ES2315176A1 - Electrodo bacteriano aerobico para anodo de una pila de combustible sin mediadores redox ni membrana intercambiadora de protones. - Google Patents
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Abstract
Electrodo bacteriano aeróbico para ánodo de una pila de combustible sin mediadores redox ni membrana intercambiadora de protones. La presente invención proporciona nuevos electrodos biológicos para pilas de combustible microbianas que no requieran membrana transportadora de protones para separar el cátodo del ánodo, ni el uso de mediadores redox en disolución para asegurar la comunicación electrónica eficaz entre células bacterianas y el ánodo. En la presente invención se describe por primera vez la adsorción de células bacterianas del género Acidiphilium spp. sobre un electrodo de un material conductor de electricidad. Las células adsorbidas son capaces de oxidar compuestos orgánicos cediendo directamente los electrones de la reacción al electrodo sin necesidad del uso de mediadores redox en disolución y no viéndose afectado el proceso por la presencia de oxígeno molecular en el medio.
Description
Electrodo bacteriano aeróbico para ánodo de una
pila de combustible sin mediadores redox ni membrana
intercambiadora de protones.
La presente invención se relaciona con
electrodos microbianos para pilas de combustible en las cuales el
combustible es materia orgánica. Por tanto, se relaciona con la
biotecnología y más concretamente con el uso de células bacterianas
como biocatalizadores y más en particular como biocatalizadores
redox y más en particular con la biotecnología de la producción
directa de energía eléctrica a partir de biomasa.
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La actual situación energética hace necesaria
una apuesta clara por la implantación de las Pilas de Combustible
como uno de los medios más seguros, limpios y eficaces de convertir
la energía contenida en diversos combustibles en electricidad (M.S.
Dreseselhaus and I.L. Thomas, Alternative energy
technologies. Nature, 414, 332- 337, 2001). En este contexto
cabe resaltar el hecho de que en los últimos años se ha asistido a
una intensa investigación en Biopilas de Combustible llamadas así
porque en los electrodos de la pila interviene elementos
biológicos, enzimas redox o células microbianas en ánodos y en
cátodos (G. Tayhas, R. Palmore, and G.M. Whitesides, Microbial
and Enzymatic Biofuel Cells in Enzymatic conversion of biomass
for fuel production, M.E. Himmel, J.O. Baker and R.P. Overend,
eds., American Chemical Society Symposium series, n° 566, ACS,
Washington, DC., 271-290, 1994). La utilización de
células microbianas como biocatalizadores permite utilizar como
combustible de la pila materia orgánica (glucosa, lactato, etanol,
sucrosa, celulosa, etc.), por tanto es posible obtener energía
eléctrica a partir de biomasa procedente de aguas residuales,
deshechos agrícolas o deshechos industriales. De este modo, la pila
no solo serviría para generar energía eléctrica sino también para
eliminación de residuos (F. Scholz and U. Schroder, Bacterial
Batteries. Nat. Biotechnol., 21, 1151-1152,
2003; L. T. Angenent, K. Karim, M. H. Al-Dahhan, B.
A. Wrenn and R. Domínguez-Espinosa, Production of
bioenergy and biochemicals from industrial and agricultural
wastewater. Trends Biotechnol., 22, 477-485,
2004). Generalmente, el uso de biocatalizadores microbianos en
pilas de combustible requiere la presencia de mediadores redox en
disolución para conseguir la comunicación electrónica entre el
microorganismo y el electrodo (A. K. Shukla, P. Suresh, S.
Berchmans and A. Rajendran, Biological fuel cells and their
applications. Curr. Sci., 87, 455-468, 2004),
pero en los últimos años se ha descubierto que algunas bacterias
reductoras de metales son capaces de ceder electrones directamente
al electrodo (H. J. Kim, H. S. Park, M. S. Jun, I. S. Chang, M.
Kim, B. H. Kim, A mediator-less microbial fuel
cell using a metal reducing bacterium, Shewanella
putrefaciens. Enzyme Microbiol. Technol., 30,
145-152, 2002; D. R. Bond, D. R. Lovley, Electricity
production by Geobacter sulfurreducens attached to
electrodes. Appl. Environ. Microbiol., 69,
1548-1555, 2003; S. Chaudhuri, D. R. Lovley,
Electricity generation by direct oxidation of glucose in
mediatorless microbial fuel cells. Nat. Biotechnol., 21,
1229-1232, 2003). En todos los casos descritos en la
literatura estos microorganismos solo funcionan en condiciones
estrictamente anaeróbicas, por lo tanto su utilización en ánodos de
biopilas de combustible obliga a emplear una membrana
intercambiadora de protones que separe ánodo y cátodo (Patentes
WO0104061, WO2005001981, DE10315792, US2004241528 y JP10233226).
Esto tiene el inconveniente de que estas membranas intercambiadoras
de protones son caras y pueden limitar cinéticamente el
funcionamiento de la pila de combustible (B. Min, S. Cheng, B. E.
