ES2293663T3 - Procedimiento para la caracterizacion de celulas en suspension. - Google Patents
Procedimiento para la caracterizacion de celulas en suspension. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2293663T3 ES2293663T3 ES97949270T ES97949270T ES2293663T3 ES 2293663 T3 ES2293663 T3 ES 2293663T3 ES 97949270 T ES97949270 T ES 97949270T ES 97949270 T ES97949270 T ES 97949270T ES 2293663 T3 ES2293663 T3 ES 2293663T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antigens
- cells
- markers
- particles
- antibodies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE DETECCION Y DETERMINACION DEL FENOTIPO DE CELULAS OBJETIVO EN SUSPENSIONES CELULARES MEDIANTE PARTICULAS ENVUELTAS DE ANTICUERPOS/LIGANDOS DIRIGIDOS CONTRA DETERMINANTES ANTIGENICOS/RECEPTORES EXPRESADOS SOBRE LAS CELULAS OBJETIVO, QUE SE CARACTERIZA POR EL HECHO DE QUE VARIOS TIPOS DE PARTICULAS, SIENDO CADA PARTICULA SEPARABLE VISUALMENTE O MEDIANTE INSTRUMENTOS POR FLUORESCENCIA, COLOR Y ESPESOR, Y CADA PARTICULA ENVUELTA DE UN ANTICUERPO O DE UN LIGANDO DIFERENTE, ESTAN SOMETIDAS A UNA INCUBACION SIMULTANEA O SUCESIVAMENTE CON SUSPENSIONES CELULARES QUE CONTIENEN LAS CELULAS OBJETIVO, EN RELACION O NO CON UN PROCEDIMIENTO DE ENRIQUECIMIENTO CONOCIDO POR SI MISMO, UN USO DEL PROCEDIMIENTO Y UN EQUIPO.
Description
Procedimiento para la caracterización de células
en suspensión.
\global\parskip0.880000\baselineskip
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento para la identificación y la caracterización de las
células eucarióticas.
En diversas enfermedades tales como los tumores
primarios y secundarios, los trastornos alérgicos, autoinmunes,
inflamatorios, proliferativos, infecciosos, y destructivos, o en las
enfermedades para las que los mecanismos subyacentes resultan poco
claros, sería de gran importancia poder determinar el mayor número
posible de características de las células implicadas en el proceso
patológico. Una determinación exacta del número de una multiplicidad
de diferentes marcadores en dichas células mejoraría
significativamente el diagnóstico, la prognosis y la elección de la
terapia subsiguiente. Si dicho procedimiento fuese simple y rápido,
sería fácil diagnosticar los trastornos patológicos en una etapa
temprana de la enfermedad, incrementando así las probabilidades de
seleccionar las opciones terapéuticas en el momento en el que la
terapia puede ser más efectiva. Además, en algunas circunstancias
es de crucial importancia hacer un diagnóstico inmediato y correcto,
con el fin de distinguir ente tumores malignos y benignos, para
auxiliar al cirujano en la selección del procedimiento operatorio
adecuado.
En la actualidad, se encuentran disponibles los
siguientes procedimientos de diagnosis relacionados con los
anteriores trastornos patológicos: examen morfológico convencional
de secciones de tejido, frotis o citospin de células y
procedimientos inmunológicos que comprenden inmunoquímica,
citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia. Además,
en secciones congeladas de tejidos se realizan evaluaciones
morfológicas preoperacionales de las biopsias de especímenes de
tejidos.
Mediante los procedimientos no inmunológicos
basados en criterios morfológicos, los diagnósticos sólo pueden
distinguir entre células normales y patológicas.
Los procedimientos inmunológicos tales como la
inmunocitoquímica y la citometría de flujo son herramientas
diagnósticas valiosas, aunque sufren múltiples limitaciones
importantes. En los dos procedimientos se exponen las poblaciones
heterogéneas de células a anticuerpos u otros ligandos para que se
unan a las células diana. En los estudios de citometría de flujo se
pueden incubar células vivas o fijadas con el fin de permitir que
los anticuerpos marcados con fluorescencia se unan a los antígenos
de membrana o intracelulares relevantes, antes de que se analice la
suspensión de células en el instrumento. Para la inmunocitoquímica
es necesaria la preparación de las secciones de tejido, citospins o
frotis, fijación e inmunotinción de las células antes de su
evaluación al microscopio. La visualización de un anticuerpo unido
se obtiene directamente mediante una o múltiples etapas que
culminan con una reacción de color con un enzima/sustrato, que
permite la observación al microscopio de las células teñidas. El
procedimiento de múltiples etapas no se puede completar en el mismo
día del muestreo de las células. Además, generalmente se necesita la
concienzuda evaluación de un patólogo experto para obtener
resultados fiables. Por ejemplo, si las células anormales se
identifican en una población de células mezcladas y la proporción
de células patológicas a normales es pequeña, tal como la de las
células malignas en una muestra de médula ósea o sangre periférica,
puede resultar necesaria una gran cantidad de trabajo de un
patólogo experto para identificar las células. Otro problema está
relacionado con la poca existencia de anticuerpos que reconocen
antígenos expresados de modo selectivo y consistente en todas las
células diana. Si el objetivo consiste en identificar células
tumorales en la sangre o la médula ósea, se utilizan generalmente
anticuerpos dirigidos contra marcadores "tejido específicos",
tales como las citoqueratinas que se encuentran en las células
epiteliales. Sin embargo, como es sabido que algunas células
normales pueden expresar citoqueratinas y que no todas las células
epiteliales malignas lo hacen, existe el riesgo de resultados falsos
tanto positivos como negativos.
Se pueden utilizar anticuerpos marcados con
fluorescencia con el fin de detectar células diana tanto mediante
microscopía de fluorescencia como por citometría de flujo. El primer
procedimiento se puede utilizar con éxito con el fin de demostrar
la unión de un único anticuerpo, aunque la utilización de un solo
criterio morfológico como procedimiento adicional, para distinguir
entre células normales y patológicas, es muy limitado. Además, la
fluorescencia generalmente se extingue y desaparece rápidamente
durante la observación al microscopio. Por consiguiente, se
necesita estudiar las células fluorescentes y evaluarlas
microscópicamente en un corto período de tiempo después de la unión
al anticuerpo. El análisis mediante citometría de flujo necesita la
presencia de un número elevado de células diana para proporcionar
resultados fiables. Además, el procedimiento no proporciona la
posibilidad de análisis morfológico o de distinguir entre células
fluorescentes diana o no diana. Además, muchos de los
procedimientos mencionados tienen la desventaja de que durante las
etapas del procedimiento se pierden las células.
