ES2312828T3 - Inmunoensayo no competitivo para analitos pequeños. - Google Patents
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Abstract
Un inmunoensayo no competitivo para un analito pequeño de menos de 5000 Da que comprende hacer reaccionar una muestra que contiene dicho analito con un par de reactivos, que comprende un primer compañero de unión que se une a dicho analito y un segundo compañero de unión que se une al complejo de dicho analito y dicho primer compañero de unión, y determinar la unión del segundo compañero de unión, indicando así la presencia del analito en la muestra, caracterizado por la obtención del segundo compañero de unión a partir de una biblioteca de presentación de compañeros de unión recombinante sin tratamiento previo, mediante la selección de un compañero de unión que se une a dicho complejo del analito y del primer compañero de unión.
Description
Inmunoensayo no competitivo para analitos
pequeños.
La presente invención se refiere a inmunoensayos
y especialmente a inmunoensayos no competitivos para analitos
pequeños. Se describen pares de reactivos útiles en los ensayos y la
invención comprende un proceso para su preparación.
En un inmunoensayo competitivo, el reactivo
externo que compite con el analito tiene que añadirse, lo cual no
ocurre en el formato de ensayo no competitivo. Actualmente, el
método elegido para la detección de analitos por inmunoquímica es
un inmunoensayo no competitivo, en el que dos anticuerpos se unen a
dos epítopos diferentes del analito creando el llamado ensayo de
tipo sándwich. Tal ensayo se adapta muy bien a los analitos de alto
peso molecular y proporciona una mayor velocidad, sensibilidad y
especificidad, que son necesarias en los inmunoensayos modernos.
Sin embargo, ha sido una tarea difícil desarrollar ensayos no
competitivos para analitos pequeños, pues las moléculas de bajo
peso molecular no alcanzan el suficiente tamaño para unirse
simultáneamente a más de un anticuerpo independientemente. Por lo
tanto, a pesar de muchos problemas fundamentales con respecto a su
especificidad y sensibilidad, el formato de inmunoensayo competitivo
se ha usado casi exclusivamente para la detección de analitos
pequeños.
Sin embargo, hay varias publicaciones en las que
se ha descrito el desarrollo de un inmunoensayo no competitivo para
un analito pequeño. En estos artículos, se ha desarrollado un
anticuerpo secundario anti-complejo inmune
(anti-IC) que se une a un anticuerpo primario
anti-analito que se combina con el analito pero que
no se une al anticuerpo primario o al analito en solitario (Ullman
et al., 1993; Self et al., 1994; Towbin et
al., 1995). Ullman et al., 1993, describe un anticuerpo
que reconoce un inmunocomplejo de un anticuerpo contra
tetrahidrocanabinol (THC). El anticuerpo anti-IC se
obtuvo usando un anticuerpo anti-THC marcado por
afinidad como inmunógeno y seleccionando un anticuerpo
anti-IC cuya unión se aumentaba por la presencia de
\Delta^{9}THC. Self et al., 1994, usó el mismo principio
en la preparación de anticuerpos anti-IC para la
determinación de digoxina. Towbin et al., 1995, describen un
inmunoensayo de tipo sándwich para el hapteno angiotensina 11, en
el que la inmunización implica la inducción de tolerancia con el
anticuerpo primario que no está formando complejos antes de la
inmunización con el complejo anti-inmune para
obtener los anticuerpos anti-IC. Los anticuerpos
anti-IC usados en inmunoensayos no competitivos para
analitos pequeños hasta el momento han sido anticuerpos
policlonales o monoclonales convencionales obtenidos por
inmunización, y los ensayos descritos aquí incluyen el marcaje del
anticuerpo primario y la inmovilización del secundario o
viceversa.
El documento US 6.323.159 describe la detección
de analitos pequeños como la morfina o el canabinol mediante el uso
de un ensayo de tipo sándwich homogéneo, en el que uno de los
anticuerpos es un anticuerpo anti-IC que es
específico para el complejo formado entre el analito y el anticuerpo
primario anti-analito. El anticuerpo
anti-IC se obtiene mediante la inmunización
convencional de un animal con un inmunocomplejo (IC), que es
extremadamente difícil debido, entre otras cosas, a la
inestabilidad del IC.
Brennan J. et al., 2003, Journal of
Chromatography B, vol. 786, 1-2,
327-342 describe una proteína de unión a antígeno
de cadena sencilla (scFv) obtenida a partir de una biblioteca de
presentación en fagos de dominios variables de anticuerpos
preinmunizados. El fragmento scFv es capaz de unirse específicamente
a la morfina libre. Sin embargo, no hay ninguna descripción de la
obtención o uso de ningún fragmento de anticuerpo
anti-IC ni de los problemas relacionados con
ello.
Mares et al., 1995, han desarrollado el
denominado inmunoensayo no competitivo "idiométrico" para
analitos pequeños. Se usaron dos tipos de anticuerpos
anti-idiotípicos que reconocen diferentes epítopos
dentro de la región hipervariable del anticuerpo primario
específico del estradiol. El primer anticuerpo
anti-idiotípico (del tipo beta) posee la capacidad
de competir con el analito por un epítopo en el sitio de unión del
anticuerpo primario. El segundo anti-idiotipo (del
tipo alfa) reconoce un epítopo dentro de la región variable del
anticuerpo primario y la unión no es sensible a la presencia del
analito. Sin embargo, la unión del tipo alfa al anticuerpo primario
está impedida estéricamente en presencia del tipo beta. Estos tres
tipos de anticuerpos permiten el desarrollo de un ensayo no
competitivo para analitos pequeños.
Se han desarrollado los denominados
inmunoensayos de tipo sándwich abiertos para la detección de
haptenos (Suzuki et al., 2000; Suzuki et al., 1999;
Yokozeki et al., 2002). Son ensayos no competitivos basados
en un fenómeno de acuerdo con el cual se favorece enormemente la
asociación de las cadenas V_{H} y V_{L} separadas en algunos
anticuerpos en presencia de antígeno (Ueda et al., 1996).
A pesar de los significativos beneficios del
formato de inmunoensayo no competitivo, sólo se han presentado
algunos ejemplos de ese tipo de ensayos para analitos pequeños. La
razón más probable para ello es la dificultad de producir
anticuerpos secundarios (anti-inmunocomplejo o
anti-idiotípicos) por medio de la inmunización de
animales. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales
anti-haptenos, que se han desarrollado mediante la
tecnología de hibridomas (Kohler and Milstein, 1975) son
autoantígenos para ratones y es difícil provocar una respuesta
inmune contra ellos (Maruyama et al., 2002; Ullman et
al., 1993; Kobayashi et al., 2000). Un problema añadido
es que el inmunocomplejo usado para la inmunización tiende a
degradarse antes de que se obtenga la respuesta contra el
inmunocomplejo (Ullmann et al., 1993; Kobayashi et
al., 2000).
