limitarse a estos, el programa
GCG, incluyendo GAP ((Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research
12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of
Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. y
col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). El programa
BLAST X de Nacional Centre for Biotechnology Information (NCBI) y
al que se refieren otras fuentes (BLAST Handbuch, Altschul S., y
col., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S. y col., J. Mol.
Biol. 215:403-410 (1990)). También se puede usar el
algoritmo de Smith Waterman conocido para la determinación de
homología.
Parámetros preferidos para la comparación de
secuencias de ácido nucleico comprenden los siguientes:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol.
48:443-453 (1970)
Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff y
Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 89:10915 a 10919 (1992)
Valor de huecos (Gap Penalty): 12
Valor de longitud de huecos (Gap Lenght
Penalty): 4
Valor umbral de la similitud: 0
El programa GAP es también adecuado para el uso
con los parámetros precedentes. Los parámetros precedentes son los
parámetros estándar (parámetros de defecto) para comparación de
secuencia de ácido nucleico, en donde no se reducen los huecos en
los extremos del valor de homología. En secuencias muy cortas en
comparación con la secuencia de referencia puede ser necesario
adicionalmente aumentar el valor esperado hasta 100.000 (expected
value) y dado el caso reducir la longitud de palabra (word size)
hasta 2.
Se pueden usar por ejemplo otros algoritmos,
valores de huecos-aberturas (gap opening penalties),
valores de extensión de huecos (gap extension penalties), matrices
de comparación incluyendo el Wisconsin-Paket en el
Programm-Handbuch, versión 9, Septiembre 1997,
conocidos. La elección depende de la comparación que se va a llevar
a cabo y además de si se lleva a cabo la comparación entre pares de
secuencias, en donde se prefieren GAP o Best Fit, o entre una
secuencia y una base de datos de secuencia extensa, en donde se
prefieren FASTA o BLAST.
Una concordancia determinada con el algoritmo
anteriormente citado del 60% se designa en el marco de esta
solicitud como 60% de homología. Esto es correspondientemente válido
para grados de homología superiores.
En una forma de realización adicional la
invención proporciona polipéptidos de hemocianina que se pueden
obtener mediante el procedimiento de preparación recombinante o
modificaciones del mismo.
Se prefieren polipéptidos de hemocianina, de las
formas de realización anteriormente representadas, que comprenden
cualquiera de las secuencias SEC ID Nº: 25 a 32, en donde la
secuencia SEC ID Nº: 25 puede estar reemplazada por SEC ID Nº: 63
y/o SEC ID Nº: 32 por SEC ID Nº: 64. Se prefieren igualmente
polipéptidos de hemocianina que comprenden las secuencias SEC ID
Nº: 33 a 39 o las secuencias SEC ID Nº: 65, 66, 34 a 39, en donde
SEC ID Nº: 35 puede estar reemplazada por SEC ID Nº: 67 y/o SEC ID
Nº: 36 por SEC ID Nº: 68. Los polipéptidos de hemocianina se tratan
con especial preferencia de hemocianina 2 de Haliotis
tuberculata.
Adicionalmente se prefiere de forma particular
hemocianina 2 de Haliotis tuberculata, que presenta un peso
molecular visible de 370 kDa en SDS-PAGE PAGE en
condiciones reductoras. Las hemocianinas se pueden obtener mediante
el procedimiento de disociación selectivo descrito en los ejemplos a
partir de hemocianina completa de Haliotis tuberculata.
Adicionalmente se prefieren polipéptidos de
hemocianina de las formas de realización anteriormente
representadas, que comprenden cualquiera de las secuencias SEC ID
Nº: 40 a 43 o las secuencias SEC ID Nº: 40 a 43 y SEC ID Nº: 71 a
73, en donde respectivamente la secuencia SEC ID Nº: 40 puede estar
reemplazada por SEC ID Nº: 66 y/o SEC ID Nº: 43 con SEC ID Nº: 70.
Se prefieren igualmente polipéptidos de hemocianina que bien
comprenden cualquiera de las secuencias SEC ID Nº: 44 a 48 o bien
las secuencias SEC ID Nº: 44 a 46, 77, 78, 47, 48, en donde
respectivamente la secuencia SEC ID Nº: 44 puede estar reemplazada
por SEC ID Nº: 74, SEC ID Nº: 45 por SEC ID Nº: 75, SEC ID Nº: 46
por SEC ID Nº: 76 y/o SEC ID Nº: 47 por SEC ID Nº: 79.
Estos polipéptidos de hemocianina se tratan con
especial preferencia de hemocianina 2 completa (KLH2) de
Megathura crenulata.
Adicionalmente se proporciona polipéptido de
hemocianina no glicosilado y glicosilado, que se pueden obtener
mediante expresión en células huésped con capacidad y sin capacidad
de glicosilación. Según cada uso previsto del polipéptido de
hemocianina se puede preferir el modelo de glicosilación de
levadura, de forma particular levadura metilótrofa, de células de
plantas o de células COH o HeLa.
La invención se refiere adicionalmente a
composiciones farmacéuticas que contienen las moléculas de ácido
nucleico de acuerdo con la invención y aditivos fisiológicamente
aceptables que son conocidos del estado de la técnica.
Preferiblemente se usan las composiciones farmacéuticas para la
inmunoestimulación inespecífica en forma de una terapia génica, en
donde se expresan tras transformación con un vector adecuado
polipéptidos de hemocianina y sirven para la antigenización del
tejido.
De forma particular la presente invención prevé
el uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la
invención, que está unida a una secuencia de ADN que codifica el
antígeno, para la inmunización específica frente a este antígeno.
La inmunización se basa a este respecto, sin unirse a esta teoría,
en la estimulación inespecífica del sistema inmunológico con
epítopos de polipéptido de hemocianina y la inmunización sobre todo
específica con reconocimiento de epítopos de antígeno por el sistema
inmunológico.
Una inmunización de este tipo es especialmente
valiosa en lo que respecta a antígenos de agentes patógenos, pero
muy especialmente en lo que respecta a antígenos tumorales. La
aplicabilidad de la composición farmacéutica de acuerdo con la
invención para el tratamiento de enfermedades tumorales resulta
también de la reactividad cruzada de los anticuerpos específicos de
hemocianina formados con restos de hidratos de carbono que aparecen
sobre la superficie de tumores como, por ejemplo, el antígeno de
Thomsen-Friedenreich que se presenta en múltiples
tumores humanos como carcinomas epiteliales, carcinoma de ovarios,
carcinoma colorrectal, carcinoma de mama, carcinoma de bronquios y
carcinoma de vejiga urinaria.
Adicionalmente se pueden usar las composiciones
farmacéuticas de acuerdo con la invención para el tratamiento de
enfermedades parasitarias como esquistosomiasis y para la prevención
del abuso de cocaína.
