ES2311478T3 - VACCINE COMPOSITIONS AGAINST HCV. - Google Patents

Abstract

The present invention relates generally to an immunogenic complex comprising a charged organic carrier and a charged antigen and, more particularly, a negatively charged organic carrier and a positively charged antigen, wherein the charged antigen is a polyprotein of Hepatitis C Virus (HCV), particularly the core protein of HCV, or a fragment thereof, or a fusion protein comprising the polyprotein or a fragment thereof. The complexes of the present invention are useful, inter alia, in vaccine compositions as therapeutic and/or prophylactic agents for facilitating the induction of immune responses, and in particular a cytotoxic T-lymphocyte response, in the treatment of a disease condition which results from an HCV infection.

Description

Composiciones de vacuna contra el HCV.HCV vaccine compositions.

Campo de la invenciónField of the Invention

La presente invención se relaciona generalmente con una composición de vacuna y con un complejo inmunogénico para utilizar en la composición de vacuna. En particular, la invención se relaciona con un complejo inmunogénico que comprende un portador orgánico cargado, más particularmente un portador orgánico con carga negativa, y un antígeno cargado, más particularmente un antígeno cargado positivamente, en donde el antígeno cargado es una poliproteína, preferiblemente la proteína del núcleo, del Virus de la Hepatitis C (HCV) o un fragmento de este, o una proteína de fusión que comprende dicha poliproteína o un fragmento de esta. Las composiciones de vacunas y complejos inmunogénicos de la presente invención son útiles, inter alia, como agentes terapéuticos y/o profilácticos para facilitar la inducción de respuestas inmunes, y en particular una respuesta de linfocitos-T citotóxicos, en el tratamiento de una condición patológica que resulta de una infección por HVC.The present invention generally relates to a vaccine composition and an immunogenic complex for use in the vaccine composition. In particular, the invention relates to an immunogenic complex comprising a charged organic carrier, more particularly a negatively charged organic carrier, and a charged antigen, more particularly a positively charged antigen, wherein the charged antigen is a polyprotein, preferably the core protein, Hepatitis C Virus (HCV) or a fragment thereof, or a fusion protein comprising said polyprotein or a fragment thereof. The vaccine compositions and immunogenic complexes of the present invention are useful, inter alia , as therapeutic and / or prophylactic agents to facilitate the induction of immune responses, and in particular a cytotoxic T-lymphocyte response, in the treatment of a pathological condition. which results from an HVC infection.

Antecedentes de la invenciónBackground of the invention

El virus de la hepatitis C (HCV) actualmente se reconoce como la principal causa de la enfermedad del hígado crónica y se estima que 170 millones de personas están infectadas actualmente con el virus (Armstrong, G. L., M. J. Alter, G. M. McQuillan, and H. S. Margolis. 2000. Hepatology 31:777, Cohen, J. 1999. Science 285:26). A pesar de estos números alarmantes, muy pocas terapias están disponibles para el tratamiento y aquellas disponibles son de baja eficacia. Las terapias mejoradas se necesitan desesperadamente pero su desarrollo ha sido obstaculizado por la falta de un modelo de animal pequeño para la infección y enfermedad, y sistemas ineficientes para cultivar el virus. Muchos estudios han sugerido que las respuestas inmunes mediadas de la célula T para la infección por HVC pueden afectar el resultado de infección por HCV y la enfermedad (Missale, G., R. Bertoni, V. Lamonaca, A. Valli, M. Massari, C. Mori, M. G. Rumi, M. Houghton, F. Fiaccadori, and C. Ferrari. 1996. J. Clin. Invest. 98:706., Cooper, S. L., A. L. Erickson, E. J. Adams, J. Kansopon, A. J. Weiner, D. Y. Chien, M. Houghton, P. Parham, and C. M. Walker. 1999. Immunity 10:439, Lechner, F., D. K. Wong, P. R. Dunbar, R. Chapman, R. T. Chung, P. Dohrenwend, G. Robbins, R. Phillips, P. Klenerman, and B. D. Walker. 2000. J. Exp. Med. 191:1499). Adicionalmente existe una correlación inversa entre la frecuencia de las células T citotóxicas específicas de HCV (CTLs) y la carga viral y la presencia de CTLs específicas del HCV Core antes del tratamiento con el interferón se ha asociado con la consiguiente respuesta de pacientes a esta terapia (Nelson, D., C. Marousis, G. Davis, C. Rice, J. Wong, M. Houghton, and J. Lau. 1997. J. Immunol. 158:1473. Nelson, D. R., C. G. Marousis, T. Ohno, G. L. Davis, and J. Y. Lau. 1998. Hepatology 28:225). Por lo tanto, una vacuna capaz de producir CTLs puede ser útil en el control de HCV particularmente como un complemento para las terapias actuales. El uso de las proteínas de HCV para el desarrollo de la vacuna se ha descrito previamente (Houghton, EP Patent No. 0318216).Hepatitis C virus (HCV) is currently recognized as the main cause of liver disease chronic and an estimated 170 million people are infected currently with the virus (Armstrong, G. L., M. J. Alter, G. M. McQuillan, and H. S. Margolis. 2000. Hepatology 31: 777, Cohen, J. 1999. Science 285: 26). Despite these alarming numbers, very few therapies are available for treatment and those Available are low efficiency. The improved therapies are they desperately need but their development has been hindered due to the lack of a small animal model for infection and disease, and inefficient systems to grow the virus. Many studies have suggested that the immune responses mediated from the T cell for HVC infection may affect the outcome of HCV infection and disease (Missale, G., R. Bertoni, V. Lamonaca, A. Valli, M. Massari, C. Mori, M. G. Rumi, M. Houghton, F. Fiaccadori, and C. Ferrari. 1996. J. Clin. Invest. 98: 706., Cooper, S. L., A. L. Erickson, E. J. Adams, J. Kansopon, A. J. Weiner, D. Y. Chien, M. Houghton, P. Parham, and C. M. Walker. 1999. Immunity 10: 439, Lechner, F., D. K. Wong, P. R. Dunbar, R. Chapman, R. T. Chung, P. Dohrenwend, G. Robbins, R. Phillips, P. Klenerman, and B. D. Walker. 2000. J. Exp. Med. 191: 1499). Additionally there is an inverse correlation between the frequency of HCV-specific cytotoxic T cells (CTLs) and load viral and the presence of specific HCV Core CTLs before interferon treatment has been associated with the consequent Patient response to this therapy (Nelson, D., C. Marousis, G. Davis, C. Rice, J. Wong, M. Houghton, and J. Lau. 1997. J. Immunol. 158: 1473. Nelson, D. R., C. G. Marousis, T. Ohno, G. L. Davis, and J. Y. Lau. 1998. Hepatology 28: 225). Therefore, a vaccine capable Producing CTLs can be useful in the control of HCV particularly as a complement to current therapies. He HCV protein use for vaccine development has been previously described (Houghton, EP Patent No. 0318216).

Las propiedades del adyuvante de saponina se han conocido durante mucho tiempo, como su capacidad para incrementar los títulos de anticuerpos a inmunógenos. Según se utiliza aquí, el término "saponina" se refiere a un grupo de glucósidos de superficie activa de origen vegetal compuestos de una región hidrofílica (usualmente varias cadenas de azúcar) en asociación con una región hidrofóbica de ya sea una estructura esteroide o triterpenoide. Aunque la saponina está disponible de un número de diversas fuentes, las saponinas con actividad adyuvante útil, han sido obtenidas del árbol de América del Sur Quillaja saponaria (Molina). La saponina obtenida de esta fuente se utilizó para aislar una fracción "homogénea" denominada "Quil A" (Dalsgaard, K., (1974), Arch. Gesamte Virusforsch. 44:243).The properties of saponin adjuvant have been known for a long time, as its ability to increase antibody titer to immunogens. As used herein, the term "saponin" refers to a group of active surface glycosides of plant origin composed of a hydrophilic region (usually several sugar chains) in association with a hydrophobic region of either a steroid or triterpenoid structure. Although saponin is available from a number of different sources, saponins with useful adjuvant activity have been obtained from the South American tree Quillaja saponaria (Molina). The saponin obtained from this source was used to isolate a "homogeneous" fraction called "Quil A" (Dalsgaard, K., (1974), Arch. Gesamte Virusforsch. 44: 243).

La reactividad en el sitio de dosificación es una preocupación importante para el uso tanto veterinario como humano de Quil A en preparaciones de vacuna. Una manera de evitar esta toxicidad de Quil A es el uso de un complejo de inmunoestimulación (conocido como un ISCOM^{TM}, una abreviatura para Immuno Stimulating COMplex). Esto es ante todo porque, Quil A es menos reactivo cuando se incorpora en los complejos de inmunoestimulación, porque su asociación con el colesterol en el complejo, reduce su capacidad de enlace al colesterol en membranas celulares y por lo tanto sus efectos líticos de la célula. Además, se necesita una menor cantidad de Quil A para generar un nivel similar de efecto adyuvante.The reactivity at the dosing site is an important concern for both veterinary and human use of Quil A in vaccine preparations. One way to avoid this toxicity of Quil A is the use of an immunostimulation complex (known as an ISCOM ™, an abbreviation for Immuno Stimulating COM plex). This is primarily because, Quil A is less reactive when incorporated into immunostimulation complexes, because its association with cholesterol in the complex reduces its ability to bind cholesterol in cell membranes and therefore its lytic effects of the cell . In addition, a smaller amount of Quil A is needed to generate a similar level of adjuvant effect.

Las propiedades inmunomodulatorias de las saponinas Quil A y los beneficios adicionales que se derivan a partir de estas saponinas, cuando se incorporan en un complejo de inmunoestimulación han sido descritos en varias publicaciones, por ejemplo Cox and Cox, J.C. and Coulter, A.R. Advances in Adyuvante Technology and Application in Animal Parasite Control Utilising Biotechnology, Chapter 4, Editor Yong, W.K. CRC Press (1992); Cox, J.C. and Coulter, A.R. (1997) Vaccine, 15(3):248-256; Cox, J.C. and Coulter, A.R. (1999) BioDrugs 12(6):439-453); Dalsgaard, (1974) (supra); Morein et al., (1989) "Immunostimulating complejo (ISCOM)", In "Vaccines: Recent Trends and Progress". G. Gregoriadis, A.C. Allison and G. Poster (Eds). Plenium Press, New York, p.153; Australian Patent Specifications Nos. 558258, 589915, 590904 and 632067.The immunomodulatory properties of Quil A saponins and the additional benefits derived from these saponins, when incorporated into an immunostimulation complex have been described in several publications, for example Cox and Cox, JC and Coulter, AR Advances in Adjuvant Technology and Application in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology, Chapter 4, Editor Yong, WK CRC Press (1992); Cox, JC and Coulter, AR (1997) Vaccine, 15 (3): 248-256; Cox, JC and Coulter, AR (1999) BioDrugs 12 (6): 439-453); Dalsgaard, (1974) ( supra ); Morein et al ., (1989) "Immunostimulating complex (ISCOM)", In "Vaccines: Recent Trends and Progress". G. Gregoriadis, AC Allison and G. Poster (Eds). Plenium Press, New York, p.153; Australian Patent Specifications Nos. 558258, 589915, 590904 and 632067.

Los ISCOMs clásicos se forman por combinación del colesterol, la saponina, fosfolípido, e inmunógenos, tales como proteínas cubiertas virales. Las composiciones matriz ISCOM (conocidas como ISCOMATRIX^{TM}) se forman idénticamente, pero sin proteínas virales. Los ISCOMs parecen estimular ambas respuestas inmunes celulares y humorales. Los ISCOMs se han fabricado con proteínas de varios virus, incluyendo HSV-1, CMV, EBV, virus de la hepatitis B (HBV), virus de la rabia, y virus de la influenza, ver por ejemplo, I.G. Barr et al., Adv. Drug Delivery Reviews, 32:247-271 (1998). Se ha observado que cuando el ADN desnudo o los polipéptidos a partir de agentes infecciosos son pobremente inmunogénicos cuando se dan por ellos mismos, la inclusión dentro de los ISCOMs ha incrementado su inmunogenicidad. Se ha demostrado que varias proteínas formuladas con los ISCOMs inducen la CTL, principalmente en modelos de roedores. Berzofsky, (1991), Biotechnol. Ther. 2:123-135; Hsu et al., (1996), Vaccine 14:1159-1166; Lipford et al., (1994), Vaccine 12:73-80; Mowat et al., (1991), Immunology 72:317-322; Osterhaus et al., (1998), Dev. Biol. Stand. 92:49-58; Rimmelzwaan et al., (1997), J. Gen. Virol. 78 (pt.4):757-765; Sambhara et al., (1998), J. Infect. Dis. 177: 1266-1274; Sambhara et al., (1997), Mech. Aging Dev. 96:157-169; Sjolander et al., (1997), Vaccine 15:1030-1038; Sjolander et al., (1998), J. Leukoc. Biol.. 64:713-723; Takahashi et al., (1990), Nature 344:873-875; Tarpey et al., (1996), Vaccine 14:230-236; Trudel et al., (1987), Vaccine 10:107-112; Verschoor et al., (1999), J. Virol. 73:3292-3300; Villacres- Eriksson, (1995), Clin. Exp. Immunol. 102:46-52; Zugel et al., (1995), Eur. J. Immunoll. 25:451-458.Classic ISCOMs are formed by a combination of cholesterol, saponin, phospholipid, and immunogens, such as viral coated proteins. ISCOM matrix compositions (known as ISCOMATRIX?) Are formed identically, but without viral proteins. ISCOMs seem to stimulate both cellular and humoral immune responses. ISCOMs have been manufactured with proteins from several viruses, including HSV-1, CMV, EBV, hepatitis B virus (HBV), rabies virus, and influenza virus, see for example, IG Barr et al ., Adv. Drug Delivery Reviews, 32: 247-271 (1998). It has been observed that when naked DNA or polypeptides from infectious agents are poorly immunogenic when given by themselves, inclusion within ISCOMs has increased their immunogenicity. It has been shown that several proteins formulated with ISCOMs induce CTL, mainly in rodent models. Berzofsky, (1991), Biotechnol. Ther. 2: 123-135; Hsu et al ., (1996), Vaccine 14: 1159-1166; Lipford et al ., (1994), Vaccine 12: 73-80; Mowat et al ., (1991), Immunology 72: 317-322; Osterhaus et al ., (1998), Dev. Biol. Stand. 92: 49-58; Rimmelzwaan et al ., (1997), J. Gen. Virol. 78 (pt.4): 757-765; Sambhara et al ., (1998), J. Infect. Dis. 177: 1266-1274; Sambhara et al ., (1997), Mech. Aging Dev. 96: 157-169; Sjolander et al ., (1997), Vaccine 15: 1030-1038; Sjolander et al ., (1998), J. Leukoc. Biol .. 64: 713-723; Takahashi et al ., (1990), Nature 344: 873-875; Tarpey et al ., (1996), Vaccine 14: 230-236; Trudel et al ., (1987), Vaccine 10: 107-112; Verschoor et al ., (1999), J. Virol. 73: 3292-3300; Villacres- Eriksson, (1995), Clin. Exp. Immunol. 102: 46-52; Zugel et al ., (1995), Eur. J. Immunoll. 25: 451-458.

Se piensa que, la asociación entre el antígeno y el adyuvante es importante para la inducción óptima de respuestas inmunes en CTL particular (Cox, J.C. and Coulter, A.R. (1999) BioDrugs, 12(6):439-445). Se ha hecho un número de estudios, que confirma esta hipótesis incluyendo el trabajo con virosomas y ISCOMs^{TM} (Ennis, F. A., Crux, J., Jameson, J., Klein, M., Burt, D. and Thipphawong, J. 1999. Virology 259: 256-261., Zurbriggen, R., Novak-Hofer, I., Seelig, A. and Gluck, R. (2000), Progress in lípido Research 39: 3-18. Usualmente la asociación entre ISCOM^{TM} y el antígeno se ha logrado por la incorporación de antígenos anfipáticos en la estructura ISCOM^{TM} durante la formación (Morein, B., B. Sundquist, S. Hoglund, K. Dalsgaard, and A. Osterhaus. 1984. Nature 308:457). La incorporación fue por interacciones hidrofóbicas. Sin embargo muchos antígenos, tales como la proteína del núcleo HCV, fueron capaces de ser incorporados en los ISCOMs^{TM} por el método clásico. Los métodos más recientemente asociados con los antígenos con un preformado complejo libre de proteínas de inmunoestimulación (ISCOMATRIX ^{TM}) utilizando interacciones de quelación y electrostático han sido desarrollados (Aplicaciones de Patentes Internacionales Nos. PCT/AU98/00080 - WO 98/36772, y PCT/AU00/00110).It is thought that, the association between the antigen and the adjuvant is important for the optimal induction of responses immune in particular CTL (Cox, J.C. and Coulter, A.R. (1999) BioDrugs, 12 (6): 439-445). It has made a number of studies, which confirms this hypothesis including the I work with virosomes and ISCOMs? (Ennis, F. A., Crux, J., Jameson, J., Klein, M., Burt, D. and Thipphawong, J. 1999. Virology 259: 256-261., Zurbriggen, R., Novak-Hofer, I., Seelig, A. and Gluck, R. (2000), Progress in lipid Research 39: 3-18. Usually the association between ISCOM? and the antigen has been achieved by the incorporation of amphipathic antigens into the structure ISCOM? During training (Morein, B., B. Sundquist, S. Hoglund, K. Dalsgaard, and A. Osterhaus. 1984. Nature 308: 457). The Incorporation was by hydrophobic interactions. However many antigens, such as the HCV core protein, were able to be incorporated into the ISCOMs? by the classical method. The methods most recently associated with antigens with a Preformed immunostimulation protein-free complex (ISCOMATRIX ™) using chelation interactions and electrostatic have been developed (Patent Applications International Nos. PCT / AU98 / 00080 - WO 98/36772, and PCT / AU00 / 00110).

La proteína del núcleo de HCV, lo mismo que las proteínas de membrana E1 y E2, se ha demostrado que es útil en la inmunización contra HCV (ver, por ejemplo, co-pendiente de la Aplicación de la Patente U.S. Serie No. 08/823,980). Las secuencias para las proteínas de membrana también contienen ciertas regiones conservadas, aún en los dominios hipervariables de estas, que proporcionan utilidad incrementada para la inmunización contra los diversos mutantes de escape responsables de infecciones crónicas. Permanece una necesidad, sin embargo, de métodos y composiciones que incrementen la capacidad de estas proteínas y polipéptidos de ser inmunogénico y estimular el desarrollo de amplio y durable CTL activo contra la infección por HVC. En el trabajo que condujo a la presente invención, los inventores han desarrollado un complejo inmunogénico basándose en la asociación electrostática de un antígeno del HCV y un portador orgánico, tal como un adyuvante. Esta asociación electrostática permite la co-entrega del antígeno y el portador orgánico para el sistema inmune, para el propósito de inducir una respuesta inmune, particularmente una respuesta de linfocitos-T citotóxicos, en el antígeno.The HCV core protein, the same as the E1 and E2 membrane proteins have been shown to be useful in the HCV immunization (see, for example, co-pending U.S. Patent Application Series No. 08 / 823,980). The sequences for the proteins of membrane also contain certain conserved regions, even in the hypervariable domains of these, which provide utility increased for immunization against the various mutants of escape responsible for chronic infections. Remains one need, however, for methods and compositions that increase the ability of these proteins and polypeptides to be immunogenic and stimulate the development of broad and durable active CTL against the HVC infection. In the work that led to the present invention, the inventors have developed an immunogenic complex based on the electrostatic association of an HCV antigen and an organic carrier, such as an adjuvant. This association electrostatic allows co-delivery of the antigen and the organic carrier for the immune system, for the purpose of induce an immune response, particularly a response from cytotoxic T-lymphocytes, in the antigen.

Resumen de la invenciónSummary of the Invention

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto demande otra cosa, la palabra "comprende", y las variaciones tales como "comprende" y "que comprende" se entiende que implican la inclusión de un indicado número entero o grado o grupo de números enteros o grados, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grado de grupo de números enteros o grados.Throughout this specification and the claims that follow, unless the context demands another thing, the word "understand", and variations such as "understand" and "understand" is understood to imply inclusion of an indicated whole number or grade or group of numbers integers or degrees, but not the exclusion of any other number integer or group grade of whole numbers or degrees.

Un aspecto de la presente invención se relaciona con un complejo inmunogénico que comprende un complejo orgánico con carga negativa y un antígeno cargado, complejo orgánico y antígeno que están asociados electrostáticamente, en donde el complejo orgánico es un adyuvante con carga negativa y comprende una saponina y colesterol y en donde el antígeno cargado comprende (i) uno o más polipéptidos inmunogénicos de una región del Virus de la Hepatitis C (HCV) seleccionado de Core, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b, o (ii) una proteína de fusión que comprende un polipéptido inmunogénico de la región Core del HCV y un segundo polipéptido inmunogénico seleccionado de las regiones E1, E2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b del HCV.One aspect of the present invention relates to with an immunogenic complex comprising an organic complex with negative charge and a charged antigen, organic complex and antigen which are electrostatically associated, where the complex Organic is a negatively charged adjuvant and comprises a saponin and cholesterol and wherein the charged antigen comprises (i) one or more immunogenic polypeptides from a region of the Hepatitis Virus C (HCV) selected from Core, NS3, NS4a, NS4b, NS5a and NS5b, or (ii) a fusion protein comprising an immunogenic polypeptide of the Core region of HCV and a second immunogenic polypeptide selected from regions E1, E2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a and NS5b of HCV.

