ES2309187T3

ES2309187T3 - Preparacion y uso de giberelinas para tratar la diabetes.

Info

Publication number: ES2309187T3
Application number: ES02753918T
Authority: ES
Inventors: Peter James Jenkins; Minne Wu; David Shine Wu
Original assignee: Australian Biomedical Co Pty Ltd
Current assignee: Australian Biomedical Co Pty Ltd
Priority date: 2001-08-31
Filing date: 2002-08-12
Publication date: 2008-12-16
Anticipated expiration: 2022-08-12
Also published as: EP1420774A4; US7435756B2; BR0212150A; PT1420774E; US7968596B2; CN1242741C; EP1420774A1; EP1420774B1; KR20040031008A; NZ530990A; CA2458797C; IL160435A0; CN1543343A; ATE401876T1; US20040162248A1; JP2005501864A; AU2002322165B2; DE60227820D1; CY1108394T1; RU2310444C2

Abstract

El uso de un compuesto de Fórmula (1) y/o sus derivados farmacéuticamente aceptables en la fabricación de un agente antidiabético para uso en el tratamiento de la diabetes y una o más enfermedades relacionadas seleccionadas de obesidad, micro y macrovasculopatías, nefropatía, neuropatía y enfermedades oculares (Ver fórmula) en la que R 1 es H o un grupo -O-R 20 , en el que R 20 es H, un grupo éter glicosílico (éter de glicósido), grupo alquilo C1 - 6, o R 1 forma un enlace junto con R 2 o R 10 (un doble enlace C1-C2 o C1-C10, respectivamente); R 2 es H o un grupo -O-R 21 , en el que R 21 es H, un grupo éter glicosílico (éter de glicósido), o forma un enlace junto con R 4 (lactona) o R 2 forma un enlace junto con R 1 o R 3 (un doble enlace C1-C2 o C2-C3, respectivamente); R 3 es H, =O, u -O-R 22 , en el que R 22 es H o un grupo éter glicosílico (éter de glicósido), o R 3 forma un enlace junto con R 2 (un doble enlace C2-C3); R 4 es OH, u -O-R 23 , en el que R 23 es alquilo C1 - 20 sin sustituir o sustituido, alilo, arilo, arilalquilo, amidina, -NR 24 R 25 o un anillo insaturado o saturado que contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre; R 24 y R 25 pueden ser o no ser el mismo, son hidrógeno, o alquilo C1 - 20, alilo, arilo, arilalquilo o un anillo insaturado o saturado que contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre; o R 4 forma un enlace junto con R 21 o R 28 (lactona); R 5 es...

Description

Preparación y uso de giberelinas para tratar la diabetes.

La presente invención se refiere al uso de compuestos de Fórmula (1) (giberelinas) y sus derivados para la fabricación de un agente antidiabético para uso en el tratamiento de diabetes, sus complicaciones y enfermedades asociadas, es decir, obesidad, micro y macrovasculopatías, nefropatía, neuropatía y enfermedades oculares. La invención da como resultado la normalización del nivel sérico de glucosa y otras enfermedades fisiológicas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la aplicación de un grupo de compuestos conocidos como giberelinas y sus derivados para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de diabetes y enfermedades relacionadas, poniendo disponible un método para tratar estas y otras enfermedades administrando giberelinas y/o sus sales o ésteres farmacéuticamente aceptables, que incluyen ésteres de gliclósido, ésteres activos o lactonas. Además, esta invención se refiere a la fabricación y el uso de un medicamento para tratar diabetes y sus enfermedades relacionadas. Además, la aplicación de giberelinas y sus derivados, especialmente cuando se administran por vía oral, por inyección, por parches transdérmicos, o por inhalación, se puede usar como un sustituto para el tratamiento con insulina y/o sus fragmentos derivados y/o IGFs (por sus siglas en inglés, factores de crecimiento similares a la insulina) o como una elección de terapia combinada con insulina, sus fragmentos derivados, IGF, factores de crecimiento u otros agentes antidiabéticos farmacéuticamente compatibles para el tratamiento de diabetes y enfermedades
relacionadas.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a una aplicación novedosa de giberelinas en medicina y veterinaria. En concreto, la invención concierne a formulaciones farmacéuticas que contienen giberelinas y a su uso para el tratamiento de diabetes que incluye la diabetes de tipo 1 y de tipo 2 y sus complicaciones y enfermedades asociadas, es decir, obesidad, micro y macro vasculopatías, nefropatía, neuropatía y enfermedades oculares.

Las giberelinas son una serie de compuestos que se dan de forma natural, que se conocen como reguladores del crecimiento de las plantas con una extendida aplicación en el reino vegetal [1]. Se han aislado también a partir de metabolitos de algunos microorganismos, tales como Gibberella fujikuroi [2]. Las giberelinas, especialmente el ácido giberélico (giberelina A_{3}), y su mezcla con giberelina A_{4} y/o giberelina A_{7} que están disponibles de forma comercial, se han aplicado extensamente en agricultura para aumentar el crecimiento de algunas frutas (fresas y uvas) y vegetales (tomates, repollos y coliflores), también como aditivo alimentario en la cebada cervecera [3].

[1]. J. MacMillian, et al. "Isolation and Structure of Gibberellin From Higher Plants". Adv. Chem. Ser 28, 18\sim24, (1961).

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[2].

(a): P.J. Curtis et al. Chem. & Ind. (Londres) 1066, (\underbar{1954}).

(b): B.E. Cross, J. Chem. Soc. 4670, (\underbar{1954}).

(c): P.W. Brian et al., Patente de EE.UU. 2.842.051.

(d): C.T. Calam et al, Patente de EE.UU. 2.950.288.

(e): A.J. Birch et al, Patente de EE.UU. 2.977.285.

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[3].

(a): M. Devlin, Plant Physiology, Nueva York, Reinhold, (\underbar{1966}).

(b): P.W. Brian et al., Plant Physio, 5.669 (\underbar{1955}).

(c): A.K Mehta et al., J. Hostic Sci 4.167 (\underbar{1975}).

(d): R.J. Weavor, Adv. Chem. Ser 28, 89 (\underbar{1961}).

(e): F.G. Gustafson, Plant Physical 35, 521 (\underbar{1960}).

(f): Fed. Reg. 25, 2162 (\underbar{1960}).

La giberelina A_{3} y su mezcla con giberelina A_{4} y/o A_{7} se pueden obtener por fermentación de microorganismos tales como la Gibberella fujikuroi. Los compuestos brutos se pueden aislar y purificar para proporcionar un producto cristalino de elevada pureza. Los otros derivados de la giberelina se pueden obtener por ruta semisintética a partir de giberelina A_{3} o por síntesis total, que están muy documentadas [4].

[4].

(a): Índice Merck, 12, 4426, bibliografía citada en él.

(b): Furber M., et al., "New Synthesis Pathways From Gibberellins to Autheridiogens Isolated From the Fern Genus Anemia", J. of Org. Chem. Vol. 55, n^{o} 15, 4860\sim4870 (\underbar{1990}).

(c): Mander L. N., et al., "C-18 hydroxylation of Gibberellins", J.C.S., Perkin Trans. 1 (17), 2893\sim2894 (\underbar{2000}).