La presente invención proporciona ahora un
protocolo de inmunoensayo no competitivo para analitos pequeños,
que evita la inmunización de animales con el inmunocomplejo, que
hasta ahora ha sido la tarea más desafiante cuando se han
desarrollado anticuerpos anti-IC. La invención
también facilita un inmunoensayo homogéneo que mejora
adicionalmente la velocidad, sensibilidad y simplicidad del
ensayo.
Las dificultades asociadas con la producción de
anticuerpos anti-IC para su uso en inmunoensayos
para analitos pequeños pueden evitarse ahora proporcionando los
anticuerpos anti-IC necesarios a partir de una
biblioteca de presentación de compañeros de unión recombinante en
vez de a partir de animales inmunizados. Puede construirse una
biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos que contiene un
gran número de clones, de los cuales aquellos que codifiquen los
compañeros de unión deseados, tales como fragmentos de anticuerpos,
pueden enriquecerse y seleccionarse mediante selección secuencial.
Este protocolo abre nuevas posibilidades para el desarrollo de
inmunoensayos rápidos, fiables y sencillos para analitos pequeños de
una forma rentable y viable.
Por consiguiente, un objeto de la presente
invención es un inmunoensayo no competitivo para un analito pequeño
de menos de 5000 Da que comprende hacer reaccionar una muestra que
contiene dicho analito con un par de reactivos que comprende un
primer compañero de unión que se une a dicho analito y un segundo
compañero de unión que se une al complejo de dicho analito y dicho
primer compañero de unión, y determinar la unión del segundo
compañero de unión, indicando de esta forma la presencia del
analito en la muestra. El inmunoensayo se caracteriza mediante la
obtención del segundo compañero de unión a partir de una biblioteca
de presentación de compañeros de unión recombinante sin tratamiento
previo, mediante la selección de un compañero de unión que se une a
dicho complejo del analito y del primer compañero de unión.
Un objeto adicional de la invención es un
proceso para preparar un par de reactivos para un inmunoensayo no
competitivo para un analito pequeño de menos de 5000 Da, que
comprende el suministro de un primer compañero de unión que se une
a dicho analito y un segundo compañero de unión que se une al
complejo de dicho analito y dicho primer compañero de unión,
caracterizado por la obtención del segundo compañero de unión a
partir de una biblioteca de presentación de compañeros de unión
recombinante sin tratamiento previo, mediante la selección de un
compañero de unión que se una a dicho complejo del analito y el
primer compañero de unión.
Pueden usarse en el ensayo nuevas proteínas de
unión recombinantes, que comprenden la porción de unión a ligando
de Fab M1 que comprende la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2; Fab M2 que
comprende la SEC ID Nº 3 y la SEC ID Nº 4; o K11 scFv que comprende
la SEC ID Nº 5.
Se describe ADN que codifica las nuevas
proteínas de unión, así como células hospedadoras que las
expresan.
Se exponen realizaciones ventajosas de la
invención en las reivindicaciones adjuntas.
Otros objetos, detalles y ventajas de la
presente invención serán evidentes a partir de los siguientes
dibujos, descripción detallada y ejemplos.
Figura 1. Un ELISA competitivo que usa Fab M1.
Orina + es orina con 1 \mug/ml de morfina añadida.
Figura 2. Un inmunoensayo fluorescente con
resolución temporal no competitivo (TR-FIA) con el
fragmento de scFv del inmunocomplejo de anti-M1 +
morfina K11 marcado con Eu. a) Reactividad cruzada y sensibilidad
del ensayo. b) Sensibilidad del ensayo con diluciones de control de
orina S1 como muestras.
Figura 3. Un inmunoensayo de
TR-FRET homogéneo de morfina.
Figura 4. Análisis de la reactividad cruzada del
fragmento Fab de antimorfina M1 con codeína, heroína, noscapina y
papaverina mediante un ELISA competitivo.
Figura 5. Un inmunoensayo homogéneo basado en
TR-FRET comparativo para morfina.
El par de reactivos para el inmunoensayo no
competitivo de la invención comprende un primer compañero de unión
y un segundo compañero de unión. El primer compañero de unión se une
al analito para formar un complejo entre el primer compañero de
unión y el analito. El segundo compañero de unión se une al complejo
formado por el primer compañero de unión y el analito. Los
compañeros de unión son habitualmente proteínas tales como
anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpo que tienen las
propiedades de unión deseadas. Un anticuerpo es una molécula de
inmunoglobulina y puede pertenecer a cualquiera de las clases de
IgG, IgM, IgE, IgA o IgD; siendo IgG e IgM las usadas más
frecuentemente. Preferiblemente, los compañeros de unión son
fragmentos de anticuerpo que comprenden el sitio de unión a
ligando, tales como Fab, o fragmentos scFv. El fragmento conocido
como fragmento Fab (fragmento de unión a antígeno) consiste en el
dominio variable y constante de una cadena ligera de inmunoglobulina
unida de forma covalente por un puente disulfuro al dominio
variable y al primer dominio constante de una cadena pesada de
inmunoglobulina. El Fv (dominio variable) se refiere a las regiones
variables de la molécula de inmunoglobulina que son responsables de
la unión al ligando. El ScFv (Fv de cadena sencilla) se refiere a
una molécula en la que los dominios variables de las cadenas pesada
y ligera de un anticuerpo se unen por un péptido para formar una
sola cadena polipeptídica sintetizada a partir de una sola molécula
de ARNm. Las regiones variables de la cadena pesada y la cadena
ligera de una inmunoglobulina son en conjunto responsables de la
unión a ligando. El ligando es la sustancia a la que se une el
compañero de unión, junto con anticuerpos, es un antígeno o un
hapteno.
El primer compañero de unión puede ser un
anticuerpo policlonal o monoclonal convencional o un fragmento del
mismo, pero preferiblemente es uno recombinante, como lo es el
segundo compañero de unión. Cuando se ha seleccionado el primer
compañero de unión, forma un complejo con su ligando y este complejo
se usa para seleccionar el segundo compañero de unión a partir de
un biblioteca recombinante sin tratamiento previo. El primer
compañero de unión sin el ligando se usa como contraselección. El
segundo compañero de unión debería reconocer únicamente complejos,
no primeros compañeros de unión libres ni antígenos libres en ningún
grado significativo.
