ES2292564T3 - Diferenciacion de celulas de la medula osea en celulas neuronales y usos asociados. - Google Patents
Diferenciacion de celulas de la medula osea en celulas neuronales y usos asociados. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para inducir la diferenciación de células estromales de la médula ósea en neuronas, comprendiendo dicho método transferir células estromales de la médula ósea aisladas en un medio sin suero que contiene al menos un antioxidante, induciendo así la diferenciación de dichas células estromales de la médula ósea aisladas en neuronas.
Description
Diferenciación de células de la médula ósea en
células neuronales y usos asociados.
Se han detectado células madre pluripotentes en
múltiples tejidos en mamíferos adultos, que participan en el
reemplazo normal y la reparación, que sufren la autorenovación (Hay,
1966, "Regeneration", Holt, Rinehart y Winston, New York;
McKay, 1999, Nature Med. 5:261-262;
Lemiscka, 1999, Ann. N.Y. Acad. Sci.
872:274-288; Owens y Friedenstein, 1988,
"Ciba Foundation Syp". 136, Chichester, U.K. págs.
42-60; Prockop, 1997, Science
276:71-74; Ferrari et al., 1998,
Science 279:1528-1530; Caplan, 1991,
J. Orthop. Res. 9:641-650; Pereira
et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:4857-4861; Kuznetsov et al., 1997,
Brit. J. Haemotology 97:561-570;
Majumdar et al., 1998, J. Cell Physiol.
176:57-66; Pittenger et al., 1999,
Science 284:143-147). Una subclase de
células madre de la médula ósea es un prototipo, capaz de
diferenciarse en linajes mesenquimales in vitro osteogénicos,
condrogénicos, adipogénicos y otros (Owens y Friedenstein, 1988,
"Ciba Foundation Symp. 136", Chichester, U.K. págs.
42-60; Prockop, 1997, Science 276;
71-74; Ferrari et al., 1998, Science
279:1528-1530; Caplan, 1991, J. Orthop.
Res. 9:641-650; Pereira et al.,
1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:4857-4861; Kuznetsov et al., 1997,
Brit. J. Haemotology 97:561-570;
Majumdar et al., 1998, J. Cell. Physiol.
176:57-66; Pittenger et al., 1999,
Science 284:143-147). Estas células
pluripotentes han sido denominadas células estromales de la médula
ósea (CEM), y recientemente han sido usadas clínicamente para tratar
la osteogenesis imperfecta (Horwitz et al., 1999, Nature
Med. 5: 309-313).
El reciente descubrimiento de poblaciones de
células madre en el sistema nervioso central (SNC) ha generado un
intenso interés, ya que el cerebro ha sido considerado durante mucho
tiempo como incapaz de la regeneración (Reynolds y Weiss, 1992,
Science 255:1707-1710; Richards et
al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:8591-8595; Morshead et al., 1994,
Neuron 13:1071-1082). Las células
madre neurales (SNC) son capaces de sufrir la ampliación y la
diferenciación en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos in
vitro (Reynolds y Weiss, 1992, Science
255:1707-1710; Johansson et al., 1999,
Cell 96:25-34; Gage et al.,
1995, Annu. Rev. Neurosci. 18:159-192;
Vescovi et al., 1993, Neuron
11:951-966). Las CMN
re-trasplantadas en el cerebro de un roedor adulto
sobreviven y se diferencian en neuronas y células de la glia,
aumentando la posibilidad de su potencial terapéutico (Lundberg
et al., 1997, Exp. Neurol.
145:342-360; Lundberg et al., 1996,
Brain Res. 737:295-300; Renfranz et
al., 1991, Cell 66:713-729; Flax
et al., 1998, Nature Biotech.
