ES2298857T3 - Dispositivo de trabajo que comprende zonas trabajo ribeteadas, laboratorio en un chip microsistema. - Google Patents

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Abstract

Dispositivo (1) de trabajo que comprende: - una caja (Bo) de trabajo equipada con medios de introducción de un líquido (E) de interés en la caja y de medios (o, s) de extracción del líquido de interés de la caja, - un sustrato (S) que comprende una superficie activa sensiblemente no humectante con respecto a dicho líquido de interés encerrado en dicha caja, - varias zonas (Zt) de trabajo formadas sobre dicha superficie activa de manera clara y rodeadas cada una por un borde (b) formado sobre dicha superficie activa sensiblemente no humectante con respecto al líquido de interés, los bordes no se tocan entre sí y no tienen límite en común, en el que los medios (o, s) de introducción y de extracción del líquido de interés de la caja están dispuestos sobre dicha caja de trabajo de tal manera que cuando se introduce el líquido de interés en la caja (Bo), cubre las zonas de trabajo y su borde respectivo, y en el que los bordes tienen una geometría tal que cuando se extrae el líquido deinterés de la caja, tras haberse introducido en la misma, una gota (g) del líquido (E) de interés queda aprisionada por cada borde (b) y en contacto con la zona (Zt) de trabajo que rodea.

Description

Dispositivo de trabajo que comprende zonas de trabajo ribeteadas, laboratorio en un chip y microsistema.
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a un dispositivo de trabajo que comprende zonas de trabajo ribeteadas, a un laboratorio en un chip y a un microsistema que comprende este dispositivo, particularmente a un chip biológico. La presente invención se refiere igualmente a un procedimiento de fabricación de un dispositivo de la invención.
La presente invención permite obtener una matriz de gotas localizadas, de alta densidad, sobre una superficie, a partir de un líquido de interés. Permite garantizar fácilmente la transición de una cámara de fluidos cerrada, denominada caja de trabajo, y rellena de un líquido de interés a una matriz de gotas, o microvolúmenes, perfectamente localiza-
das sobre una superficie situada en dicha cámara, cuando el líquido de interés se evacua de dicha cámara de fluidos.
Por matriz de gotas, se entiende una disposición determinada de dichas gotas, sin que se exija una forma geométrica particular de dicha disposición. La matriz de gotas puede ser redonda, cuadrada, poligonal e incluso aleatoria, siendo lo esencial que las gotas formadas estén dispuestas de manera localizada y determinada sobre la superficie según el objetivo alcanzado por la presente invención. En el contexto de la presente invención, por "localizada", se entiende circunscrita, individualizada y distinta de las demás gotas capturadas voluntariamente sobre dicha superficie gracias al dispositivo de la invención.
Cada una de las gotas puede someterse a una o varias operaciones destinadas a analizar cualitativamente y/o cuantitativamente uno o varios analito(s) presente(s) o susceptible(s) de estar presente(s) en el líquido de interés, por ejemplo una molécula, un oligonucleótido, una proteína, etc. El análisis de los analitos en la gota puede realizarse mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica para efectuar análisis, en particular en un volumen de líquido tan reducido como una gota. Puede tratarse de técnicas de análisis utilizadas en los chips biológicos. El análisis puede hacer intervenir o no la superficie del dispositivo de la invención recubierta por la gota, según la puesta en práctica de la presente invención.
Cada una de las gotas forma un volumen en el que pueden realizarse reacciones químicas o bioquímicas. Puede realizarse en este volumen cualquier reacción química o bioquímica conocida por el experto en la técnica. Estas reacciones pueden hacer intervenir o no la superficie del dispositivo de la invención recubierta por la gota, según la puesta en práctica de la presente invención. Cuando estas reacciones hacen intervenir la superficie del dispositivo de la invención recubierta por la gota, pueden hacerlo con una sola gota o varias gotas depositadas sucesivamente sobre esta superficie, estando constituidas estas gotas sucesivas por un único o por varios líquidos de interés diferentes según la puesta en práctica de la presente invención. Un ejemplo de reacciones químicas que hacen intervenir dos líquidos de interés diferentes sobre un dispositivo de la invención es el siguiente: mediante una gota de un primer líquido de interés, depósito localizado de una película de un polímero orgánico sobre la superficie cubierta por esta gota, después, mediante una gota de un segundo líquido de interés, funcionalización de la película de polímero orgánico depositada sobre esta superficie.
Según la presente invención, análisis y reacción(es) química(s)/bioquímica(s) puede(n) ponerse en práctica exclusivamente sobre un dispositivo según la presente invención (análisis o reacción), o de manera complementaria. En este último caso, esto puede ser de manera simultánea (reacción y análisis) o sucesiva (reacción y después análisis o análisis y después reacción). Además, pueden sucederse diversos análisis y/o diversas reacciones. Por ejemplo, el dispositivo de la presente invención puede intervenir ventajosamente, por un lado en la fabricación de una tarjeta, o laboratorio en un chip (por ejemplo mediante reacciones químicas que permiten depositar un polímero, y después funcionalizarlo) ("lab-on-chip"), en el que todas las etapas necesarias para los análisis cualitativos y cuantitativos de un líquido de interés están integradas: manipulación de fluido, reacciones químicas y/o bioquímicas, chip de detección óptica, eléctrica y/o química, etc.; y por otro lado en la utilización de esta tarjeta, o laboratorio en un chip, para efectuar análisis cualitativos y/o cuantitativos en las gotas de un líquido de interés a analizar (reacción(es) quími-
ca(s)/bioquímica(s) y análisis).
En la presente descripción, las referencias entre corchetes [ ] remiten a la lista de referencias adjunta.
Estado de la técnica
Según las aplicaciones previstas, esta invención se acerca al campo general de la formación de gotas, al trabajo en microvolumen(es), a matrices de alta densidad de gotas.
La formación de zonas localizadas para aislar una fase líquida está extendida en el campo de los chips biológicos, y particularmente de los chips de ADN. Para estas aplicaciones, el volumen de reacción es a menudo muy reducido para ahorrar en productos biológicos y reactivos.
Para la formación de gotas localizadas y matrices de alta densidad de gotas, las empresas Protogene Laboratories Inc. [1] y Affymetrix Inc. [2] utilizan una técnica que emplea un sistema de dispensación automatizado. Estos sistemas llevan a la formación de gotas y matrices de alta densidad de regiones o de gotas sobre una superficie.
No obstante, aparte del sistema de dispensación de gotas, estas técnicas requieren todas ellas el uso de un dispositivo de desplazamiento y alineación preciso de este sistema, así como un dispositivo para la alimentación de líquido. El coste de este conjunto de aparatos es elevado. Además, la densidad máxima de las matrices de gotas que pueden formarse está limitada por una combinación entre el tamaño de las gotas dispensadas y el paso mínimo entre regiones del sistema de dispensación.
Para la formación de matrices de alta densidad de microcubetas, pueden mencionarse dos ejemplos significativos: la formación de una red de cubetas microfabricadas mediante grabado en una placa de silicio para realizar amplificaciones de ADN por PCR en microvolúmenes de unos pocos picolitros, y la formación de pocillos o de canales mediante fotolitografía sobre resinas fotosensibles depositadas sobre un sustrato de plástico [3]. Con estas técnicas, el número de pocillos varía de 100 a 9600 pocillos, con diámetros de 60 a 500 \mum y profundidades de 5 a
300 \mum.
No obstante, los límites de estas cubetas no dejan separación física entre la fase líquida dentro de la cubeta y la del exterior de éste, permitiendo así conexiones entre las cubetas, y por tanto contaminaciones entre ellas. Además, estos dispositivos requieren para su uso sistemas de dispensación de gotas, un dispositivo de desplazamiento y alineación preciso de este sistema, así como un dispositivo para la alimentación de líquido. Existen por tanto los mismos inconvenientes y problemas que los anteriormente citados.
Para la detección eléctrica o electroquímica en los ensayos biológicos, un gran número de sistemas de detección eléctrica o electroquímica descritos en la bibliografía no permiten bajar del nanomolar en términos de límite de detección, limitación debida a menudo al reducido número de electrones generados por cada híbrido.
Las técnicas que hacen intervenir una acumulación enzimática permiten reducir este límite de detección a aproximadamente el picomolar debido a la alta amplificación del número de especies redox que van a detectarse presentes en el medio de reacción [4]. No obstante, este método de amplificación genera un problema para los sistemas de múltiples regiones conocidos actualmente porque el compuesto redox se difunde y puede así contaminar las regiones vecinas.
Con este fin, la mayor parte del tiempo en la bibliografía se recomienda la utilización de estructuras tridimensionales (utilización de compartimentos). Por ejemplo, Infineon [6] propone paredes de polímeros y un sistema de migración de moléculas mediante fuerzas eléctricas, de manera las encierra en un volumen definido y evita así la contaminación entre regiones. Desgraciadamente, pueden aparecer problemas de llenado de fluidos con esta clase de enfoque cuando se desea trabajar por ejemplo en vena de líquidos muy fina. De nuevo, un dispensador de gotas se vuelve indispensable.
