ES2301284B1 - DEVICE AND IMPROVEMENT PROCEDURE FOR QUANTITATIVE ANALYSIS IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS. - Google Patents

Abstract

Dispositivo y procedimiento de mejora para el análisis cuantitativo en electroforesis capilar.Improvement device and procedure for quantitative analysis in capillary electrophoresis.

Se propone el empleo de un nuevo procedimiento para mejorar el análisis cuantitativo en electroforesis capilar. Para ello se utiliza la información proporcionada por el perfil de corriente eléctrica (PCE) suministrado por cualquier equipo comercial durante el análisis. Se demuestra que este procedimiento mejora considerablemente la precisión y exactitud del análisis cuantitativo en electroforesis capilar sin necesidad de modificaciones estructurales de los equipos. Se reivindica un procedimiento de mejora para el análisis cuantitativo en electroforesis capilar caracterizado por aprovechar la información del perfil de corriente eléctrica (PCE) facilitado por los equipos comerciales. Esta reivindicación es extendida a todos los modos de electroforesis capilar, incluyendo electroforesis capilar a intensidad (o potencia) constante, electrocromatografía y electroforesis capilar en chips. La invención es de aplicación principalmente en el área de instrumentación analítica, así como en sus áreas de uso (sector químico, farmacéutico, clínico y alimentario).The use of a new procedure is proposed to improve quantitative analysis in capillary electrophoresis. For this, the information provided by the profile of electric current (PCE) supplied by any equipment commercial during the analysis. It is shown that this procedure considerably improves the accuracy and accuracy of the analysis quantitative in capillary electrophoresis without the need for structural modifications of the equipment. A claim is claimed improvement procedure for quantitative analysis in capillary electrophoresis characterized by taking advantage of the information of the electric current profile (PCE) provided by the equipment commercial. This claim is extended to all modes of capillary electrophoresis, including capillary electrophoresis a constant intensity (or power), electrochromatography and capillary electrophoresis in chips. The invention is applicable mainly in the area of analytical instrumentation, as well as in its areas of use (chemical, pharmaceutical, clinical and food).

Description

Dispositivo y procedimiento de mejora para el análisis cuantitativo en electroforesis capilar.Improvement device and procedure for quantitative analysis in capillary electrophoresis.

Sector de la técnicaTechnical sector

Instrumentación analítica (análisis químico) aplicable entre otros en el sector químico, farmacéutico, clínico y alimentario.Analytical instrumentation (chemical analysis) applicable among others in the chemical, pharmaceutical, clinical and food

Estado de la técnicaState of the art

La electroforesis capilar (CE) es una técnica analítica de separación actualmente utilizada en muchos laboratorios de análisis. CE trabaja con volúmenes de muestra inyectados del orden de nanolitros. Una de las principales limitaciones de esta técnica es su mala reproducibilidad en el análisis cuantitativo, como resultado de la dificultad para inyectar de manera reproducible volúmenes de muestra tan pequeños. Aunque se han descrito algunos procedimientos para solucionar este problema, hasta la fecha el problema persiste.Capillary electrophoresis (EC) is a technique separation analytics currently used in many Analysis laboratories CE works with sample volumes injected of the order of nanoliters. One of the main limitations of this technique is its poor reproducibility in the quantitative analysis, as a result of the difficulty in injecting reproducibly so small sample volumes. Although have described some procedures to solve this problem, To date the problem persists.

Así, se han llevado a cabo nuevos diseños instrumentales para mejorar la reproducibilidad del análisis (Yao y col, J. Sep. Sci. 26 (2003) 37-42; Watzig y Dette, Fresen. J. Anal. Chem. 345 (1993) 403-410; Watzig y Dette, J. Chromatogr. A 636 (1993) 31-38; Ermakov y col., Electrophoresis 15 (1994) 1158-1166), si bien todos estos procedimientos suponen modificaciones estucturales de los equipos y/o el empleo de nueva instrumentación, lo que ha hecho que no hayan tenido éxito habiéndose quedado como meros prototipos de laboratorio.Thus, new instrumental designs have been carried out to improve the reproducibility of the analysis (Yao et al, J. Sep. Sci . 26 (2003) 37-42; Watzig and Dette, Fresen. J. Anal. Chem . 345 (1993 ) 403-410; Watzig and Dette, J. Chromatogr. A 636 (1993) 31-38; Ermakov et al., Electrophoresis 15 (1994) 1158-1166), although all these procedures involve structural modifications of the equipment and / or the use of new instrumentation, which has made them unsuccessful having remained as mere laboratory prototypes.