16:1033-1039; Gage et al., 1995,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:11879-11883; Svendsen et al.,
1997, Exp. Neurol. 148:135-146). Sin
embargo, la inaccesibilidad de las fuentes de CMN inmersas dentro
del cerebro limitan drásticamente su utilidad clínica. Un informe
reciente que demuestra que las CMN pueden generar células
hematopoyéticas in vivo sugiere que las poblaciones de
células madre pueden estar menos restringidas de lo que se piensa
(Bjornson, 1999, Science
283:534-537).
En el documento WO99/56759, fueron inducidas
células estromales de la médula ósea (CEM) a la diferenciación en
fenotipos de neuronas in vitro e in vivo poniendo en
contacto tales células con factores de crecimiento (tales como
PDGF, GDNF, FGF2, NGF y BDNF) y ácido retinoico (ácido
cis-9-retinoico, ácido
todo-transretinoico o sus combinaciones).
Las pruebas de que las CEM inyectadas en los
ventrículos laterales de ratones neonatales se pueden diferenciar
en astrocitos y en células que contienen neurofilamentos dan soporte
a este argumento (Kopen et al., 1999, Proc. Natl. Acad.
Sci. 96: 10711-10716).
Sin embargo, aunque la diferenciación de las CEM
en astrocitos y células de la glia ha sido demostrada (documento WO
99/43286), hasta el momento, no ha habido ningún método para inducir
la diferenciación de CEM en células neuronales. Así, a pesar de la
necesidad crucial de obtener células neuronales para el tratamiento
de enfermedades del SNC, trastornos, y condiciones, ningún método
ha estado disponible para obtener grandes números de células
neuronales sin encontrar las barreras técnicas y éticas implicadas
en la obtención de CEM humanas o del tejido fetal. La presente
invención supera esta necesidad.
La presente invención incluye un método para
inducir la diferenciación de células estromales de la médula ósea
aisladas en neuronas. El método comprende transferir dichas células
estromales de la médula ósea en un medio sin suero que contiene al
menos un compuesto que induce la diferenciación neuronal. Éste
induce la diferenciación de las células estromales de la médula ósea
aisladas en neuronas.
En un aspecto, la célula estromal de la médula
ósea aislada es una célula de rata. Preferiblemente, la célula
estromal de la médula ósea aislada es una célula humana.
El compuesto que induce la diferenciación
neuronal es un antioxidante. El antioxidante se selecciona a partir
del grupo que consiste en \beta-mercaptoetanol,
dimetilsulfóxido, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado,
ácido ascórbico, dimetilfumarato y
n-acetilcisteína.
En otro aspecto, el antioxidante es el
\beta-mercaptoetanol.
En otro aspecto, el antioxidante es el
dimetilsulfóxido. En otro aspecto más el antioxidante es
dimetilsulfóxido e hidroxianisol butilado.
La invención además incluye un método in
vitro para producir células neuronales aisladas. El método
comprende aislar células estromales de la médula ósea, transferir
las células estromales de la médula ósea aisladas en un medio libre
de células que contiene un antioxidante, en el que el compuesto
induce a las células estromales de la médula ósea aisladas a
diferenciarse en una células neuronales aisladas, produciéndose así
células neuronales aisladas.
Además, la invención incluye el uso de una
población aislada de células que comprende células neuronales
obtenidas a partir de una muestra de médula ósea de un donante
humano, después del aislamiento de células estromales a partir de
dicha muestra de médula ósea y la inducción de dichas células
estromales para que se diferencien en células neuronales aisladas,
contrayendo dichas células estromales aisladas con al menos un
antioxidante, para preparar un medicamento para efectuar el
tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición del sistema
nervioso central de un paciente humano. La presencia de las células
neuronales aisladas en el sistema nervioso central del paciente
humano efectúa el tratamiento de la enfermedad, trastorno o
condición.