(d): Pour M. et al., "Synthesis of 3,12-Dihydroxy-9,15-Cyclo Gibberellins", Tetrahedron 54(45), 13833\sim13850 (\underbar{1998}).

(e): Liu J.P. et al., "A General Protocol For the Hydroxylation of C-14 in Gibberellins Synthesis of 14-Beta-hydroxy-Gibberellin A_{1} Methyl Ester", Tetrahedron 54(38), 11637\sim11650 (\underbar{1998}).

(f): Pour M, et al., "Synthetic and Structural Studies on Novel Gibberellins", Pure and Applied Chemistry 70(2), 351\sim354 (\underbar{1998}); "Synthesis of 12-Hydroxy-9,15-Cyclo-Gibberellins", Tetrahedron Letters, 39(14), 1991\sim1994 (\underbar{1998}); Australian J. of Chemistry 50(4), 289\sim299 (\underbar{1997}).

(g): King G.R. et al., "A New and Efficient Strategy for the Total Synthesis of Polycyclic Diterpenoids - The Preparation of Gibberellins (+/-)-GA_{103} and (+/-)-GA_{73}", J. Am. Chem. Soc. 119(16), 3828\sim3829 (\underbar{1997}).

(h): Mander L. N., "Synthesis of 12-Hydroxy-C-20-Giebberellin from Gibberellin A_{3}", Tetrahedron 53(6), 2137\sim2162 (\underbar{1997}) y bibliografía citada en él.

Además, también se ha publicado ampliamente la extracción y aislamiento de diferentes giberelinas a partir de diferentes plantas, brotes, frutas y semillas [5].

[5].

(a): Pearce D.W., et al., Phytochemistry, 59(6), 679\sim687 (\underbar{2002}).

(b): Chang S.T., et al., Physiologia Plantarum, 112(3), 429\sim432 (\underbar{2001}).

(c): Nakayama M. et al., Phytochemistry, 57(5), 749\sim758 (\underbar{2001}); 48(4), 587\sim593 (\underbar{1998}).

(d): Blake P.S., et al., Phytochemistry, 55(8), 887\sim890 (\underbar{2000}); 53(4), 519\sim528 (\underbar{2000}).

(e): Koshioka M., et al., J. of the Japanese Society for Horticultural Science, 68(6), 1158\sim1160 (\underbar{1999}); 67(6), 866\sim871 (\underbar{1998}).

(f): Mander L.N. et al., Phytochemistry, 49(8), 2195\sim2206 (\underbar{1998}); 49(6), 1509\sim1515 (\underbar{1998}).

(g): Wynne G. et al., Phytochemistry, 49(7), 1837\sim1840 (\underbar{1998}).

Las giberelinas se han usado previamente como antiinflamatorios, para el tratamiento de prostatitis y psoriasis, para el tratamiento de tumores, y para curar úlceras y heridas [6].

[6].

(a): Patente de EE.UU. 4424232 1/1984 Parkinson.

(b): Patente de Francia 2597339 10/1987.

(c): Patente de EE.UU. 5487899 1/1996 Davis.

(d): Patente de EE.UU. 5580857 12/1996 Oden.

(e): Patente de Australia 695054 11/1998 Wu.

(f): Patente de EE.UU. 6121317 9/2000 Wu.

La Solicitud de Patente Internacional WO 97/02032 se refiere a una composición que comprende como componentes indispensables un inhibidor de la ECA y un antagonista del receptor AII para el tratamiento de enfermedades renales tales como nefropatía diabética.

La Patente de EE.UU. 4.424.232 se refiere a una composición que comprende L-lisina, ácido giberélico y urea como componentes indispensables para el tratamiento de herpes simple y otras enfermedades cutáneas dolorosas. De acuerdo con este documento, se considera necesaria la acción combinada de los tres componentes para obtener el efecto deseado.

La Solicitud de Patente Internacional WO 06/20703 describe giberelinas para ser promotoras de la curación de lesiones, curación de ulceras, curación de heridas o cultivo de estirpes celulares cutáneas o crecimiento del cabello.

La Solicitud de Patente Internacional WO 94/26240 se refiere a una composición para el tratamiento de la disminución de crecimiento del cabello, en la que la composición comprende al menos una giberelina que actúa contra la alopecia.

R.H. Davis et al., "Aloe Vera and Gibberellin" en Journal of the American Podiatric Medical Association, volumen 79, nº 1, Enero de 1989, páginas 24 a 26, se refiere a un estudio de la curación de heridas y efecto antiinflamatorio del Aloe Vera y la giberelina.

Hemos descubierto ahora la aplicación de la giberelina o sus derivados para el tratamiento de la diabetes que incluye la diabetes de tipo 1 y de tipo 2 y sus enfermedades relacionadas.

Descripción de la invención

Se ha descubierto ahora en nuestro laboratorio que las giberelinas poseen propiedades similares a las del factor de crecimiento de los mamíferos (tales como IGF, EGF).

Los resultados experimentales (Ejemplos 3 y 4) sugieren que las giberelinas, que son generadas por plantas y microbios, actúan como ligantes de amplio espectro que se unen a una gama de receptores de factores de crecimiento. Difieren de los factores de crecimiento encontrados en animales, cada uno de los cuales tiene una afinidad elevada por un receptor específico. Este es el resultado de la evolución. Los sistemas biológicos de plantas y microbios producen sustancias biológicas que actúan en una base más amplia (menos específica) que las de las formas más complejas de vida, tales como los animales.

Ya que las giberelinas son moléculas más pequeñas que los factores de crecimiento, la unión de las giberelinas a los receptores del factor de crecimiento es probablemente más débil. En presencia de niveles bajos de factores de crecimiento, las giberelinas se unen a receptores de factores de crecimiento vacantes para estimular el crecimiento celular y otras funciones. En esta situación, las giberelinas realizan las funciones de los factores de crecimiento. En presencia de un nivel normal de factores de crecimiento, los factores de crecimiento se unen a sus receptores más fácilmente debido a su afinidad más alta por esos sitios de receptor. La voluminosidad física de estos factores de crecimiento no deja espacio o deja muy poco espacio en los sitios del receptor para que las giberelinas se puedan unir. Esto da como resultado que las giberelinas son ineficaces cuando están presentes en cantidades suficientes factores de crecimiento con afinidad de unión suficiente. Este mecanismo proporciona un perfil muy bueno para que las giberelinas actúen como un sustituto o activador para factores de crecimiento que incluyen el IGF, ya que la presencia de un exceso de giberelinas no interfiere con las funciones normales de estos factores de crecimiento.

