ES2312164T3 - Vectores de adenovirus para la transferencia de genes extraños en celulas del sistema nervioso central, particularmente en el cerebro. - Google Patents

Abstract

EL INVENTO SE REFIERE A UN VECTOR DNA RECOMBINANTE CARACTERIZADO EN QUE ES CAPAZ DE DIRIGIR LA PRESENTACION Y/O TRANSCRIPCION DE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA SELECCIONADA EN LAS CELULAS DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL Y EN QUE COMPRENDE (I) AL MENOS PARTE DE UN GENOMA DE UN ADENOVIRUS, INCLUYENDO LAS REGIONES REQUERIDAS PARA QUE EL ADENOVIRUS PENETRE EN LAS CELULAS NORMALMENTE INFECTABLES POR ESE ADENOVIRUS Y (II) INJERTARLO DENTRO DE DICHA PARTE DE GENOMA DE UN ADENOVIRUS BAJO EL CONTROL DE UN PROMOTOR, BIEN PRESENTE O TAMBIEN INSERTADO DENTRO DE DICHA PARTE DE GENOMA Y OPERATIVO EN DICHAS CELULAS. ESTE VECTOR RECOMBINANTE ENCUENTRA EMPLEO PARTICULAR EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL, TAMBIEN EN TERAPIA GENICA.

Description

Vectores de adenovirus para la transferencia de genes extraños en células del sistema nervioso central, particularmente en el cerebro.

Transferir ADN terapéutico con seguridad y eficacia dentro al sistema nervioso central, es un reto formidable en el desarrollo de terapias activas en las enfermedades cerebrales.

Se han llevado a cabo investigaciones preliminares con numerosos vectores, más específicamente vectores retrovíricos y vectores derivados del herpes simple. Sin embargo la utilidad de dichos vehículos de transferencia génica ha sido limitada hasta la fecha.

En la mayoría de los casos, los vectores retrovíricos no son útiles porque no pueden infectar células posmitóticas, incluyendo la mayoría de las células nerviosas (1). Los vectores derivados del herpes simple infectan las células nerviosas pero quedan sin resolver problemas de patogenicidad y de estabilidad de la expresión génica (2, 3). Además los vectores derivados del herpes simple han demostrado hasta la actualidad que presentan menos eficacia limitada de expresión. En un artículo más reciente (4) los autores se refieren a la expresión a corto plazo descrita al principio de los vectores derivados de VSH-1, porque la mayoría de los activadores utilizados habían resultado activos solamente durante la fase aguda de la infección vírica (menos de 10 días después de la infección). Dieron a conocer la expresión de un gen de b-glucuronidasa en una célula del sistema nervioso central bajo el control del activador LAT asociado normalmente a la secuencia del virus transcrita asociada con la latencia (LAT). Aunque los autores también describen que, aun cuando sus experimentos demostraron la viabilidad de utilizar el activador LAT para la expresión a largo plazo de los genes extraños en células del sistema nervioso central para corregir una insuficiencia enzimática genética en las células infectadas, muy pocas células habían sido corregidas para alterar el fenotipo de la enfermedad. Por consiguiente su sistema vectorial necesitaba ser mejorado para corregir suficientes células para obtener un efecto clínicamente significativo.

El documento WO 9207945 da a conocer la utilización de un vector del virus VSH-1 defectuoso para la infección de células nerviosas. Quantin et al. en PNAS EUA vol. 89, págs. 2581-2584 (1992) dan a conocer un adenovirus que expresa la beta-galactosidasa utilizada para la infección de células musculares in vivo. Cohen-Haguenauer y Boiron en Path Biol. Vol. 40, págs. 5-13 (1992) describen aproximadamente el estado de la técnica y las perspectivas en los vectores de terapia génica y mencionan que se están estudiando sistemas vectoriales, incluyendo vectores adenovíricos, para infectar neuronas posmitóticas diferenciadas.

Los objetivos de la invención consisten en superar dichas dificultades y proporcionar sistemas vectoriales más eficaces que pueden administrar genes extraños y, cuando resulte adecuado, sus productos de transcripción o productos de expresión directamente a las células del sistema nervioso central, particularmente a las células diferenciadas terminalmente, que no pueden proliferar. Un objetivo más específico de la invención consiste también en permitir la amplia difusión de dichos sistemas vectoriales por todo el tejido nervioso que se ha de infectar, incluso mientras permanecen confinadas sustancialmente a éstos.

Todavía otro objetivo de la invención consiste en producir dichos sistemas vectoriales que son suficientemente seguros para permitir un estudio y la regulación in vitro de genes clonados en dichas células o en animales de ensayo, y para la terapia, en el hombre o animales, que implica, la producción in situ de un producto de expresión seleccionado, que incluye la terapia génica.

La invención se basa en el reconocimiento de que los vectores derivados de adenovirus, particularmente de vectores de adenovirus no replicantes, pueden conseguir estos objetivos, tanto in vitro como in vivo. Proporcionan poderosos sistemas de administración de genes dentro de las células del sistema nervioso central, más particularmente las células del cerebro. Están caracterizados porque presentan un grado de infectividad de suficiente magnitud para que permita la infección de poblaciones considerables de células. Los experimentos biológicos dados a conocer a continuación demuestran la capacidad de los vectores derivados de adenovirus (o vectores adenovíricos) de células nerviosas que infectan de manera eficaz, específicamente neuronas, tanto in vitro como in vivo.

Por lo tanto la invención proporciona un procedimiento para la producción de un vector recombinante útil en un procedimiento que comprende dar lugar al producto de transcripción o el producto de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido seleccionable que ha de dirigirse o producirse en células del sistema nervioso central, por ejemplo, células cerebrales, específicamente neuronas, neurogliocitos o ependimocitos, en las que dicho vector recombinante es un vector adenovírico que comprende por lo menos parte del genoma de un adenovirus incluyendo las regiones de este genoma que proporcionan la información genética requerida por este adenovirus para penetrar en el interior de las células normalmente infectables por éste, estando insertada dicha secuencia nucleotídica en dicha parte del genoma, bajo el control de un activador presente o también insertado dentro de dicho vector adenovírico y resultando operativo dicho activador en dichas células.

Por lo tanto la invención está relacionada más específicamente con la utilización de un vector derivado de adenovirus para la expresión de un nucleótido seleccionado en las células del sistema nervioso central.

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La invención proporciona también un vector ADN recombinante caracterizado porque puede dirigir la expresión y/o transcripción de una secuencia nucleotídica seleccionada en las células del sistema nervioso central y en el que comprende (i) por lo menos parte del genoma de un adenovirus, incluyendo las regiones requeridas para que este adenovirus penetre en las células del sistema nervioso central, y (ii) dicha secuencia nucleotídica seleccionada bajo el control de un activador operativo en dichas células.

La potente capacidad de los vectores adenovíricos de transferir fragmentos de gen in vivo en células nerviosas latentes se ilustra mediante los experimentos comunicados a continuación, que se realizaron con un vector adenovírico que lleva el gen lac Z de E. coli de la tirosina hidroxilasa humana, gen, en células nerviosas de ratas adultas. Un gran número de células nerviosas (incluyendo neuronas, astrocitos, microgliocitos y ependimocitos) expresaron estos genes por lo menos 60 días después de la inoculación de varias áreas cerebrales. La inyección hasta de 3\times10^{5} pfu en 10 \mul no dio resultado en ningún efecto citopático detectable, que se observaron solamente para los valores de infección mayores (>10^{7} pfu/10 \mul) y estaban probablemente asociados a una endocitosis masiva de partículas víricas en células nerviosas próximas al punto de inyección.

Además los genomas de adenovirus pueden manipularse para alojar genes extraños de 7,5 kb de longitud o más. Existe una gran gama de hospedador, una patogenicidad baja en el hombre y pueden obtenerse altos valores de los virus (5).

Se apreciará fácilmente que estos resultados apoyan firmemente la presunción de que el adenovirus ofrece, como vector, una nueva y notable herramienta para modificar genéticamente células latentes del sistema nervioso, debido a su gran eficacia de infección, expresión a largo plazo, amplio intervalo de hospedador y baja toxicidad. Por lo tanto, el adenovirus debería ser instrumental en el estudio de la función de los productos génicos clonados en su contexto fisiológico y anatómico. La capacidad para infectar el hipocampo (como se muestra a continuación) es de gran interés para estudiar los fenómenos integrados tales como la potenciación a largo plazo, en animales.