Otro procedimiento descrito para mejorar la reproducibilidad en el análisis cuantitativo en CE es el empleo del procedimiento clásico de la adición de un patrón interno (Goodall y col, TRAC-Trend Anal. Chem., 10 (1991) 272-279; Saeed y col, Chromatographia 47 (1998) 709-715; Ru y Luo, Anal. Lett. 33 (2000) 3013-3023; Habe y col., Anal. Chem., 70 (1998) 2261-2267). La idea básicamente consiste en añadir a la muestra que se va a analizar una cantidad conocida de un determinado compuesto patrón, cuyas características físico-químicas deben ser muy parecidas a las de los compuestos de la muestra a analizar. De esta manera cualquier variación observada en la cantidad detectada del compuesto patrón sirve para corregir las cantidades detectadas para el resto de los compuestos de la muestra. Sin embargo, no es fácil encontrar un patrón interno para muchas separaciones, requiriendo tiempo su búsqueda, el ajuste de las condiciones de análisis y siendo necesario conocer con antelación la naturaleza de los compuestos de la muestra a analizar (lo que en muchos casos no es viable). Estas limitaciones han hecho que este procedimiento sea poco utilizado en CE.Another procedure described to improve reproducibility in quantitative analysis in EC is the use of the classical procedure of adding an internal standard (Goodall et al., TRAC-Trend Anal. Chem ., 10 (1991) 272-279; Saeed et al. , Chromatographia 47 (1998) 709-715; Ru and Luo, Anal. Lett . 33 (2000) 3013-3023; Habe et al., Anal. Chem ., 70 (1998) 2261-2267). The idea basically consists of adding to the sample that a known quantity of a certain standard compound is to be analyzed, whose physicochemical characteristics must be very similar to those of the compounds of the sample to be analyzed. In this way any variation observed in the detected amount of the standard compound serves to correct the detected amounts for the rest of the sample compounds. However, it is not easy to find an internal standard for many separations, requiring time to search, adjusting the analysis conditions and being necessary to know in advance the nature of the compounds of the sample to be analyzed (which in many cases is not viable). These limitations have made this procedure little used in CE.

En cuanto a patentes lo único que se ha encontrado son descripciones estándar para el análisis específico de algún compuesto.As for patents the only thing that has been Found are standard descriptions for the specific analysis of some compound.

Es el caso de la patente ES-2101808 (Patente europea: 0517370; Título: Cuantificación de muestras utilizando electroforesis capilar, Autor: Chen, Fu-Tai Albert.; Titular: Beckman Instruments, Inc.) en la que se describe la adición de un patrón interno para mejorar el análisis cuantitativo.It is the case of the patent ES-2101808 (European Patent: 0517370; Title: Quantification of samples using capillary electrophoresis, Author: Chen, Fu-Tai Albert .; Holder: Beckman Instruments, Inc.) which describes the addition of an internal standard for Improve quantitative analysis.

Similar patente se ha descrito para el análisis de proteínas utilizando también un patrón interno (Patente ES 2 131 708; Título: Utilización de la electroforesis capilar para determinar la cantidad de concentración de componentes de proteína y la totalidad de proteína en los fluidos. Autores: Wang, Hann-Ping y Liu, Cheng-Ming; Titular: Beckman Instruments, Inc.). También se han publicado varias patentes en las que se muestran diferentes diseños instrumentales del inyector para mejorar el problema de la mala reproducibilidad en el volumen inyectado. Estas patentes son:Similar patent has been described for analysis of proteins also using an internal standard (Patent ES 2 131 708; Title: Use of capillary electrophoresis for determine the amount of protein component concentration and all the protein in the fluids. Authors: Wang, Hann-Ping and Liu, Cheng-Ming; Owner: Beckman Instruments, Inc.). They have also been published several patents showing different designs injector instruments to improve the problem of bad Reproducibility in the injected volume. These patents are:

- la patente europea 0479137A3; Título: Capillary electrophoresis sample injection technique; Autor: Allington, Robert William; Titular: ISCO, Inc.)- European patent 0479137A3; Title: Capillary electrophoresis sample injection technique; Author: Allington, Robert William; Owner: ISCO, Inc.)

