ES2300817T3 - Tratamiento de enfermedades fibroticas. - Google Patents
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Abstract
Uso de un polipéptido para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia, en que dicho polipéptido es seleccionado del grupo que consiste en: a) un polipéptido como el expuesto en cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 7 e ID. SEC. nº 10; b) la forma de etiqueta histidínica de los polipéptidos cuyas secuencias se exponen en la ID. SEC. nº 2 (ID. SEC. nº 3) o ID. SEC. nº 5 (ID. SEC. nº 6) o ID. SEC. nº 7 (ID. SEC. nº 8) o ID. SEC. nº 10 (ID. SEC. nº 11); c) un polipéptido que comprende cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC. nº 11; d) una muteína de cualquiera de (a) a (c), en que la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 40% o 50% o 60% o 70% u 80% o 90% de identidad con respecto a al menos una de las secuencias de (a) a (c); e) una muteína de cualquiera de (a) a (c), en que los cambios en la secuencia de aminoácidos son sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos de (a) a (c); y f) una sal o una isoforma, proteína de fusión, derivado funcional, fracción activa o derivado circularmente permutado de cualquiera de (a) a (e).
Description
Tratamiento de enfermedades fibróticas.
El presente invento pertenece al campo de las
enfermedades fibróticas y los trastornos del tejido conjuntivo. Más
específicamente, el invento se refiere al uso de INSP035 para el
tratamiento y/o la prevención de enfermedades fibróticas, en
particular la esclerodermia. Dentro del presente invento también hay
combinaciones de INSP035 con un interferón, un antagonista del TNF
u otro agente antifibrótico tal como OPG o
SARP-1.
La fibrosis es un estado caracterizado por el
depósito de componentes de la matriz extracelular en los órganos
internos, incluyendo los riñones, el corazón, los pulmones, el
hígado, la piel y las articulaciones.
La fibrosis pulmonar es una de las enfermedades
fibróticas predominantes. La fibrosis pulmonar idiopática (IPF; del
inglés, idiopathic pulmonary fibrosis) se
caracteriza por inflamación crónica de las paredes alveolares con
fibrosis progresiva, y es de etiología desconocida. La IPF, o
alveolitis fibrosante criptogénica, representa del 50 al 60% de los
casos de enfermedad pulmonar intersticial idiopática [para
revisiones sobre la IPF, véanse N. Khalil y O'Connor (2004) y
Selman et al. (2004)].
La neumonía intersticial usual (UIP; del inglés,
usual interstitial pneumonia), un patrón
histopatológico específico de neumonía intersticial, es el clásico
patrón hallado en las biopsias pulmonares de afectados por IPF. Con
baja ampliación, el tejido aparece heterogéneo, con áreas alternas
de pulmón normal, inflamación intersticial, fibrosis y lesiones en
forma de panal (honeycombing). La inflamación intersticial
consiste en una infiltración septal alveolar de linfocitos, células
plasmáticas e histiocitos asociada con hiperplasia de neumocitos de
tipo II. Las zonas fibróticas están compuestas principalmente de
colágeno acelular denso, aunque también se pueden ver focos
dispersos de fibroblastos proliferantes (focos fibroblásticos), que
son los sitios de la enfermedad precoz y activa, normalmente en una
posición intraalveolar. Las áreas de lesiones en forma de panal
están compuestas de espacios aéreos fibróticos quísticos,
frecuentemente cubiertos de epitelio bronquiolar y llenos de moco.
Se pueden reunir neutrófilos en el moco. A menudo aparece
hiperplasia de músculo liso en las áreas de fibrosis y lesiones en
forma de panal. Las distribuciones subpleural y paraseptal, el
carácter desigual y la heterogeneidad temporal son los los rasgos
más útiles para identificar la UIP.
En los trastornos vasculares del colágeno [por
ejemplo, artritis reumatoide (RA; del inglés, rheumatoid
arthritis), lupus eritematoso sistémico (SLE; del inglés,
systemic lupus erythematosus), esclerosis
sistémica progresiva, enfermedad mixta del tejido conjuntivo y
diabetes mellitus], las neumoconiosis (por ejemplo, la asbestosis),
las lesiones por radiación y ciertas enfermedades pulmonares
provocadas por fármacos (por ejemplo, por nitrofurantoína), aparece
un patrón idéntico de inflamación intersticial y fibrosis.
El curso clínico de la IPF es progresivo; la
supervivencia mediana después del diagnóstico es de 4 a 6 años. La
prednisona es el tratamiento habitual en el caso de IPF. La
respuesta al tratamiento es variable, aunque parece más probable
que los pacientes con enfermedad precoz, en una fase más celular
antes de que predomine la cicatrización, mejoren con una terapia
por corticosteroides o agentes citotóxicos. El tratamiento auxiliar
y paliativo incluye O_{2} en elevadas concentraciones para aliviar
la hipoxemia y, si aparece una infección bacteriana, antibióticos.
El trasplante de pulmón ha resultado exitoso en pacientes con
enfermedad pulmonar de fase final.
La fibrosis del hígado tiene que ver con una
acumulación de tejido conjuntivo en el hígado, que da lugar a un
desequilibrio entre la producción y la degradación de la matriz
extracelular y resulta acentuada por el colapso y la condensación
de fibras preexistentes [para revisiones, véanse N. H. Afdhal y D.
Nunes (2004), Kershenobich y Weissbrod (2003), y Pinzani y Rombouts
(2004)].
La fibrosis hepática es una respuesta común a
una lesión o necrosis hepatocelular, que puede ser provocada por
una gran variedad de agentes, tales como, por ejemplo, cualquier
proceso que altera la homeostasis hepática (especialmente una
inflamación, una lesión por tóxicos o un flujo sanguíneo hepático
alterado) e infecciones del hígado (víricas, bacterianas, fúngicas
y parasíticas). Numerosos trastornos de almacenamiento que resultan
de errores congénitos del metabolismo están frecuentemente asociados
con fibrosis, incluyendo anormalidades lipídicas (enfermedad de
Gaucher); enfermedades del almacenamiento de glucógeno
(especialmente los tipos III, IV, VI, IX y X); déficit de
\alpha_{1}-antitripsina; almacenamiento de
sustancias exógenas, como se ve en los síndromes de sobrecarga de
hierro (hemocromatosis) y enfermedades del almacenamiento de cobre
(enfermedad de Wilson); acumulación de metabolitos tóxicos (como en
la tirosinemia, fructosemia y galactosemia); y trastornos
peroxisomales (síndrome de Zellweger). Numerosos fármacos y
productos químicos causan fibrosis, especialmente el alcohol, el
metotrexato, la isoniazida, la oxifenisatina, la metildopa, la
clorpromazina, la tolbutamida y la amiodarona. Las alteraciones de
la circulación hepática (por ejemplo, insuficiencia cardíaca
crónica, síndrome de Budd-Chiari, enfermedad
venooclusiva y trombosis de la vena porta) y la obstrucción crónica
del flujo biliar pueden conducir a fibrosis. Finalmente, la
fibrosis hepática congénita es una malformación autosómica
recesiva.
El hígado normal está compuesto de hepatocitos y
sinusoides distribuidos dentro de una matriz extracelular compuesta
de colágeno (predominantemente de los tipos I, III y IV) y proteínas
no colágenas, incluyendo glicoproteínas (por ejemplo, fibronectina
y laminina) y varios proteoglicanos (por ejemplo, sulfato de
heparán, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, e
hialuronato). Los fibroblastos, normalmente sólo hallados en los
tractos portales, pueden producir colágeno, glicoproteínas grandes
y proteoglicanos.
Otras células hepáticas (particularmente
hepatocitos y células almacenadoras de grasa, de Kupffer y
endoteliales) también pueden producir componentes de la matriz
extracelular. Las células almacenadoras de grasa, situadas debajo
del endotelio sinusoidal en el espacio de Disse, son precursores de
fibroblastos, capaces de proliferar y producir un exceso de matriz
extracelular. El desarrollo de fibrosis a partir del depósito activo
de colágeno es una consecuencia de un daño en las células
hepáticas, particularmente una necrosis, y de células inflamatorias.
No se conocen los factores exactos liberados por estas células,
pero es probable que haya una o más citocinas o productos de
peroxidación lipídica. Las células de Kupffer y los macrófagos
activados producen citocinas inflamatorias. Se forman nuevos
fibroblastos alrededor de las células hepáticas necróticas; la
síntesis de colágeno aumentada conduce a cicatrizaciones. La
fibrosis puede proceder de una fibrogénesis activa y de una
degradación deteriorada de colágeno normal o alterado. Las células
almacenadoras de grasa, las células de Kupffer y las células
endoteliales son importantes en el aclaramiento del colágeno de tipo
I, diversos proteoglicanos, y colágenos desnaturalizados. Cambios
en las actividades de estas células pueden modificar el grado de
fibrosis. Para el histopatólogo, el tejido fibroso puede llegar a
ser más evidente a partir del colapso pasivo y la condensación de
fibras preexistentes.
De esta manera, una síntesis aumentada o una
degradación reducida de colágeno da lugar al depósito activo de
tejido conjuntivo en exceso, lo que afecta a la función hepática:
(1) la fibrosis pericelular daña la nutrición celular y da lugar a
atrofia hepatocelular; (2) dentro del espacio de Disse, el tejido
fibroso se acumula alrededor de los sinusoides y obstruye el paso
libre de sustancias desde la sangre hasta los hepatocitos; y (3) la
fibrosis alrededor de las vénulas hepáticas y los tractos portales
altera el flujo de la sangre hepática. La resistencia venosa a
través del hígado aumenta desde las ramificaciones de la vena porta
a los sinuosides y finalmente a las venas hepáticas. Pueden estar
afectadas las tres vías.
Las bandas fibrosas que unen los tractos
portales con las venas centrales también activan canales
anastomóticos: la sangre arterial, apartándose de los hepatocitos
normales, es desviada a venas hepáticas eferentes, lo que daña más
la función hepática y puede acentuar la necrosis hepatocelular. El
grado en que están presentes estos procesos determina la magnitud
de la disfunción hepática; por ejemplo, en la fibrosis hepática
congénita, grandes bandas fibrosas afectan predominantemente a las
regiones portales aunque normalmente respetan el parénquima
hepático. De esta manera, la fibrosis hepática congénita se presenta
como hipertensión portal con función hepatocelular conservada.
La esclerodermia es una enfermedad del tejido
conjuntivo caracterizada por fibrosis de la piel y órganos internos,
lo que conduce a una insuficiencia orgánica y a la muerte (Black
et al., 1998; y Clements y Furst, 1996; para revisiones,
véanse J. Varga, 2004; Chung y Utz, 2004; y Rhew y Barr, 2004). La
esclerodermia presenta un espectro de manifestaciones y una
diversidad de implicaciones terapéuticas. Comprende esclerodermia
localizada, esclerosis sistémica, trastornos de tipo esclerodérmico
y esclerodermia Sin (Smith, 2000). Mientras que la esclerodermia
localizada es una rara enfermedad dermatológica asociada con
fibrosis y con manifestaciones limitadas a la piel, la esclerosis
sistémica es una enfermedad multisistémica con riesgo variable en
cuanto a la afectación de órganos internos y a la variación en el
grado de enfermedad cutánea. La esclerosis sistémica puede ser
difusa o limitada. La esclerosis sistémica limitada es también
llamada CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, disfunción
esofágica, esclerodactilia y telangiectasia). Se cree que los
trastornos de tipo esclerodérmico están relacionados con la
exposición a ambientes industriales. En la enfermedad Sin, hay
afectación de órganos internos sin cambios cutáneos.
Las principales manifestaciones de la
esclerodermia y, en particular, de la esclerosis sistémica son una
síntesis y un depósito excesivos e inapropiados de colágeno,
disfunción endotelial, espasmo, colapso y obliteración por
fi-
brosis.
brosis.