Por tanto, existe una necesidad real de un dispositivo que permita obtener fácilmente una matriz de gotas de alta densidad a partir de un líquido de interés, utilizable sin ningún equipo de dispensación de gotas, fácil de fabricar, que permita evitar eficazmente contaminaciones entre las gotas, y que pueda utilizarse de manera muy flexible con todos los procedimientos actualmente conocidos por el experto en la técnica para analizar colectiva o individualmente microvolúmenes, por ejemplo en un laboratorio en un chip, ya se trate de un procedimiento químico, eléctrico u óptico o de una combinación de estos procedimientos.
Exposición de la invención
La presente invención responde precisamente a esta necesidad, e incluso a otras, explicadas a continuación, proporcionando un dispositivo de trabajo que comprende:
- una caja de trabajo equipada con medios de introducción de un líquido de interés en la caja y de medios de extracción del líquido de interés de la caja,
- un sustrato que comprende una superficie activa sensiblemente no humectante con respecto a dicho líquido de interés y encerrado en dicha caja,
- varias zonas de trabajo formadas sobre dicha superficie activa de manera clara y rodeadas cada una por un borde formado sobre dicha superficie activa sensiblemente no humectante con respecto al líquido de interés, no tocándose los bordes entre sí y no teniendo límites en común,
en el que los medios de introducción y de extracción del líquido de interés de la caja están dispuestos sobre dicha caja de trabajo de tal manera que cuando el líquido de interés se introduce en la caja, cubre las zonas de trabajo y su borde respectivo, y
en el que los bordes tienen una geometría tal que cuando se extrae el líquido de interés de la caja, tras haberse introducido, una gota de líquido de interés queda aprisionada por cada borde y en contacto con la zona de trabajo que rodea.
La presente invención responde igualmente a esta necesidad proporcionando un laboratorio en un chip que comprende un dispositivo según la invención.
La presente invención responde igualmente a esta necesidad proporcionando un sistema que comprende un dispositivo según la invención.
El dispositivo de la presente invención permite realizar sin equipo de dispensación de gotas, una transición de un volumen de líquido de interés presente en una cámara de fluidos, constituida por la caja de trabajo, hacia multitud de gotas de dicho líquido retenidas por las microcubetas independientes constituidas por los bordes que rodean las zonas de trabajo, en el seno de las cuales pueden encontrarse por ejemplo un detector o un accionador, óptico, eléctrico, magnético, mecánico, electrostático, etc.
En el contexto de la presente invención, un líquido se denomina "de interés" ya que este líquido está destinado a capturarse por bordes de un dispositivo según la invención, para formar una matriz de gotas de este líquido.
Por "líquido de interés", se entiende cualquier líquido susceptible de necesitar una disposición en matriz de gotas sobre un soporte, por ejemplo con un fin analítico y/o químico y/o bioquímico. Por "fin químico y/o bioquímico", se entiende cualquier reacción química y/o bioquímica que puede realizarse en un líquido. Por "fin analítico", se entiende cualquier análisis cualitativo y/o cuantitativo que puede realizarse en un líquido.
El líquido de interés puede ser orgánico o acuoso. Puede tratarse de uno cualquiera de los líquidos actualmente manipulados en laboratorio o en la industria, por ejemplo en laboratorios en un chip. Puede tratarse por ejemplo de un líquido seleccionado de una solución, un disolvente, un reactivo, una muestra, un extracto celular, una extracción procedente de un organismo animal o vegetal, una extracción realizada en la naturaleza o en la industria, etc. Puede tratarse de un líquido biológico o químico. Este líquido de interés puede ser un líquido diluido, si es necesario, para su uso con el dispositivo de la presente invención, tal como puede hacerse en los laboratorios en un chip. Un producto sólido puede disolverse para constituir un líquido de interés en el sentido de la presente invención. Este producto sólido puede seleccionarse por ejemplo de un producto químico o bioquímico, un reactivo, un material que va a analizarse, una extracción procedente de un organismo animal o vegetal, una extracción realizada en la naturaleza o en la industria, etc. El experto en la técnica conoce la manipulación de tales productos y líquidos de interés.
El sustrato del dispositivo de la invención constituye de hecho el soporte sobre el cual está formada la superficie activa con sus zonas de trabajo y su borde respectivo. El sustrato puede consististir en cualquier material apropiado para la puesta en práctica de la presente invención. Puede tratarse por ejemplo de uno de los materiales de base utilizados para fabricar los laboratorios en un chip, chips biológicos, microsistemas, etc. Puede tratarse por ejemplo de un material seleccionado del grupo que consiste en silicio, óxido de silicio, nitruro de silicio, vidrio, plástico, un polímero orgánico y un metal o una aleación de metales. Los polímeros orgánicos pueden seleccionarse por ejemplo del grupo que comprende los policarbonatos, los polidimetilsiloxanos, los poli(metacrilatos de metilo), los policlorobifenilos y los copolímeros de cicloolefinas. El metal puede seleccionarse por ejemplo del grupo que consiste en Au, Ti, Pt, Al, Ni, Sn y la aleación de metales puede ser acero inoxidable.
Por superficie activa se entiende la superficie del sustrato sobre la que están formadas las zonas de trabajo rodeadas por su borde. Según la invención, el sustrato puede comprender una o varias superficies activas. La superficie activa puede estar constituida por cualquier material sensiblemente no humectante con respecto al líquido de interés y apropiado para poner en práctica la presente invención. De hecho, el funcionamiento del dispositivo de la presente invención se basa en parte en el hecho de que la superficie activa no retiene nada o muy poco el líquido de interés, lo que permite una retirada total del líquido, fácil, sin retención del líquido de interés sobre la superficie entre los bordes, y todo ello sin secado. Así, las gotas de líquido de interés se capturan selectiva y exclusivamente por los bordes y están circunscritas a las zonas de trabajo que rodean, lo que evita cualquier problema de contaminación entre las gotas, y por tanto entre las zonas de trabajo.
Por superficie sensiblemente no humectante con respecto al líquido de interés, se entiende la superficie sobre la que el líquido de interés presenta una débil adherencia, es decir que si se hace pasar el líquido de interés sobre una superficie de este tipo, no deja restos ni gotas. No obstante, la captura se vuelve difícil, o incluso imposible, en el caso en el que el líquido de interés no humecta en absoluto la superficie. De la misma manera, si la superficie es totalmente humectante, resultará difícil aspirar el líquido de interés. Por tanto, preferiblemente, la superficie sensiblemente no humectante forma un ángulo de contacto con el líquido de interés al que está destinado el dispositivo de la invención de al menos 60º, preferiblemente de 60 a 90º. Por ejemplo, cuando el líquido de interés es acuoso, el material que forma la superficie activa es ventajosamente hidrófobo, preferiblemente con un ángulo de contacto de 60
a 110º.
No se requiere ninguna modificación química de la superficie del sustrato si el sustrato consiste en un material ya sensiblemente no humectante con respecto al líquido de interés.
En cambio, si la superficie del sustrato no es ya sensiblemente no humectante con respecto al líquido de interés, puede ser necesario un tratamiento de superficie para hacerla sensiblemente no humectante. En este caso, el material de la superficie activa se selecciona particularmente en función del líquido de interés a partir del cual debe formarse una matriz de gotas, en función del sustrato y también en función de las zonas de trabajo. Puede formarse sobre el sustrato mediante modificación química de la superficie del sustrato o mediante deposición sobre esta superficie de un material sensiblemente no humectante con respecto al líquido de interés.
Por ejemplo, cuando el líquido de interés es acuoso, el material que forma la superficie activa es ventajosamente hidrófobo. Por ejemplo, en los ejemplos de materiales anteriormente mencionados que constituyen el sustrato, la superficie del sustrato puede hacerse no humectante, en este caso hidrófoba, mediante modificación química, por ejemplo mediante silanización con un silano que lleva funciones hidrófobas, por ejemplo 1H,1H,2H,2H-perfluorodecil-triclorosilano. También puede tratarse por ejemplo de una deposición de teflón líquido sobre una placa giratoria; de una silanización en fase gaseosa de silano hidrófobo; de la utilización de silano hidrocarbonado, por ejemplo del tipo de octadecil-triclorosilano. Los materiales y procedimientos utilizables para la puesta en práctica de tales modificaciones químicas los conoce el experto en la técnica. A continuación se facilita un ejemplo de realización.
La forma y tamaño de esta superficie activa, y por tanto también del sustrato sobre el cual está formada, no tienen importancia para el funcionamiento del dispositivo de la invención. Pueden determinarse por ejemplo en función del número de bordes acoplados a zonas de trabajo formadas sobre la misma, y eventualmente su disposición sobre esta superficie, así como en función del tamaño deseado del dispositivo tal como se utilizará y especificaciones de coste. Con el fin de evitar retenciones no deseables del líquido de interés entre los bordes, la superficie del sustrato que comprende las zonas de trabajo y su borde es preferiblemente plana. A título de ejemplo, la superficie activa puede tener una forma y un tamaño comparables a las utilizadas en los laboratorios en un chip y los microsistemas de análisis y de detección conocidos por el experto en la técnica.