- la patente europea 0383459A3; Título: Automated capillary injector; Autor: Burolla, Victor Paul; Titular: Beckman Instruments, Inc.- European patent 0383459A3; Title: Automated capillary injector; Author: Burolla, Victor Paul; Headline: Beckman Instruments, Inc.

- la patente europea 0620432A1; Título: Method for controlling sample introduction in microcolumn separation techniques and sampling device; Authors: Manz, Andreas et al; Titular: CIBA-GEIGY AG.- European patent 0620432A1; Title: Method for controlling sample introduction in microcolumn separation techniques and sampling device; Authors: Manz, Andreas et al ; Owner: CIBA-GEIGY AG.

- la patente international WO 97/33166; Título : Method and apparatus for feeding a sample into a capillary electrophoresis apparatus; Author: Rauno, Virtanen.- international patent WO 97/33166; Title : Method and apparatus for feeding a sample into a capillary apparatus electrophoresis; Author: Rauno, Virtanen.

- la patente internacional WO 01/88527 A3; Título: Method and device to inject a sample in an electrophoresis capillary; Autores: Gauguet, Gilbert; Siebert, Rainier; CNRS.- international patent WO 01/88527 A3; Title: Method and device to inject a sample in an electrophoresis capillary; Authors: Gauguet, Gilbert; Siebert, Rainier; CNRS

Ninguna de estas patentes plantea o menciona un procedimiento como el que es objeto de esta patente, es decir, el empleo del perfil de corriente eléctrica para mejorar la reproducibilidad y precisión en el análisis cuantitativo por CE. Además debe señalarse que el procedimiento que se propone no requiere ninguna modificación estructural del equipo de CE.None of these patents raise or mention a procedure such as that which is the subject of this patent, that is, the use of the electric current profile to improve the Reproducibility and precision in the quantitative analysis by CE. It should also be noted that the proposed procedure does not requires no structural modification of the CE equipment.

Descripción de la invenciónDescription of the invention - Breve descripción de la invención - Brief description of the invention

El objeto de esta invención es dar solución a una de las limitaciones más importantes que presenta la técnica analítica de separación conocida como electroforesis capilar (CE). Esta limitación es la pobre reproducibilidad que proporciona en el análisis cuantitativo. Para ello se desarrolla un nuevo método que permite determinar el volumen inyectado dentro del capilar en cada inyección, mejorando de esta manera la reproducibilidad y exactitud del análisis cuantitativo en CE (así como en otras técnicas que utilicen un campo eléctrico como fuerza motora). Para ello se utiliza el perfil de corriente eléctrica (ver Figura 1) que todo equipo de electroforesis capilar proporciona durante el análisis y del que se extrae la información sobre el volumen inyectado como se especifica a continuación en la descripción detallada de la invención.The object of this invention is to provide a solution to one of the most important limitations of the technique analytical separation known as capillary electrophoresis (EC). This limitation is the poor reproducibility that it provides in the quantitative analysis. For this a new method is developed that allows to determine the volume injected into the capillary in each injection, thus improving reproducibility and accuracy of the quantitative analysis in EC (as well as in other techniques that use an electric field as a driving force). To do this use the electric current profile (see Figure 1) that everything capillary electrophoresis equipment provides during analysis and from which information about the injected volume is extracted as specified below in the detailed description of the invention.

- Descripción detallada de la invención - Detailed description of the invention

Asumiendo un capilar monodimensional lleno con disoluciones (o zonas) de diferente conductividad eléctrica, asumiendo cada disolución con una composición uniforme, la conductividad total, K, dentro del capilar seráAssuming a monodimensional capillary filled with solutions (or zones) of different electrical conductivity, assuming each solution with a uniform composition, the total conductivity, K, inside the capillary will be