Además el adenovirus aparece claramente como medio eficaz para transferir genes extraños dentro del cerebro con un objetivo terapéutico. Los vectores de adenovirus tienen gran potencial para la terapia génica de las enfermedades del sistema nervioso, tal como la administración local de factores de crecimiento o neurotransmisores para enfermedades degenerativas y, más en general, para reemplazar genes defectuosos en células apropiadas. Valores relativamente bajos de vectores de adenovirus pueden transferir con eficacia genes extraños en un número significativo de células cerebrales sin desencadenar efectos patológicos. El asunto para la utilización de la dosis de vectores recombinantes adenovíricos que contienen un gen extraño que debe administrarse en las células cerebrales, abren nuevas vías en el tratamiento de muchas enfermedades genéticas y neurológicas adquiridas, por consiguiente, una alternativa para el tratamiento con fármaco o el transplante cerebral de tejidos fetales.

Los adenovirus, específicamente los adenovirus de tipo 2 ó 5 (Ad2 o Ad5) resultan particularmente preferidos. Son relativamente estables, pueden cultivarse fácil y rápidamente (ciclo vírico de aproximadamente 30 horas) y proporcionan valores elevados: hasta de 10^{4} a 10^{5} unidades formadoras de placa (p.f.u.) por célula infectada. No son oncogénicos. La secuencia completa de su genoma vírico se ha creado (6) y su biología molecular se ha estudiado extensamente. Por último se han obtenido varios mutantes, particularmente los mutantes por eliminación, lo que hace posible insertar fragmentos de tamaño grande en éstos (7).

Preferentemente los vectores recombinantes para su utilización en la presente memoria son adenovirus defectuosos, cuyos genomas no contienen ya las secuencias nucleotídicas requeridas para la replicación del virus en las células (otras aparte de las células cerebrales) normalmente inyectables mediante éste. Más específicamente, están exentas de la región E1, incluyendo la región E1a primaria que activa otras unidades de transcripción iniciales del virus requerido para su réplica así como la región EIb implicada en la creación de un fenotipo completamente transformado, en la producción de secuencias de ADN durante la infección vírica y requeridas para la evolución normal de los episodios víricos tardíos en infección.

Preferentemente además, están desprovistos de la región E3 que está implicada en la inmunidad celular in vivo y es totalmente dispensable para el cultivo in vitro.

Preferentemente sin embargo el vector recombinante para su utilización en la presente memoria comprende todas las secuencias que son esenciales para la encapsulación del adenovirus.

El activador que controla la secuencia que codifica el polipéptido seleccionado que va a ser dirigido o producido en las células del sistema nervioso central, puede ser endógeno o exógeno con respecto a las partes adenovíricas del vector recombinante.

El activador homólogo preferido es cualquiera que es probable que sea reconocido por las polimerasas, prácticamente la ARN polimerasa II, de las células humanas o animales infectadas por dichos adenovirus. Un activador endógeno especialmente preferido es el potente activador tardío principal (MLP) del adenovirus humano de tipo 2 (Levrero et al., 1991) (8). Otro activador que puede utilizarse está constituido por el activador precoz de la región E1a del adenovirus. En este último caso, un adenovirus defectuoso preferido está desprovisto de su región 5' normalmente corriente arriba de este activador precoz. En este último caso, la secuencia nucleotídica buscada que debe introducirse en las células nerviosas se sustituye por la región E1A.

Los activadores endógenos de los adenovirus pueden también estar sustituidos por otros activadores omnipresentes de origen heterólogo o exógeno, por ejemplo:

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un activador contenido en la LTR (repetición larga terminal) del virus del sarcoma de Rous (VSR) o el activador LAT mencionado anteriormente,

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un activador del gen IE de Citomegalovirus (CMV),

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activadores MMTV inducibles (que se originan a partir del virus del tumor de mama de ratón) o activadores de metaltionina.

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Además pueden utilizarse otros activadores. Específicamente, resultarán preferidos los activadores nerviosos o gliales, especialmente en los casos en los que la secuencia nucleotídica insertada en el vector adenovírico va a dirigirse más específicamente en clases más específicas de células nerviosas. Se hace referencia por ejemplo a los activadores siguientes, especialmente a los implicados en los genes que codifican enzimas de síntesis del neurotransmisor:

TH (tirosina hidroxilasa)

CHAT (acetilcolina transferasa)

TPH (triptófano hidroxilasa)

GFAP (proteína ácida fibrilar del glial) enolasa G (marcador de proteína neuronal)

aldolasa C.

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La invención se refiere también a un procedimiento para la preparación de dichos vectores recombinantes, procedimiento que comprende insertar la secuencia nucleotídica cuya expresión se busca en los vectores de partida y la transformación de células infectables con dichos vectores. Cuando el vector es un virus completamente vivo, los virus recombinantes se recuperan entonces del medio de cultivo celular. Cuando el vector recombinante es un virus defectuoso, un procedimiento preferido entonces comprende la transformación de una estirpe celular eucariótica transformable (preferentemente de origen humano o animal) que comprende una secuencia nucleotídica distinta que puede complementar la parte del genoma del adenovirus que es esencial para su aplicación y que no está presente en dicho vector, con lo que dicha secuencia de complementación se incorpora preferentemente en el genoma de dicha estirpe celular.

A título de ejemplo preferido de dichas estirpes celulares, se debe mencionar la denominada "estirpe celular 293" obtenida de un riñón de embrión humano que contiene, integrado en su genoma, el primer 11% de la región 5' y un genoma del virus Ad5. Este fragmento del genoma Ad5 permite virus recombinantes defectuosos en esta región, a causa de una eliminación de parte de esta región, que se complemente de manera apropiada. Dicho procedimiento para la producción de virus defectuosos se ha descrito más específicamente en la solicitud de patente europea EP nº 185573, presentada el 20 de noviembre de 1985.

Tras la transformación de dichas estirpes celulares, los virus recombinantes defectuosos se multiplican, se recuperan y se purifican.

No es necesario decir que el mismo proceso puede ser aplicable para la producción de otros adenovirus defectuosos como resultado de una eliminación en otra región aparte de la región 5' mencionada en la presente memoria anteriormente, comprendiéndose entonces que las estirpes celulares utilizadas en dicha producción incluirían entonces en su propio genoma la secuencia eliminada forman el genoma adenovírico para permitir de este modo la complementación de dichos adenovirus defectuosos.

La invención proporciona de este modo por primera vez una alternativa seria a la infección en el área del cerebro de las células, por ejemplo células embrionarias que llevan la información genética pertinente, en terapia génica que se destina a corregir insuficiencias metabólicas o defectos en las células a las que se dirige, particularmente neuronas posmitóticas. Esta es la consecuencia de la importante potencia infecciosa de los adenovirus, conservada también por los correspondientes vectores derivados de adenovirus defectuosos, de su capacidad de propagar a través del tejido neural o nervioso al que se dirige mientras que también permanece sustancialmente confinada dentro del tejido seleccionado, si se inyecta específicamente en éste, así como de la transcripción a largo plazo y en la mayoría de los casos, la expresión de la secuencia nucleotídica transportada en el tejido nervioso por dichos vectores adenovíricos.

La secuencia nucleotídica cuya introducción en las células del sistema nervioso central puede pretenderse, puede estar constituida por cualquier secuencia que puede proporcionar moléculas que interactúan con el metabolismo de dichas células. Dichas moléculas pueden estar constituidas por los ARN antisentido seleccionados, o los oligorribonucleótidos antisentido, capaces de interactuar con los ARN mensajeros defectuosos cuyo tratamiento adicional, responsable de las enfermedades correspondientes, debería bloquearse, por ejemplo en numerosas enfermedades neuropsiquiátricas, epilepsia, etc... Esta metodología parece de especial interés en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. El procedimiento antisentido podría utilizarse únicamente, únicamente a título de ejemplo, para provocar un bloqueo del precursor b-amiloide, impidiendo una acumulación del péptido b-amiloide en las placas seniles. Alternativamente se podría hacer uso del oligonucleótido antisentido que puede inhibir la expresión de las enzimas implicadas en la fosforilación anormal de las proteínas, por ejemplo la proteína TAU implicada en la enfermedad de Alzheimer. Alternativamente de nuevo la secuencia nucleotídica es la que podría secuestrar las proteínas de fijación específica, normalmente implicadas en el tratamiento de la secuencia de ADN o de ARN cuya transcripción o expresión se busca para ser inhibida.

La secuencia nucleotídica cuya introducción en las células del sistema nervioso central debe buscarse puede también codificar un producto de expresión con una propiedad biológica. Dicho producto de expresión puede por ejemplo ser capaz (1) de compensar un polipéptido defectuoso natural que contiene el producto codificado por la correspondiente secuencia nucleotídica defectuosa, o (2) de compensar la falta de producción endógena del correspondiente polipéptido endógeno natural que contiene el producto en dichas células diana, o (3) de introducir nuevas actividades terapéuticas en las células infectadas. Los ejemplos de dichos productos defectuosos que contienen polipéptido pueden consistir en enzimas neurotransmisoras de síntesis y factores de crecimiento. Por ejemplo en el caso de la enfermedad de Parkinson (caracterizado porque presenta una vulnerabilidad de las células dopaminérgicas) se podría prever producir localmente DOPA o dopamina expresando el ADNc que codifica la tirosina hidroxilasa o un factor de crecimiento tal como BDNF (factor neurótrofo obtenido del cerebro) que podría favorecer la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas.