En un aspecto, la enfermedad, el trastorno o la
condición del sistema nervioso central se seleccionan a partir del
grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, enfermedad de
Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral
amiotrófica, un tumor, un traumatismo, demencia senil, la enfermedad
de Tay-Sach, la enfermedad de Sandhoffs, el
síndrome de Hurler, la enfermedad de Krabbe, daño traumático del
sistema nervioso central inducido en el nacimiento, epilepsia,
esclerosis múltiple, traumatismo, tumor, apoplejía y daño de la
médula espinal.
En otro aspecto, las células neuronales
aisladas, habían sido transfectadas con un ácido nucleico aislado
que codifica una proteína terapéutica en el que, cuando la proteína
se expresa en células, la proteína sirve para efectuar el
tratamiento de la enfermedad, trastorno o condición.
En un aspecto alternativo, las células
neuronales aisladas habían sido transfectadas con un ácido nucleico
aislado que codifica una citoquina, una quimiocina, una
neurotrofina, otra proteína alimentaria, un factor de crecimiento,
un anticuerpo o una proteína tóxica del glioma.
La presente invención además incluye el uso de
una población de células que comprende células neuronales obtenidas
a partir de células estromales de la médula ósea de un paciente
humano, después de la propagación de dichas células estromales de
la médula ósea en un cultivo en condiciones que induzcan su
diferenciación en células neuronales, inducida por la transferencia
de dichas células estromales de la médula ósea en un medio sin suero
que contiene un antioxidante para preparar un medicamento para el
tratamiento de un paciente humano en necesidad de dichas células
neuronales.
La invención también incluye una población
aislada de células que comprenden células neuronales, hechas por el
método de inducir la diferenciación de células de la médula ósea
aisladas en células neuronales. El método comprende transferir
dichas células estromales de la médula ósea en un medio sin suero
que contiene un antidioxidante. El contacto entre la célula
estromal de la médula ósea aislada y el antioxidante que induce a la
diferenciación neuronal induce la diferenciación de la célula
estromal de la médula ósea aislada en la célula neuronal de la
invención.
En un aspecto, la población de células que
comprenden células neuronales hechas por este método es una
población de células de roedor. En otro aspecto, las células
neuronales son células de rata. En un aspecto preferido, la célula
neuronal hecha por este método es una población de células
neuronales humanas.
Una realización preferida de la invención
incluye una población de células neuronales aislada transfectada
con una proteína terapéutica. La población de células neuronales se
aisla por el método de inducir la diferenciación de células de
médula ósea aisladas en las células neuronales citadas
anteriormente. La población de células neuronales es entonces
adecuada para la transfección con un ácido nucleico aislado que
codifica una proteína terapéutica que, cuando se exprese, efectuará
el tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición del sistema
nervioso central. En un aspecto de la invención, la proteína
terapéutica codificada por el ácido nucleico aislado es una
citoquina, una quimiocina,
una neurotrofina, otra proteína alimentaria, un factor de crecimiento, un anticuerpo o una proteína tóxica del glioma.
una neurotrofina, otra proteína alimentaria, un factor de crecimiento, un anticuerpo o una proteína tóxica del glioma.
La invención abarca enfermedades, trastornos o
condiciones del sistema nervioso central incluyendo, pero no está
limitada a, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson,
la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, un
tumor, un traumatismo, demencia senil, la enfermedad de
Tay-Sach, la enfermedad de Sandhoff, el síndrome de
Hurler, la enfermedad de Krabbe, daño traumático del sistema
nervioso central inducido en el nacimiento, epilepsia, esclerosis
múltiple, traumatismo, tumor, apoplejía y daño de la médula
espinal.
En un aspecto, la población de células que
comprenden la célula neuronal, hecha por el método de inducir la
diferenciación de una célula estromal de la médula ósea anterior,
son células de rata o células de roedor. Preferiblemente las células
neuronales transfectadas son células humanas.
La invención también incluye una población
aislada de células que comprenden las células neuronales producidas
por un método in vitro que comprende aislar células
estromales de la médula ósea y transferir dichas células estromales
de la médula ósea en un medio sin suero que contiene al menos un
antioxidante.