1one

donde l_{i} y \kappa_{i} son la longitud y conductividad de cada zona i, respectivamente. Para un capilar de longitud total L, en el que se ha inyectado una muestra de longitud l_{0} y conductividad \alpha\kappa^{BGE} (\kappa^{BGE} es la conductividad del buffer de separación, y \alpha es un factor de proporcionalidad que puede determinarse fácilmente como se mostrará más abajo), la conductividad total se puede expresar como,where l_ {i} and \ kappa_ {i} are the length and conductivity of each zone i , respectively. For a capillary of total length L , in which a sample of length l 0 { and conductivity α [kappa] BGE ([kappa] BGE) is injected the conductivity of the separation buffer, and [alpha] it is a proportionality factor that can be easily determined as shown below), the total conductivity can be expressed as,

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La relación de la conductividad total dentro del capilar antes (a) y después (d) de que la zona de inyección ha abandonado el capilar será,The ratio of the total conductivity within the capillary before ( a ) and after ( d ) that the injection zone has left the capillary will be,

33

donde l_{a} y l_{d} son las intensidades de corriente eléctrica antes y después del escalón que se obtiene en el perfil de corriente eléctrica (PCE) (ver Figura 1), y K_{a} y K_{d} son las conductividades antes y después del escalón, respectivamente. Esta ecuación también es aplicable en aquellos casos en los que los equipos de CE trabajen a intensidad de corriente eléctrica constante, en cuyo caso l_{a} y l_{d} deberán ser sustituidos por el voltaje antes y después del escalón. Asimismo pueden utilizarse alguna de sus magnitudes derivadas (por ejemplo, potencia eléctrica). Reorganizando la Ecuación 3 se obtiene,where l_ {a} and l_ {d} are the electric current intensities before and after the step obtained in the electric current profile (PCE) (see Figure 1), and K_ {a} and K_ {d} are the conductivities before and after the step, respectively. This equation is also applicable in those cases in which the CE equipment works at a constant electric current intensity, in which case l_ {a} and l_ {d} must be replaced by the voltage before and after the step. Likewise, some of its derived quantities (for example, electrical power) can be used. Reorganizing Equation 3 is obtained,

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donde l_{s} es la amplitud del escalón normalizada en el PCE. Según esta ecuación, la relación de la intensidad de corriente antes y después del escalón puede proporcionar información directa y específica sobre la longitud de muestra inyectada, l_{0} para cada experimento. Se demuestra (ver ejemplos) que este conocimiento permite mejorar la reproducibilidad y exactitud del análisis cuantitativo por CE. Es interesante señalar que hasta la fecha el valor de l_{0} sólo puede obtenerse de manera esencialmente teórica (l_{0the}) utilizando la ecuación de Poiseuille, l_{0the} = (r^{2} \DeltaP t_{iny})/(8\etaL (cuando se utiliza inyección hidrodinámica) o bien la ecuación l_{0the} = (\mu V t_{iny})/L (cuando se utiliza inyección por voltaje, V). Estas ecuaciones relacionan la longitud inyectada l_{0} con el tiempo de inyección t_{iny}, la presión utilizada \DeltaP, la longitud del capilar L, su radio r, su movilidad electroforética aparente \mu y la viscosidad de la muestra \eta.where l_ {s} is the amplitude of the standardized step in the PCE. According to this equation, the ratio of the current intensity before and after the step can provide direct and specific information about the length of the injected sample, 10 for each experiment. It is demonstrated (see examples) that this knowledge allows to improve the reproducibility and accuracy of the quantitative analysis by CE. It is interesting to note that to date the value of l_ {0} can only be obtained in an essentially theoretical way ( l_ {0the} ) using the Poiseuille equation, l_ {0the} = (r ^ {2} \ DeltaP t_ {iny} ) / (8 \ etaL (when hydrodynamic injection is used) or the equation l_ {0the} = ( µV t_ {iny}) / L (when voltage injection is used, V). These equations relate the injected length l_ {0} with the injection time t_ {iny}, the pressure used ΔP, the length of the capillary L, its radius r, its apparent electrophoretic mobility µ and the viscosity of the sample η.

A continuación se demuestra en varios ejemplos que la utilización de la ecuación 4 junto con el perfil de corriente eléctrica (PCE), proporcionado por cualquier equipo de CE, permite determinar la longitud inyectada l_{0}, y que el conocimiento de esta valor mejora considerablemente la reproducibilidad y exactitud del análisis cuantitativo por CE.It is demonstrated in several examples below that the use of equation 4 together with the electric current profile (PCE), provided by any EC equipment, allows to determine the injected length l_ {0} , and that knowledge of this value improves considerably the reproducibility and accuracy of the quantitative analysis by CE.