La biblioteca de compañeros de unión
recombinante funciona es, convenientemente, una biblioteca de
expresión, que típicamente es una biblioteca de presentación. El
principio general de las bibliotecas de presentación de compañeros
de unión recombinantes es que presentan el compañero de unión como
una proteína de fusión en la superficie, que puede ser la
superficie de una célula microbiana, tal como una célula de levadura
o bacteriana, o un fago. La biblioteca de presentación de
compañeros de unión recombinante también puede ser una biblioteca
de presentación en la que se producen complejos estables de proteína
naciente y ARNm en un sistema de expresión in vitro. Las
bibliotecas de presentación en fagos son las usadas más
frecuentemente. Se describe la tecnología de presentación en fagos
de anticuerpos y sus aplicaciones, por ejemplo, en Hoogenboom et
al., 1998.
Una biblioteca de presentación en fagos de
anticuerpos se puede construir mediante la clonación de dominios de
inmunoglobulina que codifican ADNc en un vector de presentación en
fagos apropiado. El ADN que codifica millones de variantes de
fragmentos de anticuerpos se clona en lotes en el vector como parte
de la proteína de recubrimiento del fago. Pueden obtenerse grandes
bibliotecas que contienen millones de fragmentos de anticuerpos con
diferentes especificidades mediante la transformación de los
vectores en la bacteria. El cultivo de las bacterias lleva a la
expresión de fagos que presentan fragmentos de anticuerpos en su
superficie. El gen para el anticuerpo presentado se lleva en el
genoma del fago, enlazando así genotipo y fenotipo. La conexión
física entre la proteína presentada y su ADN permite la exploración
de grandes números de variantes de la proteína, cada una ligada a
su ADN correspondiente, mediante una sencillo proceso de selección
in vitro sencillo denominado selección
(panning). En su forma más simple, la selección se
lleva a cabo incubando la combinación de variantes presentadas en
fagos con el ligando de interés, que se ha inmovilizado en un
soporte, eliminando por lavado los fagos no unidos y eluyendo
específicamente los fagos unidos por rotura de la unión al ligando.
Después, el fago eluido se amplifica in vivo. Se repite el
proceso varias veces, dando como resultado un enriquecimiento
progresivo de la combinación de fagos, a favor las secuencias de
unión más estrecha. Después de aproximadamente 3 a 6 vueltas de
selección y amplificación, se secuencian los mejores clones y se
usan para transformar una célula hospedadora para la expresión
posterior. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota o
procariota, por ejemplo, una célula de levadura, animal, planta o
insecto o célula bacteriana. Puede ser incluso una célula de
hibridoma que, tras su transformación, produce un anticuerpo
monoclonal recombinante. El compañero de unión recombinante, o al
menos parte del mismo, también puede producirse de forma
sintética.
El concepto del uso de bibliotecas de
anticuerpos recombinantes hace posible el ensayo de tipo sándwich no
competitivo para analitos pequeños. El sándwich puede detectarse
mediante todos los inmunoensayos convencionales. Normalmente se
inmoviliza un compañero de unión en un soporte, tal como un pocillo
de microtitulación o una perla. Se forma un sándwich en presencia
de analito y del otro compañero de unión. El sándwich puede
detectarse, por ejemplo, usando anticuerpos secundarios o marcando
al menos uno de los compañeros de unión. El marcador puede ser
cualquier marcador convencional, como un marcador radiactivo, una
enzima o un compuesto fluorescente. El ensayo puede ser, por
ejemplo, ELISA o FIA.
Una gran ventaja del par de reactivos usado en
la presente invención es que permite un inmunoensayo no competitivo
homogéneo, es decir, un inmunoensayo que se lleva a cabo en
solución. El evitar las etapas de inmovilización y lavado hace que
el ensayo sea extremadamente sencillo. También es adecuado un ensayo
de este tipo para el ensayo in situ, es decir, en otros
lugares aparte del laboratorio.
Un inmunoensayo homogéneo preferible es uno
basado en la transferencia de energía por resonancia de
fluorescencia (FRET), para una revisión véase Szöllösi et
al, 1998. En el FRET, la energía de un fluoróforo molecular
(donador) se excita hasta un estado de alta energía y se transfiere
a otro fluoróforo (aceptor) a través de un acoplamiento
intermolecular dipolo-dipolo. Esto sólo es posible
si la distancia entre el donador y el aceptor es corta
(10-100 A) y el espectro de fluorescencia del
donador y el espectro de absorción del aceptor se solapan
parcialmente. Después, se detecta la transferencia de energía como
un cambio en la fluorescencia. A menudo se utiliza fluorescencia
con resolución temporal (Hemmilä et al., 1988).
El FRET se aplica en la presente invención
marcando los dos compañeros de unión, que preferiblemente son
fragmentos de anticuerpos, con fluoróforos que forman un par
donador-aceptor de FRET. Cuando los compañeros de
unión y los analitos son pequeños, los fluoróforos se aproximan
mucho y se obtiene una señal de FRET medible.
La invención proporciona una herramienta
analítica conveniente y rápida para analitos de bajo peso molecular,
tales como fármacos terapéuticos o de abuso, esteroides, hormonas,
metabolitos y contaminantes ambientales y toxinas. Una
característica común de estos analitos pequeños es que son demasiado
pequeños para los ensayos de sándwich convencionales, en los que se
usan dos anticuerpos que reconocen epítopos diferentes del antígeno.
El peso molecular de estos analitos pequeños es normalmente menor
de 5000, aunque los límites no son absolutos.
El inmunoensayo puede emplearse en todo tipo de
investigaciones, tales como en la detección de riesgos
medioambientales, compuestos tóxicos en alimentos y piensos,
indicadores químicos de procesos en desarrollo, por ejemplo,
procesos microbiológicos en edificios, procesos metabólicos de
organismos vivos y en ensayos clínicos, vigilancia de fármacos e
investigación farmacológica. Los ensayos son extremadamente útiles
para detectar drogas de abuso, como opiáceos (por ejemplo,
morfina), anfetaminas, canabinoides (por ejemplo,
tetrahidrocanabinol, THC), barbitúricos, benzodiazepinas, cocaína,
LSD, metadona, metacualona, penciclidina, propoxifeno,
antidepresivos tricíclicos. El ensayo homogéneo proporciona una
herramienta excelente y conveniente para realizar ensayos in
situ, por ejemplo, a usar por la policía en redadas de
conductores, etc. La muestra a analizar para, por ejemplo, fármacos
y drogas de abuso, puede ser cualquier muestra de fluido corporal,
como sangre, suero, orina o saliva.
El par de reactivos usado en la invención puede
incluirse en un kit de ensayo. Dicho kit de ensayo puede comprender
además cualquier otro reactivo necesario para el ensayo, tal como
soluciones de reacción, tampones, soluciones de lavado y medios de
detección, tales como marcadores y, opcionalmente, un fluorómetro.