Asimismo en la enfermedad de Alzheimer, en la que la que uno de los neurotransmisores desaparecidos es la acetilcolina que es sintetizada por la acetilcolina transferasa. Además el NGF (factor de crecimiento de nervios) podría evitar la degeneración de las neuronas colinérgicas.

Otro factor potencialmente útil para expresar es el CNTF (factor neurótrofo ciliar) que podría evitar la muerte neuronal. Pero el CNTF puede tener también un efecto interesante en el cerebro, por ejemplo para el bloqueo de la destrucción (provocado aparentemente en los pacientes afectados de diabetes) de los nervios periféricos. Otro factor trófico cuya expresión debe buscarse está constituido, a título de ejemplos por IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3 y NT5.

De manera general los factores de crecimiento podrían originarse al ser producidos en las células neuronales de los pacientes afectados de neuropatías, íctus, lesión de la médula espinal, esclerosis lateral amiotrófica, corea de Huntington, enfermedades de Alzheimer y Parkinson o parálisis cerebral. La epilepsia, entre otras posibilidades puede tratarse mediante una producción local, en el sistema nervioso central, del neurotransmisor GABA, como resultado de la expresión ácido glutámico descarboxilasa.

La invención también es de particular interés para la preparación de composiciones destinadas a su utilización en el tratamiento de enfermedades hereditarias que afectan al producto defectuoso o carente del gen mutante: enzimas lisosómicas en enfermedades lisosómicas (por ejemplo hexosaminidasas) en las enfermedades de Tay Sachs y Sandhoff), arilsulfatasa en leucodistrofia metacromática, glucocerebrosidasa en la enfermedad de Gaucher, b-glucursoronidasa en la mucopolisacaridosis, HGPRT en la enfermedad de Lesh Nyhan, etc...). Las degeneraciones neuronales hereditarias progresivas podrían tratarse mediante transferencia del gen de la enfermedad normal por vectores adenovíricos, o, como se expuso anteriormente, por provocación de una producción local de factores de crecimiento. Por ejemplo, se ha demostrado, que la producción de CNTF podría ralentizar la degeneración motoneuronal progresiva (pmm) de ratones (Sendtner et al., Nature 1992; 358: 502-504), observándose la misma con aFGF en la degeneración del fotorreceptor en la distrofia de la retina hereditaria en rata (Faktorovich) et al., Nature 1990; 347:83-86). Las enfermedades adquiridas de la médula espinal como la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) frecuente y constantemente letal podría beneficiarse quizás de similar producción local de CNTF, que ha demostrado que protege a las motoneuronas.

Las enfermedades de dismielinación hereditarias podrían también mejorarse mediante transferencia génica mediada por adenovirus en las células que sintetizan mielina.

Por último, algunos otros tipos de agentes terapéuticos potenciales podrían producirse localmente en el SNC, por ejemplo las encefalinas para atenuar dolores rebeldes, por ejemplo en pacientes cancerosos.

La invención se refiere también a las composiciones farmacéuticas constituidas por vectores adenovíricos recombinantes que contienen las secuencias nucleotídicas definidas anteriormente, asociadas a un vehículo farmacéutico adecuado para la vía de administración que debe seleccionarse, por ejemplo, inyección directa in situ de las suspensiones víricas obtenidas en el tejido nervioso pertinente (o aunque mucho menos preferida, por vía general, por ejemplo vía intravenosa, especialmente cuando el vector adenovírico contiene también un activador selectivamente operativo en determinado tejido nervioso o células).

La invención no se limita a las utilizaciones terapéuticas de vectores adenovíricos consideradas anteriormente en la presente memoria. Estas últimas pueden también, debido a su gran capacidad de infección, utilizarse en ensayos in vitro en determinadas poblaciones de células nerviosas, por ejemplo para estudiar la capacidad de un activador (después acoplado a un "marcador" adecuado, por ejemplo b-gal) de ser reconocido por las polimerasas de dichas células nerviosas. Alternativamente dichos vectores adenovíricos pueden utilizarse también para la detección o la evaluación del virus recombinante de interacción (que está expresado por la secuencia nucleotídica bajo el control de un activador operativo en dichas células) con una población dada de células nerviosas o un tejido nervioso más complejo. Por ejemplo, esta evaluación o detección puede ayudar a la localización de las células de tejido más complejo que llevan un receptor para el virus. La detección puede hacer uso de cualquier procedimiento marcado clásico apropiado, por ejemplo la utilización de anticuerpos marcados para detectar productos de expresión de la secuencia nucleotídica analizada. Las perspectivas de estas evaluaciones pueden ser considerables en el campo de la neuroanatomía.

El vector recombinante de la presente invención es también útil en un procedimiento que comprende la producción del producto de transcripción o del producto de expresión de una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido seleccionado que será dirigido o producido en las células del sistema nervioso central, por ejemplo células del cerebro o de la médula espinal, especialmente las células neuronas, neurogliocitos o ependimocitos, de un animal y que detectan la modificación fisiológica o del comportamiento resultante producida en dicho animal por dicho producto de transcripción o dicho producto de expresión.

Por ejemplo en el caso de una lesión del conducto septohipocámpico que reduce el hipocampo en acetilcolina, sería posible estudiar los efectos de la transferencia de un gen que codifica la acetilcolina transferasa (ChAT) en el hipocampo. La introducción de este gen en el núcleo diana de fibras colinérgicas (cortado por la lesión) podría producir un reincremento de la cantidad de la acetilcolina disponible y, en consecuencia, corregir la insuficiencia. Esta insuficiencia puede evaluarse mediante pruebas de comportamiento. Por ejemplo, ratones descongelados en una "piscina" pueden aprender a encontrar de nuevo una plataforma que les permite salir del agua (piscina de Morris). Sin embargo los animales cuyo conducto septo-hipocámpico se ha deteriorado están muy impedidos para esta operación. La detección de un aumento de la acetilcolina producido como resultado de la expresión génica se apreciaría a continuación fácilmente con lo que los animales serían capaces otra vez de encontrar la plataforma.

Según otro ejemplo, la invención permitiría el análisis del grado de compensación de los problemas del comportamiento motor producidos por la desnervación del cuerpo estriado, especialmente en el caso de una lesión de los núcleos dopaminérgicos del mesencéfalo (sustancia negra). La introducción del gen que codifica la fortirosina hiddroxilasa (TH) en el cuerpo estriado podría corregir esta insuficiencia. La compensación puede evaluarse mediante el estudio del comportamiento de las ratas en la prueba de rotación: los animales heridos en un lado solamente rotan de manera repetitiva (más de diez rotaciones por minuto) cuando reciben una inyección de apomorfina. La producción de dopamina (relacionada con la introducción del gen TH) podría apreciarse en esta prueba de comportamiento.

Incluso según otro ejemplo, la invención permite el estudio electrofisiológico y de comportamiento en otros casos. Por ejemplo, las neuronas del asta posterior de la médula espinal que transmiten información relacionada con la estimulación nocirreceptora (canales del dolor) son sensibles a la morfina que da lugar a que disminuya su actividad. La introducción de un gen que codifica una endomorfina en la médula espinal podría provocar una secreción de esta sustancia que, como la morfina, actuaría en estas células. Dicha acción podría evaluarse por pruebas de comportamiento (umbral de reacción de animales al estímulo nocirreceptivo) así como por estudios electrofisiológicos de las propias neuronas de la médula espinal. El registro de la actividad de estas células permitiría apreciar la existencia de una modulación producida por la expresión del gen transferido.

Las posibilidades proporcionadas por la invención se ilustrarán con mayor detalle, incluso de manera no limitativa mediante la descripción de numerosos ensayos, que en parte están soportados por las figuras adjuntas a la presente descripción. Especialmente, el Ad.RSVbgal parece como un medio atractivo para analizar la morfología neuronal y glial en áreas específicas del cerebro proporcionando la tinción de tipo Golgi de las células en el punto de inyección. La presentación de los axones por la enzima puede proporcionar además formas de analizar las proyecciones de poblaciones neuronales discretas. Por el contrario la absorción del virus por los terminales y el posterior transporte retrógrado a los corpúsculos celulares neuronales permite el seguimiento de conjuntos de aferentes a un área del cerebro específica.

Una ventaja principal de esta técnica para la neuroanatomía es la fácil combinación de la tinción de X-gal con toda clase de técnicas de marcado, en particular la inmunocitoquímica. La utilización de vectores en los que la secuencia nls sería omitida podría mejorar la eficacia de dicha técnica.

Asimismo el vector adenovírico proporciona una base para el estudio de la acción de otros activadores sustituidos por el activador RSV LTR, con respecto a diferentes poblaciones de células nerviosas.