Descripción detallada de las figurasDetailed description of the figures

Figura 1. Típico perfil de corriente eléctrica (PCE) y electroferograma proporcionado por un equipo de electroforesis capilar. Los números corresponden a:Figure 1. Typical electric current profile (PCE) and electropherogram provided by a team of capillary electrophoresis The numbers correspond to:

1-one-

Perfil de corriente eléctrica (PCE)Electric current profile (PCE)

2-2-

EscalónStep

3-3-

ElectroferogramaElectropherogram

4-4-

Marcador neutroNeutral marker

5-5-

AnalitoAnalyte

Figura 2. Determinación de la amplitud del escalón en el PCE utilizando 25 mM borato como tampón de separación.Figure 2. Determination of the amplitude of the step in the PCE using 25 mM borate as a buffer separation.

Muestra: 0.12 mM m-HBA disuelto en:Sample: 0.12 mM m-HBA dissolved in:

(A)(TO)

50:50 (tampón:agua) e inyectada 5 s;50:50 (buffer: water) and injected 5 s;

(B)(B)

25:75 (tampón:agua) e inyectada 5 s;25:75 (buffer: water) and injected 5 s;

(C)(C)

10:90 (tampón:agua) e inyectada 5 s;10:90 (buffer: water) and injected 5 s;

(D)(D)

10:90 (tampón:agua) e inyectada 3 s.10:90 (buffer: water) and injected 3 s.

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
    

Ejemplos de realización de la invenciónExamples of embodiment of the invention

Los siguientes ejemplos dirigidos a modo de realización preferidos de la invención descrita en la presente no pretenden ser ni deben interpretarse como limitaciones de la descripción o de las reivindicaciones que siguen.The following examples addressed by way of Preferred embodiments of the invention described herein are not they claim to be and should not be construed as limitations of the description or of the claims that follow.

Condiciones de separación. Los experimentos se realizaron en un equipo de electroforesis capilar P/ACE MDQ de Beckman (Fullerton, CA, USA). Los capilares de sílice fundida de 50 micras de diámetro interno y 363 micras de diámetro externo de Composite Metals, Worcester, UK., y se utilizaron con una longitud total de 500 mm y una longitud de detección de 400 mm. Las inyecciones se realizaron utilizando una presión de 0.5 psi o aplicando un voltaje de 6 kV. La longitud de onda de detección fue de 214 nm. Separation conditions . The experiments were performed in a Beckman P / ACE MDQ capillary electrophoresis device (Fullerton, CA, USA). The fused silica capillaries of 50 microns internal diameter and 363 microns external diameter of Composite Metals, Worcester, UK., And were used with a total length of 500 mm and a detection length of 400 mm. Injections were made using a pressure of 0.5 psi or applying a voltage of 6 kV. The detection wavelength was 214 nm.

Preparación de muestras. Se utilizaron como muestras distintas disoluciones de ácido m-hydroxybenzoico (m-HBA) o de 2,4,6-Trimetilpiridina (TM) preparadas en diferentes disoluciones tampón:agua (50:50; 25:75 y 10:90, v:v). Sample preparation Different solutions of m-hydroxybenzoic acid (m-HBA) or 2,4,6-Trimethylpyridine (TM) prepared in different buffer solutions were used as samples: water (50:50; 25:75 and 10:90, v: v).

Determinación de la conductividad: para la determinación experimental del valor de a (ver Ecuación 2), el equipo de CE se utilizó como conductimetro. En concreto, se midió la intensidad de corriente obtenida con cada muestra (o tampón) tras llenar el capilar con dicha muestra y aplicar un voltaje de 20 kV durante 1 minuto. El valor de \alpha se determinó dividiendo la corriente eléctrica obtenida con la muestra por la obtenida con el correspondiente tampón de separación. Determination of conductivity : for the experimental determination of the value of a (see Equation 2), the EC equipment was used as a conductimeter. Specifically, the current intensity obtained with each sample (or buffer) was measured after filling the capillary with said sample and applying a voltage of 20 kV for 1 minute. The α value was determined by dividing the electric current obtained with the sample by that obtained with the corresponding separation buffer.