Logan, Electricity generation using membrane and salt bridge
microbial fuel cells, Water Res. 39, 1675-1686,
2005; J. L. Cohen, D. A. Westly, A. Pechenik, H. D. Abruña,
Fabrication and preliminary testing of a planar membraneless
microchannel fuel cell, J. Power Sources 139,
96-105, 2005). Muy recientemente, se ha publicado
una patente de una pila de combustible microbiana sin mediadores
redox y sin membrana intercambiadora de protones pero sigue
requiriendo condiciones anaeróbicas para el funcionamiento de las
bacterias que actúan como biocatalizadores, por lo cual las aguas
residuales que proporcionan el combustible deben tratarse
anaeróbicamente y el compartimiento catódico debe estar separado
del compartimiento anódico por lana de vidrio y cuentas de vidrio
para evitar la difusión de O_{2} desde el compartimiento catódico
(patente US2005208343).
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La presente invención proporciona nuevos
electrodos biológicos para pilas de combustible microbianas que no
requieran membrana transportadora de protones para separar el
cátodo del ánodo, ni el uso de mediadores rédox en disolución para
asegurar la comunicación electrónica eficaz entre células
bacterianas y el ánodo. En la presente invención se describe por
primera vez la adsorción de células bacterianas del género
Acidiphilium spp. sobre un electrodo de un material
conductor de electricidad. Las células adsorbidas son capaces de
oxidar compuestos orgánicos cediendo directamente los electrones de
la reacción al electrodo sin necesidad del uso de mediadores redox
en disolución y no viéndose afectado el proceso por la presencia de
oxígeno molecular en el medio.
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente
invención lo constituye un electrodo biológico, en adelante
electrodo biológico de la presente invención, basado en la
utilización de células del género bacteriano Acidiphilium
spp. adsorbidas sobre un electrodo conductor para producción de
electricidad a partir de materia orgánica de diferentes orígenes,
al menos en condiciones aeróbicas, donde las células del género
Acidiphilium se caracterizan porque presentan una región
homologa al polinucleótido que se muestra en la figura 8 (SEQ ID N°
1), correspondiente a la región 16S de su RNA ribosómico nuclear,
de al menos un 80% de identidad, preferentemente de al menos un 90%
de identidad más preferentemente de al menos un 95% de identidad y,
en una realización aún más preferente de la invención, de al menos
un 99% de identidad con el polinucleótido mostrado en dicha figura
(SEQ ID N° 1)
La información que se proporciona en esta
memoria, es suficiente para permitir a un taxónomo molecular
identificar a otras cepas que estén dentro de este género.
El género Acidiphilium fue descrito por
Harrison en 1981 (Harrison 1981, Int. J. Syst. Bacteriol.,
1981, 31, 327-332.). empleando
Acidiphilium cryptum Harrison 1981 como especie tipo.
Posteriormente se han añadido otras especies al género, un total de
9.
Acidiphilium acidophilum (Harrison
1983) Hiraishi et al. 1998.
Acidiphilium aminilyticum corrig.
Kishimoto et al. 1994, actualmente.
Acidocella aminolytica (Kishimoto
et al. 1994) Kishimoto et al.
1996.
Acidiphilium angustum Wichlacz et al. 1986.
Acidiphilium facile corrig.
Wichlacz et al. 1986.
Acidiphilium multivorum Wakao et al. 1995.
Acidiphilium organovorum Lobos et al. 1986.
Acidiphilium rubrum Wichlacz et
al. 1986.
Acidiphilium symbioticum Battacharyya et al. 1991.
De estas 9 especies, una ha surgido como una
nueva combinación de Thiobacillus acidophilus (ex
Guay and Silver 1975) Harrison 1983, y dos de ella han sido
transferidas posteriormente a un nuevo género, Acidocella,
como Acidocella aminolytica (Kishimoto et al. 1994)
Kishimoto et al. 1996 y Acidocella facilis (Wichlacz
et al. 1986) Kishimoto et al. 1996.
Por las especiales características de estos
organismos, que aún no se han estudiado en profundidad, y por las
dificultades que supone su descripción, esta será más fácil y
fiable si su delimitación taxonómica se basa en métodos de biología
molecular (filogenia molecular).
Tanto Acidiphilium como Acidocella
pertenecen al Phylum Proteobacteria, a la Clase
Alphaproteobacterias del orden Rhodospirillales, de la
Familia Acetobacteraceae. El género representante de la
Familia es Acetobacter Beijerinck 1898, siendo el tipo del
género Acetobacter aceti (Pasteur 1864) Beijerinck 1898.
Los otros géneros de la Familia, y sus
respectivos tipos, de acuerdo a los criterios taxonómicos del
GenBank,
son:
son:
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Con el fin de definir, a efectos de esta
memoria, el género Acidiphylium se realizó un análisis
filogenético de las especies tipo de los distintos géneros
pertenecientes a la Familia Acetobacteraceae. Como outgroup
(grupo externo de comparación) se incluyeron otras especies de la
clase Alphaproteobacteria:
De la Familia Rhodobacteraceae
Rhodobacter Imhoff et al.
1984 - Tipo Rhodobacter capsulatis (Molisch
1907) Imhoff et al. 1984.
\vskip1.000000\baselineskip
De la Familia Rhodospirillaceae:
Rhodospirillum Molisch 1907
-Tipo Rhodospirillum rubrum (Esmarch 1887)
Molisch 1907.
