ES2302959T3

ES2302959T3 - Metodos para predecir elevacion del colesterol durante una terapia inmunodepresora.

Info

Publication number: ES2302959T3
Application number: ES03779798T
Authority: ES
Inventors: Sridhar Kudaravalli; Mihael Hristos Polymeropoulos; Rosarelis Torres; Curt Douglas Wolfgang
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2002-09-30
Filing date: 2003-09-29
Publication date: 2008-08-01
Anticipated expiration: 2023-09-29
Also published as: JP2006500930A; DE60319719T2; EP1549770A2; DE60319719D1; CN1685062A; AU2003287955B9; BR0314552A; AU2003287955B2; HK1084445A1; WO2004029618A3; US7732134B2; CN100453650C; PT1549770E; ATE389034T1; AU2003287955A1; CA2500979A1; EP1549770B1; US20100184798A1; IL167639A; JP4575775B2

Abstract

Un método in vitro para determinar el grado de elevación del colesterol en el suero que ocurrirá en un paciente durante el tratamiento con un medicamento inmunodepresor que comprende, determinar las dos copias del gen IL-1Beta presentes en el paciente la identidad de un par de nucleótidos seleccionado del grupo que consiste del par de nucleótidos en el sitio polimórfico -511 C --> T (en la posición 1423 de la secuencia X04500) del gen IL-1Beta, y asignarle al paciente un grupo de elevación de colesterol alto si ambos pares son AT, asignándole al paciente un grupo de elevación de colesterol intermedio si un par es AT y un par es GC y asignando al paciente a un grupo de elevación de colesterol bajo si ambos pares son GC; y el par nucleótido en el sitio polimórfico a -31 T --> C (posición 1903 de la secuencia X04500) del gen IL-1Beta, y asignarle al paciente un grupo de elevación de colesterol alto si ambos pares son CG, asignándole al paciente un grupo de elevación de colesterol intermedios si un par es AT y un par es GC y asignándole al paciente un grupo de elevación de colesterol bajo si ambos pares son AT.

Description

Métodos para predecir elevación del colesterol durante una terapia inmunodepresora.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención pertenece a los campos de la farmacología y la medicina y suministra métodos para determinar qué pacientes desarrollarán niveles elevados de colesterol en el suero durante el tratamiento con un fármaco inmunodepresor. En particular, ésta invención se relaciona con el uso de análisis genómico para identificar pacientes con riesgo de desarrollar niveles de colesterol altos durante terapia con un fármaco inmunodepresor y con métodos para determinar las estrategias de tratamiento óptimas para éstos pacientes.

Descripción de la técnica relacionada

Los fármacos inmunodepresores tienen muchas aplicaciones importantes en la medicina moderna. Estas drogas son utilizadas para inhibir el rechazo de órganos trasplantados, incluyendo corazones, pulmones y riñones para prolongar la vida útil del órgano trasplantado. Además, las drogas inmunodepresoras son utilizadas para tratar una amplia variedad de otras enfermedades tales como enfermedades auto-inmunes, miocarditis y artritis reumatoide. Sin embargo, los fármacos inmunodepresores tienen numerosos y algunas veces severos efectos colaterales que incluyen causar cáncer y linfomas y producir una variedad de efectos tóxicos sobre los órganos internos, tales como el riñón.

En razón a los efectos tóxico de los fármacos inmunodepresores, ha habido un gran esfuerzo para desarrollar alternativas menos tóxicas y para encontrar fármacos cuyo mecanismo de acción difiera de aquel de los otros fármacos inmunodepresores de tal forma que se puedan utilizar combinaciones sinérgicas con más pocos efectos colaterales totales.

Recientemente un antibiótico antifúngico, anti-tumoral e inmunodepresor denominado rapamicina (también conocido como sirolimus y RAPAMUNE^{TM}) se ha encontrado como efectivo para inhibir el rechazo de alo-injerto. La rapamicina tiene un mecanismo de acción que es única y marcadamente diferente de aquel de otros fármacos inmunodepresores. La rapamicina y sus derivados, tal como el everolimus (CERTICAN^{TM}) (RAD) actúa al inhibir las sendas bioquímicas involucradas en la progresión de la fase G1-S de las células T activadas de una manera independiente del Ca^{2+}. Ver Schuler et al., Transplantation, Vol. 64, pp. 36-42 (1997). De ésta manera, los derivados de la rapamicina tales como everolimus bloquea la transducción de la señal de citoquina en lugar de bloquear la producción de citoquinas en el caso de otros fármacos inmunodepresores, tales como las ciclosporina.

La rapamicina y sus derivados y el ácido micofenólico son fármacos inmunodepresores efectivos, sin embargo, en algunos pacientes la administración de estos fármacos se ha encontrado que origina la elevación del colesterol y los triglicéridos en el suero, es decir, hipercolesterolemia e hiperlipidemia. Ambas condiciones son factores de riesgo para la enfermedad de la arteria coronaria (CAD) y la aterosclerosis en general, especialmente en pacientes diabéticos.

La hipercolesterolemia misma, es una condición común y puede ser tratada varias clases principales de fármacos. Estos incluyen los inhibidores de HMG-CoA reductasa o las así llamadas estatinas, las resinas que se unen al ácido filial y el ácido nicotínico.

Radeau et al. (Nephron (2000) 84: 333-341) describe la evaluación de los efectos de un polimorfismo de TaqIB en el gen CETP (alelos B1, B2) sobre los niveles HDL-C en 78 receptores de trasplante renal macho que recibieron un tratamiento inmunodepresor.

El incrementos de los niveles del colesterol del suero durante el tratamiento con un fármaco inmunodepresor, tal como la rapamicina o sus derivados que incluyen, pero no están limitados a, everolimus (CERTICAN^{TM}) (RAD) o con ácido micofenólico, es un efecto colateral adverso serio. Esto es especialmente cierto para pacientes con trasplante de órgano en razón a que éstos pacientes requieren tratamiento de largo plazo (generalmente de toda la vida). El incremento en los niveles de colesterol en el suero varia ampliamente de paciente a paciente y antes de la presente invención no era posible predecir que pacientes desarrollarían éstos incrementos. Así, subsiste la necesidad de métodos para predecir que pacientes experimentaran elevaciones en el colesterol del suero cuando drogas inmunodepresoras, tales como la rapamicina y sus derivados o ácido micofenólico se administran a pacientes, especialmente durante uso de largo plazo.

Resumen de la invención

La presente invención soluciona este problema al suministrar un método para determinar el grado de elevación del colesterol en el suero que ocurrirá en un paciente durante el tratamiento con una medicación inmunodepresora que comprende, determinar para las dos copias del gen IL-1\beta presente en el paciente la identidad de un par de nucleótidos seleccionados del grupo que consiste del par de nucleótidos en el sitio polimórfico -511 C\rightarrowT (en la posición 1423 en la secuencia X04500) del gen IL-1\beta, y asignando al paciente a un grupo de elevación alta del colesterol si ambos pares son AT, asignando al paciente a un grupo de elevación de colesterol intermedio si uno de los pares es AT y un par es GC y asignando al paciente a un grupo de elevación baja del colesterol si ambos pares son GC; y el par de nucleótidos están el sitio polimórfico -31 T\rightarrowC (posición 1903 de la secuencia X04500) del gen IL-1\beta, y asignando al paciente a un grupo de la versión del colesterol alto si ambos pares son CG, asignando al paciente a un grupo de elevación de colesterol intermedia si un par es AT y un par es GC y asignando al paciente a un grupo de elevación baja del colesterol si ambos pares son AT.

Se describe además un método para tratar un paciente con un medicamento inmunodepresor que comprende: determinar para las dos copias del gen IL-1\beta presente en el paciente la identidad del par de nucleótidos en el sitio polimórfico -511 C\rightarrowT (posición 1423 de la secuencia X04500) del gen IL-1\beta; y tratar al paciente con un medicamento inmunodepresor si ambos pares son GC y utilizar un tratamiento alternativo si uno de los pares es AT y un par es GC y si ambos pares son AT. El medicamento inmunodepresor se puede seleccionar de la lista en la Tabla 2 y puede ser everolimus. Además el tratamiento alternativo puede comprender la adición de un medicamento que disminuye el colesterol escogido de la lista en la Tabla 1.

Además se describe un método para determinar el grado de elevación del colesterol en el suero el cual ocurrirá en un paciente durante el tratamiento con un medicamento inmunodepresor que comprende: determinar para las dos copias del gen IL-1\beta presentes en el paciente la identidad del par de nucleótidos en el sitio polimórfico -31 T\rightarrowC (posición 1903 de la secuencia X04500) del gen IL-1\beta; y asignar al paciente a un grupo de elevación del colesterol alto si ambos pares son CG, asignar al paciente a un grupo de elevación de colesterol intermedio si un par es AT y el otro par el GC y asignar al paciente a un grupo de elevación baja del colesterol si ambos pares son AT.

Además se describe un método para tratar un paciente con un medicamento inmunodepresor que comprende: determinar para las dos copias del gen IL-1\beta presente en el paciente la identidad del par de nucleótidos en el sitio polimórfico -31 T\rightarrowC (posición 1903 de la secuencia X04500) del gen IL-1\beta; y tratar al paciente con un medicamento inmunodepresor si ambos pares son AT y utilizar el tratamiento alternativo si un par el AT y un par el GC y si ambos pares son CG. El medicamento inmunodepresor se puede seleccionar de la lista en la Tabla 2 y puede ser everolimus. Además el tratamiento alternativo puede comprender la adición de medicación que baja el colesterol escogido del listado en la Tabla 1.

Además se describe un kit para determinar el par de nucleótido en el sitio polimórfico -511 en el gen IL-1\beta en un paciente que comprende: un recipiente que contiene por lo menos un reactivo específico para detectar la naturaleza del par de nucleótidos en el sitio polimórfico -511 del gen IL-1\beta; e instrucciones para opciones de tratamiento recomendadas con base en la naturaleza del dicho par de nucleótidos.

Además se describe un kit para determinar el par de nucleótidos en el sitio polimórfico -31 en el gen IL-1\beta en un paciente, que comprende: un recipiente que contiene por lo menos un reactivo específico para detectar la naturaleza del par nucleótido en el sitio polimórfico -31 del gen IL-1\beta; e instrucciones para opciones de tratamiento recomendadas con base en la naturaleza del dicho par de nucleótidos.

Además se describe un método para determinar el grado de elevación del colesterol en el suero que ocurrirá en un paciente durante el tratamiento con un medicamento inmunodepresor que comprende determinar, para las dos copias, que contienen el gen IL-1\beta, presentes en el paciente, el haplotipo con relación al gen IL-1\beta. El término "haplotipo con relación al gen IL-1\beta" se referirá al haplotipo que consiste de la combinación de los polimorfismos en la posición -511 y -31 del gen IL-1\beta. Al paciente le sería asignado un grupo de elevación de colesterol alto si ambos cromosomas contienen el haplotipo "colesterol alto" es decir T para C en el sitio -511 y C para T en el sitio -31 del gen IL-1\beta, y al paciente le sería asignado un grupo de elevación intermedia del colesterol si el cromosoma contiene el haplotipo "colesterol alto" y uno contiene el haplotipo " colesterol bajo" y el paciente sería asignado a un grupo de elevación baja de colesterol si ambos cromosomas contienen el haplotipo "colesterol bajo" es decir C en el sitio -511 y T en el sitio -31.