Preferiblemente el kit de ensayo comprende múltiples pares de
reactivos físicamente separados uno de otro, por ejemplo, muchos en
forma de una microserie, por la que, por ejemplo, pueden ensayarse
simultáneamente muchas drogas de abuso diferentes pueden testarse a
partir de una sola muestra de saliva.
En una realización especial de la invención, se
produce un par de reactivos para detectar morfina y se emplea en un
inmunoensayo homogéneo para dicha sustancia. El primer compañero de
unión es un fragmento Fab obtenido de una biblioteca de
presentación en fagos de anticuerpos producida a partir de ADNc de
un ratón inmunizado con morfina conjugada a un inmunotransportador,
BSA. Los fagos de anticuerpos específicos de morfina se
enriquecieron seleccionando aquellos que se unen a la morfina
conjugada con BSA y eliminado por selección los que se unen sólo a
BSA. Tras varias vueltas de selección, se secuencian dos clones de
unión elevada y se expresan. Los fragmentos Fab expresados se
denominaron Fab M1 y M2 Fab.
El segundo compañero de unión se obtiene a
partir de una biblioteca de presentación en fagos de fragmentos de
anticuerpos scFv sin tratamiento previo por selección de los
anticuerpos que se unen a un complejo de morfina y Fab M1. Primero,
se preincuban los fagos para unirse a Fab M1 para eliminar por
selección los que se unen a Fab M1 como tal. Se separan los fagos
no unidos y se incuban con una mezcla de morfina y Fab M1
inmovilizado para seleccionar los fagos que se unen al
inmunocomplejo formado entre el Fab M1 inmovilizado y la morfina.
Los fagos no unidos se eliminan por lavado y después se eluyen los
unidos al complejo. El fondo se controla por examen de la unión a
Fab M1 en ausencia de morfina. Tras varias vueltas de selección se
escogen varios clones, se secuencian y se expresan, dando como
resultado el fragmento scFv K11.
Se realiza un inmunoensayo basado en
fluorescencia usando Fab M1 marcado con europio como primer
compañero de unión y fragmento scFv K11 marcado con Cy5 como
segundo compañero de unión. Los compañeros de unión se incuban con
muestras de saliva u orina que contienen morfina y entonces se mide
la fluorescencia tras un tiempo predeterminado. El ensayo es
completamente homogéneo y la señal es legible en aproximadamente 5
minutos. La sensibilidad tanto para orina como para saliva es
claramente mayor que la exigida por las autoridades en el caso de
la morfina, nuestro analito modelo. El rendimiento del ensayo es tal
que los reactivos están en el pocillo de una placa de
microtitulación y se añaden disoluciones seriadas de saliva u orina.
En un modo preferido, por ejemplo, para el uso en el campo
policial, los reactivos están en forma seca en un recipiente. Se
añade saliva, que disuelve los reactivos, y se puede leer el
resultado sin necesidad de procesos adicionales.
Las nuevas proteínas de unión recombinantes
descritas comprenden cualquier porción de unión a ligando de Fab
M1, Fab M2 o K11 scFv. Se entiende por "porción de unión a
ligando" aquella parte de la molécula que es responsable de la
unión.
Se inmunizó a cuatro hembras de ratón Balb/C de
seis semanas de edad en intervalos de tres semanas con morfina
conjugada con BSA (Fitzgerald) en adyuvante de Freund. Se ensayaron
muestras de suero tras la segunda estimulación y se seleccionó el
ratón que mostraba la mejor respuesta contra el antígeno en un
directo ELISA para ser la fuente de una biblioteca de presentación
en fagos de anticuerpos.
Todos los métodos de ADN recombinante básicos se
llevaron a cabo esencialmente como se describe (Sambrook et
al. 1990). Se sacrificó el ratón con la mayor respuesta de
anticuerpos contra el conjugado de morfina-BSA y se
aisló el ARN total de las células de bazo usando el RNagents® Total
RNA Isolation System (Promega Co., WI, Estados Unidos). Se aisló el
conjunto de ARNm del ARN total con el Oligotex mRNA Kit (QUIAGEN
Inc., Alemania). El ADNc se sintetizó a partir del ARNm con
cebadores oligo-dT. Se amplificaron los genes que
codifican fragmentos Fab de anticuerpos con PCR usando cebadores
específicos de la región variable y de la región constante de la
cadena pesada y la cadena ligera kappa de anticuerpos. Los productos
de PCR de la cadena ligera de anticuerpos se combinaron y
digirieron con las enzimas de restricción NheI y AscI, se
purificaron mediante un gel agarosa preparativo en combinación con
el QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc., Alemania). El ADN de la
cadena ligera de anticuerpo purificado en gel de agarosa se ligó en
el vector fagémido de Fab phagemid9 procedente de pComb3 (Barbas
et al., 1991) y se usó para transformar la cepa XL1- Blue de
E. coli (Stratagene) por electroporación. El ADN plasmídico
se aisló con el QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN Inc., Alemania) a
partir del cultivo de una noche. Los productos PCR que codifican la
región Fd (región variable y primera constante) de la cadena pesada
se combinaron y se digirieron con las enzimas de restricción SfiI y
NotI, se purificaron mediante aislamiento en un gel agarosa
preparativo y se ligaron en el vector fagémido que contenía el ADN
de la cadena ligera. El vector fagémido que codifica tanto la cadena
ligera como la pesada del fragmento Fab se usó para transformar
bacterias E. coli TOP10F' (Invitrogen Inc., CA, Estados
Unidos) por electroporación. Las bacterias transformadas se
incubaron durante una noche a 37ºC en un agitador y se aisló el ADN
plasmídico con el QIAGEN Plasmid Midi Kit. La diversidad de la
biblioteca de anticuerpos se aseguró por secuenciación parcial de
las regiones de genes V_{L} o V_{H} de clones individuales.
Una biblioteca de presentación en fagos de
anticuerpos se preparó de la siguiente manera: 4 \mug de ADN
plasmídico de una biblioteca de anticuerpos se transformaron en
E. coli TOP10F' por electroporación en dos transformaciones
paralelas. Después de las transformaciones, se suspendieron las
células en 2,8 ml de medio SOC y se incubaron durante 1 h a 35ºC en
un agitador. Se añadieron 7 ml de medio SB precalentado (+37ºC), 20
\mug/ml de carbenicilina y 10 \mug/ml de tetraciclina. Tras 1 h
de incubación a +35ºC en un agitador, se añadió 30 \mug/ml de
carbenicilina y se continuó la incubación durante 1 h, tras la cual
se añadió 1 ml (\sim10^{11} ufp) de fago auxiliar
VCS-M13 (Stratagene) y se permitió que los fagos
infectaran las bacterias durante 20 min a 35ºC con agitación lenta.