Preferiblemente, la poliproteína es la proteína del núcleo del HCV.Preferably, the polyprotein is the protein of the HCV core.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con una composición de vacuna que contiene como el componente activo un complejo inmunogénico de acuerdo con la invención junto con uno o más portadores o diluentes farmacéuticamente aceptables.A further aspect of the present invention is relates to a vaccine composition that contains as the active component an immunogenic complex according to the invention together with one or more carriers or diluents pharmaceutically acceptable.

Otro aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el uso de un complejo inmunogénico o una composición de vacuna de acuerdo con la invención en la fabricación de un medicamento para utilizar en un método para el tratamiento o prevención de una infección por HVC en un mamífero causando, induciendo o por otra parte facilitando, una respuesta inmune a un antígeno del HCV.Another additional aspect of the present invention it is related to the use of an immunogenic complex or a vaccine composition according to the invention in the manufacture of a medication to use in a method for treatment or prevention of an HVC infection in a mammal causing, inducing or otherwise facilitating, an immune response to a HCV antigen.

Todavía un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el uso de un complejo inmunogénico o una composición de vacuna como se describe anteriormente en el texto, en la fabricación de un medicamento para inhibir, detener, retrasar o prevenir el inicio o evolución de una infección por HVC.Still an additional aspect of the present invention relates to the use of an immunogenic complex or a vaccine composition as described earlier in the text, in the manufacture of a medicine to inhibit, stop, delay or prevent the onset or evolution of an HVC infection.

Aún otro aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un complejo inmunogénico o composición de vacuna de acuerdo con la invención para utilizar en un método de tratamiento del organismo humano o animal mediante una terapia.Still another additional aspect of this invention relates to an immunogenic complex or composition of vaccine according to the invention for use in a method of treatment of the human or animal organism through therapy.

Como se describe adicionalmente a continuación, los complejos inmunogénicos de la presente invención pueden incluir, como el antígeno cargado, una proteína de HCV tal como una proteína de la nucleocápsida del HCV Core, una proteína no-estructural, los fragmentos inmunogénicos de cualquiera de dichas proteínas, o combinaciones de tales proteínas. Dichos fragmentos generalmente incluyen polipéptidos que comprenden epitopes reconocibles por las células T. Los fragmentos preferidos comprenden aquellos fragmentos que son inmunogénicos cuando se suministran por ellos mismos, o cuando se incluyen en un complejo inmunogénico de la presente invención. Como se utiliza a lo largo de la especificación, el término "poliproteína del HCV" o "proteína de HCV" tiene la intención de incluir la proteína de longitud total lo mismo que fragmentos de polipéptidos. Una proteína de HCV tal como una proteína de la nucleocápsida del HCV Core, una proteína no-estructural, la proteína de membrana E1, la proteína de membrana E2, los fragmentos inmunogénicos de cualquiera de dichas proteínas o combinaciones de tales proteínas también pueden estar presentes en los complejos inmunogénicos de la presente invención como proteínas de fusión, dependiendo de cual método de expresión de la proteína de HCV se escoge. Las secuencias para estos polipéptidos y proteínas se conocen (ver, por ejemplo Patente U.S. No. 5,350,671). La invención también proporciona polipéptidos que son homólogos (i.e., tienen identidad de secuencia) a estos fragmentos. Dependiendo del fragmento particular, el grado de identidad de la secuencia preferiblemente es mayor del 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más). Estos polipéptidos homólogos incluyen mutantes y variantes alélicas de los fragmentos.As described further below, the immunogenic complexes of the present invention can include, as the loaded antigen, an HCV protein such as a HCV Core nucleocapsid protein, a protein non-structural, immunogenic fragments of any of said proteins, or combinations of such proteins. Such fragments generally include polypeptides that comprise epitopes recognizable by T cells. Preferred fragments they comprise those fragments that are immunogenic when supplied by themselves, or when included in a complex immunogenic of the present invention. As used throughout of the specification, the term "HCV polyprotein" or "HCV protein" is intended to include the protein of total length the same as polypeptide fragments. A protein of HCV such as a nucleocapsid protein of HCV Core, a non-structural protein, membrane protein E1, the E2 membrane protein, the immunogenic fragments of any of said proteins or combinations of such proteins they may also be present in the immunogenic complexes of the present invention as fusion proteins, depending on which HCV protein expression method is chosen. The sequences for these polypeptides and proteins are known (see, for example U.S. Patent No. 5,350,671). The invention also provides polypeptides that are homologous (i.e., have sequence identity) to these fragments. Depending on the particular fragment, the degree sequence identity is preferably greater than 50% (per example, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% or more). These polypeptides homologs include mutants and allelic variants of the fragments

Breve descripción de los dibujosBrief description of the drawings

Figura 1 es una representación gráfica del análisis de gradiente de sacarosa de formulaciones Core-ISCOM^{TM} para la proteína del núcleo (Figura 1A), ISCOMATRIX^{TM} (Figura 1B), y Core-ISCOM^{TM} (Figura 1C).Figure 1 is a graphic representation of the sucrose gradient analysis of formulations Core-ISCOM ™ for core protein (Figure 1A), ISCOMATRIX ™ (Figure 1B), and Core-ISCOM ™ (Figure 1C).

Figura 2: B-LCLs de los dos animales sin respuesta, inmunizados-ISCOM-HCV Core no pueden presentar los péptidos derivados de Core 121-135 y 86-100. Figura 2A: La línea CTL 121-135-específica, establecida del animal DV037 se probó en un ensayo de liberación ^{51}Cr estándar para su capacidad de lisar las células diana DV037 B-LCL sensibilizadas con el péptido 121-135 (cuadrados sólidos) o un péptido irrelevante (cuadrados abiertos), células diana AY921 B-LCL sensibilizadas con el péptido 121-135 (cuadrados sólidos) o un péptido irrelevante (círculos abiertos), y células diana BB231 B-LCL sensibilizadas con el péptido 121-135 (triángulos sólidos) o un péptido irrelevante (triángulos abiertos). Figura 2B: La línea CTL 86-100-específica se probó en un ensayo de liberación ^{51}Cr estándar para su capacidad de lisar las células diana DV036 B-LCL sensibilizadas con el péptido 86-100 (cuadrados sólidos) o un péptido irrelevante (cuadrados abiertos), células diana AY921 B-LCL sensibilizadas con el péptido 86-100 (círculos sólidos) o un péptido irrelevante (círculos abiertos), y células diana BB231 B-LCL sensibilizadas con el péptido 86-100 (triángulos sólidos) o un péptido irrelevante (triángulos abiertos).Figure 2: B-LCLs of the two unanswered animals, Immunized-ISCOM-HCV Core cannot present the peptides derived from Core 121-135 and 86-100. Figure 2A: The CTL line 121-135-specific, established from animal DV037 was tested in a standard 51 Cr release test for its ability to lyse DV037 target cells B-LCL sensitized with the peptide 121-135 (solid squares) or an irrelevant peptide (open squares), target cells AY921 B-LCL sensitized with peptide 121-135 (squares solids) or an irrelevant peptide (open circles), and cells BB231 B-LCL target sensitized with the peptide 121-135 (solid triangles) or a peptide irrelevant (open triangles). Figure 2B: The CTL line 86-100-specific was tested in a 51 Cr standard release assay for its ability to lyse DV036 B-LCL target cells sensitized with the peptide 86-100 (solid squares) or a peptide irrelevant (open squares), target cells AY921 B-LCL sensitized with the peptide 86-100 (solid circles) or an irrelevant peptide (open circles), and BB231 B-LCL target cells sensitized with peptide 86-100 (triangles solids) or an irrelevant peptide (open triangles).

Figura 3 muestra la longevidad de las respuestas de CTL cebado por vacunación. Las PBMCs de DV037 (Figura 3A) y BB232 (Figura 3B) se re-estimularon in vitro con el péptido epitópico 121-135. Después del enriquecimiento del CD8+, las células se ensayaron para la actividad citotóxica contra los B-LCLs autólogas sensibilizadas con el péptido epitópico 121-135 (círculos sólidos) o un péptido irrelevante (círculos abiertos). Figura 3C muestra los resultados de un experimento donde las PBMCs aisladas recientemente de DV037, 51 semanas después de su última inmunización (dos paneles izquierdos), o PBMCsre-estimulados-in vitro desde el mismo punto de tiempo (dos paneles derechos) se re-estimularon por 12 horas con el péptido 121-135 o un péptido control y se tiñe por la CD8 superficial y IFN-\gamma y TNF-\alpha intracelular. Los linfocitos se controlaron por el lado vs. luz de dispersión hacia adelante y luego para CD8-PerCP. Los registros muestran el log de la intensidad de fluorescencia para TNF-\alpha-FITC e IFN-\gamma-PE.Figure 3 shows the longevity of the CTL responses primed by vaccination. The PBMCs of DV037 (Figure 3A) and BB232 (Figure 3B) were re-stimulated in vitro with epitope peptide 121-135. After enrichment of CD8 +, cells were assayed for cytotoxic activity against autologous B-LCLs sensitized with epitope peptide 121-135 (solid circles) or an irrelevant peptide (open circles). Figure 3C shows the results of an experiment where recently isolated PBMCs from DV037, 51 weeks after their last immunization (two left panels), or in vitro stimulated PBMCs from the same time point (two right panels) are re- stimulated for 12 hours with peptide 121-135 or a control peptide and stained by surface CD8 and intracellular IFN-? and TNF-?. Lymphocytes were controlled on the side vs. Forward scatter light and then for CD8-PerCP. The records show the fluorescence intensity log for TNF-? -FITC and IFN-?-PE.

Figura 4 muestra los títulos de anticuerpos contra Core en el suero de animales inmunizados. Las barras abiertas, pre-inmunización; barras a rayas, 2 semanas después de la segunda inmunización; barras rellenas, 2 semanas después de la tercera inmunización.Figure 4 shows antibody titers against Core in the serum of immunized animals. The bars open, pre-immunization; striped bars, 2 weeks after the second immunization; stuffed bars, 2 weeks after the third immunization.

Figura 5 muestra las citoquinas de tipo Th-1 y Th-2 en Core-ISCOM-animales inmunizados. El nivel de IFN-\gamma (Figura 5A), IL-2 (Figura 5B), IL-5 (Figura 5C) e IL-10 (Figura 5D) se midió por un ELISA específico en el sobrenadante libre de células de PBMCs aisladas recientemente, estimuladas por 48 h como se describe en los ejemplos. Las barras abiertas, la pre-inmunización; barras a rayas, 2 semanas después de la segunda inmunización; barras rellenas, 2 semanas después de la tercera inmunización. NT: No probada.Figure 5 shows the type cytokines Th-1 and Th-2 in Core-ISCOM-immunized animals. He IFN-γ level (Figure 5A), IL-2 (Figure 5B), IL-5 (Figure 5C) e IL-10 (Figure 5D) was measured by a specific ELISA in the cell-free supernatant of isolated PBMCs recently, stimulated for 48 h as described in the examples. Open bars, pre-immunization; striped bars, 2 weeks after the second immunization; bars  stuffed, 2 weeks after the third immunization. NT: No tested.

Figura 6 muestra restricción MHC clase I de los CTLs de los péptidos 121-135 y 86-100. (Figura 6A) muestra los resultados de un experimento donde la línea CTL del péptido 86-100-específica derivada del animal 15864 se probó en un ensayo de liberación ^{51}Cr estándar para su capacidad de lisar las células diana B-LCL del péptido 86-100 -sensibilizadas derivadas de los animales DV036 (cuadrados sólidos), 15864 (círculos sólidos), 15860 (triángulos sólidos) y 15861 (círculos abiertos). Figura 6B muestra los resultados de un experimento donde la línea CTL del péptido 121-135-específico derivada del animal 15862 se probó en un ensayo de liberación ^{51}Cr estándar para su capacidad de lisar células diana B-LCL sensibilizadas del péptido 121-135 derivadas de los animales DV037 (cuadrados sólidos), BB232 (triángulos sólidos),15862 (triángulos sólidos invertidos), 15863 (círculos sólidos), 15861 (cuadrados abiertos) y 15860 (triángulos abiertos invertidos).Figure 6 shows MHC class I restriction of CTLs of peptides 121-135 and 86-100. (Figure 6A) shows the results of a experiment where the peptide CTL line 86-100-specific derived from Animal 15864 was tested in a standard 51 Cr release test for its ability to lyse B-LCL target cells of the 86-100 -sensitized peptide derived from animals DV036 (solid squares), 15864 (solid circles), 15860 (solid triangles) and 15861 (open circles). Figure 6B shows the results of an experiment where the peptide CTL line 121-135-specific derived from Animal 15862 was tested in a standard 51 Cr release test for its ability to lyse B-LCL target cells sensitized peptide 121-135 derived from animals DV037 (solid squares), BB232 (solid triangles), 15862 (inverted solid triangles), 15863 (solid circles), 15861 (open squares) and 15860 (inverted open triangles).

Figura 7 muestra una cuantificación de las respuestas de la célula T CD8+ y CD4+ en animales-ISCOM-Core inmunizados. Las PBMCs recientemente aisladas se re-estimularon ex vivo con B-LCLs autólogas rVVC/E1 o VVwt-infectado (Figura 7A) o con la proteína del núcleo recombinante de un E. coli control (Figura 7B). Las células luego se tiñeron para CD8 o CD4 superficial, e IFN-\gamma y TNF-\alpha intracelular como se describe en los ejemplos. Los linfocitos se controlaron por el lado vs. luz de dispersión hacia adelante y luego por CD8-PerCP (Figura 7A) o CD4-APC (Figura 7B). En la Figura 7A, el porcentaje corregido de las células T CD8+ con IFN-\gamma y/o TNF-\alpha detectable se calculó como (% de células T CD8+ re-estimuladas con rVVC/E1 que fueron IFN-\gamma y/o TNF-\alpha+) - (% de células T CD8+ re-estimuladas con VVwt que fueron IFN-\gamma y/o TNF-\alpha+). En la Figura 7B, el porcentaje corregido de las células T CD4+ con IFN-\lambda y/o TNF-\alpha detectable se calculó como (% de células T CD4+ re-estimuladas con Core que fueron IFN-\gamma y/o TNF\alpha-+) - (% de células T CD4+ re-estimuladas con la E. coli que fueron IFN-\gamma y/o TNF-\alpha+). Las barras abiertas, pre-inmunizadas; barras a rayas, 2 semanas después de la segunda inmunización; barras rellenas, 2 semanas después de la tercera inmunización.Figure 7 shows a quantification of the CD8 + and CD4 + T cell responses in immunized ISCOM-Core animals. Recently isolated PBMCs were re-stimulated ex vivo with autologous rVVC / E1 or VVwt-infected B-LCLs (Figure 7A) or with the recombinant core protein of an E. coli control (Figure 7B). The cells were then stained for superficial CD8 or CD4, and intracellular IFN-? And TNF-? As described in the examples. Lymphocytes were controlled on the side vs. forward scatter light and then by CD8-PerCP (Figure 7A) or CD4-APC (Figure 7B). In Figure 7A, the corrected percentage of CD8 + T cells with IFN-? And / or detectable TNF-? Was calculated as (% of CD8 + T cells re-stimulated with rVVC / E1 that were IFN-? And / or TNF-? +) - (% of CD8 + T cells re-stimulated with VVwt that were IFN-? and / or TNF-? +). In Figure 7B, the corrected percentage of CD4 + T cells with IFN-? And / or detectable TNF-? Was calculated as (% of CD4 + T cells re-stimulated with Core that were IFN-? And / or TNF α- +) - (% of CD4 + T cells re-stimulated with E. coli which were IFN-? and / or TNF-? +). Open bars, pre-immunized; striped bars, 2 weeks after the second immunization; filled bars, 2 weeks after the third immunization.

Figura 8 muestra que Core-ISCOM puede servir como un adyuvante para E1E2. Los ratones (10 animales por grupo) se inmunizaron con 2g de solamente E1E2 soluble, 2 g de E1E2 soluble + 2g de Core-ISCOM, o 2 g de E1E2 soluble con adyuvante MF59. Los ratones se desangraron dos semanas después de la tercera inmunización. Los títulos anti-E2 (barras rellenas) y anti-CD81 (barras a rayas) se presentan como la media geométrica de los títulos obtenidos de los ratones individuales de cada grupo. NT: No probada.Figure 8 shows that Core-ISCOM It can serve as an adjuvant for E1E2. Mice (10 animals per group) were immunized with 2g of only soluble E1E2, 2g of Soluble E1E2 + 2g of Core-ISCOM, or 2 g of E1E2 soluble with adjuvant MF59. The mice bled two weeks after the third immunization. The titles anti-E2 (filled bars) and anti-CD81 (striped bars) are presented as the geometric mean of the titles obtained from the mice Individuals of each group. NT: Not tested.

Figura 9 es una representación esquemática del genoma HCV, que representa las diferentes regiones de la poliproteína a partir de la cual las actuales proteínas para utilizar con el ISCOMs se derivan.Figure 9 is a schematic representation of the HCV genome, which represents the different regions of the polyprotein from which current proteins for Use with the ISCOMs are derived.

Figura 10 es una representación gráfica del análisis de gradiente de sacarosa de las formulaciones de 121-ISCOM^{TM} NS35 Core para NS35 Core 121-ISCOM^{TM}. (Figura 10A) y proteína 121 NS35 Core (Figura 10B).Figure 10 is a graphic representation of the sucrose gradient analysis of the formulations of 121-ISCOM ™ NS35 Core for NS35 Core 121-ISCOM ™. (Figure 10A) and 121 NS35 protein Core (Figure 10B).

Descripción detallada de las modalidades preferidasDetailed description of the preferred modalities

La presente invención se basa, en parte, en el desarrollo de una formulación del complejo inmunogénico, el cual utiliza interacciones electrostáticas para asociar un antígeno de HCV y un portador, lo que facilita, inter alia, la co-entrega de estas moléculas con el sistema inmune. Los complejos inmunogénicos de la presente invención son particularmente apropiados para su uso en facilitar la estimulación de respuestas del linfocito-T citotóxico.The present invention is based, in part, on the development of an immunogenic complex formulation, which uses electrostatic interactions to associate an HCV antigen and a carrier, which facilitates, inter alia , the co-delivery of these molecules with the immune system. The immunogenic complexes of the present invention are particularly suitable for use in facilitating the stimulation of cytotoxic T-lymphocyte responses.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se relaciona con un complejo inmunogénico que comprende un portador orgánico cargado y un antígeno cargado, portador orgánico y antígeno que están asociados electrostáticamente, y en donde el antígeno cargado es una poliproteína del Virus de la Hepatitis C (HCV), preferiblemente la proteína del núcleo del HCV, o un fragmento de esta, o una proteína de fusión que contiene dicha poliproteína o un fragmento de esta.Therefore, an aspect of the present invention relates to an immunogenic complex comprising a charged organic carrier and a charged, carrier antigen organic and antigen that are electrostatically associated, and in where the loaded antigen is a polyprotein of the Virus of the Hepatitis C (HCV), preferably the HCV core protein, or a fragment thereof, or a fusion protein containing said polyprotein or a fragment thereof.

La referencia a un "complejo" se debería entender como la descripción de una entidad de dos o más distintos componentes químicos que interactúan.The reference to a "complex" should be understand as the description of an entity of two or more different chemical components that interact.

La referencia a un portador o antígeno orgánico "cargado" se debería entender como una referencia a un portador o antígeno orgánico que muestra una carga eléctrica positiva completa o una carga eléctrica negativa completa. Por "completa" se entiende la suma de las cargas positiva y negativa individuales que una molécula dada comprende. Donde la suma de las cargas positiva y negativa individual resulta en una neutralidad eléctrica completa, la molécula no se estima como "cargada" dentro del contexto de la presente invención. Preferiblemente, el portador orgánico comprende una carga negativa completa.The reference to an organic carrier or antigen "loaded" should be understood as a reference to a carrier  or organic antigen that shows a positive electrical charge complete or a complete negative electrical charge. By "complete" means the sum of the positive charges and individual negatives that a given molecule comprises. Where the sum of individual positive and negative charges results in a complete electrical neutrality, the molecule is not estimated as "charged" within the context of the present invention. Preferably, the organic carrier comprises a negative charge. complete.

Por consiguiente, la presente invención más particularmente proporciona un complejo inmunogénico como se describe anteriormente, en donde el portador orgánico cargado es un portador orgánico con carga negativa.Therefore, the present invention more particularly provides an immunogenic complex as described above, wherein the charged organic carrier is a Organic carrier with negative charge.

La referencia a "electrostáticamente asociado" es una referencia al portador orgánico y el antígeno que se liga, une o por otra parte asocia por medio del cual incluyen interacción electrostática. Por consiguiente, debe entenderse que, en algunos casos la interacción electrostática será solo la fuerza atractiva que resulta en los complejantes del antígeno y el portador orgánico. Sin embargo, en otros casos la formación de la interacción electrostática también puede dar lugar a, o ser asociado con, la formación de otras fuerzas interactivas.The reference to "electrostatically associated "is a reference to the organic carrier and the antigen that binds, joins or otherwise associates by means of which They include electrostatic interaction. Therefore, you must understood that, in some cases the electrostatic interaction will be only the attractive force that results in the complexers of antigen and organic carrier. However, in other cases the electrostatic interaction formation can also result to, or be associated with, the formation of other forces interactive

Los términos "poliproteína", "proteína" y "polipéptido" se utilizan en este documento de forma intercambiable y se refieren a un polímero de residuos de aminoácido y no se limitan a una longitud mínima del producto. Por lo tanto, los péptidos, los oligopéptidos, dímeros, multímeros, y similares, se incluyen dentro de la definición. Ambos proteínas y fragmentos de longitud completa de esta, se abarcan por la definición. Los términos también incluyen modificaciones de pos-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Adicionalmente, para propósitos de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservadores en la naturaleza), a la secuencia nativa, siempre y cuando la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagenesis de sitio dirigido, o pueden ser accidentales, como a través de mutaciones de huéspedes que producen las proteínas o errores debidos a la amplificación PCR.The terms "polyprotein", "protein" and "polypeptide" are used herein interchangeably and refer to a waste polymer of amino acid and are not limited to a minimum product length. By therefore, peptides, oligopeptides, dimers, multimers, and similar, are included within the definition. Both proteins and full length fragments of this, are encompassed by the definition. The terms also include modifications of post-expression of the polypeptide, for example, glycosylation, acetylation, phosphorylation and the like. Additionally, for purposes of the present invention, a "polypeptide" refers to a protein that includes modifications, such as deletions, additions and substitutions (generally conservative in nature), to the sequence native, as long as the protein maintains the desired activity. These modifications can be deliberate, as through site-directed mutagenesis, or they may be accidental, such as to through host mutations that produce proteins or Errors due to PCR amplification.

