ES2298227T3 - Agonistas y antagonistas de receptores de lpa y procedimientos de utilizacion. - Google Patents
Agonistas y antagonistas de receptores de lpa y procedimientos de utilizacion. Download PDFInfo
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Abstract
Compuesto según la fórmula (I) (I) donde X1 es (HO)2PO-Z1- o (HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-; X2 y X3 son ambos R1-NR2-A-, cada uno siendo igual o diferente; A es un enlace directo, (CH2)k, siendo k un número entero comprendido entre 0 y 30, o es O; Z1 es -O(CH2)m, siendo m un número entero comprendido entre 1 y 50, o es -O-; Z2 es -O(CH2)n, siendo n un número entero comprendido entre 1 y 50, o es -O-; Q1 y Q2 son, independientemente, H2 o =O; R1 es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, seleccionadas del grupo de los alquilos, los alcóxidos, los ácidos y los alcoholes, un acilo que incluye un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, -C(O)-O-R7; y R2 es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30; R7 es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30; donde cuando X1 es (HO)2PO-O-, X2 es NHCH3,Q1 es H2 y Q2 es =O, entonces X3 no es -NHR2, donde R2 es hidrógeno o un acilo sustituido por metilo o fenilo.
Description
Agonistas y antagonistas de receptores de LPA y
procedimientos de utilización.
La presente invención se refiere a derivados del
ácido lisofosfatídico ("LPA"), que tienen actividad como
agonistas o antagonistas en los receptores del LPA y a diversas
aplicaciones terapéuticas de los mismos incluyendo, entre otros
posibles, el tratamiento del cáncer de próstata y el tratamiento del
cáncer de ovario.
Todas las células no transformadas necesitan
factores de crecimiento para su supervivencia y proliferación.
Además de los factores de crecimiento polipeptídicos, se ha
descubierto una clase emergente de lípidos que tienen propiedades
similares a las de los factores de crecimiento conocida
colectivamente por el nombre de factores de crecimiento
fosfolipídicos (PLGFs). Pese a que tienen propiedades farmacológicas
similares en cuanto a que inducen la proliferación de la mayoría de
las células inactivas (Jalink et al., 1994a; Tokumura, 1995;
y Moolenaar et al., 1997), los PLGFs pueden ser subdivididos,
por su estructura, en dos amplias categorías. En la primera
categoría se engloban los mediadores glicerofosfolipídicos (GPMs),
que presentan un esqueleto de glicerol. GPMs representativos son,
entre otros posibles, el LPA, el ácido fosfatídico (PA), el ácido
fosfatídico cíclico (PA cíclico), el
alquenil-glicerol-fosfato
(alquenil-GP) y la lisofosfatidilserina (LPS). En
la segunda categoría se encuadran los mediadores esfingolipídicos
(SPMs), que presentan un motivo de base esfingoide. SPMs
representativos son, entre otros posibles, la
esfingosina-1-fosfato (SPP), la
dihidroesfingosina-1-fosfato, la
esfingosilfosforilcolina (SPC) y la esfingosina (SPH).
En suero se han detectado el LPA (Tigyi et
al., 1991; Tigyi y Miledi, 1992), el PA (Myher et al.,
1989), el alquenil-GP (Liliom et al., 1998),
el PA cíclico (Kobayashi et al., 1999), la SPP (Yatomi et
al., 1995) y la SPC (Tigyi et al., 2000). Estos
mediadores lipídicos han sido identificados y caracterizados. No
obstante, en el suero y en el plasma aún hay más PLGFs presentes,
que aunque sean desconocidos, muestran propiedades similares a los
de los factores de crecimiento (Tigyi y Miledi, 1992). El LPA, con
una concentración sérica de \approx20 \muM, es el PLGF más
abundante presente en el suero (Tigyi y Miledi, 1992; Jalink et
al., 1993).
En las células eucarióticas, el LPA es un
intermedio clave en las fases iniciales de la biosíntesis de
fosfolípidos, que tiene lugar predominantemente en la membrana del
retículo endoplásmico (Bosch, 1974; Bishop y Bell, 1988). En el
retículo endoplásmico, el LPA se deriva de la acción de la
acil-CoA sobre el
glicerol-3-fosfato, que es acilado
adicionalmente para producir PA. Dado que la tasa de acilación de
LPA a PA es muy alta, se acumula muy poco LPA en el lugar de la
biosíntesis (Bosch, 1974). Como el LPA está limitado al retículo
endoplásmico, lo más probable es que su función como intermedio
metabólico no esté relacionada con su función como molécula
señalizadora.
señalizadora.
El LPA es un constituyente del suero, y su nivel
sérico está en la franja micromolar baja (\muM) (Eicholtz et
al., 1993). Este nivel está dentro de lo que cabría esperar,
porque el LPA es liberado por las plaquetas activadas durante el
proceso de coagulación. A diferencia de lo que ocurre en el suero,
el LPA no es detectable en sangre fresca o plasma (Tigyi y Miledi,
1992; Eicholtz et al., 1993). El LPA presente en el suero
está ligado a la albúmina, y es responsable de la mayoría de la
actividad biológica termoestable, no dializable, del suero completo
(Moolenaar, 1994). Se logró identificar que el componente sérico
activo que es responsable de provocar una corriente de cloruro
hacia el interior del oocito de Xenopus es otro el LPA (18:0)
(Tigyi y Miledi, 1992). La mayor parte del LPA ligado a la albúmina
(18:0) es producido durante el proceso de coagulación, más que por
la acción de la lisofosfolipasa D (LPD) sobre la
lisofosfatidilcolina (liso-PC). Esta última ruta
metabólica es responsable de la presencia de LPA en el plasma
"envejecido" que ha sido descoagulado por la acción de la
heparina o del citrato más dextrosa (Tokumura et al., 1986).
Otro aspecto a tener en cuenta es que el LPA no está presente en el
plasma que ha sido tratado con EDTA. Este hecho implica que la
lisofosfolipasa plasmática puede ser dependiente del Ca^{2+}
(Tokumura et al., 1986).
El papel o función de la albúmina es proteger al
LPA de las acciones de las fosfolipasas presentes en el suero
(Tigyi y Miledi, 1992). Tigyi y Miledi sugirieron que la albúmina no
sólo actúa como portador del LPA en el torrente sanguíneo, sino
que, además, aumenta su semivida fisiológica. Hay mediadores
lipídicos aún no identificados presentes en la seroalbúmina que
imitan las acciones del LPA a la hora de provocar una corriente de
cloruro hacia el interior del oocito de Xenopus.
Los tipos de células que responden al LPA van
desde los mohos deslizantes y el oocito de Xenopus hasta las
células somáticas de los mamíferos. Por lo tanto, parece probable
que la fuente de LPA y la liberación de LPA no estén limitadas
únicamente a las plaquetas activadas. En experimentos recientes se
ha demostrado que los fibroblastos de los mamíferos, cuando son
estimulados con factores de crecimiento peptídicos, producen LPA
rápidamente, y que tras esta producción de LPA, el LPA resultante es
liberado en el medio extracelular (Fukami y Takenawa,
1992).
1992).
Existen indicios de que hay cantidades
relativamente altas de LPA bioactivo de origen celular desconocido
en el líquido ascítico de pacientes aquejados de cáncer de ovario
(Xu et al., 1995a), y se sabe que el líquido ascítico de
tales pacientes tiene una potente actividad mitógena en las células
del carcinoma ovárico (Mills et al., 1988; Mills et
al., 1990). Aún no se ha determinado si este LPA bioactivo es
secretado por las células tumorales al líquido extracelular, o si
es secretado por los leucocitos, o si es producido a partir de
lípidos más complejos mediante las acciones de diversas
fosfolipasas.
Los GPMs y los SPMs provocan una amplia variedad
de respuestas celulares que abarcan todo el árbol filogenético
(Jalink et al., 1993a). El LPA induce incrementos
transitorios del Ca^{2+} (señales de Ca^{2+}) originados en
depósitos intracelulares de varios tipos de células, por ejemplo,
las células neuronales (Jalink et al., 1993; Durieux et
al., 1992), las plaquetas, los fibroblastos tanto normales como
transformados (Jalink et al., 1990), las células epiteliales
(van Corven et al., 1989; Moolenaar, 1991), y los oocitos de
Xenopus (Tigyi y Miledi, 1992; Durieux et al., 1992;
Fernhout et al., 1992). El LPA induce la agregación
plaquetaria (Schumacher et al., 1979; Tokumura et al.,
1981; Gerrard et al., 1979; Simon et al., 1982) y la
contracción de la musculatura lisa (Tokumura et al., 1980;
Tokumura et al., 1994); y tras administración intravenosa,
induce cambios dependientes de especie en la presión sanguínea
(Schumacher et al., 1979; Tokumura et al., 1978).
Cuando se añade LPA a fibroblastos inactivos,
éste estimula la síntesis de ADN y la división celular (van Corven
et al., 1989; van Corven et al., 1992). Los efectos
similares a los del crecimiento que tiene el LPA no requieren de la
presencia de factores de crecimiento peptídicos para manifestarse.
Dada esta observación, se constata que el LPA difiere en este
sentido de la endotelina o de la vasopresina, que sí que requieren
de la presencia de la insulina o del factor de crecimiento
epidérmico (Moolenaar, 1991) para mantener la proliferación
celular. Un hecho a tener en cuenta es que en las células del
mieloma Sp^{2}, el LPA fue responsable de una respuesta
antimitógena que fue mediada por un aumento de los niveles de AMPc
(Tigyi et al., 1994; Fischer et al., 1998). A
diferencia de lo que ocurría con la ruta mitógena, la ruta
antimitógena no se veía afectada por la toxina pertussis (PTX).
Además, al añadir forskolina e isobutil metilxantina, las acciones
antimitógenas del LPA en las células del mieloma Sp^{2} fueron
aditivas (Tigyi et al., 1994). En diversos tipos de células,
el LPA ocasiona cambios en el citoesqueleto, incluida la formación
de adherencias focalizadas y de fibras de tensión en los
fibroblastos (Ridley y Hall, 1992). Asimismo, el LPA promueve la
reducción y supresión de la diferenciación de los neuroblastomas
induciendo la retracción de las neuritas en desarrollo (Jalink
et al., 1994a; Jalink et al., 1994b). La adición de
cantidades nanomolares (nmol) de LPA (Jalink y Moolenaar, 1992) a
células de neuroblastoma N1E-115 privadas de suero
ocasionó una retracción inmediata de las neuritas, acompañada de un
redondeamiento rápido, aunque transitorio, del cuerpo celular
(Jalink et al., 1993b). En presencia continua de LPA, las
células del neuroblastoma mantienen su fenotipo indiferenciado,
pero no sufren mitosis (Jalink et al., 1993b). Fueron
necesarios factores adicionales, tales como los factores de
crecimiento similares a la insulina, para la progresión del ciclo
celular. Una vez que las células se han diferenciado
morfológicamente, la adición de LPA invierte el cambio morfológico.
Por lo tanto, las retracciones de las neuritas inducidas por el LPA
son consecuencia de la contracción del citoesqueleto de actina, más
que de una pérdida de adherencia al sustrato (Jalink et al.,
1993b; Jalink et al.,
1994b).
1994b).
El LPA, a semejanza de otros quimioatrayentes
fisiológicos (por ejemplo, la interleucina 8), induce la migración
celular, mediante un mecanismo haptotáctico, en los monocitos
humanos (Zhou et al., 1995). Además de inducir la migración
celular, el LPA promueve la invasión, por parte de las células de
hepatoma y de carcinoma, de la monocapa de células mesoteliales
(Imamura et al., 1993). El mecanismo causante de esta
invasión sigue sin estar claro, pero la invasión puede deberse a un
aumento de la motilidad celular y de la adherencia celular. Por
último, se sabe que el LPA bloquea la apoptosis de los
cardiomiocitos neonatales (Umansky et al., 1997).
Se observó que un fosfolípido natural único, el
PA cíclico, es responsable de acciones celulares similares u
opuestas a las de otros GPMs, en función del tipo de célula. Cuando
se probó el PA cíclico con el oocito de Xenopus, provocó una
corriente de cloruro (al igual que otros GPMs), pero la respuesta no
era desensibilizada por el LPA (Fischer et al., 1998).
Murakami-Murofushi et al. (1993) demostraron
que el PA cíclico es responsable de acciones antiproliferativas (a
diferencia del LPA, que induce la proliferación).
Los receptores de los PLGF (PLGFRs) pertenecen a
una superfamilia de receptores con siete dominios transmembrana
unidos a proteínas G que regulan la unión a nucleótidos de guanina.
Los GPCRs de siete-TM son una familia de receptores
situados en la superficie celular que median respuestas celulares
interaccionando con la proteína G heterotrimérica. Se ha
identificado una serie de receptores del LPA, incluidos, entre
otros, el EDG-2, el EDG-4, el
EDG-7 y el PSP-24. En la Figura 1
aparece un árbol filogenético que ilustra la relación existente
entre estos receptores del LPA y otros.
En 1996, Hecht et al. emplearon la
técnica de hibridación diferencial para clonar un ADNc que codifica
un receptor serpentino putativo de líneas celulares neocorticales de
ratón (Hecht et al., 1996). El gen fue denominado "gen 1
de la zona ventricular" (Vzg-1). El
Vzg-1 se expresaba en las regiones neurógenas
corticales y codificaba una proteína de 41 kDa de peso molecular
(364 aminoácidos). El Vzg-1 era muy similar a una
secuencia ovina no publicada denominada "gen 2 de diferenciación
endotelial" (EDG-2). El mismo ADNc fue aislado
también como un receptor huérfano en bibliotecas murinas y bovinas,
y se denominó recl.3 (Macrae et al., 1996). Estaba
ampliamente distribuido en los tejidos murinos, y su expresión más
alta tenía lugar en el cerebro y el corazón.
En 1996, Guo et al., empleando un
protocolo basado en la PCR (reacción en cadena de la polimerasa),
aislaron otro receptor putativo del LPA, conocido como
PSP-24 (372 aminoácidos), del oocito de
Xenopus (Guo et al., 1996). Este receptor mostraba
pocas semejanzas con el
Vzg-1/EDG-2/recl.3 (Guo et
al., 1996). Una búsqueda de receptores de los esfingolípidos,
basada en secuencia (realizada empleando la secuencia de ADNc del
receptor del LPA humano EDG-2), condujo a dos GPCRs
estrechamente relacionados entre sí, a saber: el H218 de rata
(EDG-5, 354 aminoácidos) y el EDG-3
(378 aminoácidos) (An et al., 1997a). El análisis mediante
la técnica Northern blot reveló una alta expresión de los ARNm que
codificaban el EDG-3 y el EDG-5 en
el tejido cardiaco.
La reciente identificación del
EDG-2 como receptor funcional del LPA motivó a An
et al. a llevar a cabo una búsqueda basada en secuencia de
un subtipo novedoso de receptor del LPA (An et al., 1998a).
Se descubrió un ADNc humano que codificaba un GPCR; dicho ADNc
humano fue designado como EDG-4 (An et al.,
1998a). El análisis mediante la técnica Northern blot reveló que
aunque tanto EDG-2 como EDG-4 actúan
como receptores de los GPMs, sus distribuciones tisulares eran muy
diferentes. A diferencia del EDG-2, el
EDG-4 se expresaba principalmente en los leucocitos
de sangre periférica, y en los testículos (An et al.,
1998a).
Gracias a la amplificación mediante PCR del ADNc
procedente de células T (linfocitos) Jurkat, se identificó un GPCR
anteriormente desconocido que pertenece a la familia de los EDG. El
GPCR identificado se designó como EDG-7. Tiene una
masa molecular de 40 kDa (353 aminoácidos). El análisis, mediante la
técnica Northern blot, de la expresión del EDG-7 en
tejidos humanos reveló que el EDG-7 se expresa en
corazón, páncreas, próstata y testículos (Bandoh et al.,
1999). Por lo tanto, hay dos familias bien diferenciadas de
receptores de los PLGFs: PSP24 y EDG, con un total de diez PLGFRs
diferentes (Figura 1). La lista de PLGFRs va en aumento.
Estos diversos receptores se pueden clasificar
con arreglo a sus especificidades en cuanto a ligandos: GPMs o SPMs
(como se indica en la siguiente tabla, Tabla 1).
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El PSP24 de Xenopus y el PSP24 expresado
en ratones transducen específicamente las corrientes oscilatorias
de cloruro inducidas por GPM (LPA, Fischer et al., 1998).
Ninguno de ambos PSP24 es estructuralmente homólogo a la familia
EDG (Tigyi y Miledi, 1992; Fernhout et al., 1992). La familia
EDG puede dividirse en dos subgrupos bien diferenciados. En el
primer grupo se encuadran EDG-2,
EDG-4 y EDG-7, que sólo actúan como
receptores para los GPMs (Hecht et al., 1996; An et
al., 1998a; Bandoh et al., 1999; An et al., 1998b)
y transmiten numerosas señales en respuesta a la unión a ligandos.
En el segundo grupo se encuadran EDG-1,
EDG-3, EDG-5, EDG-6
y EDG-8, y este segundo grupo es específico de los
SPMs (An et al., 1997a; Im et al., 2000; van Brocklyn
et al., 1998; Speigel y Milstein, 2000). En la Tabla 2 se
indican las principales expresiones tisulares de los diversos
PLGFRs.
Los PLGFs activan varios procesos de
transducción de señales mediados por las proteínas G. Dichos
procesos son mediados por las familias de proteínas G
heterotriméricas G_{q/11}, G_{l/0} y G_{12/13} (Moolenaar,
1997; Speigel y Milstein, 1995; Gohla et al., 1998).
La ruta de la proteína G_{q/11} es responsable
de la activación de la fosfolipasa C (PLC), que a su vez induce la
producción de inositol trifosfato (IP_{3}), con la consiguiente
movilización de Ca^{2+}, en una amplia variedad de células
(Tokumura, 1995). En algunas células esta respuesta es sensible a la
PTX, lo que implica que participan varias rutas sensibles y no
sensibles a la PTX (Tigyi et al., 1996). Además, esta ruta
es responsable de la activación de la proteína quinasa C (PKC)
mediada por el diacilglicerol (DAG). La PKC activa la fosfolipasa D
(PLD) celular, que es responsable de la hidrólisis de la
fosfatidilcolina; dicha hidrólisis produce colina libre y PA (van
der Bend et al., 1992a). Asimismo, la PLC es capaz de
activar la MAP quinasa, bien directamente, bien a través de la
activación -mediada por el DAG- de la PKC, en algunos tipos de
células (Ghosh et al., 1997).
La ruta de señalización mitógena es mediada a
través de la subunidad G_{l/0} de las proteínas G
heterotriméricas. Los estudios de transfección llevados a cabo
indican que el responsable de la activación de las
Ras-MAP quinasas es el dímero G_{i\beta \gamma},
y no la subunidad \alphai. La activación de Ras se ve precedida
por la transactivación de las tirosina quinasas receptoras (RTK)
tales como los receptores del EGF (factor de crecimiento
epidérmico) (Cunnik et al., 1998) o los receptores del PDGF
(factor de crecimiento derivado de las plaquetas) (Herrlich et
al., 1998). Las RTKs transactivadas activan la Ras, y esto
conduce a la activación de las MAP quinasas (ERK 1,2) mediante la
Raf. La subunidad G_{i\alpha}, que es sensible a la PTX, inhibe
la adenilciclasa (AC), lo que provoca que el dímero \beta\gamma
se acople a una quinasa receptora unida a proteína G (GRK) que
fosforila y desensibiliza el receptor. El receptor fosforilado es
reclutado por la \beta-arrestina, con lo que se
recluta la quinasa src, que a su vez fosforila el receptor de
EGF, generando su conformación activa (Lin et al., 1997; Ahn
et al., 1999; Luttrell et al., 1999). A su vez, las
RTKs transactivadas activan la Ras, lo que conduce a la activación
de las de las MAP quinasas (ERK 1,2) mediante la Raf. La subunidad
G_{i\alpha}, que es sensible a la PTX, inhibe la AC, y esto
conduce a una reducción de los niveles de AMP cíclico (AMPc). Los
efectos celulares opuestos que genera el LPA, a saber, mitogénesis
y antimitogénesis, se ven acompañados por efectos contrarios en el
sistema de segundo mensajero AMPc. La mitogénesis es mediada a
través de la ruta de la G_{i\alpha}, que conduce a una reducción
de los niveles de AMP cíclico (AMPc) (van Corven et al.,
1989; van Corven et al., 1992), mientras que la
antimitogénesis se ve acompañada de un incremento, dependiente del
Ca^{2+} y no sensible a la PTX, de los niveles de AMPc (Tigyi
et al., 1994; Fischer et al., 1998).
En cambio, se sabe muy poco acerca de la vía de
señalización de la G_{12/13}, insensible a la PTX, que conduce a
la reorganización del citoesqueleto de actina. Es posible que en
esta vía se transactiven también las RTKs (Lin et al., 1997;
Ahn et al., 1999; Luttrell et al., 1999; Gohla et
al., 1998), y que converja en una Rho GTPasa pequeña (Moolenar,
1997). Se sabe mucho más acerca de la señalización "downstream"
de Rho, porque se han aislado e identificado diversas proteínas
asociadas. Rho activa las serina/treonina quinasas, que fosforilan,
y como consecuencia inhiben, la fosfatasa de la cadena ligera de la
miosina (MLC-fosfatasa) (Kimura et al.,
1996). Esta vía conduce a la acumulación de la forma fosforilada de
la cadena ligera de la miosina (MLC), lo que a su vez provoca
respuestas citoesqueléticas que conllevan efectos celulares tales
como la retracción de las neuritas (Tigyi y Miledi, 1992; Tigyi
et al., 1996; Dyer et al., 1992; Postma et
al., 1996; Sato et al., 1997), la inducción de fibras de
tensión (Ridley y Hall, 1992; Gonda et al., 1999), la
estimulación de la quimiotaxis (Jalink et al., 1993a), la
migración celular (Zhou et al., 1995; Kimura et al.,
1992) y la invasividad de las células tumorales (Imamura et
al., 1993; Imamura et al., 1996). La invasividad de las
células tumorales, inducida por los PLGF y mediada por Rho, es
bloqueada por la toxina C3 de C. Botulinum, que ribosila de
forma específica la Rho siguiendo un mecanismo dependiente de ADP
(Imamura et al., 1996).
Además, Rho tiene capacidad para estimular la
síntesis de ADN en los fibroblastos inactivos (Machesky y Hall,
1996; Ridley, 1996). La expresión de la GTPasa de la familia Rho
activa el factor de respuesta sérica (SRF), que media la
transcripción temprana de los genes (Hill et al., 1995).
Asimismo, el PLGF (el LPA) induce la invasión por parte de las
células tumorales (Imamura et al., 1996), aunque aún no está
claro si en este mecanismo subyacen cambios citoesqueléticos o
transcripción de genes o ambas cosas.
Dada la implicación del LPA/de los receptores
del LPA en una serie de rutas celulares y actividades celulares,
tales como la proliferación o la migración, así como su implicación
en la cicatrización de heridas y en el cáncer, sería deseable
identificar compuestos nuevos que sean capaces de actuar,
preferiblemente de modo selectivo, como antagonistas o agonistas de
los receptores del LPA que se han indicado anteriormente.
Actualmente se conocen muy pocos inhibidores (ya
sea sintéticos o endógenos) de los receptores del LPA. De entre los
antagonistas notificados hasta la fecha, con los que más se ha
trabajado es con la SPH, la SPP, la
N-palmitoil-l-serina
(Bittman et al., 1996) y la
N-palmitoil-l-tirosina
(Bittman et al., 1996). Se sabe que los compuestos
mencionados inhiben las corrientes de cloruro inducidas por el LPA
en el oocito de Xenopus (Bittman et al., 1996; Zsiros
et al., 1998). Sin embargo, no se han estudiado estos
compuestos en sistemas celulares. Se sabe también que la SPP inhibe
la invasividad de las células tumorales, pero no está claro si esta
inhibición se debe a que la SPP actúa como inhibidor del LPA o a las
acciones de los inhibidores de la propia SPP. La
N-palmitoil-l-serina
y la
N-palmitoil-l-tirosina
también inhibieron la agregación plaquetaria inducida por el LPA
(Sugiura et al., 1994), pero no se ha dilucidado todavía si
actúan a nivel del receptor del LPA. El lisofosfatidilglicerol (LPG)
fue el primer lípido del que se demostró que ejercía un cierto
grado de inhibición de las acciones del LPA (van der Bend et
al., 1992b), pero, en varios tipos de células que respondían al
LPA, el LPG no era detectable (Lilliom et al., 1996). No se
pudo demostrar que ninguno de estos inhibidores actuase
selectivamente a nivel de receptores del LPA concretos.
Se demostró que un compuesto polisulfonado, la
suramina, inhibía la síntesis de ADN inducida por el LPA, de una
manera reversible y proporcional a la dosis. No obstante, se halló
que la suramina no presenta especificidad por el receptor del LPA y
que bloquea las acciones del LPA únicamente a concentraciones
milimolares (mM) muy altas (van Corven et al., 1992).
Se afirma que dos compuestos, a saber, el ácido
2-[4-([3-(2,4-diamino-6-oxo-1,6-dihidro-pirimidin-5-il)-propil]-{[(4-fosfonooxi-butilcarbamoil)-metilsulfanil]-acetil}-amino)-benzoilamino]-pentanodioico,
y el ácido
2-(4-{[3-(2,4-diamino-6-oxo-1,6-dihidro-pirimidin-5-il)-propil]-(8-fosfonooxi-octanil)-amino}-benzoilamino)-pentanodioico,
inhiben el transporte del 3H-metotrexato al
interior de las células de la leucemia de células T
MOLT-4 (Beilstein, Abs XP002239009).
La presente invención tiene como objetivo
superar las deficiencias asociadas con los agonistas del LPA y
antagonistas del LPA conocidos actualmente.
La presente invención se refiere a compuestos
según la fórmula (I) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
donde
- \quad
- X^{1} es (HO)_{2}PO-Z^{1}- o (HO)_{2}PO-Z^{2}-P(OH)O-Z^{1}-;
- \quad
- X^{2} y X^{3} son R^{1}-NR^{2}-A-, cada uno siendo igual o diferente;
- \quad
- A es un enlace directo, (CH_{2})_{k}, siendo k un número entero comprendido entre 0 y 30, o es O;
- \quad
- Z^{1} es -O(CH_{2})_{m}, siendo m un número entero comprendido entre 1 y 50, o es -O-;
- \quad
- Z^{2} es -O(CH_{2})_{n}, siendo n un número entero comprendido entre 1 y 50, o es -O-;
- \quad
- Q^{1} y Q^{2} son, independientemente, H_{2} o =O;
- \quad
- R^{1} es, independientemente, hidrógeno; un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30; un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30; un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, seleccionadas del grupo de los alquilos, los alcóxidos, los ácidos y los alcoholes; un acilo que incluye un anillo aromático; un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30; un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, -C(O)-O-R^{7}; y
- \quad
- R^{2} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30;
- \quad
- R^{7} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30;
- \quad
- y donde cuando X^{1} es (HO)_{2}PO-O-, X^{2} es NHCH_{3}, Q^{1} es H_{2} y Q^{2} es =O, entonces X^{3} no es -NHR_{2}, donde R_{2} es hidrógeno o un acilo sustituido por metilo o fenilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Asimismo, se presentan composiciones
farmacéuticas que incluyen un portador farmacéuticamente aceptable y
un compuesto de la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para modular la actividad del receptor del LPA
in vitro, que incluye proporcionar un compuesto de la
presente invención que tiene actividad como agonista del receptor
del LPA o como antagonista del receptor del LPA, así como poner en
contacto un receptor del LPA in vitro con el compuesto, en
condiciones eficaces para modular la actividad del receptor del
LPA.
Otro aspecto adicional de la presente invención
se refiere al uso, en el tratamiento del cáncer, de un compuesto de
la presente invención, y a la administración de una cantidad eficaz
del compuesto a un paciente, de una manera eficaz para tratar el
cáncer.
Otro aspecto adicional de la presente invención
se refiere al uso, para el aumento de la proliferación celular, de
un compuesto de la presente invención que tiene actividad como
agonista del receptor del LPA, así como poner en contacto un
receptor del LPA en una célula con el compuesto, de una manera
eficaz para aumentar la proliferación, inducida por el receptor del
LPA, de la célula.
Otro aspecto adicional de la presente invención
se refiere a un procedimiento de fabricación de los compuestos
objeto de la presente invención. Una estrategia para la fabricación
de los compuestos objeto de la presente invención consiste en:
hacer reaccionar
(Y^{2}O)_{2}PO-Z^{11}-Z^{13}
o
(Y^{2}O)_{2}PO-Z^{12}-P(OH)O-Z^{11}-Z^{13},
donde
- \quad
- Z^{11} es -O(CH_{2})_{m}, siendo m un número entero comprendido entre 1 y 50, o es -O-;
- \quad
- Z^{12} es -O(CH_{2})_{n}, siendo n un número entero comprendido entre 1 y 50, o es -O-;
- \quad
- Z^{13} es H o un primer grupo saliente, o bien -Z^{11}-Z^{13} juntos forman el primer grupo saliente; e
- \quad
- Y^{2} es H o un grupo protector,
\newpage
con un compuesto intermedio según la fórmula
(VI)
donde
- \quad
- X^{12} y X^{13} son ambos R^{11}-NR^{12}-A-, siendo cada uno iguales o diferentes entre sí;
- \quad
- X^{11} es OH, NH_{2}, SH o un segundo grupo saliente;
- \quad
- A es o bien un enlace directo, o bien (CH_{2})_{k}, siendo k un número entero comprendido entre 0 y 30, o es O;
- \quad
- Q^{11} y Q^{12} son, independientemente, H_{2} o =O;
- \quad
- R^{11} es, independientemente, hidrógeno; un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30; un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30; un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, seleccionadas del grupo de los alquilos, los alcóxidos, los ácidos y los alcoholes; un acilo que incluye un anillo aromático; un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30; un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30; -C(O)-O-R^{16}; y
- \quad
- R^{12} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30;
- \quad
- R^{16} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30;
si es necesario, después se lleva a
cabo una etapa de desprotección, realizándose tanto dicha etapa de
reacción como dicha etapa de desprotección en condiciones que
resultan eficaces para obtener un compuesto según la fórmula (I),
donde X^{1} es (HO)_{2}PO-Z^{1}- o
(HO)_{2}PO-Z^{2}-P(OH)O-Z^{1}-.
Los compuestos de la presente invención que se
han identificado en la presente invención como agonistas o
antagonistas de uno o más receptores del LPA se pueden usar para
inhibir o potenciar, respectivamente, rutas bioquímicas mediadas
por la señalización a través de los receptores del LPA. Dado que
modulan la señalización a través de los receptores del LPA, dichos
antagonistas y agonistas se pueden usar, de manera específica y
sustancial, para tratar el cáncer y mejorar la cicatrización de las
heridas.
La Figura 1 es un árbol filogenético que ilustra
la clasificación y la relación existente entre diez receptores de
los factores de crecimiento fosfolipídicos, incluidos los receptores
del LPA: EDG-2, EDG-4,
EDG-7, y PSP-24
(\alpha,\beta).
La Figura 2 ilustra el esquema de síntesis
empleado para preparar los compuestos de serina amida
35-43.
La Figura 3 ilustra el esquema de síntesis
empleado para preparar los compuestos de fosfato de serina amida
55-59.
La Figura 4 ilustra el esquema de síntesis
empleado para preparar los compuestos difosfato
66-68.