Ejemplo 1Example 1

Como se demuestra en la Figura 2, el perfil de corriente eléctrica (PCE) depende tanto de la relación de conductividades muestra/tampón de separación como de la longitud inyectada, lo que corrobora la utilidad de la ecuación 4 y en general la idea propuesta en esta invención. Esto último puede deducirse comparando la Figura 2C con la Figura 2D en las que se utilizó idéntica muestra y el mismo tampón pero distintos tiempos de inyección.As shown in Figure 2, the profile of Electric current (PCE) depends so much on the ratio of Sample conductivities / separation buffer as of length injected, which corroborates the utility of equation 4 and in general the idea proposed in this invention. The latter can deduced by comparing Figure 2C with Figure 2D in which used the same sample and the same buffer but different times Injection

En la Tabla 1 se demuestra que el procedimiento propuesto utilizando el PCE y la ecuación 4 permite determinar la longitud inyectada l_{0PCE} empleando distintas condiciones de análisis. Se demuestra además que el procedimiento propuesto mejora la reproducibilidad del análisis cuantitativo por CE. En concreto para cada experimento A, B, C... se midió el área de pico normalizada Área_{N} empleando el procedimiento normalmente utilizado en CE (es decir dividir el área de pico por el tiempo de análisis) y el procedimiento propuesto en esta invención que consiste en utilizar el área normalizada corregida con el perfil de corriente eléctrica Área_{PCE} (calculada multiplicando el valor de Área_{N} por la longitud teórica de inyección l_{0the} y dividida por la longitud de inyección calculada utilizando el PCE, l_{0pCE}). Los valores RSD_{N} y RSD_{PCE} son las desviaciones estándar relativas calculadas para cada caso. Como se puede deducir comparando los valores de RSD_{N} y RSD_{PCE} de la Tabla 1, el procedimiento propuesto utilizando el PCE claramente mejora en todos los casos dicha reproducibilidad, en algunos casos hasta más de cuatro veces (ver por ejemplo el experimento B de la Tabla 1).Table 1 shows that the procedure proposed using the PCE and equation 4 allows to determine the length injected 10CEP using different analysis conditions. It is further demonstrated that the proposed procedure improves the reproducibility of the quantitative analysis by CE. Specifically for each experiment A, B, C ... the normalized peak area Area_ {N} was measured using the procedure normally used in EC (that is, divide the peak area by the analysis time) and the proposed procedure in This invention consists in using the normalized area corrected with the electric current profile Area_ {PCE} (calculated by multiplying the value of Area_ {N} by the theoretical injection length l_ {0the} and divided by the injection length calculated using the PCE, l_ {0pCE} ). The RSD_ {N} and RSD_ {PCE} values are the relative standard deviations calculated for each case. As can be deduced by comparing the values of RSD_ {N} and RSD_ {PCE} in Table 1, the procedure proposed using the PCE clearly improves in all cases such reproducibility, in some cases up to more than four times (see for example the experiment B of Table 1).

55

Ejemplo 2Example 2

La utilidad de esta idea para mejorar la reproducibilidad del análisis cuantitativo en CE se ratificó de la forma siguiente. Utilizando el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1, se determinaron los valores de Área_{N}, Área_{PCE}, RSD_{N} y RSD_{PCE} tras inyectar durante 5s una muestra conteniendo 0.12 mM m-HBA en 10:90 tampón:agua (v:v) en un mismo día (n=5 inyecciones) y cinco días diferentes. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2. Como puede apreciarse, los valores de RSD_{N} para un mismo día variaron entre 4.4 y 15.6%, mientras que los valores de RSD_{PCE} (utilizando el perfil de corriente eléctrica propuesto en esta invención) fueron siempre inferiores a 4.3%. Además, los valores medios de RSD obtenidos para los cinco días mejoraron en un factor de más de 2.5 veces utilizando el PCE (RSD_{N} = 10.5%, RSD_{PCE} = 4.2%) lo que ratifica la utilidad de este nuevo procedimiento.The usefulness of this idea to improve the Reproducibility of the quantitative analysis in EC was ratified by the following form. Using the same procedure described in the Example 1, the values of Area_ {N}, Area_ {PCE} were determined, RSD_ {N} and RSD_ {PCE} after injecting a sample for 5s containing 0.12 mM m-HBA in 10:90 buffer: water (v: v) on the same day (n = 5 injections) and five different days. The results obtained are shown in Table 2. How can you appreciate, the RSD_ {N} values for the same day varied between 4.4 and 15.6%, while the RSD_ {PCE} values (using the electric current profile proposed in this invention) were always below 4.3%. In addition, the values RSD means obtained for the five days improved by a factor more than 2.5 times using the PCE (RSD_ {N} = 10.5%, RSD_ {PCE} = 4.2%) which confirms the usefulness of this new process.