La esclerodermia es una enfermedad rara con una
incidencia estable de aproximadamente 19 casos por millón de
personas. Se desconoce la causa de la esclerodermia; sin embargo, la
predisposición genética es importante. Las anormalidades ocasionan
autoinmunidad y alteración de la función de las células endoteliales
y los fibroblastos. En realidad, la esclerosis sistémica es
probablemente la más grave de las enfermedades autoinmunes, con una
mortalidad comunicada de 50% en 5 años tras el diagnóstico (Silman,
1991).
En términos de diagnóstico, un parámetro clínico
importante es el engrosamiento cutáneo próximo a las articulaciones
metacarpofalángicas. El fenómeno de Raynaud es un componente
frecuente, casi universal, de la esclerodermia. Se diagnostica por
cambios en el color de la piel tras una exposición a frío. Isquemia
y engrosamiento cutáneo son síntomas de la enfermedad de
Raynaud.
Diversos procesos biológicos subyacentes están
implicados en el inicio, la gravedad y el progreso de la enfermedad,
e incluyen disfunción vascular, activación y daño de células
endoteliales, acumulación de leucocitos, producción de
autoanticuerpos y, crucialmente, una respuesta fibrótica
incontrolada que puede conducir a la muerte (Clements y Furst,
1996). Los fibroblastos tienen un papel esencial en la patogénesis
de esta enfermedad. Fibroblastos primarios obtenidos de pacientes
con esclerodermia presentan muchas de las propiedades
características de la enfermedad vistas in vivo, una
síntesis y un depósito notablemente aumentados de matriz
extracelular, notablemente de colágeno y fibronectina, y una
producción alterada de factores de crecimiento y citocinas, tales
como TGF-\beta y CTGF (Strehlow y Korn, 1998; y
LeRoy, 1974).
No hay tratamiento curativo para la
esclerodermia. Una terapia innovadora, aunque de alto riesgo,
propuso el trasplante de células madre autólogas (Martini et
al., 1999). En particular, no hay actualmente tratamientos para
la esclerodermia que se dirijan al proceso fibrótico (Wigley y
Boling, 2000).
La identificación de los genes asociados con el
riesgo de enfermedad y el progreso de la esclerodermia puede
conducir al desarrollo de estrategias eficaces para la intervención
en diversas fases de la enfermedad.
En el Documento WO03/054012, la proteína
secretada INSP035 fue clasificada en el subconjunto de citocinas de
haces de cuatro hélices \alpha, que es subdividido en citocinas de
cadenas cortas y de cadenas largas ya que sus hélices comprenden
aproximadamente 15 y 25 residuos, respectivamente. Se han
determinado las estructuras cristalinas de las citocinas de haces
de cuatro hélices \alpha de cadenas largas: LIF,
IL-6, CNTF, GH, factor estimulador de colonias de
granulocitos (G-CSF; del inglés,
granulocyte-colony stimulating factor),
y leptina. Aunque sólo presentan un bajo grado de homología en sus
estructuras primarias, muestran una elevada homología en sus
estructuras terciarias y en sus epítopos receptores funcionales.
INSP035 fue identificada como un miembro de la familia de citocinas
de cadenas largas y, más particularmente, como una leptina. En la
bibliografía se han descrito secuencias similares a las de INSP035
y sus variantes (ID. SEC. nº 31196 e ID. SEC. nº 42492 en el
Documento WO01/75067; ID. SEC. nº 13 en el Documento WO02/074961;
SwissProt, nº de acceso Q9BTA0). Sin embargo, los datos
experimentales proporcionados hasta ahora no muestran implicación
alguna de estas secuencias en enfermedades fibróticas.
La osteoprotegerina (OPG) fue identificada por
vez primera en 1997 como una nueva citocina soluble secretada por
fibroblastos (Simonet et al., 1997). La OPG es un miembro de
la familia de receptores de TNF (Morinaga et al., 1998;
Yasuda et al., 1998), y comprende cuatro dominios de tipo
TNFR, ricos en cisteína, en su porción N-terminal
(Simonet et al., 1997). Se ha mostrado que la OPG desempeña
un papel en el desarrollo del hueso, y los ratones que carecían del
gen OPG tenían un fenotipo osteoporótico e importantes anormalidades
esqueléticas (Min et al., 2000).
La osteoprotegerina, que es producida por
osteoblastos y por células estromales de médula ósea, carece de un
dominio transmembranal y actúa como un receptor señuelo secretado
que no tiene capacidad de señalización directa. La OPG actúa
uniéndose a su ligando natural, el ligando de osteoprotegerina
(OPGL; del inglés, osteoprotegerin
ligand), que es también conocido como ligando del receptor
activador del factor nuclear kappaB (RANKL; del inglés,
receptor activator of nuclear factor
kappaB ligand). La unión entre OPG y OPGL evita que
OPGL active su receptor afín, RANK, que es el receptor
osteoclástico vital para la diferenciación, activación y
supervivencia del osteoclasto. La supresión de OPGL o RANK también
produce una osteopetrosis profunda, lo que indica el importante
papel fisiológico de estas proteínas en la regulación de la
reabsorción ósea. La secreción de OPG y OPGL por osteoblastos y
células estromales es regulada por numerosas hormonas y citocinas, a
menudo de un modo recíproco. Por consiguiente, la OPG podría
representar una opción terapéutica eficaz para enfermedades
asociadas con una excesiva actividad osteoclástica (Kostenuik y
Shalhoub, 2001). También se mostró que, in vitro, la OPG se
unía a otro miembro de la familia del TNF, es decir, al ligando
inductor de apoptosis relacionado con TNF/ligando de Apo2
(TRAIL/Apo2L; del inglés, TNF-related
apoptosis-inducing ligand/Apo2 ligand),
con alta afinidad, comparable a la de la unión por el receptor (R)
2 de TRAIL (J. Emery et al., 1998; H. Walczak et al.,
1997). Además, en un estudio sobre mieloma múltiple, Shipman y
Croucher (C. M. Shipman y Croucher, 2003) mostraron que TRAIL/Apo2L
provocaba apoptosis en células de mieloma y que esto podía ser
evitado con la adición de OPG recombinante (rOPG). TRAIL provoca
apoptosis por entrecruzamiento de los dos receptores de TRAIL que
contienen un dominio de muerte, TRAIL-R1 y
TRAIL-R2. TRAIL-R3 y
TRAIL-R4 son receptores que no transmiten una señal
apoptótica.
En el Documento WO03/084560, la administración
de osteoprotegerina daba lugar a una mejora significativa de la
enfermedad en un modelo animal establecido de fibrosis pulmonar. La
fibrosis pulmonar es una de las manifestaciones de la
esclerodermia. Por lo tanto, se sugirió usar osteoprotegerina para
la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la
prevención de enfermedades fibróticas, en particular la
esclerodermia. Además, Hasel et al., al determinar la
expresión de TRAIL y sus receptores en páncreas normal y
pancreatitis crónica, mostraron que los cambios en la expresión del
receptor de TRAIL eran muy acusados en las zonas de infiltración
inflamatoria y fibrosis activa, y que células similares a
fibroblastos (FLC; del inglés, fibroblast-like
cells) expresaban TRAIL en zonas de fibrosis activa (C.
Hasel et al., 2003). Taimr et al. proponen que los
antagonistas de TRAIL-R2 pueden ser útiles para
reducir la fibrosis al provocar la apoptosis de células estrelladas
porque los hepatocitos no expresan TRAIL-R2 (P.
Taimr et al., 2003). Esto se basa en la observación de que la
apoptosis representa un mecanismo importante para reducir los
números de células estrelladas activadas, durante la fase de
resolución de la fibrosis hepática. Además, Yurovsky mostró que
tanto el nivel de mRNA del colágeno alfa-2 (I) como
la secreción total de colágeno soluble por fibroblastos pulmonares
humanos normales resultaban aumentados tras la estimulación con
TRAIL en bajas concentraciones, mientras que se halló que elevadas
concentraciones de TRAIL provocaban la muerte apoptótica de esas
células. Sugirió también que TRAIL potencia la síntesis de matriz
extracelular al desencadenar la producción de
TGF-\beta, que actúa de un modo autocrino (V. V.
Yurovsky, 2003).
En el Documento WO 03/054012 se describen usos
terapéuticos para polipéptidos/polinucleótidos INSP035, incluyendo
la cicatrización de heridas, la artritis reumatoide y la
insuficiencia cardíaca.
El invento se basa en el hallazgo de que INSP035
es un potente inhibidor de TRAIL en un ensayo in vitro
diseñado para seleccionar moléculas antiapoptóticas en fibroblastos,
con osteoprotegerina (OPG) como testigo. Por lo tanto, como OPG,
INSP035 es capaz de contrarrestar el efecto apoptótico de TRAIL
recombinante humano soluble sobre los fibroblastos, lo que reduce
consistentemente la apoptosis de fibroblastos.
Por lo tanto, un primer objeto del invento es
utilizar INSP035 para la preparación de un medicamento para el
tratamiento y/o la prevención de enfermedades fibróticas, en
particular la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar y la
esclerodermia. Un segundo objeto del invento es utilizar una célula
que exprese INSP035, o un vector de expresión que comprenda la
secuencia de codificación de INSP035, para la preparación de un
medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad
fibrótica, en particular la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar
o la esclerodermia. También se describen aquí composiciones
farmacéuticas que comprenden INSP035 y otros fármacos
antifibróticos, tales como halofuginona, OPG y
SARP-1, y métodos de tratamiento que comprenden
administrar INSP035 al cuerpo humano.
Figura 1 Forma de Longitud Media, modificada con
His, de INSP035 (ID. SEC. nº 8) en el ensayo de TRAIL. El eje Y
representa el porcentaje de inhibición de TRAIL. El eje X representa
el logaritmo decimal (log) de la dilución de la forma media
modificada de INSP035. Se obtuvieron curvas similares con la ID.
SEC. nº 3 (Forma Larga de INSP035-His) y la ID.
SEC. nº 6 (Forma Media de INSP035-His).
Figura 2 LEPTINA en el ensayo de TRAIL. El eje Y
representa la densidad óptica. El eje X representa los diferentes
ensayos llevados a cabo, comenzando con el testigo negativo y
siguiendo luego con TRAIL recombinante, osteoprotegerina y
finalmente leptina en diversas concentraciones (10 ng/ml, 100 ng/ml
y 1000 ng/ml).
Figura 3 Efecto de INSP035 sobre OPG de ratón 24
horas (A) y 48 horas (B) después de la adición de INSP035. En cada
una de las figuras, el eje Y representa la densidad óptica y el eje
X representa los diferentes ensayos llevados a cabo, empezando con
los testigos negativo y positivo y siguiendo con las diversas formas
de INSP035 analizadas, subdivididos en dos categorías dependiendo
de la cantidad de INSP035 añadida (18 \mul y 2 \mul,
respectivamente).
El invento se basa en el hallazgo de que INSP035
es un potente inhibidor de TRAIL en un ensayo in vitro
diseñado para seleccionar moléculas antiapoptóticas en fibroblastos,
con osteoprotegerina (OPG) como testigo. Por lo tanto, como OPG,
INSP035 es capaz de contrarrestar el efecto apoptótico de TRAIL
recombinante humano soluble sobre los fibroblastos, lo que reduce
consistentemente la apoptosis de los fibroblastos (véase la Figura
1). En el mismo ensayo, la proteína leptina no afectó a la apoptosis
mediada por TRAIL, no mostrando efecto alguno en absoluto (véase la
Figura 2).
En el Documento WO03/084560, se muestra que la
administración de osteoprotegerina daba lugar a una mejora
significativa de la fibrosis en un modelo animal establecido de
fibrosis pulmonar (véanse también Hasel et al. y Taim et
al. en la sección "Antecedentes del invento". Basándose en
que OPG e INSP035 comparten funciones comunes y en los hallazgos
relativos a que TRAIL estimula la producción de colágeno (V. V.
Yurovsky, 2003), se sugiere que INSP035 es útil en el tratamiento
de la fibrosis. Aunque sin pretender respaldos teóricos, se propone
una hipótesis sobre el mecanismo de acción de INSP035 basándose en
los presentes resultados, en el que INSP035, como un inhibidor de
TRAIL, podría reducir la cantidad de TGF-\beta
presente las células, lo cual, a su vez, reduciría la síntesis de
colágeno, de la cual se sabe que es deletérea en la patogénesis de
la fibrosis.