Recientemente se han descrito mejores
posibilidades para detectar células diana (WO94/07138, WO94/07139,
WO95/24648). En tales procedimientos, se utilizan anticuerpos
unidos a partículas superparamagnéticas con el fin de detectar y
seleccionar las células que se deben identificar. Una limitación de
este procedimiento consiste en que es difícil demostrar
directamente la naturaleza patológica de las células unidas a la
superficie de las partículas. Una ventaja en comparación con los
demás procedimientos descritos es, sin embargo, la simplicidad del
procedimiento y que los resultados se obtienen en un período de
tiempo corto.
Con el fin de confirmar todavía más la
naturaleza patológica de las células teñidas, fluorescentes o unidas
a las inmunpartículas es importante caracterizar las células diana
mediante más de un marcador. El objetivo consiste en obtener
información biológica importante e información con significancia
diagnóstica y pronóstica. Si el número de células diana es elevado,
se puede utilizar citometría de flujo con el fin de estudiar en
paralelo la unión de dos anticuerpos fluorescentes diferentes unidos
a las células. Sin embargo, este procedimiento no permite examinar
células individuales y su morfología, y de hecho identificar a las
células fluorescentes como las verdaderas células diana. La
inmunocitoquímica permite estudiar en paralelo un máximo de dos
marcadores, uno mediante la visualización enzimática convencional
del anticuerpo unido y el otro mediante un procedimiento de
amplificación con oro/plata. Los dos procedimientos de múltiples
etapas son relativamente complicados, largos y requieren de
equipamiento costoso y/o un grado especial de experiencia en las
respectivas áreas.
Mediante el procedimiento inmunomagnético, se
puede lograr una caracterización adicional de las células enteras
mediante la preparación de citospin de las células seleccionadas
magnéticamente seguido de análisis por inmunotinción como en la
inmunocitoquímica convencional. Por consiguiente, son pertinentes
las mismas limitaciones que se describieron para la
inmunocitoquímica, y además debido a que las células diana presentan
cuentas unidas en su superficie, puede ser difícil hacer que se
peguen a los portas utilizados en las preparaciones cistopin
convencionales.
Los documentos
US-A-5340719 &
DE-A-3811566 dan a conocer
procedimientos ópticos de selección en los que las células se
combinan con uno o más conjuntos de diferentes microesferas que
difieren en color o tamaño.
La patente WO 94/07142 da a conocer un ensayo de
la presencia y abundancia relativa de subpoblaciones de linfocitos
T utilizando diferentes anticuerpos unidos a diferentes partículas.
Los dos procedimientos se utilizan con el fin de aislar células
hematopoyéticas sin requerimientos de especificidad y utilizan
etapas metodológicas que incrementan el riesgo de dañar las células
diana.
En conclusión, los procedimientos existentes
proporcionan la posibilidad de estudiar como máximo dos marcadores
independientes, y presentan múltiples problemas importantes y
limitaciones inherentes a los procedimientos descritos. Fue por
consiguiente deseable desarrollar un procedimiento que de un modo
más simple, rápido y fiable pudiese ayudar a identificar y
caracterizar las células patológicas diana. La complejidad y
heterogeneidad de la biología celular hace necesario poder examinar
la expresión de múltiples marcadores biológicos independientes en
las mismas células. Dicha información biológica podría ser de vital
importancia diagnóstica y pronóstica y podría auxiliar en la
elección de alternativas terapéuticas. Con el examen de múltiples
marcadores en paralelo sería posible obtener una información más
fiable sobre la naturaleza patológica de las células diana,
mejorando de este modo la fiabilidad del diagnóstico y ayudando en
la exclusión de falsos positivos y negativos. De manera importante,
la caracterización de múltiples parámetros podría comprender
marcadores de la proliferación celular, la muerte celular (tal como
la apoptosis), adhesión, motilidad, invasión, antigenicidad,
inflamación, destrucción celular, mecanismos autoinmunes,
angiogénesis, agresividad de la enfermedad, metástasis de tumores,
e inhibidores de tales funciones. Además, si se pueden examinar
múltiples marcadores también al nivel de células individuales,
sería posible estudiar la heterogeneidad celular e identificar
subconjuntos de células con propiedades biológicas específicas. En
algunas enfermedades también sería importante estudiar las células
patológicas obtenidas de diferentes lugares en el mismo paciente
con el fin de determinar si las características celulares pueden
cambiar de un lugar a otro, proporcionando de este modo información
adicional de importancia biológica y pronóstica. En conjunto, el
impacto que puede tener la obtención de información del tipo que se
describe en la presente memoria para la evaluación clínica y el
tratamiento de los pacientes difícilmente se puede subestimar.
Estos objetivos se consiguen en la presente
invención tal como resulta caracterizado mediante las
reivindicaciones adjuntas.
Se introduce un nuevo concepto en la
caracterización de células diana intactas en suspensiones celulares,
haciendo posible una identificación microscópica directa de más de
dos marcadores asociados a la membrana. Con el presente
procedimiento se pueden estudiar en la misma operación múltiples
marcadores de membrana celular del origen, la biología y el destino
potencial de las células diana. El procedimiento es muy simple y se
puede completar en un período de tiempo muy corto sin necesidad de
instrumentación avanzada y cara. Con el presente procedimiento, se
pueden estudiar microscópicamente las células diana, con un mínimo
de manipulación, sin pérdida de células, para determinar la
expresión de múltiples moléculas marcadoras independientes, incluso
al nivel de células individuales. En consecuencia, además de obtener
una imagen de los parámetros biológicos presentes en la población
de células diana, dicho procedimiento también permite el examen de
la variación intercelular en la expresión de moléculas marcadoras,
proporcionando información de vital importancia biológica y
médica.
En breve, el procedimiento se puede realizar tal
como se describe en la presente memoria: microesferas teñidas o
fluorescentes (cuentas, partículas) conjugadas a anticuerpos o
ligandos que se pueden unir a los determinantes de las membranas
celulares que se desea estudiar, se añaden a la suspensión de
células y se incuban con una rotación suave. A continuación, se
examinan muestras de la suspensión celular en un microscopio de
fluorescencia para detectar células con microesferas de diferentes
colores o fluorescencia. El grado y la variabilidad del enlace a
las células de las diferentes microesferas se pueden determinar y
cuantificar. La valoración de las partículas unidas a las células
se puede determinar, si se desea, mediante un procedimiento
automático.