Según la invención, por "bordes" se entienden estructuras en relieve formadas sobre el sustrato de manera que se crean cubetas no unidas. Estas cubetas no están "hundidas" en el cuerpo del sustrato, sino que están constituidas en su superficie por su borde. La figura 1 adjunta es una representación esquemática en corte de dos tipos de cubetas: a la izquierda cubetas (c_{a}) de la técnica anterior, "hundidas" en un sustrato (S_{a}), y a la derecha cubetas (c) según la presente invención, es decir, formadas gracias a su borde (b) sobre un sustrato (S). Por tanto, queda un espacio libre disponible entre los bordes de las cubetas según la presente invención para el paso del líquido de interés. Cada uno de estos bordes permite por tanto una captura muy localizada de una gota (g) del líquido de interés. El término "localizado" se definió anteriormente. Por ejemplo, en un uso básico del dispositivo, haciendo pasar líquido de interés sobre la superficie activa, de manera que se cubren esos bordes, y las cubetas que forman, los bordes capturan, o retienen, una gota de líquido de interés en la cubeta, mientras que la superficie activa, sensiblemente no humectante con respecto al líquido de interés, no retiene nada o muy poco de líquido de interés. Deteniendo el paso del líquido de interés, sólo se retiene una gota de este líquido localmente por borde, sobre la zona de trabajo que rodea.
La forma exacta de los bordes, o murete, no es definitiva y puede adaptarse según las aplicaciones y los medios de fabricación disponibles para su fabricación. Según la invención, los bordes pueden tener cualquier forma con la condición de que puedan capturar, o aprisionar, cada uno, una gota del líquido de interés, y que esta gota esté en contacto con la zona de trabajo rodeada por dicho borde. A título de ejemplo, los bordes pueden tener una sección en corte transversal, en el sentido de la superficie activa hacia la parte alta del borde, seleccionada de una forma triangular, rectangular, cónica, troncocónica, de semicírculo, de semielipse. La figura 2 representa esquemáticamente, en corte transversal, diferentes geometrías posibles de bordes (b) según la invención formadas sobre un sustrato (S). Igualmente a título de ejemplo, los bordes pueden tener una forma, alrededor de su(s) zona(s) de trabajo y vista desde arriba, seleccionada de una forma anular, en estrella, en rectángulo, en cuadrado, en triángulo, en elipse, o en polígono que tiene de 4 a 20 lados. La figura 3 es una representación esquemática de bordes (b) según la invención, en vista desde arriba, que tienen diferentes formas alrededor de su zona (Zt) de trabajo que rodean.
La razón entre la altura de los límites y el diámetro de las cubetas es un factor de control de la buena retención de una gota de líquido de interés en las cubetas. Cuando los bordes son demasiado elevados para un diámetro dado, el líquido de interés no puede llenar las cubetas formadas por esos bordes y por tanto retenerse. Por el contrario, cuando la altura de los bordes es demasiado baja para un diámetro dado, el líquido de interés no se retiene en las cubetas formadas por esos bordes ya que no pueden desempeñar su papel de obstáculo a la aspiración. Por tanto, a título de ejemplo, según la invención, los bordes se presentan ventajosamente en forma de anillo, eventualmente con una de las formas geométricas mencionadas anteriormente, cuya altura (h) a partir de la superficie activa es de 5 a 20 \mum; anillo cuya sección (e) a nivel de la superficie activa es de 20 a 100 \mum; y cuyo diámetro (D) en el interior del borde, que delimita la zona de trabajo, es de 15 \mum a 5 mm.
Según la invención, la superficie activa también puede definirse de la siguiente manera (véase la figura 1 a título indicativo para las referencias):
D: diámetro interior de las gotas, con, por ejemplo, 15 \mum \leq D \leq 5 mm;
L: distancia entre gotas;
e: sección mayor del murete, con, por ejemplo, 20 \mum \leq e \leq 100 \mum; y
h: altura del murete, con, por ejemplo, 5 \mum \leq h \leq 20 \mum;
con h/D < 0,15; e/D < 0,33; y h/L < 0,3.
Los bordes se realizan según las siguientes reglas: se trata de estructuras en relieve en forma de murete que definen un perímetro cerrado, con límites no unidos de un borde a otro. Estos bordes pueden fabricarse mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la técnica para deformar los materiales citados anteriormente que constituyen el sustrato, o mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la técnica para formar relieves sobre una superficie, particularmente en el campo de los laboratorios en un chip y microsistemas de análisis, por ejemplo mediante deposición de material (x) y grabado. A título de ejemplo, entre los procedimientos conocidos por el experto en la técnica utilizables para fabricar los bordes según la presente invención, pueden citarse los siguientes: gravado directo del sustrato; deposición de un material a la superficie de un sustrato plano, por ejemplo mediante recubrimiento, evaporación, pulverización o deposición electroquímica, después gravado junto con un procedimiento clásico de fotolitografía, por ejemplo mediante recubrimiento de resina, insolación y definición de motivos, o gravado; definición directa de motivos mediante fotolitografía en polímeros fotosensibles, por ejemplo en el caso de resinas fotosensibles; moldeo o embutido, por ejemplo de materiales plásticos o del sustrato que forma la superficie
activa.
La fabricación de los bordes según la invención puede realizarse particularmente durante la última etapa de un apilamiento tecnológico de varias capas sobre el sustrato. Las capas inferiores podrán contener accionadores o detectores mecánicos, ópticos o electrónicos, por ejemplo del tipo MEMS o MEMS óptico ("Micro Electro Mechanical System" - sistema microelectromecánico) o incluso moléculas injertadas de interés químico o biológico destinadas a formar las zonas de trabajo. Las cubetas pueden estar dispuestas por ejemplo en cuadrícula, en la superficie del sustrato, de tal manera que no presentan ningún límite en común.
Según la invención, opcionalmente, los bordes pueden ser humectantes con respecto al líquido de interés sobre su parte más elevada con respecto a la superficie activa y/o sobre su vertiente con respecto a la zona de trabajo que rodea. Esta opción permite reforzar, si es necesario, la retención de la gota de líquido de interés capturada por el borde. Esta humectabilidad puede obtenerse, por ejemplo, sobre bordes constituidos por silicio, óxido de silicio (SiO_{2}), vidrio, nitruro de silicio (Si_{3}N_{4}), es decir, materiales que pueden constituir el sustrato, mediante injerto sobre este material de una función química humectante con respecto al líquido de interés al que está destinado el dispositivo de la invención. Por ejemplo, la función química humectante con respecto a un líquido de interés acuoso puede seleccionarse del grupo que consiste en una función alcohol, alcoholato, ácido carboxílico, carboxilato, ácido sulfónico, sulfonato, oxiamina, hidrazina, amina y amonio.
Esta humectabilidad también puede obtenerse, cuando el sustrato a base de silicio, mediante gravado para formar óxido de silicio negro hidrófilo que no necesitará modificación química para ser humectante con respecto a disoluciones acuosas. Este modo de realización económico se utiliza por tanto preferiblemente cuando el líquido de interés es acuoso. El documento [10] presenta un protocolo utilizable para realizar este modo de realización.
La naturaleza de la superficie, en el exterior de las cubetas, pero también ventajosamente en el interior de las cubetas, es un parámetro importante para permitir el buen funcionamiento global del dispositivo de la presente invención. El tratamiento de la superficie del sustrato para hacerlo sensiblemente no humectante puede realizarse antes o después de la formación de las cubetas, con el fin de modificar la afinidad de las zonas sobre el sustrato: entre las cubetas y, ventajosamente, en su centro. Por tanto, la aspiración del líquido de interés se facilita por una débil afinidad entre el líquido de interés y la superficie entre las cubetas. Por otra parte, el centro de las cubetas puede presentar ventajosamente una buena afinidad con respecto a la fase líquida para facilitar la captura de una gota de líquido de interés en el seno de las cubetas.
De manera totalmente inesperada, los inventores han constatado que cuando toda la superficie del sustrato, es decir, el centro de las cubetas formadas por los bordes y la superficie entre las cubetas, presenta una mala afinidad con el líquido de interés, particularmente cuando es sensiblemente no humectante con respecto al líquido de interés, sin embargo la captura de la fase líquida en las cubetas durante la aspiración puede realizarse gracias a la presencia de las paredes de las cubetas según la presente invención, aunque no sean humectantes con respecto al líquido de interés. Por tanto, según la invención, las zonas de trabajo pueden ser zonas no humectantes con respecto al líquido de interés. Otra ventaja de esta invención es que la captura del líquido de interés depende mucho menos del estado de la superficie o de su evolución en el tiempo que para los dispositivos de la técnica anterior. De hecho, si la afinidad entre el centro de la cubeta y el líquido de interés disminuye en el transcurso del tiempo, la captura sigue quedando garantizada por la presencia de los bordes, o muretes según la presente invención.
Preferiblemente, según la invención, al menos una zona de trabajo está en el mismo plano que la superficie activa, aún preferiblemente, todas las zonas de trabajo de la superficie activa. Estando los bordes realizados alrededor de las zonas de trabajo, la fabricación del dispositivo de la presente intención se facilita de este modo.
Por zona de trabajo, se entiende en la presente invención una zona a nivel de la cual pueden llevarse a cambo operaciones físicas y/o químicas y/u ópticas en la gota capturada por el borde que la rodea (su borde). Por tanto, según la invención, al menos una zona de trabajo puede ser una zona de interacción seleccionada de una zona de interacción eléctrica, química, mecánica, óptica con dicha gota de líquido de interés capturada, o una zona a nivel de la cual varias de estas interacciones se utilizan simultánea o sucesivamente.