Las Figuras 5A-B ilustran la
síntesis de los compuestos difosfato. La Figura 5A ilustra el
esquema de síntesis empleado para preparar los compuestos
1,2-difosfato 85-92. La Figura 5B
ilustra el esquema de síntesis empleado para preparar los
compuestos 1,3-difosfato.
Las Figuras 6A-B ilustran los
esquemas de síntesis empleados para preparar los compuestos
pirofosfato.
Las Figuras 7A-C ilustran los
esquemas de síntesis empleados para preparar monofosfatos y
monofosfonatos sustituidos a partir de un compuesto intermedio
diéter protegido con tosilato.
La Figura 8 ilustra el esquema de síntesis
empleado para preparar los compuestos fosfato con ácido graso de
cadena lineal 106-110.
La Figura 9 ilustra la síntesis de ésteres de
monoalquilo y ácido tiofosfórico, de cadena lineal.
La Figura 10 ilustra la síntesis de alquiloamido
de cadena lineal-ácido fosfórico.
La Figura 11 ilustra un esquema de síntesis
empleado para preparar compuestos fosfato cíclico de conformación
restringida.
La Figura 12 ilustra un esquema de síntesis
empleado para preparar compuestos fosfato cíclico de conformación
restringida.
La Figura 13 ilustra un esquema de síntesis
empleado para preparar compuestos fosfato cíclico de conformación
restringida.
La Figura 14 ilustra un esquema de síntesis
empleado para preparar compuestos de conformación restringida y con
un grupo fosfato libre.
La Figura 15 ilustra un esquema de síntesis
alternativo empleado para preparar
2-monofosfatos.
La Figura 16 ilustra un esquema de síntesis
alternativo empleado para preparar compuestos
1,3-difosfato.
La Figura 17 ilustra un esquema de síntesis
empleado para preparar compuestos que tienen como X^{3} un grupo
-N(H)-acilo.
La Figura 18 ilustra un esquema de síntesis
empleado para preparar compuestos que tienen como X^{3} un grupo
-N(H)-imidazol.
La Figura 19 ilustra un esquema de síntesis
empleado para preparar compuestos que tienen como X^{3} un grupo
-N(H)-C(O)-O-R^{7}.
La Figura 20 ilustra un esquema de síntesis
empleado para preparar compuestos que tienen como X^{3} un grupo
-N(H)-C(S)-O-R^{7}.
La Figura 21 es un gráfico que ilustra la
inhibición, proporcional a la dosis, de las corrientes de cloruro
inducidas por el LPA en oocitos de Xenopus, mediante
aplicación extracelular de 56 (SAP [fosfato de serina amida],
14:0).
La Figura 22 es un gráfico que ilustra la
inhibición, proporcional a la dosis, de las corrientes de cloruro
inducidas por el LPA en oocitos de Xenopus, mediante
aplicación extracelular de 57 (SAP, 18:0).
Las Figuras 23A-B son gráficos
que ilustran la inhibición, proporcional a la dosis, de las
corrientes de cloruro inducidas por el LPA en oocitos de
Xenopus, mediante aplicación extracelular de 66 (MAGDP,
18:0). La flecha indica el momento de la inyección de 5 \muM de
66, seguida por la aplicación extracelular de LPA.
La Figura 24 es un gráfico que ilustra el efecto
inhibidor, proporcional a la dosis, de 66 (MAGDP, 18:0). Se aplicó
a los oocitos una corriente constante de LPA (5 nM), junto con
cantidades crecientes de 66. Los puntos de datos representan la
amplitud de los picos de las corrientes de cloruro medidas.
La Figura 25 es un gráfico que ilustra la
inhibición, proporcional a la dosis, de las corrientes de cloruro
inducidas por el LPA en oocitos de Xenopus, mediante
aplicación extracelular de 92 (MAGDP, 22:0).
La Figura 26 es un gráfico que ilustra el
efecto, proporcional a la dosis, de 56a (SDAP, 14:0/2:0) sobre los
oocitos de Xenopus.
La Figura 27 es un gráfico de barras que
describe los efectos de 56 (SAP, 14:0), 56a (SDAP, 14:0/2:0) y 66
(MAGDP, 18:0) sobre la migración de las células HEY inducida por el
LPA. La concentración de los compuestos de la prueba fue 1 \muM y
la concentración de LPA fue 0,1 \muM.
Las Figuras 28A-C son gráficos
que ilustran la relación existente con la dosis en los incrementos
del Ca^{2+} en células RH7777 que expresan heterólogamente el
EDG-2 (28A), el EDG-4 (28B) o el
EDG-7 (28C). Cada punto de los datos representa el
promedio de al menos tres mediciones \pm S.D. (desviación
estándar).
Las Figuras 29A-D son gráficos
que ilustran la inhibición, por parte del diacilglicerol pirofosfato
(DGPP) 8:0, de los incrementos del Ca^{2+} provocados por el LPA
en las células RH7777 que expresan el EDG-2 y el
EDG-7, pero no el EDG-4. Se
expusieron células RH7777 que expresaban el EDG-2,
el EDG-4 o el EDG-7 a una mezcla de
LPA 18:1 100 nM y DGPP 8:0 1 \muM. Las células de control fueron
expuestas a LPA 18:1 100 nM. En estos gráficos, se ilustran los
incrementos de Ca^{2+} representativos en células RH7777 estables
que expresan el EDG-2 (Figura 29A), el
EDG-4 (Figura 29B) y el EDG-7
(Figura 29C), o de células RH7777 que expresan de manera
transitoria el EDG-4 (Figura 29D).
Las Figuras 30A-C son gráficos
que ilustran la caracterización farmacológica de la inhibición de la
respuesta al LPA por parte del DGPP 8:0 en células RH7777 que
expresan el EDG-7 ("células
EDG-7"). Dichas células fueron expuestas a una
concentración 250 nM de LPA 18:1 mezclado con concentraciones
crecientes de DGPP 8:0, y se midió el área pico de los incrementos
del Ca^{2+} resultantes (Figura 30A). Además, las células fueron
expuestas a concentraciones crecientes de LPA 18:1 mezclado con una
concentración 500 nM de DGPP 8:0 (Figura 30B). Asimismo, las
"células EDG-7" fueron expuestas a una
concentración 250 nM de LPA 18:1 mezclado con una concentración 500
nM del lípido indicado (Figura 30C). Las áreas pico de los
incrementos del Ca^{2+} se representan como los valores promedio,
con un mínimo de tres mediciones \pm S.D. (desviación
estándar).
Las Figuras 31A-C son gráficos
que ilustran la caracterización farmacológica de la inhibición de la
respuesta al LPA por parte del DGPP 8:0 en células RH7777 que
expresan el EDG-2 ("células
EDG-2"). Se expusieron "células
EDG-2" estables a una concentración 250 nM de LPA
18:1 mezclado con concentraciones crecientes de DGPP 8:0, y se
midió el área pico de los incrementos del Ca^{2+} resultantes
(Figura 31A). Además, se expusieron "células
EDG-2" a concentraciones crecientes de LPA 18:1
mezclado con una concentración 10 \muM de DGPP 8:0 (Figura 31B).
Asimismo, se expusieron "células EDG-2" a una
concentración 250 nM de LPA 18:1 mezclado con una concentración 10
\muM del lípido indicado (Figura 31C). Las respuestas (los
incrementos) se representan como los valores promedio de un mínimo
de tres mediciones \pm S.D. (desviación estándar).
Las Figuras 32A-B son gráficos
que ilustran la relación estructura-actividad en
relación con el DGPP en células RH7777 que expresan el
EDG-4 ("células EDG-4"). Se
expusieron "células EDG-4" estables a una
concentración 500 nM de LPA 18:1 mezclado con una concentración 5
\muM de los lípidos indicados (Figura 32A). Se expusieron células
RH7777 que expresaban transitoriamente el EDG-4 a
una concentración 100 nM de LPA 18:1 mezclado con una concentración
1 \muM de los lípidos indicados (Figura 32B). Se midieron las
áreas pico de los incrementos del Ca^{2+}, que se representan
como los valores promedio de un mínimo de tres mediciones \pm S.D.
(desviación estándar).
Las Figuras 33A-C son gráficos
que ilustran la caracterización farmacológica del DGPP 8:0 en
relación con las corrientes de cloruro provocadas por el LPA en
oocitos de Xenopus. Se expusieron dichos oocitos a una
concentración 5 nM de LPA 18:1 mezclado con concentraciones
crecientes de DGPP 8:0, y se midieron las amplitudes pico de las
corrientes de cloruro oscilatorias resultantes (Figura 33A). Se
expusieron oocitos a concentraciones crecientes de LPA 18:1
mezclado con una concentración 200 nM de DGPP (Figura 33B). Los
puntos de datos representan los valores promedio de un mínimo de
tres mediciones \pm S.D. (desviación estándar). Se trataron
oocitos con LPA 18:1 5 nM, o con una mezcla de LPA 18:1 5 nM y DGPP
8:0 1 \muM, de la manera indicada (Figura 33C). La flecha indica
la inyección intracelular de DGPP 8:0 1 \muM.
Las Figuras 34A-D son gráficos
que ilustran cómo el DGPP 8:0 inhibe los incrementos del Ca^{2+}
provocados por el LPA en fibroblastos NIH3T3 y en células de cáncer
ovárico HEY. La Figura 34A refleja la detección mediante
TI-PCR (TI = transcriptasa inversa; PCR = reacción
en cadena de la polimerasa) de transcritos para los receptores EDG
y PSP24 en las células NIH3T3. Las células NIH3T3 fueron expuestas a
una concentración 100 nM de LPA 18:1, o S1P, mezclado con una
concentración 10 \muM de DGPP 8:0 (Figura 34B). La Figura 34C
refleja la detección mediante TI-PCR de la
presencia de transcritos para los receptores EDG y PSP24 en las
células HEY. Las células HEY fueron expuestas a una concentración
100 nM de LPA 18:1, o S1P, mezclado con una concentración 1 \muM
de DGPP 8:0 (Figura 34D). Se midieron las áreas pico de los
incrementos del Ca^{2+} resultantes, que se representan como
promedio de un mínimo de tres mediciones \pm S.D. (desviación
estándar).
La Figura 35 es un gráfico que ilustra la
inhibición, por parte del DGPP 8:0, de la proliferación de las
células NIH3T3 promovida por el LPA. Se privó de suero a las
células NIH3T3 durante 6 horas, y se las expuso a una concentración
5 \muM de LPA 18:1 mezclado con una concentración 10 \muM de los
lípidos indicados. Las células de control recibieron, en vez de LPA
18:1, un disolvente (seroalbúmina bovina [BSA]). Se incubaron las
células con los lípidos durante 24 horas y se contaron las células.
Los datos son representativos de tres experimentos.
La Figura 36 es un gráfico que ilustra la
caracterización farmacológica de la inhibición de la respuesta al
LPA por parte de los compuestos fosfato con ácido graso de cadena
lineal 106-110 en oocitos de Xenopus.
La Figura 37 es un gráfico que ilustra la
caracterización farmacológica de la inhibición de la respuesta al
LPA por parte del compuesto fosfato con ácido graso de cadena lineal
108 en oocitos de Xenopus.
La Figura 38 es un gráfico que ilustra la
caracterización farmacológica de la respuesta, inducida por
antagonistas o agonistas, que se daba en células RH7777 que
expresaban el receptor EDG-2, EDG-4
o EDG-7 tras la exposición de dichas células al
compuesto fosfato con ácido graso de cadena lineal 108. Se midieron
las áreas pico de los incrementos del Ca^{2+}.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un compuesto según la fórmula (I)
donde
- \quad
- X^{1} es (HO)_{2}PO-Z^{1}- o (HO)_{2}PO-Z^{2}-P(OH)O-Z^{1}-;
- \quad
- X^{2} y X^{3} son R^{1}-NR^{2}-A-, cada uno siendo igual o diferente;
- \quad
- A es un enlace directo, (CH_{2})_{k}, siendo k un número entero comprendido entre 0 y 30, o es O;
- \quad
- Z^{1} es -O(CH_{2})_{m}-, siendo m un número entero comprendido entre 1 y 50, o es -O-;
- \quad
- Z^{2} es -O(CH_{2})_{n}-, siendo n un número entero comprendido entre 1 y 50, o es -O-;
- \quad
- Q^{1} y Q^{2} son, independientemente, H_{2} o =O;
- \quad
- R^{1} es, independientemente, hidrógeno; un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30; un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30; un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, seleccionadas del grupo de los alquilos, los alcóxidos, los ácidos y los alcoholes; un acilo que incluye un anillo aromático; un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30; un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30; -C(O)-O-R^{7}; y
- \quad
- R^{2} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30;
- \quad
- R^{7} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30;
- \quad
- y donde cuando X^{1} es (HO)_{2}PO-O-, X^{2} es NHCH_{3}, Q^{1} es H_{2} y Q^{2} es =O, entonces X^{3} no es -NHR_{2}, donde R_{2} es hidrógeno o un acilo sustituido por metilo o fenilo.
Para cada uno de los grupos R indicados
anteriormente (por ejemplo, R^{1}, R^{2}, R^{7}), se pretende
que los alquilos de cadena lineal tengan la fórmula
(CH_{2})_{x}(CH_{3}), donde x es un
número entero comprendido entre 0 y 29; los alquilos de cadena
ramificada tengan la fórmula definida para los alquilos de cadena
lineal, a excepción de que uno o más grupos CH_{2} estén
reemplazados por grupos CHW, donde W es la cadena lateral de un
alquilo; los alquenilos de cadena lineal tengan la fórmula
(CH_{2})_{xa}CH=CH(CH_{2})_{xb}CH_{3},
donde xa y xb son, cada uno, un número entero
comprendido entre 0 y 27 y (xa + xb) no es superior a
27; y los alquenilos de cadena ramificada tengan la fórmula definida
anteriormente para los alquenilos de cadena lineal, a excepción de
que uno o más grupos CH_{2} estén reemplazados por grupos CHW o de
que un grupo CH esté reemplazado por un grupo CW, donde W es la
cadena lateral de un alquilo.
Los anillos aromáticos pueden ser, entre otros,
fenilos, indenos, naftalenos y bifenilos. El anillo aromático puede
incluir monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del
anillo, situadas en las posiciones orto, meta o
para de los anillos, respecto de la posición en que el anillo
se une al grupo NR_{2} de la cadena
R^{1}-NR^{2}-A-. Las
sustituciones de los anillos pueden ser, entre otras: alquilo,
alcoxi, ácidos, alcoholes.
Los grupos acilo pueden incluir un alquilo, un
alquenilo o anillos aromáticos como los descritos anteriormente.
Los grupos arilalquilo y ariloxialquilo pueden
incluir, entre otros, grupos alquilo de cadena lineal o ramificada
de C1 a C30 como los descritos anteriormente, y el grupo alquilo se
une al grupo NR_{2} de la cadena
R^{1}-NR^{2}-A-.
Se excluyen específicamente de la definición
indicada del compuesto según la fórmula (I) los siguientes
compuestos endógenos o sintéticos que ya eran conocidos: ácido
lisofosfatídico, ácido fosfatídico, ácido ciclofosfatídico,
alquenil glicerolfosfato, dioctil-glicerol
pirofosfato, y
N-palmitoil-L-serina.
Los compuestos de ejemplo según la fórmula (I)
son los compuestos subclase según la fórmula (III) siguientes.
En las estructuras de la fórmula (III), Q^{1}
es H_{2}; Q^{2} es =O, X^{1} es
(HO)_{2}PO-Z^{1}-, Z^{1} es O; X^{2}
y X^{3} son R^{1}-NR^{2}-A-, A
es un enlace directo y NR^{2} es -NH-. Cada R^{1} se define
independientemente tal como se ha indicado anteriormente para la
fórmula (I). Las especies preferidas dentro del ámbito de la
fórmula III son aquellas en las que X^{3} es -NH_{2} y X^{2}
es -NHR^{1}, donde R^{1} es un alquilo de C14 a C18, y más
preferiblemente un alquilo C14 o un alquilo C18; o en las que
X^{3} es -NHR^{1}, donde R^{1} es un grupo acetilo y X^{2}
es -NHR^{1}, donde R^{1} es un alquilo C14.
Los compuestos según la fórmula (I), así como
los compuestos subgénero según la fórmula (III), se pueden preparar
empleando los esquemas de síntesis que se describen a
continuación.
Para sintetizar las series de la serina amida
(SA) y del fosfato de serina amida (SAP) (fórmula (III)), primero
se sintetizó el precursor \beta-lactona (25)
protegida con t-Boc (ter-butoxicarbonilo). Partiendo
de una t-Boc-L-serina (Figura
2, 24) disponible en el mercado, se introdujeron trifenil fosfina
(PPh_{3}) y dietilazidodicarboxilato (DEAD) en condiciones de
Mitsunobo, obteniéndose el compuesto 25 aproximadamente al 50% (Sun
et al., 1996). Los intentos que se llevaron a cabo, empleando
el procedimiento desarrollado por Sun et al., para abrir la
altamente lábil \beta-lactona 25 con diversas
aminas primarias a fin de obtener hidroxiamidas, fracasaron a pesar
de usar diversos reactivos (trietilamina, etc.)). A continuación,
en lugar del procedimiento de Sun et al., se hizo refluir las
aminas primarias con la \beta-lactona en
tetrahidrofurano (THF), y de este modo se obtuvieron las
hidroxiamidas 26-34, protegidas con t-Boc.
Se purificaron los compuestos 26-34 mediante
cromatografía en columna flash. Mediante la retirada del grupo
protector t-Boc, mediada por ácido trifluoroacético (TFA), se
obtuvieron los compuestos 35-43 en forma de sales
de TFA.
Para sintetizar los compuestos
55-59, se fosforilaron las hidroxiamidas
26-30 protegidas por t-Boc. Tras estudiar
detenidamente el compuesto final, se pensó que dicho compuesto final
presentaría una región altamente hidrófoba y una región altamente
hidrófila. Dichas regiones podrían ocasionar problemas durante el
proceso de extracción o fijarse a la columna durante la fase de
purificación. Para evitar estos posibles problemas, se empleó un
procedimiento basado en el fosforamidato. La hipótesis era que,
empleando este procedimiento basado en el fosforamidato, se podrían
proteger los grupos hidroxil-fosfato, con lo que la
molécula se volvería completamente hidrófoba y ello facilitaría su
purificación.
Esencialmente, se empleó una combinación de
procedimientos con el fin de obtener los productos deseados
(55-59) (Lynch et al., 1997; Bittman et
al., 1996; Liu et al., 1999). Las hidroxiaminas de
partida (26-30) fueron lavadas repetidamente con
una piridina anhidra, y luego fueron secadas en condiciones de alto
vacío durante más de 48 horas. Se mantuvo a las hidroxiaminas
lavadas con piridina en una atmósfera compuesta de argón. Después,
se añadió 1H-tetrazol y una mezcla 1:1 de
THF/CH_{2}Cl_{2} recién destilados. Se añadió asimismo el
compuesto fosforilador dibencildiisopropil fosforamidato. Tras
monitorizar la reacción mediante cromatografía en capa fina (TLC),
se oxidó el fosfonato a fosfato in situ empleando ácido
peracético. La mezcla de reacción fue purificada mediante
cromatografía en columna, obteniendo los compuestos
50-54 en forma de fosfatos protegidos por bencilo.
La retirada de los grupos protectores bencilo se llevó a cabo en
etanol, sometiendo los compuestos 50-54 a una
reducción catalítica empleando paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) en una atmósfera de H_{2} a 60 psi (4,13 bares), obteniendo
como resultado los compuestos 55-59 (Figura 3).
Haciendo reaccionar el compuesto 56 con anhídrido acético se obtuvo
el compuesto 56a (Figura 3).
Una vez determinada la técnica de fosforilación
adecuada para la síntesis de la serie de la SAP (compuestos
55-59), se empleó un procedimiento similar para la
síntesis de los biofosfatos (Figuras 4 y 5A-B). Se
lavaron los dioles 60-62 (disponibles en el
mercado) con piridina anhidra, y luego se los secó durante 48 horas
en condiciones de alto vacío. Estos dioles secados
(60-62) fueron disueltos en una mezcla 1:1 de
THF/CH_{2}Cl_{2} recién destilados, y luego se añadió
1H-tetrazol. A esta mezcla, agitada, se le añadió
dibencildiisopropil fosforamidato. La mezcla de reacción fue
monitorizada mediante cromatografía en capa fina, y en el momento
adecuado se oxidó el fosfonato a fosfato in situ empleando
ácido peracético. La mezcla de reacción fue purificada mediante
cromatografía en columna, obteniendo los compuestos
63-65 en forma de difosfatos protegidos por
bencilo. La retirada de los grupos protectores bencilo se llevó a
cabo en etanol, sometiendo los compuestos 63-65 a
una reducción catalítica empleando paladio al 10% sobre carbón
activado (Pd/C) en una atmósfera de H_{2} a 60 psi (4,13 bares),
obteniendo como resultado los compuestos 66-68 en
forma de difosfatos. Se empleó un procedimiento similar al descrito
para la síntesis de los compuestos 66-68 con el fin
de obtener los compuestos 85-92.
Aunque los compuestos 85-92 son
1,2-difosfatos, la Figura 5B ilustra la síntesis de
1,3-difosfatos. Como material de partida se empleó
2-fenoxi-1,3-propano-diol
disponible en el mercado. Primero se protegió el compuesto de
partida con t-BuOK en presencia de yoduro de metilo, y
después se realizó una hidrogenación catalítica para obtener un
compuesto intermedio que posteriormente se hizo reaccionar con un
haluro (RX, donde R es lo definido anteriormente para R^{1}).
Posteriormente, el compuesto intermedio recuperado fue tratado con
AlCl_{3} en presencia de etil-SH, obteniendo un
1,3-diol que presenta el grupo RO unido al C2 del
esqueleto. El 1,3-diol recuperado fue disuelto en
una mezcla 1:1 de THF/CH_{2}Cl_{2} recién destilados, y luego se
añadió 1H-tetrazol. A esta mezcla, agitada, se le
añadió dibencildiisopropil fosforamidato. La mezcla de reacción fue
monitorizada mediante cromatografía en capa fina, y en el momento
adecuado se oxidó el fosfonato a fosfato in situ empleando
ácido peracético. La mezcla de reacción fue purificada mediante
cromatografía en columna, obteniendo compuestos difosfato
protegidos por bencilo. La retirada de los grupos protectores
bencilo se llevó a cabo en etanol, sometiendo los compuestos a una
reducción catalítica empleando paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) en una atmósfera de H_{2} a 60 psi (4,13 bares), obteniendo
como resultado los compuestos 1,3-difosfato.
Para sintetizar los pirofosfatos, como material
de partida se empleó tosilato glucídico ((2R)(-) o (2R)(+))
(Figuras 6A-B). La apertura del anillo fue
catalizada por un ácido de Lewis, por ejemplo, BF_{3}, en
presencia de un alcohol, obteniéndose un compuesto intermedio
protegido por tosilato en la posición C1. En el paso siguiente, el
alcohol de la posición C2 fue reemplazado por un grupo R (por
ejemplo, R^{1} tal como se ha descrito anteriormente) empleando
un exceso de R-triflato y
2,6-di-ter-butil-4-metilpiridina,
obteniéndose el compuesto intermedio diéter. Tratando el compuesto
intermedio diéter con
tris(tetra-n-butilamonio)
hidrógeno pirofosfato se provocó un ataque nucleofílico al
tosilato, de manera que el tosilato fue reemplazado por su
sustituyente pirofosfato en la posición C1.
Para producir un pirofosfato, el compuesto
intermedio protegido por tosilato fue tratado con alcohol bencílico
en presencia de anhídrido tríflico y de
2,6-di-ter-butil-4-metilpiridina,
que bencila el compuesto intermedio en la posición C2. Primero se
retiró el grupo protector tosilato del compuesto intermedio
bencilato mediante la acción de superóxido potásico en presencia de
18-corona-6, obteniéndose un grupo
hidroxilo en la posición C1 que fue reemplazado por un grupo R (por
ejemplo, R^{1} tal como se ha descrito anteriormente) empleando
un exceso de R-triflato y
2,6-di-ter-butil-4-metilpiridina.
El compuesto intermedio diéter resultante seguía presentando el
grupo protector bencilo en la posición C2. El grupo protector
bencilo fue retirado mediante hidrogenación y el grupo hidroxilo
resultante fue tosilado por acción de la piridina y del cloruro de
p-toluensulfonilo, obteniéndose un diéter que presentaba un
grupo tosilo en la posición C2. El grupo tosilo fue retirado por
ataque nucleofílico mediante tratamiento con
tris(tetra-n-butilamonio)
hidrógeno pirofosfato, de manera que el tosilato fue reemplazado
por un sustituyente pirofosfato en la posición C2.
Las Figuras 15 y 16 ilustran esquemas
alternativos para la preparación de fosfatos y difosfatos (así como
pirofosfatos, fosfonatos, etc.).
En la Figura 15, como material de partida se
empleó bromuro glucídico, junto con un alcohol (ROH). Las
condiciones de reacción incluyeron un tratamiento con
K_{2}CO_{3}, seguido de un tratamiento con la sal amónica de
C_{6}H_{6}CH_{2}N^{+}(C_{2}H_{5})_{3}Cl^{-},
que provocaron el desplazamiento del bromuro por parte del grupo R.
Después, se abrió el anillo del compuesto intermedio glucídico tras
un tratamiento con HCl 1M en éter y un alcohol (R^{1}OH),
obteniéndose un compuesto intermedio diéter que presentaba un grupo
hidroxi en la posición C2. Se mezcló el diéter con
1H-tetrazol, y a la mezcla, agitada, se le añadió
dibencildiisopropil fosforamidato. La mezcla de reacción fue
monitorizada mediante cromatografía en capa fina, y en el momento
adecuado se oxidó el fosfonato a fosfato in situ empleando
ácido peracético. La mezcla de reacción fue purificada mediante
cromatografía en columna, obteniendo fosfatos protegidos por
bencilo. La retirada de los grupos protectores bencilo se llevó a
cabo en etanol, sometiendo los fosfatos protegidos por bencilo a
una reducción catalítica empleando paladio al 10% sobre carbón
activado (Pd/C) en una atmósfera de H_{2} a 60 psi (4,13 bares),
obteniendo como resultado compuestos monofosfato.
En la Figura 16 se empleó un esquema de reacción
similar, salvo que en vez de hacer reaccionar el bromuro glucídico
con un alcohol (ROH), se empleó BnOH para proteger la posición C3.
Las condiciones de reacción incluyeron un tratamiento con
K_{2}CO_{3}, seguido de un tratamiento con la sal amónica de
C_{6}H_{6}CH_{2}N^{+}(C_{2}H_{5})_{3}Cl^{-},
que provocaron el desplazamiento del bromuro por parte del grupo
Bn. A continuación se abrió el anillo del compuesto intermedio
glucídico tras un tratamiento con HCl 1M en éter y BnOH anhidro, que
protegía la posición C1. El compuesto intermedio diéter resultante
presentaba un grupo hidroxi en la posición C2. El diéter fue
mezclado con una sal de haluro (RX) en solución acuosa de
K_{2}CO_{3}, obteniéndose un compuesto intermedio que
presentaba un grupo R unido por un enlace éter en la posición C2. Se
desprotegió este compuesto intermedio mediante reducción catalítica
empleando paladio al 10% sobre carbón activado (Pd/C) en una
atmósfera de H_{2} a 60 psi (4,13 bares), obteniendo como
resultado un 1,3-diol. El 1,3-diol
fue combinado con 1H-tetrazol, y a esta mezcla,
agitada, se le añadió dibencildiisopropil fosforamidato. La mezcla
de reacción fue monitorizada mediante cromatografía en capa fina, y
en el momento adecuado se oxidó el fosfonato a fosfato in
situ empleando ácido peracético. La mezcla de reacción fue
purificada mediante cromatografía en columna, obteniendo compuestos
difosfato protegidos por bencilo. La retirada de los grupos
protectores bencilo se llevó a cabo en etanol, sometiendo los
fosfatos protegidos por bencilo a una reducción catalítica empleando
paladio al 10% sobre carbón activado (Pd/C) en una atmósfera de
H_{2} a 60 psi (4,13 bares), obteniendo como resultado
1,3-difosfatos.
Empleando el compuesto intermedio diéter
preparado como se ilustra en la Figura 6A (por ejemplo, presentando
dicho compuesto intermedio diéter los sustituyentes R y R^{1}), es
posible unir una serie de fosfatos y fosfonatos modificados a la
posición C1 tras retirar el grupo tosilo. Como se ilustra en la
Figura 7A, se hace reaccionar el compuesto intermedio, en
condiciones de basicidad (pH básico), con
X^{4}-Z^{1}-PO(O-grupo
protector)_{2}, donde Z^{1} es -(R^{3})CH- y
X^{4} es H. Las condiciones de basicidad eliminan el grupo
protector tosilato y permiten que el fosfato modificado
-Z^{1}-PO(O-grupo
protector)_{2} forme un enlace único con la posición C1.
Los grupos protectores son retirados tras un tratamiento con TMSBr,
obteniéndose un grupo
-(R^{3})CH-PO(OH)_{2} en la
posición C1. Como se ilustra en la Figura 7B, se hace reaccionar el
compuesto intermedio, en condiciones de basicidad, empleando
tris(tetra-n-butilamonio),
con
X^{4}-Z^{1}-PO(OH)-Z^{2}-PO(OH)_{2},
donde Z^{1} es -O-, Z^{2} es CH_{2}, y X^{4} es H. Las
condiciones de basicidad eliminan el grupo protector tosilato y
permiten que el fosfonato modificado
-Z^{1}-PO(OH)-Z^{2}-PO(OH)_{2}
forme un enlace único con la posición C1. Tras tratamiento con
condiciones acídicas y CH_{3}CN, en posición C1 se instala el
grupo
-O-PO(OH)-CH_{2}-PO(OH)_{2}.
Como se ilustra en la Figura 7C, se hace reaccionar el compuesto
intermedio, en condiciones de basicidad, con
X^{4}-Z^{1}-PO(O-grupo
protector)_{2}, donde Z^{1} es -OCH_{2}CH_{2}- y
X^{4} es H. Las condiciones de basicidad eliminan el grupo
protector tosilato y permiten que el fosfato modificado
-Z^{1}-PO(O-grupo
protector)_{2} forme un enlace único con la posición C1.
Los grupos protectores son retirados tras un tratamiento con TMSBr
en colidina y un lavado con agua, obteniéndose un grupo
-OCH_{2}CH_{2}-PO(OH_{2}) en la
posición C1.
Para preparar el compuesto fosfato cíclico de
conformación restringida de la fórmula (III), como materiales de
partida se emplearon los compuestos 26-30 en el
esquema de síntesis que se ilustra en la Figura 11. Se hizo
reaccionar los compuestos 26-30 con
1H-tetrazol, y el producto resultante se trató con
di-ter-butil diisopropilfosforamidato, lo que causó una
ciclación intramolecular. La oxidación in situ del fosfonato
con ácido peracético produjo un compuesto intermedio fosfato
cíclico. La reducción con TFA produjo los compuestos de la fórmula
(III).
También es posible preparar otros compuestos de
conformación restringida.