Ensayo 1

Se ha hecho uso del adenovirus con replicación defectuosa, el Ad.RSVb-gal, que expresa una b-galactosidasa (b-gal) dirigida nuclearmente conducida por el activador con repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (RSV LTR) (9). La nls (señal de localización nuclear) del SV40 en dicho vector proporcionó la dirección del vector a los núcleos de las células. Se determinó la capacidad de este vector para infectar cultivos primarios de neuronas del simpático del ganglio cervical superior (SCG) y astrocitos. Se observó la actividad de b-gal histoquímicamente utilizando la sustancia cromógena 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactosidasa (X-gal) (10). Los SCG cultivados en presencia de agente antimitótico proporcionan un medio conveniente para obtener una preparación pura y homogénea de neuronas (11).

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Más específicamente la expresión de b-gal en neuronas del simpático y astrocitos cultivados tras la inoculación por adenovirus Ad.RSVb-gal se realizó de la manera siguiente:

Se extirparon los SCG de ratas Wistar de 2 días de vida, se disociaron, se colocaron en placas de cultivo 16 mm recubiertas con colágeno y se cultivaron como se describe en (11). Se añadió citosina arabinofuranósido (10 \muM) durante la primera semana de cultivo para impedir la proliferación de células ganglionares no neuronales. Tras 6 días en el cultivo, se inocularon las células con 10^{6} unidades formadoras de placa (pfu) de Ad.RSVb-gal en medio de cultivo o, como referencia, se expusieron solamente al medio de cultivo. Veinticuatro horas después, se eliminó el virus y se mantuvieron las células durante 2 días en el medio de cultivo. Se lavaron las células, se fijaron con paraformaldehído y a continuación se reveló la actividad de b-gal mediante tinción histoquímica (10).

Tras 6 días de cultivo se hicieron las siguientes observaciones: prácticamente todas las células eran positivas a b-gal, sin efectos tóxicos o cambios morfológicos aparentes. Las células marcadas positivamente no pudieron detectarse cuando la redacción de tinción se realizó en un cultivo en paralelo no inoculado.

Se determinó también la capacidad del adenovirus para infectar los cultivos primarios del tejido del hipocampo de rata enriquecido en astrocitos. La inoculación se produjo en una tinción nuclear azul en aproximadamente dos tercios de las células. La identificación de las células positivas a b-gal como astrocitos se confirmó mediante tinción adicional con un anticuerpo contra la proteína glial ácida fibrilar (GFAP).

Más específicamente los ensayos se realizaron de la manera siguiente. Se crearon cultivos primarios de astrocitos enriquecidos a partir de tejido neonatal del hipocampo de rata como se describe en otra parte (12). Se colocaron las células en placas de plástico de 35 mm de diámetro y se cultivaron en medio de Eagle modificado con Dulbecco enriquecido (DMEM) durante 5 días. Se inocularon a continuación 2 \mul de la solución adenovírica (valor 10^{8} pfu/ml) en cada placa durante 24 horas. Después del lavado y del fijado en paraformaldehído, se caracterizaron las células que expresan b-gal utilizando histoquímica de X-gal. Se observó una superposición de los dos marcadores (no representada).

Ensayo 2

La viabilidad del adenovirus para infectar células cerebrales in vivo se evaluó en numerosas estructuras características.

Se inyectaron por vía estereotáctica 17 ratas Wistar macho (de 10 semanas de vida) con anestesia profunda con 1 a 5 \mul de medio que contenía 10^{10} unidades formadoras de placa (pfu)/ml de virus muy purificado en el hipocampo o la sustancia negra. Se sacrificaron los animales a los 1, 2, 3, 5, 7, 30 y 60 días de la inoculación. Se detectó actividad de b-gal en las células positivas por vía histoquímica utilizando tanto el sustrato X-gal como un anticuerpo dirigido contra la proteína (el anticuerpo fue una fracción de IgG de conejo purificada por afinidad contra b-gal (Cappel, dilución 1:800) que se unió a continuación a un complejo de peroxidasa biotinilado con estreptavidina (Amersham) con diamino-benzidina como cromógeno, reforzada con níquel. Este último procedimiento es más sensible y en algunos casos puso de manifiesto a b-gal en procedimientos citoplásmicos finos debido a la alta expresión del gen transferido.

Todos los animales inyectados presentaron un alto nivel de actividad de b-gal. Se detectó la expresión tan pronto como 24 horas después de la inoculación y persistió en los animales analizados después de dos meses. La difusión del virus fue mayor en el hipocampo que en la sustancia y se extendió a todo el hipocampo dorsal. En la sustancia negra, el modelo general de infección se restringió más y se distribuyó a lo largo de una orientación medio-lateral. Esta diferencia puede reflejar probablemente la propensión del virus a difundirse a los tejidos con una baja adhesividad, tal como la fisura del hipocampo y los límites entre la capa de células granulares de la circunvolución dentada y los tejidos circundantes.

En el hipocampo, la extensión del área infectada se correlacionó con el volumen de la solución vírica administrada. Por lo general, en las ratas sacrificadas 3 a 7 días después de la inoculación en el hipocampo, el área infectada estaba comprendida entre 1 y 4 mm^{3} para 3 a 5 \mul de virus inyectado (10^{10} pfu/ml). Resulta interesante, un examen cuidadoso de las secciones del hipocampo a lo largo del tiempo, que puso de manifiesto un cambio en el modelo de marcado. Aunque solamente se apreciaron diferencias menores en la primera semana después de la inoculación, un remodelado notable en la distribución de las células marcadas se observó después de un mes. Este nuevo modelo se mantuvo después de dos meses. En este modelo a largo plazo, la distribución de las células positivas a b-gal fue menos difusa, el marcado parecía estar confinado a una capa de células definida.

No se observó ningún efecto citotóxico aparente en los animales infectados. Todos sobrevivieron a la inoculación sin anomalías del comportamiento destacadas. El examen de los cerebros infectados por el virus no puso de manifiesto ningún ensanchamiento del ventrículo lateral, ni destrucción de la citoarquitectura normal de las estructuras. La única alteración destacada fue una necrosis local del tejido y gliosis reactiva, que se limitó a la región inyectada. Este fenómeno fue principalmente debido a la propia inyección ya que se observó un efecto similar en los animales inyectados con solución salina. Por último, el análisis de las secciones de hipocampo a un nivel celular con la tinción de Nissl no mostró ninguna pérdida celular ni pruebas de citólisis en las capas de células piramidales de la capa de células granulares de la circunvolución dentada.

Ensayo 3

Los resultados anteriores demuestran que el adenovirus puede infectar células cerebrales. El siguiente experimento demuestra más específicamente que las neuronas pueden infectarse in vivo.

Se infectaron tipos de células gliales y neuronales mediante inoculación directa in vivo del adenovirus Ad.RSVb-gal. La expresión de b-gal en microgliocitos se realizó por detección inmunohistoquímica cerca del área inyectada de una rata que recibió inyección en el hipocampo 5 días después del sacrificio. Se procesó la reacción inmunohistoquímica utilizando peroxidasa reforzada con níquel y con anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína.

Poco después de la inyección muchas de las células positivas a b-gal presentaron una morfología típica de los microgliocitos. Estas pequeñas células presentan procesos finos, muy ramificados que se extienden radialmente lejos del soma. Aunque los microgliocitos representaban una gran producción de células que expresan b-gal hasta una semana, sus cifras disminuyeron drásticamente en tiempos más prolongados tras la infección. Otras células infectadas detectadas durante los puntos de tiempo iniciales se demostró que eran astrocitos mediante doble tinción utilizando el sustrato X-gal y un anticuerpo dirigido contra la proteína ácida fibrilar glial astroglial (GFAP) (datos no representados).

Unas pruebas convincentes de que algunas de las células infectadas son neuronas se demostraron en ambas estructuras cerebrales inyectadas. En el caso de la sustancia negra, la presencia de b-gal en células dopaminérgicas podría documentarse utilizando un anticuerpo dirigido contra la tirosina hidroxilasa (TH), un marcador clásico de neuronas catecolaminérgicas. La ampliación mayor puso de manifiesto claramente que las células marcadas con anticuerpo TH presentaban también un núcleo azul. Estas células suman aproximadamente el 50% de las células positivas a b-gal dentro del área infectada de células dopaminérgicas. En el hipocampo, se identificaron de forma inequívoca numerosas células marcadas como neuronas basadas tanto en características morfológicas como anatómicas (Fig. 1). En algunas células, la tinción puso de manifiesto un perfil de tipo Golgi debido a la difusión de b-gal, produciendo un alto nivel de expresión de la enzima. Este modelo se observó la mayoría de las veces desde 48 horas a una semana. Las neuronas piramidales, las células granulares y las interneuronas hiliares se observaron en la capa CA1 de la célula piramidal, la capa de la célula granular y en el hilio de la circunvolución dentada. Estas últimas células podrían identificarse fácilmente debido a la citoarquitectura característica del hipocampo que está compuesta de subgrupos celulares segregados y laminados distintamente. Ocasionalmente, se observaron procesos de tinción larga a distancias mayores de 400 \mum del soma, lo que confirma la naturaleza neuronal de estas células. Además, se observaron varios segmentos con varicosidades gigantes traspasando el hilio, lo que indica que las fibras musgosas estaban también marcadas.