Por tanto, según una primera forma de realización de la invención, al menos una zona de trabajo puede ser una zona de interacción eléctrica, por ejemplo una microcélula electroquímica. Una microcélula electroquímica es un dispositivo que presenta al menos dos electrodos, preferiblemente coplanarios, que forman un electrodo de trabajo y un contraelectrodo. Puede presentar igualmente un electrodo de referencia. El experto en la técnica conoce estos elementos y los procedimientos de fabricación que pueden utilizarse para fabricar esta zona de trabajo, por ejemplo el procedimiento descrito en el documento referencia [7].
Gracias a esta forma de realización, el dispositivo de la presente invención puede constituir un auténtico micro-reactor electroquímico que utiliza las gotas de líquido de interés capturadas por los bordes como medios de reacción, y más precisamente como medios electroquímicos. Cada reactor electroquímico (borde + zona de trabajo en forma de microcélula electroquímica + gota de líquido de interés capturada) según esta primera forma de realización de la presente invención puede utilizarse para realizar cualquier reacción y/o análisis electroquímico conocido por el experto en la técnica.
Este reactor puede servir por ejemplo para realizar reacciones de electropolimerización localizada de uno o de varios monómero(s) presente(s) en la gota (polimerización o copolimerización) y/o de electro-injerto localizado de una o de varias molécula(s) química(s) presente(s) en la gota del líquido de interés en uno de los electrodos de la microcélula. En este ejemplo, el líquido de interés puede ser un líquido que contiene los reactivos necesarios para la electropolimerización o el electroinjerto deseado. La polimerización y el injerto se sitúan entonces ventajosamente a nivel de la gota del líquido de interés capturada por el borde. Tales reacciones de electropolimerización o injerto localizados pueden utilizarse por ejemplo para la fabricación de chips biológicos o sistemas de análisis.
En un ejemplo particular, la microcélula electroquímica del dispositivo de la invención puede utilizarse en primer lugar para "fabricar" las zonas de trabajo, y a continuación, por ejemplo para utilizar estas zonas de trabajo para el análisis de las gotas de un líquido de interés que va a analizarse. Por ejemplo, si las zonas de trabajo deben comprender un polímero orgánico funcionalizado por una sonda, por ejemplo una sonda biológica, puede fabricarse mediante electropolimerización de un polímero conductor funcionalizado por una sonda, por ejemplo según el procedimiento descrito en el documento referencia [5]. La particularidad relacionada con el uso del dispositivo de la invención es que se utilizan los bordes para capturar de manera localizada sobre cada zona de trabajo una primera gota de un primer líquido de interés que contiene los reactivos necesarios para la electropolimerización (monómero orgánico). La funcionalización por la sonda, puede realizarse simultáneamente a la electropolimerización, el primer líquido de interés también contiene entonces la sonda (por ejemplo monómero funcionalizado por la sonda). La funcionalización también puede realizarse tras la electropolimerización mediante una segunda gota de un segundo líquido de interés (que contiene la sonda) capturada por los mismos bordes y, por ello, localizada sobre las mismas zonas de trabajo. Además, las zonas de trabajo así fabricadas pueden secarse a continuación, y pueden servir, siempre gracias a su borde que las rodea, a capturar una gota de un tercer líquido de interés a analizar, que contiene una diana que interacciona con la sonda (por ejemplo oligonucleótidos complementarios). Aún puede utilizarse un cuarto líquido de interés para analizar (detección y/o dosificación) la interacción sonda/diana sobre dichas zonas de trabajo, y así sucesivamente.
El micro-reactor electroquímico según la invención también puede servir por ejemplo para realizar análisis electroquímicos, cualitativos y/o cuantitativos, de analitos presentes en las gotas capturadas por los bordes. También puede servir por ejemplo para realizar análisis electroquímicos, cualitativos y/o cuantitativos, de una interacción molecular sonda/diana, estando la sonda fijada sobre las zonas de trabajo, y encontrándose la diana en las gotas del líquido de interés capturadas.
En un ejemplo particular, en el que la microcélula electroquímica de un dispositivo de la presente invención se utiliza para detectar una diana presente en una muestra líquida, por ejemplo poniendo en práctica una interacción de la diana que va a detectarse con una sonda específica fijada sobre las zonas de trabajo, es posible detectar electroquímicamente dicha interacción por ejemplo con amplificación de la señal mediante acumulación enzimática en una gota de un líquido de interés, que contiene un sustrato enzimático, capturada por el borde que rodea a cada zona de trabajo. El documento [4] expone un protocolo operativo utilizable para este tipo de detección, con el dispositivo de la presente invención.
La detección de una interacción sonda/diana sobre una zona de trabajo puede hacer intervenir uno de los otros medios conocidos por el experto en la técnica distintos de la célula electroquímica, por ejemplo uno de los expuestos en la presente descripción, por ejemplo un procedimiento óptico. La microcélula electroquímica puede entonces servir en este caso únicamente para "fabricar" las zonas de trabajo, realizándose a continuación la detección de una interacción sonda/diana por otro medio, o bien para analizar una interacción sonda/diana, realizándose la fabricación de las zonas de trabajo por otro procedimiento, por ejemplo uno de los conocidos por el experto en la técnica en el campo de los chips biológicos.
Independientemente de la puesta en práctica de esta forma de realización caracterizada por la presencia de una microcélula electroquímica, cuando se utiliza una sonda sobre las zonas de trabajo, puede seleccionarse por ejemplo del grupo que consiste en una enzima, un sustrato de enzima, un oligonucleótido, un oligonucleósido, una proteína, un receptor de membrana de una célula eucariota o procariota, un anticuerpo, un antígeno, una hormona, un metabolito de un organismo vivo, una toxina de un organismo vivo, polinucleótido, polinucleósido, ADN complementario o una mezcla de los mismos. Obviamente, se selecciona en función de la diana con la que deberá interaccionar.
Según una segunda forma de realización de la invención, al menos una zona de trabajo puede ser una zona de interacción química con la gota de líquido de interés capturada, sin microcélula electroquímica. Esta zona de trabajo puede comprender por ejemplo funciones o reactivos químicos o biológicos listos para reaccionar con una diana de esas funciones o de esos reactivos presentes en un líquido de interés. Al igual que para la primera forma de realización, el dispositivo de la invención puede servir en primer lugar para colocar esas funciones o esos reactivos sobre zonas de trabajo, y en segundo lugar, tras el secado, para capturar una gota de líquido de interés que contiene la diana de esas funciones o de esos reactivos.
Esta, al menos una, zona de trabajo puede seleccionarse de las conocidas por el experto en la técnica en el campo de los chips biológicos (chips comercializados por AGILENT, CIPHERGEN, EUROGENTEC). La diferencia del dispositivo de la presente invención con esos chips de la técnica anterior reside sobretodo en la presencia de un borde que rodea cada zona de trabajo y permite capturar una gota de líquido de interés. Esta, al menos una, zona de trabajo puede fabricarse por ejemplo mediante silanización y después inmovilización de sondas biológicas tal como se describe por ejemplo en el documento referencia [8].
Esta, al menos una, zona de trabajo puede ser por ejemplo una zona que comprende un polímero funcionalizado por una sonda biológica tal como los citados anteriormente, con el objetivo de fijar una diana correspondiente susceptible de estar presente en un líquido de interés para detectarla, por ejemplo ópticamente. Por ejemplo, sobre un sustrato tal como los citados anteriormente, esta, al menos una, zona de trabajo puede obtenerse según los métodos descritos en el documento referencia [9].
Según una tercera forma de realización de la invención, al menos una zona de trabajo puede presentar dispositivos activos o de medición, tales como detectores o accionadores. Esta forma de realización puede añadirse a las formas de realización y variante citadas anteriormente, o ser exclusiva según el objetivo propuesto en la puesta en práctica de la presente invención. Los dispositivos activos o de medición están ventajosamente situados en el centro de la superficie de las zonas de trabajo delimitadas por un borde.
Cuando una zona de trabajo comprende un detector, puede seleccionarse por ejemplo del grupo que consiste en detectores eléctricos, magnéticos, electrostáticos, mecánicos (por ejemplo detector de presión), térmicos (por ejemplo detectores de temperatura), ópticos (por ejemplo dispositivo de detección ópticos) y químicos.
Cuando una zona de trabajo comprende un accionador, puede seleccionarse por ejemplo del grupo que consiste en accionadores ópticos (fuente luminosa), eléctricos, magnéticos, electrostáticos, mecánicos (desplazamiento mecánico), térmicos (resistencia calefactora) y químicos.
Tales detectores y accionadores, utilizables para la puesta en práctica de la presente invención, así como su procedimiento de fabricación, los conoce el experto en la técnica, particularmente en el campo de los microsistemas. De nuevo, la diferencia del dispositivo de la presente invención con esos chips de la técnica anterior reside particularmente en la presencia del borde que rodea a cada zona de trabajo.
Independientemente de la forma de realización del procedimiento de la presente invención, sobre un sustrato pueden disponerse varias zonas de trabajo cada una rodeada por un borde según la invención. En una aplicación habitual, por ejemplo para la fabricación de un laboratorio en un chip, o de un microsistema, el número de zonas de trabajo rodeadas cada una por un borde puede ser, únicamente a título de ejemplo, de 16 a 3025 por cm^{2} de superficie activa. Según una variante de la presente invención, varias zonas de trabajo pueden estar rodeadas por un único borde, por ejemplo de 2 a 4 o más, siempre que cuando una gota de líquido de interés queda capturada por el borde, esta gota recubre, al menos parcialmente, todas las zonas de trabajo que están rodeadas por este borde.