Además se describe un método para tratar un paciente con un medicamento inmunodepresor, que comprende determinar, para los dos cromosomas que contienen el gen IL-1\beta, presentes en el paciente, el haplotipo con relación al gen IL-1\beta, y tratar al paciente con un medicamento inmunodepresor si ambos cromosomas contienen el haplotipo "colesterol bajo" o si uno de los cromosomas contiene el haplotipo "colesterol bajo" y uno contiene el haplotipo "colesterol alto" y utilizar tratamiento alternativo si ambos cromosomas contienen el haplotipo "colesterol alto". El medicamento inmunodepresor se puede seleccionar de la lista en la Tabla 2 y puede ser everolimus. El tratamiento alternativo puede comprender la adición de medicamento que baje el colesterol escogido del listado en la Tabla 1.

Se suministran además métodos para determinar la identidad del par de nucleótidos en el sitio -511 y -31 del gen IL-1\beta en un paciente o el haplotipo del gen IL-1\beta en el paciente para encontrar los SNP en cualquier parte en el cromosoma que están en desequilibrio de enlace con el polimorfismo -511 o el polimorfismo -31 en el gen IL-1\beta y utilizar la relación del dicho SNP o los SNP para determinar la naturaleza del par de nucleótidos o el haplotipo de interés y utilizar ésta información para estimar la elevación del colesterol durante la terapia IM y para tomar decisiones de tratamiento.

Además se describe un kit para determinar la naturaleza del haplotipo del gen IL-1\beta que incluye; un recipiente que contiene por lo menos un reactivo específico para detectar la naturaleza del par nucleótido en el sitio polimórfico -511 del gen IL-1\beta; y un recipiente que contiene por lo menos un reactivo específico para detectar la naturaleza del par nucleótido en el sitio polimórfico -31 del gen IL-1\beta; e instrucciones para determinar el haplotipo de los resultados de lo anterior e instrucciones para opciones de tratamiento recomendadas con base en la naturaleza del haplotipo
indicado.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Niveles de colesterol total medio LS comparados con los genotipos (-511) IL-1\beta CC, CT o TT en todos los grupos de tratamiento combinados con el ensayo clínico RAD B251.

Figura 2: Niveles de colesterol total medios LS comparados con los genotipos (-31) IL-1\beta CC, CT o TT en todos los grupos de tratamiento combinados con el ensayo clínico RAD B251.

Figura 3: Niveles de colesterol HDL medios LS comparados con los genotipos (-511) IL-1\beta CC, CT o TT en todos los grupos de tratamiento combinados con el ensayo clínico RAD B251.

Figura 4: Niveles de colesterol HDL medios LS comparados con los genotipos (-31) IL-1\beta CC, CT o TT en todos los grupos de tratamiento combinados con el ensayo clínico RAD B251.

Figura 5: Niveles de colesterol LDL medios LS comparados con los genotipos (-511) IL-1\beta CC, CT o TT en todos los grupos de tratamiento combinados con el ensayo clínico RAD B251.

Figura 6: Niveles de colesterol LDL medios LS comparados con los genotipos (-31) IL-1\beta CC, CT o TT en todos los grupos de tratamiento dentro del ensayo clínico RAD B251.

Descripción detallada de la invención

La presente invención suministra métodos para determinar el grado de elevación del colesterol en el suero que ocurrirá en un paciente durante el tratamiento con un medicamento inmunodepresor (IM), tal como rapamicina y sus derivados.

En una modalidad, un paciente que es un candidato potencial para el tratamiento con un IM tendrá extracción de sangre para la determinación de la presencia de un polimorfismo, es decir, citoquina (C) \rightarrowtimina (T) en la posición del nucleótido -511 (en la región promotora sin cambio de aminoácido); esto es un cambio C\rightarrowT en la posición del nucleótido 1423 de la secuencia X04500, en las dos copias del gen interleuquina-1-beta (IL-1\beta) presente en el paciente. Si el par nucleótido en la posición -511 es AT en ambas copias del gen, entonces el paciente experimentara una alta elevación en los niveles del colesterol en el suero durante el tratamiento con un IM.

Si el par de nucleótidos en la posición -511 es AT en una copia y CG en la otra copia, entonces el paciente tendrá una elevación intermedia en los niveles del colesterol durante el tratamiento con un medicamento inmunodepresor.

Si el par nucleótido es GC en ambas copias en la posición -511, entonces el paciente tendrá una elevación baja en los niveles de colesterol del suero durante el tratamiento con un IM.

En otra modalidad, una determinación de que medicamento utilizar para tratar un paciente necesitado de tratamiento con un IM se basaría en los resultados en la determinación de la naturaleza de los pares de nucleótido en la posición -511 en el gen IL-1\beta presente en el paciente.

Si ambos pares de nucleótidos son GC entonces el paciente será tratado con un IM. Este medicamento inmunodepresor podría ser de aquellos mostrados en la Tabla 2, incluyendo rapamicina o uno de sus derivados, incluyendo, pero no estando limitado a, everolimus (Certican^{TM}) (RAD).

Si ambos pares de nucleótidos son AT o si un par es AT y el otro par el GC, entonces el paciente seria tratado con una medicación alternativa que no eleve los niveles de colesterol alternativamente el paciente sería tratado con una droga que disminuye el colesterol además del IM y los niveles del colesterol del paciente serian monitoreados durante el tratamiento. Esta droga que disminuye el colesterol, que se utilizaría en combinación con IM podría ser uno o más de los medicamentos escogidos de la lista en la Tabla 1 adelante.

En una modalidad adicional, un paciente que es un candidato potencial para el tratamiento con un IM tendría una muestra de sangre para la determinación de la presencia de un polimorfismo T\rightarrowC en la posición del nucleótido -31 (en la región promotora sin cambio de aminoácidos); esto es un cambio T\rightarrowC en la posición de nucleótido 1903 de la secuencia X04500 en las dos copias del gen IL-1\beta presentes en el paciente. Si el par de nucleótido en la posición -31 es un CG en ambas copias del gen, entonces el paciente experimentara una alta elevación en los niveles de colesterol en el suero durante el tratamiento con un IM. Si el par de nucleótido en la posición -31 es AT en una copia y CG en la otra copia, entonces el paciente tendrá una elevación intermedia en sus niveles de colesterol durante el tratamiento con un IM. Si el par de nucleótidos es AT en ambas copias en la posición -31, entonces el paciente tendrá una elevación baja en los niveles de colesterol en el suero durante el tratamiento con un IM.

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En otra modalidad, una determinación de que medicamentos utilizar para tratar un paciente necesitado del tratamiento con un IM se basaría en los resultados de la determinación de la naturaleza de los pares de nucleótidos en la posición -31 en el gen IL-1\beta presente en el paciente. Si ambos pares de nucleótidos son AT entonces el paciente seria tratado con un IM.

Este IM podría ser cualquiera de aquellos basados en la Tabla 2 incluyendo, pero no limitada a, rapamicina o uno de sus derivados incluyendo, pero no limitado a, everolimus (CERTICAN^{TM}) (RAD).

Si ambos pares de nucleótido son GC o si el par de nucleótido es AT en una copia y CG en la otra copia, entonces el paciente sería tratado con un medicamento alternativo que no elevara los niveles de colesterol alternativamente del paciente sería tratado con una droga que disminuyera el colesterol además del IM y los niveles de colesterol del paciente serían monitoreados durante el tratamiento. Este fármaco que disminuye el colesterol, que se utilizaría en combinación con el IM, podría ser uno o más de los medicamentos escogidos de la lista en la Tabla 1 de adelante.

La rapamicinas adecuadas para uso en los métodos de ésta invención son, por ejemplo, como se describió en las Patentes U.S Nos 3,929,992 y 5,258,389 y en la WO 94/09010 y la WO 01/60345.

TABLA 1 Agentes Antilipemicos (Drogas que Disminuyen el Colesterol)

1

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TABLA 2 Drogas Inmunodepresoras

2

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Se suministra el siguiente ejemplo con el propósito solamente de ilustración adicional y no pretende ser una limitación sobre la invención descrita.

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Ejemplo 1 El Estudio RAD B251 Diseño total del estudio

El estudio RAD B251 fue un estudio de grupo paralelo, aleatorizado, multicentro, doble-ciego, de la eficacia y seguridad del everolimus (Certican^{TM}) (RAD) versus el micofenolato mofetil (MMF) utilizado en combinación con ciclosporina (CsA) (NEORAL®) y prednisona. El estudio consistió de tres periodos: un periodo de selección, un periodo de línea Base y un periodo de Tratamiento doble-ciego. Luego de las evaluaciones de línea Base los pacientes que cumplieron con los criterios de inclusión/exclusión fueron aleatorizados en uno de los tres grupos de tratamiento (1:1:1) una vez que se había averiguado que el alo-injerto es funcional y que la medicación oral se puede tolerar (dentro de las 48 horas post-trasplante). La determinación de la fusión del alo-injerto fue de acuerdo con el juicio del investigador y se baso en la salida y evidencia de orina adecuadas de la caída de los niveles de creatinina. El día de la aleatorización y de la administración de la primera dosis del medicamento de estudio se registró como Día 1 del estudio. Los tres grupos de tratamiento se describen adelante:

\bullet Nivel de dosis 1:0.75 mg RAD bid + NEORAL® + prednisona

\bullet Nivel de dosis 2:1.5 mg RAD bid + NEORAL® + prednisona

\bullet Comparador: 1 g MMF bid + NEORAL® + prednisona

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Terapia Concomitante Iniciación y mantenimiento de NEORAL®

La administración de oral CsA (NEORAL®) se inició a 6-12 mg/kg/día p.o. y se ajustó para mantener un nivel de 12 horas bajo que refleja un rango de ensayo blanco estándar. La administración intravenosa (e.v.) del CsA se evitó a menos que se obligara por la situación clínica. Los niveles sanguíneos completos fueron llevados en los rangos terapéuticos listados adelante tan rápidamente como fuera posible. Una vez se lograra esto, las dosis del CsA se ajustaron solamente para mantener niveles sanguíneos bajo dentro de los rangos blanco.

\bullet Semanas 1-4:200-350 ng/mL

\bullet Meses 2-36:100-300 ng/mL

En los días cuando se sacó sangre para las mediciones CsA o RAD, el paciente recibió la dosis previa de NEORAL® y la medicación de estudio 12 \pm 1 hora antes de la extracción de la sangre. Los pacientes se les instruyo ajustar su programa de medicación el día previo a la extracción de la sangre para lograr un tiempo adecuado y se recibió el tiempo exacto de administración de la dosis nocturna. La medicación del estudio y el NEORAL® debidos en el día de la extracción de la sangre no fueron tomados por el paciente, sino fueron llevados por el clínico y tomados después de que se completo la extracción de la sangre.