Como forma de realización adicional de la
presente invención se disponen composiciones farmacéuticas que
contienen un polipéptido de hemocianina de acuerdo con la invención
en unión con uno o varios aditivos fisiológicamente aceptables.
Como ya se citó anteriormente, puede suponerse que un polipéptido de
hemocianina de este tipo está constituido por una subunidad de
hemocianina completa, por uno o varios dominios así como por uno o
varios fragmentos de tales dominios, presentando estos fragmentos
aún las propiedades inmunológicas de al menos de un dominio de una
hemocianina. Una composición farmacéutica de este tipo es adecuada
bien por la inmunoestimulación inespecífica, que se atribuye sólo a
la hemocianina, o bien por la reacción inmune específica sobre el
antígeno asociado a la hemocianina, por ejemplo, como agente
antiparasitario, agente antivírico o agente antitumoral. De este
modo se puede usar, por ejemplo, para el tratamiento de
esquistosomiasis, carcinomas epiteliales, carcinoma de ovarios,
carcinoma colorrectal, carcinoma de mama, carcinoma de los bronquios
y carcinomas de la vejiga urinaria, siendo también adecuado no
obstante para el tratamiento de la hipertensión. El tratamiento de
la hipertensión se consigue llevando a cabo una inmunización con
ayuda de construcciones de péptido del receptor
hemocianina-\beta-adrenérgico y/o
proteínas de fusión.
En una forma de realización adicional se usan
las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención como
vacunas. Estas pueden provocar por tanto una contribución valiosa
para la profilaxis de enfermedades provocadas por agentes patógenos
conocidos. Esto es válido particularmente para composiciones
farmacéuticas en las que está unida un polipéptido de hemocianina a
un virus, componente de virus, bacterias muertas, componentes de
bacterias, de forma particular proteínas de superficie de envolturas
de virus o de bacterias, ADN, componentes de ADN, moléculas
inorgánicas u orgánicas, por ejemplo, hidratos de carbono, péptidos
y/o glicoproteínas.
Según una forma de realización preferida
adicional se usa la composición farmacéutica de acuerdo con la
invención para la prevención del abuso de cocaína.
Para la administración tanto de las moléculas de
ácido nucleico de acuerdo con la invención como también de
polipéptidos de hemocianina son adecuados de forma particular
liposomas. En consecuencia la presente invención comprende
liposomas que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo
con la invención, una construcción de acuerdo con la invención o un
polipéptido de hemocianina de acuerdo con la invención.
El especialista en la técnica conoce distintos
procedimientos para la preparación de liposomas, que son de
utilidad para fines farmacéuticos. La selectividad de los liposomas
que contienen las moléculas de ácido nucleico o polipéptidos de
hemocianina de acuerdo con la invención se puede aumentar con la
formación adicional de moléculas de reconocimiento de células en
los liposomas que se unen de forma selectiva a células diana. A tal
fin son adecuados de forma particular ligandos receptores que se
unen a receptores o células diana, o, especialmente en el caso de
tumores, anticuerpos que están dirigidos contra antígenos de
superficie de células diana tomadas como objetivo
respectivamente.
respectivamente.
Los polipéptidos de hemocianina de acuerdo con
la invención están previstos además como moléculas vehículo para
medicamentos como, por ejemplo, citostáticos. El aumento del peso
molecular prologa el semiperíodo de vida fisiológico de los
medicamentos considerablemente, ya que se reduce claramente la
pérdida por ultrafiltración en los riñones.
La preparación de las vacunas se realiza según
procedimientos conocidos por el especialista en la técnica; en
algunas formas de realización se prevé el uso adicional de
adyuvantes como, por ejemplo, adyuvante de Freundlich o
polisacáridos.
La invención proporciona además anticuerpos que
reaccionan específicamente con el polipéptido de hemocianina de
acuerdo con la invención y que se pueden obtener mediante
inmunización de un animal de ensayo con un polipéptido de
hemocianina. Se pueden obtener anticuerpos monoclonales mediante
inmunización, por ejemplo, de conejos y a continuación obtención de
antisueros. Se pueden obtener anticuerpos monoclonales según
procedimientos convencionales mediante inmunización, por ejemplo,
de ratones, obtención e inmortalización de células del bazo y
clonación de hibridomas que producen anticuerpos específicos para la
hemocianina.
Adicionalmente se proporciona un procedimiento
de rastreo para la identificación de ADN específico de tumor en una
célula que comprende las etapas de:
- a)
- poner en contacto ADN celular y/o proteínas celulares con una sonda que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o el anticuerpo de acuerdo con la invención y
- b)
- la detección de la unión específica.
Preferiblemente el tumor que se va a detectar es
un carcinoma de vejiga urinaria, carcinoma epitelial, carcinoma de
ovarios, carcinoma de mama, carcinoma de bronquios o carcinoma
colorrectal.
Se pretende aclarar la invención con las figuras
y ejemplos siguientes, pero sin limitar la misma en modo alguno.
Son accesibles para el especialista en la técnica en base a la
descripción y los ejemplos otras formas de realización que están
comprendidas igualmente.
La figura 1 muestra la caracterización y
purificación de hemocianina de Haliotis tuberculata
(HtH):
(a) microscopía electrónica de HtH completo
coloreado negativamente, que se purificó mediante
ultracentrifugación de hemolinfa libre de células;
(b) electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida (7,5% de poliacrilamida) de HtH1
en comparación con KLH (peso molecular de 370 kDa);
(c) electroforesis en gel de poliacrilamida
nativa (5% de poliacrilamida) del preparado de subunidades de HtH,
en donde el ánodo se encuentra en el borde inferior;
(d) inmunoelectroforesis cruzada de ambas
subunidades de HtH con uso de anticuerpos de
anti-HtH de conejos;
(e) microscopía electrónica de didecámeros de
HtH1 que quedan (flechas blancas) tras la disociación selectiva de
HtH2 (flechas negras);
(f) perfil de elución de cromatografía de
filtración en gel (Biogel A15m) en presencia de solución de
molibdato de amonio/polietilenglicol (pH 5,9) tras la disociación
selectiva de HtH2 en su subunidad y subsiguiente enriquecimiento de
HtH1 mediante ultracentrifugación;
(g) electroforesis en gel de poliacrilamida
nativa (6,5% de poliacrilamida) de subunidades de HtH1 y HtH2
purificadas mediante cromatografía en gel en comparación con el
material de partida;
(h, i) inmunoelectroforesis cruzada de
subunidades de HtH purificadas cromatográficamente; y
\newpage
(j, m) inmunoelectroforesis cruzada de
subunidades de HtH purificadas con uso de anticuerpos
anti-KLH de conejos, que son específicas de KHL1 o
KLH2.