Esto induce que la célula estromal de la médula
ósea aislada se diferencie en células neuronales aisladas.
Una población aisladas transfectada de células
que comprenden células neuronales producidas aislando células
estromales de la médula ósea y transfiriendo dichas células
estromales de la médula ósea en un medio sin suero que contiene al
menos un antioxidante también es incluida en la invención. La
población aisladas de células, que comprenden células neuronales
producidas por este método, entonces son transfectadas con un ácido
nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica, que, cuando
se exprese en las células neuronales, efectuará el tratamiento de
una enfermedad, trastorno o condición del sistema nervioso
central.
En un aspecto preferido, la proteína terapéutica
codificada por el ácido nucleico aislado es una citoquina, una
quimiocina, una neurotrofina, otra proteína alimentaria, un factor
de crecimiento, un anticuerpo o una proteína tóxica del glioma.
En un aspecto de la presente invención, la
población transfectada de células que comprenden las células
neuronales producidas poniendo en contacto un compuesto que induce
la diferenciación neuronal con células estromales de la médula ósea
son células de rata. En otro aspecto, las células neuronales
transfectadas son células de roedor. En un aspecto preferido, las
células neuronales transfectadas son células humanas.
El sumario precedente, así como la siguiente
descripción detallada de la invención, serán entendidos mejor
cuando se lean junto con los dibujos añadidos. Con el objetivo de
ilustrar la invención, se muestran la(s)
realización(ones) de los dibujos que son preferidas en este
caso. Debe entenderse, sin embargo, que la invención no está
limitada con las disposiciones exactas y los procedimientos
mostrados. En los dibujos:
La figura 1A es una gráfica que representa la
clasificación de células fluorescentes de rCEM del paso 1 usando
anticuerpos monoclonales de ratón que se unen específicamente al
marcador de la superficie celular CD11b (CD11/integrina
alpha_{M}/cadena alfa de Mac-1; Pharmingen, San
Diego, CA) (picos no rellenos). El anticuerpo secundario usado era
anticuerpo antiratón conjugado con isotiocianato de fluoresceina
(FITC). Un control de isotipo es incluido en cada experimento para
identificar la fluorescencia de fondo (picos rellenos). El número de
células analizadas (Eventos) se representa sobre el eje de
ordenadas, mientras que la intensidad de la tinción se representa en
el eje de abcisas.
La figura 1B es una gráfica que representa la
clasificación de células fluorescentes de rCEM del paso 1 usando
anticuerpos monoclonales de ratón que se unen específicamente con el
marcador de la superficie celular CD45/antígeno común de leucocitos
(Pharmingen) (picos no rellenos). El anticuerpo secundario es un
anticuerpo antiratón conjugado con isotiocianato de fluoresceina
(FITC). Un control de isotipo es incluido en cada experimento para
identificar la fluorescencia de fondo (picos rellenos). El número de
células analizadas (Eventos) se representa sobre el eje de
ordenadas, mientras que la intensidad de tinción se representa sobre
el eje de abscisas.
La figura 1C es una gráfica que representa la
clasificación de células fluorescentes de rCEM del paso 1 usando
anticuerpos monoclonales de ratón que se unen específicamente al
marcador de la superficie celular
CD90/Thy-1/CD90.1/Thy1.1 (Pharmingen) (picos no
rellenos). El anticuerpo secundario es anticuerpo antiratón
conjugado con isotiocianato de fluoresceina (FITC). Un control de
isotipo es incluido en cada experimento para identificar la
fluorescencia de fondo (picos rellenos). El número de células
analizadas (Eventos) se representa sobre el eje de ordenadas,
mientras que la intensidad de tinción se representa sobre el eje de
abscisas. Los datos descritos en este documento demuestran que la
intensidad de fluorescencia es mayor (desplazada a la derecha)
cuando se incuban rCEM con el anticuerpo CD90 (no relleno), según se
compara con el anticuerpo control (relleno), indicando que una
enorme mayoría de células en los cultivos de rCEM expresa CD90, lo
que es compatible con su estado no diferenciado.