En particular, como se muestra en la Figura 9, varias proteínas se codifican por el genoma del HCV. El orden y nomenclatura de los productos de división de la poliproteína del HCV es como sigue: NH_{2}-C-E1-E2-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b- COOH. La división inicial de la poliproteína se cataliza por proteasas huésped las cuales liberan tres proteínas estructurales, la proteína N-terminal de la nucleocápsida (denominada "Core") y dos glicoproteínas de membrana, "E1" (también conocidas como E) y "E2" (también conocida como E2/NS1), lo mismo que las proteínas no-estructurales (NS) que contienen las enzimas virales. Las regiones NS se denominan NS2, NS3, NS4 y NS5. La NS2 es una proteína de membrana integral con actividad proteolítica. La NS2, ya sea sola o en combinación con NS3, divide el enlace sissle NS2-NS3 que a su vez genera el N-terminal NS3 y libera una gran poliproteína que incluye ambas actividades serina proteasa y ARN helicasa. La proteasa de NS3 sirve para procesar la poliproteína remanente. La terminación de la maduración de la poliproteína se inicia por división autocatalítica en el empalme NS3-NS4a, catalizada por la proteasa de serina NS3. Las posteriores divisiones NS3-mediadas de la poliproteína del HCV parecen involucrar el reconocimiento de los empalmes de división de la poliproteína por una molécula NS3 de otro polipéptido. En estas reacciones, NS3 libera un co-factor de NS3 (NS4a), dos proteínas con función desconocida (NS4b y NS5a), y una polimerasa de ARN dependiente del ARN (NS5b).In particular, as shown in Figure 9, Several proteins are encoded by the HCV genome. Order and nomenclature of HCV polyprotein cleavage products It is as follows: NH2 -C-E1-E2-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-  COOH The initial division of polyprotein is catalyzed by host proteases which release three structural proteins, N-terminal nucleocapsid protein (called "Core") and two membrane glycoproteins, "E1" (also known as E) and "E2" (also known like E2 / NS1), same as proteins non-structural (NS) enzymes contain viral. The NS regions are called NS2, NS3, NS4 and NS5. NS2 is an integral membrane protein with proteolytic activity. The NS2, either alone or in combination with NS3, split the sissle link NS2-NS3 which in turn generates the N-terminal NS3 and releases a large polyprotein that It includes both serine protease and RNA helicase activities. The NS3 protease serves to process the remaining polyprotein. The termination of polyprotein maturation is initiated by autocatalytic division in the NS3-NS4a junction, catalyzed by NS3 serine protease. Subsequent ones NS3-mediated HCV polyprotein divisions seem to involve the recognition of the splices of division of the polyprotein by an NS3 molecule of another polypeptide. In these reactions, NS3 releases a co-factor of NS3 (NS4a), two proteins with unknown function (NS4b and NS5a), and one RNA-dependent RNA polymerase (NS5b).

Como se explica anteriormente, cualquiera de un número de polipéptidos del HCV derivado de la poliproteína del HCV se puede utilizar en los complejos inmunogénicos de la presente invención. Por lo tanto, estos complejos pueden contener los polipéptidos derivados de la proteína del HCV Core de la nucleocápsida, una proteína no-estructural, la proteína de membrana E1, la proteína de membrana E2, los fragmentos de polipéptidos de cualquiera de tales proteínas, o combinaciones de tales proteínas. Dichos fragmentos pueden ser polipéptidos que comprenden epitopes reconocibles por las células T. Los fragmentos preferidos comprenden aquellos fragmentos que son inmunogénicos cuando se proporcionan por ellos mismos, o cuando se incluyen en el complejo inmunogénico de la presente invención.As explained above, any of a number of HCV polypeptides derived from HCV polyprotein can be used in the immunogenic complexes of the present invention. Therefore, these complexes may contain HCV Core protein derived polypeptides from the nucleocapsid, a non-structural protein, the E1 membrane protein, E2 membrane protein, fragments of polypeptides of any such protein, or combinations of such proteins. Such fragments can be polypeptides that comprise epitopes recognizable by T cells. Fragments Preferred comprise those fragments that are immunogenic when they are provided by themselves, or when they are included in the immunogenic complex of the present invention.

Preferiblemente, el complejo inmunogénico de la presente invención comprende la proteína del núcleo de HCV, o un fragmento inmunogénico de esta. La proteína del núcleo de HCV tiene un pH de 10, logrando una carga altamente positiva en el pH neutro y ácido. La referencia a la "proteína del núcleo" de HCV debe entenderse que incluye una referencia a los derivados y equivalentes de la proteína del núcleo.Preferably, the immunogenic complex of the The present invention comprises the HCV core protein, or a immunogenic fragment of this. The HCV core protein has a pH of 10, achieving a highly positive charge in neutral pH and acid. The reference to the "core protein" of HCV should understood to include a reference to derivatives and equivalents of the core protein.

El polipéptido para su uso en el complejo inmunogénico de la presente invención no necesita ser derivado físicamente del HCV, pero puede ser producido sintética o recombinantemente utilizando técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, y la inmunología, que están dentro de la habilidad del oficio. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, por ejemplo Sambrook Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition (1989); ADN Cloning, Volumes I and II (D.N. Glovere, ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1986); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 and 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds., (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987), Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986).The polypeptide for use in the complex immunogenic of the present invention need not be derived physically from HCV, but it can be produced synthetically or recombinantly using conventional biology techniques molecular, microbiology, recombinant DNA, and immunology, which They are within the skill of the trade. Such techniques are explained. completely in the literature, for example Molecular Sambrook Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); Cloning DNA, Volumes I and II (D.N. Glovere, ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1986); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); Animal cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 and 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds., (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987), Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986).

Adicionalmente, el polipéptido se puede derivar de cualquiera de las distintas cepas de HCV conocidas, tales como a partir de cepas 1, 2, 3 o 4 de HCV. Un número de regiones conservadas y variables se conocen entre estas cepas y, en general, las secuencias de aminoácidos de epitopes derivados de estas regiones tendrán un alto grado de homología de la secuencia, por ejemplo, homología de la secuencia de aminoácidos de más del 30%, preferiblemente más del 40%, cuando las dos secuencias se alinean. Por lo tanto, por ejemplo, el término polipéptido "Core" se refiere a la proteína del núcleo nativa a partir de cualquiera de las diferentes cepas de HCV, lo mismo que análogos, muteinas y fragmentos inmunogénicos de Core, como se define adicionalmente a continuación.Additionally, the polypeptide can be derived of any of the different strains of HCV known, such as a from strains 1, 2, 3 or 4 of HCV. A number of regions conserved and variable are known among these strains and, in general, the amino acid sequences of epitopes derived from these regions will have a high degree of sequence homology, by example, amino acid sequence homology of more than 30%, preferably more than 40%, when the two sequences are aligned. Therefore, for example, the term "Core" polypeptide is refers to the native core protein from any of the different strains of HCV, as well as analogs, muteins and Core immunogenic fragments, as further defined by continuation.

La referencia a "derivado y equivalentes" debe entenderse como una referencia a equivalentes químicos, mutantes, homólogos y análogos de fuentes naturales, sintéticas o recombinantes. Los derivados se pueden derivar de inserción, deleción o sustitución de aminoácidos. Derivados insercionales del aminoácido incluyen fusiones terminales de amino y/o carboxílico lo mismo que inserciones intrasecuencia de aminoácidos sencillos o múltiples. Las variantes de secuencia de aminoácido insercionales son aquellos en los cuales uno o más residuos de aminoácido se introducen en un sitio predeterminado en la proteína aunque la inserción al azar también es posible con la apropiada selección del producto resultante. Las variantes delecionales se caracterizan por la extracción de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes de aminoácidos sustitucionales son aquellas en los cuales un residuo en la secuencia ha sido extraído y un residuo diferente se inserta en su lugar. "Equivalentes" pueden actuar como un análogo funcional del antígeno sujeto. Los equivalentes químicos no pueden necesariamente ser derivados del antígeno sujeto pero pueden compartir ciertas similaridades adaptativas. De manera alternativa, los equivalentes químicos se pueden diseñar para minimizar ciertas propiedades fisicoquímicas del antígeno en cuestión. Los equivalentes se pueden sintetizar químicamente o se pueden detectar después de, por ejemplo, la selección del producto natural. Los homólogos contemplados aquí incluyen, pero no se limitan a, moléculas derivadas de distintas especies.The reference to "derivative and equivalents" It should be understood as a reference to chemical equivalents, mutants, homologues and analogs from natural, synthetic or recombinant Derivatives can be derived from insertion, deletion or substitution of amino acids. Insertion Derivatives of amino acid include terminal fusions of amino and / or carboxylic lo same as intrasequence insertions of simple amino acids or multiple. The insertion amino acid sequence variants are those in which one or more amino acid residues are introduced at a predetermined site in the protein although the random insertion is also possible with the appropriate selection of resulting product. Deletional variants are characterized by the extraction of one or more amino acids from the sequence. The substitutional amino acid variants are those in which a residue in the sequence has been extracted and a different residue It is inserted in its place. "Equivalents" can act as a Functional analogue of the subject antigen. The chemical equivalents do not they may necessarily be derived from the subject antigen but they can Share certain adaptive similarities. Alternatively, chemical equivalents can be designed to minimize certain Physicochemical properties of the antigen in question. The equivalents can be chemically synthesized or can be detected after, for example, the selection of the natural product. The counterparts contemplated here include, but are not limited to, molecules derived from different species.

La presente invención también se extiende a un complejo inmunogénico como se describe anteriormente en donde el antígeno cargado es un fragmento de una proteína de HCV. Por "fragmento" se entiende un polipéptido que consiste de solo una parte de la secuencia de proteína y estructura intacta de longitud completa. El fragmento puede incluir una deleción C-terminal y/o una deleción N-terminal del polipéptido nativo. Un "fragmento inmunogénico" de una proteína de HCV particular generalmente incluirá al menos aproximadamente 5-10 residuos de aminoácido continuos de la molécula de longitud completa, preferiblemente al menos aproximadamente 15-25 residuos de aminoácido continuos de la molécula de longitud completa, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20-50 o más residuos continuos de aminoácido de la molécula de longitud completa, que define un epitope, o cualquier número entero entre 5 aminoácidos y la secuencia de longitud completa, a condición que el fragmento en cuestión retiene la capacidad de producir una respuesta inmune como se define a continuación. Por ejemplo, los fragmentos inmunogénicos preferidos, incluyen pero no se limitan a fragmentos de la proteína del núcleo del HCV que comprende, por ejemplo, los aminoácidos 10-45, 10-53, 67-88, 81-130, 86-100, 120-130, 121-135 y 121-170 de la poliproteína, numerados en relación con la secuencia del HCV-1a presentada en Choo et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2451, así como se definen los epitopes derivados de la región c33c de la poliproteína del HCV, lo mismo que cualquiera de los otros epitopes identificados de las regiones del HCV core, E1, E2, NS3 y NS4. Ver, por ejemplo, Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al. International Publ. No. WO 93/00365; Chien, D.Y. International Publ. No. WO 94/01778; la autorizada Aplicación de la Patente U.S. Serie Nos. 08/403,590 and 08/444,818.The present invention also extends to an immunogenic complex as described above wherein the charged antigen is a fragment of an HCV protein. By "fragment" is meant a polypeptide consisting of only a part of the intact full length protein sequence and structure. The fragment may include a C-terminal deletion and / or an N-terminal deletion of the native polypeptide. An "immunogenic fragment" of a particular HCV protein will generally include at least about 5-10 continuous amino acid residues of the full length molecule, preferably at least about 15-25 continuous amino acid residues of the full length molecule, and more preferably at least about 20-50 or more continuous amino acid residues of the full length molecule, which defines an epitope, or any integer between 5 amino acids and the full length sequence, provided that the fragment in question retains the ability to produce an immune response as defined below. For example, preferred immunogenic fragments, include but are not limited to HCV core protein fragments comprising, for example, amino acids 10-45, 10-53, 67-88, 81-130, 86-100, 120-130, 121-135 and 121-170 of the polyprotein, numbered in relation to the HCV-1a sequence presented in Choo et al . (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 2451, as well as epitopes derived from the c33c region of the HCV polyprotein are defined, as well as any of the other epitopes identified from the HCV core, E1, E2, NS3 regions and NS4. See, for example, Chien et al . Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al . J. Gastroent. Hepatol (1993) 8: S33-39; Chien et al . International Publ. No. WO 93/00365; Chien, DY International Publ. No. WO 94/01778; the authorized US Patent Application Series Nos. 08 / 403,590 and 08 / 444,818.

El término "epitope" como se utiliza aquí se refiere a una secuencia de al menos aproximadamente 3 a 5, preferiblemente aproximadamente 5 a 10 o 15, y no más de aproximadamente 1,000 aminoácidos (o cualquier número entero entre estos), que define una secuencia que por sí misma o como parte de una secuencia más grande, estimulará un sistema inmune del huésped para generar una respuesta inmune específica del antígeno celular cuando el antígeno se presenta, o una respuesta de anticuerpo humoral. Un epitope para su uso en el sujeto de la invención no se limita a un polipéptido que tiene la secuencia exacta de la porción de la proteína patrón a partir del cual se deriva. Ciertamente, los genomas virales están en un estado de flujo constante y contienen varios dominios variables que muestran grados relativamente altos de variabilidad entre aislados. Por lo tanto el término "epitope" abarca las secuencias idénticas a la secuencia nativa, lo mismo que las modificaciones a la secuencia nativa, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservadoras en la naturaleza).The term "epitope" as used here refers to a sequence of at least about 3 to 5, preferably about 5 to 10 or 15, and not more than approximately 1,000 amino acids (or any integer between these), which defines a sequence that by itself or as part of a larger sequence, will stimulate a host immune system to generate a specific immune response of the cellular antigen when the antigen is present, or an antibody response humoral An epitope for use in the subject of the invention is not limits a polypeptide that has the exact sequence of the portion of the standard protein from which it is derived. Certainly the viral genomes are in a constant flow state and contain several variable domains that show relatively high degrees of variability between isolates. Therefore the term "epitope" encompasses sequences identical to the sequence native, as well as modifications to the native sequence, such as deletions, additions and substitutions (generally conservative in nature).

Las regiones de un polipéptido dado que incluyen un epitope, se pueden identificar utilizando cualquier número de técnicas de mapeo de epitopes, bien conocidas en el oficio. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Human Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, los epitopes lineales se pueden determinar por ejemplo, al sintetizar al mismo tiempo una gran cantidad de péptidos en soportes sólidos, los péptidos correspondientes a las porciones de la molécula de la proteína, y hacer reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras que los péptidos están todavía unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en el oficio y se describen en, por ejemplo, Patente U.S. No. 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715, todas se incorporan aquí por referencia en su integridad. De manera similar, Los epitopes conformacionales se identifican fácilmente, determinando la conformación espacial de los aminoácidos tal como por, por ejemplo, cristalografía de rayos-X y resonancia magnética nuclear en 2-dimensiones. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Las regiones antigénicas de las proteínas también se pueden identificar utilizando antigenicidad estándar y perfiles de hidropatía, tal como aquellos calculados utilizando, por ejemplo, el programa software Omiga versión 1.0 disponible de Oxford Molecular Group. Este programa de ordenador emplea el método Hopp/Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828 para determinar los perfiles de antigenicidad, y la técnica Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 para perfiles de hidropatía.Regions of a given polypeptide that include an epitope can be identified using any number of epitope mapping techniques, well known in the art. See, for example, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Human Press, Totowa, New Jersey. For example, linear epitopes can be determined for example, by synthesizing at the same time a large number of peptides on solid supports, the peptides corresponding to the portions of the protein molecule, and reacting the peptides with antibodies while the peptides They are still attached to the brackets. Such techniques are known in the art and are described in, for example, US Patent No. 4,708,871; Geysen et al . (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al . (1986) Molec. Immunol 23: 709-715, all are incorporated herein by reference in their entirety. Similarly, conformational epitopes are easily identified, determining the spatial conformation of amino acids such as, for example, X-ray crystallography and 2-dimensional nuclear magnetic resonance. See, for example, Epitope Mapping Protocols , supra . Antigenic regions of proteins can also be identified using standard antigenicity and hydropathy profiles, such as those calculated using, for example, the Omiga version 1.0 software program available from Oxford Molecular Group. This computer program employs the Hopp / Woods method, Hopp et al ., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78: 3824-3828 to determine antigenicity profiles, and the Kyte-Doolittle technique, Kyte et al ., J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132 for hydropathy profiles.

Según se utiliza aquí, el término "epitope conformacional" se refiere a una porción de una proteína de longitud completa, o un análogo o muteina de esta, que tiene características estructurales nativas a la secuencia de aminoácido que codifica el epitope dentro de la proteína natural de longitud completa. Las características estructurales naturales incluyen, pero no se limitan a, glicosilación y la estructura tri-dimensional. Preferiblemente, un epitope conformacional se produce recombinantemente y se expresa en una célula a partir de la cual se extrae bajo condiciones que conserven sus deseadas características estructurales, por ejemplo sin desnaturalización del epitope. Tales células incluyen células de bacterias, de levadura, insecto, y de mamífero. La expresión y aislamiento de los epitopes conformacionales recombinantes a partir de la poliproteína del HCV se describen en por ejemplo, Publicación Internacional Nos. WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734, cuyas aplicaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad.As used here, the term "epitope conformational "refers to a portion of a protein from full length, or an analogue or mutein thereof, which has structural characteristics native to the amino acid sequence which encodes the epitope within the natural protein of length complete. Natural structural features include, but they are not limited to glycosylation and structure three-dimensional Preferably, an epitope conformational occurs recombinantly and is expressed in a cell from which it is extracted under conditions that retain its desired structural characteristics, for example without denaturation of the epitope. Such cells include cells from Bacteria, yeast, insect, and mammal. The expression and isolation of recombinant conformational epitopes from of HCV polyprotein are described in for example, Publication International Nos. WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734, whose applications are incorporated here by reference in its totality

Según se utiliza aquí el término "epitope de la célula-T" se refiere a una característica de una estructura peptídica que es capaz de inducir la inmunidad de la célula-T hacia la estructura peptídica o un asociado hapteno. Los epitopes de la célula-T generalmente comprenden péptidos lineales determinantes que asumen las conformaciones extendidas dentro de la fisura del enlace del péptido de las moléculas de MHC, (Unanue et al., Science (1987) 236:551-557). La conversión de los polipéptidos a péptidos lineales determinantes asociados de MHC clase II (generalmente entre 5 - 14 aminoácidos de longitud) se denomina "elaboración del antígeno" que se realiza por las células que presentan antígenos (APCs). Más particularmente, un epitope de la célula-T se define por características locales de una estructura peptídica pequeña, tales como propiedades de secuencia de aminoácido primarias que involucran carga e hidrofobicidad, y ciertos tipos de estructuras secundarias, como helicidad, que no dependen del plegado del polipéptido total. Adicionalmente, se cree que los péptidos pequeños capaces de reconocer mediante la ayuda de las células -T generalmente son estructuras anfipáticas que comprenden un lado hidrófobo (para la interacción con la molécula de MHC) y un lado hidrofílico (para la interacción con el receptor de la célula-T), (Margalit et al., Computer Prediction of T-cell Epitopes, New Generation Vaccines Marcel-Dekker, Inc, ed. G.C. Woodrow et al., (1990) pp. 109-116) y adicionalmente que las estructuras anfipáticas tienen una configuración \alpha-helicoidal (ver, por ejemplo, Spouge et al. J. Immunol. (1987) 138: 204-212; Berkower et al. J. Immunol. (1986) 136:2498-2503).As used herein, the term "T-cell epitope" refers to a characteristic of a peptide structure that is capable of inducing T-cell immunity towards the peptide structure or a hapten partner. T-cell epitopes generally comprise determining linear peptides that assume extended conformations within the peptide bond fissure of MHC molecules, (Unanue et al ., Science (1987) 236: 551-557). The conversion of polypeptides to associated MHC class II linear determining peptides (generally between 5-14 amino acids in length) is called "antigen elaboration" which is performed by antigen presenting cells (APCs). More particularly, a T-cell epitope is defined by local characteristics of a small peptide structure, such as primary amino acid sequence properties that involve loading and hydrophobicity, and certain types of secondary structures, such as helicity, that do not depend on folding. of the total polypeptide. Additionally, it is believed that small peptides capable of recognizing by means of T-cells are generally amphipathic structures comprising a hydrophobic side (for interaction with the MHC molecule) and a hydrophilic side (for interaction with the receptor of T-cell), (Margalit et al ., Computer Prediction of T-cell Epitopes, New Generation Vaccines Marcel-Dekker, Inc, ed. GC Woodrow et al ., (1990) pp. 109-116) and additionally that amphipathic structures have an α-helical configuration (see, for example, Spouge et al . J. Immunol. (1987) 138: 204-212; Berkower et al . J. Immunol. (1986) 136: 2498-2503).