La figura 2 muestra el estudio de organización
de subunidades de HtH1, en donde se usaron para la
inmunoelectroforesis anticuerpos anti-HtH1 de
conejos y se encontraba el ánodo en los lados izquierdo:
(a) inmunoelectroforesis cruzada tras
proteolisis limitada de HtH1 con ayuda de elastasa:
(b) electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida (7,5% de poliacrilamida) de
subunidad de HtH1 escindida de elastasa;
(c, d, g-j, l, n, p)
inmunoelectroforesis cruzada de productos de escisión de elastasa de
la subunidad de HtH1;
(e) inmunoelectroforesis cruzada tras
proteolisis limitada de HtH1 con ayuda de proteasa V8;
(f) electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida (7,5% de poliacrilamida) de
subunidad de HtH1 escindida con proteasa V8 y
(k, m, o) inmunoelectroforesis cruzada tras
proteolisis limitada de HtH1 con ayuda de tres proteasas dadas.
La figura 3 muestra la separación de productos
de escisión proteolíticos de la subunidad de HtH1 con ayuda de
HPLC.
La figura 4 muestra la secuencia genómica del
gen de HtH1.
La figura 5 muestra la estructura primaria
derivada de la proteína de HtH1.
La figura 6 muestra la secuencia genómica del
gen de HtH2.
La figura 7 muestra la estructura primaria
derivada de la proteína de HtH2.
La figura 8 muestra la secuencia genómica del
gen de KLH 1.
La figura 9 muestra la estructura primaria
derivada de la proteína de KLH1.
La figura 10 muestra la secuencia genómica del
gen de KLH2.
La figura 11 muestra la estructura primaria
derivada de la proteína de KLH2.
\vskip1.000000\baselineskip
Que aclaran la presente
invención
Se prepararon individuos de oreja de mar europeo
Haliotis tuberculata de la zona de la costa atlántica
francesa de S.M.E.L. (Blainville sur Mer, Francia) y de la compañía
Biosyn (Fellbach, Alemania). Se mantuvieron los animales en un
acuario de agua de mar de 300 l a 17ºC y se alimentaron con algas
pardas. Para la extracción de la hemolinfa se colocaron las orejas
de mar en un saco de plástico cerrado en hielo. Después de una hora
se había segregado grandes volúmenes de hemolinfa a través de su
piel. Se deduce que la hemocianina obtenida con este procedimiento
es idéntica a la hemocianina que se pudo reunir mediante incisión de
una concavidad en el pie de caracoles de mar enfriados con uso de
un escalpelo. Las células sanguíneas se separaron de la hemolinfa
mediante centrifugación a 800 g durante 30 minutos a 4ºC. Sedimentó
inmediatamente después toda la hemocianina mediante
ultracentrifugación preparativa a 30000 g durante 4 horas a 4ºC. El
sobrenadante se desechó y se suspendió el agregado de hemocianina
azul durante la noche en "tampón de estabilización" (Tris 0,05
M, CaCl_{2} 5 mM, MgCl_{2} 5 mM, NaCl 0,15 mM, PMSF 1 mM, pH
7,4) y se conservó a 4ºC.
Se obtuvo HtH1 intacto con uso del procedimiento
descrito por Harris y col., 1995, véase anteriormente, a partir de
HtH completo mediante disociación selectiva de HtH2 en solución de
molibdato de amonio/polietilenglicol (1%/0,2%), pH 5,9 y
subsiguiente ultracentrifugación. Se disolvió el agregado de HtH1
parcialmente purificado que se genera y se purificó mediante
filtración en gel sobre un dispositivo de Biogel A15m hasta la
homogeneidad. La última etapa dio pequeñas cantidades de HtH2
purificado. Se disoció HtH1 y HtH2 nativos mediante diálisis contra
"tampón de disociación" (glicina 0,13 M/NaOH, pH 9,6) a 4ºC
durante la noche cuantitativamente en las subunidades; no se
requirió la presencia de EDTA. Se añadió PMSF 1 mM en cada etapa de
purificación para inhibir la proteolisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo "tinción negativa"
convencional con el procedimiento de gotas individuales (Harris y
Horne en Harris, J.R. (editor) Electron microscopy in biology,
(1991), IRL Press Oxford, páginas 203-228). Se
sometieron a descarga luminiscente láminas portadoras de carbono
inicialmente durante 20 segundos para hacerlas hidrófilas y
adsortivas para la proteína. Se deja adsorber las muestras de
proteína en las láminas de carbono durante 60 segundos. Entre tanto
se separan las sales tampón mediante lavado secuencial con cuatro
gotas de agua de 20 \mul una tras otra. Se colorean negativamente
las retículas finalmente con una gota de 20 \mul de molibdato de
amonio al 5% acuoso, que contiene 1% de trehalosa (pH 7,0) y se
dejan secar a temperatura ambiente. Para el estudio de microscopía
electrónica se usa un microscopio electrónico de transmisión Zeiss
EM 900.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) según
el procedimiento de Laemmli (Nature 227 81970),
670-685). Para la PAGE nativa se usó un sistema
alcalino según Markl y col. (1979) J. Comp. Physiol. 133 B,
167-175 con un Tris/borato 0,33 M, pH 9,6 como
tampón de gel y Tris/borato 0,065 M, pH 9,6 como tampón de
electrodos. Se llevaron a cabo inmunoelectroforesis (IE) cruzada y
"de línea cruzada" según Weeke (Scand. J. Immunol. 2 (1973),
Suppl. 1, 47-56) o bien Kroll (Scand. J. Immunol. 2,
Suppl. 1 (1973), 79-81). Se produjeron anticuerpos
de conejo de Charles River Deutschland (Kisslegg, Alemania) contra
HtH completo disociado y HtH1 purificado. El procedimiento de
inmunización se llevó a cabo según Markl y Winter (J. Comp. Physiol.
159B (1989), 139-151).
\vskip1.000000\baselineskip
La proteolisis limitada se llevó a cabo a 37ºC
en glicina 0,13 M/NaOH, pH 9,6 mediante incorporación posterior de
un enzima (Sigma, Deisenhofen, Alemania) que se había disuelto en
NH_{4}HCO_{3} 0,1 M, pH 8,0: proteasa V8 tipo XVII (8400) de
Staphylococcus aureus, papaína tipo II de leche de papaya
(P-3125), pancreasa-elastasa de
ternera tipo IV (E-0258), quimotripsina y tripsina.
La concentración de hemicianina se encontraba entre 1 y 10 mg/ml.
La concentración final del enzima fue de 2% (peso/peso). La
proteolisis finalizó después de 5 horas tras congelación a -20ºC.