Como se ilustra en la Figura 12, se muestra un
esquema alternativo para la preparación de fosfato cíclicos, en el
que X^{1} y X^{2} juntos son
-O-PO(OH)-O. Se hace
reaccionar un compuesto intermedio 1,3-diol,
protegido por bencilo, con POCl_{3}, y esto produce una ciclación
intramolecular. Mediante tratamiento con paladio al 10% sobre
carbón activado (Pd/C) en una atmósfera de H_{2} (como se ha
descrito anteriormente) se obtiene un fosfato cíclico que presenta
un grupo hidroxilo unido al carbono C2. Después, el compuesto
intermedio cíclico se trata con un exceso de
R-triflato y
2,6-di-ter-butil-4-metilpiridina,
obteniéndose el compuesto definitivo.
Como se ilustra en la Figura 13, se muestra un
esquema para la preparación de un fosfato cíclico, en el que
X^{1} y X^{2} juntos son
-O-PO(OH)-NH-. Empleando como
material de partida los compuestos intermedios
35-43 preparados anteriormente, éstos son tratados
con tris(1,2,4-triazol)fosfato, y
luego con un lavado de HCl al 2%, lo que produce una ciclación
intramolecular.
Como se ilustra en la Figura 14, se muestra un
esquema para la preparación de un compuesto cíclico en el que el
grupo fosfato no forma parte del anillo; concretamente, X^{2} y
X^{3} juntos son
-N(H)-C(O)-N(R^{1})-.
Empleando como material de partida los compuestos intermedios
50-54 preparados anteriormente, éstos son tratados
con COCl_{2}, que inserta un carbonilo entre las aminas unidas a
los carbonos C2 y C3 durante la ciclación. Los grupos protectores
bencilo son retirados del fosfato empleando paladio al 10% sobre
carbón activado (Pd/C) en una atmósfera de H_{2} (de la manera
descrita anteriormente).
Otra clase de compuestos que pueden emplearse
como agonistas o antagonistas de los receptores del LPA son
compuestos fosfato con ácido graso o compuestos fosfatados de cadena
lineal. Como se ilustra en la Figura 8, el
n-alcanol anhidro y el 1H-tetrazol
pueden ser disueltos en cloruro de metileno anhidro. Se puede añadir
una solución de
dibencil-N,N-diisopropil
fosforamidito en cloruro de metileno anhidro. Después se puede
añadir ácido peracético en cloruro de metileno anhidro, gota a
gota, para obtener los compuestos fosfato con ácido graso,
protegidos por bencilo, 101-105. Los grupos
protectores bencilo son retirados tras tratamiento en metanol
anhidro con paladio al 10% sobre carbón activado (Pd/C) en una
atmósfera de H_{2} (de la manera descrita anteriormente),
obteniéndose los compuestos fosfato con ácido graso
106-110.
Como alternativa para preparar compuestos
fosfato con ácido graso, se pueden preparar también tiofosfatos y
amidofosfatos. Por ejemplo, como se ilustra en la Figura 9, se
pueden disolver n-mercaptoalcanos y
1H-tetrazol en cloruro de metileno anhidro. Se
puede añadir una solución de
dibencil-N,N-diisopropil
fosforamidito en cloruro de metileno anhidro. Después se puede
añadir ácido peracético en cloruro de metileno anhidro, gota a
gota, para obtener compuestos tiofosfato con ácido graso, protegidos
por bencilo. Los grupos protectores bencilo son retirados tras
tratamiento en metanol anhidro con paladio al 10% sobre carbón
activado (Pd/C) en una atmósfera de H_{2} (de la manera descrita
anteriormente), obteniéndose los compuestos tiofosfato con ácido
graso. Por ejemplo, como se ilustra en la Figura 10, se pueden
disolver una n-alquilamina y
1H-tetrazol en cloruro de metileno anhidro. Se
puede añadir una solución de
dibencil-N,N-diisopropil
fosforamidito en cloruro de metileno anhidro. Después se puede
añadir ácido peracético en cloruro de metileno anhidro, gota a
gota, para obtener compuestos amidofosfato con ácido graso,
protegidos por bencilo. Los grupos protectores bencilo se eliminan
tras tratamiento en metanol anhidro con paladio al 10% sobre carbón
activado (Pd/C) en una atmósfera de H_{2} (de la manera descrita
anteriormente), obteniéndose los compuestos tiofosfato con ácido
graso.
Cada uno de los esquemas de reacción
identificados anteriormente se pueden modificar adicionalmente
atacando un grupo amina primaria, como se ilustra en las Figuras
17-20. El compuesto intermedio se prepara, por
ejemplo, a partir de los compuestos 50-54 que se
trataron con TFA para eliminar el grupo protector t-Boc,
obteniéndose la amina primaria en la posición C2 a la vez que se
deja protegido el fosfato.
En la Figura 17, el compuesto intermedio (que
presenta una amina primaria en la posición C2) se ataca con un
haluro de ácido (por ejemplo, R^{1}COCl), que convierte la amina
primaria en una amida
(-N(H)-C(O)-R^{1}).
Después, el fosfato protegido por bencilo puede desprotegerse
mediante tratamiento con paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) en una atmósfera de H_{2} (de la manera descrita
anteriormente).
En la Figura 18, el compuesto intermedio (que
presenta una amina primaria en la posición C2) se ataca con
N-acetil imidazolina en POCl_{3}, y esto convierte
la amina primaria en una amina secundaria
(-N(H)-imidazol). También se pueden emplear
imidazolinas sustituidas. Después, el fosfato protegido por bencilo
puede desprotegerse mediante tratamiento con paladio al 10% sobre
carbón activado (Pd/C) en una atmósfera de H_{2} (de la manera
descrita anteriormente).
En la Figura 19, el compuesto intermedio (que
presenta una amina primaria en la posición C2) se ataca con
R^{1}CO(O)Cl, que convierte la amina primaria en un
carbamato
(-N(H)-C(O)-O-R^{1}).
Después, el fosfato protegido por bencilo puede desprotegerse
mediante tratamiento con paladio al 10% sobre carbón activado (Pd/C)
en una atmósfera de H_{2} (de la manera descrita
anteriormente).
En la Figura 20, el compuesto intermedio (que
presenta una amina primaria en la posición C2) se ataca con
R^{1}NCO o R^{1}NCS, y esto convierte la amina primaria en una
uramida
(-N(H)-C(O)-N(H)-R^{1})
o en una tiouramida
(-N(H)-C(S)-N(H)-R^{1}).
Después, el fosfato protegido por bencilo puede desprotegerse
mediante tratamiento con paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) en una atmósfera de H_{2} (de la manera descrita
anteriormente).
Así, los compuestos no cíclicos de la presente
invención se pueden preparar haciendo reaccionar
(Y^{2}O)_{2}PO-Z^{11}-Z^{13}
o
(Y^{2}O)_{2}PO-Z^{12}-P(OH)O-Z^{11}-Z^{13}
[donde Z^{11} es -O(CH_{2})_{m}- siendo m un
número entero comprendido entre 1 y 50, o es -O-; Z^{12} es
-O(CH_{2})_{n}- siendo n un número entero
comprendido entre 1 y 50, o es -O-; Z^{13} es H o es un primer
grupo saliente o -Z^{12} -Z^{13} juntos forman el primer grupo
saliente, e Y^{2} es H o un grupo protector; con un compuesto
intermedio conforme con la fórmula (VI), y después, si es
necesario, llevando a cabo una etapa de desprotección. Ambas etapas
(reacción y desprotección) se llevan a cabo en condiciones eficaces
para la obtención de un compuesto según la fórmula (I), en el que
X^{1} es (HO)_{2}PO-Z^{1}- o
(HO)_{2}PO-Z^{2}-P(OH)O-Z^{1}-,
donde Z^{1} y Z^{2} son lo que se ha definido
anteriormente.
El compuesto intermedio de la fórmula (VI) tiene
la siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
donde
- \quad
- X^{12} y X^{13} son ambos R^{11}-NR^{12}-A-, siendo cada uno iguales o diferentes entre sí;
- \quad
- X^{11} es OH, NH_{2}, SH o un segundo grupo saliente;
- \quad
- A es o bien un enlace directo, o bien (CH_{2})_{k}, siendo k un número entero comprendido entre 0 y 30, o es O;
- \quad
- Q^{11} y Q^{12} son, independientemente, H_{2} o =O;
- \quad
- R^{11} es, independientemente, hidrógeno; un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30; un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30; un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, seleccionadas del grupo de los alquilos, los alcóxidos, los ácidos y los alcoholes; un acilo que incluye un anillo aromático; un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30; un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30; -C(O)-O-R^{16}; y
- \quad
- R^{12} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30;
- \quad
- R^{16} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30;
si es necesario, después se lleva a cabo una
etapa de desprotección, realizándose tanto dicha etapa de reacción
como dicha etapa de desprotección en condiciones que resultan
eficaces para obtener un compuesto según la fórmula (I), donde
X^{1} es (HO)_{2}PO-Z^{1}- o
(HO)_{2}PO-Z^{2}-P(OH)O-Z^{1}-.
Tras preparar los agonistas y antagonistas de
los receptores del LPA de la presente invención, tales compuestos
pueden emplearse para preparar composiciones farmacéuticas adecuadas
para tratar pacientes, de las maneras que se describen de aquí en
adelante. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica que incluye un portador
farmacéuticamente aceptable y un compuesto de los descritos en la
presente invención. Además, la composición farmacéutica puede
incluir excipientes adecuados, o estabilizantes, y puede tener
forma sólida o líquida, por ejemplo, comprimidos, cápsulas, polvos,
soluciones, suspensiones o emulsiones. Habitualmente, la
composición farmacéutica contendrá de un 0,01 a un 99 por ciento
(preferiblemente, de un 20 a un 75 por ciento) del compuesto o
compuestos activos, y además contendrá el portador, el excipiente,
el estabilizante, etc.
Las formas de administración de unidades sólidas
pueden ser del tipo convencional. La forma sólida puede ser una
cápsula, como las ordinarias de tipo gelatina, que contenga los
compuestos de la presente invención y un portador, por ejemplo,
lubricantes y sustancias de relleno inertes, tales como lactosa,
sacarosa o almidón de maíz. En otra forma de realización, los
compuestos de la presente invención se incluyen en comprimidos, con
bases convencionales para comprimidos, tales como lactosa, sacarosa
o almidón de maíz, junto con aglutinantes tales como goma arábiga,
almidón de maíz o gelatina, y sustancias desintegrantes tales como
almidón de maíz, fécula de patata o ácido algínico, y un lubricante
tal como ácido esteárico o estearato de magnesio.
Los compuestos de la presente invención pueden
asimismo tener una forma de administración inyectable o tópica, que
se consigue mediante la disolución o suspensión de estos materiales
en un diluyente fisiológicamente aceptable y un portador
farmacéutico. Los portadores farmacéuticos pueden ser, entre otros,
líquidos estériles, por ejemplo, agua y aceites, añadiendo o no un
tensoactivo y otro portador farmacéutica y fisiológicamente
aceptable, incluidos, entre otros, adyuvantes, excipientes o
estabilizantes. Aceites ilustrativos son los aceites de petróleo y
los de origen animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de
cacahuete, aceite de soja o aceite mineral. En general, como
portadores líquidos se prefieren, especialmente para las soluciones
inyectables, agua, solución salina, solución acuosa de dextrosa y
soluciones azucaradas similares, y glicoles, por ejemplo,
propilenglicol o polietilenglicol.
Para el uso como aerosol, se pueden empaquetar
los compuestos de la presente invención, en forma de solución o
suspensión, en un aerosol presurizado junto con los propelentes
adecuados, por ejemplo, propelentes hidrocarbonados tales como
propano, butano o isobutano, y con adyuvantes convencionales.
Asimismo, es posible administrar los materiales de la presente
invención en forma no presurizada, por ejemplo, en forma de
nebulizador o atomizador.
En función del tipo de tratamiento que se lleve
a cabo, los compuestos de la presente invención se pueden
administrar por vía oral, tópica, transdérmica, parenteral,
subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por
instilación nasal, por instilación intracavitaria o intravesical, o
por vía intraocular, intrarterial, intralesional, o por aplicación
en las membranas mucosas, por ejemplo, las de la nariz, la garganta
o los bronquios.
Son composiciones cubiertas por el ámbito de la
presente invención todas aquellas que contienen el compuesto de la
presente invención en una cantidad eficaz para lograr el objetivo
que se persigue con ellas. Aunque las necesidades individuales
varían, la determinación de los intervalos óptimos de cantidades
eficaces de cada componente están al alcance de aquellos
cualificados en la materia. Las dosificaciones habituales están
comprendidas entre unos 0,01 y unos 100/mg/kg de peso corporal. Las
dosificaciones preferidas están comprendidas entre unos 0,1 y unos
100 mg/kg de peso corporal. Las dosificaciones que más se prefieren
están comprendidas entre unos 1 y unos 100 mg/kg de peso corporal.
La pauta de tratamiento para la administración de los compuestos de
la presente invención también puede ser determinada fácilmente por
los expertos en la materia.
\newpage
Se ha descubierto que ciertos compuestos de la
presente invención son útiles como agonistas de los receptores del
LPA, y que otros compuestos de la presente invención son útiles como
antagonistas de los receptores del LPA. Debido a las diferencias en
su actividad, los diversos compuestos tienen aplicaciones
diferentes. El sujeto animal preferido para la presente invención
es un mamífero, es decir, un individuo perteneciente a la clase
Mammalia. La invención es particularmente útil en el
tratamiento de sujetos humanos.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un procedimiento para modular la actividad del receptor del LPA
in vitro, que incluye proporcionar un compuesto de la
presente invención y que tiene actividad como agonista del receptor
del LPA o como antagonista del receptor del LPA, así como poner en
contacto un receptor del LPA in vitro con el compuesto en
condiciones eficaces para modular la actividad del receptor del
LPA.
El receptor del LPA está presente en una célula
que expresa normalmente el receptor del LPA, o que ha sido
transformada de algún modo para que exprese un receptor concreto del
LPA. Los receptores del LPA adecuados son, entre otros, los
receptores EDG-2, EDG-4,
EDG-7 y PSP-24. En la Tabla 1
expuesta anteriormente en la presente invención se indican los
tejidos que contienen células que expresan normalmente estos
receptores. Cuando se pone en contacto una célula con el agonista
del receptor del LPA o con el antagonista del receptor del LPA
descritos en la presente invención, el contacto puede llevarse a
cabo estando la célula in vitro.
Para expresar heterólogamente estos receptores
en células anfitrionas que normalmente no los expresan, puede
insertarse una molécula de ácido nucleico que codifique uno o más de
tales receptores, en orientación "de sentido" en un vector de
expresión que incluya las adecuadas regiones reguladoras de la
transcripción y la traducción (es decir, promotor y señales de
detención de la transcripción), y a continuación las células
anfitrionas se pueden transformar mediante el vector de expresión.
El vector de expresión puede integrarse en el genoma celular o
simplemente estar presente como material nuclear extracromosómico.
La expresión puede ser constitutiva o inducible, aunque la
expresión constitutiva resulta adecuada para la mayoría de los
propósitos.
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos
del EDG-2 son conocidas y han sido descritas en An
et al. (1997b) y en el Genbank Accession No. U80811 (Número
de acceso U80811 a Genbank), que se incorporan en la presente por
referencia. Una molécula de ácido nucleico que codifica el
EDG-2 tiene una secuencia de nucleótidos según el
siguiente Número identificador de secuencia (Secuencia Nº 1):
El receptor EDG-2 codificado
tiene una secuencia de aminoácidos según el siguiente Número
identificador de secuencia (Secuencia Nº 2):
\newpage
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos
del EDG-4 son conocidas y han sido descritas en An
et al. (1998b) y en el Genbank Accession No. NM_004720
(Número de acceso NM_004720 a Genbank), que se incorporan en la
presente invención por referencia. Una molécula de ácido nucleico
que codifica el EDG-4 tiene una secuencia de
nucleótidos según el siguiente Número identificador de secuencia
(Secuencia Nº 3):
El receptor EDG-4 codificado
tiene una secuencia de aminoácidos conforme con el siguiente Número
identificador de secuencia (Secuencia Nº 4):
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos
del EDG-7 son conocidas y han sido descritas en
Bandoh et al. (1999) y en el Genbank Accession No. NM_012152
(Número de acceso NM_012152 a Genbank), que se incorporan en la
presente invención por referencia. Una molécula de ácido nucleico
que codifica el EDG-7 tiene una secuencia de
nucleótidos conforme con el siguiente Número identificador de
secuencia (Secuencia Nº 5):
El receptor EDG-7 codificado
tiene una secuencia de aminoácidos conforme con el siguiente Número
identificador de secuencia (Secuencia Nº 6):
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos
del PSP-24 son conocidas y han sido descritas en
Kawasawa et al. (2000) y en el Genbank Accession No.
AB030566 (Número de acceso AB030566 a Genbank), que se incorporan
en la presente invención por referencia. Una molécula de ácido
nucleico que codifica el PSP-24 tiene una secuencia
de nucleótidos según el siguiente Número identificador de secuencia
(Secuencia Nº 7):
El receptor PSP-24 codificado
tiene una secuencia de aminoácidos conforme con el siguiente Número
identificador de secuencia (Secuencia Nº 8):
Característicamente, los agonistas de los
receptores del LPA inducirán actividad similar a la del LPA en un
receptor del LPA; dicha actividad se puede medir químicamente, por
ejemplo, midiendo la corriente de Ca^{2+} o de Cl^{-} en los
oocitos, o bien, se pueden examinar los cambios en la morfología,
motilidad o proliferación celular, etc. Por contra, los
antagonistas de los receptores del LPA bloquean la actividad similar
a la del LPA en los receptores del LPA. Este bloqueo también se
puede medir químicamente, por ejemplo, midiendo la corriente de
Ca^{2+} o de Cl^{-} en los oocitos, o examinando los cambios en
la morfología, motilidad o proliferación celular, etc.
Como se ha expuesto anteriormente, el LPA es una
molécula señalizadora que participa en una serie de rutas celulares
diferentes en las que se produce señalización mediante receptores
del LPA, incluidos los receptores del LPA que se han descrito
anteriormente en la presente invención. Por lo tanto, se espera que
los compuestos de la presente invención modulen los efectos del LPA
sobre el comportamiento celular, actuando bien como antagonistas de
los receptores del LPA, bien como agonistas de los receptores del
LPA.
Un aspecto de la presente invención se refiere
al uso, en el tratamiento del cáncer, de un compuesto de la
presente invención, y a la administración de una cantidad eficaz del
compuesto a un paciente, de una manera eficaz para tratar el
cáncer. Entre los tipos de cáncer que se pueden tratar con los
compuestos de la presente invención figuran los caracterizados por
presentar células cancerosas cuyo comportamiento es atribuible, al
menos en parte, a la actividad mediada por el LPA. Habitualmente,
estos tipos de cáncer se caracterizan por presentar células
cancerosas que expresan uno o más tipos de receptores del LPA.
Formas representativas de estos tipos de cáncer son, entre otras,
el cáncer de próstata y el cáncer de ovario.
Los compuestos de la presente invención que
resultan particularmente útiles en el tratamiento del cáncer son
los antagonistas de los receptores del LPA.
Los compuestos de la presente invención se
pueden administrar sistémicamente o directamente en un lugar
concreto del cuerpo en el que haya células cancerosas presentes. La
administración de dichos compuestos se puede realizar de cualquier
manera que sea eficaz para hacer llegar el compuesto concreto a las
células cancerosas. Sin limitarnos a la teoría, podemos decir que
se cree que los antagonistas de los receptores del LPA, al unirse a
los receptores del LPA, inhibirán la proliferación o la metástasis
de las células cancerosas, o que destruirán dichas células
cancerosas. Como se indica en el Ejemplo 12 (véase más adelante),
varios compuestos antagonistas de los receptores del LPA de la
presente invención resultaron citotóxicos para líneas celulares de
cáncer de próstata que expresan uno o más receptores del LPA del
tipo que se ha descrito anteriormente.
A la hora de administrar los compuestos
antagonistas de los receptores del LPA o las composiciones
farmacéuticas de la presente invención para tratar el cáncer, la
composición farmacéutica puede también contener otros principios
activos terapéuticos o incluir otros tratamientos, o puede
administrarse junto con otros principios activos terapéuticos o
tratamientos, ya sea conocidos actualmente o desarrollados en un
futuro para el tratamiento de los diversos tipos de cáncer.
La invasión cancerosa es un proceso complejo,
integrado por varios pasos, en el que células o conjuntos de
células se desprenden del tumor primario, alcanzan la circulación
sistémica o el sistema linfático, y se distribuyen o difunden a
distintos órganos (Liotta et al., 1987). Durante este
proceso, las células tumorales deben detenerse en los capilares,
extravasarse y migrar hasta el estroma del tejido con el fin de
establecer focos secundarios. En primer lugar, las células
tumorales deben reconocer señales de una célula endotelial que las
haga desviarse de la circulación. En segundo lugar, las células
tumorales deben fijarse a la glicoproteína laminina de la membrana
basal mediante los receptores de la laminina presentes en la
superficie celular. Tras fijarse a la membrana basal, las células
tumorales secretan proteasas que degradan la membrana basal. Tras
la fijación y la proteolisis local, el tercer paso de la invasión es
la migración de las células tumorales. La motilidad celular
desempeña una función crucial en la invasión y metástasis tumoral.
La relación existente entre la motilidad de las células tumorales
in vitro y el comportamiento metastásico en los experimentos
llevados a cabo en animales indica que existe una fuerte correlación
directa (Hoffman-Wellenhof et al., 1995). Es
un hecho bien documentado que los PLGFs promueven la proliferación y
aumentan la invasividad de las células cancerosas in vitro.
Imamura y otros demostraron que las células cancerosas necesitan
factores del suero para llevar a cabo sus invasiones (Imamura et
al., 1991), y a continuación identificaron el LPA como el
componente sérico más importante que es plenamente capaz de
restaurar la invasión por parte de las células tumorales en
sistemas en los que no hay suero (Xu et al., 1995a; Imamura
et al., 1993; Mukai et al., 1993).
Se ha demostrado que los PLGFRs se expresan en
líneas celulares de cáncer de ovario, concretamente, en las células
OCC1 y HEY. Específicamente, los análisis mediante
TI-PCR demuestran la presencia de receptores
EDG-2 y EDG-7 en dichas líneas
celulares. Recientemente, Im et al. (2000) demostraron que el
EDG-7 se expresa en líneas celulares de cáncer de
próstata, concretamente, en las células PC-3 y
LNCaP. Los análisis mediante TI-PCR de las líneas
celulares de cáncer de próstata DU-145,
PC-3 y LNCaP demostraron que el
EDG-2, el EDG-4, el
EDG-5 y el EDG-7 están presentes en
esas tres líneas celulares de cáncer de próstata, y que el
EDG-3 está presente en las líneas celulares de
cáncer de próstata LNCaP y DU-145.
Como se indica en los Ejemplos, varios
antagonistas de los receptores del LPA de la presente invención son
capaces de dirigirse contra líneas celulares de cáncer de próstata
concretas y líneas celulares de cáncer de ovario concretas. Por lo
tanto, los antagonistas de los receptores del LPA de la presente
invención brindan un procedimiento alternativo para el tratamiento
de los cánceres mediados por el LPA, incluidos el cáncer de
próstata y el cáncer de ovario.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso, para el aumento de la proliferación celular, de los
compuestos de la presente invención. Con el fin de poder usar dichos
compuestos para aumentar la proliferación celular, hay que llevar a
cabo dos pasos: proveer un compuesto de la presente invención que
tenga actividad como agonista de un receptor del LPA, y poner en
contacto un receptor del LPA en una célula con el compuesto, de una
manera eficaz para aumentar la proliferación, inducida por el
receptor del LPA, de la célula.
Además de las funciones que el LPA desempeña en
la modulación de la actividad de las células cancerosas, existen
pruebas firmes que sugieren que el LPA también desempeña una función
fisiológica en la cicatrización natural de las heridas. Se cree que
el LPA derivado de las plaquetas activadas es responsable, al menos
en parte, de la estimulación de la proliferación celular en los
lugares de las heridas, así como de la inflamación, posiblemente en
sincronía con otros factores derivados de las plaquetas (Balazs
et al., 2000). Además, el LPA por sí mismo induce la
agregación plaquetaria, que a su vez puede ser el factor que inicia
un elemento de retroalimentación positiva sobre la respuesta
agregadora inicial (Schumacher et al., 1979; Tokumura et
al., 1981; Gerrard et al., 1979; Simon et al.,
1982).
Dada la función que el LPA desempeña en la
proliferación celular, los compuestos que tienen actividad agonista
de los receptores del LPA se pueden utilizar de manera eficaz para
promover la cicatrización de las heridas.
El objetivo principal del tratamiento de las
heridas es lograr el cierre de éstas. Las heridas cutáneas abiertas
constituyen una categoría importante de heridas, y son, entre otras,
las heridas por quemadura, las úlceras neuropáticas, las úlceras
por presión, las úlceras por insuficiencia venosa y las úlceras
diabéticas. Las heridas cutáneas abiertas suelen cicatrizar
mediante un proceso que consta de seis componentes principales: i)
inflamación, ii) proliferación de fibroblastos, iii) proliferación
de vasos sanguíneos, iv) síntesis de tejido conjuntivo, v)
epitelización y vi) contracción de la herida. Cuando estos
componentes, ya sea cada uno por su cuenta o de forma conjunta, no
funcionan correctamente, la cicatrización de las heridas se ve
alterada. Hay numerosos factores que pueden afectar a la
cicatrización; entre otros, la malnutrición, las infecciones, los
fármacos (por ejemplo, la actinomicina y los corticoesteroides), la
diabetes o la edad avanzada (véase Hunt y Goodson, 1988).
Se ha demostrado que los fosfolípidos son
importantes reguladores de la actividad celular, incluida la
mitogénesis (Xu et al., 1995b), la apoptosis, la adhesividad
celular y la regulación de la expresión de los genes. En concreto,
por ejemplo, el LPA produce efectos similares a los de los factores
de crecimiento sobre la proliferación celular (Moolenaar, 1996) y
sobre la migración celular (Imamura et al., 1993). Además, se
ha sugerido que el LPA desempeña una función en la regeneración y
la cicatrización de las heridas (Tigyi y Miledi, 1992).
En general, las sustancias que promueven una
afluencia más rápida de fibroblastos, células endoteliales y
células epiteliales hacia las heridas deberían aumentar la velocidad
de cicatrización de las heridas. Es posible identificar y probar,
en una serie de modelos in vitro e in vivo, compuestos
que resulten útiles como tratamiento para la cicatrización de las
heridas.
Los sistemas in vitro constituyen un
modelo de diferentes componentes del proceso de cicatrización de
las heridas, por ejemplo, el retorno de las células a una monocapa
confluyente "herida" de células de cultivos tisulares, por
ejemplo, fibroblastos (Verrier et al., 1986), células
endoteliales (Miyata et al., 1990) o células epiteliales
(Kartha et al., 1992). Otros sistemas permiten medir la
migración o proliferación de las células epiteliales (Muller et
al., 1987; Sato et al., 1988).
Los modelos in vivo de la cicatrización
de las heridas son también bien conocidos para aquellos cualificados
en la materia, y son, por ejemplo, la epidermis herida (lesionada)
porcina (Ohkawara et al., 1977) o las lesiones de mucosa
oral inducidas por fármacos en el abazón de hámster (Cherrick et
al., 1974).
Los compuestos que se muestran eficaces para la
cicatrización de las heridas se pueden administrar también
combinados (es decir, dentro de la misma composición farmacéutica o
mediante administración simultánea por vías diferentes) con un
medicamento seleccionado de un grupo que consiste en un fármaco
antibacteriano, un fármaco antivírico, un fármaco antifúngico, un
fármaco antiparasitario, un fármaco antinflamatorio, un fármaco
analgésico, un fármaco antipruriginoso, o con una combinación de
estos fármacos.
Para la cicatrización de las heridas, un modo de
administración preferido es la vía tópica. No obstante, el fármaco
se puede administrar, como alternativa o a la vez, por vía
parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal
o transdérmica. Asimismo, como alternativa, o a la vez, el fármaco
se puede administrar por vía oral. La dosis administrada dependerá
de la edad, el estado general de salud y el peso del paciente, del
tipo de tratamiento simultáneo que se le esté administrando (si se
le está administrando alguno), de la frecuencia del tratamiento y
de la naturaleza del efecto que se desea lograr.
Para las aplicaciones tópicas preferidas,
especialmente a la hora de tratar seres humanos y animales que
presentan una herida, se prefiere administrar una cantidad eficaz
del compuesto en la zona herida, por ejemplo, superficies cutáneas.
Generalmente esta cantidad oscilará entre 0,001 mg y 1 g por
aplicación, en función del área que se deba tratar, de la gravedad
de los síntomas y de la naturaleza del vehículo tópico empleado. Una
preparación tópica preferida es una pomada en la que se usen de
unos 0,01 a unos 50 mg del principio activo por ml de base de la
pomada, tal como PEG-1000.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos tienen como intención
ilustrar, y de ningún modo limitar, el ámbito de la presente
invención, que se expone en las reivindicaciones anexas. Los
compuestos que se preparen conforme a los Ejemplos 3, 6, 7, 8 y 9
recaen fuera del ámbito de las reivindicaciones.
Para medir todos los puntos de fusión, que no
hubo que corregir, se empleó un equipo Thomas-Hoover
de medición del punto de fusión en tubos capilares.
Se registraron los espectros de resonancia
magnética nuclear (RMN) en disolución de ^{1}H y ^{13}C en un
espectrómetro Bruker AX 300 (300, a 75,5 MHz). Los valores de
desplazamiento químico (\delta) se expresan en forma de partes
por millón (ppm) en relación con el tetrametilsilano (TMS). Los
picos se abrevian de la siguiente manera: s - singlete; d -
doblete; t - triplete; c - cuarteto; sa - singlete ancho; m -
multiplete; ma - multiplete ancho; dd - doble doblete; etc.
Se obtuvieron los espectros de resonancia
magnética nuclear del protón, del carbono-13 y del
fósforo-31 en un espectrómetro Bruker AX 300. Los
desplazamientos químicos para el protón y para el
carbono-13 se notifican en forma de partes por
millón (\delta) en relación con el tetrametilsilano (TMS). Los
espectros para el fósforo-31 se notifican en forma
de partes por millón (\delta) en relación con trifenilfosfato
0,0485 M en acetona-d_{6} a \delta = 0 ppm.
Se registraron los espectros de infrarrojos (IR)
en un Sistema 200-FTIR de Perkin Elmer.
Los espectros de masas se registraron en un
espectrómetro Bruker Esquire AG o en un espectrómetro Bruker Esquire
LC/MS por infusión directa empleando la Interfaz de Electrospray
(ESI) en modo positivo o negativo. Los datos espectrales fueron
conformes con las estructuras asignadas.
La empresa Atlantic Microlabs, Inc. (Norcross
[Georgia], Estados Unidos) realizó análisis elementales, y los
valores hallados estaban dentro de un \pm0,4% respecto de los
valores teóricos.
Para llevar a cabo la cromatografía en columna
flash se empleó gel de sílice (Merck, malla de
230-400, o malla de 200-425,
60Aº).
Se llevó a cabo cromatografía en capa fina
analítica en láminas (para cromatografía en capa fina) de gel de
sílice 60 F 254 de Sigma-Aldrich, con soportes de
aluminio (grosor de 200 a 250 micras).