Por consiguiente, los segmentos de las proteínas que incluyen el epitope de la células-T se pueden predecir fácilmente utilizando numerosos programas de ordenador. (Ver por ejemplo, Margalit et al., Computer Prediction of T-cell Epitopes, New Generation Vaccines Marcel-Dekker, Inc, ed. G.C. Woodrow et al., (1990) pp. 109-116). Tales programas generalmente comparan la secuencia de aminoácido de un péptido con las secuencias conocidas para inducir una respuesta de célula-T, y búsqueda para patrones de aminoácidos que se cree que se requieren para un epitope de la célula-T.Accordingly, segments of the proteins that include the T-cell epitope can be easily predicted using numerous computer programs. (See for example, Margalit et al ., Computer Prediction of T-cell Epitopes, New Generation Vaccines Marcel-Dekker, Inc, ed. GC Woodrow et al ., (1990) pp. 109-116). Such programs generally compare the amino acid sequence of a peptide with the known sequences to induce a T-cell response, and search for amino acid patterns that are believed to be required for a T-cell epitope.

En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta nucleótido-a-nucleótido o aminoácido-a-aminoácido de dos secuencias de polinucleótidos o polipéptido, respectivamente. El porcentaje de identidad se puede determinar por una comparación directa de la información de la secuencia entre dos moléculas por alineación de las secuencias, el conteo del número exacto de equivalencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta, y multiplicando el resultado por 100. Los programas de ordenador disponibles, fácilmente se pueden utilizar para ayudar en el análisis, tal como ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, which adapts the local homology algorithm of Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 para el análisis de péptidos. Los programas para determinar la identidad del nucleótido de la secuencia son disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también dependen del Smith y Waterman algoritmo. Estos programas fácilmente se utilizan con los parámetros de defecto recomendado por el fabricante y se describen en el Wisconsin Sequence Analysis Package referido anteriormente. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótido particular con una secuencia referencia se puede determinar utilizando la homología del algoritmo de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización por hueco de seis posiciones de nucleótido.In general, "identity" refers to a exact correspondence nucleotide-to-nucleotide or amino acid-to-amino acid of two polynucleotide or polypeptide sequences, respectively. He identity percentage can be determined by a comparison direct sequence information between two molecules per sequence alignment, the exact number count of equivalences between the two aligned sequences, dividing by the length of the shortest sequence, and multiplying the result per 100. The available computer programs, easily they can use to help in the analysis, such as ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3: 353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, which adapts the local homology algorithm of Smith and Waterman Advances in Appl. Math 2: 482-489, 1981 for peptide analysis. The programs to determine the nucleotide identity of the sequence are available in the Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (available from Genetics Computer Group, Madison, WI) for example, the BESTFIT, FASTA and GAP programs, which also They depend on the Smith and Waterman algorithm. These programs easily are used with the default parameters recommended by the manufacturer and are described in the Wisconsin Sequence Analysis Package referred to above. For example, the percent identity of a particular nucleotide sequence with a reference sequence can be determined using the homology of the Smith algorithm and Waterman with a default score table and a six hole nucleotide hole penalty.

Otro método para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es utilizar el paquete MPSRCH de programas derechos de autor por la University of Edinburgh, desarrollado por John F. Collins and Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). De este juego de paquetes el algoritmo de Smith-Waterman se puede emplear cuando los parámetros por defecto se utilizan para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalización de hueco abierto de 12, penalización de extensión de hueco de uno, y un hueco de seis). A partir de los datos generados el valor "Equivalente" refleja la "identidad de la secuencia." Otros programas apropiados para calcular el porcentaje de identidad o similaridad entre las secuencias generalmente son conocidos en el oficio, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, utilizado con parámetros de defecto. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP se pueden utilizar utilizando los siguientes parámetros de defecto: código genético = estándar; filtro = ninguno; cadena = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; ordenar por = ALTO PUNTAJE; Base de datos = no-repetitivo, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss proteína + Spupdate + PIR. Detalles de estos programas se pueden dar en la siguiente dirección de internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-binBLAST.Another method to set the percentage of identity in the context of the present invention is to use the MPSRCH package of copyright programs by the University of Edinburgh, developed by John F. Collins and Shane S. Sturrok, and distributed by IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Of this packet game the Smith-Waterman algorithm is can be used when the default parameters are used for scoring table (for example, open pit penalty of 12, penalty of extension of one hole, and one hole of six). From the generated data the "Equivalent" value reflects the "sequence identity." Other appropriate programs to calculate the percentage of identity or similarity between sequences are generally known in the trade, for example, another alignment program is BLAST, used with parameters of default. For example, BLASTN and BLASTP can be used using the following defect parameters: genetic code = standard; filter = none; string = both; cut = 60; expected = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Database = non-repetitive, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Details of these programs can be given in the following internet address: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-binBLAST.

Las secuencias para estos polipéptidos y proteínas se conocen (ver, por ejemplo, Patente U.S. No. 5,350,671). Por ejemplo, un número de polipéptidos inmunogénicos generales y específicos, derivados de la poliproteína del HCV, ha sido descrito. Ver, por ejemplo, Houghton et al., European Publ. Nos. 318,216 and 388,232; Choo et al. Science (1989) 244: 359-362; Kuo et al. Science (1989) 244:362-364; Houghton et al. Hepatology (1991) 14:381-388; Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., International Publ. No. WO 93/00365; Chien, D.Y., International Publ. No. WO 94/01778. Estas publicaciones proporcionan un fondo de gran alcance en HCV generalmente, lo mismo que en la fabricación y usos de reactivos inmunológicos del polipéptido de HCV.The sequences for these polypeptides and proteins are known (see, for example, US Patent No. 5,350,671). For example, a number of general and specific immunogenic polypeptides, derived from HCV polyprotein, have been described. See, for example, Houghton et al ., European Publ. Nos. 318,216 and 388,232; Choo et al . Science (1989) 244: 359-362; Kuo et al . Science (1989) 244: 362-364; Houghton et al . Hepatology (1991) 14: 381-388; Chien et al . Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al . J. Gastroent. Hepatol (1993) 8: S33-39; Chien et al ., International Publ. No. WO 93/00365; Chien, DY, International Publ. No. WO 94/01778. These publications provide a powerful background in HCV generally, as well as in the manufacture and uses of HCV polypeptide immunological reagents.

Cabe señalar, que para mayor comodidad, las diferentes regiones de HCV generalmente se definen con respecto al número de aminoácidos relativo a la poliproteína codificada por el genoma de HCV-1a, como se describe en Choo et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2451, con el iniciador metionina que se designa en la posición 1. Sin embargo, los polipéptidos para su uso con la presente invención no se limitan a aquellos derivados de la secuencia de HCV-1a. En este sentido, las regiones correspondientes en otro aislado de HCV, se pueden determinar fácilmente por secuencias de alineación a partir de los dos aislados de una manera que llevan las secuencias en una alineación máxima.It should be noted that, for convenience, the different regions of HCV are generally defined with respect to the number of amino acids relative to the polyprotein encoded by the HCV-1a genome, as described in Choo et al . (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 2451, with the methionine initiator which is designated in position 1. However, the polypeptides for use with the present invention are not limited to those derived from the HCV-1a sequence. In this sense, the corresponding regions in another HCV isolate can easily be determined by alignment sequences from the two isolates in a manner that takes the sequences into maximum alignment.

Por ejemplo, los polipéptidos del HCV derivados de la región Core, tal como los polipéptidos derivados de la región encontrados entre los aminoácidos 1-191; aminoácidos 10-53; aminoácidos 10-45; aminoácidos 67-88; aminoácidos 86-100; 81-130; aminoácidos 121-135; aminoácidos 120-130; aminoácidos 121-170; y cualquiera de los epitopes Core identificados en, por ejemplo, Houghton et al., Patente U.S. No. 5,350,671; Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., International Publ. No. WO 93/00365; Chien, D.Y., international Publ. No. WO 94/01778; y la autorizada Aplicación de la Patente U.S. Serie Nos. 08/403,590 y 08/444,818 encuentra su uso en los complejos inmunogénicos de la presente invención.For example, HCV polypeptides derived from the Core region, such as polypeptides derived from the region found between amino acids 1-191; amino acids 10-53; amino acids 10-45; amino acids 67-88; amino acids 86-100; 81-130; amino acids 121-135; amino acids 120-130; amino acids 121-170; and any of the Core epitopes identified in, for example, Houghton et al ., US Patent No. 5,350,671; Chien et al . Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al . J. Gastroent. Hepatol (1993) 8: S33-39; Chien et al ., International Publ. No. WO 93/00365; Chien, DY, international Publ. No. WO 94/01778; and the authorized Application of US Patent No. Nos. 08 / 403,590 and 08 / 444,818 finds its use in the immunogenic complexes of the present invention.

Los polipéptidos del HCV derivados de la membrana del HCV, incluyendo los polipéptidos derivados de las regiones E1 y E2, lo mismo que las fusiones entre E1 y E2 también encontrarán su uso aquí. Particularmente, las glicoproteínas de membrana del HCV E1 y E2 forman un complejo estable que es co-inmunoprecipitable (Grakoui et al. (1993) J. Virol. 67:1385-1395; Lanford et al. (1993) Virology 197:225-235; Ralston et al. (1993) J. Virol. 67:6753-6761). Se ha demostrado que las glicoproteínas del HCV E1 y E2 son protectoras en estudios en primates. (Choo et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1294-1298). La región E1 madura de HCV1 comienza aproximadamente en el aminoácido 192 de la poliproteína y continúa aproximadamente en el aminoácido 383. La región E2 madura del HCV1 comienza aproximadamente en el aminoácido 384-385 y se extiende hasta aproximadamente el residuo del aminoácido 746 (ver, Lin et al. J. virol. (1994) 68:5063-5073).HCV polypeptides derived from the HCV membrane, including polypeptides derived from regions E1 and E2, as well as fusions between E1 and E2 will also find their use here. Particularly, the membrane glycoproteins of HCV E1 and E2 form a stable complex that is co-immunoprecipitable (Grakoui et al . (1993) J. Virol. 67: 1385-1395; Lanford et al . (1993) Virology 197: 225- 235; Ralston et al . (1993) J. Virol. 67: 6753-6761). It has been shown that HCV glycoproteins E1 and E2 are protective in studies in primates. (Choo et al . (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1294-1298). The mature E1 region of HCV1 begins approximately at amino acid 192 of the polyprotein and continues approximately at amino acid 383. The mature E2 region of HCV1 begins approximately at amino acid 384-385 and extends to approximately amino acid residue 746 (see, Lin et al . J. virol. (1994) 68: 5063-5073).

Adicionalmente, los polipéptidos derivados de las regiones no-estructurales del virus también encontrarán su uso aquí. La región NS3/4a de la poliproteína del HCV ha sido descrita y la secuencia de aminoácido y la estructura completa de la proteína se revelan en Yao et al. Structure (November 1999) 7:1353-1363. Ver, también, Dasmahapatra et al., Patente U.S. No. 5,843,752. Como se explica anteriormente, tanto la secuencia nativa como los análogos inmunogénicos se pueden utilizar en las formulaciones en cuestión. Dasmahapatra et al., Patente U.S. No. 5,843,752 y Zhang et al., Patente U.S. No. 5,990,276, ambas describen los análogos de NS3/4a y los métodos para elaborarlos.Additionally, polypeptides derived from the non-structural regions of the virus will also find their use here. The NS3 / 4a region of the HCV polyprotein has been described and the amino acid sequence and complete structure of the protein are disclosed in Yao et al . Structure (November 1999) 7: 1353-1363. See, also, Dasmahapatra et al ., US Patent No. 5,843,752. As explained above, both the native sequence and the immunogenic analogs can be used in the formulations in question. Dasmahapatra et al ., US Patent No. 5,843,752 and Zhang et al ., US Patent No. 5,990,276, both describe the analogs of NS3 / 4a and the methods for making them.

Adicionalmente, los antígenos de fusión del epitope múltiples (denominados "MEFAs"), como se describe en International Publ. No. WO 97144469, se pueden asociar con los complejos inmunogénicos. Dichos MEFAs incluyen epitopes múltiples derivados de dos o más de las diversas regiones virales. Los epitopes son preferiblemente a partir de más de una cepa del HCV, de esta manera proporciona la capacidad adicional de proteger contra varias cepas del HCV en una sola vacuna.Additionally, the fusion antigens of multiple epitope (called "MEFAs"), as described in International Publ. No. WO 97144469, can be associated with immunogenic complexes. Such MEFAs include multiple epitopes derived from two or more of the various viral regions. The Epitopes are preferably from more than one strain of HCV, in this way it provides the additional ability to protect against several strains of HCV in a single vaccine.

Adicionalmente, los polipéptidos para su uso en los complejos inmunogénicos de esta invención se pueden derivar de la región NS3 de la poliproteína del HCV. Un número de dichos polipéptidos se conoce, incluyendo, pero no limitando a los polipéptidos derivados de las regiones c33c y c100, lo mismo que las proteínas de fusión que comprenden un epitope NS3, tal como c25. Estos y otros polipéptidos NS3 son útiles en las presentes composiciones y se conocen en el oficio y se describen en, por ejemplo, Houghton et al, Patente U.S. No. 5,350,671; Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., International Publ. No. WO 93/00365; Chien, D.Y., International Publ. No. WO 94/01778; y la autorizada Aplicación de la Patente U.S. Serie Nos. 08/403,590 y 08/444,818.Additionally, the polypeptides for use in the immunogenic complexes of this invention can be derived from the NS3 region of the HCV polyprotein. A number of such polypeptides is known, including, but not limited to polypeptides derived from the c33c and c100 regions, the same as fusion proteins comprising an NS3 epitope, such as c25. These and other NS3 polypeptides are useful in the present compositions and are known in the art and are described in, for example, Houghton et al , US Patent No. 5,350,671; Chien et al . Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al . J. Gastroent. Hepatol (1993) 8: S33-39; Chien et al ., International Publ. No. WO 93/00365; Chien, DY, International Publ. No. WO 94/01778; and the authorized US Patent Application Series Nos. 08 / 403,590 and 08 / 444,818.

Es evidente que una multitud de polipéptidos del HCV se puede utilizar en las formulaciones del complejo inmunogénico o se pueden co-administrar con estas, con el fin de proporcionar una respuesta inmune celular contra el antígeno del HCV en cuestión.It is evident that a multitude of polypeptides of the HCV can be used in immunogenic complex formulations  or can be co-administered with these, in order of providing a cellular immune response against the antigen of HCV in question.

La presente invención adicionalmente se extiende con un complejo inmunogénico como se describe anteriormente en donde, la proteína cargada es una proteína de fusión que comprende el núcleo u otra proteína del HCV o un fragmento de esta. La referencia a una "proteína de fusión" debe entenderse como una referencia a una fusión en la cual el núcleo del HCV u otra proteína o fragmento se liga operativamente a otro péptido, polipéptido o proteína. El término "ligado operativamente" se entiende para indicar que el núcleo del HCV u otra proteína o fragmento y el otro péptido, polipéptido o proteína se funden en marco a cada uno, ya sea directa o indirectamente a través de un péptido o polipéptido conector, con la fusión ya sea esta en el final N-terminal o en el final C-terminal del núcleo del HCV u otra proteína o fragmento.The present invention further extends with an immunogenic complex as described above in where, the loaded protein is a fusion protein that comprises the nucleus or other HCV protein or a fragment thereof. The reference to a "fusion protein" should be understood as a reference to a merger in which the core of HCV or other protein or fragment is operably linked to another peptide, polypeptide or protein. The term "operably linked" is understood to indicate that the core of HCV or another protein or fragment and the other peptide, polypeptide or protein merge into frame to each one, either directly or indirectly through a peptide or polypeptide linker, with fusion either in the N-terminal end or end C-terminal of the HCV core or other protein or fragment.

La proteína de fusión puede comprender una proteína tag o fracción del péptido tal como una fracción hexa-his (His)6, fracción glutatión-S-transferasa (GST) o una fracción FLAG.The fusion protein may comprise a tag protein or peptide fraction such as a fraction hexa-his (His) 6, fraction glutathione-S-transferase (GST) or a FLAG fraction.

Preferiblemente, sin embargo, la proteína de fusión comprende un segundo péptido, polipéptido o proteína activo inmunogénicamente, el cual se puede derivar del HCV, o algún otro organismo viral, bacteriano, fúngico o similar.Preferably, however, the protein of fusion comprises a second peptide, polypeptide or active protein immunogenically, which can be derived from HCV, or some other viral, bacterial, fungal or similar organism.

El conector péptido o polipéptido, cuando se presenta en la proteína de fusión, puede comprender una secuencia a partir de 1 a 50, preferiblemente 1 a 20, y más preferiblemente 1 a 5 residuos de aminoácido.The peptide or polypeptide linker, when presented in the fusion protein, may comprise a sequence to from 1 to 50, preferably 1 to 20, and more preferably 1 to 5 amino acid residues.

La referencia a lo largo de esta especificación al "portador orgánico" debe entenderse como una referencia a cualquier molécula, agregado o complejo de moléculas, compuesto u otra entidad que, cuando un antígeno se asocia con esta, facilita la inducción de una respuesta inmune, y en particular una respuesta de linfocitos-T citotóxicos, con el antígeno. El sujeto portador es "orgánico" y, en este sentido, "orgánico" debe entenderse como un compuesto de carbono si se obtiene de manera natural, recombinante o sintéticamente o si es derivado. En una modalidad preferida particularmente el portador orgánico es un adyuvante. Por "adyuvante" se entiende cualquier molécula, agregado o complejo de moléculas, compuesto u otra entidad, que funciona para estimular, mejorar o por otra parte favorecer la expresión de cualquiera o más aspectos de la respuesta inmune. Por ejemplo, el adyuvante puede inducir la inflamación por consiguiente atrayendo las células de respuesta inmune al sitio de localización del antígeno. De manera alternativa, el adyuvante puede liberar lentamente el antígeno, proporcionando por consiguiente que suceda la estimulación del sistema inmune.The reference throughout this specification the "organic carrier" should be understood as a reference to any molecule, aggregate or complex of molecules, compound or another entity that, when an antigen is associated with it, facilitates the induction of an immune response, and in particular a response of cytotoxic T-lymphocytes, with the antigen. He carrier subject is "organic" and, in this sense, "organic" should be understood as a carbon compound if obtains naturally, recombinantly or synthetically or if it is derivative. In a particularly preferred embodiment the carrier Organic is an adjuvant. "Adjuvant" means any molecule, aggregate or complex of molecules, compound or another entity, which works to stimulate, improve or otherwise favor the expression of any or more aspects of the response immune. For example, the adjuvant can induce inflammation by consequently attracting immune response cells to the site of antigen location. Alternatively, the adjuvant can slowly release the antigen, thereby providing that Immune system stimulation happen.

Ejemplos de portadores orgánicos cargados, los cuales son adyuvantes apropiados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, saponina, complejos de saponina, cualquiera o más componentes del complejo de inmunoestimulación de la saponina, el colesterol y el lípido conocido como ISCOMATRIX^{TM} (por ejemplo el componente de saponina y/o el componente de fosfolípido), liposomas o emulsiones aceite-en-agua. [La composición y preparación del ISCOMATRIX^{TM} se describen con detalle en la Aplicación de la Patente Internacional Número PCT/SE86/00480, patente Australiana Números 558258 y 632067 y Publicación de la Patente Europea No. 0 180 564]. Ejemplos adicionales de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, aquellos detallados en las publicaciones de Cox y Coulter, 1992, 1997 y 1999. Debe entenderse que el portador orgánico en cuestión puede ser de origen natural o se puede derivar sintética o recombinantemente.Examples of loaded organic carriers, the which are appropriate adjuvants for use herein invention include, but are not limited to, saponin, complexes of saponin, any or more components of the complex immunostimulation of saponin, cholesterol and lipid known as ISCOMATRIX ™ (for example the component of saponin and / or the phospholipid component), liposomes or emulsions oil-in-water. [The composition and ISCOMATRIX? preparation are described in detail in the Application of International Patent Number PCT / SE86 / 00480, Australian Patent Numbers 558258 and 632067 and Publication of the European Patent No. 0 180 564]. Additional examples of adjuvants include, but are not limited to, those detailed in the Cox and Coulter publications, 1992, 1997 and 1999. It should be understood that the organic carrier in question may be of natural origin or It can be derived synthetically or recombinantly.

Por consiguiente, la presente invención todavía más preferiblemente proporciona un complejo inmunogénico como se describe anteriormente, en donde el portador orgánico cargado es un adyuvante con carga negativa.Therefore, the present invention still more preferably it provides an immunogenic complex as described above, wherein the charged organic carrier is a adjuvant with negative charge.

Preferiblemente, el citado adyuvante comprende la saponina o un complejo de saponina. Más preferiblemente, dicho complejo de saponina es el ISCOMATRIX^{TM}.Preferably, said adjuvant comprises Saponin or a saponin complex. More preferably, said Saponin complex is the ISCOMATRIX ™.

El portador orgánico de la presente invención también puede ser, en su forma inicial o natural, con carga negativa, cargado positivamente o neutral. El incremento del grado de carga negativa (por ejemplo, cuando el portador orgánico es solo débilmente con carga negativa) o la conversión a neutro o portador orgánico cargado positivamente a un portador orgánico con carga negativa también se puede lograr por cualquier método apropiado conocido por aquellos de habilidad en el oficio. Por ejemplo, cuando el portador orgánico es una emulsión aceite-en-agua, la incorporación de cualquier agente tensoactivo aniónico con un residuo non-polar impartirá una carga negativa completa a la emulsión debido a la inserción del residuo del agente tensoactivo en la gotita de aceite que por consiguiente deja el grupo principal con carga negativa expuesto. La carga negativa de un adyuvante complejo de saponina se puede incrementar, por ejemplo, por la adición de un lípido con carga negativa durante la formación del complejo.The organic carrier of the present invention it can also be, in its initial or natural form, loaded negative, positively charged or neutral. The increase in grade negative charge (for example, when the organic carrier is only weakly with negative charge) or conversion to neutral or carrier positively charged organic to a charged organic carrier negative can also be achieved by any appropriate method known for those of skill in the trade. For example when the organic carrier is an emulsion oil-in-water, the incorporation of any anionic surface active agent with a residue non-polar will impart a full negative charge to the emulsion due to the insertion of the surfactant residue in the oil droplet that consequently leaves the main group With exposed negative charge. The negative charge of an adjuvant saponin complex can be increased, for example, by the addition of a negatively charged lipid during the formation of the complex.