A continuación se describe la presente invención
con mayor detalle mediante los ejemplos no limitativos de la
invención, y las figuras en las que:
La Figura 1 ilustra la unión de 4 tipos de
microesferas a 4 determinantes antigénicos expresados en la membrana
de una célula diana. La unión en este caso está mediada por 4
anticuerpos diferentes, que reconocen cada uno de ellos uno de
dichos 4 antígenos, en la que los anticuerpos se conjugaron primero
a las microesferas respectivas, directamente mediante un enlace
químico (Figura 1, los tres ejemplos a la izquierda) o
indirectamente, en la que las cuentas se revisten previamente con
avidina antes de su conjugación a un anticuerpo biotinilado (Figura
1, ejemplo a la derecha) tal como se ilustra en la Figura 1, un
anticuerpo se une a una microesfera teñida de azul, un anticuerpo a
una pequeña y otro a una gran microesfera roja fluorescente,
mientras que un cuarto anticuerpo ha sido conjugado con
avidina-biotina a una microesfera verde
fluorescente.
La Figura 2 ilustra como se puede utilizar la
presente invención para caracterizar dos o más determinantes de la
membrana celular en una situación en la que las células diana son
raras en una suspensión de células mezcladas, necesitando así un
procedimiento de enriquecimiento antes de la evaluación de la
muestra. En el caso ilustrado, se unen a la membrana celular
cuentas superparamagnéticas revestidas con anticuerpos junto con
microesferas fluorescentes rojas y verdes conjugadas directamente o
mediante una unión avidina-biotina a distintos
anticuerpos. En tal situación, se puede obtener un enriquecimiento
inmunomagnético mediante la utilización de un imán fuerte que atrae
a las células unidas a cuentas magnéticas. La suspensión enriquecida
en células se examina a continuación en un microscopio en el que se
puede observar la unión de las microesferas fluorescentes a las
células diana unidas a cuentas magnéticas.
Las partículas fluorescentes o teñidas
distinguibles visual o instrumentalmente, que pueden ser del mismo
o diferente tamaño, utilizadas en la presente invención están
conjugadas a ligandos tales como anticuerpos, o fragmentos de
anticuerpos, lectinas y factores de crecimiento que se pueden unir a
moléculas específicas expresadas en la membrana de las células
anormales, de modo que las partículas unidas se pueden identificar
microscópicamente. Los ejemplos comprenden la utilización de
microesferas fluorescentes de látex de poliestireno de múltiples
colores que se pueden observar en un microscopio de fluorescencia y
partículas no fluorescentes teñidas, rojas, amarillas, verdes,
negras y azules, que se pueden detectar mediante microscopía de luz
convencional. Los anticuerpos conjugados a las microesferas
comprenden todos los que reconocen antígenos, receptores y otros
determinantes expresados en la membrana de las células anormales y
en las células normales, véase a continuación. Mediante la
combinación de conjugados de anticuerpos y partículas relevantes a
las células que se deberán estudiar, se puede obtener rápidamente y
directamente una huella digital de las características celulares en
la suspensión de células. Dichas huellas digitales antigénicas
podrían ser muy valiosas en la evaluación de características
biológicas importantes de las células, ver lo anteriormente
descrito, poblaciones o subpoblaciones celulares. La simplicidad y
velocidad con la que el procedimiento puede proporcionar dicha
información es sorprendente y constituye un elemento clave de la
presente invención.
Las partículas fluorescentes y teñidas
conjugadas a anticuerpos han sido utilizadas en múltiples tipos de
inmunoensayos con el fin de determinar, p. ej., la presencia de
antígenos libres, proteínas, virus y bacterias en fluidos
biológicos. Con células eucarióticas intactas, las esferas
fluorescentes conjugadas a anticuerpos han sido utilizadas para
estudiar en cada caso una única proteína expresada en un tipo
específico de células normales, tales como monocitos, linfocitos,
hepatocitos y fibroblastos. El objetivo de tales estudios ha sido
el examen de la motilidad de los marcadores de membrana en los
macrófagos o parámetros metabólicos en los hepatocitos. No se han
encontrado en la literatura reportajes sobre intentos de estudiar
células anormales, tales como las células cancerosas y las células
neoplásicas benigna y las células anormales que se encuentran en
una multiplicidad de trastornos infecciosos, reactivos, autoinmunes,
inflamatorios y proliferativos. Además, no se describe la
combinación de múltiples anticuerpos conjugados a diferentes
microesferas teñidas o fluorescentes en la misma población de
células o en células individuales. Además, no se han utilizado
dichos procedimientos en el estudio, con fines diagnósticos, de
subpoblaciones de células diana en poblaciones mixtas de
células.
Las partículas que se deben utilizar pueden ser
microesferas de látex de poliestireno fluorescentes o partículas no
fluorescentes de diferentes colores. El tamaño de las microesferas
pueden estar comprendido entre 0,01 \mum y 6 \mum. Las
partículas deben proporcionar la posibilidad de poder conjugar
anticuerpos u otros ligandos en su superficie. Esto se puede lograr
directamente, mediante grupos químicos tales como carboxilo, amino
u otros grupos, o indirectamente mediante la unión de los
anticuerpos a microesferas previamente revestidas con proteínas
tales como la avidina, estreptavidina, proteína A, o con anticuerpos
que se pueden hacer reaccionar con un segundo anticuerpo. El tamaño
de las microesferas se pueden seleccionar para que se ajuste al
tamaño de las células y el objetivo de la investigación, de tal
modo que pueda facilitar la identificación de diferentes conjugados
de anticuerpos-microesferas. Se considera que un
tamaño de partícula de p. ej., 1 \mum facilita la identificación
de un número relativamente pequeño de partículas unidas, mientras
que un tamaño menor podría posiblemente ser ventajoso si se debe
estudiar una proteína marcadora que se expresa a una densidad
elevada. Otra característica importante de la presente invención es
que se puede aplicar tanto cuando se deben examinar números muy
pequeños o muy grandes de células. También es importante que las
microesferas fluorescentes puedan retener su intensidad de
fluorescencia durante un período de tiempo muy largo.
Los anticuerpos que reconocen los antígenos
marcadores de membrana relevantes o receptores pueden ser IgG
completas de un isotipo cualquiera, anticuerpos IgM o cualquier
fragmento de dichos anticuerpos, lo que comprende asimismo
anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpos. El nuevo
procedimiento comprende unir dichas microesferas fluorescentes o
teñidas a una célula diana en una suspensión con un pequeño número
de células no diana, y en otros casos el número de células diana es
bajo en comparación con el de las células no diana. La suspensión
de células se incuba con entre 2 y 6 anticuerpos cada uno de ellos
conjugado a diferentes microesferas, del mismo o de diferente
tamaño, de un colorante específico o color fluorescente. La
proporción entre el número de partículas y el número de células
diana puede estar comprendida entre 5:1 y 0,5:1, preferentemente de
5:1, limitada por el tamaño de las partículas. La suspensión de
células se debe incubar con las partículas revestidas con
anticuerpo durante entre 5 a 10 minutos y 2 horas, preferentemente
durante 30 minutos, a entre 0ºC y 37ºC, preferentemente a 4ºC con
rotación suave. Después de la incubación, se toman muestras de la
suspensión de células para evaluarlos en un microscopio de
fluorescencia u otros dispositivos de visualización o imagen en los
que se puedan observar las partículas fluorescentes y las partículas
teñidas. Las microesferas que se unen a las células se pueden
visualizar y el número de células con los diferentes tipos de
partículas unidos a su superficie se puede determinar, con o sin la
enumeración del número de cuentas unido a las células. Debido a que
es posible utilizar una combinación de múltiples microesferas
revestidas con anticuerpos, se pueden utilizar filtros de
fluorescencia adecuados al estudio de diferentes espectros de
emisión fluorescente. El procedimiento proporciona también la
posibilidad de análisis de imagen semiautomático mediante vídeo y
ordenador para determinar la presencia de partículas teñidas o
fluorescentes unidas a las células.