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De la Familia Hyphomicrobiaceae:
Rhodomicrobium Duchow &
Douglas 1949- Tipo Rhodomicrobium vannielii
Duchow & Douglas 1949.
Blastochloris Hiraishi 1997
- Tipo Blastocholris viridis (Drews &
Giesbrecht 1966) Hiraishi 1997.
\newpage
De la Familia Erythrobacteracceae:
Erythrobacter Shiba and
Simidu 1982 - Tipo Erythrobacter longus
Shiba and Simidu 1982.
Para el análisis arriba mencionado se emplearon
polinucleótidos homólogos al que se muestra en la Figura 8 (SEQ ID
N°1) y que pertenece al microorganismo empleado para realizar el
ejemplo 1 de la presente invención. Estos polinucleótidos homólogos
se localizan en la región 16S ribosómico nuclear del material
genético de estos microorganismos y fueron obtenidos del
GenBank.
El alineamiento de estos nucleótidos se hizo
mediante el software SAM (Hughey & Krogh, 1996), obteniendo una
matriz de 75 taxones y 923 pares de bases. La matriz resultante fue
analizada usando la metodología Bayesian Markov Chain Monte Carlo
(B/MCMC) tal y como se recoge en Larget y Simon, 1999; y
Huelsenbeck et al., 2000. El análisis Bayesiano se llevó a
cabo usando MrBayes v3.03b (Huelsenbeck & Ronquist, 2001). La
probabilidad posterior (pp) de cada rama se aproximó por muestreo de
los árboles filogenéticos por el método Markov Chain Monte Carlo
(MCMC). Se empleó el programa MrBayes (Huelsenbeck & Ronquist,
2001) para muestrear los árboles, y el análisis se realizó
asumiendo el modelo general time reversible (Rodriguez et
al., 1990) incluyendo la estimación de los sitios invariantes y
asumiendo una distribución discreta gamma y con seis categorías
(GTR+I+G). No se asumió reloj molecular. Se analizaron 2000000 de
generaciones, comenzando con un árbol al azar, y empleando 6 cadenas
simultaneas. Cada 100 generaciones el árbol resultante se guardó.
Se eliminaron los árboles resultantes de las 200000 primeras
generaciones, obteniendo el árbol consenso de los últimos 18000
árboles, que ya habían alcanzado el estado estacionario. Los clados
con probabilidad igual o superior al 95% se consideraron
soportados
significativamente.
significativamente.
La Figura 7 muestra el análisis filogenético que
incluye las especies tipo de la Familia Acetobacteracceae,
de acuerdo a los criterios taxonómicos del GenBank, así como todas
las especies de Acidiphilium y Acidocella cuyo
polinucleótido homólogo al de la Figura 8 (SEQ ID N°1) se encuentra
depositado en el GenBank. Se consideraría que un experto en la
materia a la luz de lo descrito anteriormente podría determinar si
las células de un determinado microorganismo pertenecen al género
Acidiphilium mediante un análisis filogenético igual o
similar.
Adicionalmente, en la identificación de un
microorganismo como perteneciente al género Acidiphilium son
aplicables los parámetros siguientes, sea aisladamente o en
combinación con los anteriores. Dado que las cepas de
Acidiphilium son afines en cuanto a su evolución, puede
esperarse que la homología global de los genomas al nivel de los
nucleótidos, y más concretamente a nivel de la región 16 S del RNA
ribosómico nuclear, y más concretamente al polinucleótido de la
región 16S del RNA ribosómico nuclear que se recoge en la Figura 8
(SEQ ID N°1), sea de un 80% o mayor, y más preferiblemente de un
90% o mayor. La correspondencia entre la secuencia genómica de
la(s) cepa(s) de Acidiphilium
putativa(s) y la secuencia de otro microorganismo se puede
determinar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo,
aquéllas se pueden determinar por una comparación directa de la
información de secuencia del polinucleótido procedente de
Acidiphilium putativo, y la secuencia del polinucleótido que
se muestra en la Figura 8 de esta memoria. Por ejemplo, también,
aquéllas se pueden determinar por hibridación de los
polinucleótidos en condiciones que forman dúplex estables entre
regiones homólogas, seguido por digestión con nucleasa(s)
específica(s)
monocatenaria(s), seguido por determinación del tamaño de los fragmentos digeridos.
monocatenaria(s), seguido por determinación del tamaño de los fragmentos digeridos.
El porcentaje de homología se ha determinado
midiendo la identidad entre el polinucleótido que se muestra en la
Figura 8 (SEQ ID N°1) (perteneciente a la cepa del género
acidiphillium utilizada para llevar a cabo el ejemplo 1 de la
presente invención) y todos los polinucleótidos homólogos del
género Acidiphylium que se encontraban recogidos en el
momento de escritura de esta memoria, en el GenBank. Para ello, se
realizó un alineamiento de los polinucleótidos con el programa
Clustal X (Thompson et al. 1997). Se obtuvo una matriz de 34
taxones y 1045 pares de bases. Se calcularon las distancias
genéticas entre el polinucleótidos de la cepa de
acidiphillium utilizada en el ejemplo 1 con la secuencia
consenso SEQ ID N° 1 y los restantes polinucleótidos, y se calculó
la identidad entre los polinucleótidos que presentaron la mayor
distancia genética con él. La identidad que presentaron fue de un
89%. La identidad entre los polinucleótidos que presentaron una
mayor distancia genética fue de un 86%. Por tanto, cabe pensar que
un organismo que pertenezca al género Acidiphilium tendrá un
polinucleótido homólogo al de la Figura 8 (SEQ ID N°1),
perteneciente a la región 16S de su RNA ribosómico nuclear, que
presente, al menos, una identidad del 80% con
éste.