Tal como se apuntó anteriormente, en todas las ratas sacrificadas a uno o dos meses después de la inoculación, la distribución y número de células b-gal positivas es notablemente diferente de la observada en los puntos de tiempo iniciales. La distribución de células positivas a b-gal se evaluó en la circunvolución dentada un mes después de la inoculación adenovírica de Ad.RSVb-gal, utilizando histoquímica X-gal. Se observó que las células azules marcadas se concentraban en la circunvolución dentada izquierda del hipocampo inyectado, en comparación con el lado contrario no inyectado (barra de escalas de Fig. 2, 1 mm). La localización dentada de las células infectadas se confirmó por detección de b-gal inmunohistoquímica (tinción utilizando peroxidasa más níquel). Una vista a gran ampliación (40\times) presenta el gran número de núcleos de células marcadas con b-gal densamente aglomeradas en la capa de las células granulares de la circunvolución dentada (escala de barras de la Fig. 3, 300 \mum).

La capa molecular, que se infectó en gran medida en tiempos tras la inoculación más breves, estaba entonces desprovista de células teñidas. Tal como se detecta en las secciones teñidas por contraste con violeta de cresilo (datos no representados), las células positivas a b-gal coincidieron con las de la capa granular y las células no positivas se observaron en la parte más interna de la capa que incluye la mayoría de las células en cesta y unos pocos neurogliocitos. La tinción azul en las ratas sacrificadas después de dos meses se concentró exclusivamente en la capa de células granulares.

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Ensayo 4

El alto nivel de infectabilidad de las células nerviosas por el adenovirus se pone más claramente de manifiesto más mediante los resultados de los experimentos descritos a continuación.

Procedimientos

Los vectores adenovíricos que contienen el gen LacZ se prepararon según los procedimientos descritos anteriormente (5). Se anestesiaron trece ratas Sprague-Dawley adultas (Charles River France) utilizando cloral hidratado (400 mg/kg, i.p.) y se colocaron en un aparato estereotáctico. Se inyectó una suspensión vírica que contenía 3,3\times10^{10} a 10^{11} unidades formadoras de placa (pfu) por ml durante diez minutos utilizando una jeringuilla Hamilton (10 \mul, inyección total: 3,3\times10^{8} a 10^{9} pfu) en el núcleo XII (n=6) o en varias regiones del prosencéfalo (n=7). Después un tiempo de supervivencia de cuatro días, se volvieron a anestesiar las ratas y se les perfundió por vía transcardial con 4% de paraformaldehído en tampón fosfato (0,1 M; pH 7,4). Se extirpó el sistema nervioso central, se fijó después durante 4 horas y a continuación se crioprotegió toda la noche en sacarosa al 30%. Se cortaron secciones parasagitales (de 48 \mum de espesor) en un criostato. Se incubó cada cuarta sección durante 4 a 12 horas entre 28 y 30ºC con la tinción X-gal como se describió anteriormente (10). En tres ratas, se enjuagaron las secciones tratadas con X-gal en tampón fosfato, a continuación se continuaron tratando utilizando técnicas inmunohistoquímicas clásicas con kits Vectastain (Vector labs) utilizando un anticuerpo policlonal de conejo construido contra GFAP (1/500) o el anticuerpo monoclonal de ratón OX-42 (1/1200) que tiñe específicamente células de microglia en el sistema nervioso central de la rata. Se montaron a continuación las secciones en portaobjetos gelatinizados y una de cada dos secciones se tiñó por contraste con violeta de cresilo antes de la cobertura final del portaobjetos en tolueno.

La Figura 4 proporciona fotomicrografías que presentan la tinción histoquímica de b-galactosidasa en varias poblaciones de células en el cerebro de rata después de dicho marcaje a. y b. con inyección de adenovirus observado tras la inyección en el núcleo del nervio duodécimo (XII). Prácticamente todas las neuronas en el núcleo XII se han infectado, extendiendo la tinción a todos los procesos neuronales incluyendo los axones (flecha en a.), proporcionando un aspecto "similar a Golgi" de las células. Algunas de las células infectadas pueden identificarse como astrocitos (cabezas de flecha) mediante el producto de reacción pardo que indica inmunorreactividad de GFAP (proteína glial ácida fibrilar). d., tinción en las ependimocitos (ep) después de una inyección intraventricular. Las secciones en a, b y d se han teñido por contraste con violeta de cresilo.

Se realizaron las observaciones siguientes.

No se apreció ningún efecto grueso desfavorable de esta inoculación en la salud y el comportamiento de los animales hasta 60 días después de la inoculación (el tiempo más largo estudiado). En todos los casos, se tiñó histoquímicamente un gran número de células. Se infectaron células nerviosas incluyendo las neuronas (Figs. 4a, b) y se identificó el glía como astrocitos (Fig. 4c) o el microglía (no representada) en experimentos de doble tinción utilizando marcadores inmunocitoquímicos específicos. Cuando la inyección se dirigió al sistema ventricular, abundantes células ependimarias expresaron el gen (Fig. 4d).

En el parénquima cerebral, se encontraron células marcadas la mayoría dentro de 500 a 1.000 \mum del recorrido de la aguja. Los límites del área que contienen células infectadas tendían a respetar a los límites anatómicos tales como los tubos de fibra larga o lamelas. Por ejemplo, las inyecciones dirigidas al núcleo del nervio XIIº (Fig. 4a, b) produjeron prácticamente una tinción completa e intensa de todas las neuronas dentro del núcleo mientras que las áreas circundantes contenían solamente células infectadas dispersadas. Asimismo, se observaron células ependimarias inyectadas más de varios milímetros tras las inyecciones intraventriculares, aunque adjuntando tejido nervioso no contenían ninguna célula teñida (Fig. 4d). Es probable, por consiguiente, que la topografía de la b-galactosidasa que expresa las células en el punto de inyección corresponde a una extensión limitada de partículas víricas dentro del tejido y que los límites anatómicos tales como conductos de fibra larga o limitativos del glía impidan su difusión.

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Ensayo 5

Además de las células marcadas alrededor del tubo de la aguja, para las que la endocitosis de las partículas víricas a nivel pericarial era probable, se marcaron grupos alejados de neuronas que envían proyecciones del axón a las áreas de inyección, tales como las neuronas de la sustancia negra tras la inyección en el cuerpo estriado (Fig. 5b).

Como materia de hecho la Fig. 6 representa fotomicrografías que muestran la tinción histoquímica con b-galactosidasa tras la inyección de adenovirus en el cuerpo estriado. Los procedimientos son los mismos que en el ensayo 4.a. Producto de reacción en las células en la periferia del punto de inyección. Producto de reacción es la mayoría de los casos en la región nuclear-perinuclear y la intensidad osciló entre muy débil (cabezas de flecha) a fuerte, extendiéndose en las neuronas en la sustancia negra (SN) y en el área ventral tegmentaria (VTA) que ha transportado los vectores víricos de manera retrógrada desde el cuerpo estriado. \times20.

La localización nuclear-perinuclear de la tinción en células de la sustancia negra así como la falta de una tinción profusa en la trayectoria nigro-estriada axonal indica que las partículas víricas más bien que la enzima fueron absorbidas por los terminales de los axones y transportadas de manera retrógrada desde el cuerpo estriado a la sustancia negra. En cambio, no se observó ninguna tinción histoquímica en las neuronas que tienen cruzamiento de axones (pero no finalizan) el punto de inyección, lo que sugiere que las partículas víricas no pueden ser endocitosadas por los axones de paso.

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Ensayo 6

Estos resultados anteriores subrayan el alto nivel de infectabilidad de la célula neural por el adenovirus. Esto se ha demostrado también en los ensayos realizados de la manera siguiente:

Procedimientos: La suspensión de 3,3\times10^{10} pfu/ml se utilizó directamente o se diluyó utilizando solución salina estabilizada antes de la infección en el cerebro de 10 ratas. Se describen otros procedimientos en el ensayo 4 con la excepción que las secciones se cortaron en el plano coronal.