Los anticuerpos pueden ser de origen murino,
rata, conejo o humano y preferentemente pueden reconocer antígenos
presentes en las células diana y no en las células normales en una
suspensión de células mezcladas. Una lista de los
anticuerpos/ligandos comprende, aunque sin resultar limitativa, los
dirigidos contra grupos de determinantes antigénicos, por ejemplo
el antígeno CD56/NCAM, antígeno panepitelial EGP2/grupo2, mucina de
mama (MUC1) y otros epítopos de mucina, HMW y otros antígenos
asociados a los melanomas tales como gp100, MAGE 1,2 y 3 y MUC18,
antígeno 80kD asociado a sarcomas, erbB2, receptores de factores de
crecimiento tales como EGF, TGF, PDGF, bFCF, VEGF, IGF1 y IGF2,
laminina, lamin5, uPA, uPAr, PAI, TIMP1 y 2, estromelisina, y otras
proteínas relacionadas a la invasividad, CEA, PSA, PSM, NSE,
c-Met, CD44 y las variantes ICAM-1,
integrinas, cadherinas, cateninas y otras moléculas asociadas a la
adhesión celular, marcadores de resistencia a fármacos tales como
MDR y MRP, moléculas relacionadas a la apoptosis tales como Fas y
FasL, marcadores de la proliferación celular, motilidad,
diferenciación, metástasis, angiogénesis, transducción de señal y
moléculas de la membrana relacionadas a la inflamación, productos
de oncogenes y receptores de s tales como CCR 1-5,
CXCR 1-4 y antígeno Duffy y todo tipo de marcador
de las células hematopoyéticas y linfáticas categorizado en el
sistema CD. La Tabla 1 es una lista de los grupos de
deter-
minantes de membrana a los que se puede dirigir y muestra asimismo un número de ejemplos en cada un de los grupos.
minantes de membrana a los que se puede dirigir y muestra asimismo un número de ejemplos en cada un de los grupos.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos descritos a continuación ilustran
las formas de realización y reflejan el potencial del nuevo
procedimiento para la detección y la caracterización de las células
diana, desconocido anteriormente por los expertos en la materia.
Resultó muy sorprendente que se pudiesen incubar simultáneamente, o
en secuencia, poblaciones de células mezcladas con múltiples
anticuerpos diferentes unidos a partículas, que para cada anticuerpo
la unión del complejo anticuerpo-partícula a la
célula diana fuese específico y que la unión de los diferentes
complejos se pudiese visualizar fácilmente y distinguir en un
microscopio de fluorescencia con filtros individuales y/o múltiples
compatibles con el espectro de emisión fluorescente de las
microesferas fluorescentes, o mediante el cambio a microscopía de
luz convencional con el fin de identificar mejor la unión de las
partículas teñidas no fluorescentes.
Cuando se incuban múltiples complejos
partícula-anticuerpo simultáneamente con las células
diana en una suspensión de células mezcladas, se esperaría que los
complejos se apiñasen o reaccionasen entre sí, formando complejos
que se uniesen no específicamente a las células, que por razones
estéricas u otras podrían bloquear entre sí la unión a las células,
o que la fluorescencia de las partículas podría ser enmascarada,
dificultando la distinción entre los diferentes tipos de
partículas. Sorprendentemente, sin embargo, siguiendo el
procedimiento de acuerdo con la presente invención, no se aprecian
dichos problemas. La especificidad de esta estrategia se demuestra
además en experimentos que comprenden incubar las células diana con
un conjugado de anticuerpo-partícula que produciría
fluorescencia amarilla en el microscopio y a continuación con el
mismo anticuerpo unido a partículas de fluorescencia roja. En este
caso se observó la unión del conjugado
anticuerpo-partícula amarillo, mientras que la
unión del segundo complejo quedó completamente bloqueada debido a
que se había utilizado el mismo anticuerpo para la conjugación a
las partículas amarillas y rojas.
Cuando las células diana en una suspensión de
células mezcladas son raras, tal como el de las células tumorales
en la sangre periférica y la médula ósea, se puede introducir un
procedimiento de enriquecimiento antes o en combinación con el
procedimiento de las partículas de color/fluorescentes. El
enriquecimiento se puede obtener mediante múltiples estrategias
conocidas previamente, que comprenden procedimientos inmunológicos
tales como el lavado, separación en columna, o la selección positiva
o negativa mediante inmunopartículas. Si se prefiere la
inmunoselección, la misma etapa de incubación puede comprender tanto
las cuentas magnetizables como las que no contienen hierro con los
anticuerpos de unión a las células. Después de la etapa de
enriquecimiento, la suspensión de células que contiene las células
diana se puede examinar y valorar al microscopio para determinar su
unión a partículas fluorescentes o teñidas. Además, si se utilizan
partículas inmunomagnéticas de, por ejemplo, 1 \mum para el
enriquecimiento, también se pueden observar dichas partículas unidas
a las células y utilizar como marcador celular adicional (Fig.
2).