La diabetes mellitus es una enfermedad crónica que se manifiesta por hiperglucemia y una alteración en el metabolismo de lípidos y proteínas. Según la Asociación Americana de Diabetes, más de 13 millones de personas en los EE.UU. padecen diabetes, y cada año se identifican unos 650.000 nuevos casos. La introducción de insulina y de sulfonilureas representó un hito importante en el tratamiento de la diabetes mellitus. El factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1, por sus siglas en inglés), una molécula con homología de estructura con la insulina, tiene su propio receptor específico, el receptor de IGF de tipo-1, a través del cual provoca diversos efectos metabólicos que son similares a la insulina. El descubrimiento de la región activa del factor de crecimiento humano responsable de las acciones similares a las de la insulina de la molécula ha conducido al desarrollo de nuevos agentes peptídicos antidiabéticos. Además, los factores de crecimiento son polipéptidos que regulan la replicación, diferenciación y homeostasis metabólica de las células. Aumentan el crecimiento y/o supervivencia de las neuronas. En las pruebas preclínicas para el tratamiento de diversas enfermedades neurológicas que incluyen neuropatías diabéticas, el IGF-2 aumentó la tasa de regeneración de los nervios. Además, concentraciones intracelulares elevadas de AMPc potencian la secreción de insulina dependiente de glucosa procedente de las células \beta pancreáticas. Se ha encontrado que las giberelinas aumentan la actividad de la adenilato y la guanilato ciclasas, de modo que las concentraciones intracelulares de AMPc y GMPc pueden aumentar por la administración de giberelinas para potenciar a su vez las secreciones de insulina dependiente de glucosa procedentes de las células \beta pancreáticas. Puede verse así que las giberelinas tienen aplicación en el tratamiento de la diabetes.

Los resultados de los experimentos en animales (Ejemplos 5 y 6) muestran ratas diabéticas tratadas con 5 mg/kg de giberelina A_{3} o una mezcla de A_{3} y A_{4} o A_{7} que recuperaron sus niveles séricos normales de glucosa, así como sus pesos corporales. Esto indica que las giberelinas pueden ser eficaces en el tratamiento de la diabetes.

La toxicidad de la giberelina A_{3} para los mamíferos es extremadamente baja. Se informa que la LD_{50} única por vía oral para ratas y ratones es 6,3 g/kg [7a] y >15 g/kg [7b] respectivamente. En experimentos de alimentación de 90 días, el nivel de no efecto para ratas y perros fue >1 g/kg/día [7b]. No es irritante para la piel y los ojos [7b]. No se han encontrado indicios de carcinogenicidad [7c]. Clasificaciones: clase de toxicidad según la OMS, Tabla 5 (producto de la clase menos peligrosa, improbablemente se presenta peligro grave en el uso normal); toxicidad de clase III según la EPA (por sus siglas en inglés, agencia de protección del medioambiente de los EE.UU.)(segunda clasificación menos peligrosa).

[7].

(a): NTP Chemical Repository.

\quad: http://ntpserver.niehs.nih.gov/htdocs/CHEM_H&S/NTP_CHEM7/Radian77-06-5.html.

(b): The Agrochemicals Handbook, Royal Society of Chemistry, agosto \underbar{1991}.

(c): Gold L.S., Slone T.H., Ames B.N. (\underbar{2001}), Pesticide Residues in Food and Cancer Risk: A Critical Analysis, Publications from the Carcinogenic Potency Project, en Handbook of Pesticide Toxicity, segunda edición, (R. Krieger, ed.), Academic Press.

De esta forma, un aspecto de esta invención se refiere al uso de compuestos de Fórmula (1) (giberelinas) o sus derivados para la fabricación de un agente antidiabético para uso en el tratamiento de la diabetes y sus complicaciones y enfermedades asociadas, es decir, obesidad, micro y macrovasculopatías, nefropatía, neuropatía y enfermedades oculares. Conforme a la invención, se proporciona una formulación farmacéutica para el tratamiento de diabetes y enfermedades relacionadas, es decir, obesidad, micro y macrovasculopatías, nefropatía, neuropatía y enfermedades oculares, dicha formulación farmacéutica incluye giberelinas, y/o sus sales o ésteres farmacéuticamente aceptables.

Las giberelinas tienen la fórmula siguiente:

1

en la que

R^{1} es H o un grupo -O-R^{20}, en el que R^{20} es H, un grupo éter glicosílico (éter de glicósido), grupo alquilo C_{1-6}, o R^{1} forma un enlace junto con R^{2} o R^{10} (un doble enlace C_{1}-C_{2} o C_{1}-C_{10}, respectivamente);

R^{2} es H o un grupo -O-R^{21}, en el que R^{21} es H, un grupo éter glicosílico (éter de glicósido), o forma un enlace junto con R^{4} (lactona) o R^{2} forma un enlace junto con R^{1} o R^{3} (un doble enlace C_{1}-C_{2} o C_{2}-C_{3}, respectivamente);

R^{3} es H, =O, u -O-R^{22}, en el que R^{22} es H o un grupo éter glicosílico (éter de glicósido), o R^{3} forma un enlace junto con R^{2} (un doble enlace C_{2}-C_{3});

R^{4} es OH, u -O-R^{23}, en el que R^{23} es alquilo C_{1-20} sin sustituir o sustituido, alilo, arilo, arilalquilo, amidina,
-NR^{24}R^{25} o un anillo insaturado o saturado que contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre; R^{24} y R^{25} pueden ser o no ser el mismo, son hidrógeno, o alquilo C_{1-20}, alilo, arilo, arilalquilo o un anillo insaturado o saturado que contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre; o R^{4} forma un enlace junto con R^{21} o R^{28} (lactona);

R^{5} es H o un grupo éster glicosílico (éster de glicósido), o ésteres de alquilo C_{1-20} sin sustituir o sustituidos (por ejemplo halogenados), ésteres de alilo, ésteres de arilo, ésteres de arilalquilo, ésteres activos (tales como éster de fenacilo, éster de pivaloilo);

R^{6} es H u OH o forma un enlace junto con R^{7} (un doble enlace_{ }C_{11}-C_{12});

R^{7} es H, =O, u -OR^{26}, en el que R^{26} es H o un grupo éter glicosílico (éter de glicósido) o R^{7} forma un enlace junto con R^{6} (un doble enlace_{ }C_{11}-C_{12});

R^{8} es H, hidroxilo, mercaptano, o halógeno (por ejemplo F, CI), amino, azida, N^{24}R^{25}, alquilo C_{1-20} sin sustituir o sustituido (por ejemplo halogenado), alilo, arilo, o arilalquilo, u -OR^{27}, en el que R^{27} es un grupo éter glicosílico (éter de glicósido);

R^{9} es H u OH, o forma un enlace junto con R^{15} (un enlace C_{9}-C_{15});

R^{10} es H, CH_{3}, CHO, COOH, o un éster glicosílico (éster de glicósido) de dicho COOH, CH_{2}O-R^{28} u -OR^{28}, en los que R^{28} es H o forma un enlace junto con R^{4} (lactona) o R^{10} forma un enlace junto con R^{1} (un doble enlace_{ }C_{1}-C_{10});

R^{11} es H, u OH o no está presente;

R^{12} es CH_{3}, CH_{2}OH, COOH o un éster glicosílico (éster de glicósido) de dicho COOH;

R^{13} es metileno, o un heteroátomo divalente, o NR^{29}, en el que R^{29} es NHR^{30} u OR^{30} en los que R^{30} es H, o alquilo C_{1-20}, arilo, alquilarilo; y un doble enlace está presente entre C_{16} y R^{13} cuando R^{11} no está presente; o R^{13} es H, OH, CH_{3}, CHO, CH_{2}X, en el que X es halógeno (por ejemplo F, CI); CHNR^{29} en el que R^{29} es NHR^{30} u OR^{30} en los que R^{30} es H, o alquilo C_{1-20}, arilo, alquilarilo cuando R^{11} es H u OH; con la condición de que cuando R^{11} es OH, R^{13} no es OH;

R^{14} es H u OH;

R^{15} es H, o forma un enlace junto con R^{9} (un enlace C_{9}-C_{15}).