De manera general, gracias al dispositivo de la presente invención, pueden capturarse sucesivamente diferentes gotas constituidas por diferentes líquidos de interés por un mismo borde y con diferentes fines, por ejemplo para realizar etapas sucesivas de un protocolo de fabricación de la zona de trabajo que rodea, por ejemplo también para realizar etapas sucesivas de detección y/o de dosificación de un analito en un líquido de interés. La ventaja relacionada con la presente invención es que independientemente del objetivo de las capturas sucesivas de gotas de líquidos de interés, las gotas capturadas sucesivamente están todas localizadas sobre las zonas de trabajo, gracias a su borde respectivo.
El dispositivo de la invención comprende igualmente una caja de trabajo. Esta caja de trabajo es una caja utilizada para cubrir la superficie activa del dispositivo de la invención con el líquido de interés. Esta caja puede permitir además confinar la superficie activa y/o realizar análisis sobre o en las gotas capturadas sobre las zonas de trabajo. En estos dos últimos casos, el dispositivo de la presente invención constituye entonces un auténtico laboratorio en miniatura.
El dispositivo de la presente invención puede utilizarse en microsistemas, tales como microsistemas de análisis, o formar un chip biológico por ejemplo seleccionado del grupo que consiste en chips de ácido nucleico, anticuerpos, antígenos, proteínas y células.
Las dimensiones de esta caja dependen particularmente de las dimensiones del sustrato equipado con su superficie activa que debe introducirse en la misma, pero también, dado el caso, de otros dispositivos de análisis o microsistemas que pueden unirse en dicha caja, por ejemplo otros laboratorios en un chip. Pueden reducirse a menos de un cm para el lado más grande.
La caja puede estar constituida por ejemplo por un material seleccionado del grupo que consiste en un polímero orgánico, un material plástico elastómero, un vidrio, metal, silicio, una resina fotosensible, o por cualquier material conocido por el experto en la técnica y que permita la puesta en práctica de la presente invención. Por ejemplo, puede tratarse de un polímero seleccionado del grupo que comprende los policarbonatos, los polidimetilsiloxanos, los poli(metacrilatos de metilo), los policlorobifenilos y los copolímeros de cicloolefinas.
El material de la caja se selecciona generalmente en función de la naturaleza del líquido de interés que va a introducirse en la caja, del uso de la caja (sencillamente cobertura del sustrato por el líquido de interés para formar la matriz de gotas o cobertura y análisis o u otro (reacciones químicas, electroquímicas o bioquímicas) y en función de las especificaciones de coste del fabricante. Puede tratarse de un material idéntico al sustrato del dispositivo de la invención o diferente.
La caja es preferiblemente lo suficientemente estanca para evitar por ejemplo los escapes durante de la introducción en la misma del líquido de interés y/o las contaminaciones que pueden proceder del exterior de la caja, por ejemplo bacteriana, química, etc. y/o la evaporación de las gotas capturadas por los bordes que rodean las zonas de trabajo del dispositivo de la presente invención.
Según un modo de realización particular de la caja, cuando el sustrato y la caja están constituidos por un mismo material, el sustrato puede constituir una de las paredes de la caja, estando la superficie activa dirigida hacia el interior de la caja.
Las paredes de la caja pueden montarse a partir de, y sobre, la superficie activa del dispositivo de la invención, por ejemplo por pegado o compresión.
La caja de trabajo puede comprender una cubierta para su montaje, pero también, en ciertas aplicaciones, para abrirla o cerrarla, particularmente con el fin de poder retirar de la misma el sustrato de la invención con su superficie activa tras haberlo puesto en contacto con el líquido de interés, o tras los análisis o reacciones en las gotas. De hecho, una única caja puede servir igualmente para sumergir al mismo tiempo o sucesivamente uno o, según su concepción, varios sustratos según la invención. La caja puede comprender entonces medios de fijación amovibles, por ejemplo presillas, del o de los sustrato(s) en el interior de la misma. Si la caja comprende una cubierta, es preferiblemente lo suficientemente estanca para no perturbar la introducción del líquido de interés en la caja.
La cubierta puede estar constituida por un material tal como los citados anteriormente para la caja. Puede fabricarse, por ejemplo, mediante moldeo, mediante embutido, mediante gravado o mediante erosión mecánica, etc. A continuación puede fijarse definitivamente sobre la caja para cerrarla, por ejemplo mediante pegado, compresión, presión o mediante cualquier otro medio conocido por el experto en la técnica y que garantiza el mantenimiento y la estanqueidad requeridos para el uso de la misma. También puede fijarse sobre la caja de manera amovible, siempre garantizando el mantenimiento y la estanqueidad requeridas para el uso de la misma, con el fin de que la propia caja así constituida pueda servir para disponer de las matrices de gotas sobre varios sustratos diferentes según la invención, y/o con diferentes líquidos de interés.
Preferiblemente, el material de la caja, y, dado el caso, de su cubierta, es, en el interior de la misma, sensiblemente no humectante con respecto al líquido de interés. De hecho, esto permite evitar que las gotas se adhieran a las superficies internas de la caja, tras la extracción del líquido de interés, y vuelvan a caer sobre la superficie activa y alteren los análisis y reacciones sobre las zonas de trabajo en las gotas capturadas por los bordes. Pueden necesitarse tratamientos de superficie para obtener este resultado, tal como para la superficie activa del dispositivo de la invención. Estos tratamientos pueden ser por ejemplo los mencionados anteriormente para la fabricación de la superficie activa.
La caja de la presente invención puede estar equipada con medios de introducción del líquido de interés en dicha caja y de extracción de líquido de interés de dicha caja. Estos medios pueden comprender por ejemplo dos aberturas. No hay limitación en la posición, forma, número y función de estas aberturas a parte de las siguientes: deben permitir la introducción y después la extracción del líquido de interés de la caja, y deben estar dispuestas de tal manera que cuando el líquido de interés se introduce en la caja, cubre el o los borde(s) de la superficie activa, y cuando el líquido de interés se extrae de la caja, una gota del líquido de interés queda capturada por el borde. El líquido de interés puede entrar y después salir de la caja por dos aberturas diferentes. También puede entrar y después salir de la caja por una única de dos aberturas, sirviendo una segunda abertura para permitir la extracción del líquido de interés, o bien dejando pasar el aire requerido para la extracción del líquido de interés, o bien inyectando por esta segunda abertura un fluido gaseoso que permite empujar el líquido de interés hacia el exterior de la caja.
Los medios de introducción y de extracción del líquido de interés de la caja comprenden particularmente aberturas que pueden estar dispuestas sobre la cubierta o sobre las paredes de la caja, por ejemplo mediante gravado, embutido, moldeo, exposición a la luz para una resina fotosensible, perforación mecánica, etc.
Los medios de introducción del líquido de interés en la caja pueden comprender cualquier medio apropiado conocido por el experto en la técnica para inyectar un líquido en una caja, particularmente los utilizados en el campo de los laboratorios en un chip y de los microsistemas. Estos medios de introducción pueden seleccionarse por ejemplo entre una jeringuilla, una pipeta, una micropipeta o una bomba de inyección, etc.
Los medios de extracción del líquido de interés de la caja pueden comprender cualquier medio apropiado conocido por el experto en la técnica para extraer un líquido de una caja, particularmente los utilizados en el campo de los laboratorios en un chip y de los microsistemas. Estos medios de extracción pueden ser por ejemplo una bomba de extracción, manual o automática.
Por ejemplo, según la invención, cuando el medio de extracción del líquido de interés comprende una bomba de extracción, puede ser en forma de una bomba de inyección de un fluido gaseoso en la caja, por una primera abertura formada sobre la caja, de manera que puede inyectarse en la caja un fluido gaseoso que expulsa el líquido de interés de la caja por una segunda abertura formada sobre la caja. Ventajosamente, la bomba de inyección del fluido gaseoso comprende además un dispositivo de saturación del fluido gaseoso inyectado en vapor del líquido de interés. Esta saturación permite evitar o limitar la evaporación de la, o de las, gota(s) capturada(s) por los bordes.
También por ejemplo, cuando el medio de extracción comprende una bomba aspirante, puede ser en la forma de una bomba aspirante dispuesta a nivel de una abertura formada sobre la caja de manera que puede extraerse el líquido de interés de la caja aspirándolo por esta abertura. Ventajosamente, una segunda abertura puede disponerse sobre la caja de manera que se permite la introducción de un fluido gaseoso, por ejemplo aire, un gas neutro o un fluido gaseoso saturado en vapor del líquido de interés, por requerimiento de aire provocado por la aspiración del líquido de interés.
La presente invención se refiere igualmente a un procedimiento de fabricación de un dispositivo según la invención, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
- proporcionar un sustrato
- formar zonas de trabajo sobre dicho sustrato,
- estructurar la superficie del sustrato de manera que se forme un borde alrededor de las zonas de trabajo,
- tratar la superficie sobre la que se han formado las zonas de trabajo y su borde para hacerla sensiblemente no humectante con respecto al líquido de interés,
- proporcionar una caja e introducir en ella el sustrato que comprende las zonas de trabajo rodeadas por su borde, comprendiendo dicha caja medios para introducir el líquido de interés en la caja y medios para extraer el líquido de interés de la caja, y
- cerrar dicha caja.