Por lo tanto, el invento se refiere al uso de un
polipéptido para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento y/o la prevención de la fibrosis hepática, la fibrosis
pulmonar o la esclerodermia, polipéptido que es seleccionado del
grupo que consiste en:
- a)
- un polipéptido como el expuesto en cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 7 e ID. SEC. nº 10;
- b)
- la forma de etiqueta histidínica de los polipéptidos cuyas secuencias se exponen en la ID. SEC. nº 2 (ID. SEC. nº 3) o ID. SEC. nº 5 (ID. SEC. nº 6) o ID. SEC. nº 7 (ID. SEC. nº 8) o ID. SEC. nº 10 (ID. SEC. nº 11);
- c)
- un polipéptido que comprende cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC. nº 11;
- d)
- una muteína de cualquiera de (a) a (c), en que la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 40% o 50% o 60% o 70% u 80% o 90% de identidad con respecto a al menos una de las secuencias de (a) a (c);
\newpage
- e)
- una muteína de cualquiera de (a) a (c), en que los cambios en la secuencia de aminoácidos son sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos de (a) a (c); y
- f)
- una sal o una isoforma, proteína de fusión, derivado funcional, fracción activa o derivado circularmente permutado de cualquiera de (a) a (e).
El invento se refiere además al uso de una
molécula de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis hepática, la
fibrosis pulmonar o la esclerodermia, molécula de ácido nucleico
que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un
polipéptido como el expuesto en cualquiera de las ID. SEC. nº 2,
ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC.
nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC. nº 11, y que comprende una
secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste
en:
- a)
- una secuencia de ácido nucleico como la expuesta en cualquiera de las ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº 4 e ID. SEC. nº 9;
- b)
- una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con el complemento de la secuencia de ácido nucleico de (a) bajo condiciones moderadamente rigurosas o bajo condiciones muy rigurosas; y
- c)
- una secuencia de ácido nucleico de cualquiera de (a) y (b), en que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos que tiene sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC. nº 11.
Dicha sustancia puede ser la propia INSP035 o
cualquier fragmento de INSP035 capaz de inhibir a TRAIL.
El cDNA de longitud completa de la INSP035
humana (Forma Larga de INSP035) ha sido clonado y se representa
como ID. SEC. nº 1 en la lista de secuencias adjunta. La
correspondiente secuencia de aminoácidos se proporciona como ID.
SEC. nº 2 en la lista de secuencias adjunta. El cDNA de la INSP035
humana comenzando en la segunda metionina (Forma Media de INSP035)
de la Forma Larga de INSP035 ha sido clonado y se representa como
ID. SEC. nº 4 en la lista de secuencias adjunta. La correspondiente
secuencia de aminoácidos se proporciona como ID. SEC. nº 5 en la
lista de secuencias adjunta. Se ha generado una Forma Media de
INSP035 modificada con una sustitución por isoleucina en la
posición 1 (Met - -> Ile), con la secuencia de aminoácidos
proporcionada como ID. SEC. nº 7. El cDNA de la INSP035 humana
comenzando en la tercera metionina (Forma Corta de INSP035) de la
Forma Larga de INSP035 ha sido clonado y se representa como ID. SEC.
nº 9 en la lista de secuencias adjunta. La correspondiente
secuencia de aminoácidos se proporciona como ID. SEC. nº 10 en la
lista de secuencias adjunta.
La expresión "tratamiento y/o prevención",
como se usa aquí, abarca toda atenuación, reducción o prevención o
bloqueo parcial, sustancial o completo de la formación, desarrollo o
progreso de la enfermedad o de la formación, desarrollo o progreso
de uno cualquiera o de varios o todos los síntomas de la
enfermedad.
La expresión "enfermedad fibrótica", como
se usa aquí, se refiere a enfermedades que acarrean fibrosis, que
puede ser debida, por ejemplo, a una inflamación crónica o a
reparación y reorganización de tejidos. La fibrosis puede afectar
al pulmón o al hígado. Por lo tanto, el invento se refiere al
tratamiento y/o la prevención de enfermedades fibróticas tales como
la fibrosis hepática y la fibrosis pulmonar. Otras enfermedades y
trastornos tratables con INSP035 comprenden la cicatrización de
heridas en el pulmón, que comprende inflamación crónica del pulmón
y finalmente fibrosis de superficies pulmonares. Los trastornos que
ocasionan inflamación del pulmón comprenden, por ejemplo, fibrosis
pulmonar idiopática, sarcoidosis, displasia broncopulmonar y ARDS
fibroproliferativa, así como manifestaciones pulmonares o
enfermedades sistémicas tales como la artritis reumatoide (Krein
et al., 2001).
La fibrosis implica generalmente generación o
proliferación de tejido conjuntivo, el cual sustituye a tejido
especializado funcional de un órgano dado. Por lo tanto, en una
realización preferida del presente invento, la enfermedad fibrótica
es una enfermedad del tejido conjuntivo, es decir,
esclerodermia.
El término "esclerodermia", como se usa
aquí, se refiere a una enfermedad también llamada esclerosis
sistémica o esclerodermia sistémica. Estas expresiones se utilizan
sinónimamente en la presente solicitud de patente. La esclerosis
sistémica es una enfermedad crónica de causa desconocida,
caracterizada por fibrosis difusa, cambios degenerativos y
anormalidades vasculares en la piel, estructuras articulares y
órganos internos (especialmente el esófago, el tracto
gastrointestinal, el pulmón, el corazón y el riñón, por ejemplo).
Puede ser localizada, o mixta, sistémica, limitada o difusa.
El término "esclerodermia" se refiere
preferiblemente a las esclerodermias localizada, sistémica,
limitada y difusa, así como a los síndromes de solapamiento.
La esclerodermia localizada afecta
principalmente a la piel, pero también puede afectar a los huesos y
músculos subyacentes. Sin embargo, no afecta generalmente a los
órganos internos. La esclerodermia localizada es relativamente
benigna y puede estar relacionada con la esclerodermia sistémica en
términos de síntomas superficiales similares, tal como el aspecto
de biopsias cutáneas bajo el microscopio.
La esclerodermia sistémica comprende varios
tipos de síntomas o grupos de síntomas, tal como CREST, limitada y
difusa. También se puede hacer referencia a ella como esclerosis
sistémica progresiva o esclerosis sistémica progresiva familiar. La
esclerodermia sistémica puede afectar, por ejemplo, a la piel, los
vasos sanguíneos y/u los órganos internos. Cuando afecta a la piel,
puede causar el endurecimiento de la piel, muy corrientemente en
las manos y/o la cara. Cuando afecta a los vasos sanguíneos, puede
causar la enfermedad de Raynaud. En las formas más graves de
esclerosis sistémica están afectados los órganos internos, lo que
puede causar incapacidad e incluso la muerte. La esclerosis
sistémica comprende, entre otros procesos: enfermedad pulmonar por
esclerodermia, crisis renal esclerodérmica, manifestaciones
cardíacas, debilidad muscular incluyendo fatiga y CREST limitada,
espasmo y dismotilidad gastrointestinales, y anormalidades en los
sistemas nerviosos central, periférico y autónomo. Con respecto a
las anormalidades del sistema nervioso, lo más común es el síndrome
del túnel carpiano seguido de la neuralgia del trigémino.
La esclerodermia limitada puede limitarse, por
ejemplo, a las manos, aunque también pueden estar afectadas la cara
y el cuello.
La esclerodermia difusa comprende tirantez de la
piel y también se presenta encima de las muñecas (o codos). Hay
varias subcategorías de esclerosis sistémica difusa, tales como la
"esclerodermia sin esclerodermia", en la que hay fibrosis de
órganos internos pero no tirantez de la piel, y la esclerosis
sistémica progresiva familiar, una forma rara que se presenta en
familias.
Se hace referencia a síndromes de solapamiento
cuando un paciente con esclerodermia también tiene otra enfermedad
autoinmune (tal como lupus, artritis reumatoide, etc.), tal como,
por ejemplo, en la esclerodermia difusa que solapa con lupus. Los
síntomas de esclerodermia pueden ser también parte de la enfermedad
mixta del tejido conjuntivo (MCTD; del inglés, mixed
connective tissue disease) o la enfermedad
indiferenciada del tejido conjuntivo (UCTD; del inglés,
undifferentiated connective tissue
disease).
El término "INSP035", como se usa aquí, se
refiere a una proteína que comprende toda, o una porción de, la
secuencia de la ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID.
SEC. nº 4, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº
8, ID. SEC. nº 9, ID. SEC. nº 10 o ID. SEC. nº 11 (todas humanas) de
la lista de secuencias adjunta, así como a sales, isoformas,
muteínas, fracciones activas, derivados funcionales y derivados
circularmente permutados de las mismas. Se puede utilizar una
INSP035 de una especie que no sea la humana, tal como de ratón o
rata, de acuerdo con el presente invento con tal de que haya una
identidad suficiente entre las proteínas que permita que la
proteína presente su actividad biológica y no genere una respuesta
inmune sustancial en un ser humano.
El término "INSP035", como se usa aquí, se
refiere además a cualquier fragmento, porción, dominio o subdominio
de la ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 4,
ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID.
SEC. nº 9, ID. SEC. nº 10 o ID. SEC. nº 11 que muestra la actividad
deseada en la esclerodermia u otras enfermedades fibróticas. Se
pueden utilizar fragmentos proteínicos, isoformas, formas
diferentemente glicosiladas o sialiladas o uno o más dominios de la
proteína de acuerdo con el invento con tal de que presenten
cualquier efecto beneficioso sobre la enfermedad fibrótica,
preferiblemente un efecto que sea al menos comparable al de la
proteína de longitud completa. El efecto beneficioso puede ser
medido en uno de los ensayos in vitro o in vivo
descritos más adelante en los ejemplos, o en cualquier otro ensayo
adecuado para demostrar un efecto en enfermedades fibróticas, en
particular en la esclerodermia.
De acuerdo con el presente invento, INSP035
puede ser una proteína presente en la naturaleza, es decir, nativa,
o una proteína recombinante. La producción recombinante puede ser
llevada a cabo en células eucarióticas, tales como células de
levadura o células de mamífero, preferiblemente en células CHO, en
células de riñón embrionario humano (HEK; del inglés, human
embryonic kidney) o en fibroblastos humanos o líneas
celulares de fibroblasto humano. Además, puede ser llevada a cabo
en células procarióticas tales como E. coli.
Preferiblemente, INSP035 está glicosilada en uno
o más sitios. También puede estar sin glicosilar, dependiendo de
las necesidades dadas y de la fuente de producción o aislamiento de
la proteína.
El término "sales" se refiere aquí tanto a
sales de grupos carboxilo como a sales de grupos amino, por adición
de ácido, de la molécula de INSP035 o de compuestos análogos de la
misma. Las sales de un grupo carboxilo pueden ser formadas por
medios conocidos en la técnica e incluyen sales inorgánicas, tales
como, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, férricas o de
zinc, y similares, y sales con bases orgánicas como las formadas,
por ejemplo, con aminas tales como trietanolamina, arginina o
lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales por adición de
ácido incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales, tales como,
por ejemplo, ácido clorhídrico y ácido sulfúrico, y sales con
ácidos orgánicos, tales como, por ejemplo, ácido acético y ácido
oxálico. Por supuesto, dichas sales deben conservar la actividad
biológica de INSP035 que es relevante para el presente invento, es
decir, deben ejercer un efecto beneficioso sobre enfermedades
fibróticas, en particular sobre la esclerodermia.
También se pueden utilizar isoformas o variantes
de corte y empalme de INSP035 de acuerdo con el invento, con tal de
que sean capaces de inhibir el progreso y/o los síntomas de esa
enfermedad.