Las transformaciones en paralelo se juntaron y se añadieron 80 ml
de medio SB precalentado (+37ºC) con 50 \mug/ml de carbenicilina y
10 \mug/ml de tetraciclina. Tras 2 h de incubación a 35ºC en un
agitador, se añadieron 70 \mug/ml de kanamicina y se continuó con
la incubación durante una noche.
Se centrifugaron las células durante 15 min a
4000 g a +4ºC. Se añadieron 20 ml de PEG al 20%, NaCl 2,5 M
(PEG/NaCl) al sobrenadante y se incubó durante 30 minutos en hielo.
Los fagos precipitados con PEG se centrifugaron durante 20 min a
13000 g a +4ºC. El sedimento se suspendió en 2 ml de PSB y se
transfirió 1 ml a dos tubos eppendorf. Tras la centrifugación
durante 5 min a +4ºC, se precipitaron los fagos por adición de 200
\mul de PEG/NaCl al sobrenadante. La solución se mezcló y
centrifugó durante 5 min a +4ºC. El sedimento se suspendió en 1 ml
de PBS o PBS + BSA al 1%. Se añadió 1 \mul de
azida-Na al 20% como conservante. Se guardó la
biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos a +4ºC.
Se seleccionaron anticuerpos específicos de
morfina a partir de la biblioteca de presentación en fagos de
anticuerpos mediante el siguiente procedimiento de selección: Se
recubrió un pocillo de microtitulación durante una noche a +4ºC con
1 \mug de morfina conjugada con BSA (morfina-BSA;
Fitzgerald Industries International, Inc., Ma, Estados Unidos) en
100 \mul de tampón Na-bicarbonato 100 mM, pH 9.8.
El pocillo se lavó dos veces con PBS y se bloqueó con BSA al 1% en
PBS durante 1 h a +37ºC. Se incubaron 100 \mul de la biblioteca de
fagos en el pocillo durante 1 h a temperatura ambiente con
agitación, tras lo cual se eliminaron los fagos no unidos y se lavó
el pocillo 22 veces con PBS. Se eluyeron los fagos unidos con 100
\mul de HCl 100 mM (pH 2,2) durante 15 min. Se retiraron del
pocillo los fagos eluidos y se neutralizaron con Tris 1 M. Se
infectaron 3 ml de células frescas de E. coli
XL1-Blue (DO_{600} \sim 1)
cultivadas en SB suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina, con fagos eluidos a +35ºC durante 15 minutos. Se añadieron 7 ml de SB precalentado (+37ºC) con 20 \mug/ml de carbenicilina y 10 \mug/ml de tetraciclina y el cultivo se incubó durante 1 h a +35ºC en un agitador. Se añadieron 30 \mug/ml de carbenicilina y se continuó la incubación durante 1 h. Se añadió al cultivo 1 ml de fago auxiliar VCS-M13 y se incubó durante 15 minutos a +35ºC con agitación lenta. Se disolvió el cultivo con 90 ml de SB precalentado (+37ºC) con carbenicilina 50 \mug/ml y tetraciclina 10 \mug/ml. Tras 2 h de incubación a +35ºC en un agitador, se añadieron 70 \mug/ml de kanamicina y se continuó con la incubación durante una noche. La purificación de los fagos amplificados se llevó a cabo mediante precipitación con PEG, como se ha descrito previamente.
cultivadas en SB suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina, con fagos eluidos a +35ºC durante 15 minutos. Se añadieron 7 ml de SB precalentado (+37ºC) con 20 \mug/ml de carbenicilina y 10 \mug/ml de tetraciclina y el cultivo se incubó durante 1 h a +35ºC en un agitador. Se añadieron 30 \mug/ml de carbenicilina y se continuó la incubación durante 1 h. Se añadió al cultivo 1 ml de fago auxiliar VCS-M13 y se incubó durante 15 minutos a +35ºC con agitación lenta. Se disolvió el cultivo con 90 ml de SB precalentado (+37ºC) con carbenicilina 50 \mug/ml y tetraciclina 10 \mug/ml. Tras 2 h de incubación a +35ºC en un agitador, se añadieron 70 \mug/ml de kanamicina y se continuó con la incubación durante una noche. La purificación de los fagos amplificados se llevó a cabo mediante precipitación con PEG, como se ha descrito previamente.
Los fagos purificados se usaron en sucesivas
vueltas de enriquecimiento. Tras cuatro vueltas de selección, los
fagos de anticuerpos específicos para morfina se habían enriquecido
más de 1000 veces en comparación con el fondo. La unión de fondo de
los fagos se controló en paralelo en cada vuelta de selección,
incubando la biblioteca de fagos en un pocillo de microtitulación
recubierto con BSA. Se lavó el pocillo y se eluyeron los fagos,
como en el pocillo recubierto con morfina-BSA. Se
controló el enriquecimiento de los fagos específicos de morfina,
comparando la cantidad de los fagos eluidos del pocillo recubierto
con morfina-BSA con la cantidad de fagos eluidos
del pocillo de fondo.
Tras la cuarta vuelta de selección, se aisló el
ADN de fagémido con el QIAGEN Plasmid Midi Kit. Se digirió el
plásmido con enzimas de restricción NheI y NotI para aislar el
fragmento génico de Fab. El ADN aislado en gel de agarosa se ligó
con el vector de expresión pKKtac. La reacción de ligamiento se
transformó en células E. coli XL-1 Blue.
Se seleccionaron clones individuales y se
extrajo ADN de una minipreparación con el QIAprep Spin Miniprep Kit
(QIAGEN Inc., Alemania). Según la secuencia de las
minipreparaciones, se encontraron dos clones de Fab diferentes. A
estos clones se les denominó M1 y M2. Las secuencias de aminoácidos
del fragmento Fab M1 eran la SEC ID Nº 1 (cadena ligera) y SEC ID
Nº 2 (cadena pesada). Los aminoácidos del número 3 al 108
representan la región variable y los del número 109 a 215
representan la región constante de la cadena ligera de M1 (SEC ID
Nº 1). Los aminoácidos del número 4 al 123 representan la región
variable y los del nº 124 al 226 representan la región constante de
la cadena pesada de M1 (SEC ID Nº 2). Las secuencias de aminoácidos
del fragmento Fab M2 eran la SEC ID Nº 3 (cadena ligera) y la SEC
ID Nº 4 (cadena pesada). Los aminoácidos del número 3 al 108
representan la región variable y los del número 109 al 215
representan la región constante de la cadena ligera M2 (SEC ID Nº
3). Los aminoácidos del nº 4 al 123 representan la región variable y
del nº 124 al 226 la región constante de la cadena pesada de M2. El
resto de los aminoácidos proviene de la técnica de clonación, y
algunos de los aminoácidos C-terminales facilitan
el aislamiento y la purificación de la proteína. Se realizaron
también cultivos de expresión de Fab a pequeña escala (3 ml). La
fracción periplásmica de las células se aisló mediante congelación
y descongelación de las células tres veces en
PBS.