La figura 2, que comprende a las figuras
2A-2H, es una imagen que representa la
diferenciación neuronal de las rCEM en varios puntos de tiempo
después del tratamiento. Brevemente, el protocolo de diferenciación
neuronal descrito en este documento fue iniciado a 0 minutos y fue
seguido durante 210 minutos. La figura 2A representa 0 minutos, la
figura 2B representa 30 minutos, la figura 2C representa 60 minutos,
la figura 3D representa 90 minutos, la figura 2E representa 120
minutos, la figura 2F representa 150 minutos, la figura 2G
representa 180 minutos, y la figura 2H representa 210 minutos. Las
rCEM planas en la figura 2A se identifican (\ding{116}) antes de
la diferenciación. La retracción del cuerpo celular y la elaboración
de proyecciones son evidentes al aumentar el tiempo. La flecha en la
figura 2E indica una segunda diferenciación celular. La retracción
de las neuritas es indicada por (>). (Amplificación = 200X).
La figura 3A es una imagen que representa la
expresión de enolasa neuroespecíficas (ENE) en neuronas que se
diferencian usando un anticuerpo policlonal anti-ENE
(Polisciences, Warrington, PA). Brevemente, las rCEM no
diferenciadas (indicadas por un ">") conservaron la
morfología aplanada y fueron teñidas sólo ligeramente para la
expresión de ENE. Las neuronas derivadas de rCEM (flechas) se
tiñeron de marrón oscuro para la expresión de ENE y mostraron
cuerpos de células condensados y proyecciones altamente ramificadas.
Las células de transición (\rightarrow) exhibieron morfologías
neuronales intermedias, con cuerpos de células parcialmente
retraídos y una tinción de ENE marrón clara.
La figura 3B es una imagen que representa que
las morfologías de neuronas derivadas de rCEM incluyen células
bipolares simples (\ding{116}) y multipolares complejas con
proyecciones altamente ramificadas (flecha). Una tinción de ENE
intensa es evidente en ambos tipos de neuronas.
La figura 3C es una imagen que representa que
las neuronas reactivas con ENE que muestran morfologías piramidales
a veces son generadas usando los protocolos descritos en otra parte
en este documento. El contacto con una célula de transición (marrón
claro) es mantenido vía una sola proyección no ramificada.
La figura 3D es una imagen que representa una
neurona reactiva con ENE que elabora una larga proyección con
evidentes varicosidades (flechas). Los datos descritos en este
documento demuestran que el cuerpo neuronal está en contacto íntimo
con una célula de transición.
La figura 3E es una imagen que representa que
los grupos de neuronas derivadas de rCEM de morfologías variables
forman redes complejas. Los datos descritos en este documento
demuestran que las rCEM no diferenciadas (>) están incluidas
dentro de esta malla de proyecciones. (Amplificación = 320X).
La figura 3F es una imagen de un análisis de
inmunotransferencia que describe la expresión de niveles bajos de
ENE en rCEM no inducidas (U). Los datos descritos en este documento
demuestran que un aumento significativo de la expresión de ENE es
evidente a las 5 horas después del tratamiento de BME (I). Niveles
comparables de tubulina son detectados en cada separación, indicando
una carga igual de las muestras.
La figura 4A es una imagen que representa la
expresión de NeuN en neuronas derivadas de rCEM usando un anticuerpo
monoclonal anti-NeuN (Chemicon, Temeeula, CA).
Brevemente, los datos descritos en este documento demuestran que
NeuN puede ser detectado en el núcleo y en el citoplasma circundante
de neuronas derivadas de rCEM (flecha).