Como se usa aquí, el término "muteínas" se
refiere a compuestos análogos de INSP035 en que uno o más de los
residuos de aminoácido de la INSP035 natural han sido sustituidos
por residuos de aminoácido diferentes o han sido suprimidos, o se
han añadido uno o más residuos de aminoácido a la secuencia natural
de INSP035, que tienen preferiblemente al menos la misma actividad
que la INSP035 de tipo silvestre o que incluso tienen una actividad
mucho más potente. La actividad biológica de INSP035 puede ser
medida, por ejemplo, analizando la capacidad de INSP035 para
inhibir a TRAIL. Los ensayos para evaluar interacciones
proteína-proteína son bien conocidos por la persona
experta en la técnica. Son ejemplos de dichos ensayos los ensayos de
unión de tipo ELISA (ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas;
en inglés, enzyme-linked immunosorption
assay), los ensayos de inmunoprecipitación, y la medición en
cualquier otro sistema adecuado, tal como el sistema BIAcore. Estas
muteínas son preparadas mediante conocidas técnicas de síntesis y/o
de mutagénesis dirigida al sitio o mediante cualquier otra técnica
conocida y adecuada para ello.
Cualquiera de dichas muteínas tiene
preferiblemente una secuencia de aminoácidos suficientemente
duplicativa de la de INSP035, de modo que tiene al menos una
actividad sustancialmente similar a la de INSP035. La actividad de
una INSP035 mutante puede ser adicionalmente probada en los ensayos
explicados más adelante en los ejemplos (Ejemplo 2) o en los
ejemplos descritos en el Documento WO03/084560. La medición, por
ejemplo, de la cantidad de síntesis de colágeno en fibroblastos
tratados con INSP035 puede ser un ensayo adecuado para evaluar la
actividad de muteínas de INSP035.
Las muteínas de acuerdo con el presente invento
incluyen proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal como DNA
o RNA, que se hibrida con DNA o RNA que codifica INSP035, de acuerdo
con el presente invento, bajo condiciones rigurosas. La expresión
"condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones de la
hibridación y el lavado subsiguiente a las que quienes tienen
experiencia normal en la técnica se refieren convencionalmente como
"rigurosas". Véanse Ausubel et al., Current Protocols
in Molecular Biology, Interscience, New York, EE.UU., secciones
6.3 y 6.4 (1987, 1992), y Sambrook et al. [J. C. Sambrook, E.
F. Fritsch y T. Maniatis (1989), Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
New York, EE.UU.].
Sin limitación, los ejemplos de condiciones
rigurosas incluyen condiciones de lavado 12-20ºC por
debajo de la Tm calculada del híbrido bajo estudio en, por ejemplo,
SSC 2x y SDS al 0,5% durante 5 minutos, SSC 2x y SDS al 0,1%
durante 15 minutos, SSC 0,1x y SDS al 0,5% a 37ºC durante
30-60 minutos, y luego SSC 0,1x y SDS al 0,5% a
68ºC durante 30-60 minutos. Quienes tienen una
experiencia normal en esta técnica entienden que las condiciones de
rigor también dependen de la longitud de las secuencias de DNA,
sondas oligonucleotídicas (tales como de 10-40
bases) o sondas oligonucleotídicas mixtas. Si se usan sondas mixtas,
es preferible usar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en lugar de
SSC (véase Ausubel, supra).
Cualquiera de dichas muteínas tiene
preferiblemente una secuencia de aminoácidos suficientemente
duplicativa de la de INSP035, de modo que tiene una actividad
biológica sustancialmente similar a, o incluso mejor que, la de
INSP035.
Una actividad fácilmente mensurable de INSP035
es su capacidad para reducir la síntesis de colágeno. Con tal de
que la muteína tenga una sustancial actividad reductora de la
síntesis de colágeno, se puede considerar que tiene una actividad
sustancialmente similar a la de INSP035. De esta manera, por medio
de una experimentación rutinaria a que se somete dicha muteína, se
puede determinar si cualquier muteína dada tiene al menos
sustancialmente la misma actividad que INSP035.
En una realización preferida, cualquiera de
dichas muteínas tiene al menos un 40% de identidad u homología con
respecto a la secuencia de INSP035. Más preferiblemente, tiene al
menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o,
muy preferiblemente, al menos un 90%, de identidad u homología con
respecto a aquella.
La identidad refleja una relación entre dos o
más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias
polinucleotídicas, determinada por comparación de las secuencias.
En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta,
nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido, de los dos
polinucleótidos o las dos secuencias polipeptídicas,
respectivamente, en toda la longitud de las secuencias que se
comparan.
Para las secuencias en que no haya una
correspondencia exacta, se puede determinar un "% de
identidad". En general, las dos secuencias que se van a comparar
son alineadas para obtener la máxima correlación entre las
secuencias. Esto puede incluir la inserción de "huecos" en una
o ambas secuencias para aumentar el grado de alineación. El % de
identidad se puede determinar para la longitud completa de cada una
de las secuencias que se comparan (la llamada "alineación
global"), lo que es particularmente adecuado para secuencias que
tienen la misma longitud o una longitud muy similar, o para
longitudes definidas más cortas (la llamada "alineación
local"), lo que es más adecuado para secuencias de longitud
diferente.
Los métodos para comparar la identidad y la
homología de dos o más secuencias son bien conocidos en la técnica.
De este modo, por ejemplo, se pueden usar programas asequibles en el
Winconsin Sequence Analysis Package, versión 9.1 (J.
Devereaux et al., 1984), por ejemplo, los programas BESTFIT y
GAP, para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y
el % de identidad y el % de homología entre dos secuencias
polipeptídicas. BESTFIT utiliza el algoritmo de "homología
local" de Smith y Waterman (1981) y encuentra la mejor región
única de similitud entre dos secuencias. En la técnica también se
conocen otros programas para determinar la identidad y/o similitud
entre secuencias, tales como, por ejemplo, la familia BLAST de
programas (S. F. Altschul et al., 1990; S. F. Altschul et
al., 1997, accesible a través de la página de inicio del NCBI en
www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (W. R. Pearson, 1990; Pearson,
1988).
Las muteínas de INSP035, que pueden ser
utilizadas de acuerdo con el presente invento, o los ácidos
nucleicos que las codifican, incluyen un conjunto finito de
secuencias sustancialmente correspondientes como polinucleótidos o
péptidos de sustitución que pueden ser rutinariamente obtenidos por
quien tiene una experiencia normal en la técnica, sin una
experimentación excesiva, basándose en las enseñanzas y la
orientación aquí presentadas.
Los cambios preferidos para las muteínas de
acuerdo con el presente invento son los que se conocen como
sustituciones "conservativas". Las sustituciones de aminoácido
conservativas en los polipéptidos o proteínas INSP035 pueden
incluir, dentro de un grupo, aminoácidos sinónimos que tengan
propiedades fisicoquímicas suficientemente similares para que la
sustitución entre miembros del grupo conserve la función biológica
de la molécula (Grantham, 1974). Es evidente que también se pueden
realizar inserciones y deleciones de aminoácidos en las secuencias
anteriormente definidas sin que se altere su función,
particularmente si las inserciones o deleciones sólo afectan a unos
pocos aminoácidos, por ejemplo, menos de treinta y preferiblemente
menos de diez, y sin que se eliminen ni desplacen aminoácidos que
son críticos para una conformación funcional, por ejemplo, los
residuos de cisteína. Las proteínas y muteínas producidas mediante
dichas deleciones y/o inserciones caen dentro del alcance del
presente invento.
Preferiblemente, los grupos de aminoácidos
sinónimos son los definidos en la Tabla I. Más preferiblemente, los
grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla II; y
muy preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los
definidos en la Tabla III.
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Los ejemplos de producción de sustituciones de
aminoácidos en proteínas que se pueden usar para obtener muteínas
de proteínas o polipéptidos INSP035 para uso en el presente invento
incluyen cualesquier operaciones metódicas conocidas, tales como
las presentadas en las Patentes de EE.UU. 4.959.314, 4.588.585 y
4.737.462, concedidas a Mark et al.; 5.116.943, concedida a
Koths et al.; 4.965.195, concedida a Namen et al.;
4.879.111, concedida a Chong et al.; y 5.017.691, concedida
a Lee et al.; y las proteínas sustituidas con lisina
presentadas en la Patente de EE.UU. nº 4.904.584 (Shaw et
al.).
La expresión "proteína de fusión" se
refiere a un polipéptido que comprende INSP035, o una muteína del
mismo, fusionado con otra proteína que, por ejemplo, tiene un
tiempo de permanencia prolongado en los fluidos corporales. De
acuerdo con el invento, se prefieren las proteínas de fusión que
comprenden toda la, o una parte funcional de, INSP035 fusionada con
toda, o una parte funcional de, una proteína capaz de mejorar las
actividades biológicas de la molécula, tal como, por ejemplo, la
semivida en el organismo humano. En una realización preferida, la
proteína de fusión comprende una fusión de inmunoglobulina (Ig). Las
proteínas de fusión que comprenden toda, o parte de, la INSP035
fusionada con toda, o parte de, una inmunoglobulina son muy
preferidas. Pueden ser monómeras o multímeras, heteromultímeras u
homomultímeras. Ventajosamente, la proteína de fusión comprende la
región constante de una inmunoglobulina, en particular de la porción
Fc de la inmunoglobulina. De acuerdo con el invento, se prefieren
más las realizaciones en que la inmunoglobulina es del isotipo IgG1
o IgG2. Preferiblemente, la fusión es una fusión de Fc.
Por lo tanto, la INSP035 puede ser fusionada con
otra proteína, polipéptido o similar, por ejemplo, una
inmunoglobulina o un fragmento de la misma. La fusión puede ser
directa o por medio de un corto péptido conector que puede tener
una longitud de tan sólo 1 a 3 residuos de aminoácido o más, por
ejemplo, una longitud de 13 residuos de aminoácido. Dicho conector
puede ser, por ejemplo, un tripéptido de secuencia
E-F-M
(Glu-Phe-Met) o una secuencia
conectora de 13 aminoácidos que comprende
Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met,
introducida entre la secuencia de INSP035 y la secuencia
inmunoglobulínica.
Como se usan aquí, los "derivados
funcionales" abarcan derivados de INSP035 y sus muteínas y
proteínas de fusión, que se pueden preparar por medios conocidos en
la técnica a partir de los grupos funcionales que se encuentran
como cadenas laterales en los residuos o en los grupos N- o
C-terminales, y son incluidos en el invento con tal
de que permanezcan farmacéuticamente aceptables, es decir, que no
destruyan la actividad de la proteína que es al menos
sustancialmente similar a la actividad de INSP035 y no confieran
propiedades tóxicas a las composiciones que los contienen. Por lo
tanto, en una realización preferida, el derivado funcional comprende
al menos un resto fijado a uno o más grupos funcionales que se
encuentran como una o más cadenas laterales en los residuos de
aminoácido.
De acuerdo con el presente invento, las cadenas
laterales de polietilenglicol (PEG) son restos muy preferidos. Las
cadenas laterales de PEG pueden enmascarar sitios antigénicos y
prolongar en los fluidos corporales la permanencia de la sustancia
a la que están fijados. Otros derivados incluyen ésteres alifáticos
de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por
reacción con amoniaco o con aminas primarias o secundarias,
derivados N-acílicos de grupos amino libres de los
residuos de aminoácido, formados con restos acilo (por ejemplo,
grupos alcanoilo o aroilo carbocíclico), o derivados
O-acílicos de grupos hidroxilo libres (por ejemplo,
de residuos de serilo o treonilo) formados con restos acilo.
Las "fracciones activas" de INSP035 y sus
muteínas y proteínas de fusión abarcan fragmentos o precursores de
la cadena polipeptídica de la molécula proteica, solos o junto con
moléculas o residuos asociados unidos a ellas, por ejemplo,
residuos de azúcar o fosfato, o agregados de la molécula proteica o
los residuos de azúcar solos, con tal de que dicha fracción activa
tenga al menos una actividad sustancialmente similar a la de
INSP035.