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Prednisona

Inmediatamente antes del trasplante, los pacientes pudieron recibir hasta 1 g de metilprednisolona i.v. y luego hasta 500 mg de metilprednisolona i.v. 12 horas mas tarde. Tan pronto como fuera posible post-trasplante, la prednisona oral se inició a 0.35-2.0 mg/kg/día y disminuida con el fin de lograr una dosis de 20 mg/día, 0.25 mg/kg/día, el Día 30 y no menos de 5 mg/día durante los primeros seis meses.

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Profilaxis para Citomegalovirus (CMV)

La profilaxis CMV fue obligatoria para todos los casos en el cual las pruebas de donador fueron positivas y las pruebas de receptor negativas para CMV. El tratamiento con ganciclovir, globulina hiperinmune CMV o aciclovir se permitió y se administró de acuerdo con la práctica local. Todos los casos diferentes de los donadores positivos CMV a los receptores negativos CMV se trataron de acuerdo con la práctica local. Las profilaxis CMV también se recomendaron luego de cualquier tratamiento de anticuerpo de episodios de rechazo agudo.

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Profilaxis PCP

Todos los pacientes iniciaron con trimetoprim-sulfametoxazol, una concentraciones de una única tableta por día iniciando cuando la medicación oral se podría tolerar y continuando durante los primeros seis meses después del trasplante. Las dosis disminuyeron a discreción del investigador a una concentración de una única tableta 3 veces a la semana durante los segundos seis meses. El tratamiento después de un año fue de acuerdo con la práctica local. La pentamidina aerosolizada o dapsona se administró a pacientes incapaces de tolerar el trimetoprim-sulfametoxazol.

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Otra terapia concomitante

Ningún medicamento diferente a los fármacos del estudio, la profilaxis del estudio y los medicamentos usuales de los pacientes fueron dados durante el periodo de tratamiento completo del estudio, es decir, desde el día inicial de la selección hasta que todas las evaluaciones del estudio final se habían completado. Excepciones a ésta regla aplicaron solamente a medicamentos que fueron necesarios para tratar eventos adversos los (AE). Administración de cualquier medicamento adicional (incluyendo medicamentos y vitaminas sin prescripción médica) fueron documentados claramente en la forma del reporte del caso de medicamentos anteriores y concomitantes (CRF). Si se requería para un AE, los medicamentos concomitantes fueron claramente documentados y referenciados de manera cruzada sobre los AE CRF.

Todas las drogas inmunodepresoras diferentes de aquellas especificadas por el protocolo no fueron permitidas. La terapia antirrechazo permisible incluye metilprednisolona y terapia de anticuerpo anti-linfocito de acuerdo con las guías en "Treatment of Acute Rejection Episodes". Los pacientes que requieren tacrolimus o MMF para terapia de rescate se descontinúo del fármaco de estudio. La terfenadina, astemizol y cisaprida fueron prohibidos entre los pacientes estuvieron con medicación de estudio. El uso de fenobarbital, fenitoina, carbamazepina o quetoconazol fue fuertemente desanimado.

Un periodo de tratamiento de tres años luego del trasplante. Durante el periodo de Tratamiento de Doble-Ciego, los pacientes fueron vistos en los Días 7, 14 y 28 y en los Meses 2, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 y 36. Biopsias renales se requirieron en la línea Base (puede ser intra-operativa) y en el momento de cualquier sospecha de rechazo. La administración ciega del fármaco del estudio cesó a los 3 años.

Pacientes macho y hembra, 16-65 años de edad que se programaron para experimentar trasplante de riñón de donador no relacionado viviente o relacionado idéntico o no HLA cadavérico primario, se les permitió ingresar al estudio. Los pacientes que descontinuaron el estudio prematuramente no fueron reemplazados. Cada paciente tenia que cumplir todos esos criterios de inclusión/exclusión para ser elegibles para ingresar al estudio.

3

El estudio RAD B251 se designó para evaluar la seguridad y la eficacia de dosis orales de RAD comparadas con MMF en los receptores de trasplante renales de novo medidos mediante la incidencia de episodios de rechazo agudo de alo-injerto probados con biopsia, perdida de injerto o muerte. El MMF se escogió como el agente comparador en razón de su amplio uso en trasplante renal.

Análisis Farmacogenético

En un esfuerzo por identificar factores genéticos que estén asociados con niveles de colesterol lípido incrementados observados en pacientes tratados con everolimus (RAD), 47 polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) de 24 genes dentro del polidesoxirribonucleótido genómico (ADN) de pacientes que participan en los ensayos clínicos del RAD B251 fueron examinados. De los 47 SNP fueron examinados, 21 se determinaron experimentalmente que no eran polimórficos. De los 26 que eran polimórficos, dos SNP en el promotor del gen IL-1\beta en las posiciones (-511) y (-31) mostraron significancia estadística en relación con cambios en los niveles del colesterol en pacientes que participan en el ensayo clínico RAD B251.

Los pacientes que fueron homocigotos para la transición base del IL- 1\beta (-511) C\rightarrowT (T-T) o la transición base IL-1\beta (-31) T\rightarrowC (C-C) tuvieron los niveles medios menores más altos del colesterol total en su última visita sin importar el tratamiento recibido durante el estudio (p= 0.0018 y p= 0.0013 respectivamente). (Los valores en las figuras, etc, se refieren a los niveles absolutos de colesterol en el suero en la última visita, sin embargo durante el análisis estadístico este valor se definió como una variable dependiente y el nivel de colesterol en la línea base como una variable independiente tomando en consideración automáticamente así el nivel de línea base).

El incremento en los niveles totales de colesterol se debió tanto a los niveles crecientes de HDL como LDL: pacientes homocigotos para el alelo T en la posición (-511) o el alelo C en la posición (-31) tuvieron los niveles medios mínimos cuadrados mas altos de HDL (p= 0.0214 y p= 0.0514 respectivamente) y LDL (p=0.0159 y p=0.0091 respectivamente) en su última visita. De manera importante, sin embargo, las proporciones HDL o LDL permanecieron iguales sin importar el genotipo.

Por lo tanto, nuestros hallazgos sugieren que los individuos homocigotos para el alelo T en la posición (-511) y homocigotos para el alelo C en la posición (-31) del promotor del gen IL-1\beta pueden estar predispuestos a incrementos mayores en los niveles de colesterol sanguíneo luego del tratamiento con los regimenes de RAD/NEORAL® o MMF/NEORAL®.

Métodos Muestras

Un total de 82 muestras únicas del ensayo clínico de RAD B251 fueron sometidos a genotipo luego de su consentimiento para participar la evaluación farmacogénetica. Esto representa aproximadamente el 15% de la población total que participó en el ensayo clínico RAD B251. Las muestras sanguíneas de cada paciente fueron recolectadas en los sitios de ensayos individuales y luego embarcadas a Covance (Ginebra, Suiza). El ADN genómico de cada paciente se extrajo de la sangre por Covance utilizando el kit de aislamiento PURE-GENE^{TM} ADN (D-50k) (Gentra, Minneapolis, MN).

Sometido a genotipo

Un total de 47 polimorfismos únicos que corresponden a 24 genes fueron analizados para cada ensayo clínico. Los genes candidate involucrados en el metabolismo de la droga, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, inmunodepresión e inflamación fueron escogidos para este estudio. Los ensayos SNP fueron designados utilizando información proveniente de bases de datos publicas, tales como la OMIM, la SNP Consortium, Locus Link y dbSNP, y la Third Wave Technologies, Inc. (TWT, Madison, WI) sitio Web (http://64.73.25.65:8080/coe/index.jsp). La sonda resultante establecida para el ensayo de sometido a genotipo fueron generadas mediante TWT. Genotyping se desarrollaron con 60 ng de ADN genómico utilizando un ensayo INVADER® desarrollada por TWT (9-10) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ver Lyamichev et al., Nat. Biotechnol., Vol. 17, pp.292-296 (1999); y Ryan, Mol. Diagn., Vol. 4, pp. 135-144 (1999).

La reacción de cadena de polimerasa (PCR) para el (-511) IL-1\beta SNP se desarrollo en una reacción de 20 \muL que contiene: 10-70 ng de ADN genómico, 160 \muM de los dNTP, 10 mM de Tris-HCl [pH 8.3], 50 mM de KCl, 1.5 mM de MgCl_{2}, 0.6 \muM de IL-1\beta (-511)-cebador adelantado, 0.6\muM de cebador inverso IL-1\beta (-511) y 0.03 U Taq de ADN polimerasa (Applied Biosystems, Foster City, CA). Treinta y seis (36) rondas de amplificación fueron desarrolladas utilizando las siguientes condiciones: 94ºC, 30 segundos; 55ºC, 30 segundos; 72ºC, 30 segundos. Nueve muestras fueron entonces fraccionadas (5 \muL) sobre un gel de agarosa al 2% y visualizadas mediante teñido con bromuro de etidio para confirmar la amplificación. Una disolución 1:7 del producto PCR fue corrida contra TWT SNP # 128069 utilizando una placa biplex de 384 pozos para ADN amplificado.

La secuencia cebadoras fueron como sigue:

IL-1\beta (-511)- adelantada 5'-GCAGAGCTCATCTGGCATTG-3'	(SEQ ID No 1);

IL-1\beta (-511)-inversa 5'-TATGTGGGACAAAGTGGAAG-3'	(SEQ ID No 2).

El PCR para el (-31) IL-1\beta SNP se desarrollo en una reacción de 25 \muL que contiene: 1 ng de ADN genómico, 40 \muM de dNTP, 10mM de tris-HCl [pH 8.3], 50 mM de KCl, 1.5 mM de MgCl_{2}, 0.75 \muM de IL-1\beta (-31)-cebador adelantado, 0.75 \muM de IL-1\beta (-31)-cebador inverso y 0.15 U Gold Taq de ADN polimerasa (Applied Biosystems, Foster City, CA.). Treinta y ocho (38) rondas de amplificación se desarrollaron utilizando las siguientes condiciones: 94ºC, 30 segundos; 58ºC, 30 segundos; 72ºC, 30 segundos. Todas las muestras fueron entonces fraccionadas (5 \muL) sobre un gel de agarosa al 2% y fueron visualizadas mediante teñido con bromuro de etidio para confirmar la amplificación.

La secuencias iniciadoras fueron como sigue:

IL-1\beta (-31)- adelantada 5'-GCACAACGATTGTCAGGAAAAC-3'	(SEQ ID No 3);

IL-1\beta (-31)-inversa 5'- ATGCATACACACAAAGAGGCAG-3'	(SEQ ID No 4).