éste.
El término "Género", tal y como se utiliza
en esta memoria, hace referencia a la categoría de la clasificación
biológica (categoría taxonómica) que comprende una o más especies
relacionadas filogenéticamente y morfológicamente similares.
También se espera que compartan características químicas y
metabólicas similares.
En el contexto de esta memoria, la expresión
"árbol filogenético" o "árbol evolutivo" hace referencia
a la estructura matemática usada para modelizar la historia
evolutiva real de un conjunto de unidades taxonómicas (secuencias,
individuos, especies, etcétera).
Por "categoría taxonómica" se entiende el
nivel de jerarquía utilizado para la clasificación de los
organismos.
Tal y como se utiliza en esta memoria, un
"ciado" hace referencia a un grupo monofilético, siendo un
"grupo monofilético" un grupo que incluye todos los taxones
descendientes de un taxón ancestral.
El término "polinucleotido", tal como se
utiliza en esta memoria, se refiere a una forma polímera de
nucleótidos de cualquier longitud, sean ribonucleótidos o
desoxirribonucleótidos. Este término se refiere exclusivamente a la
estructura primaria de la molécula.
El término "filogenia" como aquí se usa se
refiere a la relación histórica verdadera entre un conjunto de
taxones.
El término "homología", tal y como se
utiliza en esta memoria, hace referencia a la semejanza entre do
estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, y más
concretamente, a la semejanza entre los nucleótidos de dos o más
polinucleótidos.
El término "identidad", tal y como se
utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de
nucleótidos idénticos entre dos polinucleótidos que se
comparan.
Por "norma de reacción" se entiende el
conjunto de fenotipos a que da origen un mismo genotipo cuando se
desarrolla en distintos ambientes.
El término "genotipo", tal como se utiliza
en esta memoria, hace referencia a la constitución hereditaria o
genética de un individuo; todo el material genético contenido en
una célula, al que, por lo general, se denomina material
nuclear.
El término "fenotipo", tal como se utiliza
en esta memoria, se refiere a la suma total de las propiedades
estructurales y funcionales observables de un organismo; producto
de la interacción entre el genotipo y el medio ambiente.
El término "especie tipo" hace referencia a
la especie designada como el tipo de un género o un subgénero,
siendo el "tipo" bajo el punto de vista taxonómico, el
elemento simple de un taxón al cual se le asigna permanentemente el
nombre y sobre el que están basadas las características
descriptivas que satisfacen las condiciones de disponibilidad o de
publicación válidas.
Las bacterias del género acidophilium se
caracterizan porque pueden reducir ión férrico utilizando
compuestos orgánicos como donadores de electrones. Una propiedad
sobresaliente de este tipo de bacterias es su capacidad de utilizar
el hierro férrico como aceptor final de electrones en condiciones
anaerobias, microaerobias y en elevadas concentraciones de oxígeno.
Para llevar a cabo la presente invención se aislaron cepas de
Acidiphilium spp. de diferentes zonas del río Tinto
caracterizadas por sus elevadas concentraciones de hierro, tanto
ión ferroso como férrico. El aislamiento se hizo a partir de medio
sólido con glucosa como fuente de energía y luego se procedió a
comprobar la pureza de las cepas de Acidiphilium durante su
crecimiento en medio liquido a pH 2,5 mediante hibridación in
situ con sondas especificas.
Por tanto, una realización preferida de la
invención lo constituye el electrodo biológico de la invención en
el que las células del género bacteriano Acidiphilium spp.
se aíslan del Río Tinto (Huelva).
Estas células bacterianas pueden ser manipuladas
genéticamente por las técnicas convencionales actuales de biología
molecular para cambiar sus propiedades.
Por lo tanto, otra realización preferida de la
invención lo constituye el electrodo biológico de la invención en
el que las células del género bacteriano Acidiphilium spp.
se han modificado mediante ingeniería genética para mejorar sus
propiedades.
Las células bacterianas de Acidiphilium
spp. se pueden modificar genéticamente para promover la secreción
de hexopolisacáridos dopados con iones de Fe para favorecer su
adherencia a la superficie del electrodo y su conectividad
eléctrica.
Por lo tanto, una realización más preferida de
la invención lo constituye el electrodo biológico de la invención
en el que las células del género bacteriano Acidiphilium
spp. se han modificado mediante ingeniería genética para mejorar su
adherencia a la superficie del electrodo y su conectividad
eléctrica.
Por ingeniería genética puede también
modificarse las propiedades metabólicas de las células de
Acidiphilium spp. para aumentar el tipo de compuestos
orgánicos que son capaces de utilizar para generar electricidad.