Ejemplos de detergentes que pueden incrementar la carga negativa de un portador incluyen, pero no se limitan a un ácido cólico, ácido deoxicólico, ácido taurocólico y ácido taurodeoxicólico. Ejemplos de lípidos que pueden incrementar la carga negativa de un portador incluyen, pero no se limitan a, fosfolípidos (preferiblemente fosfatidil inositol, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol y ácido fosfatídico y más preferiblemente cardiolipina) y lípidos bacterianos (preferiblemente monofosforil lípido A(MPL) y más preferiblemente difosforil lípido A, tal como OM174 como se describe en Publicación de la Patente Internacional No. WO 95/14026).Examples of detergents that may increase a carrier's negative charge include, but is not limited to a colic acid, deoxycholic acid, taurocolic acid and acid Taurodeoxycholic Examples of lipids that can increase the negative charge of a carrier include, but is not limited to, phospholipids (preferably phosphatidyl inositol, phosphatidyl serine, phosphatidyl glycerol and phosphatidic acid and more preferably cardiolipin) and bacterial lipids (preferably monophosphoryl lipid A (MPL) and more preferably diphosphoryl lipid A, such as OM174 as described in International Patent Publication No. WO 95/14026).

Sin limitar, de ninguna manera la presente invención, los inventores han determinado, que cuando el portador orgánico cargado en cuestión y el antígeno cargado, naturalmente se cargan negativa y positivamente, respectivamente, el objetivo de la invención se puede lograr. Sin embargo, un complejo inmunogénico aún más efectivo se puede lograr, si el naturalmente portador en cuestión orgánico con carga negativa se suministra más con carga negativa (preferiblemente por adición de cardiolipina o difosforil lípido A).Without limiting, in any way this invention, the inventors have determined, that when the carrier organic loaded in question and the loaded antigen naturally negatively and positively charge, respectively, the objective of the invention can be achieved. However, an immunogenic complex still more effective can be achieved, if the naturally bearer in organic issue with negative charge is supplied more with charge negative (preferably by adding cardiolipin or diphosphoryl lipid A).

Por consiguiente, en una modalidad preferida se proporciona un complejo inmunogénico como se describe anteriormente, en donde el adyuvante con carga negativa es un adyuvante con carga negativa natural que ha sido modificado para incrementar el grado de su carga negativa.Therefore, in a preferred embodiment, provides an immunogenic complex as described above,  wherein the adjuvant with a negative charge is an adjuvant with a charge natural negative that has been modified to increase the degree of its negative charge.

La referencia a un adyuvante con carga negativa "naturalmente", debe entenderse como una referencia a la carga que la molécula lleva bajo su creación - Ya sea por medio natural, recombinante o sintético. La modificación para incrementar el grado de carga se puede lograr por cualquier técnica apropiada como se discute anteriormente. Preferiblemente, el adyuvante objeto se hace más negativo vía la adición de la cardiolipina o el difosforil lípido A.The reference to an adjuvant with a negative charge "naturally" should be understood as a reference to the load that the molecule carries under its creation - Whether by natural means, recombinant or synthetic The modification to increase the degree Charging can be achieved by any appropriate technique as discuss above. Preferably, the object adjuvant is made more negative via the addition of cardiolipin or diphosphoryl lipid A.

La presente invención se basa, en parte, en la formación de los complejos inmunogénicos vía la asociación electrostática, preferiblemente, de un portador orgánico con carga negativa con un antígeno cargado positivamente. La administración de dicho complejo a un sujeto facilita la inducción de una respuesta inmune significativamente mejor que se debería lograr fueron el adyuvante y antígeno administrado simultáneamente pero de manera no-asociada. En particular, la administración de un antígeno asociado con un adyuvante, de acuerdo con la presente invención, facilita la inducción de una respuesta del linfocito-T citotóxico con el antígeno. Sin embargo, también se pueden mejorar otras respuestas humorales y celulares.The present invention is based, in part, on the formation of immunogenic complexes via association electrostatically, preferably, of a charged organic carrier negative with a positively charged antigen. The administration from said complex to a subject facilitates the induction of a response significantly better immune that should be achieved were the adjuvant and antigen administered simultaneously but in a manner non-associated In particular, the administration of a antigen associated with an adjuvant, in accordance with the present invention facilitates the induction of a response of Cytotoxic T-lymphocyte with the antigen. But nevertheless, you can also improve other humoral responses and cell phones.

Generalmente, en el complejo inmunogénico de la presente invención, la relación del portador orgánico cargado con el antígeno cargado, en peso, está en el rango de 5:1 a 0.5:1. Preferiblemente, la relación en peso es aproximadamente 3:1 a 1:1, y más preferiblemente la relación en peso es 2:1.Generally, in the immunogenic complex of the present invention, the ratio of the organic carrier loaded with the loaded antigen, by weight, is in the range of 5: 1 to 0.5: 1. Preferably, the weight ratio is about 3: 1 to 1: 1, and more preferably the weight ratio is 2: 1.

Sin limitar la presente invención a cualquier teoría o modo de acción, se piensa que el acomplejante del adyuvante con el antígeno facilita la co-entrega del adyuvante y el antígeno con el mismo antígeno que presenta la célula, lo que facilita la inducción de respuestas inmunes que ya sea podrían no ocurrir como podrían no ocurrir como efectivamente fueron estas moléculas no co-entregadas. Por ejemplo, la inducción de algunas respuestas del linfocito-T citotóxico CD8+ se opina que ocurren cuando el adyuvante induce el escape endosomal del antígeno en la célula que presenta el antígeno. Esto necesariamente requiere la co-entrega del antígeno y el adyuvante con la célula que presenta el antígeno.Without limiting the present invention to any theory or mode of action, it is thought that the adjuvant complexer  with the antigen facilitates the co-delivery of adjuvant and the antigen with the same antigen that presents the cell, which facilitates the induction of immune responses that already either they might not happen as they might not happen as effectively These molecules were not co-delivered. By example, the induction of some responses of CD8 + cytotoxic T-lymphocyte is thought to occur when the adjuvant induces the endosomal escape of the antigen in the cell presenting the antigen. This necessarily requires the co-delivery of the antigen and the adjuvant with the cell presenting the antigen.

Un aspecto adicional de la presente invención, por consiguiente se relaciona con el uso de la invención para inducir una respuesta inmune en un mamífero incluyendo, pero no limitando a, una respuesta inmune mediada humoral y/o celular.A further aspect of the present invention, therefore it relates to the use of the invention to induce an immune response in a mammal including, but not limiting to, a humoral and / or cellular mediated immune response.

Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención se relaciona a una composición de vacuna que comprende como el componente activo de un complejo inmunogénico que comprende un portador orgánico cargado y un antígeno cargado, cuyo portador orgánico y antígeno están asociados electrostáticamente, y en donde el antígeno cargado es una poliproteína del Virus de la Hepatitis C (HCV) o un fragmento de este, o una proteína de fusión que comprende dicha poliproteína o un fragmento de esta, junto con uno o más portadores o diluentes farmacéuticamente aceptables.Therefore, another aspect of the present invention relates to a vaccine composition comprising as the active component of an immunogenic complex comprising a charged organic carrier and a charged antigen, whose carrier organic and antigen are electrostatically associated, and where The loaded antigen is a Hepatitis C Virus polyprotein (HCV) or a fragment thereof, or a fusion protein that comprises said polyprotein or a fragment thereof, together with one or more pharmaceutically acceptable carriers or diluents.

Preferiblemente, dicho portador orgánico es un adyuvante, y aún más preferiblemente una saponina o un complejo de saponina. Preferiblemente dicho complejo de saponina es el ISCOMATRIX^{TM}.Preferably, said organic carrier is a adjuvant, and even more preferably a saponin or a complex of saponin Preferably said saponin complex is the ISCOMATRIX ™.

Preferiblemente dicho portador orgánico es con carga negativa.Preferably said organic carrier is with negative charge

Las composiciones de vacuna de acuerdo con este aspecto de la invención puede ser ya sea profiláctico (i.e. utilizado para prevenir la infección) o terpéutico (i.e. utilizado para tratar la enfermedad después de la infección). Las composiciones de vacunas convencionalmente se administran vía parenteral, por ejemplo por inyección, ya sea vía subcutánea, intramuscular, o transdérmica/transcutánea. Las formulaciones apropiadas adicionales para otros modos de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios, y aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Las composiciones de vacunas se pueden administrar en conjunto con otros agentes inmunoreguladores.The vaccine compositions according to this aspect of the invention can be either prophylactic (i.e. used to prevent infection) or therapeutic (i.e. used to treat the disease after infection). The vaccine compositions are conventionally administered via parenteral, for example by injection, either subcutaneously, intramuscular, or transdermal / transcutaneous. Formulations Additional appropriate for other modes of administration include oral and pulmonary formulations, suppositories, and applications transdermal Dosage treatment can be a program single dose or a multiple dose schedule. The compositions of vaccines can be given together with other agents immunoregulators

Estas composiciones de vacunas comprenden un complejo inmunogénico de la presente invención en combinación con uno o más portadores o diluentes farmacéuticamente aceptables, dichos portadores incluyen cualquier portador que no induce por sí mismo la producción de una respuesta adversa al individuo que recibe la composición. Los portadores apropiados son usualmente grandes macromoléculas, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, lípidos agregados (tales como gotitas de aceite o liposomas), y partículas de virus inactivos. Tales portadores son bien conocidos por aquellos de ordinaria habilidad en el oficio. Adicionalmente, estos portadores pueden funcionar como agentes o adyuvantes inmunoestabilizantes en adición con el efecto adyuvante del complejo inmunogénico por sí mismo. Adicionalmente, el antígeno se puede conjugar con un toxoide bacteriano, tal como un toxoide diftérico, tetánico, cólera, H. pylori y agentes patógenos.These vaccine compositions comprise an immunogenic complex of the present invention in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers or diluents, said carriers include any carrier that does not in itself induce the production of an adverse response to the individual receiving the composition. Suitable carriers are usually large macromolecules, slowly metabolized such as proteins, polysaccharides, polylactic acids, polyglycolic acids, polymeric amino acids, amino acid copolymers, added lipids (such as oil droplets or liposomes), and inactive virus particles. Such bearers are well known to those of ordinary skill in the trade. Additionally, these carriers can function as immunostabilizing agents or adjuvants in addition to the adjuvant effect of the immunogenic complex itself. Additionally, the antigen can be conjugated with a bacterial toxoid, such as a diphtheria, tetanus, cholera, H. pylori toxoid and pathogens agents.

Las composiciones de vacunas también pueden incluir adicionalmente adyuvantes para mejorar la efectividad de la composición. Adyuvantes apropiados incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc; (2) formulaciones de emulsión aceite-en-agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como muramil péptidos (ver a continuación) o componentes de la pared celular bacteriana), como por ejemplo (a) MF59 (PCT Publ. No. WO 90/14837), que contiene 5% de Escualeno, 0.5% de Tween 80, y 0.5% de Span 85 (opcionalmente que contiene varias cantidades de MTP-PE (ver a continuación), aunque no se requiere) formulada en partículas de submicrones, (b) SAF, que contiene 10% de Escualeno, 0.4% de Tween 80,5% de polímero pluronico-bloqueado, y thr-MDP (ver a continuación) ya sea microfluidizadas en una emulsión de submicrones o agitada en un vórtex para generar una emulsión con tamaño de partículas grande, y (c) sistema de adyuvante Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene 2% de Escualeno, 0.2% Tween 80, y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste de monofosforil lípido A (MPL), trehalosa dimicolato (TDM), y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL+CWS (Detox^{TM}); (3) adyuvantes de saponina, tales como Stimulon^{TM} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA); (4) Adyuvante de Freund Completo (CFA) y Adyuvante de Freund Incompleto (IFA); (5) citoquinas, tales como interleuquinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc), interferones (por ejemplo gamma Interferon), factor estimulante de la colonia de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; (6) mutantes desintoxicados de una toxina ADP-ribosilación bacteriana tal como una toxina del cólera (CT), una toxina de Tos ferina (PT), o una toxina lábil al calor de E. coli (LT), particularmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129; ver, por ejemplo WO 93/13302 y WO 92/19265; (7) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la efectividad de la composición; y (8) micropartículas con macromoléculas adsorbentes, como se describe en la Aplicación de la Patente Internacional No. PCT/US99/17308. Se prefieren Alum y MF59.Vaccine compositions may also additionally include adjuvants to improve the effectiveness of the composition. Appropriate adjuvants include, but are not limited to: (1) aluminum salts (alum), such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum sulfate, etc .; (2) oil-in-water emulsion formulations (with or without other specific immunostimulatory agents such as muramyl peptides (see below) or bacterial cell wall components), such as (a) MF59 (PCT Publ. No. WO 90/14837), which contains 5% Squalene, 0.5% Tween 80, and 0.5% Span 85 (optionally containing several amounts of MTP-PE (see below), although not required) formulated in particles of submicrons, (b) SAF, containing 10% Squalene, 0.4% Tween 80.5% pluronic-blocked polymer, and thr-MDP (see below) either microfluidized in a submicron emulsion or vortexed to generate an emulsion with large particle size, and (c) Ribi ™ adjuvant system (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) containing 2% Squalene, 0.2% Tween 80, and one or more Bacterial cell wall components of the group consisting of monophosphoryl lipid A (MPL), trehalose dimicolate (TDM), and sch cell wall eleto (CWS), preferably MPL + CWS (Detox?); (3) saponin adjuvants, such as Stimulon ™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA); (4) Complete Freund's Adjuvant (CFA) and Incomplete Freund's Adjuvant (IFA); (5) cytokines, such as interleukins (for example IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferons (for example gamma Interferon), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), tumor necrosis factor (TNF), etc .; (6) detoxified mutants of a bacterial ADP-ribosylation toxin such as a cholera toxin (CT), a pertussis toxin (PT), or a heat labile toxin of E. coli (LT), particularly LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9 / G129; see, for example WO 93/13302 and WO 92/19265; (7) other substances that act as immunostimulatory agents to improve the effectiveness of the composition; and (8) microparticles with adsorbent macromolecules, as described in International Patent Application No. PCT / US99 / 17308. Alum and MF59 are preferred.

Como se menciona anteriormente, apropiados muramil péptidos incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normauramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-s n-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE),
etc.As mentioned above, suitable muramyl peptides include, but are not limited to, N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), N-acetyl-normauramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (nor -MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2- (1'-2'-dipalmitoyl-s n-glycer-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamine (MTP-PE),
etc.

Las composiciones de vacunas usualmente también contendrán diluentes, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes de humectación o emulsificantes, sustancias reguladoras del pH pueden estar presentes en las composiciones.Vaccine compositions usually also they will contain diluents, such as water, saline, glycerol and ethanol. Additionally, auxiliary substances, such as humidification or emulsifiers, pH regulating substances can be present in the compositions.

Las formas apropiadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles. Deben ser estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y se deben preservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. La prevención de la acción de microorganismos se puede realizar, mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal. En muchos casos, Será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede realizar por el uso en las composiciones de agentes para retrasar la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.The appropriate forms for injectable use include sterile aqueous solutions (when water soluble)  or dispersions and sterile powders for extemporaneous preparation of sterile injectable dispersions or solutions. Must be stable under manufacturing and storage conditions and it they must preserve against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The prevention of the action of microorganisms can be performed, by various agents antibacterials and antifungals, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal. In many cases, It will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride. Prolonged absorption of the compositions injectables can be performed by use in the compositions of agents to delay absorption, for example, monostearate from aluminum and jelly.

Las soluciones inyectables estériles se preparan, mediante la incorporación de los compuestos activos en la cantidad necesaria en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se necesite, seguido por la esterilización con filtro. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diferentes ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios a partir de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y la técnica de liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de la solución estéril-filtrada previamente de este.Sterile injectable solutions are prepare, by incorporating the active compounds in the amount needed in the appropriate solvent with several of the others ingredients listed above, as needed, followed by filter sterilization. Generally, dispersions are prepare by incorporating the different ingredients sterilized assets in a sterile vehicle that contains the medium of basic dispersion and the other necessary ingredients from those listed above. In the case of sterile powders For the preparation of sterile injectable solutions, the methods Preferred preparation are vacuum drying and the technique of lyophilization that produces an active ingredient powder more any additional desired ingredient from the solution previously sterile-filtered from this.

Cuando los ingredientes activos se protegen apropiadamente, se pueden administrar vía oral, por ejemplo, con un diluente inerte o con un portador comestible asimilable, o se pueden adjuntar en cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimir en tabletas, o se incorpora directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con los excipientes y utilizar en la forma de tabletas que se puedan ingerir, tabletas bucales, comprimidos medicinales, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, galletas. Tales composiciones y preparaciones deberían contener al menos 1% en peso del compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, ser variado y convenientemente puede estar entre aproximadamente 5 a aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad del compuesto activo en las indicadas composiciones útiles terapéuticamente, es tal, que una dosificación apropiada se obtendrá. Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo con la presente invención se preparan, de tal manera que una forma por unidad de dosificación oral contiene entre aproximadamente 0.1 \mug y 2000 mg del compuesto activo.When the active ingredients are protected appropriately, they can be administered orally, for example, with a inert diluent or with an assimilable edible carrier, or can be attach in hard or soft cover gelatin capsule, compress into tablets, or incorporated directly with food of the diet For oral therapeutic administration, the compound active can be incorporated with excipients and used in the form of tablets that can be ingested, oral tablets, medicinal tablets, capsules, elixirs, suspensions, syrups, cookies. Such compositions and preparations should contain the minus 1% by weight of the active compound. The percentage of compositions and preparations can, of course, be varied and conveniently it can be between about 5 to approximately 80% of unit weight. The amount of active compound in the indicated useful compositions Therapeutically, it is such that an appropriate dosage is will get. Preferred compositions or preparations according with the present invention they are prepared, such that a form per oral dosage unit contains between approximately 0.1 ? and 2000 mg of the active compound.

Las tabletas, comprimidos medicinales, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener los componentes que se enumeran a continuación, un aglutinante tal como goma, acacia, almidón com o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente desintegrante tal como almidón com, almidón de patata, ácido algínico; un lubricante tal como magnesio estearato; y un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina se puede adicionar o un agente aromatizante tal como hierbabuena, aceite de especie de planta, o aromatizantes de cereza. Cuando la forma de unidad de dosificación es una cápsula, esta puede contener, además de los materiales del tipo mencionado antes, un portador líquido. Otros diversos materiales pueden estar presentes como cubiertas o de otro modo para modificar la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, tabletas, píldoras, o cápsulas se pueden cubrir con goma laca, azúcar o ambas. Un jarabe o elixir pueden contener el compuesto activo, la sacarosa como un agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y aromatizante tal como sabor a cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma de unidad de dosificación debe ser puro farmacéuticamente y sustancialmente no-tóxico en las cantidades empleadas. Además, el o los compuestos activos se pueden incorporar en las preparaciones y formulaciones de liberación
controlada.Tablets, medicinal tablets, pills, capsules and the like may also contain the components listed below, a binder such as gum, acacia, com starch or gelatin; excipients such as dicalcium phosphate; a disintegrating agent such as com starch, potato starch, alginic acid; a lubricant such as magnesium stearate; and a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin can be added or a flavoring agent such as peppermint, plant species oil, or cherry flavoring. When the dosage unit form is a capsule, it may contain, in addition to the materials of the type mentioned above, a liquid carrier. Various other materials may be present as covers or otherwise to modify the physical form of the dosage unit. For example, tablets, pills, or capsules can be covered with shellac, sugar or both. A syrup or elixir may contain the active compound, sucrose as a sweetening agent, methyl and propylparabenos as preservatives, a colorant and flavoring such as cherry or orange flavor. Of course, any material used in the preparation of any form of dosage unit must be pharmaceutically pure and substantially non-toxic in the amounts employed. In addition, the active compound (s) can be incorporated into the preparations and release formulations
controlled.

Sin limitar la operación de la presente invención de ninguna manera, la co-entrega del complejo inmunogénico de la presente invención es particularmente útil para inducir una respuesta inmune y, en particular, una respuesta de linfocitos-T citotóxicos a un antígeno. Dicha respuesta inmune puede ser una respuesta inmune específica (célula T y/o célula B) y/o no-específica.Without limiting the operation of this invention in any way, the co-delivery of Immunogenic complex of the present invention is particularly useful for inducing an immune response and, in particular, a cytotoxic T-lymphocyte response to a antigen. Said immune response may be an immune response. specific (T cell and / or B cell) and / or non-specific

Por consiguiente, aún otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método para producir, inducir o por otra parte facilitar, en un mamífero, una respuesta inmune a un antígeno, dicho método que comprende la administración a dicho mamífero de una cantidad efectiva de un complejo inmunogénico o una composición de vacuna como se describe anteriormente en el texto.Therefore, yet another aspect of the The present invention relates to a method for producing, inducing  or on the other hand facilitate, in a mammal, an immune response to an antigen, said method comprising administration to said mammal of an effective amount of an immunogenic complex or a vaccine composition as described above in the text.

Preferiblemente dicha respuesta inmune comprende una respuesta de linfocitos-T citotóxicos.Preferably said immune response comprises a cytotoxic T-lymphocyte response.