El procedimiento de HPLC se llevó a cabo en un dispositivo de
Applied Biosystems (BAI, Bensheim, Alemania) que se equipó con un
detector de dispositivo de diodos modelo 1000S. Se aplicaron los
fragmentos proteolíticos a una columna de intercambio iónico
mono-Q (Pharmacia, Friburgo, Alemania) que se había
equilibrado con Tris/HCl 0,02 M, pH 8,0 y se eluyó con un gradiente
de cloruro de sodio lineal (CaCl 0,0 M a 0,5 M) en el mismo tampón
a una caudal de flujo de 1 ml/min. Se aislaron alternativamente los
fragmentos proteolíticos mediante recorte de las bandas de geles de
PAGE nativos (Markl. y col., 1979) J. Comp. Physiol. 133 B,
167-175, después de que estos se hubiesen coloreado
inversamente previamente con el sistema Roti-White
(Roth, Karlsruhe, Alemania) según Fernandez-Patron y
col. (1995) Anal. Biochem. 224, 203-211. Para la
escisión subsiguiente se dializaron con un segundo enzima los
fragmentos aislados primero frente a glicina/NaOH 0,13 M, pH 9,6
para separar el
NaCl.
NaCl.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas obtenidas mediante el
procedimiento de HPLC se desnaturalizaron en tampón de muestra que
contiene SDS y se separaron mediante SDS-PAGE
(Laemmli, 1970, véase anteriormente; 7,5% de poliacrilamida). Para
impedir el bloqueo del término NH_{2} se añadió 0,6% (peso/peso)
de ácido tioglicólico al tampón del cátodo (Walsh y col.,
Biochemistry 27 (1988), 6867-6876). Se trasladaron
las bandas de proteínas mediante electrotransferencia sobre
membranas ProBlot (Applied Biosystems, Alemania) a una cámara de
trazado vertical (tampón de borato 25 mM, pH 8,8, que contiene EDTA
2 mM; 10 minutos/100 mA, 15 minutos/200 mA, 12 horas/300 mA). La
detección de los polipéptidos individuales se llevó a cabo sobre
las membranas con la coloración Ponceau-S. Se
recortaron las bandas de polipéptido de interés y se secuenciaron
en un dispositivo de secuenciación de proteínas 477A de Applied
Biosystems. Las cantidades de los polipéptidos aplicados al
dispositivo de secuenciación se encontraban por debajo del orden de
pmol.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una biblioteca de expresión de ADNc
lambda de poli(A^{+})-ARN a partir de
tejido de envoltura de Haliotis con uso del vector Lambda
ZAP Express® según las instrucciones del fabricante (Stratagene,
Heidelberg, Alemania). Se aislaron los clones con uso de anticuerpos
de conejo específicos de HtH. Se llevó a cabo la secuenciación de
nucleótidos en ambas hebras con uso del tinte Taq desoxy
Terminador®-Systems. La asignación de secuencias se llevó a cabo
con el software CLUSTAL W (1,7)® y TREEVIEW ® (Thompson y col.,
Nucl. Acids. Res. 22 (1994), 4673-7680).
\newpage
Ejemplo
1
Se obtuvo hemolinfa de orejas de mar adultas. Se
separaron las células sanguíneas mediante centrifugación y se
sedimentó la hemocianina entre tanto mediante ultracentrifugación.
Se disolvió de nuevo el agregado de hemocianina azul en "tampón
de estabilización" (pH 7,4) y se estudió en el microscopio
electrónico (figura 1a). Consistía principalmente en
di-decámeros típicos, acompañados de una pequeña
proporción en decámeros y tridecámeros. La desnaturalización en 2%
de SDS en presencia de sustancias reductoras y a continuación
separación por SDS-PAGE dio una banda individual
que correspondía al polipéptido con un peso molecular aparente de
370 kDa, que sólo se encuentra mínimamente por debajo del peso de
las subunidades visibles de KLH (figura 1b). La disociación
completa de los oligómeros como los di-decámeros en
los polipéptidos nativos (subunidades) se consiguió mediante
diálisis durante la noche de HtH en "tampón de disociación" (pH
9,6). Procedimiento PAGE nativo, que se usó sobre estas muestras,
dio un componente principal y uno secundario (figura 1c). La
inmunoelectroforesis cruzada (IE cruzada) con uso de anticuerpos de
conejo policlonales producidos en HtH completo purificado dio dos
componentes que son inmunológicamente distintos, sin embargo
presentan la reacción clásica de una identidad parcialmente
inmunológica (figura 1d). Su aislamiento preparativo (figura
1e-i) mostró que representan las subunidades de dos
tipos de HtH distintas, designadas como HtH1 y HtH2, y se pudieron
asignar a cada uno individualmente el modelo de PAGE nativo y
procedimiento de IE cruzada (figura 1 c, d).
La separación de HtH1 y HtH2 se llevó a cabo
según el procedimiento para la disociación selectiva según Harris y
col., 1995, véase anteriormente. En molibdato de
amonio/polietilenglicol, HtH1 en el estado oligomérico
(di-decámeros) era completamente estable, mientras
que HtH2 se disociaba completamente en las subunidades (figura 1e).
Esto posibilitó la sedimentación cuantitativa de HtH1 en el
ultracentrifugado, en donde permanecía frente a la mayor proporción
del HtH2 en el sobrenadante. Del agregado nuevamente disuelto se
purificaron grandes cantidades en HtH1 mediante cromatografía de
filtración en gel hasta la homogeneidad, que dieron también
pequeñas cantidades de HtH2 puro (figura 1f). Se estudiaron las
fracciones mediante PAGE nativo (figura 1g) y IE cruzada (figura
1H, i). La forma de proceder de disociación selectiva de
tri-decámeros completos separados de HtH2 de las
muestras, da a entender que están constituidos en última instancia
por HtH2, pero no por HtH1 (figura 1 e). El comportamiento de
disociación selectiva de HtH2 y también la capacidad de formar
agregados que son mayores que los di-decámeros
in vivo, corresponde a las propiedades de KLH2. Inversamente,
la estabilidad de HtH1 en estas condiciones y su incapacidad para
ensamblar agregados mucho mayores que di-decámeros,
se parece al comportamiento de KLH1. Esta analogía se confirma de
nuevo mediante la reacción de anticuerpos anti-KLH1
o anti-KLH2 frente a los dos tipos de HtH (figura
1j-m).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Las ocho unidades funcionales (FU,
frecuentemente designadas como "dominios funcionales") que
forman una subunidad de Hemocianina de moluscos, se diferencian en
la estructura primaria y no presentan reactividad cruzada
inmunológica alguna, como resulta de la IE cruzada. En el caso de
la subunidad de HtH1 purificada (figura 1g, h) se usaron cinco
concentraciones bajas de distintas proteasas (elastasa, proteasa V8,
papaína, tripsina y quimotripsina), que habían escindido los
enlaces peptídicos entre FU adyacentes de KLH1 y KLH2 (Gebauer y
col., 1994, véase anteriormente, Söhngen y col., 1997, véase
anteriormente). Los productos de escisión se investigaron mediante
IE cruzada y SDS-PAGE (figura 2). El tratamiento con
elastasa produce ocho FU individuales, derivadas del número de
picos de inmunoprecipitación distintos en la IE cruzada (figura 2a)
y con el peso molecular aparente de 50 kDa de la parte principal de
los productos de escisión en SDS-PAGE (figura 2b).