Una disolución 1:10 del producto PCR fue corrida contra TWT SNP # 274339 para RAD B251 utilizando una placa biplex de 384 pozos para ADN amplificado. El análisis RFLP se utilizó para determinar los genotipos utilizando una enzima de restricción Alu-I (New England Biolabs, Beverly, MA). Los digeridos de RFLP fueron desarrollados en una reacción de 20 \muL que contiene: 50 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgCl_{2}, 1 mM de DTT [pH 7.9], 8 ng de ADN genómico amplificado y 0.5 mM de la enzima Alu-I. Todas las muestras fueron encubadas durante 72 horas a 37ºC y luego fraccionadas (19 \muL) sobre un gel de agarosa al 3% y visualizada mediante teñido con bromuro de etidio para determinar el tamaño de la banda.

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Secuencia de nucleótido que circunda el polimorfismo (-511) IL- 1\beta

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Secuencia de nucleótido que circunda el polimorfismo (-31) IL- 1\beta

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Análisis estadístico

Un análisis de modelo de covariance se utilizó para el análisis del efecto del genotipo y el tratamiento sobre los niveles de colesterol utilizando un conjunto de datos clínicos de 24 meses de lab_b.sd2 RADB 251. Los términos en el modelo incluyen el nivel de colesterol final, el nivele de colesterol inicial como el covariante, y el genotipo y el tratamiento como los efectuadotes principales. Las proporciones de probabilidades, 95% de limites de confianza y un análisis Chi-square fueron calculados donde era aplicable. Todos los análisis estadísticos fueron desarrollados utilizando un software SAS 8.02. Para corregir las pruebas múltiples, se desarrollo el método de corrección Bonferroni.

Resultados

En el estudio RAD B251, 47 SNP únicos que corresponden a 24 genes fueron sometidos a genotipo para cada paciente que consintió con los análisis farmacogeneticos participando en el ensayo clínico de RAD B251. Una comparación de los pacientes que consintieron con los análisis farmacogeneticos en la distribución de pacientes tratar para cada ensayo clínico respectivo se muestra en la Tabla 3.

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TABLA 3 RAD B251: Distribución de las Muestras Farmacogéneticas Comparadas con las Muestras de Ensayo Clínico Total

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Solamente una diferencia estadísticamente significativa se encontró entre la población de pacientes que utilizo el estudio farmacogenetico comparado con la población de pacientes total en el ensayo clínico RAD B251: la diferencia es los valores TGC medios entre la población de pacientes farmacogeneticos y la población de pacientes totales RAD B251 se encontraron que era estadísticamente significativa (p<0.001). Esta comparación sugiere por lo tanto que la población de pacientes utilizada en el estudio farmacogenetico es representativa de la población de pacientes total ensayada en cada ensayo. De los 47 SNP que fueron probados en este estudio, 21 se determinaron experimentalmente por no ser polimórficos. Por lo tanto, 26 SNP fueron utilizados en el análisis descrito adelante.

Análisis estadístico de los genotipos con el grupo de ensayos clínicos de RAD B251 identificado un polimorfismo dentro del promotor del gen IL-1\beta en la posición (-511) que tuvo un asocio significativo con niveles de colesterol. Como se mostró en la Tabla 4 y la Figura 1, el genotipo IL-1\beta (-511) (T-T) en pacientes provenientes de ambos grupos de tratamiento se correlacionaron juntos con los incrementos mas altos en los niveles del colesterol total medidos en su última visita (p=0.0018).

TABLA 4 Niveles de colesterol total medio LS (mg/dL) mediante los genotipos (-511) IL-1\beta CC, CT o TT y los grupos de tratamiento dentro del ensayo clínico RAD B251

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Se observó un asocio similar para el genotipo IL-1\beta (-31) (C-C) (p=0.0013) (Tabla 5 y Figura 2)

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TABLA 5 Niveles de colesterol total medio (mg/dL) mediante los genotipos (-31) IL-1\beta CC, CT, o TT y los grupos de tratamiento dentro del ensayo clínico RAD B251

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Para analizar ésta correlación adicionalmente, se probó si existía asociación entre los genotipos IL-1\beta (-511) y los niveles de HDL y LDL. Como se mostró en la Figura 3 y en la Tabla 6, el genotipo IL-1\beta (-511) (T-T) en pacientes de ambos grupos de tratamiento correlacionados juntos con los niveles mas altos de HDL medido en su última visita (P =0.0214).

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TABLA 6 Niveles HDL medios LS (mg/dL) mediante los genotipos (-511) IL-1\beta CC, CT o TT y los grupos de tratamiento dentro del ensayo clínico RAD B251

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Se reporto previamente que el polimorfismo IL-1\beta (-511) está en un desequilibrio de enlace fuerte con otro polimorfismo en el promotor IL-1\beta en la posición (-31). Ver El-Omar et al., Nature, Vol. 404, pp. 398-402 (2000). En este estudio, 254 alelos fueron probados en pacientes que consintieron con el análisis farmacogenético en el ensayo clínico RAD B251. Esto se reporto en el polimorfismo IL-1\beta (-511) y (-31) están en desequilibrio de enlace en 99.2%. Por lo tanto, podría ocurrir una asociación similar con el polimorfismo IL-1\beta (-511) y los niveles de colesterol se podrían detectar como con el polimorfismo IL-1\beta (-31). El análisis estadístico para los datos clínicos del RAD B251 ajustado al polimorfismo IL-1\beta (-31) identifico una asociación significativa con los niveles de colesterol. Como se mostró en la Tabla 5 y en la Figura 2, el genotipo IL-1\beta (-31) (C-C) en pacientes de ambos grupos de tratamiento se correlacionaron juntos con el incremento mas alto en los niveles de colesterol total medidos en su ultima visita (P=0.0013). Para analizar ésta correlación adicionalmente, se probó si existía asociación entre el IL-1\beta (genotipo -31) y los niveles de HDL y LDL. Como se mostró en la Tabla 4 y en la Tabla 7, el genotipo IL-1\beta (-31) (C-C) en pacientes de ambos grupos de tratamiento juntos se correlacionaron débilmente con los niveles mas altos de HDL medidos en su última visita (P =0.0514).

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TABLA 7 Niveles HDL medios LS (mg/dL) mediante los genotipos (-31) IL-1\beta CC, CT o TT y los grupos de tratamiento dentro del ensayo clínico RAD B251

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Se identificó una correlación similar con los niveles LDL también (p=0.0159, Figura 5 y Tabla 8).

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TABLA 8 Niveles LDL medios LS (mg/dL) mediante los genotipos (-511) IL-1\beta CC, CT o TT y los grupos de tratamiento dentro del ensayo clínico RAD B251

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Una correlación más fuerte se identifico con los niveles LDL y el polimorfismo -31 IL-1\beta (p=0.0091, Figura 6 y Tabla 9).

TABLA 9 Niveles LDL medios LS (mg/dL) por los genotipos (-31) IL-1\beta CC, CT o TT y los grupos de tratamiento dentro del ensayo clínico RAD B251

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De manera importante, las proporciones de HDL a LDL permanecieron sin cambio entre los grupos de genotipo. Los hallazgos presentados en el estudio predecirían una mayor probabilidad de individuos con un cierto alelo para experimentar incremento persistente en los niveles de colesterol luego del tratamiento con el régimen RAD/NEORAL® que los individuos que no poseen el alelo. Una tendencia similar se identificó en individuos tratados con el régimen MMF/NEORAL®, pero los resultados no cumplieron la significancia estadística p= 0.05.

En razón a que los niveles totales de colesterol en la sangre \geq240 mg/dL son considerados generalmente como excesivamente elevados, se decidió por lo tanto determinar las proporciones probables para un paciente con el polimorfismo IL-1\beta (-511) o IL-1\beta (-31) para encontrar un incremento en los niveles de colesterol total de la sangre que resulta en una concentración final de \geq240 mg/dL después de ser tratado con los regimenes de RAD/NEORAL® o MMF/NEORAL®. Ver, Cecil Textbook of Medicine, Goldman and Bennett, editors, Saunders, 6^{th} Edition (2000).

Como se muestra en la Tabla 10 adelante, las proporciones probables indican que los pacientes son 5.67 (95% limites de confianza: 1.20-9.01) veces más probable que tenga un incremento en los niveles de colesterol total a una concentración final de \geq240 mg/dL cuando se trata con un régimen de RAD/NEORAL® si ellos contienen una posición T a T (-511) en el promotor del gen IL-1\beta, o 7.23 (95% de limites de confianza: 1.20-9.01) veces más probable que tenga un incremento en los niveles colesteroles totales a una concentración final de \geq240 mg/dL cuando se trata con un régimen de RAD/NEORAL® si ellos contienen una C en la posición (-31) en el promotor del gen IL-1\beta. Estos hallazgos son estadísticamente significativos (p=0.0207 y p=0.0096, respectivamente) y se podrían utilizar como una medida precauterativa en el tratamiento de pacientes de trasplante con el régimen RAD/NEORAL® en razón a que la hipercolesterolemia es fácilmente tratable.

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TABLA 10 Proporciones probables para los genotipos (-511) y (-31) IL-1\beta y niveles de colesterol

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Corrección Bonferroni para pruebas múltiples

Se requiere un factor de corrección debido al número de los SNP que se analizaron en este estudio. Para hacerlo así, se desarrollo el método de corrección de Bonferroni que dicta un valor p de 0.0019.

Bonferroni= Insertar Fórmula

\eta = número RAD _de_pruebas

Por lo tanto, el hallazgo entre los polimorfismos IL-1\beta (-511) y IL-1\beta (-31) y los niveles de colesterol total (p=0.0018 y p=0.0013, respectivamente) es aun considerado como significativo.

Desequilibrio de enlace de los SNP (-511) y (-31) IL-1\beta

Se ha reportado que el polimorfismo IL-1\beta (-511) C\rightarrowT está en fuerte desequilibrio de enlace (99.5%) con otro polimorfismo dentro del promotor IL-1\beta localizado en la posición (-31) que resulta en una transición base T\rightarrowC. Ver El- Omar et al., Nature, Vol. 404, pp. 398-402 (2000). Por lo tanto, se predice que los pacientes con una T en la posición (-511) del promotor IL-1\beta tendrían una C en la posición (-31). Este hallazgo se confirma en los pacientes probados en esos dos ensayos. En el gen IL-1\beta tipo silvestre, T se encuentra en la posición -31. Esta T es muy importante para la expresión de IL-1\beta porque ésta es parte de una secuencia de caja TATA (TATAAAA) que juega un papel crítico en la iniciación transcripcional del IL-1\beta. En general, las secuencias de la caja TATA están involucrados en reclutar y ubicar la maquinaria transcripcional en la posición correcta dentro de los genes para asegurar que la transcripción inicia en el lugar correcto. El polimorfismo T\rightarrowC en la posición (-31) dañaría ésta importante secuencia de caja TATA (TATAAAA a CATAAAA), inactivando y prohibiendo así la iniciación eficiente de la transcripción del gen IL-1\beta. La falta de unión de la maquinaria transcripcional a ésta secuencia de caja TATA IL-1\beta alterada se ha mostrado. Ver El-Omar, supra.