La posibilidad de disponer de manera rápida,
simple y fiable de mapear simultáneamente los patrones de expresión
de varios marcadores relevantes en poblaciones celulares, o al nivel
de células individuales, abre nuevas vías para la investigación en
biología celular y el diagnótico de rutina, la evaluación de
prognosis y del estado de una amplia gama de enfermedades, que se
originan en todo tipo de tejidos humanos y animales. En muchas
circunstancias el diagnóstico rápido es de gran importancia en la
selección de la opción terapéutica. Los ejemplos de esto comprenden
los procedimientos quirúrgicos que se deben seleccionar dependiendo
de si, por ejemplo, un tumor mamario, de próstata o cerebro, es
maligno o no, si el agrandamiento de un nódulo linfáticos es debido
a la infiltración de células tumorales o a una reacción
inflamatoria, o qué tipo de células constituyen el engrosamiento de
las membranas sinoviales de las articulaciones, qué tipo de células
se encuentran en las agujas quirúrgicas o biopsias fibroópticas de
lesiones de la piel, pulmones, hígado, hueso, ovario o en el
intestino y otros tejidos, y qué tipo de células se puede encontrar
en las efusiones de pleura o ascites, en CSF, linfa, sangre
periférica y médula ósea. Actualmente, el diagnóstico de tales
células se basa principalmente en la evaluación morfológica y
también en la inmunocitoquímica realizada después de la preparación
de secciones de tejidos, citospin o frotis. Morfológicamente puede
ser difícil determinar la naturaleza de las células y tal como se
mencionó anteriormente, la inmunocitoquímica puede detectar como
máximo la presencia de dos marcadores. Con el nuevo procedimiento,
las células de las muestras se dispersan, por ejemplo, en disolución
salina o medio, se incuban con la combinación relevante de
anticuerpos-microesferas durante el tiempo
necesario, generalmente 30 minutos, y a continuación se examinan al
microscopio. En las suspensiones de células, las partículas unidas
se pueden reconocer fácilmente, permitiendo determinar la
caracterización inmunológica o el perfil de las células diana de un
modo sorprendentemente rápido y simple. Debido a dicha simplicidad,
la caracterización de una multiplicidad de parámetros, el corto
período de tiempo necesario para completar tanto el proceso como la
evaluación, el procedimiento representa una contribución fundamental
a los esfuerzos para lograr un diagnóstico rápido y fiable de las
enfermedades y obtener información de importancia crucial en la
gestión posterior de los pacientes.
Con el fin de ilustrar las situaciones en las
que dicha caracterización es importante, se incluyen los siguientes
ejemplos teóricos:
En el cáncer de mama es sabido que la expresión
en las células tumorales de marcadores tales como erbB2, receptor
EGF e IGF2 se puede asociar a un incremento de la proliferación y la
agresividad de la enfermedad. Además, la expresión de otros
determinantes tales como EGP2, uPAr, VEGF, MUC1, MDR, Fas y FasL
puede reflejar características importantes que determinan la
capacidad de las células para la metástasis, la inducción de
agiogénesis, la resistencia a la quimioterapia, así como también
para la apoptosis de las células tumorales o las células T del
huésped. Mediante la utilización de una combinación de microesferas
se pueden registrar varios de estos parámetros simultáneamente en
una sola operación. Dichos estudios se pueden realizar en biopsias
de tumores primarios, o biopsias de aguja de metástasis sólidas y
en muestras de fluidos pleurales o ascíticos, sangre y médula
ósea.
En los pacientes infectados por VIH, la
caracterización de los diferentes subconjuntos de linfocitos T es
de importancia vital. Los ejemplos de determinantes que se pueden
estudiar con el nuevo procedimiento además de los marcadores más
comunes de las células T son los receptores de las quimioquinas y
las moléculas relacionadas a la apoptosis tales como Fas y
FasL.
En los melanomas malignos el grado o la falta de
diferenciación de las células tumorales puede reflejar el potencial
agresivo de la enfermedad en el sentido de que menos diferenciación
está relacionada con una mayor malignidad. Además, en la respuesta
inmune son importantes múltiples moléculas, que comprenden
marcadores tales como gp 100, MAGE1, 2, 3, B7, Fas y FasL. Debido a
que dichos marcadores son importantes para la efectividad de la
imunoterapia y la vacunación, la caracterización de éstos así como
también de otros antígenos asociados a los melanomas es de gran
importancia en la gestión clínica de los pacientes. Dichas
caracterizaciones se pueden realizar fácilmente mediante el nuevo
procedimiento.
El agrandamiento de los ganglios linfáticos
puede reflejar diferentes tipos de trastornos reactivos, infecciosos
o malignos. Por consiguiente, puede ser importante determinar si
dichos ganglios linfáticos contienen células tumorales o no. Si se
encuentran células tumorales, la determinación del tipo de células
malignas puede influenciar decisivamente la selección de la
terapia. Un ejemplo es la metástasis a los ganglios linfáticos que
puede resultar de cáncer de pulmón de célula pequeña (EGP2) o
melanoma maligno (HMW250000). Con la selección adecuada del
conjugado de anticuerpo-microesfera esta distinción
se puede realizar en menos de una hora con el nuevo
procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron células de cáncer de mama humano
MCF-7 con microesferas fluorescentes rosa brillante
de 1 \mum revestidas con avidina, con o sin anticuerpo MOC31
anti-EGP2 (anti-marcador de célula
epitelial) conjugado a biotina, y/o con cuentas inmunomagnéticas
(4,5 \mum) revestidas con un anticuerpo contra mucina de mama
(MUC1) (BM7).
Se examinó al microscopio una suspensión de
células MCF-7 incubada con partículas fluorescentes
sin anticuerpo MOC31. No se detectaron cuentas fluorescentes unidas
a las células tumorales. Experimentos semejantes con partículas
fluorescentes conjugadas a MOC31 biotina-avidina
mostraron entre 5 y 10 partículas fluorescentes unidas a la
superficie de las células tumorales. En otro experimento, se
incubaron células MCF-7 con partículas
inmunomagnéticas revestidas con el anticuerpo BM7 que se une a las
células tumorales, seguido de una incubación con partículas
fluorescentes con y sin el anticuerpo MOC31. Se descubrió que las
células tumorales con cuentas inmunomagnéticas unidas en la
superficie también mostraron unión, y solamente, a las partículas
fluorescentes conjugadas a MOC31. Los dos tipos de partículas se
pueden utilizar fácilmente en paralelo, y los resultados demuestran
que no se produce unión no-específica a las
partículas que no tienen anticuerpo director.
Se incubaron células de cáncer de mama humano
SKBr3 con múltiples combinaciones de microesferas de látex provistas
de fluorescencia rosa brillante conjugadas al anticuerpo MOC31 con
o sin incubación simultánea o en secuencia, con cuentas
inmunomagnéticas revestidas con los anticuerpos MOC31 o BM7. Los
tamaños de partícula fueron como en el Ejemplo 1 anterior. Si tanto
las cuentas inmunomagnéticas como las fluorescentes tenían el mismo
anticuerpo director y se habían incubado a la vez, se observaron
los dos tipos de cuentas unidas a las células tumorales. Si
cualquiera de estas microesferas/partículas se incubó primero
durante 30 minutos y a continuación durante otros 30 minutos se
incubó con las otras partículas conjugadas a anticuerpo, se bloqueó
por completo la unión del segundo complejo de
anticuerpo-partícula. La unión de cada tipo de
partícula conjugada a un anticuerpo diferente e incubada
simultáneamente mostró el mismo patrón de unión al observado si cada
uno de ellos se estudia en experimentos separados.