Derivados farmacéuticamente aceptables, que incluyen lactonas, ésteres y sales de compuestos de Fórmula (1), incluyen sales de metales alcalinos (por ejemplo Na^{+}, K^{+}), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo Ca^{2+}, Mg^{2+}), sales de metales (por ejemplo Zn^{2+}, Al^{3+}), y sales de amonio, bases orgánicas (tales como lidocaína o NR^{16} R^{17} R^{18} R^{19} en el que R^{16}, R^{17}, R^{18}, R^{19}, que pueden ser o no el mismo, son hidrógeno, alquilo C_{1-20}, alcanol, arilo) de los mismos.

La línea de puntos junto con la línea continua indican que puede estar presente un doble enlace entre dos de los tres átomos de carbono conectados por las líneas de puntos y continua; con la condición de que no hay un doble enlace si R^{11} es un grupo OH.

Ya que la Fórmula (1) cumple las reglas de valencia normales, esto conduce a las condiciones adicionales que siguen:

R^{1} y R^{2} no pueden formar un enlace si R^{10} y R^{1} y/o R^{2} y R^{3} forman un enlace; R^{10} y R^{1} no pueden formar un enlace si R^{10} y R^{23} forman un enlace; R^{2} y R^{1} o R^{2} y R^{3} no pueden formar un enlace si R^{4} y R^{21} forman un enlace.

En el caso de la giberelina A_{3}, R^{1} forma un enlace junto con R^{2} (un doble enlace_{ }C_{1}-C_{2}); R^{3} es \beta-OH, R^{4} forma un enlace junto con R^{28} (lactona); R^{5}, R^{6}, R^{7}, y R^{9} son hidrógeno, R^{8} es OH, R^{11} no está presente; R^{12} es metilo; R^{13} es metileno, hay un doble enlace entre C_{16} y R^{13}; R^{14} y R^{15} son hidrógeno.

Las giberelinas disponibles más fácilmente es las giberelinas A_{3} y su mezcla con giberelina A_{4} y/o giberelina A_{7} a partir de la fermentación de Gibberella fujikuroi. Aunque los métodos de aislamiento y purificación de giberelinas, que incluyen la extracción con disolvente y cromatografía, han sido publicados como se ha mencionado en los antecedentes de la invención, aún es necesario un procedimiento sencillo y eficaz de aislamiento y purificación. En esta invención se proporciona un procedimiento práctico para la producción a gran escala de giberelina A_{3}, que comprende las etapas de incubar una cepa de microorganismos productores de giberelina en un caldo de fermentación hasta que la concentración de giberelinas alcanza aproximadamente 3.000 \mug/mL de caldo, seguida de:

(a): ajustar el pH del caldo de fermentación a un pH de 6,5 a 7,0 y filtrar para obtener una torta de microorganismos micelio, y un filtrado;

(b): lavar la torta con agua y mezclar el lavado con el filtrado para formar una disolución acuosa;

(c): concentrar la disolución acuosa;

(d): mezclar la disolución acuosa con un disolvente orgánico a una temperatura de 5 a 10^{o}C y ajustar el pH de la mezcla a menos de 2,0;

(e): dejar la mezcla que se separe en una fase acuosa y una primera fase orgánica y retirar la primera fase orgánica;

(f): volver a extraer la fase acuosa de la etapa (e) con disolvente orgánico para obtener una segunda fase orgánica;

(g): mezclar la primera y segunda fases orgánicas y concentrar para formar una disolución orgánica concentrada;

(h): calentar, con agitación, a 60-70^{o}C durante 3 a 4 horas la disolución orgánica concentrada, hasta que cesa la precipitación de materia sólida;

(i): enfriar la disolución orgánica concentrada a temperatura ambiente y filtrar para obtener un precipitado;

(j): lavar el precipitado en disolvente orgánico frío y secar para obtener un sólido color hueso que contiene aproximadamente 80% de giberelina A_{3}, aproximadamente 4% de giberelina A4 y aproximadamente 4% de giberelina A_{7}.

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Opcionalmente, la invención comprende adicionalmente las etapas de:

(k): disolver el sólido de color hueso en una mezcla de 32,6% de metanol, 2,2% de agua y 65,2% de acetona para obtener una disolución de giberelina;

(l): diluir la disolución de giberelina con una mezcla 10:1 de disolvente orgánico y agua;

(m): filtrar la disolución diluida de giberelina y concentrar el filtrado por evaporación a vacío;

(n): calentar con agitación el concentrado a una temperatura de 60 a 80^{o}C durante 2 a 3 horas, enfriar a temperatura ambiente y filtrar para obtener un precipitado sólido cristalino;

\quad: lavar el precipitado con acetato de etilo frío y secar para obtener cristales de giberelina con >95% de pureza.

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Además, el procedimiento para la preparación de sales y ésteres de giberelina está descrito. En concreto, la invención incluye un procedimiento para obtener la sal sódica de giberelina, que comprende las etapas de:

(a): disolver la giberelina A_{3} en metanol;

(b): añadir la disolución de giberelina a una disolución acuosa equimolar de NaHCO_{3};

(c): evaporar las disoluciones mezcladas hasta sequedad para obtener un residuo sólido;

(d): disolver el residuo en agua y secar por congelación para obtener la sal sódica de la giberelina A_{3};

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La invención incluye además un procedimiento para obtener la sal de zinc de giberelina, que comprende las etapas adicionales de disolver en agua la sal sódica de la giberelina A_{3}; pasar la disolución a través de una columna cargada con una resina de intercambio iónico de zinc, lavar la columna con agua, recoger y combinar el efluente y lavados y eliminar el agua para obtener la sal de zinc de la giberelina A_{3}.

La invención incluye además un procedimiento para obtener el éster etílico de la giberelina, que comprende las etapas de:

(a): disolver la giberelina A_{3} en una mezcla con una relación 50:1 de acetona a agua;

(b): mezclar la disolución de giberelina A_{3} con cantidades equimolares de trietilamina y cloroformiato de etilo, y una cantidad décimo molar de N-metilmorfolina, y agitar a -15^{o}C durante 20 minutos;

(c): diluir la mezcla resultante con etanol anhidro y agitar a temperatura ambiente;

(d): evaporar la mezcla diluida hasta sequedad y dividir el residuo entre acetato de etilo y agua en una relación 6:1;

(e): separar la capa de acetato de etilo, lavar con HCl al 2%, seguido de agua, seguida de NaHCO_{3} al 5%, seguido de agua, y evaporar a presión reducida hasta sequedad para dar el éster etílico de la giberelina A_{3}.