La figura 4B es una imagen que representa la
expresión de NeuN en neuronas derivadas de rCEM usando un anticuerpo
monoclonal anti-NeuN (Chemicon). Brevemente, los
datos descritos en este documento demuestran que NeuN puede ser
detectado en el núcleo y en el citoplasma circundante de neuronas
derivadas de rCEM (flecha). Además, los datos descritos en este
documento demuestran que la tinción del anticuerpo
anti-NeuN no se extiende en las proyecciones de
células positivas. La imagen además representa que las células de
transición (\rightarrow) y las rCEM no diferenciadas (<) no
expresan NeuN.
La figura 5A es una imagen que representa la
expresión de NFM y tau por diferenciación celular. Brevemente, las
neuronas derivadas de rCEM fueron inmuno-teñidas
para detectar la expresión de NF-M usando un
anticuerpo policlonal anti-NF-M
(Chemicon). Los datos descritos en este documento demuestran que las
células que exhiben morfologías neuronales expresaban
NF-M tanto en los cuerpos celulares (flecha) como en
las proyecciones (*). Las rCEM planas no diferenciadas (>) no se
tiñen por la expresión de NFM.
La figura 5B es una imagen que representa que la
preadsorción del anticuerpo
anti-NF-M (Chemicon) con 20
microgramos de proteína NF-M purificada de la noche
a la mañana a 4ºC eliminaba la tinción de neuronas derivadas de
rCEM, indicado la especificidad de la tinción de
NF-M.
La figura 5C es una imagen que representa
neuronas derivadas de rCEM teñidas para la expresión de tau usando
el anticuerpo policlonal anti-tau (compañía química
Sigma, San Louis, MO). Los datos descritos en este documento
demuestran que las células que muestran morfologías neuronales
(flechas) se tiñen de marrón oscura por la expresión de tau dentro
del cuerpo celular y que se extiende en las proyecciones (*). Las
rCEM planas no diferenciadas (>) no expresan tau y no se tiñen.
(Amplificación = 320X).
La figura 5H es una imagen que representa
neuronas derivadas de rCEM teñidas para la expresión de tau usando
el anticuerpo policlonal anti-tau (compañía química
Sigma, San Louis, MO). Los datos descritos en este documento
demuestran que células que muestran morfologías neuronales (flechas)
se tiñen de marrón oscuro para la expresión de tau dentro del cuerpo
celular y que se extiende en las proyecciones (*). Las rCEM planas
no diferenciadas (>) no expresan tau y no se tiñen.
(Amplificación = 320X).
La figura 6A es una imagen que representa el
marcaje de FM1-43 de neuronas derivadas de rCEM. Los
datos descritos en este documento demuestran que las neuronas
derivadas de rCEM despolarizadas usando KCl muestran un marcaje
intenso de los conos de crecimiento supuestos terminales (indicado
por el triángulo no relleno).
La figura 6B es una imagen que representa el
marcaje de FM1-43 de neuronas derivadas de rCEM. Los
datos descritos en este documento demuestran que las neuronas
derivadas de rCEM despolarizadas usando KCl muestran un marcaje
intenso de los conos de crecimiento supuestos terminales (indicado
por el triángulo no relleno).
La figura 7A es una imagen que representa la
diferenciación de líneas de rCEM clonales. La tinción de ENE del
clon de rCEM individual Nº. 1 sometido al protocolo de
diferenciación descrito en este documento. Células reactivas con ENE
(marrón oscuro) son derivadas a partir de cada línea clonal. Las
rCEM no diferenciadas (>) y/o las células de transición
(\rightarrow) son evidentes en cada panel. (Amplificación =
320X).
La figura 7B es una imagen que representa la
diferenciación de líneas de rCEM clonales. La tinción de ENE del
clon de rCEM Nº. 2 individual sometido al protocolo de
diferenciación descrito en este documento. Células reactivas con ENE
(marrón oscuro) son derivadas a partir de cada línea clonal. Las
rCEM no diferenciadas (>) y/o las células de transición
(\rightarrow) son evidentes en cada panel. (Amplificación =
320X).