       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
    

TABLA 2TABLE 2 Reproducibilidad del área de pico determinada mediante CE para un mismo día y cinco días diferentes con/sin la corrección propuesta utilizando el perfil de corriente eléctrica (PCE)Reproducibility of the determined peak area by CE for the same day and five different days with / without the Proposed correction using the electric current profile (PCE)

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       \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
    

Ejemplo 3Example 3

La utilidad de esta idea para mejorar la exactitud del análisis cuantitativo en CE se ratificó de la forma siguiente. Se prepararon seis soluciones de m-HBA de concentración conocida (en concreto c_{m-HBA} se varió desde 15 \muM hasta 625 \muM) y tras inyectarlas por triplicado (n=18) en un equipo de CE se determinaron los valores (utilizando el procedimiento ya descrito) de Área_{N} y Área_{PCE} para cada concentración e inyección Con estos valores y aplicando un ajuste lineal por mínimos cuadrados se obtuvieron sendas rectas de calibrado que correlacionan los valores Área_{N} y Área_{PCE} con la concentración (c_{m-HBA}). Las ecuaciones de estas rectas de calibrado junto con sus respectivos coeficientes de correlación (r2) y desviaciones estándar de los residuos (s), fueron:The usefulness of this idea to improve the Accuracy of the quantitative analysis in EC was ratified in the manner next. Six m-HBA solutions of  known concentration (specifically c_ {m-HBA} is varied from 15 µM to 625 µM) and after injecting them by triplicate (n = 18) in a CE team the values were determined (using the procedure already described) of Area_ {N} and Area_ {PCE} for each concentration and injection With these values and applying a linear adjustment for least squares they obtained straight calibration paths that correlate the values Area_ {N} and Area_ {PCE} with the concentration (c_ {m-HBA}). The equations of these calibration lines along with their respective correlation coefficients (r2) and deviations Waste standard (s), were:

Área_{N} = (359 \pm 8) c_{m-HBA} + (11.2 \pm 2.3), r^{2} = 0.993, s = 7.04Area_ {N} = (359 ± 8) c_ {m-HBA} + (11.2 ± 2.3), r 2 = 0.993, s = 7.04

Área_{ECP} = (304 \pm 4) c_{m-HBA} + (2.8 \pm 1.0), r^{2} = 0.998, s = 2.90Area_ {ECP} = (304 ± 4) c_ {m-HBA} + (2.8 ± 1.0), r 2 = 0.998, s = 2.90

El menor valor de ordenada en el origen (2.8), la menor desviación estándar de los residuos (2.90) y el mejor coeficiente de correlación (0.998) se obtienen empleando la idea aquí propuesta (Área_{ECP}), lo que claramente demuestra que el empleo de este procedimiento mejora las características del ajuste y con ello la exactitud de la medida. Este punto se corroboró además determinando experimentalmente la concentración de una muestra test utilizando ambos procedimientos. Para ello se preparó una muestra test (con una concentración conocida c_{m-HBA} = 75 \muM, que era el valor a determinar experimentalmente) y tras inyectarla por triplicado, se obtuvieron sus valores de Área_{N} y Área_{PCE}. Con estos valores y utilizando las dos ecuaciones de calibración indicadas arriba se obtuvo el valor de concentración de la muestra c_{m-HBA}. La concentración de la muestra test obtenida empleando Área_{N} fue de 67.7 (\pm 6.3) pM mientras que usando el procedimiento propuesto en esta idea (Área_{PCE}) el valor obtenido para la concentración fue de 73.1 (\pm 2.4) \muM, lo que demuestra la mejor exactitud del análisis cuantitativo en CE proporcionada por este procedimiento.The lowest ordinate value at the origin (2.8), the lowest standard deviation of the waste (2.90) and the best correlation coefficient (0.998) is obtained using the idea proposed here (Area_ {ECP}), which clearly demonstrates that the using this procedure improves the characteristics of the adjustment and with it the accuracy of the measurement. This point was also confirmed experimentally determining the concentration of a test sample using both procedures. For this a sample was prepared test (with a known concentration c_ {m-HBA} = 75 µM, which was the value to be determined experimentally) and after inject it in triplicate, its Area_ {N} values were obtained and Area_ {PCE}. With these values and using the two equations of calibration indicated above the concentration value of the sample c_ {m-HBA}. The concentration of the test sample obtained using Area_ {N} was 67.7 (± 6.3) pM while using the procedure proposed in this idea (Area_ {PCE}) the value obtained for the concentration was 73.1 (± 2.4) \ muM, which demonstrates the best accuracy of the quantitative analysis in EC provided by this process.