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Las referencias de ahora en adelante a los compuestos de Fórmula (1) incluyen los compuestos de Fórmula (1) y sus derivados farmacéuticamente aceptables que incluyen sales, ésteres y lactonas de los mismos.

Se pueden formar también composiciones farmacéuticamente aceptables de los compuestos de Fórmula (1) mezclándolos con uno o más de otros ingredientes activos, por ejemplo, insulina, polipéptidos similares a la insulina, derivados de fragmentos de insulina, IGFs, fragmentos de IGFs, factores de crecimiento, y otros agentes antidiabéticos, farmacéuticamente compatibles, para el tratamiento de la diabetes y enfermedades relacionadas.

Los compuestos de Fórmula (1) poseen actividad como agonistas y/o activadores de la insulina y similares a la insulina para el tratamiento de la diabetes, sus complicaciones y enfermedades asociadas, que son obesidad, micro y macrovasculopatías, nefropatía, neuropatía y enfermedades oculares. Se proporcionan de esta forma según la invención, los compuestos de Fórmula (1) para uso en la fabricación de un agente terapéutico activo en el tratamiento de la diabetes y enfermedades relacionadas.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para fabricar una composición farmacéutica, que comprende mezclar un compuesto de Fórmula (1) y/o sus derivados con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Conforme a la invención, se pone disponible un método para el tratamiento de la diabetes y enfermedades relacionadas en animales, que incluye a los seres humanos, que comprende administrar una cantidad eficaz de los compuestos de Fórmula (1).

Se proporciona también en un aspecto adicional de la invención el uso de los compuestos de Fórmula (1) para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes y enfermedades relacionadas.

La cantidad de los compuestos de Fórmula (1) requerida para uso en el tratamiento de la diabetes y enfermedades relacionadas variará con la velocidad de administración, la naturaleza de la enfermedad a ser tratada y la edad y enfermedad del animal, que incluye a los pacientes humanos, y será en último término a discreción veterinario o doctor.

En general una dosis adecuada estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 \mug a 100 mg/kg de peso corporal por día, preferentemente en el intervalo de 50 \mug a 20 mg/kg/día.

El tratamiento se comienza preferentemente después o en el momento en que aparece la diabetes y continua cuando es necesario. También es posible usar los compuestos de Fórmula (1) como un tratamiento preventivo.

Un tratamiento adecuado se administra 1-4 veces al día, y se continúa cuando es necesario. Alternativamente, en el caso de usar una formulación de liberación temporal, el tratamiento se puede administrar una vez cada 2 días a 1 semana.

La dosis deseada se puede presentar en una dosis única o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo como dos, tres, cuatro o más subdosis al día.

Los compuestos de Fórmula (1) se administran convenientemente en formulaciones unitarias que contienen por ejemplo de 0,1 a 500 mg de ingrediente activo por formulación unitaria. Aunque es posible, para uso en tratamiento, que los compuestos de Fórmula (1) se administren como el producto químico bruto, es preferible presentar el ingrediente activo como una formulación farmacéutica.

Así, la invención se refiere a la fabricación de una formulación farmacéutica que incluye los compuestos de Fórmula (1) o un derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables para los mismos y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos o profilácticos. El(los) vehículo(s) debe(n) ser aceptable(s) en el sentido de ser compatible(s) con los otros ingredientes de la formulación y no nocivo(s) para el receptor de los mismos.

Formulaciones farmacéuticas incluyen aquellas adecuadas para administración por vía oral, rectal, nasal, tópica (que incluye bucal y sublingual), vaginal o parenteral (que incluye intramuscular, intradérmica, subcutánea e intravenosa) o en una forma adecuada para administración en el tubo digestivo, o en una forma adecuada para administración en las vías respiratorias (que incluye los conductos nasales) por ejemplo por inhalación o insuflación o por implantación intradérmica o subcutánea o por parches transdérmicos. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente, cuando sea apropiado, en unidades de dosificación discretas y se pueden preparar por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica de farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar el compuesto activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, dar forma al producto en la formulación deseada.

Formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración por vía oral se pueden presentar como unidades discretas tales como cápsulas, píldoras o comprimidos, que contiene cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como un polvo o gránulos; como una disolución, una suspensión o una emulsión. El ingrediente activo se puede presentar también como una píldora gruesa, electuario o pasta. Los comprimidos o cápsulas para administración por vía oral pueden contener excipientes convencionales tales como agentes aglomerantes, materiales de carga, lubricantes, disgregantes, o agentes humectantes. Los comprimidos pueden estar recubiertos conforme a métodos muy conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas por vía oral pueden estar en forma de, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleosas, disoluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o se pueden presentar como un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes antisedimentación, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites alimentarios), o conservantes.

Los compuestos de Fórmula (1) se pueden formular también para administración parenteral (por ejemplo por inyección, por ejemplo inyección rápida o infusión continua) y se pueden presentar en formulaciones unitarias en ampollas, jeringas precargadas, infusiones de pequeño volumen o en recipientes multidosis con un conservante añadido. Los compuestos pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones, o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes antisedimentación, estabilizantes y/o de dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo, obtenido por aislamiento aséptico de un sólido estéril o por liofilización de una disolución, por reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril, libre de pirógenos, antes de su uso.

Para administración por vía tópica en la epidermis los compuestos de Fórmula (1) se pueden formular como pomadas, cremas o lociones, o como un parche transdérmico. Las pomadas y cremas se pueden formular, por ejemplo, con una base acuosa u oleosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones se pueden formular con una base acuosa u oleosa y contendrán también, en general, uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes de dispersión, agentes antisedimentación, espesantes, o agentes colorantes.

Para administración por vía tópica en la boca los compuestos de Fórmula (1) se pueden formular como pastillas para chupar que comprenden el ingrediente activo en una base edulcorada normalmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado.

Para administración por vía vaginal las formulaciones se pueden presentar como óvulos, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizaciones que contienen además del ingrediente activo, vehículos tales como los que se conocen en la técnica por se apropiados.

Para administración por vía rectal, se prefieren supositorios en dosis unitarias en los que el vehículo es un sólido. Vehículos adecuados incluyen manteca de cacao y otros productos usados normalmente en la técnica, y los supositorios se pueden formar convenientemente por mezcla conjunta del compuesto activo con el(los) vehículo(s) ablandado(s) o fundido(s) seguida de enfriado y conformado en moldes.

Para administración en las vías respiratorias (que incluye la administración intranasal) los compuestos de Fórmula (1) se pueden administrar por cualquiera de los métodos y formulaciones empleadas en la técnica para administración en las vías respiratorias.

De esta forma, en general, los compuestos de Fórmula (1) se pueden administrar en forma de una disolución o una suspensión o como un polvo seco.

Las disoluciones y suspensiones serán preferentemente acuosas, preparadas por ejemplo con agua sola (por ejemplo agua estéril o libre de pirógenos) o con agua y un codisolvente fisiológicamente aceptable (por ejemplo etanol, propilenglicol, y polietilenglicoles tales como el PEG 400).