La figura 7C es una imagen que representa la
diferenciación de líneas de rCEM clonales. La tinción de ENE del
clon de rCEM individual Nº. 3 sometido al protocolo de
diferenciación descrito en este documento. Células reactivas con ENE
(marrón oscuro) son derivadas a partir de cada línea clonal. Las
rCEM no diferenciadas (>) y/o las células de transición
(\rightarrow) son evidentes en cada panel. (Amplificación =
320X).
La figura 7D es una imagen que representa la
diferenciación de líneas de rCEM clonales. La tinción de ENE del
clon de rCEM individual Nº. 1 sometido al protocolo de
diferenciación descrito en este documento. Células reactivas con ENE
(marrón oscuro) son derivadas a partir de cada línea clonal. Las
rCEM no diferenciadas (>) y/o las células de transición
(\rightarrow) son evidentes en cada panel. (Amplificación =
320X).
La figura 8A es una imagen que representa la
diferenciación de CEM humanas. Los datos descritos en este documento
demuestran que las CEM humanas se diferencian en neuronas y expresan
altos niveles de ENE (marrón oscuro). Una célula de transición
ligeramente teñida (indicada por \rightarrow) es representada en
la parte inferior izquierda.
La figura 8B es una imagen que representa que
una neurona derivada de hCEM reactiva con ENE elabora una proyección
que exhibe una morfología en bulbo terminal tipo neuronal.
La figura 8C es una imagen que representa una
imagen de contraste de fases de neuronas reactivas con ENE
apareadas. Los datos descritos en este documento muestran
morfologías de cono de crecimiento con extensiones filopodiales
(doble flecha). La imagen está ampliada al 50% para mostrar los
detalles.
La figura 8D es una imagen que representa que
las neuronas derivadas de hCEM se tiñen positivamente para
NF-M. (Amplificación = 320X).
La figura 9, que comprende las figuras
9A-9F, es una imagen que representa la expresión de
nestina y trkA en la diferenciación de neuronas derivadas de rCEM.
Las figuras 9A-9C muestran células teñidas para la
expresión de nestina a las 5 horas, 1 día y 6 días, respectivamente.
Las figuras 9D-9F representan células teñidas para
la expresión de trkA a las 5 horas, 1 día y 6 días, respectivamente.
(Amplificación = 320X).
La invención está basada en el descubrimiento de
que poner en contacto células estromales de la médula ósea con un
antioxidante, como se define en las reivindicaciones, media la
diferenciación de las células en células tipo neuronales que
expresan una variedad de marcadores neuroespecíficos (por ejemplo,
NeuN, neurofilamento-M, enolasa neuroespecífica
[ENE], tau, nestina, trkA y similares). Las células exhiben otras
características fenotípicas del tipo neurona tales como, pero no
limitadas a, cuerpos celulares esféricos y refráctiles que exhiben
un aspecto neuronal pericarial típico, cuerpos celulares que
extienden largas proyecciones que terminan en conos de crecimiento
y la filopodia típica de las neuronas, y el marcaje de los conos de
crecimiento por la tinción fluorescente con FM1-43,
que típicamente marca la liberación del transmisor neuronal y el
reciclado de las vesículas sinápticas. Así, los métodos descritos
en este documento inducen la diferenciación de células estromales
de la médula ósea en células neuronales. Tales métodos son cruciales
en el desarrollo de terapias a base de células para el tratamiento
de trastornos, enfermedades o condiciones del sistema nervioso
central (SNC). En realidad, antes de la presente invención, la
carencia de fuentes de células neuronales, que puedan ser
introducidas al SNC de un paciente humano, han impedido severamente
el desarrollo de terapias del SNC.