Se reconoció un pico de precipitación adicional como dímero de FU,
que se generó mediante escisión incompleta del segmento ab (figura
2a). Se obtuvieron mediante procedimientos de HPLC con una columna
mono-Q (figura 3a) dos de los productos de escisión
de elastasa con una pureza suficiente para hacer posible mediante
"IE de línea cruzada" su asignación clara a dos de los ocho
picos de precipitación (fig. 2c, d). Las otras cuatro proteasas
muestran distintos modelos de escisión que consistía en mezclas de
FU individuales y fragmentos mayores, que contienen dos, tres o
varias FU (por ejemplo, fig. 2e, f). Muchas de ellas se
enriquecieron con el procedimiento de HPLC en cantidad suficiente
(fig. 3b-e) para hacer posible su identificación en
su modelo de SDS-PAGE y IE cruzada correspondiente.
Una cantidad de estos componentes se secuenció en terminal N
mediante transferencia Blot de geles SDS a membranas
Pro-Blot® (tabla 1). Los resultados se compararon
con secuencias de terminales N que se habían obtenido de la
proteína ortogonal visible en Megathura crenulata, KLH1
(tabla 1), del que está disponible la disposición de FU completa
(Söhngen y col., 1997, véase anteriormente; véase la fig. 5b). El
resultado de todo el preparado condujo a la determinación de la
disposición FU completa dentro de la subunidad de HtH1 (figura
2a).
De forma particular la escisión de la subunidad
de HtH1 (1-abcdefgh) con proteasa V8 dio cuatro
picos de precipitación en la IE cruzada (fig. 2e). El procedimiento
de SDS-PAGE mostró cinco fragmentos distintos (fig.
2f): 220 kDa (5 FU), 185 kDa (4 FU), 100 kDa (2 FU), 55 kDa (1 FU)
y 46 kDa (1 FU). El fragmento de 100 kDa se aisló mediante el
procedimiento de HPLC (fig. 3b) y se identificó como
1-ab mediante secuenciación en el terminal N, ya
que la secuencia era idéntica a la respectiva de la subunidad
intacta (tabla 1). En el procedimiento de IE "de línea
cruzada" se fusionó 1-ab con tres picos de
precipitación del modelo de escisión de elastasa. En base a la
evaluación resultó que los fragmentos representaban
1-ab, 1-a ó 1-b
(fig. 2g). Sin embargo no quedaba claro qué pico representaba
1-a y cuál 1-b. En una segunda etapa
se escindió 1-ab purificado por HPLC con elastasa
en sus componentes FU, a partir de ellos se pudo eluir uno con el
procedimiento de bandas de gel de PAGE nativo y se asignó al modelo
de elastasa mediante el procedimiento de IE de "línea cruzada"
(figura 2h) y se suspendió en el terminal N. Este componente mostró
la misma secuencia N-terminal que toda la subunidad
y por tanto era idéntico a 1-a. Por tanto la segunda
FU del fragmento de 100 kDa es 1-b (fig. 2a; tabla
1). Así mismo se obtuvieron 1-c y
1-h purificados por HPLC (fig. 3b), se identificaron
mediante similitudes de secuencia N-terminal con
los FU correspondientes en KLH1 (tabla 1) y se asignaron con el
procedimiento de IE "de línea cruzada" sus picos de
precipitación correspondientes al modelo de elastasa (fig. 2i, j).
Adicionalmente se identificaron 1-a,
1-b, 1-c y 1-h (fig.
2a). Con uso de papaína para la escisión de subunidades se
obtuvieron cinco picos distintos en el procedimiento de IE cruzada
(fig. k). A partir de una muestra de este tipo se purificó un
fragmento de 100 kDa (2 FU) mediante el procedimiento de HPLC (fig.
3c), que contenía según el procedimiento de IE "de línea
cruzada" la FU 1-h ya identificada y una de las
cuatro FU aún no identificadas y por tanto debe representar
1-gh (figs. 2k, 3c). En realidad este fragmento
presentaba una secuencia N-terminal que mostraba
similitudes con KLH1-g (tabla 1). Para la
confirmación adicional se escindió el fragmento purificado por HPLC
1-gh con elastasa en su componente FU, se purificó
1-g a partir de estos y se identificó mediante
secuenciación en el terminal N. Se asignó mediante procedimiento de
IE "de línea cruzada" su pico al modelo de escisión de
elastasa (fig. 2I).
Se purificó el fragmento de 220 kDa de la
escisión de proteasa V8 (fig. 2e, f) por HPLC (fig. 3b) y se fusionó
en el procedimiento de IE "de línea cruzada" con
1-h, 1-g y tres picos aún no
identificados del modelo de escisión de elastasa. Además se obtuvo
el fragmento de 185 kDa en pureza suficiente (fig. 2e, f; 3b), y se
demostró que estos contenían los mismos componentes con excepción de
1-h. Esto supone que el fragmento de 22 kDa y el de
185 kDa son 1-defgh o 1-defg. En
realidad la secuencia N-terminal era prácticamente
idéntica y mostraba además similitudes con KLH1-d
(tabla 1). La escisión de la subunidad de HtH1 con tripsina dio una
pluralidad de componentes en el intervalo de pesos moleculares de
uno a dos FU (fig. 2m). Se enriquecieron varios de los componentes
en fracciones de HPLC (fig. 3d). Un fragmento de 100 kDa demostró
ser especialmente útil ya que presentaba la misma secuencia
N-terminal que el fragmento 1-defg
de la escisión de proteasa V8 (tabla 1); por tanto debió
representar el fragmento de 100 kDa 1-de. En el
procedimiento de IE "de línea cruzada" este componente se
fusionó con dos de los tres picos de FU aún no identificados del
modelo de escisión de elastasa (fig. 2n), que debía representar por
tanto 1-d y 1-e, y por tanto dajaba
alguna posibilidad para 1-f. El procedimiento de IE
"de línea cruzada" mostró también que en la fracción
1-de estaba presente además la FU
1-f (fig. 2n). La identificación de
1-f se confirmó mediante escisión de la subunidad
con quimotripsina (fig. 2o) y subsiguiente procedimiento por HPLC
(fig. 3e). Esta escisión dio entre otros un fragmento de 95 kDa (2
FU) que se fusionó en el procedimiento de IE "de línea cruzada"
con 1-g y un segundo pico (2p) y por tanto podría
ser bien 1-gh (que se pudo excluir, ya que
1-h ya se había identificado) o bien
1-fg (que no tenía sentido debido al pico adicional
encontrado, que era idéntico al candidato que quedaba). Realmente
este fragmento mostraba una secuencia N-terminal
que es de alguna forma similar a KLH1-f (tabla l).