Todos los reactivos, disolventes y medios para
cromatografía, a menos que se indique lo contrario, fueron
comprados a las empresas Aldrich Chemical Company (Milwaukee
[Wisconsin], Estados Unidos), Fisher Scientific (Pittsburg
[Pennsylvania], Estados Unidos) o Sigma Chemical Co. (Saint Louis
[Missouri], Estados Unidos), sin que se realizase ninguna
purificación con posterioridad a su compra. Se secó tetrahidrofurano
(THF) por destilación sobre sodio metálico, empleando benzofenona
como indicador. Se destiló cloruro de metileno anhidro
(CH_{2}Cl_{2}) sobre hidruro de calcio (CaH_{2}). Todos los
monoglicéridos se obtuvieron de
Nu-Check-Prep (Minneapolis
[Minnesota], Estados Unidos). La
t-Boc-L-serina fue comprada a
la empresa Fluka.
Todos los lípidos fueron comprados a la empresa
Avanti Polar Lipids (Alabaster [Alabama], Estados Unidos). En lo
que se refiere a la seroalbúmina bovina (BSA), se empleó
seroalbúmina bovina libre de ácidos grasos. Antes de su uso, se
formó un complejo integrado por LPA en una proporción molar 1:1, con
BSA 1 mM disuelta en una solución salina equilibrada de Hanks,
libre de Ca^{2+}, que contenía EGTA 1 mM. Se disolvieron alícuotas
de todos los demás lípi-
dos en MeOH (metanol) y se mezclaron con LPA antes de su aplicación, o tal como se indique en cualquier otro caso.
dos en MeOH (metanol) y se mezclaron con LPA antes de su aplicación, o tal como se indique en cualquier otro caso.
El reactivo de transfección Cytofectene se
compró a la empresa Bio-Rad (Hercules [California],
Estados Unidos). El Fura-2 AM se compró a la
empresa Molecular Probes (Eugene [Oregón], Estados Unidos).
De la empresa Cellgro (Herndon [Virginia],
Estados Unidos) se obtuvieron medios de cultivo, suero fetal bovino
y G418.
Las células RH7777, que expresaban de manera
estable el EDG-4 humano, fueron amablemente
proporcionadas por el Dr. Kevin Lynch (Universidad de Virginia,
Charlottesville [Virginia], Estados Unidos). Los ADNc (etiquetados
con marcadores) que codificaban el EDG-4 y el
EDG-7 humanos, insertados en el plásmido de
expresión pCDNA3 (Invitrogen, Carlsbad [California], Estados
Unidos), fueron un generoso regalo del Dr. Juncen Aoki (Universidad
de Tokio [Tokio], Japón). Asimismo, se obtuvieron células RH7777 y
NIH3T3 de la American Type Culture Collection (Manassas [Virginia],
Estados Unidos). Las células HEY fueron proporcionadas por la Dra.
Lisa Jennings (Universidad de Tennesee en Memphis [Tennesee],
Estados Unidos). Todas las líneas celulares fueron mantenidas en el
medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), que contenía suero fetal
bovino al 10% y glutamina 2 mM. Los oocitos se obtuvieron de ranas
Xenopus laevis adultas, como se ha descrito anteriormente
(Tigyi et al., 1999).
Se transfectaron células RH7777 con los
constructos de ADNc que codificaban el EDG-2,
EDG-4 o EDG-7 humano, y a
continuación fueron subclonadas en el vector de expresión pCDNA3
empleando el reactivo de transfección Cytofectene según el
protocolo del fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron
en DMEM que contenía suero fetal bovino al 10% y 1 mg/ml de
geneticina. Se recogieron las células resistentes y se subclonaron
mediante dilución limitante. Después, los clones resultantes fueron
evaluados mediante pruebas funcionales y análisis con
TI-PCR. Los datos son representativos de tres clones
individuales.
Se colocaron células RH7777 en portaobjetos de
vidrio recubiertos de polilisina (Bellco, Vineland [Nueva Jersey],
Estados Unidos) un día antes de la transfección. Al día siguiente,
se transfectaron las células durante toda la noche (un período de
16 a 18 horas) con 1 \mug de ADN plásmido, mezclado con 6 \mul
de Cytofectene. Después, se enjuagaron las células con DMEM y se
cultivaron en DMEM que contenía suero fetal bovino al 10%. Al día
siguiente, se enjuagaron las células con DMEM y se extrajo el suero
durante un mínimo de 2 horas antes de monitorizar el Ca^{2+}
intracelular.
Se monitorizaron los cambios en el Ca^{2+}
intracelular empleando el indicador (fluorescente) de Ca^{2+}
Fura-2 AM descrito anteriormente (Tigyi et
al., 1999). Los puntos de datos de las mediciones del Ca^{2+}
intracelular representan el área pico total de los incrementos
transitorios de Ca^{2+} provocados según lo determinado mediante
el software FL WinLab (Perkin-Elmer, Wellesley
[Massachusetts], Estados Unidos). Los puntos de los datos
representan el promedio de al menos 3 mediciones \pm la desviación
estándar. La significación estadística de los puntos de los datos
se determinó mediante la prueba T de Student y los valores fueron
considerados significativos a p < 0,05.
Se registraron las corrientes de Cl^{-}
oscilatorias provocadas por el LPA, empleando un sistema de fijación
de voltaje, de dos electrodos, descrito anteriormente (Tigyi et
al., 1999).
Se llevó a cabo, mediante TI-PCR
(TI = transcriptasa inversa; PCR = reacción en cadena de la
polimerasa), la identificación del ARNm para los receptores EDG y
PSP24, de la forma descrita anteriormente (Tigyi et al.,
1999), empleando las siguientes secuencias de oligonucleótidos:
Se determinó, mediante recuento directo de
células, la proliferación de las células NIH3T3, de la forma
descrita anteriormente (Tigyi et al., 1999). Se colocaron
las células NIH3T3 en placas de 24 pocillos, a una densidad de
10000 células/pocillo, en DMEM que contenía suero fetal bovino al
10%. Al día siguiente se lavaron las células y se las privó de
suero, en DMEM, durante 6 horas. Luego se añadieron lípidos durante
24 horas. El número de células se determinó realizando recuentos en
un contador Coulter (de la empresa Coulter Electronics, Hialeah
[Florida], Estados Unidos).
La incorporación de
^{3}H-timidina a las células RH7777 se determinó
de la manera descrita anteriormente (Tigyi et al.,
1994).
Compuesto intermedio
25
Se equipó un matraz de tres bocas de 500 ml de
un termómetro para bajas temperaturas y de un embudo de goteo de
100 ml. Todos los utensilios de vidrio se secaron a la llama y se
enfriaron hasta que alcanzaron la temperatura ambiente bajo argón
(Ar) antes de su uso. Al matraz se le añadió trifenilfosfina
(Ph_{3}P) (10 gr, 38 mmol, secada sobre P_{2}O_{5} en
condiciones de vacío durante 72 horas) y THF recién destilado (190
ml). Se enfrió y agitó la solución a -78ºC (baño de hielo
seco-acetona) bajo argón. Agitando vigorosamente, se
añadió dietil azodicarboxilato (DEAD) (6,2 ml, 39,9 mmol) mediante
una jeringuilla a lo largo de un período de 30 minutos. Una vez
finalizada la adición, se agitó la mezcla (durante unos
30-40 minutos) hasta obtener una pasta blanca
lechosa. A esta mezcla de reacción se le añadió, gota a gota, a lo
largo de un período de 45 minutos, una solución de
N-(ter-butoxicarbonil)-L-serina
(24) (7,79 gr, 38 mmol, secada sobre P_{2}O_{5} en condiciones
de vacío durante 72 horas) en THF recién destilado (75 ml). La
mezcla obtenida fue agitada durante toda la noche a -78ºC bajo
argón y luego se dejó que se calentase hasta alcanzar 0ºC (cuando la
temperatura alcanzó -10ºC, se colocó el matraz en un baño de
hielo). Transcurridos aproximadamente 30 minutos, el baño de hielo
se reemplazó con un baño María, se agitó la mezcla de reacción
durante 2 horas, y se concentró dicha mezcla de reacción en un
evaporador rotatorio hasta obtener un aceite de color amarillo
pálido a 30ºC. Después, este aceite fue tratado con hexanos/EtOAc
al 25% (100 ml) y el sólido de color blanco resultante fue extraído
mediante filtración y lavado con hexanos/EtOAc al 25% (2 x 70 ml);
el filtrado combinado fue concentrado, y el aceite residual fue
sometido a cromatografía en columna flash sobre gel de sílice con
hexanos/EtOAc al 25% (500 ml) y al 30% (1500 ml),
sucesivamente.
Se combinaron las fracciones adecuadas para
obtener 3,4 g (47%) de 25 en forma de sólido blanco: pf (punto de
fusión) 119-121ºC dec. (Lit.
119,5-120,5ºC dec.); RMN ^{1}H (CD_{2}Cl_{2})
\delta 1,44 (s, 9H), 4,38-4,42 (m, 2H),
4,96-5,03 (c, J_{1} = 6,1 Hz, J_{2} = 12,5 Hz,
1H), 5,39 (s, br 1H); RMN ^{13}C (CD_{2}Cl_{2}) d 28,31,
60,01, 66,63, 81,50, 155,01, 169,94; IR (KBr) 3361, 2978, 1843,
1680, 1533, 1370, 1292 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{8}H_{13}NO_{4}: C, 51,33; H, 6,94; N, 7,50. Encontrado: C,
51,41; H, 7,01; N, 7,51.
\vskip1.000000\baselineskip
Los utensilios de vidrio que se emplearon se
secaron a la llama y se enfriaron hasta que alcanzaron la
temperatura ambiente en atmósfera de argón. La reacción se llevó a
cabo en atmósfera de argón. Se destiló el THF antes de usarlo.
Compuesto
26
Se añadió
N-(ter-butoxicarbonil)-L-serina
\beta-lactona (300 mg, 1,60 mmol) a una solución
de decilamina (490 mg, 3,20 mmol) en THF (60 ml) y se hizo refluir
esta mezcla a lo largo de toda la noche bajo argón. La mezcla de
reacción fue concentrada en un evaporador rotatorio. El residuo fue
sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo con
hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas, y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 290 mg
(52%) de 26 en forma de polvo ceroso de color blanco: pf
50-52ºC; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 0,88 (t,
J = 6,4 Hz, 3H), 1,26 (s, 14H), 1,46 (s, 9H), 3,04 (sa, 1H),
3,16-3,34 (m, 2H), 3,63 (m, 1H),
4,06-4,15 (m, 2H), 5,53 (sa, 1H), 6,63 (sa, 1H);
RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 1409, 22,65, 26,80, 28,27, 29,24,
29,27, 29,37, 29,50, 29,51, 31,86, 39,43, 54,34, 62,87, 77,20,
80,34, 171,52; IR (KBr) 3282, 3098, 2929, 2856, 1666, 1547, 1467,
1369, 1300, 1248, 1179 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{16}H_{32}N_{2}O_{4}: C, 62,76; H, 10,53; N, 8,13.
Encontrado: C, 63,00; H, 10,46; N, 7,98.
Compuesto
27
Se añadió
N-(ter-butoxicarbonil)-L-serina
\beta-lactona (200 mg, 1,06 mmol) a una solución
de tetradecilamina (273 mg, 1,28 mmol) en THF (40 ml) y se hizo
refluir esta mezcla a lo largo de toda la noche bajo argón. La
mezcla de reacción fue concentrada en un evaporador rotatorio. El
residuo fue sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo con
hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 245 mg
(57%) de 27 en forma de polvo de color blanco: pf
59-62ºC; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 0,88 (t,
J = 6,3 Hz, 3H), 1,25 (s, 24H), 1,45 (s, 9H),
3,15-3,36 (m, 3H), 3,63-3,65 (m,
1H), 4,07-4,13 (m, 2H), 5,60-5,63
(m, 1H), 6,72 (sa, 1H); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 14,10,
22,66, 26,81, 27,99, 28,27, 29,25, 29,33, 29,37, 29,50, 29,57,
29,62, 29,66, 31,90, 39,47, 54,58, 62,87, 77,20, 80,52, 156,34,
171,37; IR (KBr) 3345, 2920, 2852, 1708, 1688, 1655, 1637, 1572,
1529, 1472, 1248, 1173 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{22}H_{44}N_{2}O_{4}: C, 65,96; H, 11,07; N, 6,99.
Encontrado: C, 66,04; H, 11,17; N, 6,96.
Compuesto
28
Se añadió
N-(ter-butoxicarbonil)-L-serina
\beta-lactona (300 mg, 1,60 mmol) a una solución
de octadecilamina (516 mg, 2,08 mmol) en THF (60 ml) y se hizo
refluir esta mezcla a lo largo de toda la noche bajo argón. La
mezcla de reacción fue concentrada en un evaporador rotatorio. El
residuo fue sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo con
hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 300 mg
(41%) de 28 en forma de polvo de color blanco: pf
69-71ºC; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 0,88 (t,
J = 6,3 Hz, 3H), 1,25 (s, 30H), 1,46 (s, 9H), 3,03 (sa, 1H),
3,16-3,34 (m, 2H), 3,63 (m, 1H),
4,05-4,21 (m, 2H), 5,64 (sa, 1H), 6,62 (sa, 1H);
RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 14,10, 22,68, 26,81, 28,28,
29,25, 29,35, 29,51, 29,58, 29,69, 31,91, 39,43, 54,29, 62,87,
77,20, 171,53; IR (KBr) 3345, 2919, 2852, 1687, 1636, 1570, 1528,
1473, 1305, 1173 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{26}H_{52}N_{2}O_{4} \cdot 0,2C_{4}H_{8}O_{2}: C,
67,86; H, 11,39; N, 5,91. Encontrado: C, 67,59; H, 11,46; N,
6,1.
Compuesto
29
Se añadió
N-(ter-butoxicarbonil)-L-serina
\beta-lactona (91 mg, 0,490 mmol) a una solución
de 4-(tetradeciloxi)anilina (150 mg, 0,490 mmol) en THF (40
ml) y se hizo refluir esta mezcla durante 48 horas bajo argón. La
mezcla de reacción fue concentrada en un evaporador rotatorio. El
residuo fue sometido a cromatografía en columna flash (dos veces),
eluyendo con hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 110 mg
(45%) de 29 en forma de polvo de color blanco: pf
92-94ºC; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 0,87 (t,
J = 6,6 Hz, 3H), 1,25 (s, 22H), 1,48 (s, 9H), 1,76 (m, 2H),
3,67-3,72 (dd, J_{1} = 4,9 Hz, J_{2} = 7,2 Hz,
1H), 3,92 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 4,23-4,26 (m, 2H),
5,65 (sa, 1H), 6,83-6,87 (m, J_{o} = 8,9 Hz, 2H),
7,36-7,40 (m, J_{o} = 8,9 Hz), 8,6 (sa, 1H); RMN
^{13}C (CDCl_{3}) \delta 14,10, 22,69, 26,01, 28,28, 29,25,
29,34, 29,39, 29,56, 29,58, 29,64, 31,91, 62,53, 68,30, 77,20,
111,17, 114,81, 121,70, 130,25, 156,22, 169,78; IR (KBr) 3304,
2920, 2852, 1658, 1514, 1472, 1238, 1174 cm^{-1}; análisis
calculado para C_{28}H_{48}N_{2}O_{5} \cdot
0,05CHCl_{3}: C, 67,56; H, 9,71; N, 5,62. Encontrado: C, 67,80; H,
9,67; N, 5,60.
Compuesto
30
Se añadió
N-(ter-butoxicarbonil)-L-serina
\beta-lactona (151 mg, 0,8 mmol) a una solución de
p-anisidina (100 mg, 0,8 mmol) en THF (20 ml) y se
hizo refluir esta mezcla a lo largo de toda la noche bajo argón. La
mezcla de reacción fue concentrada en un evaporador rotatorio. El
residuo fue sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo con
hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
cristalizó sobre hexanos/CHCl_{3}, obteniendo 135 mg (54%) de 30
en forma de polvo de color blanco: pf 109-111ºC; RMN
^{1}H (CDCl_{3}) \delta 1,48 (s, 9H),
3,68-3,73 (m, 1H), 3,80 (s, 3H),
4,24-4,27 (m, 2H), 5,68 (sa, 1H),
6,83-6,88 (m, J_{o} = 9 Hz, 2H),
7,37-7,42 (m, J_{o} = 9 Hz, 2H), 8,61 (sa, 1H);
RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 28,29, 54,96, 55,47, 62,54,
81,00, 114,18, 121,78, 130,45, 156,64, 156,98, 169,59; IR (KBr)
3340, 2978, 1673, 1603, 1516, 1298, 1238 cm^{-1}; análisis
calculado para C_{15}H_{22}N_{2}O_{5}: C, 58,05; H, 7,15; N,
9,03. Encontrado: C, 58,04; H, 7,17; N, 9,06.
Compuesto
31
Se añadió
N-(ter-butoxicarbonil)-L-serina
\beta-lactona (91 mg, 0,490 mmol) a una solución
de 3-(tetradeciloxi)anilina (179 mg, 0,588 mmol) en THF (25
ml) y se hizo refluir esta mezcla fue durante 48 horas bajo argón.
La mezcla de reacción fue concentrada en un evaporador rotatorio.
El residuo fue sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo
con hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 105 mg
(43%) de 31 en forma de polvo de color blanco: pf
70-72ºC; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 0,88 (t,
J = 6,6 Hz, 3H), 1,26 (s, 22H), 1,48 (s, 9H), 1,76 (m, 2H),
3,67-3,73 (dd, J_{1} = 5,1 Hz, J_{2} = 6,9 Hz,
1H), 3,93 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 4,23-4,26 (m, 2H),
5,66 (sa, 1H), 6,64-6,68 (m, 1H),
6,93-6,96 (m, 1H),7,19 (t, J_{o} = 8,1 Hz, 1H),
7,23 (t, J_{m} = 2 Hz, 1H), 8,75 (sa, 1H); RMN ^{13}C
(CDCl_{3}) \delta 14,11, 22,68, 26,02, 28,28, 29,23, 29,35,
29,39, 29,60, 29,66, 31,92, 62,38, 68,07, 77,20, 106,22, 111,10,
111,92, 129,67, 138,54, 159,75; IR (KBr) 3368, 2918, 2851, 1679,
1618, 1498, 1472, 1286 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{28}H_{48}N_{2}O_{5} \cdot 0,05CHCl_{3}: C, 67,56; H,
9,71; N, 5,62. Encontrado: C, 67,44; H, 9,79; N, 5,57.
Compuesto
32
Se añadió
N-(ter-butoxicarbonil)-L-serina
\beta-lactona (200 mg, 1,06 mmol) a una solución
de m-anisidina (171 mg, 1,38 mmol) en THF (30 ml) y
se hizo refluir esta mezcla a lo largo de toda la noche bajo argón.
La mezcla de reacción fue concentrada en un evaporador rotatorio.
El residuo fue sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo
con hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas,
obteniendo 154 mg (46%) de 32 en forma de aceite de color amarillo:
RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 1,48 (s, 9H),
3,68-3,73 (dd, J_{1} = 4,8 Hz, J_{2} = 6,9 Hz,
1H), 3,75 (s, 3H), 4,22-4,25 (d, J = 10,23 Hz, 2H),
5,66 (sa, 1H), 6,66-6,69 (m, 1H),
6,96-6,99 (m, 1H), 7,21 (t, J_{o} = 8,1 Hz, 1H),
7,24 (m, 1H), 8,79 (sa, 1H); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta
28,28, 29,68, 55,30, 62,39, 77,20, 81,11, 105,67, 110,55, 112,15,
129,73, 138,63, 160,19, 169,89.
Compuesto
33
Se añadió
N-(ter-butoxicarbonil)-L-serina
\beta-lactona (102 mg, 0,545 mmol) a una solución
de 2-(tetradeciloxi)anilina (200 mg, 0,645 mmol) en THF (25
ml) y se hizo refluir esta mezcla durante 48 horas bajo argón. La
mezcla de reacción fue concentrada en un evaporador rotatorio. El
residuo fue sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo con
hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 33 mg
(<10%) de 33 en forma de aceite de color amarillo: RMN ^{1}H
(CDCl_{3}) \delta 0,88 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,26 (s, 22H), 1,48
(s, 9H), 1,76 (m, 2H), 3,67-3,73 (dd, J_{1} = 5,1
Hz, J_{2} = 6,9 Hz, 1H), 3,93 (t, J = 6,5 Hz, 2H),
4,23-4,26 (m, 2H), 5,66 (sa, 1H),
6,64-6,68 (m, 1H), 6,93-6,96 (m,
1H), 7,19 (t, J_{o} = 8,1 Hz, 1H), 7,23 (t, J_{m} = 2 Hz, 1H),
8,75 (sa, 1H); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 14,10, 22,68,
25,88, 28,30, 29,17, 29,35, 29,58, 29,64, 29,68, 31,91, 55,73,
63,03, 68,71, 77,20, 111,06, 119,86, 119,86, 120,78, 124,21,
127,27, 147,75, 157,22, 169,25.
Compuesto
34
Se añadió
N-(ter-butoxicarbonil)-L-serina
\beta-lactona (200 mg, 1,06 mmol) a una solución
de o-anisidina (238 mg, 1,93 mmol) en THF (30 ml) y
se hizo refluir esta mezcla durante 48 horas bajo argón. La mezcla
de reacción fue concentrada en un evaporador rotatorio. El residuo
fue sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo con
hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
cristalizó sobre hexanos/CHCl_{3}, obteniendo 150 mg (45%) de 34
en forma de polvo de color amarillo: pf 92-94ºC; RMN
^{1}H (CDCl_{3}) \delta 1,49 (s, 9H), 3,87 (s, 3H),
3,73-3,83 (m, 1H), 4,21-4,34 (m,
2H), 5,64 (sa, 1H), 6,86-6,97 (m, 2H),
7,03-7,09 (m, J_{o} = 7,80 Hz, J_{m} = 1,8 Hz,
1H), 8,28-8,31 (dd, J_{o} = 8,9 Hz, J_{m} = 1,5
Hz, 1H), 8,9 (sa, 1H); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 28,28,
55,73, 62,87, 80,65, 110,14, 120,03, 120,97, 124,30, 127,13, 148,33,
169,43; IR (KBr) 3525, 3319, 2982, 1672, 1653, 1548, 1528, 1465,
1256, 1160, 1006 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{15}H_{22}N_{2}O_{5}: C, 58,05; H, 7,15; N, 9,03.
Encontrado: C, 58,04; H, 7,07; N, 8,85.
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
35
Se añadió TFA (1 ml), gota a gota en atmósfera
de argón, a una solución enfriada (0ºC, mediante baño de hielo) de
26 (20 mg, 0,0580 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (1 ml). Concluida la
adición, se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3
horas, luego se la concentró a presión reducida a temperatura
ambiente, y por último se la secó en una bomba de vacío,
obteniéndose 19 mg (95%) de 35 en forma de sólido de color blanco:
pf 168-170ºC; RMN ^{1}H (CD_{3}OD) \delta 0,88
(t, J = 6,3 Hz, 3H), 1,27 (s, 14H), 1,50 (m, 2H), 3,20 (t, J = 6,0
Hz, 2H), 3,70-3,78 (m, 1H),
3,81-3,88 (m, 2H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD)
\delta 14,44, 23,74, 27,96, 30,30, 30,42, 30,47, 30,70, 30,73,
30,78, 30,80, 33,10, 40,71, 56,30, 61,77, 167,97; IR (KBr) 3280,
2919, 2850, 1654, 1573, 1464, 1231, 1141, 1089, 1059 cm^{-1};
análisis calculado para
C_{13}H_{28}N_{2}O_{2}\cdotCF_{3}COOH: C, 50,27; H,
8,16; N, 7,82. Encontrado: C, 50,15; H, 8,30; N, 7,95.
Compuesto
36
Se añadió TFA (1,5 ml), gota a gota en atmósfera
de argón, a una solución enfriada (0ºC, mediante baño de hielo) de
27 (50 mg, 0,124 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (1,5 ml). Concluida la
adición, se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3
horas, luego se la concentró a presión reducida a temperatura
ambiente, y por último se la secó en una bomba de vacío,
obteniéndose 48 mg (94%) de 36 en forma de sólido de color blanco:
pf 168-171ºC; RMN ^{1}H (CD_{3}OD) \delta 0,89
(t, J = 6,3 Hz, 3H), 1,28 (s, 22H), 3,22 (t, J = 6,0 Hz, 2H),
3,73-3,80 (m, 1H), 3,84-3,91 (m,
2H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD) \delta 14,43, 23,73, 27,95, 30,29,
30,41, 30,47, 30,69, 30,73, 30,78, 30,80, 33,08, 40,71, 56,29,
61,77, 167,99; IR (KBr) 3277, 2919, 2850, 1656, 1573, 1464, 1231,
1141, 1089, 1059 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{17}H_{36}N_{2}O_{2}\cdotCF_{3}COOH: C, 55,06; H,
9,00; N, 6,76. Encontrado: C, 54,94; H, 8,99; N, 6,58.
\newpage
Compuesto
37
Se añadió TFA (1 ml), gota a gota en atmósfera
de argón, a una solución enfriada (0ºC, mediante baño de hielo) de
28 (25 mg, 0,0547 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (1 ml). Concluida la
adición, se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3
horas, luego se la concentró a presión reducida a temperatura
ambiente, y por último se la secó en una bomba de vacío,
obteniéndose 23 mg (92%) de 37 en forma de sólido de color blanco:
pf 170-172ºC; RMN ^{1}H (CD_{3}OD) \delta 0,89
(t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,27 (s, 30H), 1,49-1,54 (m,
2H), 3,22 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 3,74-3,81 (m, 1H),
3,83-3,91 (m, 2H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD)
\delta 14,43, 23,74, 27,95, 30,30, 30,41, 30,47, 30,69, 30,78,
33,07, 40,71, 56,30, 61,77, 167,97; IR (KBr) 3276, 2919, 2850, 1657,
1468, 1207, 1181, 1138, 1059 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{21}H_{44}N_{2}O_{2}\cdotCF_{3}COOH
0,15CH_{2}Cl_{2}: C, 57,53; H, 9,45; N, 5,80. Encontrado: C,
57,45; H, 9,55; N, 5,81.
Compuesto
38
Se añadió TFA (0,050 ml), gota a gota en
atmósfera de argón, a una solución enfriada (0ºC, mediante baño de
hielo) de 29 (54 mg, 0,110 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (0,050 ml).
Concluida la adición, se agitó la reacción a temperatura ambiente
durante 3 horas, luego se la concentró a presión reducida a
temperatura ambiente, y por último se la secó en una bomba de
vacío, obteniéndose 55 mg (99%) de 38 en forma de sólido de color
blanco: pf 135-139ºC; RMN ^{1}H (CD_{3}OD),
\delta 0,89 (t, J = 6,3 Hz, 3H), 1,28 (s, 21H), 1,43 (m, 2H), 1,74
(m, J = 6,5 Hz, 2H), 3,86-4,03 (m, 5H),
6,84-6,88 (m, J_{o} = 9,0 Hz, 2H),
7,41-7,47 (m, J_{o} = 9,0 Hz, 2H); RMN ^{13}C
(CD_{3}OD) \delta 14,42, 23,72, 30,41, 30,46, 30,50, 30,67,
30,74, 33,06, 56,81, 61,72, 69,26, 115,71, 122,96, 131,84, 157,80,
166,06; IR (KBr) 3281, 2920, 2852, 1672, 1604, 1559, 1515, 1240,
1210, 1132 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{23}H_{40}N_{2}O_{3}\cdotCF_{3}COOH: C, 59,27; H,
8,16; N, 5,53. Encontrado: C, 59,48; H, 8,09; N, 5,49.
Compuesto
39
Se añadió TFA (0,049 ml), gota a gota en
atmósfera de argón, a una solución enfriada (0ºC, mediante baño de
hielo) de 30 (50 mg, 0,161 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (0,049 ml).
Concluida la adición, se agitó la reacción a temperatura ambiente
durante 3 horas, luego se la concentró a presión reducida a
temperatura ambiente, y por último se la concentró en condiciones
de vacío hasta secarla, obteniéndose 50 mg (96%) de 39 en forma de
sólido de color blanco: pf 182-183ºC dec.; RMN
^{1}H (CD_{3}OD), \delta 3,76 (s, 3H),
3,87-3,94 (m, 1H), 3,97-4,04 (m,
2H), 6,85-6,91 (m, J_{o} = 9,1 Hz, 2H),
7,44-7,49 (m, J_{o} = 9,0 Hz, 2H); RMN ^{13}C
(CD_{3}OD) \delta 55,86, 56,80, 61,73, 115,07, 122,95, 131,99,
158,31, 166,10; IR (KBr) 3278, 3099, 2964, 1673, 1562, 1517, 1196,
1131 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{10}H_{14}N_{2}O_{3}\cdotCF_{3}COOH: C, 44,45; H,
4,66; N, 8,64. Encontrado: C, 44,31; H, 4,67; N, 8,58.
Compuesto
40
Se añadió TFA (0,062 ml), gota a gota en
atmósfera de argón, a una solución enfriada (0ºC, mediante baño de
hielo) de 31 (45 mg, 0,091 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (0,062 ml).
Concluida la adición, se agitó la reacción a temperatura ambiente
durante 3 horas, luego se la concentró a presión reducida a
temperatura ambiente, y por último se la secó en una bomba de
vacío, obteniéndose 45 mg (99%) de 40 en forma de sólido de color
verde amarillento: pf 115-119ºC; RMN ^{1}H
(CD_{3}OD) \delta 0,89 (s, J = 6,5 Hz, 3H), 1,28 (s, 21H), 1,43
(m, 2H), 1,75 (m, J = 6,5 Hz, 2H), 3,8-3,93 (m, 4H),
4,01-4,05 (m, 1H), 6,67-6,71 (m,
1H), 7,04-7,07 (m, 1H), 7,20 (t, J_{o} = 8,1 Hz,
1H), 7,28 (m, J_{m} = 2,1 Hz, 1H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD)
\delta 14,14, 23,75, 27,18, 30,38, 30,49, 30,52, 30,73, 30,78,
33,09, 56,96, 61,66, 69,05, 107,71, 111,75, 113,16, 130,72, 140,16,
161,07, 166,36; IR (KBr) 3266, 2920, 2852, 1676, 1608, 1566, 1496,
1438, 1211, 1130, 1045 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{23}H_{40}N_{2}O_{3}\cdotCF_{3}COOH: C, 59,27; H,
8,16; N, 5,53. Encontrado: C, 59,49; H, 8,13; N, 5,41.
Compuesto
41
Se añadió TFA (1 ml), gota a gota en atmósfera
de argón, a una solución enfriada (0ºC, mediante baño de hielo) de
32 (120 mg, 0,386 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (1 ml). Concluida la
adición, se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3
horas, luego se la concentró a presión reducida a temperatura
ambiente, y por último se la secó en una bomba de vacío,
obteniéndose 123 mg (98%) de 41 en forma de sólido de color crema:
pf 137-140ºC; RMN ^{1}H (CD_{3}OD), \delta
3,77 (s, 3H), 3,88-3,99 (m, 2H),
4,01-4,06 (m, 1H), 6,68-6,71 (m,
1H), 7,02-7,10 (m, 1H), 7,22 (t, J_{o} = 8,1 Hz,
1H), 7,29 (t, J_{m} = 2,1 Hz, 1H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD)
\delta 55,70, 56,94; 61,67, 107,14, 111,11, 113,28, 130,73,
140,22, 161,61, 166,43; IR (KBr) 3265, 1675, 1609, 1566, 1496,
1433, 1268, 1196, 1044 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{10}H_{14}N_{2}O_{3}\cdotCF_{3}COOH: C, 44,45; H,
4,66; N, 8,64. Encontrado: C, 44,52; H, 4,59; N, 8,66.