Debe entenderse que la respuesta del linfocito citotóxico en cuestión puede ocurrir ya sea en aislamiento o junto con una respuesta de célula T auxiliar, una respuesta humoral u otra respuesta inmune específica o no-específica.It should be understood that the lymphocyte response Cytotoxic in question can occur either in isolation or together with an auxiliary T cell response, a humoral response or another specific or non-specific immune response.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el uso del complejo inmunogénico de la invención en relación con el tratamiento terpéutico y/o profiláctico de condiciones patológicas. Ejemplos de las condiciones patológicas que se pueden tratar de acuerdo con el método de la presente invención incluyen cualquier condición patológica que resulta de la infección por HVC.A further aspect of the present invention is relates to the use of the immunogenic complex of the invention in relationship with the therapeutic and / or prophylactic treatment of pathological conditions Examples of pathological conditions which can be treated in accordance with the method herein invention include any pathological condition that results from the HCV infection.

Por consiguiente, aún otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método de tratamiento para una condición patológica en un mamífero, dicho método que comprende la administración al indicado mamífero de una cantidad efectiva de un complejo inmunogénico o una composición de vacuna como se describe anteriormente en el texto, en donde la administración de la indicada composición produce, induce o por otra parte facilita una respuesta inmune que inhibe, frena, retrasa o previene el inicio o evolución de la condición patológica.Therefore, yet another aspect of the The present invention relates to a method of treatment for a pathological condition in a mammal, said method comprising administration to the indicated mammal of an effective amount of an immunogenic complex or a vaccine composition as described earlier in the text, where the administration of the indicated composition produces, induces or otherwise facilitates an immune response that inhibits, slows, slows or prevents the onset or evolution of the pathological condition.

La entrega directa de las composiciones generalmente se logra por la inyección, ya sea vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular o se entrega al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar dentro de una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple.Direct delivery of the compositions It is usually achieved by injection, either subcutaneously, intraperitoneal, intravenous or intramuscular or delivered to interstitial space of a tissue. The compositions are also They can be administered within an injury. Other modes of Administration include oral and pulmonary administration, suppositories, and transdermal or transcutaneous applications. He Dosage treatment can be a single dose schedule or a multiple dose program.

Una "cantidad efectiva" significa una cantidad necesaria al menos parcialmente para alcanzar la respuesta inmune deseada, o para retrasar el inicio o inhibir la evolución o detener del todo, el inicio o la evolución de una condición particular que se tratará. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo que se tratará, el grupo taxonómico del individuo que se tratará, la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar los anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración de la situación médica, y otro factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un rango amplio relativamente, que se pueda determinar a través de ensayos de rutina.An "effective amount" means a amount needed at least partially to reach the answer desired immune, or to delay the onset or inhibit the evolution or stop at all, the onset or evolution of a condition particular to be treated. This amount varies depending on the health and physical condition of the individual to be treated, the group taxonomic of the individual to be treated, the capacity of the system immune system to synthesize antibodies, the degree of desired protection, vaccine formulation, assessment of the medical situation, and other relevant factors. It is expected that the amount falls in a relatively wide range, which can be Determine through routine trials.

El término "mamífero" incluye humanos, primates, animales de cría (por ejemplo, caballos, ganado, ovejas, cerdos, burros), animales de ensayos de laboratorio (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, conejillos de Indias), animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos) y animales salvajes cautivos (por ejemplo, canguros, ciervos, zorros). Preferiblemente, el mamífero es un humano o animal de pruebas de laboratorio. Aún más preferiblemente, el mamífero es un humano.The term "mammal" includes humans, primates, livestock (for example, horses, cattle, sheep, pigs, donkeys), laboratory test animals (for example, mice, rats, rabbits, guinea pigs), animals of company (e.g. dogs, cats) and captive wild animals (for example, kangaroos, deer, foxes). Preferably, the Mammalian is a human or animal laboratory test. Even more preferably, the mammal is a human.

El mamífero sometido al tratamiento puede ser humano o un animal en necesidad del tratamiento terpéutico o profiláctico de una condición patológica o una condición patológica potencial.The mammal undergoing treatment can be human or animal in need of therapeutic treatment or prophylactic of a pathological condition or a pathological condition potential.

En aún otro aspecto la presente invención se relaciona con el uso de un complejo inmunogénico o composición de vacuna como se describe anteriormente en el texto en la fabricación de un medicamento para inhibir, detener, retrasar o prevenir el inicio o evolución de una condición patológica.In yet another aspect the present invention is relates to the use of an immunogenic complex or composition of vaccine as described earlier in the text in the manufacture of a medication to inhibit, stop, delay or prevent onset or evolution of a pathological condition.

Aún otro aspecto de la presente invención se relaciona con un agente para su uso en inhibir, detener, retrasar o prevenir el inicio o evolución de una condición patológica. El indicado agente que comprende un complejo inmunogénico o composición de vacuna como se describe anteriormente en el texto.Still another aspect of the present invention is relates to an agent for use in inhibiting, stopping, delaying or prevent the onset or evolution of a pathological condition. He indicated agent comprising an immunogenic complex or vaccine composition as described above in the text.

Adicionalmente, las características de la presente invención se describen más completamente en los siguientes Ejemplos no-limitantes.Additionally, the characteristics of the The present invention is more fully described in the following Non-limiting examples.

La referencia al "ISCOPREP^{TM} 703" debe entenderse como una referencia a una preparación de saponina que comprende de 50-90% en peso de la Fracción A de Quil A y 50% a 10% en peso de la Fracción C de Quil A. Las Fracciones A y C se preparan a partir de la fracción lipofílica de Quil A. Las Fracciones "A" y "C", su método de preparación y el método de preparación ISCOPREP^{TM} 703 se detallan en la Publicación de la Patente Internacional No. WO96/11711.The reference to "ISCOPREP? 703" should understood as a reference to a saponin preparation that It comprises 50-90% by weight of Quil Fraction A A and 50% to 10% by weight of Fraction C of Quil A. Fractions A and C are prepared from the lipophilic fraction of Quil A. Fractions "A" and "C", their method of preparation and the ISCOPREP? 703 preparation method are detailed in the International Patent Publication No. WO96 / 11711.

A continuación están los ejemplos de modalidades específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para solo propósitos ilustrativos, y no tienen la intención de limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera. Aquellos de habilidad en el oficio, apreciarán fácilmente que la invención puede ser practicada en una variedad de modos dados de las enseñanzas de esta divulgación.Below are the examples of modalities specific for carrying out the present invention. The examples they are offered for illustrative purposes only, and do not have the intended to limit the scope of the present invention of any way. Those of skill in the trade will easily appreciate that the invention can be practiced in a variety of ways given the teachings of this disclosure.

Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas), pero algún error experimental y desviación deberían, por supuesto, ser permitidos.Efforts have been made to ensure the accuracy with respect to the numbers used (for example, quantities, temperatures), but some experimental error and Deviation should, of course, be allowed.

Materiales y métodosMaterials and methods Animales Animals

Los macacos Rhesus (Macaca mulatta) se alojaron en Southwest Foundation for Biomedical Research (SFBR, San Antonio, TX). Los estudios se llevaron a cabo bajo NIH Guidelines for Care and Use of Laboratory Animals (National Institute of Health. (1985) Guide for the care and use of laboratory animals. US department of Health and Human services. publication No 82-23. National Institute of Health, Bethesda, MD). La tipificación del complejo de histocompatibilidad principal Clase I de los animales se realizó como se describe en (Urvater et al. (2000) J. Immunol. 164:1386.).Rhesus macaques ( Macaca mulatta ) stayed at the Southwest Foundation for Biomedical Research (SFBR, San Antonio, TX). The studies were conducted under NIH Guidelines for Care and Use of Laboratory Animals (National Institute of Health. (1985) Guide for the care and use of laboratory animals . US department of Health and Human services. Publication No 82-23. National Institute of Health, Bethesda, MD). The typing of the Class I major histocompatibility complex of animals was performed as described in (Urvater et al . (2000) J. Immunol. 164: 1386.).

Los ratones hembras C57BU6 (H-2b) se compraron en Charles River Laboratories y se utilizaron entre 8 y 10 semanas de edad. Los ratones se alojaron en un ambiente libre de patógeno y se manipularon de acuerdo con las directrices internacionales para la experimentación con animales.C57BU6 female mice (H-2b) were purchased from Charles River Laboratories and They were used between 8 and 10 weeks of age. The mice stayed in a pathogen-free environment and were handled according to international guidelines for experimentation with animals.

Inmunógenos y AdyuvantesImmunogens and Adjuvants

La proteína recombinante HCV-1a Core derivada de E. coli de longitud completa (aa: 1-191) fue producida y purificada bajo condiciones de GMP y tiene más del 98% de pureza. La proteína recombinante HCV-1a E1 E2_{809} fue producida en las células CHO. Esta proteína E1E2 modificada contenia aminoácidos 192 a 809. La proteína recombinante NS35Core121 fue producida en células de levadura. El adyuvante LTK63 es un mutante desintoxicado genéticamente de la enterotóxina lábil al calor de Escherichia coli, en el cual la Serina en la posición 63 se reemplaza por una Lisina (Partidos et al. (1999) Immunol. Lett. 67:209.). Las formulaciones Core-ISCOM se prepararon mezclando la proteína del núcleo con un ISCOMATRIX^{TM} preformado (ISCOMs^{TM} vacío) utilizando interacciones iónicas para maximizar la asociación entre el antígeno y el adyuvante. ISCOMATRIX^{TM} se preparó esencialmente por los métodos descritos previamente excepto que se utilizó diafiltración en lugar de la diálisis (Coulter et al. (1998) Vaccine 16:1243). El adyuvante aceite-en-agua MF59 ha sido descrito en (Ott et al. (1995) Pharm. Biotechnol.
6:277).The full-length E. coli- derived HCV-1a recombinant protein (aa: 1-191) was produced and purified under GMP conditions and is more than 98% pure. The recombinant HCV-1a E1 E2809 protein was produced in CHO cells. This modified E1E2 protein contained amino acids 192 to 809. The NS35Core121 recombinant protein was produced in yeast cells. The adjuvant LTK63 is a genetically detoxified mutant of the heat labile enterotoxin of Escherichia coli, in which the Serine at position 63 is replaced by a Lysine (Parties et al . (1999) Immunol. Lett. 67: 209.). Core-ISCOM formulations were prepared by mixing the core protein with a preformed ISCOMATRIX ™ (empty ISCOMs ™) using ionic interactions to maximize the association between the antigen and the adjuvant. ISCOMATRIX ™ was prepared essentially by the methods previously described except that diafiltration was used instead of dialysis (Coulter et al . (1998) Vaccine 16: 1243). The oil-in-water adjuvant MF59 has been described in (Ott et al . (1995) Pharm. Biotechnol.
6: 277).

Análisis de gradiente Sacarosa de Core-I SCOMCore-I Sucrose Gradient Analysis SCOM

Después de la formulación, las preparaciones se purificaron en un gradiente de sacarosa (10 a 50% peso/volumen) y las fracciones analizadas para ISCOMATRIX^{TM} y proteína para determinar la cantidad de asociación. ISCOMATRIX^{TM} se analizó utilizando difenilhexatrieno (DPH) el cual tiene fluorescencia cuando se asocia con un lípido. En resumen, DPH se disolvió a 1 mg/ml en acetona luego se diluyó 1 en 50 en PBS pH 7.2, luego 50 \mul se mezclaron con 50 \mul de cada fracción en una placa de microtitulación. Después de la incubación por 150 minutos a 20-25ºC la placa se leyó en un fluorómetro utilizando excitación 355nm y emisión 460nm. La proteína se detectó utilizando Pierce Coomassie de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, 50 \mul de solución de Coomassie se adicionaron a 50 \mul de cada fracción en una placa de microtitulación. La placa se mezcló y la absorbancia se lee a 595nm.After formulation, the preparations are purified on a sucrose gradient (10 to 50% weight / volume) and the fractions analyzed for ISCOMATRIX? and protein for Determine the amount of association. ISCOMATRIX ™ was analyzed using diphenylhexatriene (DPH) which has fluorescence when associated with a lipid. In summary, DPH dissolved at 1 mg / ml in acetone was then diluted 1 in 50 in PBS pH 7.2, then 50 µm mixed with 50 µl of each fraction on a plate microtiter After incubation for 150 minutes at 20-25 ° C the plate was read on a fluorometer using 355nm excitation and 460nm emission. Protein was detected using Pierce Coomassie according to the instructions of the maker. In summary, 50 µl of Coomassie solution is added 50 µl of each fraction on a plate of microtiter The plate was mixed and the absorbance is read at 595nm

Análisis del Tamaño de PartículaParticle Size Analysis

Las formulaciones se analizaron por tamaño de partícula, mediante la dispersión de la luz dinámica utilizando un Nicomp Submicron Particle Sizer Model 370.The formulations were analyzed by size of particle, by dispersing dynamic light using a Nicomp Submicron Particle Sizer Model 370.

Péptidos y Virus de VacunaPeptides and Vaccine Virus

Los péptidos (15 o 20mer traslapados por 10 aa) que abarcan la longitud total de la proteína Core (aa: 1-191) del HCV-1a (Choo et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2451) se sintetizaron con N-terminal amina libre y C-terminal ácido libre por Research Genetics (Huntsville, AL). El virus de la vacuna recombinante (rVV) que expresa Core y E1 (aa: 1-384; rWC/E1) y de tipo salvaje VV (VVwt) se ha descrito (Cooper et al. (1999) Immunity 10:439).Peptides (15 or 20mer overlapped by 10 aa) spanning the total length of the Core protein (aa: 1-191) of HCV-1a (Choo et al . (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 2451) were synthesized with N-terminal free amine and C-terminal free acid by Research Genetics (Huntsville, AL). The recombinant vaccine virus (rVV) expressing Core and E1 (aa: 1-384; rWC / E1) and wild-type VV (VVwt) has been described (Cooper et al . (1999) Immunity 10: 439).

Inmunización Immunization

Los macacos Rhesus se inmunizaron bajo anestesia. El primer estudio se compuso de nueve animales divididos en tres grupos de tres animales cada uno. El primer grupo (animales BB228, BB232 y DV036) se infectaron con 2 x 10^{8} unidades que forman la placa (pfu) (1 x 10^{8} vía intradérmica y 1 x 10^{8} por escarificación) de rVVC/E1 en el mes 0. Este grupo sirvió como un control positivo para la imprimación de CTL. Los animales del segundo grupo (AY921, BB231 y DV037) se inmunizaron con 25 \mug de Core-ISCOM, mediante inyección intramuscular (IM) en los cuádriceps izquierdos en el mes 0, 1, 2 y 6. Los animales del tercer grupo (AY922, BB227 y BB230) se inmunizaron por inyección IM con 200 \mug de HCV-proteína del núcleo son 200 \mug del adyuvante de LTK63 en el mes 0, 1, 2 y 6. Para el segundo estudio, cinco animales (15860, 15861, 15862, 15863 y 15864) se inmunizaron con 50 \mug de Core-ISCOM por inyección IM en los cuádriceps izquierdo en el mes 0, 1 y 2. Algunos animales inmunizados con Core (ver Tabla I) también recibieron 2 x 10^{8} pfu (1 x 10^{8} vía intradérmica y 1 x 10^{8} por escarificación) de rVVC/E1 nueve u once semanas después de su última inmunización con vacuna.Rhesus macaques were immunized under anesthesia. The first study consisted of nine divided animals in three groups of three animals each. The first group (animals BB228, BB232 and DV036) were infected with 2 x 10 8 units that form the plate (pfu) (1 x 10 8 intradermally and 1 x 10 8 by scarification) of rVVC / E1 in month 0. This group served as a positive control for the CTL primer. The animals of second group (AY921, BB231 and DV037) were immunized with 25 µg of Core-ISCOM, by intramuscular injection (IM) in the left quadriceps in month 0, 1, 2 and 6. The animals of the third group (AY922, BB227 and BB230) were immunized by IM injection with 200 µg of HCV-core protein are 200 LTK63 adjuvant in the month 0, 1, 2 and 6. For second study, five animals (15860, 15861, 15862, 15863 and 15864)  were immunized with 50 µg of Core-ISCOM by IM injection in the left quadriceps in month 0, 1 and 2. Some animals immunized with Core (see Table I) also received 2 x 10 8 pfu (1 x 10 8 intradermally and 1 x 10 8 by scarification) of rVVC / E1 nine or eleven weeks later of your last immunization with vaccine.

Los ratones (10 animales por grupo) se inmunizaron en los músculos tibiales anterior (50 \mul por músculo) con 2 \mug por dosis de proteína recombinante E1 E2 sola o 2 \mug por dosis de proteína recombinante E1 E2 en la presencia de MF59 (vol: vol), o 2 \mug por dosis de proteína recombinante E1 E2 + 2 \mug por dosis de Core-ISCOM en las semanas 0, 4 y 8.Mice (10 animals per group) are immunized in the anterior tibial muscles (50 µl per muscle) with 2 µg per dose of recombinant protein E1 E2 alone or 2 µg per dose of E1 E2 recombinant protein in the presence of MF59 (vol: vol), or 2 µg per dose of recombinant E1 protein E2 + 2 \ mug per dose of Core-ISCOM in the weeks 0, 4 and 8.

Las células y líneas celularesCells and cell lines

La sangre periférica se extrajo de la vena femoral mientras que los animales estaban bajo anestesia. Las PBMCs se obtuvieron después de la centrifugación sobre un gradiente Ficoll-hypaque y se cultivó en placas de 24-pozos a 5 x 10^{6} células por pozo. De aquellas células, 1 x 10^{6} se sensibilizaron con 10 \muM de una mezcla de péptidos (que consiste de péptidos individuales) por una hora a 37ºC, se lavaron y adicionaron a las remanentes 4 x 10^{6} PBMCs sin tratar en 2 ml de medio de cultivo (RPMI 1640, 10% de suero fetal bovino inactivado por el calor, y 1% de antibióticos) suplementado con 10 ng/ml de IL-7 (R&D, Minneapolis, MN). Después de 48 horas, 5% (final) de sobrenadante que contiene interleucina-2 (T-STIM sin PHA, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) y 50 U/ml (final) de IL-2 recombinante (Chiron Corporation, Emeryville, CA) se adicionaron a los cultivos. Los cultivos se alimentaron cada 3-4 días. Después de 10 días en el cultivo, las células T CD8+ se aislaron utilizando los anticuerpos anti-CD8 unidos a cuentas magnéticas (Dynal, Oslo, Norway) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células CD8+purificadas (>93% puro según se determina por citometría de flujo) se cultivaron por otros 2-3 días antes de que se analizaran para la actividad citotóxica. Las líneas CD8+ péptido específicas se obtuvieron, mediante la restimulación periódica de estas células T CD8+ con B-LCLs autólogas y el péptido.Peripheral blood was extracted from the vein femoral while the animals were under anesthesia. PBMCs were obtained after centrifugation on a gradient Ficoll-hypaque and was grown in plates 24-wells at 5 x 10 6 cells per well. From those cells, 1 x 10 6 were sensitized with 10 µM of a mixture of peptides (consisting of individual peptides) by one hour at 37 ° C, they were washed and added to the remnants 4 x 10 6 untreated PBMCs in 2 ml of culture medium (RPMI 1640, 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and 1% of antibiotics) supplemented with 10 ng / ml of IL-7 (R&D, Minneapolis, MN). After 48 hours, 5% (final) of supernatant containing interleukin-2 (T-STIM without PHA, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) and 50 U / ml (final) of recombinant IL-2 (Chiron Corporation, Emeryville, CA) were added to the crops. The cultures were fed every 3-4 days. After 10 days in culture, CD8 + T cells were isolated using anti-CD8 antibodies bound to magnetic beads (Dynal, Oslo, Norway) according to the instructions of the maker. Purified CD8 + cells (> 93% pure as determined by flow cytometry) were grown by others 2-3 days before they were analyzed for cytotoxic activity The specific CD8 + peptide lines are obtained, by periodic restimulation of these T cells CD8 + with autologous B-LCLs and the peptide.

Las B-LCLs se derivaron de cada animal utilizando los sobrenadantes a partir de H. papio productor de la línea celular S394.The B-LCLs were derived from each animal using supernatants from H. papio producer of the S394 cell line.

Ensayo CTLCTL test

La actividad citotóxica se probó en un ensayo de liberación ^{51}Cr estándar como se describe en otro lugar (Paliard et al. (2000) AIDS Res. Hum. Retroviruses 16:273). En resumen, las B-LCLs se incubaron con 10 \muM de péptidos y 50 \muCi de ^{51}Cr por 1 h, se lavaron tres veces y se sembraron en placas a 5 x 10^{3} células por pozo en una placa de 96 pozos. De manera alternativa, las B-LCLs se infectaron en una multiplicidad de infección (MOI) de 10:1 con rVVC/E1 o VVwt por 1 h, se lavaron y se cultivaron durante la noche antes de la marcación con ^{51}Cr. Las células CD8+ se sembraron en placas por duplicado a tres distintas relaciones E:T y se incubaron con células diana por 4 horas en la presencia de 2 x 10^{5} por pozo de células diana sin marcar (dianas frías), que se adicionaron para minimizar la lisis del B-LCLs por el H. papio o virus endógeno (por ejemplo virus espumoso)-CTLs específicas. Las respuestas del CTL se puntearon positivas cuando el porcentaje de lisis específica en las dos relaciones E:T más altas, fueron mayor a o igual al porcentaje de lisis de las dianas control más 10.Cytotoxic activity was tested in a standard 51 Cr release assay as described elsewhere (Paliard et al . (2000) AIDS Res. Hum. Retroviruses 16: 273). In summary, the B-LCLs were incubated with 10 µM peptides and 50 µCi of 51 Cr for 1 h, washed three times and plated at 5 x 10 3 cells per well in a plate of 96 wells. Alternatively, the B-LCLs were infected in a multiplicity of infection (MOI) of 10: 1 with rVVC / E1 or VVwt for 1 h, washed and grown overnight before labeling with 51 Cr . CD8 + cells were plated in duplicate at three different E: T ratios and incubated with target cells for 4 hours in the presence of 2 x 10 5 per well of unlabeled target cells (cold targets), which were added to minimize the lysis of B-LCLs by H. papio or endogenous virus (eg, foamy virus) -CTLs specific. The CTL responses were positive when the percentage of specific lysis in the two highest E: T ratios was greater than or equal to the percentage of lysis of the control targets plus 10.