El sustrato, la formación de las zonas de trabajo, la estructuración de la superficie destinada a formar los bordes alrededor de las zonas de trabajo, el tratamiento de la superficie del sustrato destinado a hacerla sensiblemente no humectante, ya se definieron anteriormente en el presente documento.
Por supuesto, a la vista de la presente descripción, el procedimiento de la invención incluye la formación simultánea o sucesiva de varias zonas de trabajo y bordes respectivos alrededor de las mismas.
Los diferentes materiales y etapas de este procedimiento ya se describieron anteriormente en el presente documento.
El desarrollo del procedimiento que permite la captura de una gota del líquido de interés por cubeta formada por un borde, sobre la superficie activa en la caja de trabajo, puede esquematizarse de la siguiente manera:
- llenado total o parcial de la caja, o cámara de fluidos, por el líquido de interés de manera que se cubre(n) la o las zona(s) de captura, después
- extracción del líquido de interés de la caja.
Sólo la o las zonas de captura conservan, cada una, una gota del líquido de interés, siendo la superficie activa no humectante. Ya no se necesita ningún equipo costoso de dispensación de gotas. Además, el número de zonas de trabajo ya no está limitado por los límites de estos aparatos.
Los inventores de la presente invención también han constatado que, de manera sorprendente, la extracción del líquido de interés se realiza más fácilmente que sobre un sustrato de la técnica anterior en el que están unidos los límites de las cubetas (que no lo son realmente ya que la superficie de estos sustratos está cavada para formar las cubetas, pero no se forma ningún borde en el sentido de la presente invención), ya que las zonas despejadas entre las cubetas forman el mismo número de canales para el paso de un fluido. Por otra parte, la disposición particular de las zonas de trabajo y bordes de la presente invención, junto con la fabricación en relieve sobre la superficie, permite evitar cualquier comunicación del líquido de una cubeta a otra, una vez realizada la aspiración.
El uso del dispositivo de la presente invención es muy flexible, ya que puede hacerse intervenir sucesivamente una operación que se desarrolla colectivamente, después de las operaciones individuales a nivel de cada una de las gotas formadas. Por tanto, en una primera operación, denominada colectiva, el dispositivo de la invención permite el paso de una vena de fluidos del líquido de interés, por ejemplo inyectada en dicha caja, a una matriz de gotas, o microvolúmenes, independientes unos de otros. A continuación, pueden ponerse en práctica individualmente procedimientos de detección y/o de reacciones químicas o bioquímicas conocidos por el experto en la técnica (operación individual), en paralelo, o sucesivamente, en cada una de las gotas capturadas por los bordes para detectar y analizar dianas presentes en el líquido de interés.
En procedimientos con varias etapas que utilizan el dispositivo de la invención, no es necesario que todas las etapas conduzcan a la formación de gotas. De hecho, nada impide que ciertas etapas se realicen cubriendo la totalidad de los bordes por un líquido y después vaciando la caja de este líquido de tal manera que no queden gotas capturadas por los bordes, por ejemplo mediante inyección en la caja de un gas a presión, mediante agitación enérgica, etc.
Además, es posible capturar sucesivamente diferentes gotas de uno o varios líquidos de interés sobre una misma zona de trabajo gracias al borde que la rodea. Cada líquido de interés puede contener uno o varios reactivo(s) nece-
sario(s) por ejemplo para realizar una de las etapas de un procedimiento de química o bioquímica, por ejemplo para fabricar las zonas de trabajo y/o para realizar análisis. La sucesión de las diferentes gotas sobre una misma zona de trabajo permite por ejemplo realizar diferentes etapas sucesivas de un procedimiento puesto en práctica sobre el dispositivo de la invención, y, más particularmente sobre las zonas de trabajo rodeadas por su borde. El conjunto de estas etapas de procedimiento está por tanto ventajosamente localizado sobre las zonas de trabajo gracias a su borde.
En experimentos relacionados con la puesta en práctica de la presente invención, los inventores han observado que el dispositivo de la invención resuelve incluso otros problemas técnicos, con respecto a las técnicas de la técnica anterior, en los campos de los laboratorios en un chip, chips biológicos y microsistemas. En particular, en la técnica anterior existen varios métodos de injerto covalente localizado de moléculas biológicas para funcionalizar superficies de chip biológico. Esta localización se realiza en general mediante vía química, fotoquímica o bien eléctrica. Mediante vía química, la inmovilización de un elemento biológico (sonda) se realiza mediante deposición localizada ("spotting") o síntesis in situ lo que es limitante en cuanto al tiempo. Mediante vía fotoquímica, es posible realizar síntesis de oligonucleótidos con ayuda de grupos fotolábiles [4]: de nuevo, a menudo se encuentran limitaciones en cuanto al tiempo de síntesis y volúmenes de reactivos costosos. Además, pueden producirse reacciones radicalares no selectivas. Mediante vía eléctrica, la síntesis de oligonucleótidos sobre soporte sólido con grupo electrolábil encuentra las mismas limitaciones. Mediante vía electroquímica [3], mediante copolimerización de pirrol y de portador de pirrol de una especie biológica sobre un electrodo metálico. Esta última técnica presenta el inconveniente de requerir volúmenes importantes de reactivos costosos (portador de pirrol de la especie biológica).
El dispositivo de la presente invención permite resolver estos numerosos problemas de la técnica anterior. De hecho, permite funcionalizar rápidamente y con precisión superficies de chips biológicos, que en la presente invención se convierten en las zonas de trabajo, gracias a una localización rápida y precisa de cada gota del líquido de interés sobre la o las zona(s) de trabajo, y un control preciso de las densidades de sondas inmovilizadas. Además, con respecto a los procedimientos de la técnica anterior, los volúmenes de reactivos utilizados son claramente menos importantes debido al hecho de la localización precisa de la reacción en el volumen de las gotas de reactivos capturadas por las zonas de captura. Además, los experimentaciones de los inventores han demostrado que el dispositivo de la presente invención permite trabajar en microvolúmenes independientes entre sí, sin contaminación acrecentada entre las regiones de detección, lo que aumenta considerablemente la precisión y la reproducibilidad de los análisis.
Por tanto, la presente invención permite entre otras cosas una medición electroquímica u óptica en medio confinado, en las gotas capturadas por los bordes, pero igualmente una funcionalización localizada sobre la zona de trabajo mediante vía electroquímica o química con reactivos costosos: el volumen de los reactivos se reduce a la auténtica zona útil formada por cada zona de trabajo rodeada por su borde según la invención.
Esta invención encuentra actualmente su mayor interés en las aplicaciones de laboratorio en un chip y microsistemas. La presente invención se refiere por tanto igualmente a un chip biológico, por ejemplo seleccionado del grupo que consiste en chips de ácido nucleico, chips de anticuerpos, chips de antígenos, chips de proteína y chips de células. Según la invención, pueden realizarse detecciones de diferentes moléculas susceptibles de estar presentes en el líquido de interés en paralelo, simultánea o sucesivamente, en diferentes gotas de líquido de interés capturadas sobre dicha superficie activa en la caja.
Según la invención, el, al menos un, analito que va a detectarse puede seleccionarse por ejemplo de las moléculas biológicas o químicas. Las moléculas biológicas pueden seleccionarse por ejemplo del grupo que consiste en una enzima, un sustrato de enzima, un oligonucleótido, un oligonucleósido, una proteína, un receptor de membrana de una célula eucariota o procariota, un virus, un anticuerpo, un antígeno, una hormona, un metabolito de un organismo vivo, una toxina de un organismo vivo, un nucleótido, un nucleósido, un ADN complementario. La molécula química puede ser cualquier molécula que debe analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.
Otras características y ventajas se le ocurrirán al experto en la técnica tras la lectura de los ejemplos que siguen facilitados a título ilustrativo y no limitativo con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripción de las figuras
- La figura 1 es una representación esquemática en corte de dos tipos de cubetas: a la izquierda las cubetas de la técnica anterior, y a la derecha las cubetas según la presente invención.
- La figura 2 es una representación esquemática en corte de diferentes formas geométricas de bordes según la presente invención.
- La figura 3 es una representación esquemática de bordes según la invención, en vistas desde arriba, que tienen diferentes formas alrededor de las respectivas zonas de trabajo que los rodean.
- La figura 4 es un esquema que representa en corte transversal un dispositivo según la presente invención y su funcionamiento para la creación de una matriz de gotas gracias a la superficie activa de su sustrato.
- La figura 5 es un esquema que representa en corte transversal un dispositivo según la presente invención en el cual los medios de introducción del líquido de interés en la caja y de extracción del líquido de interés de la caja utilizan una misma abertura de la caja.
- La figura 6 es un esquema en vista desde arriba, realizado a partir de fotografías experimentales, de una superficie activa según la invención que muestra la formación de una matriz de gotas: a la izquierda la superficie sin gotas antes de que el líquido de interés se introduzca en el dispositivo de la presente invención, y a la derecha, la superficie con la matriz de gotas retenida por los bordes (b) cuando el líquido de interés se ha extraído de la caja.