Las fotomicrografías que presentan los resultados obtenidos una semana después de la inyección en el tálamo de la suspensión de adenovirus a diferentes diluciones (secciones teñidas por contraste con violeta de cresilo). a. Efecto citolítico observado tras la inyección de 10 \mul de una suspensión de 3,3\times10^{10} pfu/ml de virus (total: 3,3\times10^{8} pfu). La pérdida de tejido y las áreas glióticas (las flechas ponen de manifiesto la muerte celular provocada por la inyección vírica \times20. (sección no tratada con X-gal). b. Tinción tras la infección de un total de 3,3\times10^{5} pfu. Varios miles de células todavía expresaron el gen, presentando la mayor parte tinción nuclear-perinuclear excepto unas pocas neuritas cortas (cabeza de flecha). No se produjo ningún efecto citolítico conspicuo. \times200. c. Tinción tras la inyección de 3,3\times10^{3} pfu. Unas pocas células todavía expresaron el gen (cabezas de flecha) en un área pequeña que corresponde al pico del tubo de la aguja. No se produjo ningún efecto citolítico aparente. \times400.

Un número considerable de células se infectaron tras la inoculación con suspensiones de virus de valor elevado, pero muchas células se infectaron también cuando se utilizaron valores muy inferiores. En las ratas inyectadas con una suspensión de 10 \mul valorando 3,3 \times10^{7} pfu/ml (un máximo de 3,3 \times 10^{5} partículas infecciosas) varios miles de células nerviosas expresaron todavía el gen lacZ 8 días después de la inoculación (Fig. 6b); inyecciones tan bajas como 3.300 pfu produjeron marcado de cerca de un centenar de células (Fig. 6c). La intensidad del marcado fue otra indicación de la exquisita infectabilidad de las células neurales. Cuando se utilizaron suspensiones de virus de alto valor (más de 10^{9} pfu/ml) la intensidad de la tinción fue normalmente muy fuerte en el área del centro del punto de la inyección donde las células están sometidas a una concentración de partículas víricas máxima. A pesar de la secuencia nls añadida a la b-galactosidasa, el marcado no fue tan intenso que no estuviese limitado al núcleo de las células individuales, sino que se difundió al citoplasma y a los procesos (por ejemplo dendritas y axones de neuronas) que producen una tinción "de tipo Golgi" completa de las células (Fig. 6a,b y Fig. 5a). En contraste, en la mayoría de las células situadas en la periferia del punto de inyección y en las células infectadas de manera retrógrada, solamente se marcaron los núcleos (Fig. 5a,b). Asimismo, la localización nuclear de la enzima fue la regla cuando se utilizaron suspensiones de virus de valor inferior (Fig. 6b,c).

Una sola célula nerviosa, en particular una neurona, puede de este modo endocitosar una cantidad masiva de partículas víricas. Esta gran infectabilidad lo más probablemente explica la citopatogenicidad (caracterizada por la muerte neuronal, gliosis, respuesta inflamatoria vascular y pérdida de tejido) observada en el punto de inyección de suspensiones de valor elevado (Fig. 6a). La ausencia de citopatogenicidad de las suspensiones de virus de valor inferior (\leq10^{7} pfu/ml) apoya esta hipótesis. La citopatogenicidad se refiere de la manera más probable, por consiguiente, a la endocitosis de números enormes de partículas víricas por las células dispuestas próximas al punto de inyección.

Ensayo 7

La infección por adenovirus evidentemente no es sistemáticamente citopática, ya que las células nerviosas bien preservadas que expresan el gen lacZ se observaron todavía 45 días después de la inoculación (Fig. 7). Se inyectaron nueve ratas y se sacrificaron (n=3) en semanas alternas tras la inyección. En la Figura 4 se describen procedimientos quirúrgicos e histológicos excepto que las secciones se cortaron en el plano de la corona. Las fotomicrografías que presentan el producto de reacción histoquímico de b-galactosidasa en una rata que se dejó que sobreviviera durante cuarenta y cinco días tras la infección por adenovirus en el núcleo del nervio XIIº (XII). Unas pocas células todavía expresaron el gen como se demostró por tinción histoquímica nuclear-perinuclear. Entre ellas eran motoneuronas tal como las ejemplificadas en el dibujo (teñidas por contraste con violeta de cresilo). Unos pocos axones contenían también la enzima (flecha). \times40. dibujo \times1000.

Estos resultados demuestran que las células en el sistema nervioso central, incluyendo las neuronas, pueden inyectarse con éxito en grandes cantidades mediante un adenovirus de replicación insuficiente y en consecuencia expresan un gen extraño transferido.

El impacto de la terapia génica es por lo tanto considerable. Aunque como se mencionó anteriormente la invención tiene por objeto proporcionar una alternativa al injerto en el paciente cuyas células llevan un defecto genético de células nerviosas íntegras que contienen la secuencia nucleica que pretende compensar dicho defecto genético, especialmente en un embrión, se debería apreciar que puede incluso hallar además una utilización en una mejora de dichas técnicas de injerto. Particularmente las células que han de ser injertadas podrían "enriquecerse" en la secuencia o proveerse de la misma de ácido nucleico requerida mediante transformación in vitro con un vector adenovírico que contiene esta secuencia nucleica, antes de injertarse según las técnicas ya de utilización en terapias celulares. Esta mejora puede ser de particular significado en el caso de cultivos primarios de neuronas que no experimentan divisiones.

Ensayo 8

Este ejemplo da a conocer la construcción de un vector adenovírico defectuoso recombinante que expresa la tirosina hidroxilasa humana (THh) ADNc: Ad LTR.THh.

La AdLTR.THh del adenovirus se construyó por cotransfección del plásmido pLTR-IX-THh con el mutante de la eliminación del adenovirus Ad-dl1324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) en células 293.

1.

Construcción del plásmido pLTR-IX-THh

\quad

El pLTR-IX-THh se construyó insertando el fragmento SaII-BstXI de 1769 bp de pSP6 HTH-1 (Horellou et al., J. Neurochem. 51 (1988) 652) que contiene el ADNc de THh-1, entre las secuencias únicas SaII y EcoRV del plásmido pLTR-IX corriente abajo con respecto al activador LTR de RSV. Para esta inserción, la secuencia de restricción BstXI se convirtió en extremo truncado con la T4 ADN polimerasa.

\quad

Se obtuvo el plásmido pLTR-IX a partir del plásmido pLTRBgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) por eliminación de un fragmento de ClaI-XhoI que lleva el gen BgaI, digestión con enzima de Klenow y ligadura con T4 ADN ligasa.

2.

Construcción del adenovirus recombinante defectuoso AdLTR.THh

\quad

El plásmido pLTR-IX-THh y el mutante de la eliminación del adenovirus Ad-dl1324 se linealizaron con Clal y se cotransfectaron en la estirpe celular 293 en presencia de fosfato cálcico, permitiendo la recombinación homóloga. Después de la recombinación, se seleccionaron los adenovirus, se ampliaron en la estirpe celular 293 y se recuperaron por centrifugación en cloruro de cesio (Graham et al., Virology 52 (1973) 456).

Ensayo 9

Este ejemplo da a conocer la producción in vitro e in vivo de THh utilizando el adenovirus AdLTR.THh.

9.1. Producción in vitro de THh

El vector recombinante de adenovirus AdLTR.THh dado a conocer en el ensayo 8 se utilizó para infectar la estirpe celular 293. 24 a 48 horas tras la infección, se recuperaron los sedimentos celulares por centrifugación del cultivo (1.000 r/min, 5 min.). Se utilizaron sedimentos celulares para la dosificación in vitro de la actividad enzimática de TH (a) y en el análisis de Western (b).

(a)

Dosis de actividad enzimática de TH

\quad

Se ensayó la actividad enzimática de TH utilizando un procedimiento modificado de Reinhard et al. (Life Sci. 39 (1986) 2185). Se sometieron a ultrasonidos los sedimentos celulares congelados durante 30 s. en Na HEPES 0,2%/100 mM enfriado con hielo, pH 6,99 y se centrifugó (10.000 \times g, 10 min.). Se utilizó una fracción del sobrenadante (10 \mul) para ensayar la actividad de TH midiendo la actividad de ^{3}H_{2}O formado a partir de L-[3,5-^{3}H]tirosina durante la incubación (10 min., 37ºC) en 100 \mul de medio de reacción (Na HEPES 100 mM, pH 6,99, catalasa (Sigma) 50 \mug, L-tirosina 25 \muM (base libre, Sigma) 50 y 0,2 \muCi de L-[3,5-^{3}H]tirosina (Amersham), FeSO_{4} 1 mM, DL-6-metil-5,6,7,8-tetrahidropterina 0,5 mM, ditiotreitol 5 mM). Se interrumpió la reacción mediante la adición de 1 ml de 7,5% (p/v) de carbón vegetal (activado, Sigma) en HCl 1 M. Se agitaron fuertemente a continuación las mezclas (3 s) y se centrifugaron (10.000 \times g, 10 min.). Las alícuotas (100 \mul) del sobrenadante se transfirieron a continuación a viales de centelleo que contenían 10 ml de mezcla de centelleo (centelleante de recuento acuoso, Amersham) para medir la cantidad de ^{3}H_{2}O formada. Para preparar la solución madre de L-tirosina, la L-[3,5-^{3}H]tirosina se secó en primer lugar a velocidad en vacío para eliminar el ^{3}H_{2}O contaminante antes de añadir 500 \mul de L-tirosina 500 \muM fría. Los resultados se expresan en pmoles de ^{3}H_{2}O formada por la hidroxilación de [^{3}H]tirosina por hora por mg de proteína. La cuantificación de proteína se realizó según el procedimiento de Bradford et al.