Por lo tanto, la existencia de cualquier otro polimorfismo que este en desequilibrio de enlace con el polimorfismo dentro del promotor IL-1\beta (localizado en la posición (-31) que da como resultado una transición base T\rightarrowC) o el polimorfismo localizado en -511 (C\rightarrowT) y el promotor IL-1\beta, tendría un efecto predictivo sobre el grado de elevación del colesterol esperado en un paciente durante el tratamiento con un IM. Los medios para la determinación de otros polimorfismos que están en desequilibrio de enlace con el polimorfismo (-31) bien conocida por un experto en la técnica. Tal polimorfismo, ahora conocido o descubierto en el futuro, se podría utilizar en los métodos de ésta invención para predecir el grado o probabilidad de elevación del colesterol en pacientes tratados con un IM o para ayudar a determinar las selecciones de tratamiento para tales pacientes.

Significado biológico de los hallazgos

El genotipo IL-1\beta (-31) (C-C) tiene relevancia clínica. El IL-1\beta ha mostrado que exhibe biosíntesis de colesterol del 25%. Ver El-Omar et al., supra. Por lo tanto, el resultado de este polimorfismo significaría que los pacientes con el genotipo IL-1\beta (-31) (C-C) que corresponde a genotipo IL-1\beta (-511) (T-T), disminuiría los niveles de IL-1\beta, perdiendo de ésta manera la inhibición de la biosíntesis del colesterol mediante IL-1\beta, dando como resultado niveles elevados de colesterol en la sangre. Este tipo de hallazgo se observó en el ensayo RAD B251. Como se muestra en las tablas 4 y 5 en las Figuras 1-2, los pacientes con el genotipo IL-1\beta (-511) (T-T) y el genotipo IL-1\beta (-31) (C-C) tuvieron los niveles medios mínimos cuadrados más altos del colesterol total, sin importar el tratamiento.

También se ha reportado que el IL-1\beta incrementa la expresión del gen receptor LDL a través de la activación de las quinasas reguladas por la señal extracelular (ERK). Ver Kumar et al., J. Biol. Chem., Vol. 273, pp. 15742-15748 (1998).

Las elevaciones en la expresión del receptor LDL darían como resultado un incremento en la cantidad del colesterol que se internaliza en las células, disminuyendo de ésta manera los niveles de colesterol total en la sangre. Esto tiene relevancia al RAD (everolimus) en razón a que ésta droga ha mostrado que inhibe las sendas bioquímicas que se requieren para la progresión celular a través del G1 tardío y la entrada en S. De manera importante, los ERK han mostrado que están involucrados en este proceso. Por lo tanto, es posible que la actividad ERK se disminuya mediante everolimus. En razón a que el everolimus inhibiría la actividad ERK, la expresión del receptor LDL disminuiría en todos los pacientes, independientemente de la expresión IL-1\beta, originando de ésta manera niveles crecientes de LDL y así de colesterol total en pacientes que toman everolimus. Es improbable que el everolimus inhiba completamente la activación ERK. Por lo tanto, los pacientes con los genotipos IL-1\beta (-511) (T-T) y IL-1\beta (-31) (C-C) serian capaces de inducir alguna expresión de receptor LDL. Sin embargo, aquellos pacientes que tienen niveles muy bajos de IL-1\beta, y por lo tanto menos expresión del receptor LDL, resultarían de ésta manera en menores cantidades de colesterol que son internalizadas dentro de las células y niveles de colesterol sanguíneo elevado. Esta explicación contaría así para los niveles superiores o más altos de colesterol observados en pacientes con el genotipo IL-1\beta (-31) (C-C). De manera significativa pacientes con el genotipo IL-1\beta (-511) (T-T) que corresponden al genotipo IL-1\beta (-31) (C-C), tuvieron niveles significativamente más elevados de LDL (p=0.0159) comparados con los pacientes con otros genotipos IL-1\beta (Figura 3 y Tabla 4).

Identificación y caracterización de los SNP

Se pueden utilizar muchas técnicas diferentes para identificar y caracterizar los SNP incluyendo una conformación de análisis de polimorfismo de conformación de cadena simple, análisis heteroduplex mediante la desnaturalización de la cromatografía líquida de alto desempeño (DHPLC), secuenciación de ADN directo y métodos computacionales. Ver Shi, Clin. Chem., Vol. 47, pp. 164-172 (2001). Gracias a la riqueza de la información de la secuencia en las bases de datos publicas, las herramientas computacionales se pueden utilizar para identificar los SNP in silico al alinear independientemente secuencias presentadas para un gen dado (secuencias de cADN genomicas). La comparación de los SNP obtenida experimentalmente mediante métodos in silico mostró que 55% de los candidatos SNP se encontraron mediante un SNPFinder (http://lpg-ws.nci.nih.gov:82/perl/snp/snp_cgi.pl) también se han descubierto experimentalmente. Ver, Cox et al., Hum. Mutal., Vol. 17, pp. 141-150 (2001). Sin embargo, estos métodos in silico podrían solamente encontrar 27% de los SNP reales.

Los métodos de tipeo de SNP más comunes habitualmente incluyen la hibridación, la extensión del cebador y los métodos de clivaje. Cada uno de estos métodos se debe conectar a un sistema de detección apropiado. Las tecnologías de detección incluyen polarización fluorescente, (Ver Chan et al., Genome Res., Vol. 9, pp. 492-499 (1999)), detección luminométrica y liberación de pirofosfato (piro-secuenciación), (ver Ahmadiian et al., Anal. Biochem., Vol. 280, pp. 103-110 (2000)), los ensayos de clivaje basados en (FRET) transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, DHPLC, y espectrometría de masa (ver Shi, Clin. Chem., Vol. 47, pp. 164-172 (2001) y la Patente U.S No 6,300,076 B1). Otros métodos para detectar y caracterizar los SNP son aquellos descritos en la Patente U.S No 6,297,018 B1 y 6,300,063 B1.

En una modalidad particularmente preferida la detección del polimorfismo se puede lograr por medio de la así llamada tecnología INVADER^{TM} (disponibles de Third Wave Technologies Inc. Madison, Wl). En este ensayo, un oligonucleótido "invasor" corriente arriba específico y una sonda corriente abajo parcialmente traslapante forma juntas una estructura específica cuando se une a una plantilla de ADN complementaria. La estructura se reconoce y se corta en un sitio específico mediante la enzima clivasa, y este da como resultado la liberación de la aleta 5' del oligonucleótido sonda. Este fragmento sirve entonces como el oligonucleótido "invasor" con respecto a los blancos secundarios sintéticos y a las sondas de señal fluorescentemente marcadas contenidas en la mezcla de reacción. Esto da como resultado el clivaje específico de las sondas de señal secundarias mediante la enzima de clivasa. La señal de fluorescencia se genera cuando ésta sonda secundaria, marcada con moléculas de tinte capaces de transferencia de energía de resonancia fluorescencia, se clivan. Las clivasas tienen requisitos estrictos con relación a la estructura formada por las secuencias de ADN traslapante o aletas y puede, por lo tanto, ser utilizadas para detectar específicamente no coincidencias de pares bases simples inmediatamente corriente arriba del sitio de clivaje sobre la cadena de ADN corriente abajo. Ver Ryan et al., Molecular Diagnosis, Vol. 4, No 2, pp. 135-144 (1999); y Lyamichev et al., Nat. Biotechnol., Vol. 17, pp. 292-296 (1999); ver también las Patentes U.S Nos. 5,846,717 y 6,001,567.

En algunas modalidades, una composición contiene dos o más oligonucleótidos sometidos a genotipo diferentemente marcados para sondear simultáneamente la identidad de los nucleótidos en dos o más sitios polimórficos. También se contempla que las composición cebadoras puedan contener dos o más grupos de pares cebadores específicos de alelo para permitir el apuntamiento de amplificación simultanea de dos o más regiones que contiene un sitio polimórfico.

Los oligonucleótidos que genotipean el IL-1\beta de la invención también se pueden inmovilizar sobre o sintetizar sobre una superficie sólida tal como un microchip, micro esfera o deslizador de vidrio (ver, por ejemplo, WO 98/20020 y WO 98/20019). Tales oligonucleótidos sometidos a genotipo inmovilizados se pueden utilizar en una variedad de ensayos de detección de polimorfismo, que incluyen pero no están limitados a sondear los ensayos de extensión de hibridación y polimerasa. Los oligonulceótidos que genotipean el IL-1\beta inmovilizado de la invención pueden comprender un arreglo ordenado de oligonucleótidos diseñado para seleccionar rápidamente una muestra de ADN para polimorfismos en genes múltiples al mismo tiempo.

El cebador del oligonucleótidos específico de alelo de la invención tiene un nucleótido 3' terminal, o preferiblemente un nucleótidos 3' penúltimo, que es complementario a solamente un nucleótido de un SNP particular, actuando de ésta manera como un cebador para la extensión mediada por polimerasa solamente si el alelo que contiene ese nucleótido está presente. Los cebadores de oligonucleótido específicos del alelo hibridan a la cadena codificante o no codificante se contemplan por la invención. Un cebador ASO para detectar los polimorfismos del gen IL-1\beta se podrían desarrollar utilizando técnicas conocidas por aquellos expertos en el arte.

Otros oligonucleótidos de sometidos a genotipo de la invención hibridan a una región blanco localizada uno a varios nucleótidos corriente abajo de uno de los sitios polimórficos novedosos identificados aquí. Tales oligonucleótidos son útiles en métodos de extensión de cebador mediados por polimerasa para detectar uno de los polimorfismos novedosos descritos aquí y por lo tanto tales oligonucleótidos de sometido a genotipo se denominan aquí como "oligonucleótidos de extensión de cebador". En una modalidad preferida, el terminal 3' del oligonucleótido de extensión de cebador es un desoxinucleótido complementario al nucleótido localizado inmediatamente adyacente al sitio polimórfico.

En otra modalidad, la invención suministra un kit que comprende por lo menos dos oligonucleótidos de sometido a genotipo empacados en recipientes separados. El kit también puede contener otros componentes tales como un amortiguador de hibridación (donde los oligonucleótidos van hacer utilizados como una sonda) empacados en un recipiente separado. Alternativamente, donde los oligonucleótidos van hacer utilizados para amplificar una región blanco, el kit puede contener, empacados en recipientes separados, una polimerasa y un amortiguador de reacción optimizado para la extensión cebadora mediada por la polimerasa, tal como PCR. Las composiciones de oligonucleótido anteriormente descritas y los kit son útiles en métodos para realizar genotipos y/o haplotipos el gen IL-1\beta en un individuo.

Como se utiliza aquí, el término "haplotipo con relación al gen IL-1\beta" se referirá al haplotipo que consiste de la combinación de los polimorfismos en la posición -511 y la -31 del gen IL-1\beta y estos haplotipos se deben denominar de la siguiente manera; el haplotipo se debe denominar "colesterol alto" si tanto el polimorfismo C como T en el sitio polimórfico -31 del gen IL-1\beta (posición 1903 de la secuencia X04500) están presentes en una copia del gen IL-1\beta. Por el contrario, el haplotipo se debe denominar "colesterol bajo" si ambos de éstos polimorfismos no están presentes en una copia del gen IL-1\beta y por lo tanto el nucleótido en el sitio -31 de este gen IL-1\beta es un T y el nucleótido en el sitio -511 es un C en este gen IL-1\beta en el cromosoma a que nos referimos.