Ensayo de linfoproliferaciónLymphoproliferation assay

Este ensayo ha sido descrito previamente (Hong et al. (1997) J. Virol. 71:6427). En resumen, recientemente los PBMCs aislados se sembraron en placas por triplicado a 2 x 10^{5} células por pozo en 96 pozos placas de fondo redondo y se cultivaron en la presencia de 5 \mug/ml de la proteína del núcleo recombinante o 0.05 \mug/ml de E. coli control. Las placas se pulsaron con 1 \muCi por pozo de ^{3}H-timidina en el día 5 y se cosechan 6-8 horas más tarde. Los resultados se presentan como índice de estimulación (SI) calculado como (media experimental cpm)/(media cpm en la presencia del control E. coli). Un Sl \geq3.0 fue registrado positivo.This assay has been previously described (Hong et al . (1997) J. Virol. 71: 6427). In summary, recently isolated PBMCs were plated in triplicate at 2 x 10 5 cells per well in 96 wells round bottom plates and cultured in the presence of 5 µg / ml of the recombinant core protein or 0.05 µg / ml E. coli control. Plates were pulsed with 1 µCi per well of 3 H-thymidine on day 5 and harvested 6-8 hours later. The results are presented as a stimulation index (SI) calculated as (experimental cpm average) / (cpm average in the presence of the E. coli control). A Sl \ geq3.0 was registered positive.

Análisis FACSFACS analysis

Las PBMCs recientemente aisladas o PBMCs que han sido re-estimuladas in vitro con un péptido, se cultivaron en medio solo o re-estimulado con 5 \mug/ml de proteína del núcleo, 0.05 \mug/ml de control E. coli, 5 \mug/ml de péptido, o VV-infectado o péptido-sensibilizado B-LCLs autólogos (1:1) por 12 horas en medio de cultivo que contiene 50 U/ml de rIL-2 (Chiron Corporation, Emeryville, CA) y 3 \muM monensina (Pharmingen, San Diego, CA). Las células se tiñeron de acuerdo con Pharmingen's protocol para la superficie CD4 y CD8 con APC-conjugado anti-humano CD4 y PerCP-conjugado anti-humano CD8, y para IFN-\gamma y TNF-\alpha intracelular con PE-conjugado anti-humano IFN-\gamma y FITC-conjugado anti-humano TNF-\alpha. Los anticuerpos fueron de Pharmingen and Becton-Dickinson (San Jose, CA). Las células se analizaron en un FACScalibur. Los archivos de los datos se analizaron utilizando el software CellQuest.Freshly isolated PBMCs, or PBMCs that have been re-stimulated in vitro with a peptide, were grown in medium alone or re-stimulated with 5 µg / ml of core protein, 0.05 µg / ml of E. coli control, 5 µg / ml peptide, or VV-infected or peptide-sensitized B-LCLs autologous (1: 1) for 12 hours in culture medium containing 50 U / ml rIL-2 (Chiron Corporation, Emeryville, CA) and 3 µM monensin (Pharmingen, San Diego, CA). Cells were stained according to Pharmingen's protocol for surface CD4 and CD8 with APC-conjugate anti-human CD4 and PerCP-conjugate anti-human CD8, and for IFN-? And TNF-? Intracellular with PE-conjugate anti- human IFN-? and FITC-conjugate anti-human TNF-?. The antibodies were from Pharmingen and Becton-Dickinson (San Jose, CA). The cells were analyzed in a FACScalibur. Data files were analyzed using the CellQuest software.

ELISA de la citoquinaCytokine ELISA

Las PBMCs del macacos Rhesus aisladas recientemente se re-estimularon con péptidos que abarcan la proteína del núcleo completa. Los niveles de IL-2, IL-5, IL-10 y IFN-\gamma del mono Rhesus presentan en 48 horas sobrenadantes de cultivo libre de células, se determinaron por ELISA específica (U-Cytech, Utrecht, The Netherlands) siguiendo las instrucciones del fabricante.PBMCs of Rhesus macaques isolated recently they were re-stimulated with peptides that span the complete core protein. The levels of IL-2, IL-5, IL-10 and IFN-? Of the Rhesus monkey present in 48 hours cell-free culture supernatants, were determined by ELISA specific (U-Cytech, Utrecht, The Netherlands) following the manufacturer's instructions.

Anticuerpos HCVHCV antibodies

Los niveles de suero de los anticuerpos de HCV Core y HCV E2 se cuantificaron por ELISA como se describe (Chien et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:10011). Los niveles de suero de anticuerpos para inhibir el enlace de E2 con el receptor CD81 del HCV putativo (Pileri et al. (1998) Science 282:938) se determinaron por inmunoensayo.The serum levels of the HCV Core and HCV E2 antibodies were quantified by ELISA as described (Chien et al . (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 10011). Serum antibody levels to inhibit E2 binding with the putative HCV CD81 receptor (Pileri et al . (1998) Science 282: 938) were determined by immunoassay.

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Ejemplo 1Example one

Análisis de Gradiente de Sacarosa de Core-ISCOMSucrose Gradient Analysis of Core-ISCOM

La Proteína Core se encontró en las fracciones 5 a 11 (Figura 1A) mientras que ISCOMATRIX® se encontró en las fracciones 9 a 13 (Figura 1B). El Core-ISCOM se encontró en las fracciones 14-17 con ambos picos traslapados de ISCOM^{TM} y la proteína, lo que indica la asociación (Figura 1 C).Core Protein was found in fractions 5 to 11 (Figure 1A) while ISCOMATRIX® was found in the fractions 9 to 13 (Figure 1B). The Core-ISCOM is found in fractions 14-17 with both peaks overlaps of ISCOM ™ and protein, indicating the association (Figure 1 C).

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Ejemplo 2Example 2

Estabilidad de Core-ISCOMCore-ISCOM Stability

La estabilidad de la formulación Core-ISCOM^{TM} se evaluó por 11 meses. Ambos el tamaño de partícula y la asociación permanecen consistentes por al menos 11 meses a 2-8ºC (Tabla I).Formulation stability Core-ISCOM ™ was evaluated for 11 months. Both the particle size and association remain consistent at minus 11 months at 2-8ºC (Table I).

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Ejemplo 3Example 3

Cebado de CTLs-Core específicas en Animales VacunadosPriming of CTLs-Core specific to Animals Vaccinated

Como se explica anteriormente, dos distintas vacunas prototipos (Core-ISCOM y Core + LTK63) lograron inducir la respuesta de las HCVCTLs-Core específicas cada una se administró a tres macacos Rhesus HCV-naive (ver Tabla II para el programa de asignación, dosificación e inmunización del animal). Dado que era desconocido si la moléculas clase I MHC del macacos Rhesus se puede unir y presentar péptidos derivados de HCV-Core y si el repertorio de la célula T CD8+ seleccionado positivamente en estos animales puede reconocer tal como complejos de péptidos derivados de Core-MHC clase I, tres animales adicionales se inocularon con 2 x 10^{8} pfu de rVVC/E1 para servir como controles positivos (Tabla II).As explained above, two different prototype vaccines (Core-ISCOM and Core + LTK63) they managed to induce the response of HCVCTLs-Core specific each was administered to three Rhesus macaques HCV-naive (see Table II for the program of allocation, dosage and immunization of the animal). Since it was unknown if the MHC class I molecules of the Rhesus macaque can be bind and present peptides derived from HCV-Core and if the CD8 + T cell repertoire positively selected in these animals can recognize such as peptide complexes Core-MHC class I derivatives, three animals additional were inoculated with 2 x 10 8 pfu of rVVC / E1 to serve as positive controls (Table II).

Ninguno de los nueve animales tuvo ninguna CTLs detectable en el tiempo de inmunización (semana 0; Tabla III y datos no mostrados). Esto confirma que estos animales no han sido expuestos previamente a HCV Core y que la re-estimulación de PBMCs bajo las condiciones descritas en Materiales y Métodos no resultó en la imprimación de respuestas primarias de CTL in vitro. Dos semanas después de la infección de rVVC/E1, dos (BB232 y DV036) de los tres animales tuvo CTLs detectables contra la mezcla de los péptidos Core 4 (aa: 121-170) y la mezcla 3 (aa: 81-130), respectivamente (Tabla III). Mediante la deconvolución de estas mezclas de péptidos, se determinó que las CTLs de BB232 reconocieron el péptido epitópico 121-135 y que CTLs de DV036 reconocieron el péptido 86-100. La presencia de 121-135 y 86-100-CTLs específicas en estos animales inoculados con rVVC/E1 indicaron que ambos péptidos se procesaron naturalmente. Ninguna respuesta de CTL fue detectable en el otro animal inoculado con rVVC/E1 (BB228). Esto indicó que las CTLs-Core específicas se pueden producir en al menos algún mono Rhesuss. Fuera de los tres animales que recibieron Core con el adyuvante LTK63 (Tabla II), solo un animal (BB230) mostró una respuesta CTL contra Core. Esta respuesta, dirigida contra la mezcla 2 (aa: 41-90), se transfirió, sin embargo, como fue detectable dos semanas después de la tercera inmunización, pero fue indetectable seis semanas después de la tercera inmunización. Adicionalmente, estas CTLs no se aumentaron por una cuarta inmunización (Tabla III) y el péptido individual reconocido podría no ser identificado. Dos de los tres animales inmunizados con Core-ISCOM (AY921 y BB231; Tabla II) no acumularon una respuesta de CTL específica-Core detectable. En contraste, en el otro animal inmunizado con Core-ISCOM (DV037), la mezcla 4 (aa: 121-170) que reconoce las CTLs, fue detectable ya a las dos semanas después de la segunda inmunización. Esta respuesta se dirigió contra el péptido epitópico aa: 121-135 y también se presentó después de la tercera y después de la cuarta inmunización (Tabla III).None of the nine animals had any CTLs detectable at the time of immunization (week 0; Table III and data not shown). This confirms that these animals have not been previously exposed to HCV Core and that the re-stimulation of PBMCs under the conditions described in Materials and Methods did not result in the priming of primary CTL responses in vitro . Two weeks after rVVC / E1 infection, two (BB232 and DV036) of the three animals had detectable CTLs against the mixture of Core 4 peptides (aa: 121-170) and mixture 3 (aa: 81-130) , respectively (Table III). Through the deconvolution of these peptide mixtures, it was determined that the CTLs of BB232 recognized epitopic peptide 121-135 and that CTLs of DV036 recognized peptide 86-100. The presence of specific 121-135 and 86-100-CTLs in these animals inoculated with rVVC / E1 indicated that both peptides were processed naturally. No CTL response was detectable in the other animal inoculated with rVVC / E1 (BB228). This indicated that specific Core-CTLs can be produced in at least some Rhesuss monkey. Out of the three animals that received Core with adjuvant LTK63 (Table II), only one animal (BB230) showed a CTL response against Core. This response, directed against mixture 2 (aa: 41-90), was transferred, however, as was detectable two weeks after the third immunization, but was undetectable six weeks after the third immunization. Additionally, these CTLs were not increased by a fourth immunization (Table III) and the recognized individual peptide may not be identified. Two of the three animals immunized with Core-ISCOM (AY921 and BB231; Table II) did not accumulate a detectable Core-specific CTL response. In contrast, in the other animal immunized with Core-ISCOM (DV037), mixture 4 (aa: 121-170) that recognizes CTLs, was detectable already at two weeks after the second immunization. This response was directed against the epitope peptide aa: 121-135 and also occurred after the third and after the fourth immunization (Table III).

En contraste con los animales que recibieron el prototipo de la vacuna Core + LTK63, los animales inmunizados con el prototipo de la vacuna Core-ISCOM tuvieron CTLs detectables después de la segunda inmunización y estas CTLs también se presentaron después de la tercera y cuarta inmunización (Tabla III). Por lo tanto, esta última vacuna parece más potente en la producción de respuestas de CTL en macacos Rhesus que la anterior. Sin embargo, esta formulación CTLs-Core específicas cebadas en solo uno de los tres animales. Esto podría ser debido al hecho, que las moléculas MHC clase I de los animales que no responden, fueron incapaces de unir y presentar los péptidos derivados de esta proteína relativamente pequeña (191 aa). Para probar esta hipótesis, las líneas CTL específicas para el péptido 121-135 y 86-100 se establecieron a partir de los animales que responden. Como se muestra en la Figura 2A, la línea CTL del péptido 121-135-específico lisada péptido-sensibilizada B-LCLs derivada de DV037, pero no mata las B-LCLs-sensibilizadas-péptido 121-135 a partir de los dos animales que no responden (AY921 y BB231). de manera similar, las B-LCLs derivadas de DV036 pero no AY921 o BB231 fueron capaces de presentar el péptido 86-100 con CD8+ CTLs (Figura 2B). Estos datos indicaron que las moléculas de AY921 y de BB231 MHC clase I podrían no presentar estos péptidos con las células T CD8+, y sugirieron que los haplotipos de MHC clase I determinaron si el mono Rhesuss podría acumular una respuesta CTL con el HCV-Core.In contrast to the animals that received the Core + LTK63 vaccine prototype, animals immunized with the Core-ISCOM vaccine prototype had CTLs detectable after the second immunization and these CTLs also presented after the third and fourth immunization (Table III). Therefore, this last vaccine seems more potent in the production of CTL responses in Rhesus macaques than the previous one. However, this specific CTLs-Core formulation barley in only one of the three animals. This could be due to fact, that the MHC class I molecules of animals that don't respond, were unable to bind and present the peptides derivatives of this relatively small protein (191 aa). For test this hypothesis, the CTL lines specific to the peptide 121-135 and 86-100 were set to from the animals that respond. As the picture shows 2A, the CTL line of the peptide 121-135-specific lysate peptide-sensitized B-LCLs derived from DV037, but does not kill B-LCLs-sensitized-peptide 121-135 from the two animals that do not respond (AY921 and BB231). similarly, the B-LCLs derived from DV036 but not AY921 or BB231 were able to present peptide 86-100 with CD8 + CTLs (Figure 2B). These data indicated that the molecules of AY921 and BB231 MHC class I may not present these peptides with CD8 + T cells, and suggested that MHC class I haplotypes determined whether the Rhesuss monkey could accumulate a CTL response with the HCV-Core.

Dado que distintos alelos de MHC clase I se pueden unir y presentar distintos conjuntos de péptidos, estos datos no descartaron que la formulación Core-ISCOM no fue sub-óptima, i.e. sigue siendo posible que estos animales pudieran acumular una respuesta de CTL Core-específica dirigida contra los péptidos diferentes de 86-100 y 121-135. Para hacer frente a esta posibilidad, AY921 y BB231 se desafiaron con 2 x 10^{8} pfu de rVVC/E1 once semanas después de su cuarta inmunización con Core-ISCOM. Contrariamente a BB232 y DV036 que tuvieron CTLs-Core específicas dos semanas después de la infección con rVVC/E1 (Tabla III), ninguno AY921 o BB231 tuvo ninguna CTLs detectable después de la inoculación de rVVC/E1. Esto sugiere firmemente que la ausencia de CTLs-Core específicas detectables después de la inmunización con Core-ISCOM de estos animales no se debió a una sub-óptima formulación de la vacuna, sino a una incapacidad intrínseca de estos animales para acumular dicha respuesta, es de suponer que una consecuencia de su haplotipo MHC clase I.Since different MHC class I alleles are can bind and present different sets of peptides, these data did not rule out that the Core-ISCOM formulation It was not sub-optimal, i.e. it is still possible that these animals could accumulate a CTL response Core-specific directed against peptides different from 86-100 and 121-135. To address this possibility, AY921 and BB231 challenged each other. with 2 x 10 8 pfu of rVVC / E1 eleven weeks after its fourth Immunization with Core-ISCOM. Contrary to BB232 and DV036 that had two specific CTLs-Core weeks after infection with rVVC / E1 (Table III), none AY921 or BB231 had no detectable CTLs after the inoculation of rVVC / E1. This strongly suggests that the absence of Specific CTLs-Core detectable after Immunization with Core-ISCOM of these animals is not it was due to a sub-optimal vaccine formulation, but to a intrinsic inability of these animals to accumulate such answer, presumably a consequence of your MHC haplotype class I.

Para investigar si la inmunización con Core-ISCOM indujo CTLs de larga-vida, monitoreamos DV037 por un máximo de 51 semanas (1 año) después de su cuarta inmunización. Las CTLs específicas del péptido 121-135 se detectaron 10, 15, 31, 38, 45 y 51 semanas después de la última inmunización (Figura 3A). En contraste, la respuesta 121-135-específica de la CTL cebada por rVVC/E1 en BB232 fue apenas detectable 14 semanas después de la vacunación y fue indetectable 18 semanas después de la vacunación (Figura 3B). De manera similar, las CTLs 86-100-específicas cebadas en DV036 por la vacunación con rVVC/E1 llegaron a ser indetectables 14 semanas después de la vacunación.To investigate whether immunization with Core-ISCOM induced CTLs of Long-life, we monitor DV037 for a maximum of 51 weeks (1 year) after your fourth immunization. CTLs Specific peptide 121-135 were detected 10, 15, 31, 38, 45 and 51 weeks after the last immunization (Figure 3A). In contrast, the answer 121-135-specific CTL barley by rVVC / E1 in BB232 was barely detectable 14 weeks after the vaccination and was undetectable 18 weeks after vaccination (Figure 3B). Similarly, CTLs 86-100-specific primed in DV036 by vaccination with rVVC / E1 they became undetectable 14 weeks after vaccination.

En un esfuerzo por cuantificar el número de CTLs específicas del péptido 121-135 presente en DV037 1 año después de que habían recibido su último refuerzo, las PBMCs del animal se re-estimularon ex vivo con 121-135 y el porcentaje de células T CD8+ específicas se analizó por tinción intracelular para IFN-\gamma y TNF-\alpha. Como se ilustra en la Figura 3C (paneles izquierdos), 121-135-CTLs específicas representaron el 0.49% de las células T CD8+ periféricas (o 490 células por 10^{5} células T CD8+) IFN-\gamma y/o TNF-\alpha secretadas después de la estimulación del péptido ex vivo por 12 horas. En contraste, después de la re-estimulación in vitro con el péptido 121-135, 71% de estas células T CD8+ fueron específicas para este péptido como se determina por su capacidad para secretar IFN-\gamma y/o TNF-\alpha (Figura 3C, paneles derechos).In an effort to quantify the number of specific CTLs of peptide 121-135 present in DV037 1 year after they had received their last boost, the animal's PBMCs were re-stimulated ex vivo with 121-135 and the percentage of CD8 + T cells specific was analyzed by intracellular staining for IFN-? and TNF-?. As illustrated in Figure 3C (left panels), specific 121-135-CTLs accounted for 0.49% of peripheral CD8 + T cells (or 490 cells per 10 5 CD8 + T cells) IFN-? And / or TNF -? secreted after stimulation of the peptide ex vivo for 12 hours. In contrast, after in vitro re-stimulation with peptide 121-135, 71% of these CD8 + T cells were specific for this peptide as determined by their ability to secrete IFN-? And / or TNF-? ( Figure 3C, right panels).

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Ejemplo 4Example 4

Caracterización de Respuestas Inmunes Celulares y Humorales en Monos Rhesus Inmunizados con Core-ISCOMCharacterization of Cellular and Humoral Immune Responses in Rhesus Monkeys Immunized with Core-ISCOM

Aunque solo uno de cada tres animales inmunizados Core-ISCOM tuvo CTLs detectables, el hecho de que en el animal que responde, las CTLs-Core específicas se detectaron después de solo dos inmunizaciones (Tabla III) y fueron de larga-vida (Figura 3A) formó la base para inmunizar a cinco animales más (15860-4) con Core-ISCOM (ver Tabla II para la dosificación y el programa de inmunización). Todos los animales fueron naive en el tiempo de vacunación. En este estudio, la imprimación de ambas CTLs-Core específicas y las células T CD4+ Core-específicas y los anticuerpos se monitorearon.Although only one in three animals immunized Core-ISCOM had detectable CTLs, the fact that in the animal that responds, the Specific CTLs-Core were detected after only two immunizations (Table III) and were of long-life (Figure 3A) formed the basis for immunizing five more animals (15860-4) with Core-ISCOM (see Table II for dosing and immunization program). All animals were naive in the vaccination time In this study, the primer of both Specific CTLs-Core and CD4 + T cells Core-specific and antibodies are monitored.