También se puede administrar INSP035 al cuerpo
humano en forma de un vector que comprende dicha molécula de ácido
nucleico. Por lo tanto, el invento se refiere además al uso de un
vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico, para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención
de la esclerodermia u otro trastorno fibrótico. Preferiblemente, el
vector es un vector de expresión que comprende un promotor
operativamente unido a toda la secuencia de codificación de INSP035
o a parte de ella. En una realización preferida más, el vector es
un vector para terapia génica. Los vectores para terapia génica son
conocidos en la técnica y la mayoría de ellos son vectores
víricamente derivados, tales como vectores adenovíricos o
lentivíricos.
También se puede administrar INSP035 al cuerpo
humano en forma de una célula que produce y/o secreta INSP035. Por
lo tanto, el invento se refiere además al uso de una célula que
expresa INSP035, para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia o cualquier otra
enfermedad fibrótica, es decir, a terapia celular para el
tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia u otras
enfermedades fibróticas. La célula puede ser una célula que produce
naturalmente INSP035 y/o una célula transfectada que produce
INSP035 recombinante. Se prefieren las células que expresan y
secretan elevadas cantidades de la proteína, tales como células de
sobreexpresión que llevan elevados números de copias de un vector de
expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica
INSP035.
Puesto que los fibroblastos representan la
maquinaria de la fibrosis, son las células más adecuadas para una
terapia antifibrótica y antiesclerodérmica. Por lo tanto, de acuerdo
con el presente invento se usan preferiblemente fibroblastos que
expresan INSP035.
El invento se refiere además a una célula que
comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico
que codifica toda la INSP035 o parte de ella, para la preparación de
un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de
enfermedades fibróticas, en particular de la esclerodermia. Dentro
del alcance del presente invento está también una célula que ha
sido genéticamente modificada para que produzca un polipéptido de
acuerdo con el invento.
De acuerdo con el invento, también se contempla
el uso de un vector de expresión para inducir y/o potenciar la
producción endógena de INSP035 en una célula que es normalmente muda
o que expresa cantidades insuficientes del inhibidor. Por lo tanto,
en el invento se utiliza una tecnología conocida como "activación
génica endógena" (EGA; del inglés, endogenous gene
activation) para la producción de la proteína deseada.
También se mostró aquí que INSP035 no induce la
expresión endógena de OPG, lo que indica que INSP035 no está
actuando a través de OPG (Figura 3). Esto sugiere que el uso de la
combinación de INSP035 y OPG podría actuar de modo aditivo o
sinérgico en el tratamiento de la fibrosis. De la misma manera, se
pueden combinar diversos tratamientos distintos con INSP035 para
obtener un efecto aditivo o sinérgico de acuerdo con el presente
invento. Por lo tanto, el medicamento del invento comprende además
preferiblemente:
- \bullet
- Osteoprotegerina (OPG);
- \bullet
- Interferón, en particular interferón \beta;
- \bullet
- Un antagonista del factor de necrosis tumoral (TNF; del inglés, tumor necrosis factor), en particular TNFRs solubles, tales p55 soluble (TBP I) y/o p75 soluble (TBP II);
- \bullet
- Un agente antiesclerodérmico más;
- \bullet
- Un agente antiesclerodérmico seleccionado del grupo que consiste en halofuginona, inhibidores de la enzima conversiva de angiotensina (ACE), bloqueadores del canal del calcio, inhibidores de la bomba de protones, fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAID), tal como ibuprofeno, inhibidores de la ciclooxigenasa (COX), corticosteroides, tal como prednisona, tetraciclina, pentoxifilina, bucilamina, inhibidores de la geranil-geranil transferasa, roterlina, inhibidores de la prolil-4-hidroxilasa, inhibidores de la proteinasa c, inhibidores de la lisil-oxidasa, relaxina, halofuginona, prostaglandinas, prostaciclinas, endotelina 1, óxido nítrico, inhibidores de la angiotensina II, interleucina 10, interleucina 8, leucotrieno B4, ácido ursodesoxicólico, antioxidantes y SARP-1.
SARP-1 es una proteína conocida
por ejercer un efecto beneficioso en enfermedades fibróticas tales
como la esclerodermia (Documento WO02/46225). De acuerdo con el
presente invento, también se pueden usar fragmentos, isoformas,
fracciones activas, proteínas de fusión o derivados funcionales de
SARP-1, como se describen en el Documento
WO02/46225, en combinación con INSP035.
Todos los tratamientos están destinados a un uso
simultáneo, secuencial o independiente.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
una o más de las sustancias anteriores junto con INSP035 están
dentro del alcance del presente invento.
Aunque actualmente no hay cura para la
esclerodermia, se están utilizando actualmente diversos agentes o
tratamientos para tratar los síntomas de la esclerodermia. Dichos
agentes antiesclerodérmicos, que pueden ser usados como terapia de
combinación de acuerdo con el invento, son resumidos, por ejemplo,
en Leighton (2001) y Wigley y Sule (2001), que aquí se incorporan
totalmente por referencia.
Los interferones son fundamentalmente conocidos
por sus efectos inhibidores sobre la replicación viral y la
proliferación celular. El interferón \gamma, por ejemplo,
desempeña un papel importante en la activación de respuestas
inmunes e inflamatorias. Se dice que el interferón \beta
(IFN-\beta, un interferón de tipo I) desempeña un
papel antiinflamatorio.
En aún otra realización del invento, se usa
INSP035 en combinación con un antagonista de TNF. Los antagonistas
de TNF ejercen su actividad de varias formas. En primer lugar, los
antagonistas se pueden unir a, o secuestrar, la propia molécula de
TNF con la afinidad y la especificidad suficientes para neutralizar
parcial o sustancialmente el epítopo o epítopos de TNF responsables
de la unión al receptor de TNF (en adelante denominados
"antagonistas secuestradores"). Un antagonista secuestrador
puede ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra el TNF.
Alternativamente, los antagonistas de TNF pueden
inhibir la vía de señalización de TNF activada por el receptor de
la superficie celular después de la unión del TNF (en adelante
denominados "antagonistas de señalización"). Los antagonistas
de TNF son fácilmente identificados y evaluados mediante la
exploración rutinaria de candidatos en cuanto a sus efectos sobre
la actividad del TNF nativo sobre líneas celulares susceptibles
in vitro, por ejemplo, células B humanas, en las cuales el
TNF causa proliferación y secreción de inmunoglobulinas. El ensayo
contiene la formulación de TNF en diversas diluciones del
antagonista candidato, por ejemplo, de 0,1 a 100 veces la cantidad
molar de TNF usada en el ensayo, y los testigos sin TNF o sólo con
el antagonista (Tucci et al., 1992).
Los antagonistas secuestradores son los
antagonistas de TNF preferidos para ser utilizados de acuerdo con
el presente invento. Entre los antagonistas secuestradores, se
prefieren los polipéptidos que se unen a TNF con elevada afinidad y
poseen baja inmunogenicidad. Se prefieren particularmente moléculas
receptoras solubles de TNF y anticuerpos neutralizantes hacia TNF.
Por ejemplo, las formas solubles de TNF-RI (p55) y
TNF-RII (p75) son útiles en el presente invento.
Las formas truncadas de estos receptores, que comprenden los
dominios extracelulares de los receptores o porciones funcionales
de los mismos, son antagonistas más particularmente preferidos de
acuerdo con el presente invento. En, por ejemplo, el Documento
EP914431 se describen receptores solubles truncados de tipo I y
tipo II de TNF.
Las formas truncadas de los receptores de TNF
son solubles y han sido detectadas en orina y suero como proteínas
ligantes e inhibidoras de TNF, de aproximadamente 30 kDa y 40 kDa,
que son llamadas TBP-I y TBP-II,
respectivamente (Engelmann et al., 1990). De acuerdo con el
invento, se prefiere el uso simultáneo, secuencial o independiente
de INSP035 con el antagonista de TNF y/o un interferón.
De acuerdo con el invento, TBP-I
y TBP-II son antagonistas de TNF preferidos para ser
utilizados en combinación con una INSP035. Los derivados,
fragmentos, regiones, y porciones biológicamente activas de las
moléculas receptoras que se parecen funcionalmente a las moléculas
receptoras pueden ser también utilizados en el presente invento.
Dicho equivalente o derivado biológicamente activo de la molécula
receptora se refiere a la porción del polipéptido, o de la
secuencia que codifica la molécula receptora, que tiene el tamaño
suficiente y es capaz de unirse a TNF con una afinidad tal que la
interacción con el receptor de TNF unido a la membrana resulta
inhibida o bloqueada.
En una realización preferida más,
TNF-RI (TBP-I) soluble humano es el
antagonista de TNF que se va a utilizar de acuerdo con el invento.
En las Patentes Europeas EP 308.378, EP 398.327 y EP 433.900 se han
descrito las moléculas receptoras de TNF solubles naturales y
recombinantes y métodos para su producción.
Aunque puede resultar beneficioso bloquear el
TNF-\alpha en fases tempranas de la enfermedad, se
ha discutido que, en fases posteriores, el propio TNF puede ejercer
un efecto beneficioso sobre la esclerodermia (Abraham et
al., 2000). Por lo tanto, el invento se refiere además a una
combinación de INSP035 y TNF para el tratamiento o la prevención de
la esclerodermia, en particular en fases avanzadas de la enfermedad.
De acuerdo con el invento se puede utilizar
TNF-\alpha o TNF-\beta.
TNF-\alpha o TNF-\beta.
El invento se refiere además a una composición
farmacéutica que comprende INSP035, opcionalmente junto con uno o
más vehículos, agentes diluyentes o excipientes farmacéuticamente
aceptables, para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades
fibróticas, en particular la esclerodermia. La composición
farmacéutica puede comprender además cualquiera de los componentes
adicionales anteriormente identificados, y, en particular, un
interferón, una proteína ligante de TNF (TBP; del inglés, TNF
binding protein) o un inhibidor de COX.
La composición farmacéutica de acuerdo con el
invento puede comprender también un vector que comprende una
molécula de ácido nucleico de acuerdo con el invento, o una célula
que expresa INSP035.
Los ingredientes activos del producto
farmacéutico, es decir los polipéptidos, ácidos nucleicos o células
de acuerdo con el invento, o combinaciones de los mismos, así como
las combinaciones de sustancias anteriormente mencionadas, se
pueden administrar a un individuo de diversas formas. Las vías de
administración incluyen las vías intradérmica, transdérmica (por
ejemplo, en formulaciones de liberación lenta), intramuscular,
intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, epidural, tópica e
intranasal. Se puede utilizar cualquier otra vía terapéuticamente
eficaz de administración, tal como, por ejemplo, la absorción a
través de tejidos epiteliales o endoteliales o mediante una terapia
génica con la que se administra al paciente una molécula de DNA que
codifica el agente activo (por ejemplo, a través de un vector), lo
que causa que el agente activo sea expresado y secretado in
vivo. Además, la(s) proteína(s) de acuerdo con el
invento puede(n) ser administrada(s) junto con otros
componentes de agentes biológicamente activos, tales como agente
tensioactivos, excipientes, agentes diluyentes y vehículos
farmacéuticamente
aceptables.
aceptables.
Con la definición de "farmacéuticamente
aceptable" se quiere abarcar cualquier vehículo que no interfiere
en la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo y
que no es tóxico para el huésped al que se administra. Por ejemplo,
para administración parenteral, la(s) proteína(s)
activa(s) puede(n) ser formulada(s) en una
forma de dosificación unitaria para inyección en vehículos tales
como disolución salina, disolución de dextrosa, albúmina sérica y
disolución de Ringer.
Para administración parenteral (por ejemplo,
intravenosa, subcutánea o intramuscular), la(s)
proteína(s) activa(s) puede(n) ser
formulada(s) en forma de disolución, suspensión, emulsión o
polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral
farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua, disolución salina o
disolución de dextrosa) y aditivos que mantienen la isotonicidad
(por ejemplo, manitol) o la estabilidad química (por ejemplo,
conservantes y tampones). La formulación es esterilizada mediante
técnicas comúnmente empleadas.