Por lo tanto, otra realización aún más preferida
de la invención lo constituye el electrodo biológico de la
invención en el que las células del género Acidiphilium sp
se han modificado mediante ingeniería genética para ampliar sus
propiedades metabólicas con compuestos orgánicos diversos.
El electrodo conductor que forma parte del
electrodo biológico de la invención puede ser, a modo de ejemplo y
sin que limite el alcance de la invención, de un material de tipo
carbonáceo, el cual tenga gran área específica que permita un alto
recubrimiento del electrodo con células bacterianas, y por tanto de
lugar a altas densidades de intensidad de corriente en el electrodo
biológico de la invención.
Así, otro aspecto de la presente invención lo
constituye el electrodo biológico de la invención en el que el
electrodo conductor es de un material carbonáceo.
Una realización preferida de la presente
invención lo constituye el electrodo biológico de la invención en
el que el material carbonáceo del electrodo conductor es grafito,
hilo de carbón o tela de carbón.
El material carbonáceo que constituye el
electrodo puede ser dopado con iones metálicos para favorecer la
conectividad eléctrica entre las células bacterianas adsorbidas y
el electrodo (D. H. Park, J. G. Zeikus, Improved fuel cell and
electrode designs for producing electricity from microbial
degradation, Biotechnol. Bioeng. 81, 348-355,
2003). Asimismo, con el fin de favorecer la adhesión de las células
bacterianas a la superficie del electrodo por interacciones
electroestáticas la superficie del electrodo puede ser modificada
con diferentes grupos funcionales por los métodos descritos por
Saveant y colaboradores mediante la reducción electroquímica de
sales de aril diazonio adecuadas (M. Delamar, R. Hitmi, J. Pinson,
J. M. Saveant, Covalent modification of carbon surfaces by
grafting of functionalized aryl radicals produced from
electrochemical reduction of diazonium salts, J. Am. Chem. Soc.
114, 5853-5854, 1992; P. Allongue, M. Delamar, B.
Desbat, O. Fagebaume, R. Hitmi, J. Pinson, J. M. Saveant,
Covalent modification of carbon surfaces by aryl radicals
generated from the electrochemical reduction of diazonium
salts, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119,
201-207).
Así, una realización más preferida de la
presente invención lo constituye el electrodo biológico de la
invención en el que el material del electrodo conductor está
modificado con iones metálicos o con grupos funcionales en su
superficie.
En un aspecto preferente de la invención y con
el fin de lograr la adsorción de las células bacterianas sobre el
electrodo conductor se inocula un cultivo de bacteria
Acidiphilium spp. en una celda estéril electroquímica que
contiene una disolución acuosa aeróbica con pH ácido, un compuesto
orgánico como nutriente, y en presencia de un soporte de material
conductor que actúa como electrodo de trabajo. Además se colocan un
electrodo de referencia y un contraelectrodo en la celda. La
comunicación eléctrica entre células bacterianas y el electrodo de
trabajo se evalúa por la técnica de voltametría cíclica. Tras un
periodo de tiempo de incubación (por ejemplo 6 días) se comprueba
que ha aumentado el número de células de la bacteria en el medio,
que hay células adsorbidas sobre la tela de carbón y que las
bacterias adsorbidas son capaces de ceder los electrones procedentes
de la oxidación del compuesto orgánico al electrodo en condiciones
aeróbicas sin que requiera la adición de mediadores redox en
disolución (ver Ejemplo 1).
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
lo constituye un procedimiento de obtención del electrodo biológico
de la invención, en adelante el procedimiento de obtención del
electrodo biológico de la invención, basado en el crecimiento de
células bacterianas del género Acidiphilium spp. en
disolución aeróbica y de pH ácido en presencia de un electrodo
conductor y un compuesto orgánico que actúa como nutriente.
Para un crecimiento adecuado de las células
bacterianas de Acidiphilium spp es aconsejable que el pH de
tampón sea entre 2,0 y 4,0. Así mismo, la glucosa es un nutriente
eficaz para este fin. La utilización de un material carbonáceo de
gran área específica como electrodo conductor favorece la adhesión
de un gran número de células bacterianas a esta superficie (ver
Figura 2).
Así, una realización preferida de la presente
invención lo constituye el procedimiento de obtención del electrodo
biológico de la invención en el que el pH de la disolución aeróbica
es entre 2,0 y 4,0.
Otra realización preferida de la presente
invención lo constituye el procedimiento de obtención del electrodo
biológico de la invención en el que el nutriente es glucosa.
Aún otra realización particular de la presente
invención lo constituye el procedimiento de obtención del electrodo
biológico de la invención en el que el material del electrodo
conductor es un material carbonáceo.
El crecimiento de las células bacterianas de
Acidiphilium spp. mejora cuando se añade en el medio de
cultivo otros compuestos aparte del nutriente. A modo de ejemplo y
sin que limite el alcance de la invención: 2 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,1 g/l de KCl, 0,25 g/l de
K_{2}HPO_{4}, 0,25 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l
Ca(NO_{3})_{2}. El pH óptimo de crecimiento de
éstas células es 2,5. Además, el soporte de material carbonáceo
sobre el que se adsorben las células bacterianas y que va actuar
como electrodo conductor del electrodo biológico de la invención
puede ser un disco de tela de carbono.