\quad

Este ensayo demuestra que las células 293 infectadas con AdLTR.THh producen una actividad de TH que puede formar 5 \mumoles de DOPA/hora/mg de proteína, aunque las células 293 no infectadas no producen ninguna actividad de TH.

(b)

Análisis Western

\quad

Se realizaron análisis Western depositando extractos de proteína en gel de electroforesis SDS-PAGE (10% de acrilamida), migración de proteínas y transferencia de proteínas en la membrana de nitrocelulosa. Se incubaron a continuación las membranas de nitrocelulosa 48 h. a 4ºC con un anti-suero TH (Institut Jacques Boy) diluido 1:1.000 en PBS que contiene 2% de NS/0,05% de Triton X-100. Después de 3 enjuagues, se incubaron las membranas 2,5 h en IgG de cerdo-anti-conejo (Dakopatts, Dinamarca) diluido 1:50 en PBS/0,05% Triton X-100/2% de NS. Después de otros 3 enjuagues, se incubaron en peroxidada de conejo-anti-peroxidasa (Dakopatts) diluida en 1:100 en PBS/0,05% de Triton X-100. Se tiñeron con 3,4-diaminobencidina (Sigma) y peróxido de hidrógeno y se montaron para análisis microscópico.

\quad

En las células 293 infectadas con AdLTR.THh, los anticuerpos anti-TH pusieron de manifiesto una banda de 62 kDa correspondiente al p.m. del TH, si bien no se detectó ninguna banda en las células 293 no infectadas.

9.2. Producción in vivo de THh

Se utilizaron ratas jóvenes Sprague-Dawley hembras adultas (AL-AB, Estocolmo, Suecia) en todos los experimentos. Se inyectó 6-OHDA por vía estereotáxica en la vía DA mesoestriada ascendente derecha de 12 ratas, bajo anestesia de equitesina (3 ml/kg, i.p.).

El comportamiento en la vuelta se controló en primer lugar 10 días después de la lesión con 6-OHDA, tras la administración de apomorfina o d-anfetamina. La asimetría motora se controló en vasijas de rotámetro automatizadas (Ungerstedt y Arbuthnott, 1970) durante 40 min. después de una inyección de d-anfetamina (5 mg/kg, i.p.) o una inyección de hidrocloruro de apomorfina (0,05 mg/kg; s.c. en el cuello). Tras 11 días de la lesión de 6-OHDA, las inyecciones intraestriatales del vector adenovírico recombinante AdLTR.THh (6 ratas) o Ad RSV\betaGal (6 ratas, como referencia), se realizaron en 3 puntos diferentes (10^{7} pfu en 3 \mul para cada inyección). El comportamiento en la vuelta (realizado como se describió anteriormente) y el análisis histológico se realizó los días 20 y 27. Los resultados obtenidos demuestran que:

-

\vtcortauna AdLTR.THh no produjo ningún efecto tóxico en las ratas (los receptores de dopamina eran todavía operativos)

-

\vtcortauna las ratas inyectadas con AdLTR.THh produjeron proteína TH, tal como se demostró por reactividad inmunológica: Se sumergieron los cerebros en sacarosa al 20%, fosfato potásico 100 mM (pH 7,4), durante 1 a 2 días y a continuación se seccionaron a un espesor de 40 \mum en un microtomo en congelación. Una de cada tres secciones se tiñó con violeta de cresilo y las secciones adyacentes se procesaron para inmunocitoquímica de TH tal como se describió anteriormente (Doucet et al., 1990). En resumen, después de 3 a 4 enjuagues con solución salina tamponada con fosfato (PBS) las secciones flotando libremente se preincubaron durante 1 h. en suero de cerdo normal al 10% (NSS), Triton X-100 al 0,5%, se incubaron a continuación con un antisuero TH (Institut Jacques Boy) diluido 1:1000 en PBS que contiene 5% de NSS al 5%, Triton X-100 al 0,5%. Después de 3 enjuagues, se incubaron las secciones 2,5 h. en IgG de cerdo-anti-conejo (Dakopatts, Dinamarca) diluido 1:50 en PBS, Triton X-100 al 0,5%, NSS al 5%. Después de otros 3 enjuagues, se incubaron en peroxidasa-anti-peroxidasa de conejo (Dakopatts) diluido 1:100 en PBS, Triton X-100 al 0,5% tratado con 3,4-diaminobencidina (Sigma) e peróxido de hidrógeno y se montaron.

-

\vtcortauna ratas inyectadas con AdLTR.THh tenían un comportamiento en la vuelta mejor, presentando un efecto beneficioso de la inyección de AdLTR.THh.

Ensayo 10

Este ejemplo da a conocer la construcción de un vector adenovírico defectuoso recombinante que expresa el factor murino neurótrofo ciliar: Ad LTR.CNTF.

Se construyó el adenovirus A.dLTR.CNTF por cotransfección del plásmido pLTR-IX-CNTF con el mutante Ad-dl1324 por mutante de eliminación del adenovirus (Thimmappaya et al., Cell (1982) 543) en células 293.

1.

Construcción de plásmido pLTR-IX-CNTF

\quad

Se construyó el plásmido pLTR-IX-CNTF insertando un fragmento HindIII-XbaI de 1.800 bp del plásmido pRC.CMV.CNTF (Sendtner et al., Nature 358 (1992) 502) que contiene el ADNg de CNTF murino (exones 1 y 2, intrón 1) y la secuencia principal NGF, en la única secuencia de EcoRV del plásmido pLTR-IX, corriente abajo con respecto al activador RSV LTR. Para esta inserción, el fragmento HindIII-XbaI de 1.800 bp se convirtió en extremo truncado con Klenow ADN polimerasa.

\quad

El plásmido pLTR-IX se obtuvo a partir del plásmido pLTRBgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) por eliminación de un fragmento ClaI-XhoI que lleva el gen BgaI, digestión con enzima de Klenow y ligadura con T4 ADN ligasa.

2.

Construcción del adenovirus recombinante defectuoso A.dLTR.CNTF

\quad

ADN pLTR-IX-CNTF Eagl.linealizado y Ad-dl1324 mutante por eliminación del adenovirus linealizado con ClaI se cotransfectaron en la estirpe celular 293 en presencia de fosfato cálcico, permitiendo la recombinación homóloga. Tras la recombinación, se seleccionaron los adenovirus, se ampliaron en la estirpe celular 293 y se recuperaron por centrifugación en cloruro de cesio (Graham et al., Virology 52 (1973) 456).

Ensayo 11

Este ejemplo da a conocer la construcción de un vector adenovírico recombinante defectuoso que contiene el ADNc que codifica la cadena a de la hexosaminidasa A: Ad LTR.HEXA. Los defectos genéticos en el gen HEXA son responsables de la enfermedad lisosómica de Tay-Sachs.

Se construyó el adenovirus AdlTR.HEXA por cotransfección del plásmido pLTR-IX-HEXA con el mutante Ad-dI1324 por eliminación del adenovirus (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) en las células 293.

1.

Construcción del plásmido pLTR-IX-HEXA

\quad

Se construyó el plásmido pLTR-HEXA insertando el fragmento EcoRI de 2000 bp que contiene el ADNc que codifica la cadena a de la hexosaminidasa A, obtenida por cribado de un banco de ADNc de hígado Igt (véase también Proia et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 5677), entre la secuencia EcoRV única del plásmido pLTR-IX, corriente abajo con respecto al activador RSV LTR. Para esta inserción, el fragmento EcoRI de 2000 bp se convirtió en el extremo truncado con una T4 ADN polimerasa.

\quad

Se obtuvo el plásmido pLTR-IX a partir del plásmido pLTR\betagaI (Strattford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) por eliminación de un fragmento ClaI-XhoI que lleva el gen BgaI, digestión con enzima de Klenow y ligadura con T4 ADN ligasa.

2.

Construcción del adenovirus recombinante defectuoso AdLTR.HEXA

\quad

El ADN pLTR-IX-HEXA linealizado con AseI y el mutante Ad-dl1324 por eliminación e adenovirus linealizado con ClaI se cotransfectaron en la estirpe celular 293 en presencia de fosfato cálcico, permitiendo la recombinación homóloga. Tras la recombinación, se seleccionaron los adenovirus, se ampliaron en la estirpe celular 293 y se recuperaron por centrifugación en cloruro de cesio (Graham et al., Virology 52 (1973) 456).