Una modalidad del método de sometido a genotipo involucra aislar del individuo una mezcla de ácido nucleico que comprende las dos copias del gen IL-1\beta, o un fragmento de este, que están presentes en el individuo, y determinar la identidad del par nucleótido en uno o más de los sitios polimórficos en las dos copias para asignar un genotipo IL-1\beta a los individuos. Como se entenderá fácilmente por el experto, las dos "copias" de un gen en un individuo pueden ser el mismo alelo o pueden ser diferentes alelos. En una modalidad particularmente preferida, el método de genotipo comprende determinar la identidad del par de nucleótido en cada sitio polimórfico.

Típicamente, la mezcla de ácido nucleico o proteína se aísla de una muestra biológica tomada del individuo, tal como una muestra de sangre o una muestra de tejido. Las muestras de tejido adecuadas incluyen sangre total, semen, saliva, lagrimas, orina, materia fecal, sudor, muestras bucales, piel, y biopsias de tejidos de órganos específicos, tales como tejidos musculares o nerviosos y pelo. La mezcla de ácido nucleico puede estar comprendida de un ADN genómico, un poligorribonucleótido mensajero (mARN), o cADN y, en los dos últimos casos, la muestra biológica se debe obtener de un órgano en el cual se expresa el gen IL-1\beta. Adicionalmente, se debe entender por el experto que las preparaciones de mARN o cADN no se utilizarían para detectar polimorfismos localizados en intrones, y en regiones no trascritas 5' y 3' o en regiones promotoras. Si un fragmento del gen IL-1\beta se aísla, este debe contener el o los sitios polimórficos hacer sometidos a genotipo.

Una modalidad del métodos para obtener haplotipos comprende aislar de los individuos una molécula de ácido nucleico que contiene solamente una de las dos copias del gen IL-1\beta, o un fragmento de este, que está presente en el individuo y determinar en ésta copia la identidad del nucleótido en uno o más de los sitios polimórficos en esa copia para asignar un haplotipo IL-1\beta al individuo. El ácido nucleico se debe aislar utilizando un método capas de separar las dos copias del gen o fragmento y IL-1\beta, que incluye pero no están limitados a, un método descrito anteriormente para preparar los isogenes IL-1\beta, con clonación in vivo blanco que es la aproximación preferida.

Como se apreciará fácilmente por aquellos expertos en la técnica, cualquier clon individual solamente suministrará información del haplotipo sobre uno de las dos copias del gen IL-1\beta presentes en un individuo. Si la información del haplotipo se desea para los individuos otras copias, clones IL-1\beta adicionales se requerirán examinar. Típicamente, por lo menos cinco clones se deben examinar para tener más del 90% de probabilidad de realizar haplotipos ambas copias del gen IL-1\beta en un individuo. En una modalidad particularmente preferida, el nucleótido de cada sitio polimórfico se identifica.

En una modalidad preferida, el par del haplotipo IL-1\beta se determina para un individuo al identificar la secuencia de fase de los nucleótidos en uno o más de los sitios polimórficos en cada copia del gen IL-1\beta que está presente en el individuo. En una modalidad particularmente preferida, el método de obtención de haplotipos comprende identificar las secuencias de fase de los nucleótidos en cada sitio polimórficos o en cada copia del gen IL-1\beta. Cuando se someten a la obtención de haplotipos ambas copias del gen, la etapa de identificar se desarrolla preferiblemente en cada copia del gen que es colocado en unos recipientes separados. Sin embargo, también se prevé que si las dos copias se marcan con diferentes etiquetas, o de otra manera separadamente distinguibles o identificables, podría ser posible en algunos casos desarrollar un método en el mismo recipiente. Por ejemplo, si primeras y segundas copias del gen son marcadas con diferentes primeras y segundos tintes fluorescentes, respectivamente, y el oligonucleótido específico de alelo marcado con aun un tercer tinte fluorescente diferente se utiliza para ensayar en el o los sitios polimórficos, entonces detectar una combinación de los primeros y terceros tintes identificarían el polimorfismo en la primer copia del gen mientras se detecta una combinación del segundo y los terceros tintes identificaría el polimorfismo en la segunda
copia del gen.

En ambos métodos de genotipificación y haplotipificación, la identidad de un nucleótido (un par de nucleótidos) en el o los sitios polimórficos se puede determinar al amplificar el o las regiones blanco que contienen el o los sitios polimórficos directamente de una o ambas copias del gen IL-1\beta, o fragmento de este, y la secuencia de el o las regiones amplificadas determinadas mediante métodos convencionales. Se apreciaran fácilmente por el experto en la técnica que los mismos nucleótidos se detectaran dos veces en un sitio polimórfico en individuos que son homocigotos en ese sitio, mientras dos diferentes nucleótidos se detectaran si los individuos son heterocigotos para ese sitio. El polimorfismo se puede identificar directamente, conocidos como la identificación tipo positiva, o mediante inferencia, denominada como identificación tipo negativo. Por ejemplo, donde un SNP es conocido por ser guanina y citoquina en una población de referencia, un sitio puede ser positivamente determinado para ser guanina o citoquina para todos los individuos homocigotos en ese sitio, o ambos guanina y citosina, si el individuo es heterocigoto en ese sitio. Alternativamente, el sitio puede ser negativamente determinado por no ser guanina (y así citosina/citosina) o no citoquina (y así guanina/guanina).

Además, la identidad de el o los alelos presentes en cualquiera de los sitios polimórficos novedosos descritos aquí se puede determinar indirectamente al genotipificar un sitio polimórfico no descrito aquí que está en desequilibrio de enlace con el sitio polimórfico que es de interés. Dos sitios se dicen que están en desequilibrio de enlace si la presencia de una variante particular en un sitio mejora la predecibilidad de otra variante en el segundo sitio. Ver Stevens, Mol. Diag., Vol. 4, pp. 309-317 (1999). Los sitios polimórficos en desequilibrio de enlace con los sitios polimórficos actualmente descritos se pueden localizar en regiones del gen o en otras regiones genómicas no examinadas aquí. El genotipificación de un sitio polimórfico en desequilibrio de enlace con los sitios polimórficos novedosos descritos aquí se pueden desarrollar mediante, pero no están limitados a, ninguno de los métodos anteriormente mencionado para detectar la identidad del alelo en un sitio polimórfico.

El o la región blanco se puede amplificar utilizando cualquier método de amplificación dirigida por oligonucleótido, incluyendo pero no limitado a la cadena de reacción de polimerasa (PCR) (Patente U.S No 4,965,188), reacción de cadena de ligasa (LCR) (ver Barany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 189-193 (1991); y WO 90/01069), y el ensayo de ligación de oligonucleótido (OLA) (ver Landegren et al., Science, Vol. 241, pp. 1077-1080 (1988)). Los oligonucleótidos útiles como cebadores o sondas en tales métodos deben hibridizar específicamente una región del ácido nucleico que contiene o está adyacente al sitio polimórfico. Típicamente, los oligonucleótidos tienen entre 10 y 35 nucleótidos de longitud y preferiblemente, entre 15 y 30 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, los oligonucleótidos tienen 20-25 nucleótidos de largo. La longitud exacta del oligonucleótido dependerá de muchos factores que son rutinariamente considerados y practicados por el experto en la técnica.

Otros procedimientos y amplificación de ácido nucleico conocidos se pueden utilizar para amplificar la región blanco que incluye sistemas de amplificación basados en trascripción (ver Patentes U.S Nos. 5,130,238 y 5,169,766; EP 329, 822; y WO 89/06700) y los métodos de isoterma. Ver Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp. 392-396 (1992).

Un polimorfismo en la región blanco también se puede ensayar antes o después de la amplificación utilizando uno de varios métodos basados en hibridación conocidos en la técnica. Típicamente, los oligonucleótidos específicos de alelo se utilizan para desarrollar tales métodos. Los oligonucleótidos específicos de alelo pueden ser utilizados como diferentes pares de sonda marcados, con un miembro del par que muestra una coincidencia perfecta a una variante de una secuencia blanco y el otro miembro que muestra una perfecta coincidencia a una variante diferente. En algunas modalidades, más de un sitio polimórfico se puede detectar de una vez utilizando un conjunto de pares de oligonucleótidos u oligonucleótido específico de alelo. Preferiblemente, los miembros del conjunto tienen temperatura de fundición dentro de los 5ºC y más preferiblemente dentro de los 2ºC, uno del otro cuando se hibridan a cada uno de los sitios polimórficos que son detectados.

La hibridación de un oligonucleótido específico de alelo a un oligonucleótido blanco se puede desarrollar con ambas entidades en solución o tal hibridación se pueden desarrollar cuando el oligonucleótido o el oligonucleótido blanco se fijan covalentemente o no covalentemente a un soporte sólido. La unión se puede mediar, por ejemplo, mediante interacciones de anticuerpo-antígeno, poli-L-Lys, estreptavidina o avidina-biotina, puentes de sal, interacción hidrófobas, enlaces químicos, horneado de reticulación UV, etc. Los oligonucleótidos específicos de alelo se pueden sintetizar directamente sobre el soporte sólido o unir al soporte sólido subsecuente a la síntesis. Los soportes sólidos adecuados para uso en los métodos de detección de la invención incluyen substratos hechos de silicio, vidrio, plástico, papel y similares, que se pueden formar, por ejemplo, en pozos (como en placas de 96 pozos), laminillas, láminas, membranas, fibras, chips, platos y micro-esferas. El soporte sólido se puede tratar, recubrir o derivar para facilitar la inmovilización de los oligonucleótidos específico de alelo o un ácido nucleico blanco.

El genotipo o haplotipo para el gen IL-1\beta de un individuo también se puede determinar mediante la hibridación de una muestra nucleica que contiene una o ambas copias del gen a arreglos o sub-arreglos de ácido nucleico tal como se describió en la WO 95/11995. Los arreglos contendrían una batería de oligonucleótidos específicos de alelo que representan cada uno de los sitios polimórficos hacer incluidos en el genotipo o haplotipo.

La identidad de los polimorfismos también se puede determinar utilizando una técnica de detección de falta de coincidencia, incluyendo pero no estando limitados al método de protección de RNasa utilizando ribosondas (ver Winter et al., proa. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p. 7575 (1985); y Meyers et al., Science, Vol. 230, p. 1242 (1985)) y proteínas que reconocen las tasas de coincidencia de nucleótido, tales como la proteína mutS de E. coli. Ver Modrich, Ann. Rev. Genet., Vol. 25, pp. 229-253 (1991). Alternativamente, los alelos variantes se pueden identificar mediante un análisis de polimorfismo de conformación de cadena única (SSCP) (ver Orita et al., Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989); y Humphries et al., Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Elles, Ed., pp. 321-340 (1996)) o denaturalización de gradiente por electrofóresis de gel (DGGE). Ver Wartell et al., Nucl. Acids Res., Vol. 18, pp. 2699-2706 (1990); y Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, pp. 232-236 (1989).