Por lo tanto, otra realización preferida de la
presente invención lo constituye un procedimiento de obtención del
electrodo biológico en el que el pH de la disolución es 2,5 y
contiene 2 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,1 g/l de KCl,
0,25 g/l de K_{2}HPO_{4}, 0,25 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l
Ca(NO_{3})_{2}, y el material del electrodo
conductor es tela de carbón.
Para mejorar la estabilidad de las células
bacterianas adsorbidas sobre el electrodo y evitar su desorción del
electrodo hacia la disolución, estás se pueden recubrir con
polímeros con grupos funcionales adecuados, ya sea para realizar
reacciones de entrecruzamiento entre células bacterianas próximas o
para establecer interacciones electroestáticas entre el polímero y
las células bacterianas, formándose un aglomerado de las células
bacterianas sobre el electrodo retenidas por el polímero.
Por tanto, otra realización aún más preferida de
la presente invención lo constituye el procedimiento de obtención
del electrodo biológico de la invención caracterizado porque se
estabilizan las células bacterianas adsorbidas sobre el electrodo
conductor por entrecruzamiento o encapsulación con polímeros
funcionales.
El electrodo biológico de la invención utilizado
como ánodo permite obtener energía eléctrica de compuestos
orgánicos diversos formando parte de pilas de combustible. Estos
compuestos orgánicos pueden provenir de aguas residuales de
distinto origen y por tanto puede servir también para
descontaminación.
Así, otra realización de la presente invención
lo constituye el uso del electrodo biológico de la invención como
ánodo de una pila de combustible que utilice materia orgánica de
diferentes orígenes para producir electricidad.
Como la comunicación electrónica entre las
células bacterianas y el electrodo conductor es directa no se
requiere la adición de mediadores redox en disolución. Esta es una
gran ventaja ya que estos mediadores redox suelen ser muy tóxicos y
además su uso implica un mayor coste de la pila. La otra gran
ventaja del electrodo biológico de la invención es que funciona en
condiciones aeróbicas tan bien como en condiciones anaeróbicas (ver
Ejemplo 1), por lo tanto no requiere la eliminación del oxígeno de
la disolución acuosa que actúa como combustible ni la separación
del compartimiento anódico del catódico (donde se reduce O_{2})
mediante una membrana intercambiadora de protones. Esto último es
posible también por que no se utiliza un mediador rédox en
disolución que pudiera reaccionar en el cátodo. La eliminación de la
membrana intercambiadora de protones y de la necesidad de borbotear
con N_{2} la disolución del combustible para hacerla anaerobia,
así como la posible ausencia de mediadores redox, suponen una clara
simplificación del diseño de la pila de combustible y en
consecuencia una considerable reducción de costes.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente
invención lo constituye el uso del electrodo biológico de la
invención como ánodo de una pila de combustible que no requiere
condiciones anaeróbicas ni mediadores rédox en la disolución del
compartimiento anódico, evitando la necesidad de una membrana
intercambiadora de protones que la separe del compartimiento
catódico.
El uso del electrodo biológico de la invención
como ánodo en una pila de combustible es compatible con un cátodo
de reducción de oxígeno convencional o con un cátodo basado en un
catalizador biológico.
Por tanto, una realización preferida de la
presente invención lo constituye el uso de una pila de combustible
caracterizada porque comprende el electrodo biológico de la
invención.
Figura 1. Voltamogramas cíclicos que muestran
las corrientes de oxidación de glucosa obtenidos con un electrodo
microbiano de Acidiphilium spp. La curva continua
corresponde al experimento control con glucosa 10 mM antes de
añadir bacteria, en condiciones aeróbicas y a 30°C; la curva de
trazos equivale a las mismas condiciones pero después de seis días
de inoculación de bacteria; la curva de puntos corresponde al
experimento anterior después de eliminar el oxígeno borboteando
N_{2} durante 40 minutos. Velocidad de barrido 50 mV/s. Los
potenciales redox son respecto a un electrodo de calomelanos.
Figura 2.- Imagen de microscopio de barrido
de la superficie del electrodo microbiano. La imagen
corresponde al electrodo de la Figura 1 después de seis días de
crecer la bacteria Acidiphilium 3.2 sup 5.
Figura 3.- Efecto de un inhibidor de la
bacteria en los voltamogramas cíclicos. La curva de línea
continua corresponde al experimento control antes de añadir
bacteria Acidiphilium 3.2 sup 5; la curva de trazos
corresponde al electrodo bacteriano; la curva de puntos se obtiene
23 horas después de añadir fenol al 5%.
Figura 4. Voltamograma cíclico que muestran
las corrientes de oxidación de glucosa obtenido con Acidiphilium
Sup . La curva continua corresponde al experimento con
glucosa justo al añadir la bacteria y la curva de trazos
corresponde a las mismas condiciones después de 11 días.
Figura 5. Voltamograma cíclico que muestran
las corrientes de oxidación de glucosa obtenido con Acidiphilium
Musta . La curva continua corresponde al experimento con
glucosa justo al añadir la bacteria y la curva de trazos
corresponde a las mismas condiciones después de 15 días.