Compuesto
42
Se añadió TFA (1 ml), gota a gota en atmósfera
de argón, a una solución enfriada (0ºC, mediante baño de hielo) de
33 (21 mg, 0,044 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (1 ml). Concluida la
adición, se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3
horas, luego se la concentró a presión reducida a temperatura
ambiente, y por último se la secó en una bomba de vacío,
obteniéndose 21 mg (95%) de 42 en forma de sólido de color crema: pf
63-66ºC; RMN ^{1}H (CD_{3}OD), \delta 0,88 (t,
J = 6,5 Hz, 3H), 1,27 (s, 21H), 1,46 (m, 2H), 1,83 (m, J = 7,8 Hz,
2H), 3,90-4,07 (m, 4H), 4,18 (t, J = 5,8 Hz, 1H),
6,87-6,93 (m, 1H), 6,99-7,02 (m,
1H), 7,08-7,14 (m, 1H), 7,96-7,99
(m, 1H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD) \delta 14,43, 23,73, 27,70,
30,27, 30,48, 30,57, 30,79, 33,07, 56,198, 61,67, 69,84, 112,93,
121,40, 123,38, 126,80, 127,53, 150,93, 166,74; IR (KBr) 3282, 2925,
2851, 1679, 1556, 1496, 1458, 1213, 750 cm^{-1}; análisis
calculado para C_{23}H_{40}N_{2}O_{3}\cdotCF_{3}COOH
0,5H_{2}O: C, 58,24; H, 8,21; N, 5,43. Encontrado: C, 58,59; H,
8,09; N, 5,24.
Compuesto
43
Se añadió TFA (1 ml), gota a gota en atmósfera
de argón, a una solución enfriada (0ºC, mediante baño de hielo) de
34 (80 mg, 0,257 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (1 ml). Concluida la
adición, se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3
horas, luego se la concentró a presión reducida a temperatura
ambiente, y por último se la secó en una bomba de vacío,
obteniéndose 81 mg (97%) de 43 en forma de sólido de color crema: pf
131-133ºC; RMN ^{1}H (CD_{3}OD), \delta 3,88
(s, 3H), 3,91-4,02 (m, 2H),
4,18-4,22 (m, 1H), 6,89-6,94 (m,
1H), 7,01-7,04 (m, 1H), 7,10-7,16
(t, J_{o} = 8,1 Hz, 1H), 8,00-8,03 (t, J_{m} =
2,1 Hz, 1H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD) \delta 56,27, 56,34,
56,47, 61,81, 111,94, 121,52, 123,21, 126,71, 127,54, 151,43,
166,80; IR (KBr) 3271, 1675, 1546, 1499, 1465, 1439, 1268, 1207,
1130 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{10}H_{14}N_{2}O_{3}\cdotCF_{3}COOH: C, 44,45; H,
4,66; N, 8,64. Encontrado: C, 44,18; H, 4,57; N, 8,59.
\vskip1.000000\baselineskip
Los utensilios de vidrio que se emplearon se
secaron a la llama y se enfriaron hasta que alcanzaron la
temperatura ambiente en atmósfera de argón. Se lavó el alcohol de
partida con piridina anhidra (tres veces) y luego se lo secó (en
condiciones de alto vacío, durante 48 horas). La reacción se llevó a
cabo en una atmósfera de argón. El THF y el CH_{2}Cl_{2} fueron
recién destilados antes de usarlos.
Compuesto
50
Al compuesto 28 de partida (252 mg, 0,551 mmol)
lavado con piridina se le añadió 1H-tetrazol (231
mg, 3,31 mmol). A esta mezcla se le añadió una mezcla 1:1 de
THF/CH_{2}Cl_{2} recién destilados (50 ml). Transcurridos 10
minutos, se añadió dibencildiisopropil fosforamidato (1,14 gr, 3,31
mmol), y la reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90
minutos. La cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de
reacción reveló la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada
hasta que alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo), y se le añadió un
gran exceso de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35
minutos, y luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el
exceso de ácido peracético. Se retiraron el THF y el
CH_{2}Cl_{2} en condiciones de presión reducida. El concentrado
resultante fue tratado con EtOAc (acetato de etilo) (70 ml), y
luego fue lavado con metabisulfito sódico (2 x 25 ml), NaHCO_{3}
(2 x 30 ml), agua (2 x 30 ml) y solución salina saturada (2 x 30
ml). La porción orgánica fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada a
presión reducida. El residuo fue sometido a cromatografía en
columna flash, eluyendo con hexanos/EtOAc de composición
diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 195 mg
(49%) de 50 en forma de aceite incoloro: RMN ^{1}H (CDCl_{3})
\delta 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,25 (ma, 29H), 1,34 (m, 2H),
1,44 (s, 9H), 3,17-3,23 (m, 2H),
4,01-4,09 (m, 1H), 4,31-4,43 (m,
2H), 4,96-5,09 (m, 4H), 5,55 (sa, 1H), 6,33 (sa,
1H), 7,31-7,39 (m, 10H); ^{13}C (CDCl_{3})
\delta 14,09, 22,66, 26,79, 28,25, 29,24, 29,27, 29,42, 29,50,
29,53, 31,86, 39,68, 66,98, 69,66, 69,73, 77,20, 128,06, 128,10,
128,70, 128,72, 135,02, 168,50; MS (espectrometría de masas) m/z
603 (M-H)^{-}; IR (KBr) 3349, 2919, 2852,
1717, 1685, 1654, 1516, 1470, 1457, 1242, 1163, 1037, 1025, 999
cm^{-1}.
Compuesto
51
Al compuesto 27 de partida (305 mg, 0,761 mmol)
lavado con piridina se le añadió 1H-tetrazol (319
mg, 4,56 mmol). A esta mezcla se le añadió una mezcla 1:1 de
THF/CH_{2}Cl_{2} recién destilados (40 ml). Transcurridos 10
minutos, se añadió dibencildiisopropil fosforamidato (1,57 gr, 4,56
mmol) y la reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90
minutos. La cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de
reacción reveló la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada
hasta que alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo), y se le añadió un
gran exceso de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35
minutos, y luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el
exceso de ácido peracético. Se retiraron el THF y el
CH_{2}Cl_{2} en condiciones de presión reducida. El concentrado
resultante fue tratado con EtOAc (70 ml), y luego fue lavado con
metabisulfito sódico (2 x 30 ml), NaHCO_{3} (2 x 40 ml), agua (2 x
35 ml) y solución salina saturada (2 x 35 ml). La porción orgánica
fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada a presión reducida. El
residuo fue sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo con
hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 451 mg
(89%) de 51 en forma de sólido ceroso de color blanco: pf
33-35ºC; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 0,87 (t,
J = 6,4 Hz, 3H), 1,23-1,25 (ma, 22H), 1,44 (s, 2H),
1,52-1,55 (m, 2H), 3,16-3,23 (m,
2H), 4,02-4,09 (m, 1H), 4,31-4,43
(m, 2H), 5,00-5,15 (m, 4H), 5,57 (sa, 1H), 6,34 (t,
J = 5,0 Hz, 1H), 7,31-7,40 (m, 10H); ^{13}C
(CDCl_{3}) \delta 14,08, 19,03, 22,67, 26,81, 28,27, 29,25,
29,33, 29,44, 29,51, 29,59, 29,62, 29,65, 31,91, 39,69, 46,49,
54,47, 67,00, 67,07, 67,24, 67,32, 69,66, 69,68, 69,74, 76,12,
77,20, 77,84, 80,57, 128,0, 128,05, 128,09, 128,58, 128,64, 128,68,
135,45, 135,54, 135,59, 168,51; análisis calculado para
C_{36}H_{57}N_{2}O_{7}P \cdot 1H_{2}O \cdot
0,5C_{4}H_{8}O_{2}: C, 63,14; H, 8,78; N, 3,88. Encontrado: C,
62,80; H, 8,38; N, 4,21.
Compuesto
52
Al compuesto 26 de partida (270 mg, 0,783 mmol)
lavado con piridina se le añadió 1H-tetrazol (329
mg, 4,70 mmol). A esta mezcla se le añadió una mezcla 1:1 de
THF/CH_{2}Cl_{2} recién destilados (50 ml). Transcurridos 10
minutos, se añadió dibencildiisopropil fosforamidato (1,62 gr, 4,70
mmol) y la reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90
minutos. La cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de
reacción reveló la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada
hasta que alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo), y se le añadió un
gran exceso de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35
minutos, y luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el
exceso de ácido peracético. Se retiraron el THF y el
CH_{2}Cl_{2} en condiciones de presión reducida. El concentrado
resultante fue tratado con EtOAc (50 ml), y luego fue lavado con
metabisulfito sódico (2 x 25 ml), NaHCO_{3} (2 x 25 ml), agua (2 x
25 ml) y solución salina saturada (2 x 25 ml). La porción orgánica
fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada a presión reducida. El
residuo fue sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo con
hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 135 mg
(28%) de 52 en forma de sólido de color blanco: pf
52-54ºC; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 0,87 (t,
J = 6,4 Hz, 3H), 1,23 (ma, 14H), 1,44 (s, 9H), 1,63 (m, 2H),
3,17-3,24 (m, 2H), 4,01-4,09 (m,
1H), 4,30-4,44 (m, 2H), 5,00-5,05
(m, 4H), 5,56 (sa, 1H), 6,32 (sa, 1H), 7,29-7,39 (m,
10H); ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 14,11, 22,68, 26,80, 28,25,
29,26, 29,35, 29,42, 29,52, 29,60, 29,64, 29,69, 31,91, 39,68,
67,00, 67,07, 69,69, 69,74, 77,20, 127,93, 128,06, 128,10, 128,65,
128,70, 128,73, 135,43, 168,51, 170,07; IR (KBr) 3349, 2919, 2852,
1717, 1685, 1654, 1516, 1242, 1163, 1037, 1025, 999 cm^{-1};
análisis calculado para C_{40}H_{65}N_{2}O_{7}P \cdot
0,75H_{2}O \cdot 1C_{4}H_{8}O_{2}: C, 64,56; H, 9,17; N,
3,42. Encontrado: C, 64,23; H, 9,05; N, 3,78.
Compuesto
53
Al compuesto 29 de partida (310 mg, 0,647 mmol)
lavado con piridina se le añadió 1H-tetrazol (450
mg, 6,42 mmol). A esta mezcla se le añadió una mezcla 1:1 de
THF/CH_{2}Cl_{2} recién destilados (40 ml). Transcurridos 10
minutos, se añadió dibencildiisopropil fosforamidato (2,21 gr, 6,42
mmol) y la reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90
minutos. La cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de
reacción reveló la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada
hasta que alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo) y se le añadió un
gran exceso de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35
minutos y luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el
exceso de ácido peracético. Se retiraron el THF y el
CH_{2}Cl_{2} en condiciones de presión reducida. El concentrado
resultante fue tratado con EtOAc (70 ml) y luego fue lavado con
metabisulfito sódico (2 x 25 ml), NaHCO_{3} (2 x 35 ml), agua (2
x 35 ml) y solución salina saturada (2 x 35 ml). La porción
orgánica fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada a presión
reducida. El residuo fue sometido a cromatografía en columna flash,
eluyendo con hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 81 mg
(17%) de 53 en forma de sólido de color blanco: pf
74-76ºC; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 0,87 (t,
J = 6,5 Hz, 3H), 1,30 (s, 22H), 1,46 (s, 9H),
1,71-1,80 (m, 2H), 3,91 (t, J = 6,5 Hz, 3H),
4,01-4,16 (m, 1H), 4,42-4,49 (m,
2H), 4,96-5,09 (m, 4H), 5,65 (sa, 1H),
6,80-6,86 (m, J_{o} = 9,0 Hz, 2H),
7,31-7,39 (m, 12H), 8,82 (sa, 1H); ^{13}C
(CDCl_{3}) \delta 14,10, 22,67, 26,02, 28,26, 29,26, 29,34,
29,40, 29,57, 29,64, 31,91, 68,31, 69,84, 77,20, 114,79, 121,72,
128,07, 128,13, 128,65, 128,74, 130,03, 166,71; IR (KBr) 3340,
2920, 2852, 1717, 1677, 1513, 1457, 1237, 1059, 998 cm^{-1};
análisis calculado para C_{42}H_{61}N_{2}O_{8}P \cdot
1H_{2}O \cdot 0,45C_{6}H_{14}: C, 66,31; H, 8,63; N, 3,46.
Encontrado: C, 65,92; H, 9,02; N, 3,84.
\newpage
Compuesto
54
Al compuesto 30 de partida (225 mg, 0,725 mmol)
lavado con piridina se le añadió 1H-tetrazol (254
mg, 3,625 mmol). A esta mezcla se le añadió una mezcla 1:1 de
THF/CH_{2}Cl_{2} recién destilados (20 ml). Transcurridos 10
minutos, se añadió dibencildiisopropil fosforamidato (1,25 gr, 3,625
mmol) y la reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90
minutos. La cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de
reacción reveló la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada
hasta que alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo) y se le añadió un
gran exceso de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35
minutos y luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el
exceso de ácido peracético. Se retiraron el THF y el
CH_{2}Cl_{2} en un evaporador rotatorio. El concentrado
resultante fue tratado con EtOAc (50 ml) y luego fue lavado con
metabisulfito sódico (2 x 15 ml), NaHCO_{3} (2 x 25 ml), agua (2
x 25 ml) y solución salina saturada (2 x 25 ml). La porción
orgánica fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada a presión
reducida.
El residuo fue sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo con hexanos/EtOAc de composición diversa.
El residuo fue sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo con hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 195 mg
(47%) de 54 en forma de sólido de color blanco: pf
82-84ºC; RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 1,44 (s,
9H), 4,11 (s, 3H), 4,09-4,18 (m, 1H),
4,43-4,51 (m, 2H), 4,98-5,05 (m,
4H), 5,72 (sa, 1H), 6,78-6,82 (m, J_{o} = 9,0 Hz,
2H), 7,26-7,33 (m, 10H), 7,36-7,41
(m, J_{o} = 9,0 Hz, 2H), 8,41 (sa, 1H); ^{13}C (CDCl_{3})
\delta 28,26, 55,45, 66,93, 67,00, 69,76, 69,83, 69,90, 77,20,
80,91, 114,11, 121,75, 128,06, 128,12, 128,64, 128,72, 128,73,
130,38, 135,28, 135,42, 156,62, 166,75; RMN ^{31}P (CDCl_{3})
\delta 16,72 (1P); IR (KBr) 3337, 2969, 1716, 1689, 1665, 1514,
1457, 1304, 1245, 999 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{19}H_{35}N_{2}O_{8}P: C, 61,05; H, 6,18; N, 4,91.
Encontrado: C, 60,80; H, 6,20; N, 4,88.
Compuesto
55
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (cantidad catalítica) a una solución del compuesto 50 (100
mg, 0,165 mmol) en EtOH (etanol) (15 ml). Se llevó a cabo una
hidrogenación durante 4 horas a 50 psi (3,44 bares). Transcurridas
4 horas, se determinó, mediante cromatografía en capa fina, que la
reacción había concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través
de Celite y se concentró el eluato en condiciones de presión
reducida, obteniéndose 48 mg (90%) de 55 en forma de polvo de color
blanco: pf 196-198ºC; RMN ^{1}H (CF_{3}COOD)
\delta 0,81-0,82 (m, 3H),
1,26-1,30 (m, 14H), 1,59 (m, 2H),
3,37-3,38 (m, 2H), 4,54-4,59 (m,
1H), 4,72-4,81 (m, 2H); RMN ^{13}C (CF_{3}COOD)
\delta 14,66, 24,39, 28,60, 28,60, 30,46, 30,94, 31,16, 31,30,
31,39, 33,81, 43,53, 57,21, 66,42, 167,86; MS m/z 323
(M-H)^{-}; IR (KBr) 3314, 2920, 2853, 1670,
1575, 1477, 1246, 1063, 1043 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{13}H_{29}N_{2}O_{5}P\cdot0,5CH_{3}OH: C, 47,64; H,
9,18; N, 8,23. Encontrado: C, 47,24; H, 8,84; N, 8,02.
Compuesto
56
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (cantidad catalítica) a una solución del compuesto 51 (145
mg, 0,219 mmol) en EtOH (15 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación
durante 3 horas a 45 psi (3,10 bares). Transcurridas 3 horas, se
determinó, mediante cromatografía en capa fina, que la reacción
había concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite
y se concentró el eluato en condiciones de presión reducida,
obteniéndose 75 mg (90%) de 56 en forma de polvo de color blanco: pf
189-190ºC; RMN ^{1}H (CF_{3}COOD) \delta 0,81
(sa, 3H), 1,24 (s, 23H), 1,57 (m, 2H), 3,37 (m, 2H),
4,54-4,58 (m, 1H), 4,73-4,78 (m,
2H); RMN ^{13}C (CF_{3}COOD) \delta 14,43, 24,16, 28,34,
30,21, 30,69, 31,01, 31,17, 31,22, 31,27, 33,62, 43,27, 56,96,
66,16, 167,60; RMN ^{31}P (CF_{3}COOD) \delta 17,93 (1P); MS
m/z 379 (M-H)^{-}; IR (KBr) 3318, 2923,
2852, 1671, 1657, 1563, 1475, 1242, 1055 cm^{-1}; análisis
calculado para C_{17}H_{37}N_{2}O_{5}P: C, 53,67; H, 9,80;
N, 7,36. Encontrado: C, 53,40; H, 9,73; N, 7,31.
Compuesto
56a
Se añadió un gran exceso de anhídrido acético a
una muestra de 56 (20 mg, 0,052 mmol) en 0,5 ml de piridina. Se
dejó que la mezcla se agitase a temperatura ambiente a lo largo de
toda la noche. Se retiró el exceso de piridina y de anhídrido
acético en un evaporador rotatorio. La mezcla resultante se agitó
con 20 ml de solución acuosa de HCl. La mezcla acídica se extrajo
con EtOAc (2 x 25 ml). La capa de EtOAc se lavó con agua (2 x 25
ml) y solución salina saturada (2 x 25 ml). La porción orgánica fue
secada sobre NaSO_{4} y filtrada. Se concentró el eluato en
condiciones de presión reducida, obteniéndose 15 mg (71%) de 56a en
forma de sólido gomoso: RMN ^{1}H (CD_{3}OD) \delta 0,89 (t,
J = 6,3 Hz, 3H), 1,27 (s, 22H), 1,99-2,02 (m, 3H),
3,15-3,20 (m, 2H), 4,10-4,28 (m,
2H), 4,54-4,62 (m, 1H); RMN ^{13}C
(CDCl_{3}/CD_{3}OD) 13,48, 16,19, 22,23, 26,50, 28,91, 29,21,
31,48, 30,21, 31,01, 31,17, 31,22, 31,27, 33,62, 43,27, 56,96,
66,16, 163,02, 174,96; IR (KBr) 3316, 2923, 2853, 1671, 1657, 1560,
1467, 1247, 1059 cm^{-1}.
Compuesto
57
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (cantidad catalítica) a una solución del compuesto 52 (117
mg, 0,164 mmol) en EtOH (15 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación
durante 4 horas a 50 psi (3,44 bares). Transcurridas 4 horas, se
determinó, mediante cromatografía en capa fina, que la reacción
había concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite
y se concentró el eluato en condiciones de presión reducida,
obteniéndose 70 mg (98%) de 57 en forma de polvo de color blanco: pf
190-192ºC; RMN ^{1}H (CF_{3}COOD) \delta 0,81
(t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,25 (s, 31H), 1,58 (m, 2H),
3,34-3,44 (m, 2H), 4,49-4,59 (m,
1H), 4,71-4,81 (m, 2H); RMN ^{13}C (CF_{3}COOD)
\delta 14,70, 24,43, 28,60, 30,46, 30,95, 31,28, 31,31, 31,44,
31,48, 31,55, 33,89, 43,53, 57,12, 57,21, 66,35, 167,85; MS m/z 435
(M-H)^{-}; IR (KBr) 3325, 2922, 2852, 1674,
1655, 1560, 1472, 1045 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{21}H_{45}N_{2}O_{5}P: C, 57,77; H, 10,39; N, 6,42.
Encontrado: C, 57,61; H, 10,22; N, 6,25.
Compuesto
58
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (cantidad catalítica) a una solución del compuesto 53 (40
mg, 0,054 mmol) en EtOH (15 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación
durante 4 horas a 50 psi (3,44 bares). Transcurridas 4 horas, se
determinó, mediante cromatografía en capa fina, que la reacción
había concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite
y se concentró el eluato en condiciones de presión reducida,
obteniéndose 22 mg (88%) de 58 en forma de polvo de color blanco: pf
187-190ºC; RMN ^{1}H (CF_{3}COOD) \delta
0,80-0,82 (m, 3H), 1,25 (m, 20H),
1,77-1,84 (m, 2H), 4,20 (t, J = 6,0 Hz, 2H),
4,64-4,74 (m, 1H), 4,90-4,91 (m,
2H), 7,04-7,07 (d, J_{o} = 9,0 Hz, 2H),
7,32-7,35 (d, J_{o} = 9,0 Hz, 2H); RMN ^{13}C
(CF_{3}COOD) \delta 14,81, 24,54, 27,57, 30,62, 31,19, 31,38,
31,46, 31,52, 31,60, 31,65, 33,99, 57,70, 66,35, 73,66, 119,32,
126,55, 131,25, 158,87, 167,06; MS m/z 471
(M-H)^{-}; IR (KBr) 3325, 2923, 2852, 1665,
1553, 1515, 1469, 1240, 1046 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{23}H_{41}N_{2}O_{6}P\cdot0,5CH_{3}OH\cdot0,5CHCl_{3}:
C, 52,58; H, 8,00; N, 5,11. Encontrado: C, 52,89; H, 7,83; N,
5,29.
Compuesto
59
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (cantidad catalítica) a una solución del compuesto 54 (125
mg, 0,219 mmol) en EtOH (15 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación
durante 2 horas a 45 psi (3,10 bares). Transcurridas 2 horas, se
determinó, mediante cromatografía en capa fina, que la reacción
había concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite
y se concentró el eluato en condiciones de presión reducida,
obteniéndose 82 mg (96%) de 59 en forma de polvo de color blanco: pf
199-202ºC; RMN ^{1}H (CF_{3}COOD) \delta 3,93
(m, 3H), 4,65-4,75 (m, 1H),
4,88-4,94 (m, 2H), 7,01-7,04 (d, Jo
= 9,0 Hz, 2H), 7,31-7,34 (d, Jo = 9,0 Hz, 2H); RMN
^{13}C (CDCl_{3}) \delta 57,60, 58,00, 66,54, 117,69, 126,64,
131,07, 159,62, 167,07; MS m/z 289
(M-H)^{-}; IR (KBr) 3317, 2961, 1680, 1565,
1515, 1478, 1236, 1045 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{10}H_{15}N_{2}O_{6}P: C, 41,39; H, 5,21; N, 9,65.
Encontrado: C, 41,25; H, 5,35; N, 9,73.
Los utensilios de vidrio que se emplearon se
secaron a la llama y se enfriaron hasta que alcanzaron la
temperatura ambiente en atmósfera de argón. Se lavó el alcohol de
partida con piridina anhidra (tres veces) y luego se lo secó (en
condiciones de alto vacío) durante 48 horas. La reacción se llevó a
cabo en una atmósfera de argón. El THF y el CH_{2}Cl_{2} fueron
recién destilados antes de usarlos.
Compuesto
63
Se añadió 1H-tetrazol (229 mg,
3,26 mmol) al alcohol dl-batílico de partida (60, 225 mg,
0,652 mmol) lavado con piridina. A esta mezcla se le añadió una
mezcla 1:1 de THF/CH_{2}Cl_{2} recién destilados (50 ml).
Transcurridos 10 minutos, se añadió dibencildiisopropil
fosforamidato (1,12 gr, 3,26 mmol) y la reacción fue agitada en
atmósfera de argón durante 90 minutos. La cromatografía en capa fina
realizada a la mezcla de reacción reveló la formación del producto.
Esta mezcla fue enfriada hasta que alcanzó 0ºC (mediante baño de
hielo), y se le añadió un gran exceso de ácido peracético. Se agitó
la mezcla durante otros 35 minutos y luego se añadió metabisulfito
sódico para neutralizar el exceso de ácido peracético. Se retiraron
el THF y el CH_{2}Cl_{2} en condiciones de presión reducida. El
concentrado resultante fue tratado con EtOAc (70 ml) y luego fue
lavado con metabisulfito sódico (2 x 25 ml), NaHCO_{3} (2 x 30
ml), agua (2 x 30 ml) y solución salina saturada (2 x 30 ml). La
porción orgánica fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada a presión
reducida. El residuo fue sometido a cromatografía en columna flash,
eluyendo con hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 303 mg
(53%) de 63 en forma de aceite claro: RMN ^{1}H (CDCl_{3})
\delta 0,86 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,24 (ma, 28H),
1,33-1,35 (m, 2H), 1,45 (m, 2H),
3,29-3,36 (m, 2H), 3,48-3,50 (d, J =
5,2 Hz, 2H), 4,04-4,22 (m, 2H), 4,60 (m, 1H), 5,00
(m, 8H), 7,27-7,33 (m, 20H); ^{13}C (CDCl_{3})
\delta 14,05, 18,96, 22,62, 25,95, 29,29, 29,41, 29,49, 29,53,
29,59, 29,63, 31,85, 46,48, 66,58, 69,20, 69,23, 69,28, 69,36,
71,75, 75,37, 127,76, 127,82, 127,86, 127,88, 127,94, 128,36,
128,45, 128,49, 128,61, 128,62, 135,46, 135,54, 135,59, 135,65,
135,68, 135,75, 135,79; MS m/z 866 (M+H)^{+}.
Compuesto
64
Se añadió 1H-tetrazol (645 mg,
9,2 mmol) al
dl-3-O-n-dodecil-1,2-propanodiol
de partida (61, 400 mg, 1,5 mmol) lavado con piridina. A esta
mezcla se le añadió una mezcla 1:1 de THF/CH_{2}Cl_{2} recién
destilados (40 ml). Transcurridos 10 minutos, se añadió
dibencil-diisopropil fosforamidato (3,18 gr, 9,2
mmol), y la reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90
minutos. La cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de
reacción reveló la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada
hasta que alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo), y se le añadió un
gran exceso de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35
minutos y luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el
exceso de ácido peracético. Se retiraron el THF y el
CH_{2}Cl_{2} en condiciones de presión reducida. El concentrado
resultante fue tratado con EtOAc (80 ml) y luego fue lavado con
metabisulfito sódico (2 x 35 ml), NaHCO_{3} (2 x 40 ml), agua (2 x
30 ml) y solución salina saturada (2 x 30 ml). La porción orgánica
fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada a presión reducida. El
residuo fue sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo con
hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 100 mg
(<10%) de 64 en forma de aceite claro: RMN ^{1}H (CDCl_{3})
\delta 0,86 (t, J = 6,3 Hz, 3H), 1,23 (ma, 18H), 1,46 (m, 2H),
3,13-3,36 (m, 2H), 3,49-3,51 (d, J =
5,2 Hz, 2H), 4,03-4,23 (m, 2H), 4,59 (m, 1H), 5,01
(m, 8H), 7,26-7,34 (m, 20H); ^{13}C (CDCl_{3})
\delta 14,11, 22,68, 26,01, 29,35, 29,47, 29,54, 29,59, 29,63,
29,66, 31,91, 69,01, 69,06, 69,26, 69,30, 69,34, 69,42, 69,62,
71,83, 77,21, 127,83, 127,89, 127,94, 127,95, 128,44, 128,52,
128,56, 135,64, 135,74, 135,85; IR (NaCl, puro) 3427, 1276, 1000,
885, 499 cm^{-1}; MS m/z 781 (M+H)^{+}, m/z 803
(M+Na)^{+}.
Compuesto
65
Se añadió 1H-tetrazol (664 mg,
9,47 mmol) al
dl-3-O-n-hexadecil-1,2-propanodiol
de partida (62, 500 mg, 1,57 mmol) lavado con piridina. A esta
mezcla se le añadió una mezcla 1:1 de THF/CH_{2}Cl_{2} recién
destilados (50 ml). Transcurridos 10 minutos, se añadió
dibencildiisopropil fosforamidato (3,27 gr, 9,47 mmol), y la
reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90 minutos. La
cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de reacción reveló
la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada hasta que
alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo), y se le añadió un gran exceso
de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35 minutos y
luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el exceso de
ácido peracético. Se retiraron el THF y el CH_{2}Cl_{2} en
condiciones de presión reducida. El concentrado resultante fue
tratado con EtOAc (80 ml) y luego fue lavado con metabisulfito
sódico (2 x 35 ml), NaHCO_{3} (2 x 40 ml), agua (2 x 30 ml) y
solución salina saturada (2 x 30 ml). La porción orgánica fue secada
sobre NaSO_{4} y concentrada a presión reducida. El residuo fue
sometido a cromatografía en columna flash, eluyendo con
hexanos/EtOAc de composición diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 205 mg
(15%) de 65 en forma de aceite claro: RMN ^{1}H (CDCl_{3})
\delta 0,87 (t, J = 6,3 Hz, 3H), 1,25 (ma, 26H), 1,46 (m, 2H),
3,30-3,42 (m, 2H), 3,49-3,51 (d, J =
5,2 Hz, 2H), 3,97-4,23 (m, 2H), 4,60 (m, 1H), 5,01
(m, 8H), 7,26-7,35 (m, 20H); ^{13}C (CDCl_{3})
\delta 14,11, 22,68, 26,00, 29,35, 29,47, 29,54, 29,59, 29,64,
29,68, 31,91, 69,00, 69,06, 69,26, 69,29, 69,34, 69,41, 71,82,
71,74, 75,52, 75,60, 77,20, 126,97, 127,82, 127,88, 127,93, 127,95,
127,99, 128,43, 128,51, 128,55, 128,60, 135,63, 135,73, 135,79,
135,83; IR (NaCl, puro) 3423, 1269, 1016, 736 cm^{-1}; MS m/z 837
(M+H)^{+}, m/z 859 (M+Na)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
66
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (cantidad catalítica) a una solución del compuesto 63 (135
mg, 0,156 mmol) en EtOH (15 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación
durante 4 horas a 60 psi (4,13 bares). Transcurridas 4 horas, se
determinó, mediante cromatografía en capa fina, que la reacción
había concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite
y se concentró el eluato en condiciones de presión reducida,
obteniéndose 70 mg (89%) de 66 en forma de cera clara: RMN ^{1}H
(CD_{3}OD) \delta 0,89 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,28 (s, 30H), 1,55
(m, 2H), 3,45-3,50 (m, 2H),
3,62-3,64 (m, 2H), 4,00-4,16 (m,
2H), 4,47 (m, 1H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD) \delta 14,43, 19,30,
23,73, 27,20, 30,47, 30,64, 30,78, 33,07, 72,80; MS m/z 503
(M-H)^{-}; IR (NaCl, puro) 1011
cm^{-1}.