Ninguno de los animales tuvo ninguna Core-específicas CD4+ o células T CD8+ detectable en el tiempo de inmunización (semana 0, Tabla IV). Las células T CD4+Core-específicas, como se determina por ensayo de linfoproliferación, se detectaron en todos los animales excepto el 15861 después de la segunda inmunización, pero este animal tuvo una respuesta CD4+ detectable después de la tercera inmunización (Tabla IV). Para los animales 15862 y 15863, es improbable que el SI bajo observado después de la tercera inmunización (Tabla IV) fue debido a la ausencia de una respuesta de la célula T CD4+, ya que se observó una fuerte proliferación en estos animales y en este punto de tiempo particular para el control E. coli (ver a continuación). Ninguno de los animales tuvo anticuerpos contra Core antes de la inmunización. Sin embargo, todos los animales se han seroconvertido a Core después de dos inmunizaciones, y el nivel de anticuerpos contra Core se reforzó por una tercera inmunización (Figura 4). Notablemente, el título del anticuerpo Core medio entre estos animales fue comparable después de dos inmunizaciones (1,931) y más alto después de tres inmunizaciones (4,566) (Figura 4) a aquel presente en el suero de pacientes infectados crónicamente con un título del anticuerpo anti-Core inusualmente alto (2,358; no se muestra) corrido en el mismo
ensayo.None of the animals had any Core-specific CD4 + or CD8 + T cells detectable at the time of immunization (week 0, Table IV). Core-specific CD4 + T cells, as determined by lymphoproliferation assay, were detected in all animals except 15861 after the second immunization, but this animal had a detectable CD4 + response after the third immunization (Table IV). For animals 15862 and 15863, it is unlikely that the low SI observed after the third immunization (Table IV) was due to the absence of a CD4 + T cell response, as strong proliferation was observed in these animals and in this Particular time point for the E. coli control (see below). None of the animals had antibodies against Core before immunization. However, all animals have been seroconverted to Core after two immunizations, and the level of antibodies against Core was enhanced by a third immunization (Figure 4). Notably, the mean Core antibody titer between these animals was comparable after two immunizations (1,931) and higher after three immunizations (4,566) (Figure 4) to that present in the serum of chronically infected patients with an anti antibody titer. - Create unusually high (2,358; not shown) run on it
test.

Para investigar si el Core-ISCOM produjo un respuesta del tipo Th1 o Th2 en estos monos, recientemente las PBMCs aisladas antes de la vacunación lo mismo que dos semanas después de la segunda y tercera inmunización se ensayaron para su capacidad, para producir citoquinas a las 48h en respuesta a la estimulación con los péptidos Core que abarcan la longitud total de la proteína del núcleo. Como se muestra en las Figuras 5A y 5B, un incremento significante en las citoquinas Th1 (IFN-\gamma y IL-2) se observó después de la inmunización en todos los animales, aunque la magnitud de respuesta observada para 15860, 15861 y 15862 fue inferior que aquella observada para los animales 15863 y 15864. La analogía, un incremento en las citoquinas tipo Th2 (IL-5 y IL-10) se observó en todos los animales después de la vacunación, con la mayor cantidad de IL-5 y IL-10 también detectadas en 15863 y 15864 (Figuras 5C y 5D). Aunque la cantidad de citoquinas tipo Th2 secretadas fue inferior que aquella detectada para las citoquinas del tipo Th1, estos datos indicaron que Core-ISCOM indujo una respuesta del tipo similar a Th0 en el mono
Rhesuss.To investigate whether Core-ISCOM produced a Th1 or Th2 type response in these monkeys, recently isolated PBMCs before vaccination as well as two weeks after the second and third immunization were tested for their ability to produce cytokines at 48h in response to stimulation with Core peptides that span the total length of the core protein. As shown in Figures 5A and 5B, a significant increase in Th1 cytokines (IFN-γ and IL-2) was observed after immunization in all animals, although the magnitude of response observed for 15860, 15861 and 15862 It was lower than that observed for animals 15863 and 15864. The analogy, an increase in Th2 type cytokines (IL-5 and IL-10) was observed in all animals after vaccination, with the highest amount of IL-5 and IL-10 also detected in 15863 and 15864 (Figures 5C and 5D). Although the amount of secreted Th2 type cytokines was lower than that detected for Th1 type cytokines, these data indicated that Core-ISCOM induced a Th0-like response in the monkey
Rhesuss.

Después de dos y tres inmunizaciones, tres animales (15862, 15863 y 15864) tuvieron, detectables respuestas de CTL dirigidas contra la mezcla B (aa: 60-140), mientras que las otras dos no (15860 y 15861) (Tabla IV). Esta respuesta de CTL se dirigió contra el péptido 86-100 para el animal 15864 y contra el péptido 121-135 para los animales 15862 y 15863. Dado que CTLs 86-100 y 121-135- específicas, también se cebaron en DV036 (86-100), DV037 (121-135) y BB 232 (121-135) (Tabla III), esto fue de importancia para determinar si todas las CTLs 86-100 y 121-135-específicas se restringieron respectivamente por un alelo sencillo MHC clase I. La línea CTL 86-100-específica derivada del animal 15864 eficientemente lisó las B-LCLs- del péptido 86-100- sensibilizado, derivadas del 15864 pero no las B-LCLs-péptido-sensibilizadas derivadas del animal DV036, indicando que un alelo distinto (no-identificado) MHC clase I presentó este péptido para la CTL (Figura 6A y Tabla II). En contraste, las CTLs específicas para el péptido 121-135 a partir del animal 15862, 15863, BB232 y DV037 se restringieron por un alelo sencillo, aún no-identificado, MHC clase I compartido por todos estos animales (Figura 6B y Tabla II). Estos datos también indicaron que las moléculas MHC clase I de 15860 y 15861 podrían no presentar cualquier péptido (86-100 y 121-135) para las CTLs específicas (Figuras 6A y 6B). Como se observó en el primer estudio, la infección rVVC/E1 de los dos animales que no responden (15860 y 15861) nueve semanas después de la tercera inmunización con Core-ISCOM no condujo a la imprimación de las CTLs-Core específicas en estos animales. Tomados en conjunto, esto sugiere, una vez más, que el haplotipo MHC clase I de los animales fijados, si podrían acumular las CTLs-Core
específicas.After two and three immunizations, three animals (15862, 15863 and 15864) had detectable CTL responses directed against mixture B (aa: 60-140), while the other two did not (15860 and 15861) (Table IV) . This CTL response was directed against peptide 86-100 for animal 15864 and against peptide 121-135 for animals 15862 and 15863. Since specific CTLs 86-100 and 121-135- were also primed in DV036 (86 -100), DV037 (121-135) and BB 232 (121-135) (Table III), this was of importance to determine if all 86-100 and 121-135-specific CTLs were respectively restricted by a single MHC allele class I. The CTL 86-100-specific line derived from animal 15864 efficiently lysed the B-LCLs- from sensitized 86-100-peptide, derived from 15864 but not the B-LCLs-peptide-sensitized derived from animal DV036, indicating that a different (unidentified) MHC class I allele presented this peptide for CTL (Figure 6A and Table II). In contrast, CTLs specific for peptide 121-135 from animal 15862, 15863, BB232 and DV037 were restricted by a single, still unidentified allele, MHC class I shared by all these animals (Figure 6B and Table II) . These data also indicated that the MHC class I molecules of 15860 and 15861 may not present any peptide (86-100 and 121-135) for specific CTLs (Figures 6A and 6B). As observed in the first study, rVVC / E1 infection of the two animals that do not respond (15860 and 15861) nine weeks after the third immunization with Core-ISCOM did not lead to the priming of specific CTLs-Core in these animals . Taken together, this suggests, once again, that the MHC class I haplotype of fixed animals, if they could accumulate CTLs-Core
specific.

En un esfuerzo para cuantificar el número de CD8+ Core-específicas y células T CD4+ cebadas en los animales descritos antes, las PBMCs aisladas recientemente se tiñeron para INF-\gamma y TNF-\alpha intracelular después de la re-estimulación ex vivo. Las respuestas de la célula T CD8+, a los péptidos procesados naturalmente se cuantificaron después de la re-estimulación ex vivo con B-LCLs autólogas infectadas con rVVC/E1 o VVwt, como un control. Las respuestas de la célula T CD4+, a los péptidos procesados naturalmente se cuantificaron después de la re-estimulación ex vivo con la proteína del núcleo recombinante o un control E. coli. Las respuestas de la tinción intracelular, revelaron que mientras ninguno de los animales tuvo detectables células T CD8+ Core-específicas en el tiempo de inmunización, entre 0.30 y 0.71% de las células T CD8+ periféricas de 15862, 15863 y 15864, fueron específicas para el o los péptidos Core-derivados procesados naturalmente después de 2 inmunizaciones (Figura 7A). El número de CTLs específicas, sin embargo, no incrementó después de la tercera inmunización, como se discrimina por las respuestas de tinción intracelular. Notablemente, ninguna de las células T CD8+ que secretan IFN-\gamma y/o TNF-\alpha en respuesta a Core se detectaron en los dos animales (15860 y 15861) para los cuales no se observó actividad de CTL Core-específica por el ensayo de liberación ^{51}Cr (Figura 7A y Tabla IV). La cuantificación de las células T CD4+ Core-específicas confirmó que los datos obtenidos por el ensayo de linfoproliferación (Tabla IV) en el que entre 0.32 y 2.21% de las células T CD4+ a partir de los cinco animales fueron específicas para los péptidos Core procesados naturalmente (Figura 7B). Adicionalmente, el hecho que 0.53 y 0.28% de las células T CD4+ a partir de los animales 15862 y 15863 fueron positivos para las citoquinas después de la tercera inmunización (Figura 7B), sugiere fuertemente que la SI negativo observado para este punto de tiempo (Tabla IV) fue ciertamente un "falso negativo", muy probablemente debido a la alta proliferación observada en respuesta al control E. coli. Esto sugiere que la tinción intracelular para IFN-\gamma y TNF-\alpha es un ensayo más sensible, que la linfoproliferación para evaluar las respuestas de la célula T CD4+. antígeno-específica. De hecho, para el animal 15861, no se detectaron células T CD4+ por la linfoproliferación 2 semanas después de la segunda inmunización (Tabla IV). En contraste, las células T CD4+ Core-específicas se detectaron es este animal (2 semanas después de la segunda) por tinción intracelular para IFN-\gamma y TNF-\alpha (Figura
7B).In an effort to quantify the number of Core-specific CD8 + and CD4 + T cells primed in the animals described above, recently isolated PBMCs were stained for intracellular INF-γ and TNF-α after ex vivo re-stimulation. The CD8 + T cell responses to naturally processed peptides were quantified after ex vivo re-stimulation with autologous B-LCLs infected with rVVC / E1 or VVwt, as a control. The CD4 + T cell responses to naturally processed peptides were quantified after ex vivo re-stimulation with the recombinant core protein or an E. coli control. Intracellular staining responses revealed that while none of the animals had detectable CD8 + Core-specific T cells at the time of immunization, between 0.30 and 0.71% of peripheral CD8 + T cells of 15862, 15863 and 15864, were specific for or Core-derived peptides naturally processed after 2 immunizations (Figure 7A). The number of specific CTLs, however, did not increase after the third immunization, as discriminated by intracellular staining responses. Notably, none of the CD8 + T cells secreting IFN-? And / or TNF-? In response to Core were detected in the two animals (15860 and 15861) for which no Core-specific CTL activity was observed by the 51 Cr release assay (Figure 7A and Table IV). Quantification of the Core-specific CD4 + T cells confirmed that the data obtained by the lymphoproliferation assay (Table IV) in which between 0.32 and 2.21% of the CD4 + T cells from the five animals were specific to the processed Core peptides naturally (Figure 7B). Additionally, the fact that 0.53 and 0.28% of CD4 + T cells from animals 15862 and 15863 were positive for cytokines after the third immunization (Figure 7B) strongly suggests that the negative SI observed for this time point ( Table IV) was certainly a "false negative", most likely due to the high proliferation observed in response to the E. coli control. This suggests that intracellular staining for IFN-? And TNF-? Is a more sensitive assay, than lymphoproliferation to evaluate CD4 + T cell responses. antigen-specific. In fact, for animal 15861, no CD4 + T cells were detected by lymphoproliferation 2 weeks after the second immunization (Table IV). In contrast, Core-specific CD4 + T cells were detected in this animal (2 weeks after the second) by intracellular staining for IFN-? And TNF-? (Figure
7B).

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Ejemplo 5Example 5

El uso de Core-ISCOMs como Adyuvante para los Polipéptidos HCVThe use of Core-ISCOMs as an adjuvant for HCV polypeptides

Dado que la vacunación con proteína recombinante de HCVs de membrana y adyuvante puede, al menos en algunas instancias, influenciar el resultado de infección y enfermedad (Choo et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1294), investigamos si el Core-ISCOM anterior podría servir como un adyuvante para otros polipéptidos del HCV, tal como la proteína de membrana E1 E2 heterodimérica. Con ese fin, los ratones (10 animales por grupo) se inmunizaron con 2 \mug de proteína E1 E2 soluble sola, o 2 \mug de E1 E2 soluble en la presencia del adyuvante MF59, o en la presencia de 2 \mug de Core-ISCOM. Como se muestra en la Figura 8, los ratones inmunizados con E1 E2 sola, no tuvieron significante título del anticuerpo anti-E2. En contraste, los ratones inmunizados con E1E2 + Core-ISCOM tuvieron un significante título del anticuerpo anti-E2, después de tres inmunizaciones, y estos títulos fueron comparables a aquellos observados en ratones inmunizados con E1 E2 + MF59. Adicionalmente, la "calidad" del anticuerpo produjo en los ratones inmunizados por E1 E2 + MF59 y E1 E2 + Core-ISCOM parecía ser comparable con los títulos de anticuerpos que podrían inhibir el enlace de HCV-1a E2 con el receptor putativo del HCV CD81 en ambos grupos de ratones (Figura 9).Since vaccination with recombinant protein of membrane and adjuvant HCVs can, at least in some instances, influence the outcome of infection and disease (Choo et al . (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1294), We investigated whether the Core-ISCOM above could serve as an adjuvant to other HCV polypeptides, such as the E1 E2 heterodimeric membrane protein. To that end, mice (10 animals per group) were immunized with 2 µg of soluble E1 E2 protein alone, or 2 µg of soluble E1 E2 in the presence of MF59 adjuvant, or in the presence of Core 2 µg -ISCOM. As shown in Figure 8, mice immunized with E1 E2 alone had no significant anti-E2 antibody titer. In contrast, mice immunized with E1E2 + Core-ISCOM had a significant anti-E2 antibody titer, after three immunizations, and these titers were comparable to those observed in mice immunized with E1 E2 + MF59. Additionally, the "quality" of the antibody produced in mice immunized by E1 E2 + MF59 and E1 E2 + Core-ISCOM appeared to be comparable with antibody titers that could inhibit the binding of HCV-1a E2 with the putative HCV receptor CD81 in both groups of mice (Figure 9).

Los ejemplos anteriores demostraron que la vacunación con ISCOMs del polipéptido de HCV son capaces para cebar fuertemente las células T CD8+ y CD4+ HCV polipéptido-específicas lo mismo que los anticuerpos del polipéptido anti-HCV. Adicionalmente estas formulaciones ISCOM son capaces para servir como adyuvantes para producir los anticuerpos contra otras proteínas de HCV. Por lo tanto, las ISCOMs del HCV pueden prevenir el establecimiento de cronicidad, y/o incrementar la velocidad de respuesta a una terapia anti-viral.The previous examples showed that the Vaccination with ISCOMs of the HCV polypeptide are capable of priming strongly CD8 + and CD4 + HCV T cells polypeptide-specific same as antibodies of the anti-HCV polypeptide. Additionally you are ISCOM formulations are able to serve as adjuvants for produce antibodies against other HCV proteins. For the Therefore, HCV ISCOMs can prevent the establishment of chronicity, and / or increase the speed of response to a therapy anti-viral

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Ejemplo 6Example 6

Análisis de Gradiente de Sacarosa de NS35Core121-ISCOMSucrose Gradient Analysis of NS35Core121-ISCOM

La proteína NS35Core121 se encontró en un amplio pico a través del gradiente (Figura 10A). La proteína
NS35Core121 ISCOM esencialmente se encontró en las fracciones 15 a 20 que correspondían a un pico
ISCOMATRIX^{TM} indicando que la asociación ha ocurrido (Figura 10B). Curiosamente un ISCOMATRIX^{TM} también se encontró en las fracciones 5 a 10, lo que indica que hubo una proporción del ISCOMATRIX^{TM} con proteínas no asociadas.The NS35Core121 protein was found in a wide peak across the gradient (Figure 10A). The protein
NS35Core121 ISCOM was essentially found in fractions 15-20 corresponding to a peak
ISCOMATRIX? Indicating that the association has occurred (Figure 10B). Interestingly, an ISCOMATRIX ™ was also found in fractions 5 to 10, indicating that there was a proportion of ISCOMATRIX ™ with non-associated proteins.

Por consiguiente, las composiciones HCV/ISCOM novedosas y los métodos de uso de las mismas han sido revelados.Accordingly, the HCV / ISCOM compositions Novel and the methods of using them have been revealed.

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TABLA ITABLE I Estabilidad de Formulaciones Core-ISCOM^{TM}Formulability Stability Core-ISCOM ™

1one

TABLA IITABLE II Resumen de Inmunización y tipo MHC-IImmunization Summary and Type MHC-I

22

TABLA IIITABLE III Cebado de CTLs-Core específicas en macacos RhesusPriming of specific CTLs-Core in Rhesus macaques

33

TABLA IVTABLE IV Cebado de CD8+ y CT4+Core-específicas en macacos Rhesus inmunizados con core-ISCOMsPriming CD8 + and CT4 + Core-specific in Rhesus macaques immunized with core-ISCOMs

44

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Referencias citadas en la descripciónReferences cited in the description Esta lista de referencias citadas por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto.This list of references cited by the applicant is only for the convenience of the reader. It is not part of European patent document. Even when you have had great careful to collect references, errors or omissions are not they can exclude and the EPO ignores all responsibility to this respect. Documentos de patentes citadas en la descripciónPatent documents cited in the description

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Claims (13)

1. Un complejo inmunogénico que comprende un complejo orgánico con carga negativa y un antígeno cargado, cuyo complejo orgánico y antígeno están asociados electrostáticamente, en donde el complejo orgánico es un adyuvante con carga negativa y comprende una saponina y un colesterol y en donde el antígeno cargado comprende (i) uno o más polipéptidos inmunogénicos a partir de una región del Virus de la Hepatitis C (HCV) seleccionados de Core, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b, o (ii) una proteína de fusión que comprende un polipéptido inmunogénico a partir de la región Core del HCV y un segundo polipéptido inmunogénico seleccionado de las regiones E1, E2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b del HCV.1. An immunogenic complex comprising a organic complex with negative charge and a charged antigen, whose organic complex and antigen are electrostatically associated, in where the organic complex is an adjuvant with a negative charge and comprises a saponin and a cholesterol and wherein the antigen loaded comprises (i) one or more immunogenic polypeptides from from a region of Hepatitis C Virus (HCV) selected from Core, NS3, NS4a, NS4b, NS5a and NS5b, or (ii) a fusion protein comprising an immunogenic polypeptide from the region Core of HCV and a second immunogenic polypeptide selected from the E1, E2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a and NS5b regions of HCV. 2. El complejo inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el grado de carga negativa del complejo orgánico se incrementa adicionando un detergente o lípido con carga negativa.2. The immunogenic complex according to the claim 1 wherein the degree of negative charge of the complex organic is increased by adding a detergent or lipid with a load negative. 3. El complejo inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en donde dicho complejo orgánico adicionalmente comprende un fosfolípido.3. The immunogenic complex according to the claim 1 or 2 wherein said organic complex additionally  It comprises a phospholipid. 4. El complejo inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 3 en donde dicho fosfolípido es un fosfoglicérido.4. The immunogenic complex according to the claim 3 wherein said phospholipid is a phosphoglyceride 5. El complejo inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 4 en donde el fosfoglicérido se selecciona del fosfatidil inositol, fosfatidil glicerol, ácido fosfatídico y la cardiolipina.5. The immunogenic complex according to the claim 4 wherein the phosphoglyceride is selected from phosphatidyl inositol, phosphatidyl glycerol, phosphatidic acid and the cardiolipin 6. El complejo inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 3 en donde dicho fosfolípido es el lípido A.6. The immunogenic complex according to the claim 3 wherein said phospholipid is lipid A. 7. El complejo inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 6 en donde el lípido A se selecciona de difosforil lípido A y mono-fosforil lípido A.7. The immunogenic complex according to the claim 6 wherein lipid A is selected from diphosphoryl lipid A and mono-phosphoryl lipid A. 8. El complejo inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde dicho complejo induce una respuesta de linfocitos-T citotóxicos.8. The immunogenic complex according to any of the preceding claims wherein said complex induces a T-lymphocyte response cytotoxic 9. Una composición de vacuna que comprende como el componente activo un complejo inmunogénico como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes junto con uno o más portadores y/o diluentes farmacéuticamente aceptables.9. A vaccine composition comprising as the active component an immunogenic complex as defined in any of the preceding claims together with one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents. 10. Uso de un complejo inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 en la fabricación de un medicamento para uso en un método para el tratamiento o prevención de una infección por HVC en un mamífero causando, induciendo o por otra parte facilitando, una respuesta inmune a un antígeno de HCV.10. Use of an immunogenic complex according with any of claims 1 to 8 or a composition of vaccine according to claim 9 in the manufacture of a medication for use in a method for treatment or prevention of an HVC infection in a mammal causing, inducing or by another facilitating part, an immune response to an antigen of HCV 11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha respuesta inmune comprende una respuesta de linfocitos-T citotóxicos.11. Use according to claim 10, in where said immune response comprises a response of cytotoxic T-lymphocytes. 12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10 en donde dicha respuesta inmune inhibe, frena, retrasa o previene el inicio o evolución de una condición patológica que resulta de una infección por HVC.12. Use according to claim 10 in where said immune response inhibits, slows, slows down or prevents onset or evolution of a pathological condition that results from a HVC infection. 13. Un complejo inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 para su uso en un método de tratamiento del organismo humano o animal mediante terapia.13. An immunogenic complex according to any one of claims 1 to 8 or a composition of vaccine according to claim 9 for use in a method of treatment of the human or animal organism by therapy.