- La figura 7 es una fotografía de un modo de realización del dispositivo de la invención en el que un borde de resina rodea cada zona de trabajo, y en el que las zonas de trabajo son microcélulas electroquímicas. El diámetro exterior de la corona de resina que rodea la célula electroquímica del dispositivo fotografiado es en realidad de 700 \mum.
- La figura 8 es un gráfico de curvas de voltametría cíclica que miden la intensidad (I(\muA)) en función del potencial (mV) antes (Av) de la formación de una matriz de gotas y después (Ap) de la formación de una matriz de gotas sobre un dispositivo según la presente invención cuya superficie activa está representada con aumento en la figura 7.
- La figura 9 es una representación esquemática de diferentes modos de realizaciones posibles de una caja de trabajo según la invención, en particular representa ejemplos de disposiciones de los medios de introducción y de extracción de líquido de interés de la caja en diferentes cajas de trabajo según la presente invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Fabricación de zonas de captura constituidas por bordes
Sobre una placa nueva de silicio se realiza una etapa de fotolitografía con una resina espesa fotosensible Clariant AZ4562 (marca comercial) de la siguiente manera:
- deposición de un promotor de adherencia, que en este caso es hexametilendisilazano, en un horno a 120ºC,
- recubrimiento de resina sobre devanadera a 1000 vueltas/minuto durante 30 s con una aceleración de 200 vueltas/minutos,
- recocer sobre placa de calentamiento a 115ºC durante 2 minutos,
- insolación sobre máquina de insolación Karl Süss MA750 (marca comercial) durante 50 s en modo discontinuo (5 x 10 segundos con 5 segundos de pausa) a través de una máscara,
- revelado en una disolución Shipley MF319 (marca comercial) diluida en las proporciones 1:3 con agua desionizada,
- aclarado con agua desionizada y secado bajo flujo de nitrógeno,
- recocido sobre placa de calentamiento a 115ºC durante 3 minutos, después a 150ºC durante 1 minuto,
- medición del espesor: 13 \mum.
Sobre la mascara utilizada para la insolación, todos los motivos representan anillos cuyos muretes tienen un ancho de 35 \mum con combinaciones variadas entre su diámetro (de 100 a 1000 \mum) y la distancia entre el centro de dos coronas (de 50 a 1000 \mum).
Pudieron obtenerse fácilmente 3025 cubetas sobre una superficie de 1 centímetro cuadrado.
Ejemplo 2 Fabricación de la caja
Se fabrica una cubierta hueca de polidimetilsiloxano (PDMS) mediante moldeo sobre un molde de vidrio con un motivo cuadrado con un sobreespesor de 1 mm. Sobre un dispositivo plano como los obtenidos en el ejemplo anterior, se fija esta cubierta de manera hermética mediante encolado con cola reticulante mediante insolación con rayos ultravioletas (VITRALIT 6181). Se realizan las conexiones para las entradas y salidas de los fluidos mediante perforación de la cubierta con agujas de diámetro pequeño. La aguja de entrada está unida a tubos de transporte de fluido y a una jeringuilla llena del líquido de interés. Se somete a prueba el conjunto final para detectar fugas, sabiendo que el líquido debe pasar únicamente por las conexiones previstas para ello.
La figura 4 es una representación esquemática de la caja obtenida en este ejemplo. Pueden realizarse fácilmente otras disposiciones de las conexiones (o, s) de entrada y salida de introducción y de extracción de un líquido de interés siguiendo este ejemplo, y la figura 9 representa figuras esquemáticas de las cajas que pueden obtenerse.
En la figura 4 adjunta, la caja (B) según la invención comprende aberturas (o, s). Se representan igualmente las zonas (Zt) de trabajo y bordes (b).
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Ejemplo 3 Captura de agua desionizada sobre una superficie de silicio con óxido nativo
Se someten a prueba con agua desionizada (EDI) diferentes tipos de motivos que forman bordes según la invención, representados en las figuras 1 a 3 adjuntas, y obtenidos mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 1.
Para ello, se utilizan cubiertas con una vena de fluidos de espesor próximo a 1 mm constituida gracias a una caja de trabajo según la invención, fabricada según el ejemplo 2 (figura 4 adjunta), para permitir la inyección y después la aspiración de EDI, mediante tubos de plástico.
La superficie inicial, constituida por silicio con una capa de óxido nativo, no se ha tratado y el ángulo de contacto es próximo a 68º con EDI.
Tal como muestra la figura 6 adjunta, a la derecha, la EDI queda retenida en las cubetas formadas por los límites (b), sobre la zona (Zt) de trabajo, en forma de gotas (g) tras la aspiración del líquido de interés.
Se sometieron a prueba diferentes modos de llenado de la caja por el líquido de interés: con introducción y extracción del líquido de interés por la misma abertura (figura 5 adjunta), e introducción por una abertura y extracción por otra abertura (figura 4). Se obtiene una matriz de gotas cada vez.
Además, se observó que el llenado de la caja no es obligatorio, lo esencial es que los bordes se recubran por el líquido de interés.
Este ejemplo muestra que se obtiene una matriz de gotas (g) bien localizadas sobre las zonas de trabajo gracias a este dispositivo según la presente invención. La presente invención responde por tanto al conjunto de las necesidades mencionadas anteriormente de la técnica anterior.
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Ejemplo 4 Fabricación de zonas de trabajo funcionalizadas por una sonda según la invención
Un apilamiento tecnológico utilizando técnicas habituales de microelectrónica permite formar electrodos sobre una placa de silicio mediante deposición de metal y después fotolitografía y después gravado localizado.
En este ejemplo, se fabrica y se utiliza una microcélula que comprende tres electrodos. Sobre un sustrato de Si con una capa de SiO_{2} de 300 nm, se realizan etapas convencionales para el experto en la técnica de la microelectrónica:
- deposición de 300 nm de platino (Pt) mediante pulverización;
- fotolitografía en una resina fotosensible con abertura de los motivos de la microcélula y bandas de llegada de corrientes;
- en un reactor de plasma, gravado iónico completo del Pt en las zonas sin resina;
- contracción de la resina en un baño de ácido nítrico;
- en un reactor de plasma, deposición química en fase de vapor de 500 nm de SiO_{2};
- fotolitografía en una resina fotosensible con abertura de los motivos de los electrodos de la microcélula;
- en un reactor de plasma, gravado iónico completo de 500 nm de SiO_{2} en las zonas sin resina; y
- contracción de la resina en un baño de ácido nítrico.
El electrodo (We) de trabajo y el contraelectrodo (CE) son de platino (deposición de aproximadamente 5000 \ring{A}) (véase la figura 7).
Un electrodo de referencia Ag/AgCl/Cl- (Rf) está igualmente presente. Este electrodo se obtiene mediante deposición de plata sobre el platino con el protocolo siguiente:
- preparación de 10 ml de disolución que contiene AgNO_{3} 0,2 M, KI 2 M, Na_{2}S_{2}O_{3} 0,5 mM;
- se impone un potencial de -0,65 V frente al ECS (electrodo de calomel saturado) durante 90 segundos (seguido por cronoamperometría) sobre el electrodo de referencia. Se obtiene una deposición de color gris/blanco. A continuación se aclara el sustrato con agua;
- se sumerge el sustrato con el electrodo modificado anteriormente en una disolución de HCl 0,1 M y se impone un potencial de 0,5 V frente a ECS durante 30 segundos para clorar la deposición de plata. A continuación se aclara el sustrato con agua.
A continuación se realiza una etapa de fotolitografía idéntica a la descrita en el ejemplo 1 con el fin de envolver estos electrodos obtenidos anteriormente con un reborde de resina espesa de marca comercial Clariant AZ4562 y crear cubetas de 500 \mum de diámetro, con muretes de 13 \mum de alto y 25 \mum de ancho.
Uno de los bordes (b) obtenidos se representa totalmente en la fotografía de la figura 7 adjunta. Envuelve bien la microcélula electroquímica (CE, We, Rf).
Finalmente se silaniza el sustrato con un silano hidrófobo (octadeciltriclorosilano) según el procedimiento siguiente: en primer lugar se trata el sustrato para generar los sitios de silanol en un reactor de plasma Plassys MDS 150 (marca comercial) (sociedad Plassys, Francia) en las siguientes condiciones: potencia de 400 W, tiempo de reacción de 2 minutos, presión de 21,33 Pa (160 mTorr), caudal de oxígeno de 25 cm^{3}/min., a temperatura ambiente. A continuación se coloca el sustrato durante 10 minutos a temperatura ambiente en una mezcla de heptano anhidro/silano hidrófobo a una concentración de 9 mM de silano. A continuación se lava con heptano, después con tolueno, después con agua. A continuación se coloca el sustrato en una estufa durante 1 hora a 110ºC. El ángulo de contacto medido con el agua es próximo a 100ºC.
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Ejemplo 5 Uso de un dispositivo según la invención para una medición electroquímica con una disolución de Fe^{2+}
Se somete a prueba la célula electroquímica envuelta con su borde obtenida en el ejemplo 4 utilizando la caja fabricada en el ejemplo 2, y se introduce una disolución que contiene iones ferrosos (Fe II) en la vena de fluidos formada por esta caja.