Tales disoluciones o suspensiones pueden contener adicionalmente otros excipientes, por ejemplo conservantes (tales como cloruro de benzalconio), agentes de solubilización/tensioactivos tales como polisorbatos (por ejemplo Tween 80, Span 80, cloruro de benzalconio), tampones, agentes de ajuste de la isotonicidad (por ejemplo cloruro de sodio), potenciadores de la absorción y potenciadores de la viscosidad. Las suspensiones pueden contener adicionalmente agentes antisedimentación (por ejemplo celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa de sodio).

Las disoluciones o suspensiones se aplican directamente en la cavidad nasal por medios convencionales, por ejemplo con un cuentagotas, pipeta o pulverizador. Las formulaciones se pueden proporcionar en forma sencilla o como multidosis. En el último caso se proporciona deseablemente una forma de medición de la dosis. En el caso de un cuentagotas o pipeta el paciente puede conseguirlo administrando un volumen predeterminado apropiado de la disolución o suspensión. En el caso de un pulverizador, esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante un pulverizador atomizador mecánico de dosificación.

Se puede usar también una formulación en aerosol para administración en las vías respiratorias, en la que los compuestos de Fórmula (1) se proporcionan en un envase presurizado con un propelente adecuando tal como un clorofluorocarbonado (CFC) por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano o diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. El aerosol puede contener también convenientemente un tensioactivo tal como lecitina. La dosis de fármaco se puede controlar por suministro de una válvula fija.

Alternativamente, los compuestos de Fórmula (1) se pueden proporcionar en forma de un polvo seco, por ejemplo una mezcla de polvo del compuesto en una base en polvo adecuada tal como lactosa, almidón, derivados del almidón tales como hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidina (PVP). El vehículo en polvo formará, convenientemente, un gel en la cavidad nasal. La composición en polvo se puede presentar en forma de dosis unitaria por ejemplo en cápsulas o cartuchos de, por ejemplo, gelatina o en envases tipo blíster desde los cuales se puede administrar el polvo mediante un inhalador.

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En formulaciones destinadas a administración en las vías respiratorias, que incluyen las formulaciones intranasales, el compuesto tendrá en general un tamaño de partícula pequeño por ejemplo del orden de 5 micrómetros o menos. Tal tamaño de partícula se puede obtener por medios conocidos en la técnica, por ejemplo por micronización.

Para administración en el tubo digestivo, los compuestos de Fórmula (1) o un derivado farmacéuticamente aceptable se pueden administrar por cualquiera de los métodos y formulaciones empleadas en la técnica para administración en el tubo digestivo.

Cuando se desee se pueden emplear formulaciones adaptadas para proporcionar una liberación prolongada del ingrediente activo.

Los compuestos de Fórmula (1) se pueden usar también en combinación con otros agentes terapéuticos, por ejemplo agentes antidiabéticos tales como insulina, IGF, o analgésicos, agentes antihipertensores, sedantes, hipnóticos, agentes reductores de lípidos, agentes antiinfecciosos, etc. La invención se refiere así en un aspecto adicional a una mezcla que comprende los compuestos de Fórmula (1) o un derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos, junto con otro agente terapéuticamente activo.

Las mezclas mencionadas anteriormente se pueden presentar convenientemente para uso en forma de una formulación farmacéutica y de esta forma tales formulaciones que comprenden una mezcla como se ha definido anteriormente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable comprenden por lo tanto un aspecto adicional de la invención.

Los componentes individuales de tales mezclas se pueden administrar secuencialmente o simultáneamente en formulaciones farmacéuticas separadas o combinadas.

Cuando los compuestos de Fórmula (1) se usan con un segundo agentes activo terapéutico en el tratamiento de la diabetes y enfermedades relacionadas, la dosis de cada compuesto puede ser la mismo o diferente que la que se emplea cuando cada compuesto se usa solo. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente las dosis apropiadas.

Los compuestos de Fórmula (1) y sus derivados farmacéuticamente aceptables se pueden preparar por cualquier método conocido en la técnica para la preparación de compuestos con estructura análoga.

La presente invención se describe adicionalmente en los Ejemplos siguientes:

Ejemplo 1 Fermentación, aislamiento y purificación de giberelinas

(a): Fermentación: la cepa Gibberella fujikuroi productora de giberelina A_{3}, A_{4} y A_{7} se inoculó y cultivó en un medio que contenía 100 g de glucosa, 100 g de sacarosa, 2,5 g de NH_{4}NO_{3}, 0,25 g de KH_{2}PO_{4}, 0,2 g de MgS0_{4}, 0,01 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,03 g de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,1 g de KCI, 10 g de peptona, 3 g de CaCO_{3}, 1.000 mL de H_{2}O, a 28^{o}C durante 3\sim4 días. Se transfirió entonces a un medio de producción que contenía 1.000 g de glucosa, 100 g de peptona, 24 g de NH_{4}NO_{3}, 100 g de KH_{2}PO4, 20 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 20 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,5 g de Na_{2}B_{4}O_{7}\cdot10H_{2}O, 8 g de CuSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,7 g de (NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}\cdot4H_{2}O, 20 litros de H_{2}O, a un pH de 4,5 a 28^{o}C durante 8\sim10 días. Cuando la producción de giberelinas alcanzó un pico (\sim3.000 \mug/ml de caldo), se detuvo la fermentación.

(b): Aislamiento: se ajustó el pH del caldo de fermentación (18 litros) a 6,5\sim7,0 con NaOH al 10%, después se filtró. Se lavó la torta filtrada (micelio) con 4 L de H_{2}O. El filtrado y los lavados se mezclaron y se evaporaron hasta un volumen de 2 L. Se agitó el concentrado a 5\sim10^{o}C con acetato de etilo (5 L) y se ajustó el pH a 1,5 con HCI 6 N. Entonces se separaron dos capas. La capa acuosa inferior se volvió a extraer con acetato de etilo (2 L). Los extractos orgánicos se mezclaron y se lavaron con agua (2 L), entonces se evaporaron hasta 400 mL. El concentrado se agitó y se calentó a 60\sim70^{o}C durante 3\sim4 horas hasta que se produjo más precipitación. Después de enfriar a temperatura ambiente, se filtró la suspensión. Se lavó el sólido con acetato de etilo frío y se secó para dar giberelina A_{3} y una mezcla de A_{4}/A_{7} como un sólido de color hueso (45 g). Esta mezcla contenía \sim80% de A_{3}, \sim4% de A_{4} y \sim4% de A_{7}.

(c): Purificación: 10 g de mezcla de giberelina A_{3} y A_{4}/A_{7} como, como se ha mencionado anteriormente, se disolvieron en una mezcla de 15 mL de metanol que contenía 1 mL de H_{2}O, y 30 mL de acetona. La disolución se diluyó con 100 mL de acetato de etilo que contenían 10 mL de H_{2}O. Se filtró la mezcla. El filtrado se evaporó a vacío hasta un volumen de aproximadamente 80 mL. La mezcla se agitó y se calentó 60\sim80^{o}C durante 2\sim3 horas, entonces se enfrió a temperatura ambiente. Se filtró. Se lavó el sólido con acetato de etilo frío y se secó para dar giberelina A_{3} con >95% de pureza como un cristal blanco (6,3 g).

\quad: MS: 391 (M-1+2Na)^{+} 369 (M+23)^{+} 329 (M+1-H_{2}O)^{+}.