El último problema consistía en asignar dos picos de FU que quedan
1-d o 1-e. Esto se consiguió con uso
de FU aisladas por HPLC de muestras en las que la subunidad se
había escindido con elastasa (fig. 2c, d, 3a). El componente ácido
en el procedimiento de IE cruzado era 1-d derivado
de su secuencia N-terminal, que es idéntico al de
1-defgh (fig. 2c; tabla 1), mientras que el
componente básico del par 1-d/1-g
presentaba una nueva secuencia N-terminal (tabla 1)
y por tanto debía ser 1-e (fig. 2a). Por tanto se
aclaró la estructura de las unidades funcionales de la subunidad
de
HtH1.
HtH1.
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Ejemplo
3
Comparación de pesos moleculares y secuencias de
terminales N de las unidades funcionales aisladas bioquímicamente
(FU) de HtH1 y KLH1. Las distintas FU, cada una con un punto de
unión a cobre binuclear intacto, se liberaron mediante proteolisis
limitada como segmentos globulares de su unidad mayor; véase el
párrafo "aislamiento y análisis de las unidades de HtH1". Los
datos de KLH1 se tomaron de Söhngen y col., véase anteriormente. La
asignación como unidad real se realizó en base al peso molecular y
al comportamiento inmunológico (véase la fig. 2). El peso molecular
inhabitualmente bajo de HtH1-d aislado pudo
significar que se escindió un gran péptido de terminal
C.
C.
Ejemplo
4
- 1.
- Para la clonación de ADNc de hemocianina se aisló ARNm del tejido de la envoltura de moluscos respectivos. Se obtuvo la primera hebra de ADNc mediante transcripción inversa con Oligo(dT) como cebador. La segunda hebra se obtuvo mediante síntesis convencional con cebadores aleatorios. El ADNc así obtenido se clonó en un vector de expresión lambda con formación de una biblioteca de expresión de ADNc. Con uso de un anticuerpo de hemocianina se investigó la biblioteca en condiciones adecuadas obteniéndose clones positivos. Estos clones positivos se aislaron, secuenciaron y caracterizaron.
- 2.
- Del intervalo N-terminal de un clon positivo obtenido se preparó una sonda de ADNc con la que se investigó la biblioteca de ADNc. Se aislaron, secuenciaron y caracterizaron de nuevo los clones positivos obtenidos.
- 3.
- Para obtener otra secuencia dispuesta en 5' se preparó una biblioteca de expresión adicional de ADNc, que se obtuvo con ayuda de una combinación de cebador específico de hemocianina y "aleatorio". Esta biblioteca de ADNc se investigó con sondas de ADNc que corresponden a regiones "N-terminal" de los clones positivos obtenidos en 2. Se aislaron, secuenciaron y caracterizaron los clones positivos obtenidos.
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Ejemplo
5
Se aisló ADN genómico según procedimientos
convencionales. La reacción de PCR se llevó a cabo con ayuda de
cebadores específicos de hemocianina para amplificar los segmentos
de genes de hemocianina de interés. Se clonaron, secuenciaron y
caracterizaron los productos de amplificación obtenidos en un vector
adecuado (por ejemplo, pGem T o pGem T easy (Promega,
Mannheim).
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Ejemplo
6
Se llevó a cabo una reacción de PCR con un clon
de ADNc que contenía la secuencia de codificación de
HtH-1 para amplificar específicamente la secuencia
de codificación del dominio 1d. Como cebadores se usaron
oligonucleótidos preparados sintéticamente.
El cebador 1 (aguas arriba) comprende seis
nucleótidos del final del dominio HtH-1c, un punto
de corte SacI y 12 nucleótidos del final del dominio
HtH-1d.
El cebador 2 (aguas abajo) comprende seis
nucleótidos del comienzo del dominio HtH1-e, un
punto de corte Sa/I y una secuencia específica de
HtH1-d.
Condiciones de PCR: | 2 | min | 95ºC | |
30 | seg | 95ºC | ||
30 | seg | 55ºC | ||
1 | min | 72ºC | ||
35 | ciclos | |||
10 | min | 72ºC |
El amplificado se clonó en el vector de
clonación pGEM T easy PCR (Promega) en XL-1 Blue
(Stratagene). Tras aislamiento del plásmido recombinante y
restricción con Sacl y Sa/I se pudo aislar el ADNc del dominio
1-d. El vector de expresión pQE30 (Quiagen) se
restringió igualmente con los enzimas correspondientes.
A continuación se llevó a cabo la ligadura entre
el HtH-1d-ADNc (restringido a SacI y
Sa/I) y pQE (restringido a SacI y Sa/I). Por tanto es posible una
clonación dirigida del ADNc, que codifica para
HtH-1d, en un vector de expresión. La expresión de
HtH1-d en pQE en XL-1 Blue se
realizó según las instrucciones del fabricante. Se pudo realizar de
forma análoga la expresión de otros dominios de HtH1, HtH2 o KLH1 o
KLH2.