La figura 8 es un gráfico de curvas de voltametría cíclica que miden la intensidad (I(\muA)) en función del potencial (mV) antes de la formación de la matriz de gotas y después de la formación de la matriz de gotas sobre un dispositivo según la presente invención representado en la figura 7.
Se realiza una primera medición en voltametría cíclica, que muestra la onda de oxidación de los iones ferrosos. A continuación se aspira la disolución de la caja para dejar sólo las cubetas llenas cada una por una gota del líquido de interés. Se realiza una segunda medición electroquímica, idéntica a la primera, que muestra de nuevo la presencia de la reacción de oxidación del hierro.
Por tanto, el líquido de interés queda retenido en las cubetas, permitiendo una medición tras la aspiración y vaciado de la cámara de fluidos formada por la caja de trabajo de la presente invención.
El llenado de la caja no es obligatorio, lo esencial es que los bordes estén cubiertos por el líquido de interés.
Este ejemplo muestra que se obtiene una matriz de gotas (g) bien localizadas sobre las zonas de trabajo gracias a este dispositivo según la presente invención. La presente invención responde por tanto al conjunto de las necesidades anteriormente mencionadas de la técnica anterior.
Lista de referencias
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[2] Documento US 6.040.193: Affymetrix Inc.
[3] Documento WO 99/03684: Eapen Saji y col.
[4] Azek y cols., Analytical Biochemistry, 2000, 284, 107-113.
[5] Documento WO 00/36145: Commissariat à l'Energie Atomique.
[6] Documento WO 02/090573: Infineon
[7] J. Cooper y cols., "Micromachining Sensor for Electrochemical Measurement in Subnanoliter Volumes", Anal. Chem. 1997, 69, 253-258.
[8] Documento FR-A-2 818 662
[9] Documento EP 561 722
[10] H. Jansen y cols., "The black silicon method: a universal method for determining the parameter setting of a fluorine-based reactive ion etcher in deep silicon trench etching with profile control", J. Micromech. Microeng. 5 (1995), 115-120.

Claims (32)

1. Dispositivo (1) de trabajo que comprende:
- una caja (Bo) de trabajo equipada con medios de introducción de un líquido (E) de interés en la caja y de medios (o, s) de extracción del líquido de interés de la caja,
- un sustrato (S) que comprende una superficie activa sensiblemente no humectante con respecto a dicho líquido de interés encerrado en dicha caja,
- varias zonas (Zt) de trabajo formadas sobre dicha superficie activa de manera clara y rodeadas cada una por un borde (b) formado sobre dicha superficie activa sensiblemente no humectante con respecto al líquido de interés, los bordes no se tocan entre sí y no tienen límite en común,
en el que los medios (o, s) de introducción y de extracción del líquido de interés de la caja están dispuestos sobre dicha caja de trabajo de tal manera que cuando se introduce el líquido de interés en la caja (Bo), cubre las zonas de trabajo y su borde respectivo, y en el que los bordes tienen una geometría tal que cuando se extrae el líquido de interés de la caja, tras haberse introducido en la misma, una gota (g) del líquido (E) de interés queda aprisionada por cada borde (b) y en contacto con la zona (Zt) de trabajo que rodea.
2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que la, al menos una, zona de trabajo está en el mismo plano que la superficie activa.
3. Dispositivo según la reivindicación 1 ó 2, en el que la, al menos una, zona de trabajo es una zona de interacción eléctrica y/o química con la gota capturada por su borde.
4. Dispositivo según la reivindicación 3, en el que la, al menos una, zona de trabajo es una microcélula electroquímica.
5. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que la, al menos una, zona de trabajo es un detector seleccionado del grupo que consiste en un detector óptico, eléctrico, magnético, electrostático, mecánico, térmico o químico.
6. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que la, al menos una, zona de trabajo es un accionador seleccionado del grupo que consiste en un accionador óptico, eléctrico, magnético, electrostático, mecánico, térmico o quí-
mico.
7. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la, al menos una, zona de trabajo es una zona de detección de al menos una especie química o biológica susceptible de estar presente en la gota del líquido de interés cuando se captura.
8. Dispositivo según la reivindicación 7, en el que la, al menos una, zona de trabajo es una zona funcionalizada por una sonda destinada a interaccionar con una diana susceptible de estar presente en la gota del líquido de interés cuando se captura.
9. Dispositivo según la reivindicación 8, en el que la sonda se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un sustrato de enzima, un oligonucleótido, un oligonucleósido, una proteína, un receptor de membrana de una célula eucariota o procariota, un anticuerpo, un antígeno, una hormona, un metabolito de un organismo vivo, una toxina de un organismo vivo, un polinucleótido, un polinucleósido y un ADN complementario.
10. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que la, al menos una, zona de trabajo es una zona no humectante con respecto al líquido de interés.
11. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el sustrato consiste en un material seleccionado del grupo que consiste en silicio, óxido de silicio, nitruro de silicio, vidrio, un polímero orgánico, plástico, estaño y un me-
tal.
12. Dispositivo según la reivindicación 11, en el que el polímero orgánico se selecciona del grupo que comprende los policarbonatos, los polidimetilsiloxanos, los poli(metacrilatos de metilo), los policlorobifenilos y los copolímeros de cicloolefinas.
13. Dispositivo según la reivindicación 11, en el que el metal se selecciona del grupo que consiste en Au, Ti, Pt, Al, Ni, y la aleación metálica es el acero inoxidable.
14. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que los bordes tienen una forma alrededor de la zona de trabajo y vista desde arriba, seleccionada de una forma anular, en estrella, en rectángulo, en cuadrado, en triángulo, en elipse o en polígono que tiene de 4 a 20 lados.
\newpage
15. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que los bordes tienen una sección en corte transversal, en el sentido de la superficie activa hacia la parte alta del borde, seleccionada de una forma triangular, rectangular, cónica, troncocónica, en semicírculo, en semielipse.
16. Dispositivo de trabajo según la reivindicación 1, en el que los bordes son humectantes con respecto al líquido de interés sobre su parte más alta con respecto a la superficie activa y/o sobre su vertiente con respecto a la zona de trabajo que rodea.
17. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que los bordes se obtienen mediante embutido o moldeo de la superficie activa.
18. Dispositivo de trabajo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los medios de introducción del líquido de interés en la caja que comprende una bomba de inyección del líquido de interés en la caja.
19. Dispositivo de trabajo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los medios de extracción del líquido de interés de la caja comprenden una bomba de extracción del líquido de interés de la caja.
20. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que la bomba de extracción del líquido de interés de la caja es en la forma de una bomba de inyección de un fluido gaseoso en la caja, por una primera abertura formada sobre la caja, de manera que puede inyectarse en la caja un fluido gaseoso expulsando el líquido de interés de la caja por una segunda abertura formada sobre la caja.
21. Dispositivo según la reivindicación 20, en el que la bomba de inyección del fluido gaseoso comprende un dispositivo de saturación del fluido gaseoso inyectado en vapor del líquido de interés.
22. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que la bomba de extracción del líquido de interés de la caja es en forma de una bomba aspirante dispuesta a nivel de una abertura formada sobre la caja de manera que puede extraerse el líquido de interés de la caja aspirándolo por esta abertura.
23. Sistema que comprende un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.
24. Chip biológico que comprende un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.
25. Chip biológico según la reivindicación 24, seleccionándose dicho chip del grupo que consiste en chips de ácido nucleico, chips de anticuerpos, chips de antígenos, chips de proteína y chips de células.
26. Procedimiento de fabricación de un dispositivo según la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
- proporcionar un sustrato
- formar zonas de trabajo sobre dicho sustrato,
- estructurar la superficie del sustrato de manera que se forme un borde alrededor de las zonas de trabajo,
- tratar la superficie sobre la que se han formado las zonas de trabajo y su borde para hacerla sensiblemente no humectante con respecto al líquido de interés,
- proporcionar una caja e introducir el sustrato que comprende las zonas de trabajo rodeadas por su borde, comprendiendo dicha caja medios para introducir el líquido de interés en la caja y medios para extraer el líquido de interés de la caja, y
- cerrar dicha caja.
27. Procedimiento de fabricación según la reivindicación 26, en el que los bordes se forman sobre la superficie activa mediante gravado directo de dicha superficie activa.
28. Procedimiento de fabricación según la reivindicación 26, en el que los bordes se forman sobre la superficie activa mediante deposición de un material sobre dicha superficie activa y después gravado o fotolitografía de dicho material.
29. Procedimiento de fabricación según la reivindicación 28, en el que el material depositado se selecciona del grupo que consiste en una resina, una resina fotosensible, polímeros orgánicos, metales, Si, óxido de Si y nitruro de Si.
30. Procedimiento de fabricación según la reivindicación 28 ó 29, en el que el deposición de un material sobre dicha superficie activa para formar los bordes se realiza mediante un procedimiento seleccionado de un procedimiento mediante recubrimiento, mediante evaporación, mediante pulverización, o mediante deposición electroquímica.
31. Procedimiento de fabricación según la reivindicación 28 ó 29, en el que al ser el material fotosensible, los bordes se realizan mediante fotolitografía.
32. Procedimiento de fabricación según la reivindicación 26 en el que los bordes se obtienen mediante embutido o moldeo de la superficie activa.
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