Claims (8)

1. Dispositivo de mejora para el análisis cuantitativo en electroforesis capilar caracterizado por aprovechar el perfil de corriente eléctrica (PCE), información facilitada por los equipos comerciales, para determinar la cantidad de muestra inyectada.1. Improvement device for quantitative analysis in capillary electrophoresis characterized by taking advantage of the electric current profile (PCE), information provided by commercial teams, to determine the amount of sample injected. 2. Dispositivo de mejora para el análisis cuantitativo en electroforesis capilar según la reivindicación 1 caracterizado por la introducción en el software del equipo comercial, y sin modificación estructural alguna, de un programa para la integración de la amplitud del escalón normalizado del PCE.2. Improvement device for quantitative analysis in capillary electrophoresis according to claim 1 characterized by the introduction in the software of the commercial equipment, and without any structural modification, of a program for the integration of the amplitude of the standardized step of the PCE. 3. Procedimiento de mejora para el análisis cuantitativo en electroforesis capilar según las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado porque se determina la longitud inyectada mediante el PCE, en función de la intensidad de corriente eléctrica.3. Improvement procedure for quantitative analysis in capillary electrophoresis according to claims 1 to 2, characterized in that the length injected is determined by the PCE, depending on the intensity of the electric current. 4. Procedimiento de mejora para el análisis cuantitativo en electroforesis capilar según las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque se determina la longitud inyectada mediante el PCE en función del voltaje, si se trabaja a intensidad constante, o alguna de sus magnitudes derivadas.4. Improvement procedure for quantitative analysis in capillary electrophoresis according to claims 1 to 3, characterized in that the length injected is determined by the PCE as a function of voltage, if working at constant intensity, or any of its derived quantities. 5. Procedimiento de mejora para el análisis cuantitativo en electroforesis capilar según las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque la reproducibilidad del análisis es 2,5 veces superior al método convencional.5. Improvement procedure for quantitative analysis in capillary electrophoresis according to claims 1 to 4 characterized in that the reproducibility of the analysis is 2.5 times higher than the conventional method. 6. Procedimiento de mejora para el análisis cuantitativo en electroforesis capilar según las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado por su exactitud, el valor experimental obtenido para una concentración-test 75 \muM es 73.1 (\pm 2.4) \muM frente a 67.7 (\pm 6.3) pM del método convencional.6. Improvement procedure for quantitative analysis in capillary electrophoresis according to claims 1 to 5 characterized by its accuracy, the experimental value obtained for a 75-µM test concentration is 73.1 (± 2.4) µM versus 67.7 (± 6.3) pM of the conventional method. 7. Utilización del dispositivo de mejora para el análisis cuantitativo según reivindicaciones 1 a 2 en aquellos equipos que faciliten información sobre intensidad, voltaje o magnitud derivada durante el análisis, tal como en las distintas formas de electroforesis capilar.7. Use of the improvement device for quantitative analysis according to claims 1 to 2 in those equipment that provides information on current, voltage or magnitude derived during the analysis, as in the different forms of capillary electrophoresis. 8. Utilización del dispositivo de mejora para el análisis cuantitativo según reivindicaciones 1, 2 y 7 en electrocromatografía y electroforesis en chips. 2,5 veces superior al método convencional.8. Use of the improvement device for quantitative analysis according to claims 1, 2 and 7 in electrochromatography and electrophoresis in chips. 2.5 times higher to the conventional method.