La biodisponibilidad de la(s)
proteína(s) activa(s) de acuerdo con el invento puede
ser también mejorada al utilizar procedimientos de conjugación que
aumentan la semivida de la molécula en el cuerpo humano, tal como,
por ejemplo, uniendo la molécula a polietilenglicol, como se
describe en la Solicitud de Patente PCT WO 92/13095.
La cantidad terapéuticamente eficaz de
la(s) proteína(s) activa(s) será función de
muchas variables, incluyendo el tipo de receptor, la afinidad de la
sustancia de acuerdo con el invento por su receptor, toda actividad
citotóxica residual mostrada por ella, la vía de administración y el
estado clínico del paciente.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de
la sustancia de acuerdo con el invento es aquella que, cuando se
administra, da lugar a un efecto beneficioso sobre el desarrollo o
el progreso in vivo de la enfermedad. La dosificación
correspondiente a un individuo, en forma de dosis únicas o
múltiples, variará dependiendo de una diversidad de factores que
incluyen las propiedades farmacocinéticas de INSP035, la vía de
administración, el estado y las características del paciente (sexo,
edad, peso corporal, salud, tamaño), la extensión de los síntomas,
los tratamientos concurrentes, la frecuencia de tratamiento y el
efecto deseado. El ajuste y la manipulación de los intervalos de
dosificación establecidos están dentro de la capacidad de quienes
tienen experiencia en la técnica.
La dosis requerida del polipéptido de acuerdo
con el invento variará de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg o de
aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg o de aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg o
de aproximadamente 1 a 3 mg/kg aunque, como se indicó
anteriormente, estará sometida en gran medida al juicio terapéutico.
El medicamento del invento puede ser administrado diariamente, un
día si y otro no, o tres veces por semana.
Las dosis diarias se administran normalmente en
dosis divididas o en una forma de liberación continua, eficaz para
obtener los resultados deseados. Las administraciones segundas o
subsiguientes pueden ser llevadas a cabo en una dosis que sea
igual, menor o mayor que la dosis inicial o previa administrada al
individuo. La administración segunda o subsiguiente puede ser
administrada durante la enfermedad o antes del inicio de la
enfermedad.
También se describe un método para tratar y/o
prevenir enfermedades fibróticas, en particular la esclerodermia,
que comprende administrar una cantidad eficaz de una sustancia de
acuerdo con el invento, opcionalmente junto con un vehículo
farmacéuticamente aceptable, a un paciente que la necesita.
Alternativa o adicionalmente, se puede administrar una célula que
produzca INSP035 o una molécula de ácido nucleico del invento,
opcionalmente comprendida en un vector de expresión.
El vector de expresión puede ser administrado
sistémicamente. El vector de expresión se administra preferiblemente
mediante inyección intramuscular. Otra vía preferida de
administración es por inhalación, en particular si está implicada
una fibrosis pulmonar en la enfermedad. La administración tópica de
un vector de expresión que comprende secuencias de INSP035, o de un
polipéptido INSP035 de acuerdo con el invento, es otra vía preferida
de administración, en particular si hay una afectación de la
piel.
El invento se refiere además a un método para la
preparación de una composición farmacéutica, que comprende mezclar
una cantidad eficaz de INSP035 con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
La referencia a operaciones metódicas conocidas,
operaciones metódicas convencionales, métodos conocidos o métodos
convencionales no es en modo alguno una admisión de que cualquier
aspecto, descripción o realización del presente invento está
descrito, enseñado o sugerido en la técnica pertinente.
La precedente descripción de las realizaciones
específicas revelará así totalmente la naturaleza general del
invento que otros, aplicando los conocimientos propios de la
experiencia de la técnica (incluyendo los contenidos de las
referencias aquí citadas), pueden modificar y/o adaptar fácilmente
para diversas aplicaciones, tales como realizaciones específicas,
sin una experimentación excesiva y sin apartarse del concepto
general del presente invento. Por lo tanto, dichas adaptaciones y
modificaciones son consideradas como una variedad de equivalentes
de las realizaciones descritas, basándose en la enseñanza y la
orientación aquí presentadas. Ha de entenderse que la fraseología o
terminología presente es con el fin de descripción y no de
limitación, de modo que la terminología o fraseología de la
presente memoria descriptiva ha de ser interpretada por el técnico
experto a la luz de las enseñanzas y la orientación aquí
presentadas, en combinación con los conocimientos de quien tiene
una experiencia normal en la técnica.
Una vez descrito el invento, será más fácilmente
entendido por referencia a los ejemplos siguientes que se
proporcionan a modo de ilustración y no están destinados a ser
restrictivos del presente invento.
\vskip1.000000\baselineskip
En el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2 del Documento
WO03/054012 se describen la clonación de INSP035, la construcción
de plásmidos para la expresión de INSP035 en células HEK293/EBNA, la
identificación de moldes/bancos de cDNA que contienen INSP035, y la
expresión de
INSP035-Long-6His-V1
en células de mamífero.
Se ha mostrado que el ligando inductor de la
apoptosis relacionado con TNF (TRAIL; del inglés,
TNF-related apoptosis-inducing
ligand) es uno de los ligandos celulares de la
osteoprotegerina (OPG). Se desarrolló un ensayo secundario que
mimetizaba esta interacción fisiológica en fibroblastos. Este
ensayo, la neutralización de la apoptosis en fibroblastos tratados
con TRAIL recombinante humano soluble, es indicado para seleccionar
receptores de TRAIL posiblemente nuevos y nuevas proteínas y
pequeñas moléculas con actividad antiapoptótica.
- \quad
- Placa para cultivo tisular de 96 pocillos (Ref. Costar nº 3596).
- \quad
- Lector de placas de 96 pocillos, con filtro de 490 nm.
- \quad
- Software "GraphPad Prism".
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Fibroblastos L929 de ratón (CCL-1) (Colección Americana de Cultivos Tipo; ATCC)
- \quad
- Medio DMEM (32430-027; Gibco BRL).
- \quad
- Suero bovino fetal estéril.
- \quad
- Actinomicina D (Fluka, Ref. 01817).
- \quad
- TRAIL/TNFS10 humano recombinante.
- \quad
- CytoTox 96® no radiactivo (Promega G179A).
- \quad
- Osteoprotegerina (testigo positivo).
- \quad
- INSP035.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron las células hasta que alcanzaron
la confluencia. Las células fueron luego tratadas con tripsina y
fueron sembradas en DMEM con suero de ternera fetal (FCS; del
inglés, fetal calf serum) al 2%, en una
concentración de 20.000 células/pocillo. El volumen final fue 100
\mul/pocillo. La disolución fue luego incubada durante la noche a
37ºC en una cámara humidificada con CO_{2} al 5%. El medio fue
cambiado por DMEM con FCS al 2% y actinomicina D en una
concentración final de 1 \mug/ml. A continuación se añadieron 2
ng/ml de rTRAIL (375TEC) para inducir la apoptosis y se incubó la
mezcla durante 24 horas en una cámara humidificada con CO_{2} al
5%. Luego se retiró el medio acondicionado y se tomaron muestras
para el ensayo de citotoxicidad.
En el ensayo de citotoxicidad, siempre se midió
la apoptosis en presencia de rTRAIL. Por lo tanto, el efector
positivo fue TRAIL en una concentración de 2 ng/ml. 30 minutos antes
de la adición de TRAIL, se añadió la molécula de referencia OPG (10
ng/ml), INSP035 o leptina.
El ensayo de citotoxicidad es un ensayo
colorimétrico en el que se mide la producción de lactato
deshidrogenasa.
En primer lugar, se transfirieron 50 \mul del
sobrenadante a la placa. En segundo lugar, se utilizó el tampón de
ensayo para reconstituir la mezcla de sustratos. Luego se añadieron
50 \mul de mezcla de sustratos reconstituida a cada pocillo del
sobrenadante. A continuación, la placa fue cubierta y fue incubada
durante 30 minutos a temperatura ambiental, protegida de la luz.
Luego se añadieron 50 \mul de disolución de parada a cada pocillo
y se registró la absorbancia a
490 nm.
490 nm.
Para determinar si INSP035 estimula la
producción endógena de OPG o no, se cultivaron células L929 en
placas de 96 pocillos con diversas cantidades de variantes de
INSP035 (como se describió para el ensayo de citotoxicidad). Para
el ensayo de producción de OPG, se tomaron 50 \mul del medio
acondicionado. Se utilizó el sistema de ELISA para OPG (BIOMEDICA,
Ref. BI-20402 del catálogo) para medir la producción
de OPG 24 horas y 48 horas después del tratamiento con INSP035.
INSP035 y sus variantes son potentes inhibidores
de TRAIL en un ensayo in vitro diseñado para seleccionar
moléculas antiapoptóticas en fibroblastos, con osteoprotegerina
(OPG) como testigo (véase la Figura 1; se obtuvieron curvas
similares con las demás variantes). Por consiguiente, como OPG,
INSP035 es capaz de contrarrestar el efecto apoptótico de TRAIL
recombinante humano soluble sobre los fibroblastos, reduciendo
consistentemente por ello la apoptosis de fibroblastos. En el mismo
ensayo, la leptina no afectó a la apoptosis mediada por TRAIL
(Figura 2).
Los resultados del inmunoensayo enzimático de
OPG sugieren que es que probable que INSP035, actuando a través de
una vía diferente a la de OPG, actúe de un modo aditivo o sinérgico
con OPG en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades
fibróticas.
Basándose en los hallazgos anteriores y en el
hecho de que TRAIL estimula la producción de colágeno, se sugiere
que INSP035 podría resultar útil en el tratamiento y/o la prevención
de enfermedades fibróticas.
Se mutó
pENTR-INSP035-6HIS, un plásmido
compatible con el sistema de clonación Gateway^{TM}, por
mutagénesis dirigida al sitio con objeto de insertar una secuencia
de Shine-Dalgarno (5'-AAGGAGATG)
cadena arriba del codón de inicio del cDNA de INSP035. El plásmido
mutado resultante fue luego sometido a una reacción de recombinación
con el vector de expresión pDEST14 de E. coli para crear
pDEST14-SD-INSP035-6HIS.
Se diseñó un par de cebadores para PCR,
INSP035-MF e INSP035-MR (Tabla 4),
de modo que los cebadores se hibridaran con cadenas opuestas de la
secuencia del plásmido
pENTR-INSP035-6HIS y cada cebador se
hibridara con 15-25 bases de cada lado de la región
que se iba a insertar. Los cebadores para PCR fueron optimizados
para que tuvieran una Tm superior o igual a 78ºC, un contenido
mínimo de GC de 40%, y una G o una C como base
3'-terminal. Los cebadores fueron diseñados y
optimizados usando el "Primer Designer Software" (Scientific
& Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC
27722-2045, EE.UU.). Los cebadores fueron
purificados por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE; del
inglés, polyacrylamide gel
electrophoresis).
La mutagénesis dirigida al sitio fue llevada a
cabo utilizando el sistema QuickChange® (Stratagene) para
mutagénesis dirigida al sitio, de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. La reacción de mutagénesis fue llevada a cabo usando
el sistema QuickChange (Stratagene) para mutagénesis en un volumen
final de 50 \mul que contenía:
- 5 \mul de tampón 10x de reacción,
- 100 ng de DNA del plásmido
pENTR-INSP035-6HIS,
- 125 ng de cebador
INSP035-MF,
- 125 ng de cebador
INSP035-MR,
- 1 \mul de mezcla de dNTPs,
- 3 \mul de disolución QuicK, y
- 1 \mul de DNA polimerasa Pfu
Turbo.
La termociclación fue llevada a cabo usando un
equipo DNA Engine de MJ Research, programado del modo siguiente:
95ºC, 1 minuto; 18 ciclos de 95ºC, 50 segundos, 60ºC, 50 segundos, y
68ºC, 3 minutos; seguidos de un ciclo de elongación adicional de
68ºC durante 7 minutos y un ciclo de mantenimiento de 4ºC.