<110> Biosyn Arzneimittel GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una
hemocianina, y al menos una secuencia de intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCT1220-01966
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\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Haliotis tuberculata
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1209
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1003
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1255
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1207
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1546
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 967
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Megathura crenulata
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 949
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Megathura crenulata
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 760
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 988
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 310
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 422
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
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<222> (1) ... (15)
\newpage
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<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 414
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 413
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 420
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 403
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 511
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<212> PRT
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<213> Haliotis tuberculata
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<400> 32
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 33
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<212> PRT
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<213> Haliotis tuberculata
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<212> PRT
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<213> Haliotis tuberculata
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\hskip0,8cm
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<213> Haliotis tuberculata
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\hskip0,8cm
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<212> PRT
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\hskip0,8cm
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\hskip0,8cm
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\hskip0,8cm
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<212> PRT
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<213> Haliotis tuberculata
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<212> PRT
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\hskip0,8cm
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<213> Megathura crenulata
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<212> PRT
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<213> Megathura crenulata
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<212> PRT
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<212> PRT
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<212> PRT
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<213> Megathura crenulata
\newpage
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<212> PRT
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<213> Megathura crenulata
\newpage
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\hskip0,8cm
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<212> PRT
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<213> Megathura crenulata
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<212> ADN
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<213> Haliotis tuberculata
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\newpage
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<211> 1257
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<212> ADN
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\hskip0,8cm
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<212> ADN
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<212> ADN
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\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Megathura crenulata
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<212> ADN
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<213> Haliotis tuberculata
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\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1185
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Haliotis tuberculata
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<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Haliotis tuberculata
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
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<222> (1) ... (15)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 511
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<212> PRT
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<213> Haliotis tuberculata
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Haliotis tuberculata
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<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 415
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Haliotis tuberculata
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 414
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Haliotis tuberculata
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<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
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<212> PRT
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<213> Megathura crenulata
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 418
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
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<400> 71
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 72
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<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 314
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 416
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 413
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 395
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1266
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1209
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1245
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis assimilis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1548
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 966
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 510
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 942
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1185
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 309
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (36)
1. Molécula de ácido nucleico, que comprende
- (i)
- una secuencia que codifica una hemocianina, un dominio de hemocianina o una variante según la reivindicación 1 (c)
- (ii)
- y al menos una secuencia de intrón,
en donde la secuencia de ácido
nucleico se selecciona
de:
- (a)
- secuencias de ácido nucleico que se seleccionan del grupo de las secuencias de ADN dadas a continuación o de sus secuencias de ARN correspondientes, o que las contienen:
- \quad
- SEC ID Nº: 9 (dominio b de HtH2 parcial)
- \quad
- SEC ID Nº: 10 (dominio c de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 11 (dominio d de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 12 (dominio e de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 13 (dominio f de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 14 (dominio g de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 15 (dominio h de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 20 (dominio b de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 21 (dominio c de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 22 (dominio d de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 23 (dominio g de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 24 (dominio h de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 50 (dominio a de HtH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 51 (dominio b' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 52 (dominio d' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 53 (dominio e' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 57 (dominio b' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 58 (dominio c' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 59 (dominio d' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 60 (dominio e de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 61 (dominio f de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 62 (dominio g' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 88 (dominio a'' de HtH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 89 (dominio b'' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 90 (dominio c'' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 91 (dominio d'' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 92 (dominio e'' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 93 (dominio f' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 94 (dominio g'' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 95 (dominio h'' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 102 (dominio b'' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 103 (dominio c'' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 104 (dominio d'' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 105 (dominio e'' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 106 (dominio f' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 107 (dominio g'' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 108 (dominio h'' de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 157 (dominio a de KLH2 completa);
- (b)
- secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del siguiente grupo:
- \quad
- SEC ID Nº: 33 (dominio b de HtH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 34 (dominio c de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 35 (dominio d de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 36 (dominio e de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 37 (dominio f de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 38 (dominio g de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 39 (dominio h de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 44 (dominio b de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 45 (dominio c de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 46 (dominio d de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 47 (dominio g de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 48 (dominio h de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 65 (dominio a de HtH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 156 (dominio a de HtH2 completa),
- \quad
- SEC ID Nº: 66 (dominio b' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 67 (dominio d' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 68 (dominio e' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 74 (dominio b' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 75 (dominio c' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 76 (dominio d' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 77 (dominio e de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 78 (dominio f de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 79 (dominio g' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 158 (dominio h de KLH2 parcial).
- (c)
- Secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos, que son al menos un 60% idénticas a una secuencia de la reivindicación 1b, calculándose la identidad de secuencia en 90 aminoácidos.
2. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de intrón
se selecciona de:
- (i)
- secuencias de ácido nucleico, que se seleccionan del grupo de las secuencias de ADN dadas a continuación o de las secuencias de ARN que corresponden a estas, o que las contienen:
- \quad
- SEC ID Nº: 147 (intrón 2B/2C de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 148 (intrón 2C/2D de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 149 (intrón 2D/2E de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 150 (intrón 2E/2F de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 151 (intrón 2F de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 152 (intrón 2F-2/2G de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 153 (intrón 2G-1/2G-2 de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 154 (intrón 2G-2/2G-3 de KHL2),
- \quad
- SEC ID Nº: 155 (intrón 2G/2H de KHL2);
- (ii)
- secuencias de ácido nucleico, que se hibridan con la contrahebra de una secuencia de ácido nucleico según (i);
- (iii)
- secuencias de ácido nucleico que son idénticas al menos en el 60% con una de las secuencias de ácido nucleico dadas en (i);
- (iv)
- variantes de las secuencias dadas en (i) a (iii), en donde las variantes presentan frente a las secuencias dadas en (i) a (iii), adiciones, deleciones, inserciones o inversiones; y
- (v)
- combinaciones de varias de las secuencias de ADN dadas en (i) a (iv).
3. Molécula de ácido nucleico según una de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque es una molécula
de ácido desoxirribonucleico.
4. Construcción que comprende una molécula de
ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Construcción según la reivindicación 4, que
comprende además un promotor adecuado para el control de la
expresión, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica una
hemocianina, un dominio de hemocianina o un fragmento funcional de
la misma se encuentra bajo el control del promotor.
6. Construcción según la reivindicación 4 ó 5,
que comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica
un antígeno, que está unida directamente con la secuencia de ácido
nucleico que codifica una hemocianina, un dominio de hemocianina o
un fragmento funcional de la misma.
7. Construcción según la reivindicación 6, en
donde el antígeno se selecciona de: antígenos tumorales, antígenos
de virus y antígenos de agentes patógenos bacterianos o
parasitarios.
8. Construcción según una de las
reivindicaciones 4 a 7, en donde la construcción contiene al menos
una parte de un vector, en donde el vector se selecciona de:
bacteriófagos, andenovirus, virus de vacunas, baculovirus, virus
SV-40 y retrovirus.
9. Construcción según una de las
reivindicaciones 4 a 8, en donde la construcción comprende además
una secuencia de ácido nucleico que codifica
His-Tag y la expresión de la construcción conduce a
la formación de una proteína de fusión con un
His-Tag.
10. Célula huésped, que contiene una
construcción según una de las reivindicaciones 4 a 9, en donde la
célula huésped es una célula procariótica o eucariótica adecuada
para la expresión de la construcción.
11. Célula huésped según la reivindicación 10,
caracterizada porque la célula huésped procariótica se
selecciona de E. coli y Bacillus subtilis.
12. Célula huésped según la reivindicación 10,
caracterizada porque la célula huésped eucariótica se
selecciona de células de levadura, células de plantas, células de
insectos y células de mamíferos, preferiblemente de células CHO,
células COS y células HeLa.
13. Procedimiento para la preparación de un
polipéptido de hemocianina, en donde la molécula de ácido nucleico
según una de las reivindicaciones 1 a 3 y/o la construcción según
una de las reivindicaciones 4 a 9 se expresa en una célula huésped
adecuada y dado el caso se aísla la proteína.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque el polipéptido de hemocianina preparado
se modifica de forma natural o química.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque la modificación es una reticulación
transversal o un enlace covalente en un antígeno.
16. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque la expresión
se lleva a cabo en una célula huésped según una de las
reivindicaciones 10 a 12.
17. Polipéptido de hemocianina, que comprende
una secuencia de aminoácido que es codificada por una o varias de
las moléculas de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1
a 3.