Figura 6. Voltamograma cíclico que muestran
las corrientes de oxidación de glucosa obtenido con
Acidiphilium AiRi. La curva continua corresponde al
experimento con glucosa justo al añadir la bacteria y la curva de
trazos corresponde a las mismas condiciones después de 15 días.
Figura 7.- Árbol Filogenético que delimita el
género Acidiphilium . Se ha obtenido del análisis
bayesiano que incluye los poolinucleótidos homólogos al
representado en la Figura 8 (SEQ ID N°1) de las especies tipo de los
Géneros que integran la Familia Acetobaccteraceae, según el
criterio taxonómico del GenBank, y que se encuentran depositados en
el GenBank. En el análisis se han incluido todos los
polinucleótidos homólogos al de la Figura 8 (SEQ ID N°1) que se han
clasificado en el GenBank como pertenecientes al género
Acidiphylium y Acidocella. Los clados que presentan
líneas engrosadas presentan una probabilidad posterior (p/p)
superior al 95% (p/p > 0.95).
Figura 7a.- ampliación de la zona superior
(Género Acidocella).
Figura 7b.- ampliación de la zona inferior
(Género Acidiphylium).
Figura 8.- Polinucleótido de la región 16 S
del RNA ribosómico nuclear. Obtenido de la cepa de
Acidiphilium sp. utilizada para llevar a cabo el ejemplo 1
de la presente invención y que corresponde con la SEQ ID N° 1.
Para llevar a cabo la presente invención se
aislaron las células de Acidiphilium a partir de aguas del
Río Tinto (Huelva) utilizando suporte sólidos cuya la composición
es:
Se ajusta el pH a 4.5 mediante H_{2}SO_{4},
y se esteriliza en la autoclave a 120° a 0,5 atm durante 30 minutos
para evitar la caramelización de glucosa.
Después de crecer en medio solidó se cogen la
colonias y se siembran en medio liquido que tiene los mismos
nutrientes que el suporte solidó menos el agar y el pH en este caso
fue ajustado a 2.5
Se realizaron experimentos de voltametria
cíclica para la caracterización electroquímica de
Acidiphilium 3.2 en disolución cuya l a composición es 2 g/l
de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,1 g/l de KCl, 0,25 g/l de
K_{2}HPO_{4}, 0,25 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l
Ca(NO_{3})_{2}. a pH 2.5.
Los experimentos se llevaron a cabo a
temperatura de 30°C que es la temperatura optima de crecimiento de
esta bacteria, se aplicaron velocidades de barrido de 0.05 V/s.
Todas las bacterias utilizadas para llevar a
cabo los ejemplos 2-4 pertenecen al género
acidiphillium spp y tienen al menos un 80% de homología con
la secuencia consenso mostrada en la figura 8 (SEQ ID N°1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
En una celda electroquímica estéril y
termoestatizada a 30°C se colocan un electrodo de trabajo hecho de
un disco de tela de carbono de 13 mm de diámetro, un electrodo de
referencia de calomelanos y un contraelectrodo de platino. La
celdilla electroquímica contiene una disolución a pH 2,5 de 2 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,1 g/l de KCl, 0,25 g/l de
K_{2}HPO_{4}, 0,25 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l
Ca(NO_{3})_{2}. A continuación se añade glucosa 10
mM y se inocula un cultivo de la bacteria perteneciente al género
Acidiphilium spp (Depósito realizado ante la CECT (Colección
Española de Cultivos Tipo) con referencia de identificación:
acidiphilium 3.2 sup5, n° de depósito: CECT 7285 y
fecha de depósito: 23 de mayo de 2007) con la secuencia
consenso mostrada en la figura 8 (SEQ ID N° 1) y obtenida del río
Tinto. A los seis días de incubación se comprueba que ha aumentado
el número de células de la bacteria en el medio por microscopía y
recuento directo de las células teñidas con DAPI
(4',6'-diaminofenilindol), alcanzándose 4 x 10^{9}
células/ml. Por voltametría cíclica se comprueba el efecto
catalítico de oxidación de glucosa con el electrodo biológico de la
invención y se compara con el experimento control antes de inocular
bacteria (Figura 1). El efecto catalítico de oxidación de glucosa
en presencia de oxígeno, no varía en condiciones anaeróbicas
(Figura 1). La Figura 2 muestra las imágenes obtenidas por
microscopía electrónica de barrido del electrodo biológico de la
invención, en las cuales se ven claramente las células bacterianas
adsorbidas sobre los hilos de la tela de carbón. En la Figura 3 se
muestran las voltametrías cíclicas realizadas con otro electrodo
biológico preparado del mismo modo antes y después de añadir fenol
en concentración del 5%. El fenol es un inhibidor potente de las
células bacterianas y prácticamente suprime las propiedades
catalíticas del electrodo biológico de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se repite el experimento del ejemplo 1,
manteniendo las mismas condiciones, pero construyendo el electrodo
exclusivamente con células de Acidiphilium sp. cepa Sup. y
sin medir el efecto inhibidor del fenol. El voltamograma cíclico se
mide en el momento de inocular la bacteria y 11 días después de la
inoculación. Los resultados se muestran en la Figura 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se repite el experimento del ejemplo 1,
manteniendo las mismas condiciones, pero construyendo el electrodo
exclusivamente con células de Acidiphilium sp. cepa Musta y
sin medir el efecto inhibidor del fenol. La curva continua
corresponde al experimento con glucosa justo al añadir la bacteria y
la curva continua corresponde a las mismas condiciones después de
15 días. Los resultados se muestran en la Figura 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se repite el experimento del ejemplo 1,
manteniendo las mismas condiciones, pero construyendo el electrodo
exclusivamente con células de Acidiphilium sp. cepa AiRi y
sin medir el efecto inhibidor del fenol. Los resultados se muestran
en la Figura 6.