Se incubaron células de cáncer de mama, que es
sabido que expresan múltiples antígenos diferentes en su superficie,
simultáneamente con anticuerpos que reconocen 4 de estos antígenos
diferentes. Cada uno de los anticuerpos había sido conjugado
independientemente a cuatro tipos de microesferas/cuentas: 1)
microesferas de látex teñidas de azul (0,5 \mum), 2) microesferas
de látex de fluorescencia rosa brillante (1 \mum), 3) microesferas
de fluorescencia amarilla (1 \mum) y 4) partículas
inmunomagnéticas superparamagnéticas (4,5 \mum). El procedimiento
según la presente invención demostró que las células tumorales se
unieron a los 4 tipos diferentes de cuentas que se pudieron
reconocer claramente mediante la utilización de una combinación de
microscopía convencional y de fluorescencia. El número de
partículas unido a cada uno de las células osciló para cada
complejo de anticuerpo-partícula de acuerdo con el
patrón de expresión conocido del antígeno correspondiente. Los
anticuerpos reconocieron los antígenos siguientes: EGP2, MUC1,
receptor EGF y un marcador epitelial independiente reconocido por
el anticuerpo 595.
Se añadieron células tumorales humanas NICF7 a
células mononucleares de sangre periférica de voluntarios saludables
en una proporción de células tumorales por célula mononuclear de
1/1000. La suspensión de células se incubó con anticuerpo MOC31
anti-epitelial unido a microesferas de fluorescencia
rosa brillante (1 \mum) mediante un enlace avidina/estreptavidina
y simultáneamente a inmunocuentas superparamagnéticas (4,5 \mum)
revestidas con los anticuerpos BM7 y anti-MUC1.
Después de una incubación de 30 minutos se realizó la
inmunoselección de las células tumorales mediante las cuentas
inmunomagnéticas unidas a su superficie, y se examinaron al
microscopio muestras de la suspensión. Se encontró que las células
tumorales restantes con rosetas de cuentas en su superficie tenían
también entre 5 y 10 partículas fluorescentes en la membrana,
mientras que una célula normal contaminante no mostró unión a
ninguna de las partículas/cuentas.
Se llevó al laboratorio una suspensión de
células ascíticas extraída de un paciente sin información del origen
de las células. La suspensión de células se incubó con diferentes
partículas fluorescentes revestidas con anticuerpos e inmunocuentas
paramagnéticas según la presente invención. Las partículas
revestidas con anticuerpos que reconocen diferentes antígenos
marcadores unidos a las células en suspensión, demostraron el
epítopo maligno y la naturaleza epitelial de las células,
confirmando así el diagnóstico de cáncer de ovario. En otro caso
con fluido ascítico no se encontraron células con partículas
revestidas con anticuerpos, de acuerdo con la conclusión del
patólogo. En los dos casos, el procedimiento descrito en la presente
invención proporcionó los resultados de los diferentes marcadores
en 45 minutos, mientras que el examen morfológico e
inmunocitoquímico en paralelo de un solo marcador se completó por
primera vez más de 24 horas después.
Sin conocimiento previo de la enfermedad
subyacente, la incubación de la suspensión de células con diferentes
anticuerpos antitumorales revestidos con partículas fluorescentes e
inmunomagnéticas demostró una fuerte unión de todas las
microesferas e inmunocuentas con anticuerpos anticarcinoma y mucina
de mama (MUC1). El diagnóstico del paciente fue de cáncer de mama
con efusión pleural. Las microesferas conjugadas a anticuerpo
anti-melanoma no se unieron. En conclusión, en este
caso se identificaron asimismo con éxito las células en la muestra
clínica.
La suspensión de células obtenida de un aspirado
por aguja se incubó con microesferas fluorescentes con un
anticuerpo que es conocido que reacciona con células de cáncer
colorrectal, y simultáneamente con cuentas inmunomagnéticas
revestidas con el anticuerpo anti-epitelial MOC31.
Las microesferas fluorescentes no se unieron a ninguno de los tipos
de células en la suspensión, mientras que las inmunocuentas MOC31 se
unieron fuertemente a las células epiteliales de tiroides pero no
se unieron al gran número de macrófagos presentes en la
suspensión.
Los ejemplos anteriores demuestran que el nuevo
procedimiento según la presente invención demuestra un considerable
incremento en la potencia diagnóstica y fiabilidad ya que se puede
detectar un número superior de determinantes antigénicos en las
células diana en una operación, en un período de tiempo muy corto en
comparación con los procedimientos conocidos anteriormente.
Claims (13)
1. Procedimiento para el fenotipado de células
diana, tales como células animales y humanas, suspendidas en
disolución salina fisiológica o en medio, mediante la utilización de
partículas revestidas con anticuerpos/ligandos dirigidos contra
determinantes antigénicos/receptores expresados en las células
diana, en el que
2 a 6 anticuerpos o ligandos, en el que cada
anticuerpo está conjugado a una partícula específica instrumental o
visualmente separable mediante fluorescencia, color y tamaño, con
tamaños en el intervalo comprendido entre 0,01 \mum
y 6 \mum, en el que la proporción entre el número de partículas y el número de células diana está en el intervalo comprendido entre 5:1 y 0,5:1, se incuban bajo rotación durante 5 a 10 minutos a 2 horas con suspensiones celulares que contienen las células diana a entre 0ºC y 37ºC, preferentemente a 4ºC, en el que las suspensiones celulares se preparan y estudian sin ninguna pérdida de células.