Compuesto
67
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (cantidad catalítica) a una solución del compuesto 64 (70
mg, 0,089 mmol) en EtOH (15 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación
durante 4 horas a 60 psi (4,13 bares). Transcurridas 4 horas, se
determinó, mediante cromatografía en capa fina, que la reacción
había concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite
y se concentró el eluato en condiciones de presión reducida,
obteniéndose 35 mg (94%) de 67 en forma de cera clara: RMN ^{1}H
(CD_{3}OD) \delta 0,79 (t, J = 6,7 Hz, 3H), 1,90 (s, 18H), 1,46
(m, 2H), 3,34-3,41 (m, 2H),
3,49-3,73 (m, 2H), 3,78-4,05 (m,
2H), 4,47 (m, 1H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD) \delta 14,43, 23,71,
23,74, 27,20, 30,49, 30,64, 30,76, 30,81, 33,08, 66,80, 72,79; MS
m/z 419 (M-H)^{-}; IR (NaCl, puro) 1008
cm^{-1}.
Compuesto
68
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (cantidad catalítica) a una solución del compuesto 65 (138
mg, 0,164 mmol) en EtOH (15 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación
durante 4 horas a 60 psi (4,13 bares). Transcurridas 4 horas, se
determinó, mediante cromatografía en capa fina, que la reacción
había concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite
y se concentró el eluato en condiciones de presión reducida,
obteniéndose 75 mg (96%) de 68 en forma de cera de color blanco: RMN
^{1}H (CD_{3}OD) \delta 0,89 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,28 (s,
23H), 1,56 (m, 2H), 3,43-3,50 (m, 2H),
3,58-3,65 (m, 2H), 3,89-4,16 (m,
2H), 4,47 (m, 1H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD) \delta 14,44, 23,74,
27,20, 30,48, 30,64, 30,80, 33,08, 72,80; MS m/z 475
(M-H)^{-}; IR (NaCl, puro) 1011
cm^{-1}.
Los utensilios de vidrio que se emplearon se
secaron a la llama y se enfriaron hasta que alcanzaron la
temperatura ambiente en atmósfera de argón. Se lavó el alcohol de
partida con piridina anhidra (tres veces) y luego se lo secó (en
condiciones de alto vacío) durante 48 horas. La reacción se llevó a
cabo en una atmósfera de argón. El THF y el CH_{2}Cl_{2} fueron
recién destilados antes de usarlos.
Compuesto
77
Se añadió 1H-tetrazol (1,01 gr,
14,5 mmol) a la monomiristina de partida (69, 800 mg, 2,6 mmol)
lavada con piridina. A esta mezcla se le añadió THF recién
destilado (45 ml). Transcurridos 10 minutos, se añadió
dibencildiisopropil fosforamidato (5,02 gr, 14,5 mmol), y la
reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90 minutos. La
cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de reacción reveló
la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada hasta que
alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo), y se le añadió un gran exceso
de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35 minutos, y
luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el exceso de
ácido peracético. Se retiró el THF en condiciones de presión
reducida. El concentrado resultante fue tratado con EtOAc (100 ml),
y luego fue lavado con metabisulfito sódico (2 x 50 ml), NaHCO_{3}
(2 x 75 ml), agua (2 x 50 ml) y solución salina saturada (2 x 50
ml). La porción orgánica fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada
a presión reducida. El residuo fue sometido a cromatografía en
columna flash, eluyendo con hexanos/EtOAc de composición
diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 600 mg
(28%) de 77 en forma de aceite claro: RMN ^{1}H (CDCl_{3})
\delta 0,87 (t, J = 6,3 Hz, 3H), 1,25 (ma, 20H), 1,53 (m, 2H),
2,17-2,32 (m, 2H), 3,96-4,24 (m,
4H), 4,61-4,70 (m, 1H), 4,99-5,08
(m, 8H), 7,29-7,35 (m, 20H); ^{13}C (CDCl_{3})
\delta 14,10, 22,67, 24,70, 29,08, 29,23, 29,33, 29,44, 29,59,
29,62, 29,66, 31,90, 33,86, 64,24, 65,82, 69,41, 69,46, 69,48,
69,53, 69,57, 77,20, 127,85, 127,91, 127,98, 127,99, 128,04,
128,57, 128,59, 128,70, 128,71, 135,50, 135,59, 173,09; IR (NaCl,
puro) 3422, 1742, 1457, 1274, 1035, 1001 cm^{-1}; MS m/z 8823
(M+H)^{+}, m/z 845 (M+Na)^{+}.
Compuesto
78
Se añadió 1H-tetrazol (970 mg,
13,9 mmol) a la monopentadecanoína de partida (70, 800 mg, 2,5 mmol)
lavada con piridina. A esta mezcla se le añadió THF recién
destilado (45 ml). Transcurridos 10 minutos, se añadió
dibencildiisopropil fosforamidato (4,80 gr, 13,9 mmol), y la
reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90 minutos. La
cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de reacción reveló
la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada hasta que
alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo), y se le añadió un gran exceso
de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35 minutos, y
luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el exceso de
ácido peracético. Se retiró el THF en condiciones de presión
reducida. El concentrado resultante fue tratado con EtOAc (100 ml),
y luego fue lavado con metabisulfito sódico (2 x 50 ml), NaHCO_{3}
(2 x 100 ml), agua (2 x 50 ml) y solución salina saturada (2 x 50
ml). La porción orgánica fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada
a presión reducida. El residuo fue sometido a cromatografía en
columna flash, eluyendo con hexanos/EtOAc de composición
diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 741 mg
(35%) de 78 en forma de aceite claro: RMN ^{1}H (CDCl_{3})
\delta 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,25 (ma, 22H), 1,53 (m, 2H),
2,17-2,32 (m, 2H), 3,96-4,24 (m,
4H), 4,61-4,70 (m, 1H), 4,99-5,07
(m, 8H), 7,29-7,35 (m, 20H); ^{13}C (CDCl_{3})
\delta 14,09, 22,66, 24,69, 29,08, 29,23, 29,33, 29,44, 29,59,
29,62, 29,65, 31,89, 33,85, 64,23, 65,86, 69,40, 69,46, 69,48,
69,53, 69,56, 77,20, 127,84, 127,90, 127,97, 127,98, 128,03,
128,56, 128,59, 128,69, 128,71, 135,50, 135,59, 173,09; IR (NaCl,
puro) 3421, 1742, 1457, 1275, 1035, 1014, 1001 cm^{-1}; MS m/z
837 (M+H)^{+}, m/z 859 (M+Na)^{+}.
Compuesto
79
Se añadió 1H-tetrazol (1,00 gr,
14,2 mmol) a la monopalmitina de partida (71, 800 mg, 2,4 mmol)
lavada con piridina. A esta mezcla se le añadió THF recién
destilado (45 ml). Transcurridos 10 minutos, se añadió
dibencildiisopropil fosforamidato (4,90 gr, 14,2 mmol), y la
reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90 minutos. La
cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de reacción reveló
la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada hasta que
alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo), y se le añadió un gran exceso
de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35 minutos, y
luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el exceso de
ácido peracético. Se retiró el THF en condiciones de presión
reducida. El concentrado resultante fue tratado con EtOAc (100 ml)
y luego fue lavado con metabisulfito sódico (2 x 50 ml), NaHCO_{3}
(2 x 100 ml), agua (2 x 50 ml) y solución salina saturada (2 x 50
ml). La porción orgánica fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada
a presión reducida. El residuo fue sometido a cromatografía en
columna flash, eluyendo con hexanos/EtOAc de composición
diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 786 mg
(38%) de 79 en forma de aceite claro: RMN ^{1}H (CDCl_{3})
\delta 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,25 (ma, 24H), 1,53 (m, 2H),
2,17-2,32 (m, 2H), 3,96-4,24 (m,
4H), 4,61-4,70 (m, 1H), 4,99-5,08
(m, 8H), 7,29-7,35 (m, 20H); ^{13}C (CDCl_{3})
\delta 14,09, 22,66, 24,71, 29,09, 29,23, 29,33, 29,45, 29,60,
29,63, 29,67, 31,90, 33,87, 62,23, 62,30, 65,89, 69,43, 69,48,
69,50, 69,55, 69,58, 77,20, 126,96, 127,85, 127,91, 127,98, 128,04,
128,56, 128,59, 128,64, 128,71, 135,52, 135,61, 173,07; IR (NaCl,
puro) 3421, 1742, 1457, 1273, 1035, 1016, 1001 cm^{-1}; MS m/z
851 (M+H)^{+}, m/z 873 (M+Na)^{+}.
Compuesto
80
Se añadió 1H-tetrazol (980 mg,
13,9 mmol) a la monoheptadecanoína de partida (72, 800 mg, 2,32
mmol) lavada con piridina. A esta mezcla se le añadió THF recién
destilado (40 ml). Transcurridos 10 minutos, se añadió
dibencildiisopropil fosforamidato (4,81 gr, 13,9 mmol), y la
reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90 minutos. La
cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de reacción reveló
la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada hasta que
alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo), y se le añadió un gran exceso
de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35 minutos, y
luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el exceso de
ácido peracético. Se retiró el THF en condiciones de presión
reducida. El concentrado resultante fue tratado con EtOAc (100 ml)
y luego fue lavado con metabisulfito sódico (2 x 50 ml), NaHCO_{3}
(2 x 100 ml), agua (2 x 50 ml) y solución salina saturada (2 x 50
ml). La porción orgánica fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada
a presión reducida. El residuo fue sometido a cromatografía en
columna flash, eluyendo con hexanos/EtOAc de composición
diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 1,48 g
(74%) de 80 en forma de aceite claro: RMN ^{1}H (CDCl_{3})
\delta 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,23-1,25 (ma,
26H), 1,53 (m, 2H), 2,20 (t, J = 7,1 Hz, 2H),
4,02-4,24 (m, 4H), 4,66 (m, 1H),
4,99-5,05 (m, 8H), 7,29-7,35 (m,
20H); ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 14,10, 22,66, 24,69, 29,07,
29,23, 29,33, 29,44, 29,59, 29,63, 29,66, 31,89, 33,84, 62,21,
62,27, 65,85, 69,40, 69,45, 69,47, 69,52, 69,56, 74,04, 74,23,
77,20, 127,83, 127,87, 127,96, 127,97, 128,53, 128,55, 128,57,
128,59, 135,47, 135,56, 173,07; IR (NaCl, puro) 3483, 1743, 1457,
1281, 1035, 1013, 1000 cm^{-1}; MS m/z 865 (M+H)^{+}, m/z
887 (M+Na)^{+}.
Compuesto
81
Se añadió 1H-tetrazol (1,00 gr,
14,2 mmol) a la monoestearina de partida (73, 800 mg, 2,32 mmol)
lavada con piridina. A esta mezcla se le añadió THF recién
destilado (40 ml). Transcurridos 10 minutos, se añadió
dibencildiisopropil fosforamidato (4,92 gr, 14,2 mmol), y la
reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90 minutos. La
cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de reacción reveló
la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada hasta que
alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo), y se le añadió un gran exceso
de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35 minutos y
luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el exceso de
ácido peracético. Se retiró el THF en condiciones de presión
reducida. El concentrado resultante fue tratado con EtOAc (100 ml)
y luego fue lavado con metabisulfito sódico (2 x 50 ml), NaHCO_{3}
(2 x 100 ml), agua (2 x 50 ml) y solución salina saturada (2 x 50
ml). La porción orgánica fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada
a presión reducida. El residuo fue sometido a cromatografía en
columna flash, eluyendo con hexanos/EtOAc de composición
diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 870 mg
(45%) de 81 en forma de aceite claro: RMN ^{1}H (CDCl_{3})
\delta 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,23-1,25 (ma,
28H), 1,53 (m, 2H), 2,20 (t, J = 7,2 Hz, 2H),
3,97-4,24 (m, 4H), 4,66 (m, 1H),
4,99-5,07 (m, 8H), 7,29-7,35 (m,
20H); ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 14,09, 22,66, 24,69, 29,08,
29,23, 29,33, 29,45, 29,59, 29,63, 29,67, 31,89, 33,85, 62,22,
62,28, 64,23, 65,87, 68,69, 69,23, 69,42, 69,50, 69,54, 69,58,
74,07, 74,25, 127,60, 127,84, 127,90, 127,98, 128,03, 128,54,
128,56, 128,58, 128,60, 128,71, 135,47, 135,57, 173,08; IR (NaCl,
puro) 3421, 1742, 1457, 1273, 1251, 1216, 1035, 1016, 1000
cm^{-1}; MS m/z 879 (M+H)^{+}, m/z 901
(M+Na)^{+}.
Compuesto
82
Se añadió 1H-tetrazol (977 mg,
13,9 mmol) a la monononadecanoína de partida (74, 800 mg, 2,1 mmol)
lavada con piridina. A esta mezcla se le añadió THF recién
destilado (40 ml). Transcurridos 10 minutos, se añadió
dibencildiisopropil fosforamidato (4,81 gr, 13,9 mmol), y la
reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90 minutos. La
cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de reacción reveló
la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada hasta que
alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo), y se le añadió un gran exceso
de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35 minutos y
luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el exceso de
ácido peracético. Se retiró el THF en condiciones de presión
reducida. El concentrado resultante fue tratado con EtOAc (100 ml),
y luego fue lavado con metabisulfito sódico (2 x 50 ml), NaHCO_{3}
(2 x 125 ml), agua (2 x 75 ml) y solución salina saturada (2 x 50
ml). La porción orgánica fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada
a presión reducida. El residuo fue sometido a cromatografía en
columna flash, eluyendo con hexanos/EtOAc de composición
diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 1,47 g
(78%) de 82 en forma de aceite claro: RMN ^{1}H (CDCl_{3})
\delta 0,87 (t, J = 6,3 Hz, 3H), 1,23-1,25 (ma,
30H), 1,53 (m, 2H), 2,20 (t, J = 7,2 Hz, 2H),
4,02-4,24 (m, 4H), 4,66 (m, 1H),
4,99-5,03 (m, 8H), 7,29-7,36 (m,
20H); ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 14,08, 22,65, 24,67, 29,06,
29,22, 29,32, 29,43, 29,58, 29,61, 29,66, 31,88, 33,83, 62,25,
65,84, 69,38, 69,46, 69,51, 69,54, 74,03, 74,10, 74,15, 74,22,
77,20, 127,82, 127,88, 127,96, 128,53, 128,56, 135,45, 135,55,
173,06; IR (NaCl, puro) 3483, 1743, 1457, 1273, 1282, 1216, 1035,
1013 cm^{-1}; MS m/z 893 (M+H)^{+}, m/z 915
(M+Na)^{+}.
Compuesto
83
Se añadió 1H-tetrazol (1,00 gr,
14,2 mmol) a la monoaraquidina de partida (75, 800 mg, 2,06 mmol)
lavada con piridina. A esta mezcla se le añadió THF recién
destilado (40 ml). Transcurridos 10 minutos, se añadió
dibencildiisopropil fosforamidato (4,92 gr, 14,2 mmol), y la
reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90 minutos. La
cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de reacción reveló
la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada hasta que
alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo), y se le añadió un gran exceso
de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35 minutos y
luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el exceso de
ácido peracético. Se retiró el THF en condiciones de presión
reducida. El concentrado resultante fue tratado con EtOAc (100 ml)
y luego fue lavado con metabisulfito sódico (2 x 50 ml), NaHCO_{3}
(2 x 125 ml), agua (2 x 75 ml) y solución salina saturada (2 x 50
ml). La porción orgánica fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada
a presión reducida. El residuo fue sometido a cromatografía en
columna flash, eluyendo con hexanos/EtOAc de composición
diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 1,39 g
(74%) de 83 en forma de aceite claro: RMN ^{1}H (CDCl_{3})
\delta 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,23-1,25 (ma,
32H), 1,53 (m, 2H), 2,20 (t, J = 7,2 Hz, 2H),
4,02-4,24 (m, 4H), 4,66 (m, 1H),
4,99-5,05 (m, 8H), 7,29-7,36 (m,
20H); ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 14,09, 22,65, 24,69, 29,07,
29,23, 29,33, 29,44, 29,59, 29,63, 29,67, 31,89, 33,84, 62,21,
62,27, 65,86, 69,40, 69,45, 69,48, 69,52, 69,56, 74,05, 74,12,
74,16, 74,24, 77,20, 127,83, 127,89, 127,97, 128,53, 128,55,
128,57, 128,59, 135,47, 135,56, 173,07; IR (NaCl, puro) 3483, 1743,
1457, 1273, 1282, 1216, 1035, 1012, 1000 cm^{-1}; MS m/z 907
(M+H)^{+}, m/z 929 (M+Na)^{+}.
Compuesto
84
Se añadió 1H-tetrazol (1,00 gr,
14,2 mmol) a la monobehenina de partida (76, 800 mg, 1,92 mmol)
lavada con piridina. A esta mezcla se le añadió THF recién
destilado (40 ml). Transcurridos 10 minutos, se añadió
dibencildiisopropil fosforamidato (5,14 gr, 14,8 mmol), y la
reacción fue agitada en atmósfera de argón durante 90 minutos. La
cromatografía en capa fina realizada a la mezcla de reacción reveló
la formación del producto. Esta mezcla fue enfriada hasta que
alcanzó 0ºC (mediante baño de hielo), y se le añadió un gran exceso
de ácido peracético. Se agitó la mezcla durante otros 35 minutos, y
luego se añadió metabisulfito sódico para neutralizar el exceso de
ácido peracético. Se retiró el THF en condiciones de presión
reducida. El concentrado resultante fue tratado con EtOAc (100 ml)
y luego fue lavado con metabisulfito sódico (2 x 50 ml), NaHCO_{3}
(2 x 125 ml), agua (2 x 75 ml) y solución salina saturada (2 x 50
ml). La porción orgánica fue secada sobre NaSO_{4} y concentrada
a presión reducida. El residuo fue sometido a cromatografía en
columna flash, eluyendo con hexanos/EtOAc de composición
diversa.
Se mezclaron las fracciones adecuadas y se las
concentró en condiciones de vacío hasta secarlas, obteniendo 1,27 g
(71%) de 84 en forma de un compuesto similar a una cera, de color
blanco: RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 3H),
1,23-1,25 (ma, 36H), 1,53 (m, 2H), 2,20 (t, J = 7,2
Hz, 2H), 4,02-4,24 (m, 4H), 4,66 (m, 1H),
4,99-5,03 (m, 8H), 7,29-7,36 (m,
20H); ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 14,08, 22,65, 24,68, 29,07,
29,22, 29,32, 29,44, 29,59, 29,62, 29,66, 31,88, 33,84, 62,20,
62,26, 65,85, 69,40, 69,45, 69,48, 69,53, 69,57, 74,05, 74,16,m
[sic] 74,24, 77,20, 127,83, 127,88, 127,96, 127,97, 128,30, 128,52,
128,54, 128,57, 128,58, 135,46, 135,55, 173,07; MS m/z 935
(M+H)^{+}, m/z 957 (M+Na)^{+}.
Compuesto
85
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (cantidad catalítica) a una solución del compuesto 77 (385
mg, 0,468 mmol) en EtOH (15 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación
durante 4 horas a 60 psi (4,13 bares). Transcurridas 4 horas, se
determinó, mediante cromatografía en capa fina, que la reacción
había concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite
y se concentró el eluato en condiciones de presión reducida,
obteniéndose 210 mg (98%) de 85 en forma de cera de color blanco:
RMN ^{1}H (CD_{3}OD) \delta 0,89 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,28
(s, 20H), 1,56-1,63 (m, 2H),
2,24-2,38 (m, 2H), 3,93-4,42 (m,
4H), 4,59 (m, 1H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD) \delta 14,44, 23,73,
26,09, 30,71, 30,23, 30,43, 30,47, 30,61, 30,75, 33,07, 34,80,
34,94, 61,90, 61,96, 63,96, 63,70, 66,24, 74,33, 77,51, 175,02; MS
m/z 461 (M-H)^{-}; IR (NaCl, puro) 3386,
1702, 1216, 1019 cm^{-1}.
Compuesto
86
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (cantidad catalítica) a una solución del compuesto 78 (451
mg, 0,538 mmol) en EtOH (15 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación
durante 4 horas a 60 psi (4,13 bares). Transcurridas 4 horas, se
determinó, mediante cromatografía en capa fina, que la reacción
había concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite
y se concentró el eluato en condiciones de presión reducida,
obteniéndose 250 mg (97%) de 86 en forma de cera de color blanco:
RMN ^{1}H (CD_{3}OD) \delta 0,89 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,28
(s, 22H), 1,58 (m, 2H), 2,24-2,38 (m, 2H),
3,97-4,21 (m, 4H), 4,38 (m, 1H); RMN ^{13}C
(CD_{3}OD) \delta 14,44, 23,74, 26,05, 30,16, 30,36, 30,48,
30,57, 30,76, 33,08, 35,11, 61,36, 63,70, 63,90, 66,24, 67,77,
70,22, 77,33, 77,40, 77,51, 175,63; MS m/z 475
(M-H)^{-}; IR (NaCl, puro) 3380, 1728,
1216, 1031 cm^{-1}.
Compuesto
87
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (610 mg) a una solución del compuesto 79 (561 mg, 0,659
mmol) en EtOH (15 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación durante 4
horas a 60 psi (4,13 bares). Transcurridas 4 horas, se determinó,
mediante cromatografía en capa fina, que la reacción había
concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite y se
concentró el eluato en condiciones de presión reducida, obteniéndose
300 mg (92%) de 87 en forma de cera de color blanco: RMN ^{1}H
(CD_{3}OD) \delta 0,89 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,28 (s, 24H),
1,56-1,63 (m, 2H), 2,24-2,38 (m,
2H), 3,95-4,40 (m, 4H), 4,39 (m, 1H); RMN ^{13}C
(CD_{3}OD) \delta 14,43, 23,73, 25,89, 26,05, 26,09, 30,15,
30,23, 30,36, 30,44, 30,47, 30,56, 30,61, 30,67, 30,75, 33,07,
34,08, 34,94, 35,11, 61,36, 64,00, 66,22, 67,74, 70,22, 77,33,
77,40, 77,51, 175,03; MS m/z 489 (M-H)^{-};
IR (NaCl, puro) 3357, 1729, 1216, 1029 cm^{-1}.
Compuesto
88
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (724 mg) a una solución del compuesto 80 (636 mg, 0,736
mmol) en EtOH (15 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación durante 4
horas a 60 psi (4,13 bares). Transcurridas 4 horas, se determinó,
mediante cromatografía en capa fina, que la reacción había
concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite y se
concentró el eluato en condiciones de presión reducida, obteniéndose
365 mg (98%) de 88 en forma de cera de color blanco: RMN ^{1}H
(CD_{3}OD) \delta 0,89 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,28 (s, 26H),
1,56-1,63 (m, 2H), 3,96-4,17 (m,
4H), 4,22-4,42 (m, 1H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD)
\delta 14,54, 23,73, 25,90, 26,10, 30,16, 30,24, 30,36, 30,43,
30,47, 30,56, 30,61, 30,76, 33,07, 34,81, 34,95, 61,37, 61,92,
63,97, 66,26, 67,70, 67,78, 70,06, 74,42, 77,46, 175,04; MS m/z 503
(M-H)^{-}; IR (NaCl, puro) 3357, 1710,
1216, 1032 cm^{-1}; análisis calculado para
C_{20}H_{42}O_{10}P_{2} \cdot 1H_{2}O: C, 45,97; H,
8,49. Encontrado: C, 46,32; H, 8,73.
\newpage
Compuesto
89
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (617 mg) a una solución del compuesto 81 (530 mg, 0,603
mmol) en EtOH (15 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación durante 4
horas a 60 psi (4,13 bares). Transcurridas 4 horas, se determinó,
mediante cromatografía en capa fina, que la reacción había
concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite y se
concentró el eluato en condiciones de presión reducida, obteniéndose
305 mg (97%) de 89 en forma de cera de color blanco: RMN ^{1}H
(CD_{3}OD) \delta 0,89 (t, j = 6,3 Hz, 3H), 1,28 (s, 28H),
1,56-1,61 (m, 2H), 2,42-2,38 (m,
2H), 3,91-4,17 (m, 4H), 4,24-4,42
(m, 1H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD) \delta 14,43, 23,74, 25,90,
26,06, 26,10, 30,16, 30,24, 30,36, 30,47, 30,57, 30,61, 30,67,
30,76, 33,08, 34,81, 34,95, 35,11, 61,37, 63,72, 66,26, 67,68,
67,75, 70,25, 77,48, 175,04; MS m/z 517
(M-H)^{-}; IR (NaCl, puro) 3388, 1731,
1216, 1020 cm^{-1}.
Compuesto
90
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (1,00 gr) a una solución del compuesto 82 (952 mg, 1,06
mmol) en EtOH (25 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación durante 4
horas a 60 psi (4,13 bares). Transcurridas 4 horas, se determinó,
mediante cromatografía en capa fina, que la reacción había
concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite y se
concentró el eluato en condiciones de presión reducida, obteniéndose
555 mg (98%) de 90 en forma de cera de color blanco: RMN ^{1}H
(CD_{3}OD) \delta 0,89 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,27 (s, 29H),
1,56-1,63 (m, 2H), 2,24-2,38 (m,
2H), 4,06-4,17 (m, 2H), 4,22-4,42
(m, 2H), 4,59 (m, 1H); RMN ^{13}C (CD_{3}OD) \delta 14,44,
23,74, 25,90, 26,06, 30,16, 30,24, 30,36, 30,48, 30,57, 30,63,
30,76, 30,79, 33,08, 34,81, 35,12, 63,94, 66,25, 175,03; MS m/z 531
(M-H)^{-}; IR (NaCl, puro) 1735, 1216, 1012
cm^{-1}.
Compuesto
91
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (813 mg) a una solución del compuesto 83 (711 mg, 0,784
mmol) en EtOH (25 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación durante 4
horas a 60 psi (4,13 bares). Transcurridas 4 horas, se determinó,
mediante cromatografía en capa fina, que la reacción había
concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite y se
concentró el eluato en condiciones de presión reducida, obteniéndose
419 mg (97%) de 91 en forma de cera de color blanco: RMN ^{1}H
(CD_{3}OD) \delta 0,89 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,28 (s, 32H), 1,58
(m, 2H), 2,24-2,38 (m, 2H),
3,95-4,42 (m, 4H), 4,58 (m, 1H); RMN ^{13}C
(CD_{3}OD) \delta 14,44, 23,74, 25,90, 26,06, 30,16, 30,24,
30,36, 30,48, 30,57, 30,63, 30,67, 30,76, 33,08, 34,81, 35,11,
61,37, 61,98, 66,26, 67,69, 67,77, 77,42, 175,03; MS m/z 545
(M-H)^{-}; IR (NaCl, puro) 3418, 1735,
1261, 1019 cm^{-1}.
Compuesto
92
Se añadió paladio al 10% sobre carbón activado
(Pd/C) (710 mg) a una solución del compuesto 84 (663 mg, 0,709
mmol) en EtOH (25 ml). Se llevó a cabo una hidrogenación durante 4
horas a 60 psi (4,13 bares). Transcurridas 4 horas, se determinó,
mediante cromatografía en capa fina, que la reacción había
concluido. Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite y se
concentró el eluato en condiciones de presión reducida, obteniéndose
400 mg (98%) de 92 en forma de cera de color blanco: RMN ^{1}H
(CD_{3}OD) \delta 0,89 (t, J = 6,3 Hz, 3H), 1,27 (s, 36H), 1,58
(m, 2H), 2,24-2,38 (m, 2H),
3,98-4,42 (m, 4H), 4,59 (m, 1H); RMN ^{13}C
(CDCl_{3}/CD_{3}OD) \delta 13,72, 22,40, 24,71, 28,84, 28,97,
29,08, 29,18, 29,41, 31,65, 34,16, 60,15, 60,99, 62,42, 63,17,
65,16, 65,30, 65,98, 73,24, 173,79; MS m/z 573
(M-H)^{-}; IR (NaCl, puro) 3431, 1739, 1254, 1177 cm^{-1}.
(M-H)^{-}; IR (NaCl, puro) 3431, 1739, 1254, 1177 cm^{-1}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se emplearon oocitos de Xenopus que
expresan endógenamente el PLGFR PSP24 para determinar la actividad
inhibidora del LPA de los compuestos recién diseñados y
sintetizados.
Los oocitos se obtuvieron (en condiciones
asépticas) de ranas Xenopus laevis adultas (obtenidas de la
empresa Carolina Scientific, Burlington [Carolina del Norte],
Estados Unidos) anestesiadas con xilazina, y se los preparó para el
experimento. Los oocitos de fase V-VI fueron
desprovistos de la capa de células foliculares mediante tratamiento
con colagenasa de tipo A (obtenida de Boehringer, [Indiana], Estados
Unidos), empleada en una concentración de 1,4 mg/ml en una solución
de cloruro sódico compuesta (solución de Ringer-2)
ovárica libre de Ca^{2+} ((OR-2) NaCl 85,2 mM,
KCl 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5, con NaOH). Se mantuvo
a los oocitos en una solución de Barth en un incubador a una
temperatura de 17 a 20ºC, y se los empleó durante
2-7 días tras su aislamiento.
Se llevaron a cabo registros electrofisiológicos
empleando un amplificador con fijación del voltaje de dos
electrodos estándar, manteniendo el potencial de membrana en -60 mV
(GeneClamp 500, Axon Instruments, California, Estados Unidos). Los
compuestos que se deseaba probar fueron disueltos en MeOH, formando
un complejo con BSA libre de ácidos grasos, y diluidos con una
solución de cloruro sódico compuesta (solución de
Ringer-Na^{+}) (NaCl 120 nM, KCl 2 mM, CaCl_{2}
1,8 mM, HEPES 5 mM; pH 7,0) de rana; los compuestos así preparados
fueron aplicados mediante superfusión al oocito a una velocidad de
flujo de 5 ml/min. Las corrientes de membrana fueron registradas
mediante un osciloscopio digital NIC-310 (de la
empresa Nicolet, Madison [Wisconsin], Estados Unidos). Las
aplicaciones se realizaron a intervalos de 15 minutos (mínimo) con
el fin de permitir un período de reposo farmacológico adecuado y
para que los oocitos se recuperasen de la desensibilización.
Las Figuras 21-27 ilustran la
inhibición, proporcional a la dosis, de las corrientes de cloruro
inducidas por el LPA, por parte de los compuestos 56, 57, 66 y
92.
El compuesto 36 fue el mejor inhibidor en el
grupo de los derivados no fosforilados. Cuando se inyectó el 36
intracelularmente para determinar si sus efectos inhibidores eran
consecuencia de sus acciones sobre la superficie celular o si la
inhibición se debía a sus acciones dentro de la célula, la
aplicación intracelular del 36 no arrojó información alguna sobre
su lugar de acción. Por lo tanto, se decidió pasar de emplear los
compuestos con grupo hidroxi libre (35-43) a
sintetizar los compuestos (55-59) para hacerlos
interaccionar con la superficie celular y evitar que los compuestos
penetrasen en la célula.
Los compuestos 56, 57, 66 y 92 inhibieron la
corriente de cloruro inducida por el LPA en el oocito de
Xenopus. Dichos compuestos 56, 57, 66 y 92 fueron capaces de
bloquear las acciones del LPA, de una manera proporcional a la
dosis. Además, tras lavar el oocito de Xenopus, se recuperó
por completo la respuesta al LPA; con este experimento se demostró
que los compuestos 56, 57, 66 y 92 eran capaces de inhibir las
corrientes de cloruro inducidas por el LPA, de una manera
reversible. El compuesto 66, a una concentración 5 \muM, abolió
por completo el efecto del LPA en los oocitos de Xenopus, con
una CI_{50} (concentración inhibitoria media que produce el 50%
de inhibición) de unos 1,2 \muM (Figuras 23 y 24). Además, cuando
se microinyectó el 66 en el interior de la célula (flecha, Figura
23B) y luego se aplicó extracelularmente LPA (10 nM), dicho
compuesto 66 no fue capaz de inhibir la respuesta al LPA; de este
experimento se desprende que las acciones inhibidoras del compuesto
66 eran de naturaleza extracelular.