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Ejemplo 2 Preparación de sales y ésteres de giberelina A_{3}

(a): Preparación de sal sódica de giberelina A_{3}: se disolvió una disolución de 346 mg (1 mmol) de giberelina A_{3} en 1,5 mL de metanol, se añadió a una disolución de NaHCO_{3} (84 mg, 1 mmol) en 2 mL de H_{2}O. Se evaporó toda la mezcla a presión reducida hasta sequedad. Se disolvió entonces el residuo en agua (2 mL) y se secó por congelación para dar la sal sódica de giberelina A_{3} como un sólido blanco con un rendimiento cuantitativo.

(b): Preparación de sal de zinc de giberelina A_{3}: se disolvieron 100 mg de sal sódica de giberelina A_{3} en 10 mL de agua, entonces se pasaron a través de una columna (20 mL) Dowex 50 de resina en forma de ion zinc. Se lavó entonces la columna con 30 mL de H_{2}O. Se mezclaron el efluente y los lavados y se evaporaron a vacío hasta un volumen pequeño, entonces se secaron por congelación para dar la sal de zinc de giberelina A_{3} como un sólido blanco con un rendimiento cuantitativo.

(c): Preparación del éster etílico de giberelina A_{3}: se disolvieron 346 mg (1 mmol) de giberelina A_{3} en una mezcla de acetona (10 mL) y agua (0,2 mL). A la mezcla, a -20^{o}C, se le añadieron trietilamina (100 mg, 1 mmol), N-metilmorfolina (10 mg, 0,1 mmoles), cloroformiato de etilo (108 mg, 1 mmol). La mezcla se agitó a -15^{o}C durante 20 minutos, entonces se diluyó con etanol anhidro (10 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente toda la noche, después se evaporó a sequedad. El residuo se dividió entonces entre acetato de etilo (30 mL) y agua (5 mL). Se separó la capa orgánica y se lavó sucesivamente con HCI al 2% (5 mL), agua (5 mL), NaHCO_{3} al 5% (5 mL x 2), agua (5 mL), después se evaporó a presión reducida a sequedad para dar un sólido incoloro de éster etílico de giberelina A_{3} (319 mg, 85%) MS 375 (M+1)^{+}.

Ejemplo 3

(a): Efecto de la giberelina A3 en el crecimiento celular comparado con el EGF (por sus siglas en inglés, factor de crecimiento epidérmico) in vitro. Se realizaron experimentos de cultivo de células cutáneas humanas usando medios para queratinocitos. Cada pocillo se sembró con 1.500 células. La incubación se realizó a 37^{o}C durante un periodo de cinco días. El experimento se muestra a continuación:

2

(a): Los Experimentos 3.1 y 3.3 indicaron que el EGF (por sus siglas en inglés, factor de crecimiento epidérmico) es esencial para el crecimiento celular. El experimento 3.2 indicó que la presencia de EGF y giberelina A_{3} juntas no tenía efecto aditivo en la tasa de crecimiento celular. El experimento 3.4 dio indicios de que la giberelina A_{3} sola podía estimular el crecimiento celular tan eficazmente como el EGF.

(b): Efecto de la giberelina A3 comparada con el IGF en un cultivo celular que usaba IGF-1 sustituye el EGF para el experimento del cultivo celular mencionado en (a). Los resultados fueron similares al los resultados en (a).

Ejemplo 4

Se comparó el efecto en el crecimiento celular in vitro de una mezcla de giberelina A_{3} con giberelina A_{4} y/o A_{7} con el del IGF-1. Los resultados fueron similares a los del Ejemplo 3(b).

Ejemplo 5 Efecto de la giberelina A_{3} en ratas diabéticas Métodos

Se pesaron ratas Wistar macho (290 g \sim 330 g) y se anestesiaron ligeramente (halotano al 4%, 2:1 de O_{2}/N_{2}O) para poder medir los niveles de glucosa en sangre mediante una muestra de la vena de la cola, usando un medidor de glucosa Precisión Q.I.D. Se indujo entonces la diabetes mediante una única inyección en la vena de la cola de estreptozotocina (STZ, 60 mg/kg), que se disolvió inmediatamente antes de su uso en un tampón de citrato (ácido cítrico 50 mM y citrato trisódico 50 mM; pH 4,5). Se inyectó un volumen equivalente de tampón de citrato en ratas control de edades igualadas.

Las ratas se alojaron en grupos de dos durante el experimento. La temperatura de la jaula de los animales se mantuvo a 20ºC (\pm2ºC) con un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad, y se permitió a las ratas acceso libre a comida y agua.

Se obtuvo aprobación ética del Pharmacology Animal Ethics Committee para todos los experimentos.

Administración de medicamentos y protocolo de control diario

Cuarenta y ocho horas después de la administración de la STZ (60 mg/kg), se tomó una muestra de la glucosa en sangre y se consideraron diabéticos los animales con niveles de glucosa en sangre \geq16 mM. Las ratas se dividieron entonces al azar en grupos.

Se empleó insulina Lente Monotard, de actuación lenta, y la sal sódica de la giberelina A3 se preparó según se requería en agua destilada inmediatamente antes de su uso.

Las lecturas de los niveles de glucosa se obtuvieron dos o 5 horas después de la administración de fármaco(s) cada tres días. Los resultados se muestran a continuación:

3

Ejemplo 6 Efecto de giberelina A_{3} y una mezcla de A_{4}/A_{7} en ratas diabéticas

El protocolo de este experimento es el mismo que el del Ejemplo 5, pero se usó giberelina A_{3} y una mezcla de A_{4}/A_{7} en vez de giberelina A_{3}. Los resultados no fueron diferentes de los del Ejemplo 5.

Claims

1. El uso de un compuesto de Fórmula (1) y/o sus derivados farmacéuticamente aceptables en la fabricación de un agente antidiabético para uso en el tratamiento de la diabetes y una o más enfermedades relacionadas seleccionadas de obesidad, micro y macrovasculopatías, nefropatía, neuropatía y enfermedades oculares

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4

en la que

R^{5} es H o un grupo éster glicosílico (éster de glicósido), o ésteres de alquilo C_{1-20} sin sustituir o sustituidos, ésteres de alilo, ésteres de arilo, ésteres de arilalquilo, ésteres activos;

R^{8} es H, hidroxilo, mercaptano, o halógeno, amino, azida, N^{24}R^{25}, alquilo C_{1-20} sin sustituir o sustituido, alilo, arilo, o arilalquilo, u -OR^{27}, en el que R^{27} es un grupo éter glicosílico (éter de glicósido);

R^{9} es H u OH, o forma un enlace junto con R^{15} (un enlace C_{9}-C_{15});

R^{11} es H, u OH o no está presente;

R^{13} es metileno, o un heteroátomo divalente, o NR^{29}, en el que R^{29} es NHR^{30} u OR^{30} en los que R^{30} es H, o alquilo C_{1-20}, arilo, alquilarilo; y está presente un doble enlace entre C_{16} y R^{13} cuando R^{11} no está presente; o R^{13} es H, OH, CH_{3}, CHO, CH_{2}X, en el que X es halógeno; CHNR^{29} en el que R^{29} es NHR^{30} u OR^{30} en los que R^{30} es H, o alquilo C_{1-20}, arilo, alquilarilo cuando R^{11} es H u OH; con la condición de que cuando R^{11} es OH, R^{13} no es OH;

R^{14} es H u OH;

R^{15} es H, o forma un enlace junto con R^{9} (un enlace C_{9}-C_{15});

en el que los derivados farmacéuticamente aceptables se seleccionan de un grupo que consiste en lactonas, glicósidos, ésteres, ésteres activos y sales de la misma.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que las giberelinas son giberelina A3.