\vskip1.000000\baselineskip
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ánodo de una pila de combustible sin mediadores redox ni membrana
intercambiadora de protones
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<130> 1641
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<160> 1
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<170> PatentIn version 3.4
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<210> 1
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<211> 925
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<212> DNA
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<213> Acidiphillium
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(925)
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<223> CDNA de la región 16S ribosómica
nuclear de Acidiphylium 3.2sup5
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<400> 1
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Claims (16)
1. Electrodo biológico caracterizado
porque comprende células del género bacteriano Acidiphilium
sp. adsorbidas sobre la superficie de un electrodo conductor en
condiciones aeróbicas, donde dichas células se caracterizan
porque presentan una región homologa de al menos un 80% de identidad
con el polinucleótido con SEQ ID N° 1.
2. Electrodo biológico según la reivindicación
1, donde las células del género Acidiphilium se
caracterizan porque presentan una región homóloga, de al
menos un 90% de identidad con el polinucleótido con SEQ ID N° 1,
correspondiente a la región 16S de su RNA ribosómico nuclear.
3. Electrodo biológico según la reivindicación
1, donde las células del género Acidiphilium se
caracterizan porque presentan una región homóloga de al
menos un 95% de identidad con el polinucleótido con SEQ ID N° 1,
correspondiente a la región 16S de su RNA ribosómico nuclear.
4. Electrodo biológico según la reivindicación
1, donde las células del género Acidiphilium se
caracterizan porque presentan una región homologa de al
menos un 99% de identidad con el polinucleótido con SEQ ID N° 1,
correspondiente a la región 16S de su RNA ribosómico nuclear.
5. Electrodo biológico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque las células del
género bacteriano Acidiphilium sp. se han modificado
genéticamente para mejorar su adherencia a electrodos y
conectividad eléctrica.
6. Electrodo biológico según cualquiera de las
reivindicaciones 1-8 caracterizado porque el
electrodo conductor utilizado es de material carbonáceo.
7. Electrodo biológico según la reivindicación
anterior caracterizado porque el material carbonáceo es
grafito, tela de carbono o hilo de carbono.
8. Electrodo biológico según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 caracterizado porque el
material del electrodo conductor está modificado con iones
metálicos o con grupos funcionales en su superficie.
9. Procedimiento de obtención del electrodo
biológico según cualquiera de las reivindicaciones
1-5 que comprende el crecimiento de las células
bacterianas del género Acidiphilium spp. en disolución
aeróbica y a pH ácido, en presencia del electrodo conductor y de un
nutriente.
10. Procedimiento de obtención del electrodo
biológico según la reivindicación anterior caracterizado
porque la disolución aeróbica está entre pH 2,0 y pH 4,0.
11. Procedimiento de obtención del electrodo
biológico según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10
caracterizado porque el nutriente es glucosa.
12. Procedimiento de obtención del electrodo
biológico según cualquiera de las reivindicaciones
9-11 caracterizado porque el material del
electrodo conductor es carbonáceo.
13. Procedimiento de obtención del electrodo
biológico según la reivindicación 9 caracterizado porque la
disolución aeróbica está a pH 2,5 y contiene 2 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,1 g/l de KCl, 0,25 g/l de
K_{2}HPO_{4}, 0,25 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l
Ca(NO_{3})_{2}, la temperatura es 30°C y el
material del electrodo conductor es tela de carbón.
14. Procedimiento de obtención del electrodo
biológico según cualquiera de las reivindicaciones
9-13, caracterizado porque las células
bacterianas adsorbidas sobre el electrodo se estabilizan por
entrecruzamiento o encapsulación con polímeros funcionales.
15. Uso del electrodo biológico según cualquiera
de las reivindicaciones 1-8 como ánodo de una pila
de combustible.
16. Pila de combustible caracterizada
porque comprende un electrodo biológico según las reivindicaciones
1-8.
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- 2007-06-04 ES ES200701534A patent/ES2315176B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-05-26 WO PCT/ES2008/070100 patent/WO2008148923A1/es active Application Filing
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2001004626A1 (en) * | 1999-07-07 | 2001-01-18 | Korea Institute Of Science And Technology | An electrochemical method for enrichment of microorganism, a biosensor for analyzing organic substance and bod |
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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ES2315176B1 (es) | 2010-01-26 |
WO2008148923A1 (es) | 2008-12-11 |
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