Se probaron los compuestos 35 y
37-43 en oocitos de Xenopus, pero los
resultados no fueron concluyentes. El compuesto 55, a una
concentración 1 \muM, mostró una inhibición ligera (38% contra LPA
2nM). De entre los compuestos de la serie de la SAP, no se han
probado los compuestos 58 y 59 en oocitos de Xenopus. De
entre los compuestos de la serie de los difosfatos, el compuesto 89
inhibió la respuesta inducida por el LPA (59% contra LPA 2nM). Los
compuestos 67 (umbral \sim 1 \muM), 68 (umbral \sim 10 nM) y
85 (umbral \sim 100 nM) fueron capaces de provocar una respuesta
por sí mismos; en cuanto a los compuestos 86, 87, 88, 90 y 91, aún
están pendientes de evaluación. El compuesto 56a se diseñó y
sintetizó para someter a prueba la importancia del grupo amino
libre. Cuando se evaluó el compuesto 56a en la prueba de los oocitos
de Xenopus, el 56a potenció la respuesta al LPA cuando fue
aplicado en combinación con el LPA. El compuesto 56a no provocó una
respuesta a una concentración 2 \muM (no aparece en la figura),
pero a una concentración 10 \muM fue capaz de provocar una
respuesta por sí mismo (Figura 26); de este experimento se desprende
que para que haya actividad inhibidora es necesaria la presencia de
un grupo amino libre.
\vskip1.000000\baselineskip
Es un hecho conocido que los dos receptores del
LPA EDG-2 y EDG-7 se expresan en
células de cáncer ovárico HEY, de modo que se evaluó la capacidad
de los compuestos 56, 56a y 66 para inhibir la motilidad celular
inducida por el LPA (concentración del compuesto: 1 \muM, frente
a una concentración 0,1 \muM del LPA).
Se mantuvieron células ováricas HEY en el medio
RPMI 1640 con L-glutamina 2 mM (GIBCO BRL),
suplementado con suero fetal bovino al 10% (de Hyclone). Se
sincronizaron todas las células de modo que estuviesen en la fase
G_{0}/G_{1}, cultivándolas durante 2 días hasta su confluencia.
Cuando alcanzaron un 50-60% de confluencia en el
matraz, se las colocó en placas y se las recolectó para la
realización de experimentos. Tras extraer las células del matraz,
se las expuso durante 5 minutos a EDTA 0,53 mM en PBS (tampón
fosfato salino) a 37ºC. Se neutralizó el EDTA con un volumen
idéntico de medio RPMI 1640 más L-glutamina 2 mM y
suero fetal bovino al 10%. Se centrifugaron las células a 800 rpm
durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células recolectadas
fueron lavadas dos veces con medio RPMI 1640 suplementado con
L-glutamina 2 mM y se las resuspendió en la
concentración de 1 x 10^{6} células/ml. Después se las dejó
reposar durante 1 hora a 37ºC.
Para probar la motilidad celular se empleó una
prueba de migración celular cuantitativa modificada (Cat. Nº ECM500
de la empresa Chemicon, Temecula [California], Estados Unidos). La
membrana de las cámaras Chemicon fue revestida de poros de 8 micras
de diámetro, que contenían fibronectina. Mediante pipeteo, se
añadieron 400 \mul de medio RPMI 1640 suplementado con
L-glutamina 2 mM, que no contenía inhibidores o que
contenía inhibidores (1 \muM), a la cámara inferior. A la cámara
superior se añadieron unas 5 x 10^{4} células en medio RPMI 1640
suplementado con L-glutamina 2 mM. Se incubaron las
placas de 24 pocillos con insertos durante 4 horas en un incubador
con CO_{2} al 5% a 37ºC. Concluida la incubación, se extrajeron
las cámaras y se las pasó a una placa de 24 pocillos fresca, se
extrajeron las células de la cámara interna pasando un hisopo
varias veces, y se colocaron dichas células en la solución de
tinción celular previamente preparada, dejándolas allí 30 minutos a
temperatura ambiente. Al final de esta incubación, se extrajo la
solución de tinción celular de los pocillos. Se lavaron las cámaras
3 veces con 1 ml de PBS por pocillo. Tras el lavado final con PBS,
se examinaron las cámaras a fin de confirmar que las células
presentasen la morfología correcta y se contaron las células
adherentes empleando un microscopio invertido.
En la Figura 27 se ilustra un efecto de los
compuestos recién sintetizados sobre la migración, inducida por
LPA, de la célula de cáncer ovárico HEY. El compuesto 66 inhibió
aproximadamente en un 70% la motilidad celular inducida por LPA; en
cambio, el compuesto 55 (marginalmente) y el compuesto 56a
potenciaron la motilidad celular inducida por el LPA.
\vskip1.000000\baselineskip
Im et al. (2000) y los datos derivados
del análisis mediante TI-PCR demostraron que en las
líneas celulares de cáncer de próstata DU-145,
PC-3 y LNCaP hay presencia de PLGFRs. Dada la
prometedora actividad inhibidora que mostraron una serie de
compuestos en la prueba de los oocitos de Xenopus y en la
prueba de motilidad celular, se examinaron los efectos de
inhibición del crecimiento, por parte de dicha serie de compuestos,
en las líneas celulares de cáncer de próstata
DU-145, PC-3 y LNCaP.
Se propagaron células DU-145,
PC-3 y LNCaP en matraces de 150 cm^{2} que
contenían los medios RPMI 1640 o de Dulbecco modificado
suplementados con suero fetal bovino al 10%. Se extrajeron las
células de los matraces de concentración máxima (matraces
"stock") empleando tripsina, se las centrifugó, resuspendió en
medios frescos, y colocó en placas a una densidad aproximada de
2000 células/pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos. Las
concentraciones finales de los fármacos oscilaron entre 0,05 y 10 ó
50 \muM. Se llevaron a cabo experimentos de control en paralelo,
sin adición de fármacos (control negativo) y con adición de
5-fluoroacilo (control positivo). Durante el
transcurso del experimento se retiraron los medios, y a las 48 horas
se volvieron a colocar medios con el fin de minimizar los efectos
de la degradación de los fármacos. A las 96 horas de la exposición
a los fármacos, las células fueron fijadas mediante adición de ácido
tricloroacético (TCA) e incubación a 4ºC durante 1 hora. Las
células fijadas fueron teñidas con sulforodamina B (SRB) y el número
de células se determinó mediante comparación de la absorbancia a
540 nm (comparación con una curva estándar de número de células
frente a absorbancia). Los experimentos se realizaron por duplicado.
Se representó el número de células como porcentaje del control
(pocillos no tratados) frente a la concentración de fármaco y a la
concentración que inhibía el crecimiento celular en un 50%
(CI_{50}) determinada mediante regresión no lineal (con el
software WinNonlin, de la empresa Pharsight Corporation).
En la Tabla 3 se presentan los datos de los
estudios de citotoxicidad llevados a cabo con las líneas celulares
de cáncer de próstata DU-145, PC-3 y
LNCaP, junto con los de los compuestos de referencia
5F-uracilo, LPA (18:1), SPH (13:0), SPP (13:0) y
ácido fosfórico N-palmitoil L-serina
(15:0).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los compuestos 55, 56, 56a, 66 y 85 mostraron un
abanico de actividades inhibidoras del crecimiento. El compuesto 56
fue un inhibidor más potente del crecimiento de las células
DU-145 y PC-3 que el
5-fluorouracilo. Un hecho interesante fue que el
56a inhibió selectivamente el crecimiento de las células
DU-145, mientras que se mostró menos potente contra
las células PC-3; el compuesto 55 fue un inhibidor
más potente del crecimiento de las células LNCaP que del
crecimiento de las células DU-145 y
PC-3. El compuesto 66 inhibió selectivamente el
crecimiento de las células LNCaP, mientras que no mostró actividad
alguna frente a las células PC-3 y LNCaP. El
compuesto 85 fue el que se mostró más activo de entre los compuestos
difosfato (sn-1 acilo).
Se sintetizaron de manera específica, y se
analizaron, tres series de compuestos (35-43,
55-59, 66-68 y
85-92). En la primera y la segunda serie se
amalgamaron los inhibidores endógenos SPH y SPP con el inhibidor
sintético ácido fosfórico N-palmitoil
L-serina, mientras que la tercera serie comprende
los compuestos difosfato. En prueba de los oocitos de
Xenopus, los compuestos 56, 57, 66 y 92 fueron inhibidores de
las corrientes de cloruro inducidas por el LPA. Además, los
compuestos difosfato con una cadena más corta en la posición
(sn-1) fueron capaces de provocar corrientes de cloruro en el
oocito de Xenopus, [67 (umbral \sim 1 \muM), 68 (umbral
\sim 10 nM) y 85 (umbral \sim 100 nM)]. Se demostró que el
compuesto 66 inhibe la motilidad celular inducida por el LPA en
líneas celulares de cáncer ovárico HEY. Al evaluar los efectos de
inhibición del crecimiento de los mencionados compuestos
sintetizados en las líneas celulares de cáncer de próstata
DU-145, PC-3 y LNCaP, se
descubrieron tres compuestos muy potentes y selectivos (56, 56a y
66).
De los datos que se han expuesto anteriormente
(en la Tabla 3) parece desprenderse que (i) los compuestos que
contienen un alcohol y que no contienen fosfato son menos activos
(27 frente a 56); (ii) los compuestos que tienen la fracción
fosfato protegida son menos activos (51 frente a 56); (iii) la
alquilación de la amina no reduce la actividad (56a); (iv) el
compuesto difosfato más potente presenta un enlace éter en la
posición sn-1; (v) cuando se redujo la longitud de cadena en
la serie de la SAP (55 frente a 56), la potencia contra
DU-145 y PC-3 disminuyó (aunque la
potencia contra las células LNCaP aumentó); (vi) cuando se redujo la
longitud de cadena en la serie de los compuestos difosfato
(sn-1 alquilo), la potencia disminuyó, aunque la selectividad
por las células LNCaP se mantuvo; y (vii) la sustitución en la
posición sn-1 (acilo frente a alquilo) no aumentó la
potencia. Probablemente la ubicación de destino de estas moléculas
reside en la membrana celular (por ejemplo, un receptor
transmembranal), dado que es improbable que los derivados fosfatados
polares atraviesen con facilidad la membrana celular (aunque podría
darse el caso de que existiese un sistema de transporte activo). De
estos resultados parece desprenderse que las diferencias en los
PLGFRs o los sucesos en la transducción de señales
"downstream" pueden desempeñar una función importante en las
propiedades de inhibición del crecimiento que estos compuestos
tienen sobre las células de cáncer de próstata.
En un esfuerzo por desarrollar antagonistas
selectivos de los receptores EDG-2,
EDG-4 y EDG-7, primero se eligió un
sistema de identificación de compuestos candidatos. Como sistema
modelo se eligieron las células RH7777, ya que existían informes de
que, en un amplio abanico de estudios celulares, no respondían al
LPA, y además porque se descubrió que no contenían ARNm para
ninguno de los receptores EDG conocidos (Fukushima et al.,
1998). Se instituyeron en las células RH7777 líneas de células
estables transfectadas con los receptores EDG, así como líneas de
células de control transfectadas con un vector vacío.
Se analizaron los clones resultantes, mediante
monitorización de los incrementos transitorios de Ca^{2+}
intracelulares y mediante TI-PCR. Este proceso de
análisis condujo a la identificación de al menos tres líneas
celulares que expresaban el EDG-2 y el
EDG-7; no se logró identificar ninguna línea celular
positiva que expresase el EDG-4. Asimismo, se halló
que las células transfectadas con el vector no respondían al LPA.
Aunque no se aislaron clones estables que expresasen el
EDG-4, la expresión transitoria del
EDG-4 condujo a la activación, mediada por el LPA,
de los incrementos transitorios de Ca^{2+} intracelulares, lo que
demostró que el constructo era funcionalmente activo en estas
células. La línea celular estable que expresaba el
EDG-4 empleada en estos experimentos fue aislada y
caracterizada por Im et al., quienes nos proporcionaron
amablemente ese clon (Im et al., 2000).
Se caracterizaron aún más las líneas celulares
con la intención de identificar una prueba adecuada para el
análisis e identificación de posibles antagonistas. En las células
que expresaban el EDG-2, así como en las que
expresaban el EDG-4 de manera transitoria, se
observó que el LPA provocaba la activación de la ERK 1/2; en las
células que expresaban el EDG-7 no había activación
de la ERK 1/2. El LPA provocaba incrementos transitorios de
Ca^{2+} en todas las líneas de células estables que expresaban el
EDG-2, el EDG-4 y el
EDG-7. Las curvas dosis-respuesta
revelaron valores de CE_{50} (concentración efectiva media) de 378
\pm 53, 998 \pm 67, y 214 \pm 26 nM para las células que
expresaban el EDG-2, el EDG-4 y el
EDG-7, respectivamente (Figuras
28A-C). Como el valor de CE_{50} determinado en el
clon estable que expresaba el EDG-4 difería del que
se había notificado anteriormente, se elaboró también una curva
dosis-respuesta correspondiente a las células que
expresaban el EDG-4 de manera transitoria (Figura
28B, An et al., 1998a; An et al., 1998b), la cual
arrojó un valor de CE_{50} de 186 \pm 39.
Se examinó la capacidad del LPA para estimular
la síntesis de ADN en las líneas de células estables; para ello, se
midió la incorporación de ^{3}H-timidina. Ni las
células RH7777 de referencia ni las células RH7777 transfectadas
con el vector mostraron un aumento de la incorporación de
^{3}H-timidina tras una incubación de 24 horas de
duración con LPA 10 \muM; este hecho contrasta con un informe
anterior en el que se notificaba que el LPA es mitógeno en estas
células. En las células que expresaban el EDG-2, la
incorporación de ^{3}H-timidina aumentó en un
factor de 1,8, mientras que las células que expresaban el
EDG-4 y el EDG-7 no mostraron
aumento alguno de la incorporación de
^{3}H-timidina en comparación con las células de
control.
Puesto que se habían provocado incrementos
transitorios del Ca^{2+} en las tres líneas de células estables
que expresaban el EDG-2, el EDG-4 y
el EDG-7 (Figuras 28A-C), se empleó
esta prueba con la intención de identificar posibles antagonistas.
En un esfuerzo por identificar antagonistas selectivos de los
miembros activados por LPA de la familia de receptores EDG, como
punto de partida se emplearon las características estructurales del
farmacóforo del LPA. Se probaron LPA (8:0) de cadena corta, o una
mezcla de LPA (8:0) y LPA (18:1), como inhibidores del
EDG-2, EDG-4 o
EDG-7. Cuando se probó con las células una mezcla de
LPA (8:0) y LPA (18:1), los incrementos del Ca^{2+} no se vieron
afectados en ninguna de las tres líneas de células estables (véanse
las Figuras 30A-C, 31A-C y
30A-B). El LPA (8:0) por sí solo no fue capaz de
provocar incrementos del Ca^{2+} en ninguna de las células, ni
siquiera a concentraciones tan altas como 10 \muM.
Basándose en estos resultados, los solicitantes
desarrollamos la hipótesis de que una modificación del farmacóforo
del LPA, que restringiese estéricamente la movilidad de la cadena de
ácido graso, podría afectar también a sus propiedades en cuanto a
ligandos. Por este motivo, probamos también los compuestos con un
segundo ácido graso de cadena corta, en la posición sn-2.
Tales fosfatidatos de cadena corta presentan una mayor
hidrofobicidad en relación con el LPA de cadena corta
correspondiente, que podría limitar la interacción de dichos
fosfatidatos con el bolsillo de unión a ligandos del receptor.
El ácido fosfatídico (PA) y el diacilglicerol
pirofosfato (DGPP) son lípidos que se dan naturalmente y que
comparten algunas propiedades químicas con el farmacóforo del LPA;
presentan grupos fosfato iónicos y cadenas de ácidos grasos.
Ninguno de ambos compuestos es agonista de los receptores EDG (véase
más adelante). Teniendo en cuenta esta similitud, se preparó un
DGPP de cadena corta y se lo probó como inhibidor del
EDG-2, EDG-4 o
EDG-7. Las Figuras 29A-D ilustran el
efecto de un exceso diez veces mayor de DGPP (8:0) sobre los
incrementos del Ca^{2+} generados por el LPA en las líneas de
células estables. En las células que expresaban el
EDG-2, los incrementos del Ca^{2+} fueron
inhibidos un 50% aproximadamente (Figura 29A); en las células que
expresaban el EDG-7, los incrementos del Ca^{2+}
fueron inhibidos por completo (Figura 29C). En cambio, en las
células que expresaban el EDG-4, los incrementos
del Ca^{2+} no se vieron afectados por el DGPP (8:0) (Figura 29B).
Dada la discrepancia en los valores de CE_{50} en relación con la
expresión estable y transitoria del EDG-4 (Figura
29B), se probó de manera parecida el DGPP 8:0 en células que fueron
transfectadas transitoriamente con el EDG-4. Los
incrementos del Ca^{2+} no se vieron afectados por el DGPP 8:0 en
las células que expresaban transitoriamente el
EDG-4 (Figura 29D), y esto se ajustaba a los
resultados obtenidos en los experimentos llevados a cabo con las
células estables. Se obtuvieron observaciones similares empleando PA
8:0 en cada una de las pruebas que se han descrito para el DGPP 8:0
(véase más adelante).
Se determinaron las curvas de inhibición de las
células que expresaban el EDG-2 y el
EDG-7, empleando concentraciones crecientes de DGPP
8:0 y manteniendo constante la concentración de LPA en la CE_{50}
correspondiente al receptor estudiado. A partir de estas curvas se
determinaron los valores de CI_{50} 285 \pm 28 nM para el
EDG-7 (Figura 30A) y 11,0 \pm 0,68 \muM para el
EDG-2 (Figura 31A). Empleando una cantidad constante
de DGPP 8:0, cercana al valor de CI_{50} (250 nM para el
EDG-7, 3 \muM para el EDG-2), las
curvas dosis-respuesta correspondientes al
EDG-7 (Figura 30B) y al EDG-2
(Figura 31B) se desplazaron hacia la derecha, lo que indicaba la
existencia de un mecanismo de inhibición competitivo.
Con el fin de definir mejor la relación entre
estructura y actividad del DGPP y de las especies de cadena corta
(8:0) y de cadena larga (18:1) del LPA, se probaron el DGPP, el PA y
el DAG con líneas celulares que expresaban el EDG-2
y el EDG-7. La Figura 30C ilustra el efecto de estos
lípidos sobre los incrementos del Ca^{2+} en células que
expresaban el EDG-7, expuestas a una combinación de
LPA 18:1 con cada uno de dichos lípidos. Para llevar a cabo estos
experimentos se eligió una concentración de LPA cercana a la
CE_{50}, mientras que los lípidos que se deseaba probar se
aplicaron a una concentración igual a la CI_{50} del DGPP 8:0. El
LPA 8:0 no tuvo efecto alguno sobre el EDG-7,
mientras que tanto el DGPP 8:0 como el PA 8:0 inhibieron
significativamente los incrementos del Ca^{2+}. Cuando se aumentó
la longitud de cadena del DGPP y del PA a 18:1, estos análogos no
fueron inhibidores del EDG-7 (Figura 30C). De igual
manera, el DAG 18:1 no tuvo ningún efecto inhibidor sobre el
EDG-7.
Se probó el mismo conjunto de lípidos con
células que expresaban el EDG-2 (Figura 31C). Se
emplearon análogos de longitud de cadena C8 (octil) del DGPP, PA y
DAG a una concentración 10 \muM; a dicha concentración, todos
ellos redujeron las respuestas (los incrementos del Ca^{2+}) en un
50%, 19% y 64% respecto del control, respectivamente. Tras aumentar
la longitud de cadena a 18:1, el DGPP y el DAG dejaron de tener
efecto inhibidor, mientras que el PA 18:1 mantuvo un efecto
inhibidor modesto (redujo los incrementos del Ca^{2+} en un 18%).
Se probó también el conjunto de lípidos con células que expresaban
el EDG-4 (Figuras 32A-B). Cuando
fueron probados con la líneas de células estables que expresaba el
EDG-4, ninguno de los lípidos de cadena corta o
larga tuvo efecto inhibidor, pero el PA 8:0 y el PA 18:1 aumentaron
significativamente los incrementos del Ca^{2+}, en un 162% y un
137% respecto del control, respectivamente. Para confirmar los
resultados obtenidos con el clon estable, se probó el conjunto de
lípidos con células que expresaban transitoriamente el
EDG-4 (Figura 32B). De nuevo, ni las especies de
cadena corta ni las especies de cadena larga del DGPP o del PA
tuvieron efecto inhibidor sobre los incrementos del Ca^{2+}, lo
cual se ajustaba a los resultados obtenidos con la línea de células
estable. No obstante, a diferencia de lo que ocurría con el clon que
expresaba el EDG-4 de manera estable, ninguno de
los análogos del PA aumentó los incrementos del Ca^{2+} en las
células que expresaban transitoriamente el EDG-4.
Ninguna de las especies del PA, aplicada por sí sola, a
concentraciones de hasta 10 \muM, provocó una respuesta en
células que expresaban de manera estable o transitoria el
EDG-4.
Se examinó también el efecto del DGPP 8:0 sobre
células que expresan endógenamente los receptores del LPA. Se halló
que el DGPP 8:0 inhibía las corrientes de Cl^{-} (mediadas por el
Ca^{2+}) que el LPA provocaba hacia el interior del oocito de
Xenopus, con una CI_{50} de 96 \pm 21 nM (Figura 33A). En
presencia de una concentración 200 nM de DGPP 8:0, la curva
dosis-respuesta correspondiente al LPA 18:1 se
desplazó hacia la derecha, lo que indicaba la existencia de un
mecanismo de acción competitivo semejante al hallado en los clones
EDG-2 y EDG-7 (Figura 33B). Con el
fin de determinar si el DGPP 8:0 actúa mediante un mecanismo
intracelular o extracelular, se inyectó DGPP 8:0 intracelularmente y
se expuso el oocito a LPA 18:1. La Figura 32C muestra que tras la
inyección intracelular de DGPP 8:0, calculada para alcanzar una
concentración > 300 nM, la inyección extracelular de LPA 18:1 5
nM provocó una respuesta que fue idéntica, en tamaño, a la del
control. En cambio, la respuesta provocada en condiciones normales
por el LPA 18:1 fue inhibida por completo cuando se aplicó DGPP 8:0
extracelularmente (Figura 33C). El efecto inhibidor del DGPP 8:0 era
reversible, puesto que tras un lavado de 10 minutos de duración, la
respuesta se recuperó hasta igualar el nivel de control (Figura
33C).
Con el fin de demostrar la especificidad del
DGPP 8:0 hacia los receptores del LPA expresados en el oocito, se
indujo la expresión de receptores de neurotransmisores mediante
inyección de ARNm poliA+ procedente de cerebro de rata. Esto
condujo a la expresión de los receptores, acoplados a proteína G, de
la serotonina y de la acetilcolina, que no se expresan en oocitos
que no han recibido la mencionada inyección. Estos neurotransmisores
activan la misma ruta de señalización mediada por inositol
trifosfato-Ca^{2+} que es activada por el LPA
(Tigyi et al., 1990). En estos oocitos, el DGPP 8:0 no
inhibió las respuestas generadas por la serotonina, ni las
generadas por el carbacol, lo que demuestra la especificidad del
DGPP 8:0 hacia los receptores del LPA. Cuando se empleó PA 8:0 a
concentraciones similares, el PA 8:0 se mostró también eficaz para
inhibir las respuestas provocadas por el LPA en los oocitos.
También se examinó el efecto del DGPP 8:0 sobre
las respuestas provocadas por el LPA en sistemas de mamíferos que
expresan endógenamente los receptores del LPA. Se analizaron células
NIH3T3 mediante TI-PCR para ver si presentaban ARNm
que codificase receptores EDG/PSP24. La Figura 34A muestra que en
las células NIH3T3 se detectaron transcriptos de ARNm para
EDG-2, EDG-5 y PSP24. Para demostrar
que el DGPP 8:0 inhibía específicamente los incrementos del
Ca^{2+} provocados por el LPA, y no así los incrementos del
Ca^{2+} provocados por el S1P, se expuso a las células NIH3T3 a
LPA o S1P 100 nM en presencia de DGPP 8:0 10 \muM. Como se ilustra
en la Figura 34B, el DGPP 8:0 inhibió significativamente los
incrementos del Ca^{2+} provocados por el LPA, y los incrementos
del Ca^{2+} provocados por el S1P no se vieron afectados.
Se ha demostrado que el cáncer de ovario genera
LPA, y que el LPA desempeña una función en el cáncer de ovario (Xu
et al., 1995a). Por lo tanto, se probó también el DGPP 8:0 en
células de cáncer ovárico HEY con el fin de determinar si tenía un
efecto sobre una diana terapéuticamente relevante. La Figura 34D
muestra que el DGPP 8:0 inhibió la oscilación del Ca^{2+}
provocada por el LPA en un 12% respecto del control (mientras que
el DGPP 18:1 no tuvo efecto alguno). De igual manera, el PA 8:0
inhibió la oscilación del Ca^{2} provocada por el LPA en un 6%
respecto del control, y el PA 18:1 no tuvo efecto alguno. Las
células HEY expresan transcriptos de ARNm para los receptores
EDG-1, EDG-2, EDG-5
y EDG-7 (Figura 34C).
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto distintivo de un factor de crecimiento
es su capacidad para provocar la proliferación celular. Dado que se
ha demostrado que el LPA estimula la proliferación en un amplio
abanico de tipos de células diferentes (Goetzl et al.,
2000), se examinó la capacidad del DGPP 8:0 para inhibir la
proliferación celular en células NIH3T3. La Figura 35 muestra que
el DGPP 8:0 inhibió significativamente la proliferación, inducida
por el LPA, de las células NIH3T3 - reduciendo el número de células
a niveles semejantes a los de las células de control - y que no
tuvo efecto alguno sobre las células de control tratadas con un
solvente. Con el fin de definir la relación
estructura-actividad inherente al efecto inhibidor
del DGPP 8:0, en la prueba se incluyeron las especies de cadena
corta y de cadena larga del DGPP, PA y DAG. Como se ilustra en la
Figura 35, ninguno de los lípidos incluidos en el conjunto empleado
para la prueba tuvo un efecto inhibidor o estimulador significativo
sobre las células de control tratadas con solvente. Únicamente el
DGPP 8:0 inhibió la proliferación inducida por el LPA. Ni el DGPP
18:1 ni el PA o el DAG de cadena corta/larga tuvieron efecto alguno
sobre la proliferación inducida por el LPA. Es un hecho interesante
el que el PA 8:0 no tuviese un efecto inhibidor significativo en
esta prueba.
Se emplearon células RH7777 para la expresión
heteróloga de los receptores EDG-2,
EDG-4 y EDG-7 con el fin de
identificar posibles antagonistas. Basándonos en nuestros modelos
computacionales previos de los receptores EDG (Parrill et
al., 2000) y en los datos disponibles acerca de la relación
estructura-actividad (Jalink et al., 1995),
los resultados experimentales que hemos descrito aquí demuestran que
el fosfatidato de cadena corta DGPP 8:0 es un antagonista selectivo
y competitivo del EDG-7, con un valor de CI_{50}
de 285 \pm 28 nM. Se halló asimismo que el DGPP 8:0 tenía un
efecto inhibidor escaso sobre el EDG-2, con un valor
de CI_{50} de 11,0 \pm 0,68 \muM, y que no inhibió el
EDG-4. El DGPP 8:0 inhibió la respuesta del LPA
endógeno en los oocitos de Xenopus, con un valor de CI_{50}
de 96 \pm 21 nM. El PA 8:0 mostró propiedades de inhibición
similares. Por lo tanto, estos fosfatidatos de cadena corta muestran
de 40 a 100 veces más selectividad hacia el EDG-7
que hacia el EDG-2.
Estos resultados obtenidos con los fosfatidatos
de cadena corta mencionados vienen a confirmar los obtenidos por
Bandoh et al. (2000), quienes demostraron que el LPA, con una
longitud de cadena del acilo de doce carbonos o menos, no genera
respuestas en células de insectos que expresan el
EDG-2, el EDG-4 o el
EDG-7. Como se ha demostrado anteriormente, el LPA
8:0 no fue ni agonista ni antagonista del EDG-2, el
EDG-4 o el EDG-7 en un sistema de
expresión compuesto por células de mamíferos. El
EDG-7 tiene 10 veces más preferencia por el LPA
cuando el LPA tiene una cadena de ácido graso esterificada a la
posición sn-2, frente al LPA con una cadena de ácido graso
esterificada a la posición sn-1 (Bandoh et al., 2000).
Por lo tanto, la distancia de la cadena hidrocarbonada respecto de
la fracción fosfato no impide la unión al receptor y la activación
de este último. Asimismo, el EDG-7 muestra una
preferencia por los ácidos grasos insaturados, de cadena larga,
frente a sus homólogos saturados. La presencia de un enlace éter o
de una cadena lateral de éter de vinilo también redujo la CE_{50}
en dos órdenes de magnitud (Bandoh et al., 2000). Además,
hay una longitud de cadena hidrocarbonada óptima, a saber, 18
carbonos; los análogos de 20 carbonos fueron agonistas más débiles.
Estas propiedades farmacológicas del EDG-7 parecen
indicar que la activación del receptor depende de la longitud de
cadena, así como de la flexibilidad de la cadena lateral (enlace
éster frente a enlace
éter).
éter).
Mediante el modelado computacional del receptor
EDG-1 se han identificado tres residuos cargados que
resultan necesarios para la unión a ligandos. Uno de estos
residuos, la arginina 120, que se predice que interacciona con el
grupo fosfato, se conserva en todos los miembros de la familia de
los EDG. El segundo residuo, la arginina 292, aparece en una
posición en la que todos los miembros de la familia de los EDG,
salvo el EDG-8, tienen cerca un residuo catiónico.
El tercer residuo, el glutamato 121, no se conserva en los
receptores EDG específicos del LPA; en el EDG-2, el
EDG-4 y el EDG-7, en el lugar
correspondiente hay una glutamina. Se predice que este residuo
glutamina interacciona con la fracción hidroxilo del LPA. La
sustitución de este residuo por alanina ha conducido a la pérdida
de la unión a ligandos y de la activación del receptor, lo que
parece indicar que la interacción iónica entre las fracciones
cargadas del farmacóforo de los PLGFs y estos tres residuos es
necesaria para la unión a ligandos en el EDG-1
(Parrill et al., 2000). En vista de todo esto, se formuló la
hipótesis de que, para la activación de los agonistas, se necesita
una combinación de interacciones en las que participan el ancla
iónica y la cola hidrófoba. Los resultados que hemos expuesto
respaldan dicha hipótesis, ya que demostraron que el LPA 8:0 de
cadena corta no fue capaz de activar el EDG-2, el
EDG-4 ni el EDG-7, lo que subraya
la importancia que tiene la interacción entre la cola hidrófoba y el
bolsillo de unión a ligandos. Como consecuencia, los solicitantes
han designado a la cola hidrófoba como la región "interruptor"
del farmacóforo de los PLGFs. Dada la relativa tolerancia, por parte
de estos receptores, a la sustitución de los ácidos grasos en
sn-1 y sn-2, los solicitantes se centraron en los
fosfatidatos de cadena corta, que se pensó que no eran capaces de
activar los receptores a causa de sus cadenas hidrocarbonadas
truncadas. La movilidad estructural de las cadenas acilo en los
fosfatidatos se ve limitada también por la fracción ácido graso
adyacente. Los solicitantes exploraron asimismo los efectos de una
fracción pirofosfato, que no sólo no cambia el carácter de carga
negativa de la región de anclaje, sino que aumenta dicha carga
negativa.