y 6 \mum, en el que la proporción entre el número de partículas y el número de células diana está en el intervalo comprendido entre 5:1 y 0,5:1, se incuban bajo rotación durante 5 a 10 minutos a 2 horas con suspensiones celulares que contienen las células diana a entre 0ºC y 37ºC, preferentemente a 4ºC, en el que las suspensiones celulares se preparan y estudian sin ninguna pérdida de células.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
seguido de un procedimiento de enriquecimiento conocido de por sí,
y evaluación del rango de rosetas de células diana microscópicamente
en las suspensiones de células y/o por dispositivos adecuados de
visualización.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que el procedimiento de enriquecimiento se realiza con
cuentas inmuno-magnéticas de un tamaño de por lo
menos 1 \mum.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho tamaño de
partícula está en el intervalo comprendido entre 0,5 \mum y 4,5
\mum, dicha proporción es 5:1 (número de partículas/número de
células), dicho tiempo de incubación es de 30 minutos y dicha
temperatura de incubación es de 4ºC.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las partículas
utilizadas en el procedimiento son separables mediante una
combinación de fluorescencia y/o tamaño o una combinación de
espectros de emisión fluorescente, diferentes colores o diferentes
tamaños.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque las partículas utilizadas son separables
mediante una combinación de los espectros de emisión fluorescente
y/o el tamaño.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las partículas
utilizadas en el procedimiento están revestidas con
ligandos/anticuerpos dirigidos contra moléculas de adhesión,
antígenos carbohidratos, glicolípidos, receptores de factores de
crecimiento, antígenos de melanoma, antígenos de sarcoma,
marcadores de carcinoma, antígenos de neuroblastoma, antígenos de
glioma, antígenos de cáncer de cabeza y cuello, moléculas asociadas
a la apoptosis, antígenos relacionados con la motilidad, antígenos
asociados a la proliferación, antígenos asociados a la
diferenciación, antígenos relacionados con la resistencia a
fármacos, antígenos asociados a la angiogénesis, receptores de
quimioquinas, antígenos relacionados con la invasión, catepsina D,
antígeno neuroglandular y antígeno pan-humano.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque las partículas utilizadas en el
procedimiento están revestidas con ligandos/anticuerpos dirigidos
contra los receptores/antígenos que aparecen en la Tabla 1.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 8, caracterizado porque las partículas
utilizadas en el procedimiento están revestidas con anticuerpos
dirigidos contra antígenos asociados a tumores.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque los antígenos asociados a tumores son,
anticuerpo MOC31 anti-EGP2 (antimarcador de células
epiteliales), anticuerpo BM7 anti-mucina de mama
(MUC1), 595, anti-receptor EGF (425.3),
anti-erbB2 y anti-antígeno de
melanoma HMW (9.2.27).
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que las células diana son células
malignas.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que la célula diana está
caracterizada porque presenta moléculas de adhesión,
receptores de factores de crecimiento, marcadores de carcinoma,
antígenos carbohidratos, antígenos de melanoma, antígenos de
sarcoma, antígenos de glioma, marcadores asociados a la apoptosis,
marcadores relacionados con la motilidad, antígenos asociados a la
proliferación, marcadores asociados a la diferenciación, marcadores
de la resistencia a fármacos, marcadores asociados a la
angiogénesis, receptores de quimioquina, marcadores relacionados
con la invasión u otros antígenos.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que las moléculas de adhesión son cadherina-E,
los receptores de factores de crecimiento son EGFr,
c-erbB2, receptor IL-2, receptor
TNF, los marcadores de carcinoma son EGP2, MUC1, MUC2 & 3, PSA,
PSM, GA733.2, TAG72, epítopo 15-3, epítopo de
carcinoma de ovario CA-125, los antígenos
carbohidratos son LeY, CEA, epítopo 15-3, los
antígenos de melanoma son HMW 250000, gp 75/TRP-1,
p95, MAG 1, 2, 3, los antígenos de sarcoma son los epítopos TP 1 y
TP 3, los antígenos de glioma tales como el epítopo
Mel-14, los marcadores asociados a la apoptosis son
Fas, FasL, p75, los marcadores relacionados con la motilidad son
KAT-I, AMF, los antígenos asociados a la
proliferación son gp 120, los marcadores asociados a la
diferenciación son MUC 18, TA99, los marcadores de resistencia a
fármacos son MDR, MRP, los antígenos asociados a la angiogénesis
son VEGFr, bFGF, los receptores de quimioquinas son CCR, CXCR, los
marcadores relacionados con la invasión son uPAR, uPA,
PAT-1, TIMP1 & 2, MMP9, estromelisinas y los
otros antígenos son la catepsina D y el epítopo
pan-humano.
pan-humano.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NO965531A NO308755B1 (no) | 1996-12-20 | 1996-12-20 | FremgangsmÕte til karakterisering av unormale celler, anvendelse og sett for utførelse av fremgangsmÕten |
NO19965531 | 1996-12-20 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2293663T3 true ES2293663T3 (es) | 2008-03-16 |
Family
ID=19900214
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES97949270T Expired - Lifetime ES2293663T3 (es) | 1996-12-20 | 1997-12-16 | Procedimiento para la caracterizacion de celulas en suspension. |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8097429B2 (es) |
EP (1) | EP0951645B1 (es) |
AT (1) | ATE371868T1 (es) |
AU (1) | AU728190B2 (es) |
CA (1) | CA2275335C (es) |
DE (1) | DE69738076T2 (es) |
ES (1) | ES2293663T3 (es) |
NO (1) | NO308755B1 (es) |
WO (1) | WO1998028622A1 (es) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6642062B2 (en) * | 1998-09-03 | 2003-11-04 | Trellis Bioinformatics, Inc. | Multihued labels |
US6682940B2 (en) * | 1999-05-04 | 2004-01-27 | Dan A. Pankowsky | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells |
US6828157B1 (en) * | 1999-05-04 | 2004-12-07 | Dan A. Pankowsky | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells |
GB9913556D0 (en) * | 1999-06-11 | 1999-08-11 | Zeneca Ltd | Assays |
AU2002214689A1 (en) * | 2000-11-06 | 2002-05-15 | Bio-Tech Imaging, Inc. | Method and kits for detecting hepatitis infected cells |
US20030190602A1 (en) * | 2001-03-12 | 2003-10-09 | Monogen, Inc. | Cell-based detection and differentiation of disease states |
US20030199685A1 (en) | 2001-03-12 | 2003-10-23 | Monogen, Inc. | Cell-based detection and differentiation of disease states |
AU2002310222A1 (en) * | 2001-05-31 | 2002-12-09 | Chiron Corporation | P-cadherin as a target for anti-cancer therapy |
JP4568499B2 (ja) * | 2002-02-14 | 2010-10-27 | ベリデックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 低コストで細胞計数するための方法およびアルゴリズム |
TW200521433A (en) * | 2003-12-22 | 2005-07-01 | We Gene Technologies Inc | Cell detection chip and fabricating method thereof and method of detecting cell |
US8189899B2 (en) | 2004-07-30 | 2012-05-29 | Veridex, Llc | Methods and algorithms for cell enumeration in a low-cost cytometer |