Se usó una digestión con Dpn I para digerir el
molde paterno metilado o hemimetilado de DNA (el plásmido
pENTR-INSP035-6HIS en la mezcla de
reacción de las muestras). Se añadió 1 \mul de la enzima de
restricción Dpn I (10 U/\mul, Stratagene) a la mezcla de reacción
y se incubó la mezcla a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción
fue luego usada para transformar células supercompetentes
XL10-Gold (Stratagene) del modo siguiente. Se
descongeló una parte alícuota de 50 \mul de células
XL10-Gold sobre hielo y se añadió 1 \mul del DNA
tratado con Dpn I. La mezcla fue incubada durante 30 minutos sobre
hielo y fue luego térmicamente estimulada por incubación a 42ºC
durante exactamente 45 segundos. Se devolvieron las muestras al
hielo durante 2 minutos y se añadieron 250 \mul de medio NZY
precalentado (42ºC). Las muestras fueron incubadas con sacudimiento
(220 rpm) durante 1 hora a 37ºC. La mezcla de transformación fue
luego sembrada en placas de caldo L (LB) que contenían kanamicina
(40 \mug/ml). Las placas fueron incubadas durante la noche a
37ºC.
Ocho colonias de la placa de transformación de
las muestras fueron inoculadas a 5 ml de caldo L (LB) que contenía
kanamicina (40 \mug/ml) y fueron cultivadas durante la noche a
37ºC con sacudimiento a 220 rpm. Se preparó DNA plasmídico
purificado con el sistema "mini-prep" usando un
sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen). El DNA plasmídico
(150-200 ng) fue sometido a secuenciación de DNA con
los cebadores 21M13 y M13Rev usando el sistema BigDye Terminator
(Applied Biosystems; Ref. 4390246 del catálogo) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Las secuencias de los cebadores se
muestran en la Tabla 4. Las mezclas de las reacciones de
secuenciación fueron purificadas usando columnas
Dye-Ex (Qiagen) o placas de limpieza Montage SEQ 96
(Millipore; Ref. LSKS09624 del catálogo) y fueron luego analizadas
en un secuenciador Applied Biosystems 3700.
El análisis de las secuencias permitió
identificar un clon que contenía la secuencia de
INSP035-6HIS con una secuencia de
Shine-Dalgarno cadena arriba.
El DNA plasmídico
"mini-prep", preparado a partir del plásmido
que contenía la secuencia de INSP035-6HIS con una
secuencia de Shine-Dalgarno cadena arriba (1,5
\mul), fue luego usado en una mezcla de reacción de recombinación
que contenía 1,5 \mul del vector pDEST14 (0,1 \mug/\mul), 2
\mul de tampón LR y 1,5 \mul de LR Clonase (Invitrogen) en un
volumen final de 10 \mul. Se incubó la mezcla a temperatura
ambiental durante 1 hora, se detuvo la reacción mediante la adición
de proteinasa K (2 \mug) y se incubó la mezcla a 37ºC durante 10
minutos más. Una parte alícuota de esta mezcla de reacción (1
\mul) fue usada para transformar células DH10B de E. coli
por electroporación del modo siguiente: Se descongeló sobre hielo
una parte alícuota de 25 \mul de células electrocompetentes DH10B
(Invitrogen) y se añadió 1 \mul de la mezcla de reacción LR. La
mezcla fue transferida a una cubeta enfriada de electroporación de
0,1 cm, y las células fueron sometidas a electroporación utilizando
un aparato Gene-Pulser^{TM} de BioRad de acuerdo
con el protocolo recomendado por el fabricante. Inmediatamente
después de la electroporación, se añadió medio SOC (0,5 ml) que
había sido precalentado a la temperatura ambiental. La mezcla fue
transferida a un tubo de 15 ml de capacidad con cierre por presión
y fue incubada con sacudimiento (220 rpm) durante 1 hora a 37ºC.
Luego se sembraron partes alícuotas de la mezcla de transformación
(10 \mul y 50 \mul) en placas de caldo L (LB) que contenían
ampicilina (100 \mug/ml) y se incubaron durante la noche a
37ºC.
Se preparó DNA plasmídico
"mini-prep" a partir de cultivos de 5 ml
procedentes de 6 de las colonias resultantes, usando un sistema
robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen). El DNA plasmídico
(200-500 ng) fue sometido a secuenciación de DNA
usando los cebadores de T7 y pDEST14R (Tabla 4). El DNA plasmídico
"mini-prep" de 1 de los clones resultantes
(pDEST14-SD-INSP035-6HIS)
es luego usado para transformar, por ejemplo, células BL21 DE3 de
E. coli para la producción de proteínas.
Se transcribió inversamente el RNA total de cada
muestra utilizando el sistema Superscript III (Invitrogen; Ref.
18080-051 del catálogo) de síntesis de primera
cadena para transcripción inversa-reacción en cadena
de la polimerasa (RT-PCR; del inglés,
reverse transcription-polymerase chain
reaction), en un volumen de reacción final de 20 \mul. Se
combinaron 2 \mug de RNA total con 50 ng de cebadores hexámeros
aleatorios, dATP, dGTP, dCTP y dTTP, cada uno 10 mM, y agua tratada
con DEPC en un volumen de 10 \mul. La mezcla fue incubada a 65ºC
durante 5 minutos y fue luego enfriada sobre hielo durante 1 minuto.
En un tubo separado se preparó la siguiente mezcla para síntesis de
cDNA, de 10 \mul: 2 \mul de tampón RT 10x, 4 \mul de
MgCl_{2} 25 mM, 2 \mul de DTT 0,1 M, 1 \mul de
RNaseOUT^{TM} (40 unidades/\mul) y 1 \mul de enzima
Superscript^{TM} III RT (200 unidades/\mul). Se añadió la
mezcla para síntesis de cDNA a la mezcla de RNA/cebador, y el
conjunto fue mezclado suavemente y fue incubado a 25ºC durante 10
minutos y luego a 50ºC durante 50 minutos. La enzima transcriptasa
inversa (RT) fue luego inactivada por incubación a 85ºC durante 5
minutos. Se enfrió la mezcla sobre hielo y luego se añadió 1 \mul
de RNasa H de E. coli (2 unidades/\mul) y se incubó la
mezcla a 37ºC durante 20 minutos. La mezcla fue enfriada sobre
hielo y fue luego diluida 1/250 con agua estéril. Las diluciones de
la mezcla de reacción de la transcriptasa inversa fueron luego
sometidas a un análisis por PCR en tiempo real con un instrumento
TaqMan (PE Biosystems 7700).
Utilizando el software Primer Express (PE
Biosystems), se diseñaron cebadores de PCR para INSP035 humana y el
gen testigo doméstico
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH). Los cebadores seleccionados fueron
h-INSP035-169F1 (AGGGCCCAAGCCAAACC)
y h-INSP035-281R1
(TCCTGCGCCTGCATCT-CC). La especificidad y la
concentración óptima de cebador para uso en el análisis TaqMan se
determinaron probando los cebadores específicos del gen INSP035 en
una serie de diluciones del plásmido
pCR-XL-TOPO-INSP035.
Se excluyó la posible contaminación del cDNA por DNA genómico al
llevarse a cabo las reacciones PCR usando cebadores específicos para
la secuencia intrónica de GAPDH. Se controló la ausencia de
multiplicación inespecífica analizando los productos de PCR en
geles de agarosa al 4% para asegurar que se producía una sola banda
del peso molecular esperado.
Se llevaron a cabo reacciones PCR en tiempo real
con colorante SYBR Green en un volumen de reacción de 50 \mul que
contenía 25 \mul de mezcla maestra para PCR-SYBR
Green (PE Biosystems) [a la que se habían añadido previamente 0,5
unidades de uracil N-glicosilasa (UNG) AmpErase (PE
Biosystems)], cada cebador de multiplicación en una concentración
de 300 nM, y 5 \mul del producto de RT-PCR.
La ciclación fue llevada a cabo utilizando el
sistema de detección ABI PRISM 7700 (TaqMan), programado del modo
siguiente: 1 ciclo de 50ºC durante 2 minutos; 1 ciclo de 95ºC
durante 10 minutos; 40 ciclos de 95ºC durante 15 segundos, 60ºC
durante 1 minuto. Se llevó a cabo cada reacción por duplicado y se
promediaron los resultados.
De esta manera, se multiplicaron las regiones
específicas de cebador de las muestras de cDNA inversamente
transcrito y se determinaron sus valores del ciclo umbral (Ct; del
inglés, cycle threshold). El valor de Ct de cada
muestra de cDNA fue normalizado con respecto al del gen doméstico
GAPDH, del modo siguiente. Se expresó la diferencia en el nivel de
expresión entre el gen GAPDH y el gen INSP035, en cada muestra de
cDNA, como una diferencia en el valor de Ct; es decir, Delta
(\delta) Ct = Ct (GAPDH) - Ct (INSP035). Luego se expresaron los
resultados de cada muestra como una diferencia por cociente entre el
número de ciclos requerido para una expresión detectable del gen
INSP035 y el requerido para GAPDH, de acuerdo con la fórmula:
Diferencia por Cociente = 2^{(-\delta Ct)}. Finalmente, se mostró
el nivel de expresión del gen INSP035 en cada muestra de cDNA con
respecto al nivel de expresión del gen GAPDH, siendo el nivel de
expresión de GAPDH = 100%, dividiendo 100 por la Diferencia por
Cociente para INSP035. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
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Al ser definido un umbral del nivel de expresión
de INSP035 con respecto a la expresión de GAPDH de 0,5, los
resultados de la expresión TaqMan muestran que INSP035 está muy
expresado en hígado fetal, cuello uterino, páncreas, glándula
adrenal, bazo de lupus humano, intestino delgado mezclado con
colitis ulcerosa y, particularmente, pulmón. La elevada expresión
en el pulmón y el hígado sostiene la implicación de INSP035 en las
fibrosis de pulmón e hígado.
La administración de una sola inyección
intratraqueal de bleomicina a ratones C57BL/6 da lugar a la rápida
inducción, en 14 días, de una fibrosis pulmonar que se caracteriza
por un depósito aumentado de colágeno dentro del intersticio
pulmonar (Hattori et al., 2000; Zuo et al., 2002;
Phillips et al., 2004). Con objeto de determinar si la
administración de INSP035 podía ejercer efecto protector alguno
frente al desarrollo de fibrosis o reducir realmente la gravedad de
la enfermedad, se puede analizar el efecto de una inyección diaria
de INSP035 en ratones tratados con bleomicina.
Con objeto de completar el experimento, se
dividen los ratones en cuatro grupos. Se administra bleomicina a 3
grupos de 10 ratones mediante una sola instilación intratraqueal.
Para comparación, se incluye en el estudio un 4º grupo de ratones
que comprende individuos completamente no tratados y de edad y sexo
equivalentes (ratones naíf). Se administra INSP035 por inyección
subcutánea, comenzando el día después del tratamiento con
bleomicina. Un grupo recibe una dosis elevada de bleomicina (5
mg/kg), el segundo grupo recibe una dosis menor de bleomicina (0,5
mg/kg) y los ratones testigo reciben disolución salina subcutánea y
diariamente.
Los animales tratados con bleomicina deben caer
enfermos con una rápida pérdida de masa corporal que les conduce a
la muerte.
12 días después del tratamiento con bleomicina,
todo lo ratones supervivientes son sacrificados. El análisis
histológico de los pulmones revela el efecto de INSP035 en los
animales tratados con INSP035. En los ratones tratados con INSP035
se debe observar un contenido reducido de hidroxiprolina (el
contenido de hidroxiprolina es una medida del depósito de
colágeno). Se puede concluir que el tratamiento con INSP035 conduce
eficazmente a un depósito reducido de colágeno en los pulmones.
1. D. Abraham, S. Lupoli, A.
McWhirter, C. Plater-Zyberk, T. H.
Piela, J. H. Korn, I. Olsen y C. Black
(1991). "Expression and function of surface antigens on
scleroderma fibroblasts". Arthritis Rheum. 34,
1164-1172.
2. D. J. Abraham, X. Shiwen, C.
M. Black, S. Sa, Y. Xu y A. Leask, J.
Biol. Chem., 19 de Mayo de 2000, 275 (20):
15.220-5.