Un método de extensión de cebador mediado por polimerasa también se puede utilizar para identificar el o los polimorfismos. Varios de tales métodos se han descrito en la literatura de Patentes y científica e incluyen el método "Genetic Bit Analysis" (WO 92/15712) y el análisis de bit genéticos mediados por ligasa/polimerasa (Patente U.S No 5,679,524). Los métodos relacionados se describen en la WO 91/02087, WO 90/09455, WO 95/17676, las Patentes U.S Nos. 5,302,509 y 5,945,283. Los cebadores extendidos que contienen un polimorfismo se pueden detectar mediante espectrometría de masa como se describió en la patente U.S No 5,605,798. Otro método de extensión de cebador es el PCR específico de alelo. Ver Ruafio et al., Nucl. Acids Res., Vol. 17, p. 8392 (1989); Ruafio et al., Nucl. Acids Res., Vol. 19, pp. 6877-6882 (1991).

WO 93/22456; y Turki et al., J. Clin. Invest., Vol. 95, pp. 1635-1641 (1995). Además, múltiples sitios polimórficos se pueden investigar al amplificar simultáneamente múltiples regiones del ácido nucleico utilizando conjuntos de cebadores específicos de alelo como se describen en Wallace et al. (WO 89/10414).

En una modalidad preferida, los datos de frecuencia del haplotipo para cada grupo etnogeográfico se examina para determinar si este es consistente con el equilibrio Hardy-Weinberg (ver Hartl et al., Principles of Population Genomics, Sinauer Associates, 3rd Edition, Sunderland, MA (1997), postula que la frecuencia del hallazgo del par haplotipo H_{1}/H_{2} es igual a P_{H-W} (H_{1}/H_{2} ) = 2_{p}(H_{1}) p(H_{2}) si H_{1} # H_{2} y P_{H-W} (H_{1}/H_{2} ) = p(H_{1}) p(H_{2} ) si H_{1} = H_{2}. Una diferencia estadísticamente significativa entre las frecuencias del haplotipo observadas y esperadas se podrían deber a uno o más factores que incluyen a crianza significativa en un grupo de población, presión selectiva fuerte sobre el gen, errores de muestreo, y/o errores en el proceso de gentipiado. Si se observan grandes desviaciones del equilibrio Hardy-Weinberg en un grupo etnogeográfico, el número de individuos en ese grupo se puede incrementar para ver si la desviación es debida a errores de muestreo. Si un tamaño de muestra mayor no reduce la diferencia entre las frecuencias pares del haplotipo observado y esperado, entonces uno podría desear considerar haplotipiar el individuo utilizando un método de haplotipeo directo tal como, por ejemplo, en la tecnología CLASPER System^{TM} (Patente U.S No 5,866,404), SMD o PCR de rango largo específico de alelo. Ver Michalotos-Beloin et al., Nucl. Acids res., Vol. 24, pp. 4841-4843 (1996).

En una modalidad de este método para predecir un par de haplotipo IL-1\beta, la etapa de asignación involucra desarrollar el siguiente análisis. Primero, cada posible pares de haplotipo se comparan con los pares de haplotipo en la población de referencia. En general, solamente uno de los pares de haplotipo en la población de referencia coincide con un par de haplotipo posible y ese par se asigna al individuo. De manera ocasional, solamente un haplotipo representado en los pares de haplotipo de referencia es consistente con un par de haplotipo posible para un individuo, y en tales casos al individuo se le asigna un par haplotipo que contiene el haplotipo conocido y un nuevo haplotipo derivado al sustraer el haplotipo conocido del par haplotipo posible. En caso tales, ningún haplotipo en la población de referencia es consistente con los pares de haplotipos posibles o alternativamente, múltiples pares de haplotipo de referencia son consistentes dentro de los pares de los haplotipo posibles. En tales casos, los individuos son preferiblemente haplotipeados utilizando un método de haplotipeo molecular directo tal como, por ejemplo, la tecnología CLASPER System^{TM} (Patente U.S No 5,866,404), SMD o PCR de rango largo específico de alelo. Ver Michalotos-Beloin et al., supra.

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Glosario

Alelo: Una forma particular de un gen o una secuencia de ADN en un sitio cromosómico específico (locus).

Anticuerpos: Incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, quiméricos, de cadena simple, y anticuerpos humanizados, así como también fragmentos Fab, que incluyen los productos del Fab u otra librería de expresión de inmunoglobulina.

Gen candidato: Un gen del cual se tiene la hipótesis de que es responsable por una enfermedad, condición, o la respuesta a un tratamiento, o por estar correlacionado con uno de éstos.

Genotipo completo: La secuencia 5' o 3' sin fase de pares de nucleótido encontrados en todos los sitios polimórficos conocidos en un locus sobre un par de cromosomas homólogos en un individuo único.

Haplotipo completo: Las secuencias 5' a 3' de los nucleótidos encontrados en todos los sitios polimórficos en un locus o en un cromosoma único de un individuo único.

Gen: Un segmento de ADN que contiene toda la información para la biosíntesis regulada de un producto de ARN, que incluye promotores, exones, intrones y otras regiones no traducidas que controlan la expresión.

Genotipo: Una secuencia 5' a 3' sin fase del o los pares de nucleótidos encontrados en uno o más sitios polimórficos en un locus sobre un par de cromosomas homólogos en un individuo. Como se utiliza aquí, el genotipo incluye un genotipo full y/o un sub-genotipo como se describe adelante.

Sometido a genotipo: Un proceso para determinar el genotipo de un individuo.

Haplotipo: Una secuencia 5' a 3' de los nucleótidos encontrados en uno o más sitios polimórficos ligados en un locus sobre un cromosoma único de un individuo único.

Datos de haplotipo: Información que se relaciona con uno o más de lo siguiente para un gen específico: un listado de pares de haplotipo en cada individuo en una población; un listado de diferentes haplotipos en una población; frecuencia de cada haplotipo en ese u en otras poblaciones, y cualquier asociación conocida entre uno o más haplotipos y un rasgo.

Par haplotipo: Dos haplotipos encontrados en un locus en un individuo único.

Haplotipiado: Un proceso para determinar uno o más haplotipos en un individuo e incluye el uso de pedigrís familiares, técnicas moléculas y/o inferencia estadística.

Homologo: Un término genérico utilizado en la técnica para indicar una secuencias de polinucleótido o polipéptido que posee un alto grado de relación de secuencia a una secuencia de referencia. Tal relación se puede cuantificar al determinar el grado de identidad y/o similitud entre las dos secuencias y se definirá anteriormente. Dentro de este término genérico caen los términos "ortólogo" y "paralogo".

Identidad: Una relación entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más secuencias de polinucleótido, determinadas al comparar las secuencias. En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido de las dos secuencias de polinucleótidos o las dos secuencias de polipéptido, respectivamente, sobre la longitud de las secuencias hacer comparadas.

Isoforma: Una forma particular de un gen, mARN, cADN o la proteína codificada de ésta manera, que se distingue de las otras formas por su secuencia particular y/o estructura.

Isogen: Una de las isoformas de un gen encontrado en una población. Un isogen contiene todos los polimorfismos presentes en una isoforma particular del gen.

Aislado: Como se aplica a una molécula biológica, tal ARN, ADN, oligonucleótido o proteína; aislada significa que la molécula es sustancialmente libre de otras moléculas biológicas, tales como ácido nucleicos, proteínas, lípidos, carbohidratos, u otro material, tal como desechos celulares o medios de crecimiento. En general, el término "aislado" no pretende referirse a una ausencia completa de tal material o a una ausencia de agua, amortiguadores, o sales, a menos que ellos estén presentes en cantidades que interfieran sustancialmente con los métodos de la presente invención.

Enlace: Describe la tendencia de los genes hacer heredados juntos como resultado de su localizaron sobre el mismo cromosoma; medido mediante recombinación porcentual entre los locus.

Desequilibrio de enlace: Describe una situación en la cual ocurren las combinaciones del marcador genético más o menos frecuentemente en la población de lo que se esperaría de su distancia de separación. Esto implica que un grupo de marcadores ha sido coordinadamente heredado. Esto puede dar como resultado la recombinación reducida en la región o de un efecto encontrador, en el cual habido un tiempo insuficiente para alcanzar el equilibrio en razón a que uno o más marcadores se introdujo en la población.

Locus: Una localización sobre un cromosoma o una molécula de ADN que corresponde a un gen o a una característica física o fenotípica.

Bases modificadas: Incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales, tales como inosina. Una variedad de modificaciones se puede hacer al ADN y al ARN; así, el polinucleótido abarca formas química, enzimática, o metabolitamente modificadas de polinucleótidos como se encuentran típicamente en la naturaleza, así como también formas químicas del ADN y ARN característico de virus y células. El polinucleótido también abarca polinucleótidos relativamente cortos, a menudo denominados como oligonucleótidos.

De ocurrencia natural: El término utilizado para designar ese objeto es aplicado a, por ejemplo, polinucleótidos o polipéptidos de ocurrencia natural, se pueden aislar de una fuente en la naturaleza y que no han sido intencionalmente modificados por el hombre.

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Par nucleótido: Los nucleótidos encontrados en un sitio polimórfico sobre las dos copias del cromosoma de un individuo.

Ortólogo: Un polinucleótido o polipéptido que es el equivalente funcional del polinucleótido o polipéptido en otras especies.

Paralogo: Un polinucleótido o polipéptido que están entre las mismas especies que es funcionalmente similar.

Enfase: Se aplica a una secuencia o pares de nucleótido de dos o más sitios polimórficos en un locus, en fase significa la combinación conocida de dos nucleótidos presentes en aquellos sitios polimórficos sobre una copia única de locus.

Sitio polimórfico (PS): Una posición dentro de un locus en la cual por lo menos dos secuencias alternativas se encuentran en una población, la más frecuente de las cuales tiene una frecuencia del más 99%.

Variante polimórfica: Un gen, mARN, cADN, polipéptido o péptido cuya secuencia de nucleótido o aminoácidos varia de una secuencia de referencia debido a la presencia de un polimorfismo en el gen.

Polimorfismo: Cualquier variante de la secuencia presente en una frecuencia de >1% en una población. La variación de la secuencia observada en un individuo en un sitio polimórfico. Los polimorfismos incluyen sustituciones de nucleótidos, inserciones, supresiones, o microsatélites y pueden, pero no necesitan, dar como resultado diferencias detectables en la expresión del gen o la función de la proteína.

Datos de polimorfismo: Información que se relaciona con uno o más de lo siguiente para un gen específico: localización de sitios polimórficos; variación de secuencia en aquellos sitios; frecuencia de polimorfismos en una o más poblaciones; los diferentes genotipos y/o haplotipos determinados por el gen; frecuencia de uno o más de esos genotipos y/o haplotipos en una o más poblaciones; cualquier asociaciones conocidas entre un rasgo y un genotipo o un haplotipo para el gen.