PBS.
La unión de clones de Fab individuales con
morfina se ensayó por ELISA en pocillos de microtitulación
recubiertos con morfina-BSA: Se recubrieron
pocillos de microtitulación con 200 ng de
morfina-BSA en tampón de
Na-bicarbonato 0,1 M, pH 9,8, durante una noche a
+4ºC. Los pocillos de control se rellenaron sólo con el tampón. Tras
recubrirlos, se lavaron tres veces con PBS y se bloquearon con BSA
al 0,5% en PBS (BSA/PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los
pocillos se lavaron tres veces con PBS y se añadió a los pocillos
una dilución 1:10 de las fracciones periplásmicas en 100 \mul de
BSA/PBS. Tras una hora de incubación a temperatura ambiente en un
agitador, se lavaron los pocillos tres veces con PBS y se añadió un
anticuerpo específico anti-Fab de ratón conjugado
con fosfatasa alcalina diluido 1:2000 (Sigma,
A-1293) en 100 \mul de BSA/PBS. Los pocillos se
incubaron en un agitador a temperatura ambiente durante 1 hora y se
lavaron tres veces con PBS. Se añadieron a los pocillos 100 \mul
de una solución de sustrato de fosfatasa alcalina (2 mg/ml de sal
disódica de p-nitrofenilfosfato en tampón de
dietanolamina-MgCl) y se midió la absorbancia. Según
los resultados preliminares, el Fab M1 mostró mayor rendimiento en
el ensayo y fue, por lo tanto, seleccionado para la
continuación.
El fragmento de Fab antimorfina M1 en el vector
de expresión pKKtac se usó para transformar la cepa de expresión de
E. coli RV308. El Fab se expresó mediante fermentación
semicontinua en un fermentador Bio-Flow lV (New
Brunswick) y se purificó mediante la cromatografía de intercambió
iónico con Sepharose SP y proteína G (Pharmacia).
El rendimiento del fragmento Fab antimorfina M1
se ensayó en un ensayo de ELISA competitivo usando los controles S1
y S3 de toxicología en orina comerciales (Bio-Rad).
El control de toxicología en orina S1 contiene fármacos y
metabolitos de fármacos (incluyendo morfina) a concentraciones del
20-25% inferiores a los niveles de corte del
inmunoensayo, como recomienda la U. S. Substance Abuse and Mental
Health Services Administration (SAMSHA) y otras agencias. El
control de toxicología en orina S3 contiene fármacos y metabolitos
de fármacos a concentraciones de aproximadamente tres veces los
niveles de corte del inmunoensayo. Los pocillos de microtitulación
se recubrieron durante una noche a +4ºC con 500 ng de
morfina-BSA en 100 \mul de tampón
Na-bicarbonato, pH 9,8. Se lavaron los pocillos
tres veces con PBS y se bloquearon con BSA/PBS durante una hora a
temperatura ambiente. Tras tres lavados con PBS, se añadieron
diluciones en orina de S1, S3 (Bio-Rad), control
positivo o control negativo a los pocillos en 100 \mu de BSA/PBS
con 1 ng de Fab M1 añadido. Los pocillos se incubaron durante 2
horas a temperatura ambiente en un agitador y se lavaron tres veces
con PBS. Se añadió anticuerpo anti-Fab conjugado
con fosfatasa alcalina diluido 1:2000 a los pocillos en 100 \mul
de BSA/PBS y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Los
pocillos se lavaron tres veces con PBS, se añadieron 100 \mul de
solución de sustrato de fosfatasa alcalina y se midió la A_{405}.
Los resultados se muestran en la figura 1. Un resultado positivo
podía conseguirse con una dilución 1:64 de la muestra.
El fragmento Fab M1 se biotiniló con un kit
InmunoPure
Sulfo-NHS-LC-Biotin
(Pierce). Se purificó el anticuerpo biotinilado y el tampón se
cambió a PBS con columnas Econo-Pac 10DG
(Bio-Rad, CA, Estados Unidos). Se preincubaron 200
\mul de una biblioteca de presentación en fagos de scFv humanos
sin tratamiento previo (cadena ligera kappa o lambda) en BSA/PBS
con 10 \mul de perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina
(Dynal, M-280) y 0,5 \mug de Fab M1 biotinilado
durante una noche a +4ºC. La biblioteca de demostración en fagos de
scFv humanos sin tratamiento previo se construyó a partir de
linfocitos combinados de 50 individuos sanos. El tamaño de la
biblioteca se estimó que era de 1 x 10^{8} clones. La biblioteca
de presentación en fagos de scFv humanos sin tratamiento previo
contiene los genes V_{H} específicos de IgM combinados con los
genes V_{L} específicos de kappa o de lambda. Se separaron los
fagos no unidos de las perlas y 100 \mul de ellos se incubaron
con 100 ng de morfina, 500 ng de Fab M1 biotinilado y 5 \mul de
partículas magnéticas recubiertas con estreptavidina, durante 1
hora a temperatura ambiente en un agitador. El fondo para el
procedimiento de selección se puso en práctica de una forma
similar, pero omitiendo la morfina de la reacción de unión. Se
lavaron las partículas magnéticas cinco veces con 0,5 ml de PBS y se
eluyeron los fagos unidos con 100 \mul de HCl (pH 2,2) durante 30
minutos. Los fagos eluidos se neutralizaron con Tris 1 M y se
infectaron células de E. coli XL1-Blue. Se
cultivaron las células y los fagos se purificaron como se ha
descrito anteriormente. Tras cinco vueltas de selección se observó
un enriquecimiento con la biblioteca de scFv que tenía las cadenas
ligeras kappa, cuando la cantidad de fagos eluidos se comparaba con
la cantidad de fagos eluidos del pocillo de control de fondo. El
enriquecimiento de elementos de unión específicos al inmunocomplejo,
formado por el Fab M1 y la morfina, también se observaba claramente
en un ELISA de fagos cuando se ensayaban las combinaciones de fagos
eluidas de las vueltas de selección.