3. N. H. Afdhal y D. Nunes, Am.
J. Gastroenterol., Junio de 2004, 99 (6):
1160-74; Revisión.
4. S. F. Altschul et al., J.
Mol. Biol. 215: 403-410, 1990.
5. S. F. Altschul et al.,
Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402,
1997.
6. C. M. Black y C. P. Denton
(1998), "Systemic sclerosis and related disorders" en
"Oxford Textbook of Rheumatology" (compilado por P. G.
Maddison, D. A. Isenberg, P. Woo y D. N. Glass), páginas
771-789, Oxford Univ. Press, New York,
EE.UU.
7. P. J. Clements y D. E. Furst
(1996), "Systemic Sclerosis", Williama and Williams,
Baltimore, EE.UU.
8. L. Chung y P. J. Utz, Curr.
Rheumatol. Rep., Abril de 2004, 6 (2):
156-63.
9. J. Devereux et al., Nucleic
Acids Res., 12, 387-395, 1984.
10. J. Emery et al., J. Biol.
Chem. 1998, 273: 14.363-14.367.
11. H. Engelmann, D. Novick y D.
Wallach, 1990, J. Biol. Chem. 265:
1531-1536.
12. I. Granot, O. Halevy, S.
Hurwitz y M. Pines (1993), "Halofuginone: an
inhibitor of collagen type I synthesis", Biochim. Biophys.
Acta 1156: 107-112.
13. Grantham (1974),
Science, 185: 862-864.
14. C. Hasel et al., Lab.
Invest. 2003, 83 (6): 825-36.
15. Hattori et al., J. Clin.
Invest. 2000, 106: 1341.
16. D. Kershenobich Stalnikowitz y A. B.
Weissbrod, Ann. Hepatol.,
Octubre-Diciembre de 2003, 2 (4):
159-63.
17. N. Khalil y R. O'Connor,
CMAJ 2004, 171 (2): 153-60.
18. P. J. Kostenuik y V.
Shalhoub, Curr. Pharm. Des., Mayo de 2001, 7
(8): 613-35.
19. P. M. Krein, Y. Huang y B.
W. Winston (2001), Expert Opin. Ther. Patents
11 (7): 1065-1079.
20. C. Leighton, Drugs
2001 61 (3): 419-427.
21. E. C. LeRoy (1974),
"Increased collagen synthesis by scleroderma skin fibroblasts
in vitro", J. Clin. Invest. 54,
880-889.
22. Martini, Maccario,
Ravelli et al., Arthritis Rheum. 1999,
42: 807-811.
23. T.L. McGaha, R. G. Phelps, H.
Spiera y C. Bona (2002), "Halofuginone, an
Inhibitor of Type-I Collagen Synthesis and Skin
Sclerosis, Blocks
Transforming-Growth-Factor-beta-Mediated
Smad3 Activation in Fibroblasts", J. Invest. Dermatol.
118: 461-70.
24. H. Min, S. Morony, I.
Sarosi, C. R. Dunstan, C. Capparelli et
al. (2000), "INSP035 reverses osteoporosis by
inhibiting endosteal osteoclasts and prevents vascular calcification
by blocking a process resembling osteoclastogenesis", J. Exp.
Med. 192: 463-474.
25. T. Morinaga, N. Nagakawa, H.
Yasuda, E. Tsuda y K. Higashi (1998),
"Cloning and characterization of the gene encoding human
INSP035/osteoclastogenesis inhibitory factor", Eur. J.
Biochem. 254: 685-691.
26. W. R. Pearson, "Methods in
Enzymology", 183: 63-99, 1990.
27. W. R. Pearson y D. J. Lipman,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448,
1988.
28. M. Pinzani y K. Rombouts,
Dig. Liver Dis., Abril de 2004, 36 (4):
231-42.
29. Phillips et al., The
Journal of Clinical Investigation 2004, 114 (3):
438-446.
30. E. Y. Rhew y W. G. Barr,
Curr. Rheumatol. Rep., Abril de 2004, 6 (2):
129-36.
31. Selman et al., Drugs
2004, 64 (4): 405-30.
32. C. M. Shipman y P. I.
Croucher, Cancer Res. 2003, 63 (5):
912-916.
33. A. J. Silman (1991),
"Mortality from scleroderma in England and Wales
1968-1975", Ann. Rheu. Dis. 50,
95-96.
34. W. S. Simonet, D. Lacey, C.
R. Dunstan, M. Kelley et al. (1997),
"INSP035: a novel secreted protein involved in the regulation of
bone density", Cell 89, 309-319.
35. X. Shi-wen, C. P.
Denton, A. McWhirter, G.
Bou-Gharios, D. J. Abraham, R. M.
du Bois y C. M. Black (1997), "Scleroderma
lung fibroblasts exhibit elevated and dysregulated collagen type I
biosynthesis", Arthritis Rheum. 40:
1237-1244.
36. Smith y Waterman, J. Mol.
Biol. 147: 195-197, 1981, Advances in
Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981.
37. R. E. Smith, R. M. Strieter,
S. H. Phan, N. W. Lukacs, G. B. Huffnagle, C.
A. Wilke, M. D. Burdick, P. Lincoln, H.
Evanoff y S. L. Kunkel (1994), "Production
and function of murine macrophage inflammatory
protein-1\alpha in bleomycin induced lung
injury", J. Immunol. 153, 4704.
38. Smith, "Textbook of the Autoimmune
Diseases", compilado por Lahita, Chiorazzi y Reeves, Lippincott,
Williams & Wilkins, Philadelphia, EE.UU., 2000.
39. D. Strehlow y J. Korn
(1998), "Biology of the scleroderma fibroblast",
Curr. Opin. Rheumatol. 10, 572-578.
40. P. Taimr et al.,
Hepatology 2003, 37 (1): 87-95.
41. A. Tucci, H. James, R.
Chicheportiche, J. Y. Bonnefoy, J. M. Dayer y
R. H. Zubler, 1992, J. Immunol. 148,
2778-2784.
42. J. Varga, Curr. Rheumatol.
Rep., Abril de 2004, 6 (2): 164-70.
43. H. Walczak et al., EMBO
J. 1997, 16: 5386-5397.
44. F. M. Wigley y S. D. Sule
(2001), "Expert Opinions on Investigational Drugs", 10
(1): 31-48.
45. F. M. Wigley y C. L. Boling
(2000), "The treatment of scleroderma" 2,
276-292.
46. H. Yasuda, N. Shima, N.
Nagakawa, S. Mochizuki, K. Yano et al.
(1998), "Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor
(OCIF) and osteoprotegerin (OPG): a mechanism by which OPG/OCIF
inhibits osteoclastogenesis in vitro",
Endocrinology 139: 1329-1337.
47. V. V. Yurovsky, Am. J. Respir.
Cell. Mol. Biol. 2003, 28 (2):
225-31.
48. Zuo et al., PNAS
2002, 99: 6292-6297.
<110> Applied Research Systems ARS Holding
N.V.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVO TRATAMIENTO Y/O NUEVA
PREVENCIÓN DE LA ENFERMEDAD FIBRÓTICA
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<130> WO895
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn, versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 492
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 163
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 169
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 267
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 88
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 94
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 88
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 94
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 225
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 74
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 80
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 11
Claims (21)
1. Uso de un polipéptido para la fabricación de
un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis
hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia, en que dicho
polipéptido es seleccionado del grupo que consiste
en:
en:
- a)
- un polipéptido como el expuesto en cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 7 e ID. SEC. nº 10;
- b)
- la forma de etiqueta histidínica de los polipéptidos cuyas secuencias se exponen en la ID. SEC. nº 2 (ID. SEC. nº 3) o ID. SEC. nº 5 (ID. SEC. nº 6) o ID. SEC. nº 7 (ID. SEC. nº 8) o ID. SEC. nº 10 (ID. SEC. nº 11);
- c)
- un polipéptido que comprende cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC. nº 11;
- d)
- una muteína de cualquiera de (a) a (c), en que la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 40% o 50% o 60% o 70% u 80% o 90% de identidad con respecto a al menos una de las secuencias de (a) a (c);
- e)
- una muteína de cualquiera de (a) a (c), en que los cambios en la secuencia de aminoácidos son sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos de (a) a (c); y
- f)
- una sal o una isoforma, proteína de fusión, derivado funcional, fracción activa o derivado circularmente permutado de cualquiera de (a) a (e).
2. Uso de una molécula de ácido nucleico para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención
de la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia, en
que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de
ácido nucleico que codifica un polipéptido como el expuesto en
cualquiera de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID.
SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC.
nº 11, y que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada
del grupo que consiste en:
- a)
- una secuencia de ácido nucleico como la expuesta en cualquiera de las ID. SEC. nº 1, ID. SEC. nº 4 e ID. SEC. nº 9;
- b)
- una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con el complemento de la secuencia de ácido nucleico de (a) bajo condiciones moderadamente rigurosas o bajo condiciones muy rigurosas; y
- c)
- una secuencia de ácido nucleico de cualquiera de (a) y (b), en que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos que tiene sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos de las ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 5, ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 10 e ID. SEC. nº 11.
3. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en
que el polipéptido está glicosilado en uno o más sitios.
4. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en
que la proteína de fusión comprende una fusión de inmunoglobulina
(Ig).
5. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 4, en
que la fusión de Ig es una fusión de Fc.
6. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en
que el derivado funcional comprende al menos un resto fijado a uno
o más grupos funcionales que se encuentran como una o más cadenas
laterales en los residuos de aminoácido.
7. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 6, en
que el resto es un resto de polietileno.
8. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en
que la molécula de ácido nucleico está comprendida en un vector de
expresión.
9. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 8, en
que el vector es un vector para terapia génica.
10. Uso de un vector para inducir y/o potenciar
la producción endógena de un polipéptido de acuerdo con la
Reivindicación 1 en una célula, para la preparación de un
medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis
hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia.
11. Uso de una célula que comprende una molécula
de ácido nucleico de acuerdo con la Reivindicación 2, para la
preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención
de la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la
esclerodermia.
12. Uso de una célula que expresa un polipéptido
de acuerdo con la Reivindicación 1, para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la fibrosis
hepática, la fibrosis pulmonar o la esclerodermia.
13. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1 ó
2, en que el medicamento comprende además osteoprotegerina para uso
simultáneo, secuencial o independiente.
14. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1 ó
2, en que el medicamento comprende además un interferón para uso
simultáneo, secuencial o independiente.
15. El uso de acuerdo con la Reivindicación 14,
en que el interferón es interferón \beta.
16. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1 ó
2, en que el medicamento comprende además un antagonista del factor
de necrosis tumoral (TNF) para uso simultáneo, secuencial o
independiente.
17. El uso de acuerdo con la Reivindicación 16,
en que el antagonista del TNF es TBP I y/o TBP II.
18. Un uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en que la enfermedad es
esclerodermia.
19. El uso de acuerdo con la Reivindicación 18,
en que el medicamento comprende además un agente antiesclerodérmico
para uso simultáneo, secuencial o independiente.
20. El uso de acuerdo con la Reivindicación 19,
en que el agente antiesclerodérmico es seleccionado del grupo que
consiste en halofuginona, inhibidores de ACE, bloqueadores del canal
del calcio, inhibidores de la bomba de protones, NSAIDs, tal como
ibuprofeno, inhibidores de COX, corticosteroides, tal como
prednisona, tetraciclina, pentoxifilina, bucilamina, inhibidores de
la geranil-geranil transferasa, roterlina,
inhibidores de la
prolil-4-hidroxilasa, inhibidores
de la proteinasa c, inhibidores de la lisil-oxidasa,
relaxina, halofuginona, prostaglandinas, prostaciclinas, endotelina
1, óxido nítrico, inhibidores de la angiotensina II, interleucina
10, interleucina 8, leucotrieno B4, ácido ursodesoxicólico,
antioxidantes y SARP-1.
21. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz
de una sustancia de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención
de la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la
esclerodermia.
Applications Claiming Priority (2)
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EP03102723 | 2003-09-08 |
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---|---|---|---|
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---|---|
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