Base de datos de polimorfismo: Una recolección de datos de polimorfismos dispuestos de una manera sistemática y-o metódica y capas de ser individualmente acezada mediante medios eléctricos u otros.

Polinucleótido: Cualquier ARN o ADN que puede ser un ARN o ADN no modificado o modificado. Los polinucleótidos incluyen, sin limitación, ADN de cadena simple y doble, el ADN que es una mezcla de regiones de cadena simple y doble, ARN de cadena simple y doble, y ARN que es una mezcla de regiones de cadena simple y doble, moléculas hibridas que comprende ADN y ARN que pueden ser de cadena simple o, más típicamente, o de cadena doble o una mezcla de regiones de cadena simple y doble. Además, el polinucleótido se refiere a regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN o ambos ARN y ADN. El término polinucleótido también incluye los ADN o ARN que contienen uno o más de las bases modificadas y los ADN o ARN con estructuras modificadas para la estabilidad o por otras razones.

Polipéptido: Cualquier polipéptido que comprende dos o más aminoácidos unidos uno al otro mediante uniones de péptido o uniones de péptido modificadas, es decir, isoésteres de péptido. El polipéptido se refiere a ambas cadenas cortas, comúnmente denominadas como pépticos oligopéptidos u olígomeros, o cadenas más largas, generalmente denominadas como proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes de aminoácidos codificados por 20 genes. Los polinucleótidos incluyen secuencia de aminoácido modificadas por procesos naturales, tales como procesamiento post-transduccional, o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en el arte. Tales modificaciones se describen bien en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como también en voluminosa literatura de investigación.

Grupo de población: Un grupo de individuos que comparte una característica común tal como origen etnogeográfico, condición médica, respuesta a un tratamiento etc.

Población de referencia: Un grupo de sujetos o individuos que se predicen que son representativos de uno o más características del grupo de población. Típicamente, la población de referencia representa la variación genética en la población con un nivel de incertidumbre de por lo menos el 85%, preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95% y aun más preferiblemente por lo menos 99%.

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Polimorfismo de Nucleótido {}\hskip0.3cm Único (SNP): La ocurrencia de la variabilidad del nucleótido en una posición de nucleótido única en el genoma, dentro de una población. Un SNP puede ocurrir dentro de un gen o dentro de regiones intergénicas del genoma. Los SNP se pueden ensayar utilizando amplificación específica de alelo (ASA). Para el proceso por lo menos se requieren 3 cebadores. Un primer cebador se utiliza en complemento inverso al polimorfismo que es ensayado. Este cebador común puede tener 50 a 1500 bp desde la base polimórfica. Los otros dos (o más) cebadores son idénticos el uno al otro excepto que la base 3' se bambolea para coincidir con uno de los dos (o más) alelos que configuran el polimorfismo. Dos (o más) reacciones PCR son entonces conducidas sobre el mismo ADN, cada uno utilizando el cebador común en uno de los Cebadores Específicos de Alelo.

Variante de empalme: Moléculas de cADN producidas de moléculas de ARN inicialmente transcritas de la misma secuencia de ADN genómico pero que han sufrido de empalme de ARN alternativo. El empalme de ARN alternativo ocurre cuando un trascripto de ARN primario sufre el empalme, generalmente para la remoción de intrones, que resultan en la producción de más de una molécula de mARN cada una de las cuales puede codificar diferentes secuencias de aminoácido. El término "variante de empalme" también se refiere a las proteínas codificadas por las moléculas de ADN anteriores.

Sub-fenotipo: La secuencia 5' a 3' sin fase de los nucleótidos vistos en un sub-conjunto de los sitios polimórficos conocidos en un locus sobre un par de cromosomas homólogos en un individuo único.

Sub-haplotipo: La secuencia 5' a 3' de los nucleótidos vistos en un sub-conjunto de los sitios polimórficos conocidos en un locus sobre un cromosoma único de un individuo único.

Sujeto: Un individuo humano cuyo genotipo o haplotipo o respuesta al tratamiento o estado de enfermedad se debe determinar.

Tratamiento: Un estimulo administrado internamente o externamente a un sujeto.

Sinfase: Como se aplica a una secuencia de pares de nucleótido para dos o más sitios polimórficos en un locus, sinfase significa la combinación de nucleótidos presentes en aquellos sitios polimórficos sobre una copia simple de locus que no es conocida. Ver también Human Molecular Genetics, 2nd edition. Tom Strachan y Andrew P.Read. John Wiley y Sons, Inc. Publication, New York, 1999.

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Referencias citadas

La discusión de las referencias aquí pretende simplemente resumir las aseveraciones hechas por sus autores y no se hace admisión de que ninguna referencia constituye en técnica anterior.

La presente invención no debe estar limitada en términos de las modalidad particulares descritas en ésta solicitud, que pretenden ser simples ilustraciones de aspectos individuales de la invención. La presente invención estará solo limitada en los términos de las reivindicaciones finales.

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<110> Sridar Kudaravalli

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Rosarelis Torres

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Curt Wolfgang

\hskip1cm

Mihael Polymeropoulos

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Novartis AG

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<120> Métodos para predecir colesterol

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Elevaciones durante terapia de inmunosupresión

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<130> 4-32702A/USN

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<150> US 60/415 123

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<151> 2002-09-30

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<160> 8

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<170> FastSEQ for Windows versión 4.0

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<210> 1

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<400> 1

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gcagagctca tctggcattg

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<210> 3

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<210> 4

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<400> 4

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atgcatacac acaaagaggc ag

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<210> 5

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<211> 55

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<212> ADN

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<213> Homo Sapien

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<210> 6

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<211> 55

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<212> ADN

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<213> Homo Sapien

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ctgcaattga cagagagctc ctgaggcaga gaacagcacc caaggtagag accca

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<210> 7

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<211> 63

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<212> ADN

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<213> Homo Sapien

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tcctacttct gcttttgaaa gccataaaaa cagcgaggga gaaactggca gataccaaac

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<212> ADN

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Claims

1. Un método in vitro para determinar el grado de elevación del colesterol en el suero que ocurrirá en un paciente durante el tratamiento con un medicamento inmunodepresor que comprende, determinar las dos copias del gen IL-1\beta presentes en el paciente la identidad de un par de nucleótidos seleccionado del grupo que consiste del par de nucleótidos en el sitio polimórfico -511 C\rightarrowT (en la posición 1423 de la secuencia X04500) del gen IL-1\beta, y asignarle al paciente un grupo de elevación de colesterol alto si ambos pares son AT, asignándole al paciente un grupo de elevación de colesterol intermedio si un par es AT y un par es GC y asignando al paciente a un grupo de elevación de colesterol bajo si ambos pares son GC; y el par nucleótido en el sitio polimórfico a -31 T\rightarrowC (posición 1903 de la secuencia X04500) del gen IL-1\beta, y asignarle al paciente un grupo de elevación de colesterol alto si ambos pares son CG, asignándole al paciente un grupo de elevación de colesterol intermedios si un par es AT y un par es GC y asignándole al paciente un grupo de elevación de colesterol bajo si ambos pares son AT.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además:

a): determinar, para las dos copias de los cromosomas que contiene el gen IL-1\beta, presentes en el paciente, el haplotipo que consiste de la combinación del polimorfismo en la posición -511 y el polimorfismo en la posición -31 del gen IL-1\beta y,

b): asignar al paciente a un grupo de elevación de colesterol alto si ambas dichas copias contienen un haplotipo "colesterol alto" y,

c): asignar al paciente a un grupo de elevación de colesterol intermedio si una de dichas copias contiene el haplotipo "colesterol alto" y uno contiene el haplotipo "colesterol bajo" y,

d): asignar al paciente a un grupo de elevación de colesterol bajo si ambas copias contiene el haplotipo "colesterol bajo".

3. El método de las reivindicaciones precedentes en donde el proceso para determinar la identidad del par de nucleótidos o el haplotipo comprende encontrar los SNP en cualquier parte en el dicho cromosoma que están en desequilibrio de enlace con el polimorfismo -511 o el polimorfismo -31 en el gen IL-1\beta y utilizar la relación de dicho SNP o los SNP para determinar la naturaleza del par de nucleótidos o el haplotipo de interés.

4. Uso de un inmunodepresor en combinación con una medicación que disminuye el colesterol para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente con una elevación de colesterol en el suero inducida por el inmunodepresor asociada con un polimorfismo en un gen IL-1\beta, en donde el polimorfismo se selecciona del grupo que consiste de un sitio polimórfico -511 C\rightarrowT (posición 1423 de la secuencia X04500) del gen IL-1\beta, en un sitio polimórfico -31 T\rightarrowC (posición 1903 de la secuencia X04500) del gen IL-1\beta,los polimorfismos se determinan para dos copias del gen IL-1\beta; y en donde el paciente tiene, si el sitio polimórfico es -511 C\rightarrowT, un par que es AT y un par que es GC, o ambos pares que son AT; o si el sitio polimórfico es -31 T\rightarrowC un par que es AT y un par que es GC, o si ambos pares que son CG.

5. El uso de la reivindicación 4, en donde el inmunodepresor se selecciona del grupo que consiste de rapamicina (sirolimus RAPAMUNE^{TM}), Everolimus (CERTICAN^{TM}) (RAD), ácido Micofenólico y Micofenolato Mofetil (CELLCEPT^{TM}) (MMF), Azatioprina (IMURAN^{TM}), Ciclosporina (NEORAL^{TM}), y Tacrolimus (PROGRAF^{TM}).

6. El uso de la reivindicación 4, en donde el inmunodepresor es everolimus.

7. El uso de las reivindicaciones 4, 5 o 6, en donde el medicamento que disminuye el colesterol se selecciona del grupo que cosiste de Colestipol (COLESTID^{TM}), Clofibrate (ATROMID-S^{TM}), Gemfibrozil (LOPID^{TM}), Fenofibrato (TRICOR^{TM}), Fluvastatina (LESCOL^{TM}), Atorvastatina (LIPITOR^{TM}), Lovastatina (MEVACOR^{TM}), Pravastatin (PRAVACOL^{TM}), Simvastatina (ZOCOR^{TM}), y Niacina (NIASPAN^{TM}).

8. El uso de un kit para determinar la elevación del colesterol en el suero en una muestra, dicho kit comprende:

a) un recipiente que contiene por lo menos un reactivo específico para detectar la naturaleza del par nucleótido en un sitio polimórfico en un gen IL-1\beta seleccionado del grupo que consiste del sitio polimórfico -511 del gen IL-1\beta, y

b) el sitio polimórfico -31 del gen IL-1\beta; y Instrucciones para opciones de tratamiento recomendadas con base en la naturaleza de dicho par nucleótido.

9. Uso de la reivindicación 8, dicho kit comprende además instrucciones para determinar la naturaleza del haplotipo del gen IL-1\beta de los resultados del kit anterior y las instrucciones para las opciones de tratamiento recomendadas con base en la naturaleza del haplotipo indicado.