3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que la giberelina es una mezcla de giberelina A3 y giberelina A4 y/o giberelina A7.

4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los derivados farmacéuticamente aceptables son sales que incluyen sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos, sales de metales, y sales de amonio, o bases orgánicas.

5. El uso según la reivindicación 4, en el que las bases orgánicas son lidocaína, o NR^{16} R^{17} R^{18} R^{19} en los que R^{16}, R^{17}, R^{18}, R^{19}, que pueden ser o no el mismo, son hidrógeno, o grupos alquilo C_{1-20} sustituido o sin sustituir, alcanol, o arilo.

6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 5, en el que el agente antidiabético comprende además sustancias seleccionadas del grupo que consiste en insulina, sus fragmentos derivados, IGFs (por sus siglas en inglés, factores de crecimiento similares a la insulina), factores de crecimiento, y otros agentes antidiabéticos farmacéuticamente compatibles, o combinaciones de los mismos.

7. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 6, en el que el agente antidiabético se administra en combinación con otros agentes terapéuticos compatibles seleccionados del grupo que consiste en analgésicos, agentes antihipertensores, sedantes, hipnóticos, agentes reductores de lípidos, y agentes antiinfecciosos o combinaciones de los mismos.

8. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente antidiabético es para uso en el tratamiento de diabetes de tipo 1 y sus enfermedades relacionadas.

9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el agente antidiabético es para uso en el tratamiento de diabetes de tipo 2 y sus enfermedades relacionadas.

10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el agente antidiabético es para uso en el tratamiento de diabetes resistente a la insulina.

11. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el agente antidiabético comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el agente antidiabético es un medicamento adecuado para administración con un dispensador.

13. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el agente antidiabético comprende un compuesto de Fórmula (1) como ingrediente activo, junto con vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, en el que el agente es una composición de liberación lenta.

14. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el agente es para administración por vía oral.

15. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el agente es para administración por inhalación.

16. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el agente es para administración transdérmica.

17. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el agente es para inyección parenteral.

18. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el agente es para administración por vía tópica, rectal o vaginal.

19. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el derivado es una sal de sodio de Fórmula (1).

20. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el derivado es una sal de zinc de Fórmula (1).

21. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el derivado es un éster de etilo de Fórmula (1).

22. Un procedimiento para la preparación de giberelinas que incluye la giberelina A3, que incluye las etapas de:

(a): incubar una cepa de microorganismos productores de giberelina en un caldo de fermentación;

(b): ajustar el pH del caldo de fermentación a un pH de 6,5 a 7,0 y filtrar para obtener una torta de microorganismos micelio, y un filtrado;

(c): lavar la torta con agua y mezclar el lavado con el filtrado para formar una disolución acuosa;

(d): concentrar la disolución acuosa;

(e): mezclar la disolución acuosa con un disolvente orgánico a una temperatura de 5 a 10^{o}C y ajustar el pH de la mezcla a menos de 2,0;

(f): dejar la mezcla que se separe en una fase acuosa y una primera fase orgánica y retirar la primera fase orgánica;

(g): volver a extraer la fase acuosa de la etapa (f) con disolvente orgánico para obtener una segunda fase orgánica;

(h): mezclar la primera y segunda fases orgánicas y concentrar para formar una disolución orgánica concentrada;

(i): calentar, con agitación, a 60-70^{o}C durante 3 a 4 horas la disolución orgánica concentrada, hasta que cesa la precipitación de materia sólida;

(j): enfriar la disolución orgánica concentrada a temperatura ambiente y filtrar para obtener un precipitado;

(k): lavar el precipitado en disolvente orgánico frío y secar para obtener un sólido color hueso que contiene aproximadamente 80% de giberelina A3, aproximadamente 4% de giberelina A4 y aproximadamente 4% de giberelina A7.

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23. El procedimiento de la reivindicación 22, que comprende las etapas adicionales de:

(l): disolver el sólido de color hueso en una mezcla de 32,6% de metanol, 2,2% de agua y 65,2% de acetona para obtener una disolución de giberelina;

(m): diluir la disolución de giberelina con una mezcla 10:1 de disolvente orgánico y agua;

(n): filtrar la disolución diluida de giberelina y concentrar el filtrado por evaporación a vacío;

(o): calentar con agitación el concentrado a una temperatura de 60 a 80^{o}C durante 2 a 3 horas, enfriar a temperatura ambiente y filtrar para obtener un precipitado sólido cristalino;

(p): lavar el precipitado con disolvente orgánico frío y secar para obtener cristales de giberelina A3.

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24. Un procedimiento según la reivindicación 22, en el que la cepa de microorganismos productores de giberelina es Gibberella fujikuroi.

25. Un procedimiento según la reivindicación 22, en el que la concentración de la disoluciones en las etapas (d) y (h) se consigue usando evaporación a vacío.

26. Un procedimiento según la reivindicación 22 ó 23, en el que el disolvente orgánico es acetato de etilo.

27. Un procedimiento según la reivindicación 23, que comprende las etapas adicionales de:

(q): disolver la giberelina A3 en metanol;

(r): añadir la disolución de giberelina a una disolución acuosa equimolar de NaHCO_{3};

(s): evaporar las disoluciones mezcladas hasta sequedad para obtener un residuo sólido;

(t): disolver el residuo en agua y secar por congelación para obtener la sal sódica de la giberelina A3;

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28. Un procedimiento según la reivindicación 27, que comprende las etapas adicionales de disolver en agua la sal sódica de la giberelina A3, pasar la disolución a través de una columna cargada con una resina de intercambio iónico de zinc, lavar la columna con agua, recoger y mezclar el efluente y los lavados y eliminar el agua para obtener la sal de zinc de la giberelina A3.

29. Un procedimiento según la reivindicación 23, que comprende las etapas adicionales de:

(q): disolver la giberelina A_{3} en una mezcla con una relación 50:1 de acetona a agua;

(r): mezclar la disolución de giberelina A3 con cantidades equimolares de trietilamina y cloroformiato de etilo, y una cantidad décimo molar de N-metilmorfolina, y agitar a -15^{o}C durante 20 minutos;

(s): diluir la mezcla resultante con etanol anhidro y agitar a temperatura ambiente;

(t): evaporar la mezcla diluida hasta sequedad y dividir el residuo entre acetato de etilo y agua en una relación 6:1;

(u): separar la capa de acetato de etilo, lavar con HCl al 2%, seguido de agua, seguida de NaHCO_{3} al 5%, seguido de agua, y evaporar a presión reducida hasta sequedad para dar el éster etílico de la giberelina A3.