SE0402536D0 (sv) * | 2004-10-20 | 2004-10-20 | Therim Diagnostica Ab | Immunoregulation in cancer, chronic inflammatory and autoimmune diseases |
US8921102B2 (en) | 2005-07-29 | 2014-12-30 | Gpb Scientific, Llc | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
US8372584B2 (en) | 2006-06-14 | 2013-02-12 | The General Hospital Corporation | Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags |
WO2007147074A2 (en) | 2006-06-14 | 2007-12-21 | Living Microsystems, Inc. | Use of highly parallel snp genotyping for fetal diagnosis |
US20080050739A1 (en) | 2006-06-14 | 2008-02-28 | Roland Stoughton | Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats |
WO2008104380A2 (en) * | 2007-02-27 | 2008-09-04 | Sentoclone Ab | Multiplex detection of tumour cells using a panel of agents binding to extracellular markers |
LT2334812T (lt) | 2008-09-20 | 2017-04-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Neinvazinis fetalinės aneuploidijos diagnozavimas sekvenavimu |
CN102432685A (zh) * | 2011-11-01 | 2012-05-02 | 中国环境科学研究院 | 检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球及其制备方法和应用 |
WO2014104019A1 (ja) * | 2012-12-26 | 2014-07-03 | デンカ生研株式会社 | 尿中ポドサイトの検出方法 |
DE102013106432A1 (de) * | 2013-06-20 | 2014-12-24 | Endress + Hauser Conducta Gesellschaft für Mess- und Regeltechnik mbH + Co. KG | Optische Indikator-Einheit und Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung einer physikalisch-chemischen Eigenschaft eines Prozessmediums in einer prozesstechnischen Anlage |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4511662A (en) * | 1982-06-18 | 1985-04-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Simultaneous assay for T and B lymphocyte populations and subpopulations |
JPH07104349B2 (ja) * | 1987-04-11 | 1995-11-13 | 株式会社日立製作所 | 細胞測定法 |
US5194300A (en) * | 1987-07-15 | 1993-03-16 | Cheung Sau W | Methods of making fluorescent microspheres |
FR2638849B1 (fr) * | 1988-11-04 | 1994-03-18 | Chemunex Sa | Procede d'amplification d'un signal fluorescent pour la recherche specifique de la presence eventuelle de particules et application a la detection et a la numeration desdites particules |
FR2638848B1 (fr) * | 1988-11-04 | 1993-01-22 | Chemunex Sa | Procede de detection et/ou de dosage dans un milieu liquide ou semi-liquide d'au moins une substance organique, biologique ou medicamenteuse soluble, par une methode d'agglutination |
US5340719A (en) * | 1990-11-23 | 1994-08-23 | Corporation Coulter | Method and apparatus for optically screening microscopic cells |
AU2115092A (en) * | 1991-10-08 | 1993-04-22 | Eastman Kodak Company | Method, test device and kit for assay of specific binding ligand using controlled flow through filtration membrane |
US5290707A (en) * | 1991-11-25 | 1994-03-01 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Method for detection of microorganisms |
US5256542A (en) * | 1992-03-09 | 1993-10-26 | Tanox Biosystems, Inc. | Selecting low frequency antigen-specific single B lymphocytes with correction for background noise |
WO1994007138A1 (en) * | 1992-09-14 | 1994-03-31 | Fodstad Oystein | Detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations |
EP1333274B1 (en) * | 1992-09-14 | 2010-04-07 | Sri International | Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques |
US5374531A (en) * | 1993-03-22 | 1994-12-20 | Zynaxis, Inc. | Immunoassay for determination of cells |
AUPN214095A0 (en) * | 1995-04-03 | 1995-04-27 | Australian Water Technologies Pty Ltd | Method for detecting microorganisms using flow cytometry |
-
1996
- 1996-12-20 NO NO965531A patent/NO308755B1/no not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-12-16 CA CA002275335A patent/CA2275335C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-12-16 EP EP97949270A patent/EP0951645B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-16 ES ES97949270T patent/ES2293663T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-16 DE DE69738076T patent/DE69738076T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-16 AU AU78752/98A patent/AU728190B2/en not_active Ceased
- 1997-12-16 AT AT97949270T patent/ATE371868T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-12-16 WO PCT/NO1997/000342 patent/WO1998028622A1/en active IP Right Grant
-
2005
- 2005-02-01 US US11/047,913 patent/US8097429B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1998028622A1 (en) | 1998-07-02 |
AU728190B2 (en) | 2001-01-04 |
AU7875298A (en) | 1998-07-17 |
DE69738076D1 (de) | 2007-10-11 |
ATE371868T1 (de) | 2007-09-15 |
NO965531D0 (no) | 1996-12-20 |
US20050130234A1 (en) | 2005-06-16 |
EP0951645B1 (en) | 2007-08-29 |
NO308755B1 (no) | 2000-10-23 |
US8097429B2 (en) | 2012-01-17 |
EP0951645A1 (en) | 1999-10-27 |
NO965531L (no) | 1998-06-22 |
DE69738076T2 (de) | 2008-05-21 |
CA2275335C (en) | 2008-02-12 |
CA2275335A1 (en) | 1998-07-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2293663T3 (es) | Procedimiento para la caracterizacion de celulas en suspension. | |
ES2724232T3 (es) | Procedimientos de detección de células tumorales circulantes positivas para 5T4 y procedimientos de diagnóstico de cáncer positivo para 5T4 en un sujeto mamífero | |
US20050250155A1 (en) | Multiple marker characterization of single cells | |
US6960449B2 (en) | Class characterization of circulating cancer cells isolated from body fluids and methods of use | |
ES2239407T3 (es) | Determinacion de una anormalidad en el crecimiento celular. | |
Ribeiro et al. | Prognostic significance of intraperitoneal free cancer cells obtained by laparoscopic peritoneal lavage in patients with gastric cancer | |
ES2230649T3 (es) | Metodo de deteccion, identificacion, enumeracion y confirmacion de celulas cancerosas y/o de celulas progenitoras hematologicas circulante en una muestra sanguinea. | |
Kang et al. | A handheld device for potential point-of-care screening of cancer | |
ES2275511T3 (es) | Productos y procedimientos para el fenotipado de celulas de tipo de parametro unico o multiple. | |
Bostwick et al. | Prostatic intraepithelial neoplasia and well differentiated adenocarcinoma maintain an intact basement membrane | |
Zeppa et al. | Lymph Node FNC: Cytopathology of Lymph Nodes and Extranodal Lymphoproliferative Processes | |
Gunduz et al. | Fluoresceinated estrone binding by cells from human breast cancers obtained by needle aspiration | |
Mukhopadhyay et al. | Cytokinetic studies of oral cancer cells using bromodeoxyuridine labelling in relation to factors influencing prognosis | |
RU2727251C2 (ru) | Способ диагностики сторожевых лимфоузлов при раке желудка | |
Ben-Arie et al. | The role of L1-CAM immunohistochemial staining in the diagnosis of abdominal-pelvic cancer of uncertain primary site in women | |
Paietta et al. | Detection of terminal transferase in acute myeloid leukemia by flow cytometry | |
BR102020013625A2 (pt) | Aptâmero modificado, sistema aptaimunológico, painel aptaimunológico, kit, método e uso no diagnóstico de câncer de próstata | |
CN112946271A (zh) | 用于诊断受试者体内恶性异常增生的方法和试剂盒 | |
RU2082981C1 (ru) | Способ диагностики злокачественных опухолей | |
Siddiqui | Prostate Cancer Microparticles as a Next Generation Screening Tool for Prostate Cancer |