Se escogieron y se secuenciaron clones de fagos
individuales. Todos los clones tenían la misma secuencia (SEC ID Nº
5). La secuencia de aminoácidos del fragmento scFv del
inmunocomplejo anti-M1 + morfina se denominó scFv
K11. Los aminoácidos del número 3 al 120 representan la región
variable de la cadena pesada, los del 140 al 246 representan la
región variable de la cadena ligera y los del número 121 al 139
representan el enlazador de scFv K11 (SEC ID Nº 5). El resto de los
aminoácidos proceden de la técnica de clonación y algunos de los
aminoácidos C-terminales facilitan el aislamiento y
la purificación de la proteína.
El gen que codifica el fragmento scFv K11 se
insertó en el vector de expresión pKKtac y se transformó en la cepa
de E. coli RV308. Las células se inocularon en 20 ml de LB
con 100 \mug/ml de ampicilina y se incubaron en un agitador
durante una noche a +37ºC. A partir del cultivo de una noche se
añadió un inóculo de 10 ml en dos frascos erlenmeyer que contenían
500 ml de LB con 100 \mug/ml de ampicilina. Se incubaron las
células a +37ºC en un agitador hasta que la DO_{600} fuera 1,
tras lo cual se añadieron 0,5 ml de IPTG 1M y 100 \mug/ml de
ampicilina al cultivo y se continuó con la incubación en un agitador
durante una noche a +30ºC. Tanto el sobrenadante del medio de
cultivo como la fracción periplásmica de las células se usaron para
la purificación del scFv K11. Se centrifugaron las células a 4000 g
durante 15 min y el sobrenadante se vertió en un matraz limpio. Las
células se resuspendieron en 20 ml de PBS. Se aisló la fracción
periplásmica de las células congelando (-70ºC) y descongelando
(+37ºC) las células tres veces. Después de la centrifugación a
12000 g durante 30 min, se recogió el sobrenadante periplasmático
transparente. El medio de cultivo y la fracción periplasmática se
trataron con 2 mg/ml de DNasal para eliminar el ADN cromosómico
residual durante dos horas a +37ºC. Como el scFv K11 expresado
tiene un marcador 6xHis en su extremo C-terminal,
podría purificarse por cromatografía de afinidad con metales
inmovilizados (IMAC). Se purificó el scFv K11 mediante cromatografía
en lecho expandido usando STREAMLINE Chelating (Amershampharmacia
biotech) como matriz y cobre como metal quelado. La pureza de scFv
K11 se comprobó con SDS-PAGE.
El anti-M1 purificado y el
fragmento scFv del inmunocomplejo de morfina K11 se marcaron con
europio quelado mediante el DELFIA Eu-Labelling Kit
(Wallac), como se describe por el fabricante. Se cambió el tampón
del scFv K11 marcado a Tris pH 7,8 50 mM, NaCl 0,9%. El rendimiento
del marcaje era de 0,4 Eu/scFv.
La sensibilidad y la reactividad cruzada de scFv
K11 se estudiaron mediante un inmunoensayo no competitivo. Se
lavaron tres veces con PBS pocillos de microtitulación recubiertos
con estreptavidina Streptawell (Roche) transparentes. Se añadieron
500 ng de Fab M1 antimorfina biotinilado a los pocillos en 100
\mul de BSA/PBS y los pocillos se incubaron durante 30 minutos a
temperatura ambiente en un agitador. Tras tres lavados con PBS, se
añadieron diluciones de muestra con morfina, anfetamina,
tetrahidrocanabinol (THC) o control de orina S1 añadidas a los
pocillos en 50 \mul de BSA/PBS. Se añadió scFv K11 marcado con
europio diluido 1:100 a los pocillos en 50 \mul de BSA/PBS y se
continuó con la incubación durante una hora. Se lavaron los pocillos
tres veces con PBS y se añadieron 100 \mul de solución
Enhancement (Wallac) a los pocillos. Tras agitar 15 minutos a
temperatura ambiente, se detectó la fluorescencia mediante un
fluorómetro Victor V (Wallac). Los resultados se muestran en la
Figura 2. Hay una diferencia significativa en la afinidad entre la
unión de scFv K11 al fragmento de anticuerpo primario M1 y al
inmunocomplejo de M1 y morfina. Esto permite la detección de 1
ng/ml de morfina en una muestra. No se detectó reactividad cruzada
con anfetamina o THC.
El fragmento Fab antimorfina M1 se marcó con
europio mediante el kit LANCE Eu-W1024 ITC chelate
(Wallac). Se cambió el tampón del M1 marcado a Tris 50 mM, pH 7,8,
NaCl 0.9%. El rendimiento del marcaje fue de 1,1 Eu/Fab. El
fragmento scFv K11 del inmunocomplejo anti-M1 +
morfina scFv K11 se marcó con Cy5 mediante el
FluoroLink-Ab Cy labelling kit (Amershampharmacia
biotech). El rendimiento del marcaje fue de 2 Cy5/scFv.
Se añadieron diversas diluciones de morfina a
saliva y estas muestras se filtraron a través de lana de algodón
antes de añadirlas a los pocillos de microtitulación negros (Nunc).
Se añadieron 1 \mug de Fab M1 marcado con europio y 1 \mug de
scFv K11 marcado con Cy5 a los pocillos en 50 \mul de BSA/PBS. Se
leyó la TR-FRET tras 5, 15, 30 ó 60 minutos de
incubación a temperatura ambiente, mediante un fluorómetro Victor V
(Wallac). Los resultados se muestran en la Figura 3. Tras cinco
minutos de incubación se detectó 1 ng/ml de morfina en saliva.
Aunque se ha descrito una estrategia para
suministrar reactivos y ensayos de la invención, numerosas
variaciones y modificaciones serán evidentes para el especialista
en la técnica.
La reactividad cruzada del fragmento Fab
antimorfina M1 con codeína, heroína, noscapina y papaverina se
ensayó en un ELISA competitivo. Se recubrieron pocillos de placas
de microtitulación durante una noche a +4ºC con 500 ng de
morfina-BSA en 100 \mul de tampón
Na-bicarbonato, pH 9,8. Los pocillos se lavaron tres
veces con PBS y se bloquearon con BSA al 0,5%/PSB durante una hora
a temperatura ambiente, y se lavaron de nuevo tres veces con PBS.