Este diseño farmacológico conceptual se sometió
a prueba en líneas celulares clonales que expresaban los receptores
EDG-2, EDG-4 y
EDG-7. Se descubrió que las propiedades
farmacológicas del DGPP 8:0 y del PA 8:0 son radicalmente
diferentes en relación con los tres receptores. Ambas moléculas se
mostraron eficaces como inhibidores del EDG-7, pero
fueron más de un orden de magnitud menos eficaces a la hora de
inhibir el EDG-2. Ninguna de las dos moléculas se
mostró eficaz como inhibidor del EDG-4. Se halló
también que el DGPP 8:0 era un inhibidor competitivo del
EDG-2 y del EDG-7; desplazaba las
curvas dosis-respuesta hacia la derecha y se
producía un aumento de los valores de CE_{50} para el LPA en
ambos receptores. La carencia de actividad agonista de las especies
de PA y de DGPP de cadena larga correspondientes resalta las
limitaciones que prevalecen en el bolsillo de unión a ligandos. La
importancia que tiene el ancla iónica para el acoplamiento del
ligando al bolsillo de unión se ve respaldada por la ausencia de
inhibición por parte del DAG 8:0, aunque es probable que sus
efectos celulares se confundan debido a sus acciones intracelulares
sobre otras dianas moleculares, tales como la PKC.
Tanto el PA como el DGPP son lípidos que se dan
en la naturaleza. El DGPP (8:0) fue descubierto en 1993 como un
lípido novedoso que aparecía en las plantas y que es un producto de
la fosforilación del PA por parte de la fosfatidato quinasa
(Wissing y Behrbohm, 1993; Munnik et al., 1996). El DGPP ha
sido identificado en bacterias, levaduras y plantas, pero no así en
células de mamíferos. Estudios recientes han revelado que el DGPP
activa los macrófagos y estimula la producción de prostaglandinas
mediante la activación de la fosfolipasa A_{2} citosólica, lo que
parece indicar que el DGPP desempeña una función en la respuesta
inflamatoria (Balboa et al., 1999; Balsinde et al.,
2000). Estos autores descartaron la posibilidad de que estos efectos
fuesen mediados a través de los receptores del LPA. Los resultados
que hemos expuesto, obtenidos con los análogos de cadena larga del
DGPP y del PA, confirmaron esta noción, ya que dichos compuestos no
presentaron propiedades agonistas en las líneas celulares que
expresaban receptores EDG a concentraciones de hasta 10 \muM.
También se examinó el efecto de los fosfatidatos
de cadena corta sobre los receptores del LPA que se expresaban
endógenamente en tres tipos de células diferentes. Se halló que el
DGPP 8:0 y el PA 8:0 eran eficaces como inhibidores de las
corrientes de Cl^{-} provocadas por el LPA en los oocitos de
Xenopus. Con el fin de determinar el lugar de acción, se
inyectó DGPP 8:0 en oocitos y luego se les aplicó LPA
extracelularmente. El DGPP 8:0 sólo se mostró eficaz como inhibidor
de las corrientes de Cl^{-} provocadas por el LPA cuando fue
aplicado extracelularmente, lo que demuestra que ejerce su efecto
antagonista en la superficie celular. La especificidad del DGPP 8:0
hacia los receptores del LPA fue demostrada en oocitos y en células
NIH3T3. En estas células, el DGPP 8:0 sólo inhibió eficazmente los
incrementos del Ca^{2+} provocados por el LPA; no así los
incrementos del Ca^{2+} provocados por el S1P, la acetilcolina o
la serotonina.
El análisis mediante TI-PCR
reveló que en las células NIH3T3 sólo se expresa el
EDG-2 y no el EDG-4 ni el
EDG-7. En las células NIH3T3, el DGPP 8:0, en un
gran exceso (factor de 100), sólo inhibió los incrementos del
Ca^{2+} en un 40%. Este nivel de inhibición es semejante al
observado con el DGPP 8:0 en la línea de células estables que
expresaba el EDG-2, donde también resultó ser un
inhibidor débil. Cuando se evaluaron el DGPP y el PA de cadena
corta en células de cáncer ovárico HEY, a un exceso de diez veces la
concentración de LPA, ambos fueron inhibidores eficaces, mientras
que ninguna de ambas moléculas de cadena larga tuvo efecto alguno.
El análisis mediante TI-PCR reveló que en las
células HEY el ARNm predominante codificaba el EDG-7
y sólo se detectó una pequeña cantidad de ARNm que codificase el
EDG-2. Este nivel de inhibición es semejante al
observado en la línea de células estables que expresaba el
EDG-7, en la que tanto el DGPP 8:0 como el PA 8:0
fueron inhibidores eficaces.
Se evaluó la capacidad de ambos fosfatidatos de
cadena corta para bloquear la proliferación de las células NIH3T3
inducida por el LPA. El DGPP 8:0 inhibió eficazmente la
proliferación inducida por el LPA, mientras que el DGPP de cadena
larga no la inhibió. Aunque el PA 8:0 inhibió eficazmente los
incrementos del Ca^{2+}, no se mostró eficaz en inhibir la
proliferación celular. Estos resultados son conformes con un informe
previo en el que se notificaba que el LPA (12:0) no inhibió el
efecto mitógeno del PA 18:1 (van Corven et al., 1992). En
las pruebas de larga duración preocupa la estabilidad de las
moléculas, ya que las lípidofosfatasas podrían inactivar el
antagonista. El hecho de que ni el PA ni el DAG inhibieron la
proliferación parece indicar que es probable que el DGPP 8:0 sea
más estable a lo largo de toda esta prueba. La estabilidad del DGPP
fue también demostrada por Balboa et al. (1999), quienes
notificaron que, en el transcurso de sus experimentos, el DGPP no
era metabolizado.
El DGPP 8:0 representa una herramienta nueva
importante para el campo de estudio que nos ocupa (no sólo los
receptores EDG, sino también otros receptores de los PLGFs). El
concepto de un ancla iónica y de un interruptor hidrófobo del
farmacóforo de los PLGFs, derivado del modelado computacional de la
familia de los EDG, debería resultar útil para el diseño y la
síntesis de nuevos inhibidores.
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
101
Se disolvieron 74 mg (1,00 mmol) de
n-butanol anhidro y 365 mg (5,17 mmol) de
1H-tetrazol en 34 ml de cloruro de metileno anhidro en un
matraz de fondo redondeado de 100 ml. Mediante una jeringa, se
añadió una solución de 0,895 g (2,58 mmol) de
dibencil-N,N-diisopropil
fosforamidito en 5 ml de cloruro de metileno anhidro, en atmósfera
de argón y agitando. La mezcla de reacción fue agitada a temperatura
ambiente durante 2 horas. Después se enfrió la mezcla de reacción
en un baño de hielo seco con alcohol isopropílico a \sim38ºC. Se
añadieron gota a gota 0,815 g (3,43 mmol) de ácido peracético al
32% en 28 ml de cloruro de metileno anhidro, mediante un embudo de
adición. Tras la adición, se elevó la temperatura de la mezcla de
reacción hasta \sim0ºC mediante baño de hielo. Se agitó la mezcla
de reacción en el baño de hielo durante 1 hora. Después se
transfirió la mezcla de reacción a un embudo separador y se diluyó
la mezcla de reacción con 200 ml de cloruro de metileno. Se lavó la
capa orgánica con metabisulfito sódico al 10% (2 x 40 ml),
bicarbonato sódico saturado (2 x 40 ml), agua (30 ml) y solución
salina saturada (40 ml). Se secó la capa orgánica con sulfato sódico
anhidro, se la filtró y se la concentró en condiciones de vacío
hasta secarla. Después, el producto bruto fue purificado mediante
cromatografía con adsorción en gel de sílice empleando
hexanos/acetato de etilo 1:1 como eluyente, obteniéndose el
compuesto 101 (309 mg que contenían una pequeña cantidad de impureza
originada en el exceso de reactivo fosforilador) en forma de aceite
transparente. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) 0,88 (t, J = 7,2 Hz, 3H,
CH_{3}), 1,34 (sexteto, J = 7,2 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 1,59 (quinteto, J = 6,6
Hz, 2H, OCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 3,99 (dt, J =
6,6 Hz, 6,6 Hz, 2H, OCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 5,02
(d, J = 1,8 Hz, 2H, OCH_{2}Ar), 5,05 (d, J = 2,1 Hz, 2H,
OCH_{2}Ar), 7,35 (sa, 10H, 2 x ArH); RMN ^{13}C
(CDCl_{3}) 13,55, 18,60, 32,16, (d, J_{C,P} = 6,8 Hz), 67,72 (d,
J_{C,P} = 6,1 Hz), 69,13 (d, J_{C,P} = 5,5 Hz), 127,90, 128,47,
128,55, 136,00 (d, J_{C,P} = 6,8 Hz); RMN ^{31}P (CDCl_{3})
16,84; MS (modo positivo): [M + ^{23}Na] a m/z 357,3.
\newpage
Compuesto
102
Se emplearon 130 mg (1,00 mmol) de
n-octanol anhidro y se siguió un procedimiento
análogo al empleado para obtener el compuesto 101. El producto
bruto fue purificado mediante cromatografía con adsorción en gel de
sílice empleando hexanos/acetato de etilo 7:3 como eluyente,
obteniéndose el compuesto 102 (351 mg, 90%) en forma de aceite
claro. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H,
CH_{3}), 1,24 (sa, 10H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{5}CH_{3}),
1,60 (quinteto, J = 6,9 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{5}CH_{3}),
3,98 (dt, J = 6,6 Hz, 6,9 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{5}CH_{3}),
5,02 (d, J = 2,1 Hz, 2H, OCH_{2}Ar), 5,05 (d, J = 2,4 Hz,
2H, OCH_{2}Ar), 7,34 (sa, 10H, 2 x ArH); RMN
^{13}C (CDCl_{3}) 14,09, 22,62, 25,38, 29,06, 29,14, 30,17 (d,
J_{C,P} = 6,9 Hz), 31,75, 68,05 (d, J_{C,P} = 6,2 Hz), 69,12 (d,
J_{C,P} = 5,5 Hz), 127,90, 128,47, 128,56, 135,97 (d, J_{C,P} =
6,9 Hz); RMN ^{31}P (CDCl_{3}) 16,83; MS (modo positivo): [M +
^{23}Na]^{+} a m/z 413,4.
Compuesto
103
Se emplearon 186 mg (1,00 mmol) de
n-butanol anhidro y se siguió un procedimiento
análogo al empleado para obtener el compuesto 101. El producto
bruto fue purificado mediante cromatografía con adsorción en gel de
sílice empleando hexanos/acetato de etilo 7:3 como eluyente,
obteniéndose el compuesto 103 (361 mg, 81%) en forma de aceite
claro. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) 0,88 (t, J = 7,2 Hz, 3H,
CH_{3}), 1,24 (sa, 18H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{9}CH_{3}),
1,60 (quinteto, J = 6,9 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{9}CH_{3}),
3,98 (td, J = 6,9 Hz, 6,6 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{9}CH_{3}),
5,02 (d, J = 2,1 Hz, 2H, OCH_{2}Ar), 5,05 (d, J = 2,1 Hz,
2H, OCH_{2}Ar), 7,34 (sa, 10H, 2 x ArH); RMN
^{13}C (CDCl_{3}) 14,13, 22,69, 25,38, 29,12, 29,35, 29,49,
29,56, 29,63, 30,18 (d, J_{C,P} = 7,0 Hz), 31,92, 68,05 (d,
J_{C,P} = 6,1 Hz), 69,12 (d, J_{C,P} = 5,4 Hz), 127,89, 128,46,
128,55, 135,97 (d, J_{C,P} = 6,8 Hz); RMN ^{31}P (CDCl_{3})
16,84; MS (modo positivo): [M + ^{23}Na]^{+} a
m/z 469,1.
Compuesto
104
Se emplearon 270 mg (1,00 mmol) de octadecanol y
se siguió un procedimiento análogo al empleado para obtener el
compuesto 101. El producto bruto fue purificado mediante
cromatografía con adsorción en gel de sílice empleando
hexanos/acetato de etilo 7:3 como eluyente, obteniéndose el
compuesto 104 (474 mg, 89%) en forma de sólido higroscópico de
color blanco: pf 32-33ºC; RMN ^{1}H (CDCl_{3})
0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H, CH_{3}), 1,25 (sa, 30H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{15}CH_{3}),
1,60 (quinteto, J = 6,9 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{15}CH_{3}),
3,98 (td, J = 6,6 Hz, 6,9 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{15}CH_{3}),
5,02 (d, J = 2,1 Hz, 2H, OCH_{2}Ar), 5,05 (d, J = 2,1 Hz,
2H, OCH_{2}Ar), 7,34 (sa, 10H, 2 x ArH); RMN
^{13}C (CDCl_{3}) 14,12, 22,70, 25,40, 29,13, 29,38, 29,51,
29,58, 29,68, 29,72, 30,20 (d, J_{C,P} = 6,9 Hz), 31,94, 68,06 (d,
J_{C,P} = 6,1 Hz), 69,14 (d, J_{C,P} = 5,4 Hz), 127,90, 128,47,
128,55, 136,00 (d, J_{C,P} = 6,8 Hz); RMN ^{31}P (CDCl_{3})
16,83; MS (modo positivo): [M + ^{23}Na]^{+} a m/z
553,3.
Compuesto
105
Se emplearon 327 mg (1,00 mmol) de docosanol y
se siguió un procedimiento análogo al empleado para obtener el
compuesto 101. El producto bruto fue purificado mediante
cromatografía con adsorción en gel de sílice empleando
hexanos/acetato de etilo 7:3 como eluyente, obteniéndose el
compuesto 105 (516 mg, 88%) en forma de sólido higroscópico de
color blanco: pf 43,5-44,5ºC; RMN ^{1}H
(CDCl_{3}) 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H, CH_{3}), 1,25 (sa,
38H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{19}CH_{3}),
1,60 (quinteto, J = 6,9 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{19}CH_{3}),
3,98 (td, J = 6,6 Hz, 6,6 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{19}CH_{3}),
5,02 (d, J = 2,4 Hz, 2H, OCH_{2}Ar), 5,05 (d, J = 2,4 Hz,
2H, OCH_{2}Ar), 7,35 (sa, 10H, 2 x ArH); RMN ^{13}C
(CDCl_{3}) 14,13, 22,70, 25,39, 29,12, 29,37, 29,50, 29,57,
29,66, 29,71, 30,18 (d, J_{C,P} = 6,9 Hz), 31,93, 68,06 (d,
J_{C,P} = 6,0 Hz), 69,13 (d, J_{C,P} = 5,6 Hz), 127,89, 128,47,
128,55, 135,98 (d, J_{C,P} = 6,9 Hz); RMN ^{31}P (CDCl_{3})
16,83; MS (modo positivo): [M + ^{23}Na]^{+} a m/z
609,3.
Compuesto
106
Se disolvieron 200 mg (0,60 mmol) del compuesto
101 en 30 ml de metanol anhidro en un recipiente a presión de
paredes gruesas. Se purgó el recipiente con argón y se añadieron
\sim200 mg de paladio al 10% sobre carbón activado (Pd/C). Se
conectó el recipiente a un aparato de hidrogenación y se mantuvo una
atmósfera de hidrógeno a \sim50 psi (\sim3,44 bares) dentro del
recipiente de reacción a temperatura ambiente durante 8 horas.
Después se filtró la mezcla de reacción mediante vacío a través de
una almohadilla de Celite que se lavó con metanol. Se evaporó el
solvente, en condiciones de vacío, y tras la evaporación quedaron 70
mg (86%) del compuesto 106, en forma de aceite de color amarillo.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 0,95 (t, J =
7,2 Hz, 3H, CH_{3}), 1,43 (sexteto, J = 7,5 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 1,66 (quinteto, J = 6,9
Hz, 2H, OCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 3,99 (td, J =
6,6 Hz, 6,6 Hz, 2H, OCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}); RMN
^{13}C (CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 13,71, 19,02,
32,72 (d, J_{C,P} = 7,2 Hz), 66,86 (d, J_{C,P} = 5,5 Hz); RMN
^{31}P (CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 18,84; MS (modo
negativo): [M - 1]^{-} a m/z 153,0.
Compuesto
107
Se emplearon 200 mg (0,51 mmol) del compuesto
102 y, siguiendo un procedimiento análogo al empleado para obtener
el compuesto 106, se aislaron 100 mg (93%) del compuesto 107, en
forma de sólido pegajoso de color blanco amarillento. RMN ^{1}H
(CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H,
CH_{3}), 1,29 (sa, 10H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{5}CH_{3}),
1,67 (quinteto, J = 6,9 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{5}CH_{3}),
3,97 (dt, J = 6,6 Hz, 6,6 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{5}CH_{3}); RMN
^{13}C (CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 14,18, 22,98,
25,89, 29,57, 29,58, 30,76 (d, J_{C,P} = 7,3 Hz), 32,18, 67,16
(d, J_{C,P} = 5,2 Hz); RMN ^{31}P
(CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 20,55; MS (modo
negativo): [M - 1]^{-} a m/z 209,1.
Compuesto
108
Se emplearon 200 mg (0,45 mmol) del compuesto
103 y se siguió un procedimiento igual al empleado para obtener el
compuesto 106, obteniéndose 112 mg (94%) del compuesto 108, en forma
de sólido de color blanco. RMN ^{1}H
(CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 0,88 (t, J = 6,6 Hz, 3H,
CH_{3}), 1,27 (sa, 18H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{9}CH_{3}),
1,67 (quinteto, J = 6,6 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{9}CH_{3}),
3,97 (dt, J = 6,6 Hz, 6,6 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{9}CH_{3}); RMN
^{13}C (CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 14,21, 22,98,
25,84, 29,57, 29,67, 29,89, 29,92, 29,96, 29,98, 30,69 (d,
J_{C,P} = 7,4 Hz), 32,25, 67,22 (d, J_{C,P} = 5,7 Hz); RMN
^{31}P (CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 21,22; MS (modo
negativo): [M - 1]^{-} a m/z 265,0.
Compuesto
109
Se emplearon 200 mg (0,38 mmol) del compuesto
104 y se siguió un procedimiento análogo al empleado para obtener
el compuesto 106, obteniéndose 104 mg (79%) del compuesto 109, en
forma de sólido de color blanco. RMN ^{1}H
(CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H,
CH_{3}), 1,27 (sa, 30H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{15}CH_{3}),
1,68 (quinteto, J = 6,9 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{15}CH_{3}),
3,98 (dt, J = 6,6 Hz, 6,9 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{15}CH_{3});
RMN ^{13}C (CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 14,26, 23,14,
26,01, 29,74, 29,84, 30,06, 30,09, 30,16, 30,87 (d, J_{C,P} = 7,2
Hz), 32,42, 67,32 (d, J_{C,P} = 5,8 Hz); RMN ^{31}P
(CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 21,69; MS (modo negativo):
[M - 1]^{-} a m/z 349,1.
Compuesto
110
Se emplearon 200 mg (0,34 mmol) del compuesto
105 y se siguió un procedimiento igual al empleado para obtener el
compuesto 106, obteniéndose 98 mg (71%) del compuesto 110, en forma
de sólido de color blanco. RMN ^{1}H
(CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H),
1,26 (sa, 38H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{19}CH_{3}),
1,66 (quinteto, J = 6,9 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{19}CH_{3}),
3,97 (td, J = 6,6 Hz, 6,6 Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{19}CH_{3});
RMN ^{13}C (CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 14,22, 23,01,
25,87, 29,61, 29,71, 29,93, 29,97, 30,04, 30,73 (d, J_{C,P} = 7,4
Hz), 32,29, 67,27 (d, J_{C,P} = 5,6 Hz); RMN ^{31}P
(CDCl_{3}/MeOH-d_{4}) 20,66; MS (modo negativo):
[M - 1]^{-} a m/z 405,1.
Se emplearon oocitos de Xenopus, que
expresan endógenamente el PLGFR PSP24, para evaluar la actividad
inhibidora del LPA de los compuestos 106-110. Los
oocitos se obtuvieron (en condiciones asépticas) de ranas
Xenopus laevis adultas (obtenidas de la empresa Carolina
Scientific, Burlington [Carolina del Norte], Estados Unidos)
anestesiadas con xilazina, y se los preparó para el experimento. Los
oocitos de fase V-VI fueron desprovistos de la capa
de células foliculares mediante tratamiento con colagenasa de tipo A
(obtenida de Boehringer, [Indiana], Estados Unidos), empleada en
una concentración de 1,4 mg/ml en una solución una solución de
cloruro sódico compuesta (solución de Ringer-2)
ovárica libre de Ca2+ ((OR-2) NaCl 85,2 mM, KCl 2
mM, MgCl_{2} 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5, con NaOH). Se mantuvo a los
oocitos en una solución de Barth en un incubador a una temperatura
de 17 a 20ºC, y se los empleó durante 2-7 días tras
su aislamiento.
Se llevaron a cabo registros electrofisiológicos
empleando un amplificador con fijación del voltaje de dos
electrodos estándar, manteniendo el potencial de membrana en -60 mV
(GeneClamp 500, Axon Instruments, California, Estados Unidos). Los
compuestos que se deseaba probar fueron disueltos en MeOH, formando
un complejo con BSA libre de ácidos grasos, y diluidos con una
solución de cloruro sódico compuesta (solución de
Ringer-Na+) (NaCl 120 nM, KCl 2 mM, CaCl_{2} 1,8
mM, HEPES 5 mM; pH 7,0) de rana; los compuestos así preparados
fueron aplicados mediante superfusión al oocito a una velocidad de
flujo de 5 ml/min. Las corrientes de membrana fueron registradas
mediante un osciloscopio digital NIC-310 (de la
empresa Nicolet, Madison [Wisconsin], Estados Unidos). Las
aplicaciones se realizaron a intervalos de 15 minutos (mínimo) con
el fin de permitir un período de reposo farmacológico adecuado y
para que los oocitos se recuperasen de la desensibilización.
La Figura 36 ilustra la inhibición, proporcional
a la dosis, de las corrientes de cloruro inducidas por el LPA, por
parte de los compuestos 106-110. El compuesto 108
fue el mejor inhibidor, con un valor de CI_{50} de unos 8,1 nM.
Los compuestos que presentaban grupos alquilo de cadena lineal más
corta o más larga exhibieron una eficacia decreciente a la hora de
inhibir las corrientes de cloruro inducidas por el LPA, aunque el
compuesto 107 mostró una eficacia similar a la del compuesto 108,
con un valor de CI_{50} de unos 10,2 nM. En la Figura 37 se
comparan los valores de CE_{50} correspondientes a la solución de
control positivo (sólo LPA), 25 nm, y a una solución que contenía
LPA y 100 nM del compuesto 108, 343 nM. De los datos se concluye que
el compuesto 108 inhibe eficazmente la señalización inducida por el
LPA a través de los receptores PSP24 en los oocitos de
Xenopus.
Sobre la base de estos resultados, se examinó
asimismo la eficacia del compuesto 108 como antagonista de los
receptores EDG-2, EDG-4 y
EDG-7 en células RH7777 que expresan heterólogamente
cada uno de los receptores.
La Figura 38 ilustra el efecto del compuesto 108
sobre los incrementos del Ca^{2+} en células que expresaban el
EDG-2, el EDG-4 y el
EDG-7, expuestas a una combinación de LPA 18:1 y
compuesto 108. Para la realización de estos experimentos, se eligió
una concentración de LPA cercana la CE_{50}. El compuesto 108
inhibió significativamente los incrementos del Ca^{2+},
reduciéndolas hasta niveles de alrededor de un 63% y de un 56%
respecto del control, respectivamente, en líneas celulares que
expresaban el EDG-2 y el EDG-7. En
cambio, en líneas celulares que expresaban el
EDG-4, el compuesto 108 aumentó significativamente
los incrementos del Ca^{2+}, hasta niveles de alrededor de un
148% respecto del control.
Por lo tanto, cabe esperar que los compuestos
fosfatados de cadena lineal inhiban selectivamente in vivo
la actividad del EDG-2 y del EDG-7,
y que aumenten selectivamente in vivo la actividad del
EDG-4.
Cada una de las referencias indicadas a
continuación se incorpora en la presente por referencia en su
totalidad en el documento de esta solicitud.
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Aunque en la presente invención se han ilustrado
y descrito detalladamente formas de realización preferidas, será
evidente para los expertos en la materia que es posible realizar
diversas modificaciones, adiciones, sustituciones, etc., sin
apartarse del espíritu de la presente invención y, por lo tanto,
dichas modificaciones, adiciones, sustituciones, etc., se
consideran incluidas dentro del ámbito de la invención, tal como se
define en las reivindicaciones que se indican a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No
forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido
una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se
pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes
declina cualquier responsabilidad al respecto.
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Corporation
\vskip0.400000\baselineskip
<120> AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DE LOS
RECEPTORES DEL LPA Y PROCEDIMIENTOS DE USO
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 20609/182
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/190,370
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-03-17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1095
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1056
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 351
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1062
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
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<211> 353
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (16)
1. Compuesto según la fórmula (I)
donde
- \quad
- X^{1} es (HO)_{2}PO-Z^{1}- o (HO)_{2}PO-Z^{2}-P(OH)O-Z^{1}-;
- \quad
- X^{2} y X^{3} son ambos R^{1}-NR^{2}-A-, cada uno siendo igual o diferente;
- \quad
- A es un enlace directo, (CH_{2})_{k}, siendo k un número entero comprendido entre 0 y 30, o es O;
- \quad
- Z^{1} es -O(CH_{2})_{m}, siendo m un número entero comprendido entre 1 y 50, o es -O-;
- \quad
- Z^{2} es -O(CH_{2})_{n}, siendo n un número entero comprendido entre 1 y 50, o es -O-;
- \quad
- Q^{1} y Q^{2} son, independientemente, H_{2} o =O;
- \quad
- R^{1} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, seleccionadas del grupo de los alquilos, los alcóxidos, los ácidos y los alcoholes, un acilo que incluye un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, -C(O)-O-R^{7}; y
- \quad
- R^{2} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30;
- \quad
- R^{7} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30;
- \quad
- donde cuando X^{1} es (HO)_{2}PO-O-, X^{2} es NHCH_{3}, Q^{1} es H_{2} y Q^{2} es =O, entonces X^{3} no es -NHR_{2}, donde R_{2} es hidrógeno o un acilo sustituido por metilo o fenilo.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que:
- Q^{1} es H_{2};
- Q^{2} es =O;
- X^{1} es (HO)_{2}PO-Z^{1}-; y
- X^{2} y X^{3} son ambos R^{1}-NH-;
3. Compuesto según la reivindicación 2, en el
que X^{3} es -NH_{2} y X^{2} es R^{1}-NH-,
siendo R^{1} un alquilo de cadena lineal de C14 a C18.
4. Compuesto según la reivindicación 3, en el
que R^{1} es un alquilo C14.
5. Compuesto según la reivindicación 3, en el
que R^{1} es un alquilo C18.
6. Compuesto según la reivindicación 2, en el
que
- X^{3} es NHR^{1}-, siendo R^{1} un grupo acetilo; y
- X^{2} es NHR^{1}-, siendo R^{1} un alquilo C14.
7. Composición farmacéutica que comprende:
- un portador farmacéuticamente aceptable y
- un compuesto según la reivindicación 1.
8. Procedimiento para modular la actividad del
receptor del LPA in vitro, que comprende:
- proporcionar un compuesto según la reivindicación 1 que tiene actividad como agonista del receptor del LPA o como antagonista del receptor del LPA, y
- poner en contacto un receptor del LPA in vitro con el compuesto en condiciones eficaces para modular la actividad del receptor del LPA.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el receptor del LPA está presente en una célula mantenida en
un cultivo.
10. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el receptor del LPA se selecciona del grupo que consiste en
EDG-2, el EDG-4, el
EDG-7 y el PSP-24.
11. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el compuesto tiene actividad como agonista del receptor del
LPA, y dicho contacto se lleva a cabo en condiciones eficaces para
inducir la actividad del receptor del LPA.
12. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el compuesto tiene actividad como antagonista del receptor
del LPA, y dicho contacto se lleva a cabo en condiciones eficaces
para reducir la actividad del receptor del LPA.
13. Uso de un compuesto según la reivindicación
1, que tiene actividad como antagonista del receptor del LPA, para
la fabricación de un medicamento anticanceroso.
14. Uso según la reivindicación 13, en el que el
medicamento anticanceroso está destinado al tratamiento del cáncer
de próstata o del cáncer de ovario.
15. Uso de un compuesto según la reivindicación
1, que tiene actividad como agonista del receptor del LPA para la
fabricación de un medicamento que induce la proliferación
celular.
16. Procedimiento para la fabricación un
compuesto según la reivindicación 1, que comprende:
hacer reaccionar
(Y^{2}O)_{2}PO-Z^{11}-Z^{13}
o
(Y^{2}O)_{2}PO-Z^{12}-P(OH)O-Z^{11}-Z^{13},
donde
- \quad
- Z^{11} es -O(CH_{2})_{m}, siendo m un número entero comprendido entre 1 y 50, o es -O-;
- \quad
- Z^{12} es -O(CH_{2})_{n}, siendo n un número entero comprendido entre 1 y 50, o es -O-;
- \quad
- Z^{13} es H o un primer grupo saliente, o bien -Z^{11}-Z^{13} juntos forman el primer grupo saliente; e
- \quad
- Y^{2} es H o un grupo protector,
con un compuesto intermedio según la fórmula
(VI)
donde
- \quad
- X^{12} y X^{13} son ambos R^{11}-NR^{12}-A-, siendo cada uno iguales o diferentes entre sí;
- \quad
- X^{11} es OH, NH_{2}, SH o un segundo grupo saliente;
- \quad
- A es o bien un enlace directo, o bien (CH_{2})_{k}, siendo k un número entero comprendido entre 0 y 30, o es O;
- \quad
- Q^{11} y Q^{12} son, independientemente, H_{2} o =O;
- \quad
- R^{11} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, seleccionadas del grupo de los alquilos, los alcóxidos, los ácidos y los alcoholes, un acilo que incluye un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, -C(O)-O-R^{16}; y
- \quad
- R^{12} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30;
- \quad
- R^{16} es, independientemente, hidrógeno, un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, un alquenilo de cadena lineal o ramificada de C2 a C30, un anillo aromático con o sin monosustituciones, disustituciones o trisustituciones del anillo, un acilo que incluye un alquilo de C1 a C30 o un anillo aromático, un arilalquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30, o un ariloxialquilo que incluye un alquilo de cadena lineal o ramificada de C1 a C30;
si es necesario, después se lleva a
cabo una etapa de desprotección, realizándose tanto dicha etapa de
reacción como dicha etapa de desprotección en condiciones que
resultan eficaces para obtener un compuesto según la fórmula (I),
donde X^{1} es (HO)_{2}PO-Z^{1}- o
(HO)_{2}PO-Z^{2}-P(OH)O-Z^{1}-.
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