18. Polipéptido de hemocianina según la
reivindicación 17, que comprende al menos una secuencia de
aminoácidos seleccionada del siguiente grupo:
- \quad
- SEC ID Nº: 33 (dominio b de HtH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 34 (dominio c de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 35 (dominio d de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 36 (dominio e de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 37 (dominio f de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 38 (dominio g de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 39 (dominio h de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 44 (dominio b de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 45 (dominio c de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 46 (dominio d de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 47 (dominio g de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 48 (dominio h de KLH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 65 (dominio a de HtH2 parcial),
- \quad
- SEC ID Nº: 156 (dominio a de HtH2 completa),
- \quad
- SEC ID Nº: 66 (dominio b' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 67 (dominio d' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 68 (dominio e' de HtH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 74 (dominio b' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 75 (dominio c' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 76 (dominio d' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 77 (dominio e de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 78 (dominio f de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 79 (dominio g' de KLH2),
- \quad
- SEC ID Nº: 158 (dominio h de KLH2 parcial).
o
- (b)
- un polipéptido de hemocianina, cuya secuencia es en una región parcial de al menos 90 aminoácidos, al menos un 60% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a).
19. Polipéptido de hemocianina recombinante, que
se puede obtener mediante el procedimiento según una de las
reivindicaciones 13 a 16 o modificaciones del mismo, en donde las
modificaciones son
- a)
- di-, oligo- y polímeros del polipéptido de hemocianina que se puede obtener mediante el procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 13 a 16,
- b)
- modificaciones de cadenas laterales del mismo,
- c)
- proteínas de fusión, obtenidas mediante unión a un antígeno o
- d)
- polipéptidos, obtenidos mediante episodios post-traduccional.
20. Polipéptido de hemocianina recombinante
según la reivindicación 18, caracterizado porque el
polipéptido de hemocianina comprende bien las secuencias SEC ID Nº:
44 a 48 o bien las secuencias SEC ID Nº: 44 a 46, 77, 78, 47, 48 y
KLH2 es de Megathura crenulata, pudiendo estar reemplazada
respectivamente la secuencia SEC ID Nº 44 por SEC ID Nº: 74, SEC ID
Nº: 45 por SEC ID Nº: 75, SEC ID Nº: 46 por SEC ID Nº: 76 y/o SEC ID
Nº: 47 por SEC ID Nº: 79.
21. Polipéptido de hemocianina recombinante
según la reivindicación 17 a 20, caracterizado porque está
unido de forma covalente a virus, constituyentes de virus,
bacterias, constituyentes de bacterias, ADN, constituyentes de ADN,
moléculas inorgánicas u orgánicas como, por ejemplo, péptidos de
hidratos de carbono y/o glicoproteínas.
22. Polipéptido de hemocianina recombinante
según una de las reivindicaciones 17 a 21, caracterizado
porque el polipéptido de hemocianina no está glicosilado.
23. Polipéptido de hemocianina recombinante
según una de las reivindicaciones 17 a 21, caracterizado
porque el polipéptido de hemocianina está glicosilado.
24. Composición farmacéutica, que contiene una
molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3
y/o una construcción según una de las reivindicaciones 4 a 9 y
aditivos fisiológicamente aceptables.
25. Composición farmacéutica según la
reivindicación 24, caracterizada porque se usa para el
tratamiento de tumores mediante terapia génica.
26. Composición farmacéutica, que contiene un
polipéptido de hemocianina según una de las reivindicaciones 17 a
23 y aditivos fisiológicamente aceptables.
27. Composición farmacéutica según la
reivindicación 26, caracterizada porque se usa como agente
antiparasitario, agente antivirus o como agente
anti-tumoral.
28. Composición farmacéutica según la
reivindicación 26, caracterizada porque se usa para el
tratamiento de una de las siguientes enfermedades: esquitosomiasis,
hipertensión, carcinomas superficiales de la vejiga urinaria,
carcinomas epiteliales, carcinoma de ovarios, carcinoma de mama,
carcinoma de bronquios y carcinoma colorrectal.
29. Composición farmacéutica según la
reivindicación 24, caracterizada porque se usa como
vacuna.
30. Composición farmacéutica según la
reivindicación 25, caracterizada porque se usa para la
prevención del abuso de cocaína.
31. Uso de polipéptido de hemocianina según una
de las reivindicaciones 17 a 23 como vehículo para medicamentos.
32. Liposoma, que comprende una molécula de
ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, una
construcción según una de las reivindicaciones 4 a 9 y/o un
polipéptido de hemocianina según una de las reivindicaciones 17 a
23.
33. Liposoma según la reivindicación 32,
caracterizado porque el liposoma comprende además moléculas
de reconocimiento de células.
34. Anticuerpos, que se pueden obtener mediante
inmunización de un animal de ensayo con un polipéptido de
hemocianina recombinante que se selecciona de al menos una de las
siguientes secuencias de aminoácidos:
SEC ID Nº: 33 (dominio b de HtH2 parcial),
SEC ID Nº: 34 (dominio c de HtH2),
SEC ID Nº: 35 (dominio d de HtH2),
SEC ID Nº: 36 (dominio e de HtH2),
SEC ID Nº: 37 (dominio f de HtH2),
SEC ID Nº: 38 (dominio g de HtH2),
SEC ID Nº: 39 (dominio h de HtH2),
SEC ID Nº: 44 (dominio b de KLH2),
SEC ID Nº: 45 (dominio c de KLH2),
SEC ID Nº: 46 (dominio d de KLH2 parcial),
SEC ID Nº: 47 (dominio g de KLH2),
SEC ID Nº: 48 (dominio h de KLH2 parcial),
SEC ID Nº: 65 (dominio a de HtH2 parcial),
SEC ID Nº: 156 (dominio a de HtH2 completa),
SEC ID Nº: 66 (dominio b' de HtH2),
SEC ID Nº: 67 (dominio d' de HtH2),
SEC ID Nº: 68 (dominio e' de KLH2),
SEC ID Nº: 74 (dominio b' de KLH2),
SEC ID Nº: 75 (dominio c' de KLH2),
SEC ID Nº: 76 (dominio d' de KLH2),
SEC ID Nº: 77 (dominio e de KLH2),
SEC ID Nº: 78 (dominio f de KLH2),
SEC ID Nº: 79 (dominio g' de KLH2),
SEC ID Nº: 158 (dominio h de KLH2 parcial).
35. Procedimiento de rastreo para la
identificación de ADN específico de tumor en una célula que
comprende:
- a)
- poner en contacto ADN celular y/o proteínas celulares con una sonda que comprende la secuencia de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3 y/o del anticuerpo según la reivindicación 34 y
- b)
- la detección de la unión específica.
36. Procedimiento de rastreo según la
reivindicación 35, caracterizado porque el tumor que se va a
detectar es carcinoma de vejiga urinaria, carcinoma epitelial,
carcinoma de ovarios, carcinoma de mama, carcinoma de bronquios o
carcinoma colorrectal.
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Avila Soria | Malo kingi, Cnidaria; Cubozoa; Carybdeidae. PhD Thesis, James Cook University. |