Se añadieron a los pocillos dos muestras de 100 \mul en paralelo
que contenían morfina, codeína, heroína, noscapina o papaverina
(39, 78,156, 313, 625, 1250, 2500 ó 5000 ng/ml) en PBS con 5 ng de
Fab M1 purificado y se incubaron durante 30 min a temperatura
ambiente en un agitador y se lavaron tres veces con PBS. Se añadió
a los pocillos anticuerpo anti-Fab conjugado con
fosfatasa alcalina diluido 1:2000 (Sigma, A-1293)
en 100 \mul de BSA al 0,5%/PBS y se incubaron durante 30 minutos a
temperatura ambiente en un agitador. Se lavaron tres veces los
pocillos con PBS, se añadieron 100 \mul de una disolución de
sustrato de fosfatasa alcalina y se midió la A_{450}. Los
resultados se muestran en la Figura 4. De acuerdo con el resultado
del ELISA competitivo el anticuerpo M1 tiene gran reactividad
cruzada con la codeína y la heroína, que son estructuralmente muy
similares a la morfina.
El fragmento Fab antimorfina M1 se marcó con
europio mediante el kit LANCE Eu-W1024ITC (Wallac).
Se cambió el tampón del M1 marcado a Tris 50 mM, pH 7,8, NaCl 0,9%.
El rendimiento del marcaje fue de 1,1 Eu/FAb. El fragmento scFv del
inmunocomplejo anti-M1 + morfina K11 se marcó con
Cy5 mediante FluoroLink-Ab Cy5 labelling kit
(Amersham Pharmacia Biotech). El rendimiento del marcaje fue de 2
Cy5/scFv.
A la saliva se le añadió una elevada
concentración (10 \mug/ml) de los siguientes fármacos: morfina,
heroína, codeína, papaverina y noscapina. Se filtraron las muestras
a través de lana de algodón antes de añadirlas en pocillos de
microtitulación negros (Nunc). Se añadió 1 \mug de Fab M1 marcado
con europio y 1 \mug de scFv K11 marcado con Cy5 a los pocillos
en 50 \mul de BSA/PBS. Como control, se midió la fluorescencia de
fondo del par de anticuerpos M1 y K11 sin ningún fármaco añadido.
Tras cinco minutos de incubación a temperatura ambiente se leyó el
TR-FRET mediante un fluorómetro Victor V (Wallac).
Los resultados se muestran en la figura 5.
La muestra de saliva con morfina añadida da un
valor de fluorescencia elevado, mientras que los otros fármacos dan
valores de fluorescencia que son similares a la fluorescencia de
fondo detectada a partir del control (fragmentos M1 y scFv K11
marcados sin ningún fármaco añadido). El scFv K11 se une al
inmunocomplejo formado entre el M1 y la morfina con una
especificidad extremadamente elevada. K11 es capaz de discriminar
completamente el inmunocomplejo de M1 y morfina de los
inmunocomplejos entre el M1 y la heroína o el M1 y la codeína, lo
que dio valores de fluorescencia que se corresponden con el nivel de
fondo.
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<400> 5
Claims (13)
1. Un inmunoensayo no competitivo para un
analito pequeño de menos de 5000 Da que comprende hacer reaccionar
una muestra que contiene dicho analito con un par de reactivos, que
comprende un primer compañero de unión que se une a dicho analito y
un segundo compañero de unión que se une al complejo de dicho
analito y dicho primer compañero de unión, y determinar la unión
del segundo compañero de unión, indicando así la presencia del
analito en la muestra, caracterizado por la obtención del
segundo compañero de unión a partir de una biblioteca de
presentación de compañeros de unión recombinante sin tratamiento
previo, mediante la selección de un compañero de unión que se une a
dicho complejo del analito y del primer compañero de unión.
2. El ensayo de la reivindicación 1,
caracterizado porque el primer y el segundo compañero de
unión se seleccionan de fragmentos Fab y scFv de anticuerpos.
3. El ensayo de la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque dicho ensayo es un ensayo homogéneo.
4. El ensayo de la reivindicación 3,
caracterizado porque dicho ensayo se basa en transferencia de
energía por resonancia de fluorescencia (FRET).
5. El ensayo de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el analito
es una droga de abuso.
6. El ensayo de la reivindicación 5,
caracterizado porque el analito es morfina,
tetrahidrocanabinol (THC) o anfetamina.
7. El ensayo de la reivindicación 1,
caracterizado porque el segundo compañero de unión comprende
una porción de unión a ligando de scFv K11 que comprende la SEC ID
Nº 5.
8. El ensayo de la reivindicación 1 ó 7,
caracterizado porque el primer compañero de unión comprende
una porción de unión a ligando de Fab M1 que comprende la SEC ID Nº
1 y la SEC ID Nº 2, o de Fab M2 que comprende la SEC ID Nº 3 y la
SEC ID Nº 4.
9. El ensayo de la reivindicación 8,
caracterizado porque dicha porción de unión a ligando del
primer compañero de unión está formada por los aminoácidos nº 3 a
108 de la SEC ID Nº 1 y los aminoácidos nº 4 a 123 de SEC ID Nº 2;
o por los aminoácidos nº 3 a 108 de la SEC ID Nº 3 y los aminoácidos
nº 4 a 123 de la SEC ID Nº 4; y del segundo compañero de unión por
los aminoácidos nº 3 a 120 y nº 140 a 246 de la SEC ID Nº 5.
10. Un proceso para preparar un par de reactivos
para un inmunoensayo no competitivo para un analito pequeño de
menos de 5000 Da, que comprende proporcionar un primer compañero de
unión que se une a dicho analito y un segundo compañero de unión
que se une al complejo de dicho analito y dicho primer compañero de
unión, caracterizado por la obtención de dicho segundo
compañero de unión a partir de una biblioteca de presentación de
compañeros de unión recombinante sin tratamiento previo, mediante
la selección de un compañero de unión que se une a dicho complejo
del analito y del primer compañero de unión.
11. El proceso de la reivindicación 10,
caracterizado porque los fragmentos de anticuerpos
recombinantes se preparan a partir de una biblioteca de
presentación en fagos.
12. El proceso de la reivindicación 10 u 11,
caracterizado porque el primer compañero de unión sin el
ligando se usa como contraselección para seleccionar un segundo
compañero de unión que reconozca inmunocomplejos pero no el
compañero de unión libre ni analito libre.
13. El proceso de la reivindicación 11,
caracterizado porque los fagos de presentación se preincuban
primero con el primer compañero de unión unido, que comprende un
porción de unión a ligando de Fab M1 que comprende la SEC ID Nº: 1
y la SEC ID Nº:2, para separar los que se unen al primer compañero
de unión como tal, donde después se separan los fagos no unidos y
se incuban con una mezcla de morfina y primer compañero de unión
inmovilizado, para seleccionar fagos que se unen al inmunocomplejo
formado entre el primer compañero de unión inmovilizado y la
morfina, pero no con el primer compañero de unión como tal.
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