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Ensayo 12

Este ejemplo da a conocer la construcción de un vector adenovírico defectuoso recombinante que expresa el ADNc del factor murino de crecimiento de nervios murino (NGFh) (PreproNGF): Ad LTR.NGF.

El adenovirus AdLTR.NGF se construyó por cotransfección del plásmido pLTR-IX-NGF con el mutante Ad-dl1324 por eliminación del adenovirus (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) en las células 293.

1.

Construcción del plásmido pLTR-IX-NGF

\quad

Se construyó el plásmido pLTR-IX-NGF insertando un fragmento EcoRI-PstI que contiene el ADNc preproNGF en las secuencias correspondientes del plásmido Bluescript (Stratagene). Este ADNc se aisló después como un fragmento ClaI-BamHI, se convirtió en extremo truncado con la enzima de Klenow y se insertó entre las secuencias únicas ClaI y EcoRV del plásmido pLTR-IX, corriente abajo con respecto al activador RSV LTR.

\quad

Se obtuvo el plásmido pLTR-IX a partir del plásmido pLTR\betagaI (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) por eliminación de un fragmento ClaI-XhoI que lleva el gen BgaI, digestión con enzima de Klenow y ligadura con T4 ADN ligasa.

2.

Construcción del adenovirus recombinante defectuoso AdLTR.NGF

\quad

El plásmido pLTR-IX-NGF y el mutante Ad-dl1324 por eliminación de adenovirus se linealizaron con ClaI y se cotransfectaron en la estirpe celular 293 en presencia de fosfato cálcico, permitiendo la recombinación homóloga. Tras la recombinación, se seleccionaron los adenovirus, se ampliaron en la estirpe celular 293 y se recuperaron por centrifugación en cloruro de cesio (Graham et al., Virology 52 (1973) 456).

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Referencias

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(5) Stratford-Perricaudet LD., Levrero M., Chase J.F., Perricaudet M. & Briand P., Hum. Gene Ther. 1, 241-256 (1990)

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(12) K.D. Mc Carthy and J. De Vellis, J. Cell Biol. 85, 890 (1980)

(13) A.P. Robinson, T.M. White and D.W. Mason, Immunology 57, 239 (1986)

(14) C.E. Hayes and I. J. Goldstein, J. Biol. Chem. 249, 1904 (1974)

Claims (29)

1. Utilización de un adenovirus recombinante deficiente en replicación que comprende (i) por lo menos parte del genoma de un adenovirus, que incluye las regiones requeridas para que el adenovirus penetre en las células normalmente infectables por este adenovirus; (ii) una secuencia nucleotídica seleccionada que se inserta en dicha parte del genoma de dicho adenovirus bajo el control de un activador, endógeno o exógeno con respecto a dicho genoma y operativo en las células del sistema nervioso central y (iii) todas las secuencias que se requieren para la encapsulación del adenovirus, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de trastornos en el sistema nervioso central a través de la expresión de la secuencia nucleotídica seleccionada en las células del sistema nervioso central, codificando dicha secuencia nucleotídica seleccionada un neurotransmisor o una enzima que sintetiza el neurotransmisor, un factor trófico, un factor de crecimiento, una enzima lisosómica o una secuencia antisentido.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el genoma de dicho adenovirus recombinante carece de las regiones E1A y E1B.

3. Utilización según la reivindicación 2, en la que el genoma de dicho adenovirus recombinante carece de la región E3 del genoma del adenovirus.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho activador es exógeno con respecto al genoma adenovírico.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho activador es un activador neuronal, glial o ependimario.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha secuencia nucleotídica bajo el control de dicho activador codifica un neurotransmisor o una enzima que sintetiza el neurotransmisor.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha secuencia nucleotídica bajo el control de dicho activador codifica un precursor de un neurotransmisor.

8. Utilización según la reivindicación 6, en la que la enzima que sintetiza el neurotransmisor es la tirosina hidroxilasa, la acetilcolina transferasa o la ácido glutámico descarboxilasa.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la secuencia nucleotídica bajo el control del activador codifica un factor trófico o un factor de crecimiento.

10. Utilización según la reivindicación 9, en la que el factor trófico o el factor de crecimiento se selecciona de entre el grupo constituido por BDNF, NGF, CNTF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3 y NT5.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la secuencia nucleotídica bajo el control del activador es una secuencia antisentido.

12. Utilización según la reivindicación 11, en la que la secuencia nucleotídica bajo el control del activador es una secuencia antisentido cuyo producto de transcripción puede bloquear la expresión de proteínas tóxicas o de enzimas implicadas en la biosíntesis de dichas proteínas tóxicas o de glutamato.

13. Utilización según la reivindicación 12, en la que la secuencia nucleotídica bajo el control del activador es una secuencia antisentido cuyo producto de transcripción puede bloquear la expresión de la proteína TAU o b-amiloide.

14. Adenovirus recombinante deficiente en replicación que comprende (i) por lo menos parte del genoma de un adenovirus, que incluye las regiones requeridas para que el adenovirus penetre en las células normalmente infectables por este adenovirus; (ii) una secuencia nucleotídica seleccionada que se inserta en el genoma de dicho adenovirus bajo el control de un activador, endógeno o exógeno y (iii) todas las secuencias que se requieren para la encapsulación del adenovirus, en el que dicha secuencia nucleotídica codifica un neurotransmisor o una enzima que sintetiza el neurotransmisor.

15. Adenovirus recombinante deficiente en replicación según la reivindicación 13, en el que la enzima que sintetiza el neurotransmisor es la tirosina hidroxilasa, la acetilcolina transferasa o el ácido glutámico descarboxilasa.

16. Adenovirus recombinante deficiente en replicación que comprende (i) por lo menos parte del genoma de un adenovirus, que incluye las regiones requeridas para que el adenovirus penetre en las células normalmente infectables por este adenovirus; (ii) una secuencia nucleotídica seleccionada que se inserta en el genoma de dicho adenovirus bajo el control de un activador, endógeno o exógeno, y (iii) todas las secuencias que se requieren para la encapsulación del adenovirus, en el que la secuencia nucleotídica codifica un factor trófico o un factor de crecimiento seleccionado de entre el grupo constituido por BDNF, NGF, CNTF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3 y NT5.

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17. Adenovirus recombinante deficiente en replicación que comprende (i) por lo menos parte del genoma de un adenovirus, que incluye las regiones requeridas para que el adenovirus penetre en las células normalmente infectables por este adenovirus; (ii) una secuencia nucleotídica seleccionada que se inserta en el genoma de dicho adenovirus bajo el control de un activador, endógeno o exógeno, y (iii) todas las secuencias que se requieren para la encapsulación del adenovirus, en el que la secuencia nucleotídica es una secuencia antisentido que puede transcribirse en un ARN antisentido o en un oligonucleótido antisentido que puede interactuar con un ARN mensajero seleccionado para bloquear la expresión de la proteína TAU o b-amiloide.

18. Adenovirus deficiente en replicación recombinante que comprende (i) por lo menos parte del genoma de un adenovirus, que incluye las regiones requeridas para que el adenovirus penetre en las células normalmente infectables por este adenovirus; (ii) una secuencia nucleotídica seleccionada que se inserta en el genoma de dicho adenovirus bajo el control de un activador que es un activador neuronal, glial o ependimario y (iii) todas las secuencias que se requieren para la encapsulación del adenovirus.

19. Composición farmacéutica que contiene un adenovirus deficiente en la replicación recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable que permite su administración a un sujeto animal o humano, para el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso central.

20. Animal de ensayo no humano cuyas células nerviosas o por lo menos algunas de ellas contienen un adenovirus deficiente en la replicación según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, que ha sido introducido en dicho animal.

21. Animal de ensayo no humano según la reivindicación 20, que es un modelo para las enfermedades neurodegenerativas.

22. Procedimiento para la producción de un polipéptido recombinante que comprende el cultivo de las células nerviosas que contienen un adenovirus deficiente en replicación según cualquiera según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16.

23. Población de células del sistema nervioso central transformada con un adenovirus deficiente en replicación según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18.

24. Población de células según la reivindicación 23, en la que las células del sistema nervioso central comprenden las células neuronales, gliales o ependimarias.

25. Población de células según la reivindicación 23 ó 24, que está en forma adecuada para injertar en un hospedador, particularmente el hospedador del que se obtienen las células antes de ser transformado.

26. Adenovirus recombinante deficiente en replicación que comprende un gen humano de tirosina hidroxilasa bajo el control de un activador operativo en las células del sistema nervioso central.

27. Adenovirus recombinante deficiente en replicación que comprende un gen CNTF bajo el control de un activador operativo en las células del sistema nervioso central.

28. Adenovirus recombinante deficiente en replicación que comprende un gen HEXA bajo el control de un activador operativo en las células del sistema nervioso central.

29. Adenovirus recombinante deficiente en replicación que comprende un gen NGF bajo el control de un activador operativo en las células del sistema nervioso central.