La invención incluye un método para inducir que
células estromales de la médula ósea se diferencien en una células
neuronales aisladas (véase la reivindicación 1). Las realizaciones
del método de la invención son definidas en las reivindicaciones y
son descritas en la sección de los ejemplos en este documento.
Generalmente, las células son aisladas a partir de un donante, las
células estromales son obtenidas a partir de éste, por lo general,
usando un método de clasificación célular, y las células estromales
son posteriormente cultivadas in vitro. El donante puede ser
una rata, por ejemplo, o el donante puede ser un ser humano. La
invención es requerida para abarcar a un donante mamífero y no
debería estar limitada a los donantes específicos descritos en este
documento.
Para inducir el fenotipo neuronal, las células
son pretratadas con una cantidad eficaz de un compuesto que induce
la diferenciación neuronal que es introducido en un cultivo celular
durante un periodo de tiempo. El tiempo puede variar de acuerdo con
el método exacto que se contemple y no debe ser interpretado como
una limitación de la invención de ningún modo. Después de la
exposición de pretratamiento al compuesto que induce la
diferenciación neuronal, las células son transferidas a un medio
sin suero que contiene una cantidad del mismo compuesto que induce
la diferenciación neuronal. La morfología neuronal es evidente
aproximadamente en una hora, véase la figura 2, por ejemplo, y la
morfología se hace más evidente regularmente con el tiempo. La
expresión del marcador neuronal es también evidente aproximadamente
a los 30 minutos después del tratamiento. Las células neuronales
así diferenciadas también expresan eventualmente varios marcadores
de proteicos, incluyendo, pero no limitados a, tirosina
hidroxilasa, tubulina, colinacetiltransferasa, sinaptofisina y TOAD,
que son todas las proteínas necesariamente asociadas con las
células neuronales y los procesos neuronales.
Estas neuronas recién diferenciadas son útiles
en el tratamiento de pacientes que padecen enfermedades de los
sistemas colinérgicos y catecolaminérgicos, y más generalmente, los
pacientes que padecen enfermedades del sistema nervioso central.
Los antioxidantes sirven como compuestos que
inducen la diferenciación neuronal, incluyendo, pero no limitados
a, \beta-mercaptoetanol, dimetilsulfóxido,
hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, ácido ascórbico,
dimetilfumarato y n-acetilcisteina. Las
realizaciones particularmente preferidas, como se muestra en la
sección de los ejemplos descrita en este documento, incluyen
\beta-mercaptoetanol, dimetilsulfóxido y una
combinación de dimetilsulfóxido e hidroxianisol butilado como los
antioxidantes favoritos. Sin embargo, la invención no está limitada
a los antioxidantes descritos en este documento y debe ser
interpretada para que incluya todos los antioxidantes, así como
otros compuestos que induzcan la diferenciación neuronal de células
estromales de la médula ósea.
La invención también ilustra el uso de factores
de crecimiento como los compuestos que inducen la diferenciación
neuronal en el método para inducir la diferenciación de CEM en
células neuronales. Tales factores de crecimiento incluyen, pero no
están limitados al factor de crecimiento de fibroblastos 2, el
factor de crecimiento derivado de plaquetas y el factor de
crecimiento de los nervios, así como a los agentes relacionados.
Se puede confirmar la identidad neuronal tiñendo
las células neuronales diferenciadas para la detección de
marcadores neuroespecíficos. Los ejemplos de tales marcadores son el
neurofilamento-M (NF-M), la proteína
tau, Neu-N, enolasa neuroespecífica (ENE), nestina,
y trkA. La diferenciación progresiva de la célula estromal de la
médula ósea en una neurona está en correspondencia con un aumento de
cada uno de estos marcadores, indicando que son producidas células
neuronales. Otra caracterización puede ser lograda usando técnicas
inmunocitoquímicas e inmunológicas conocidas. Por ejemplo, el
análisis inmunocitoquímico de estas células neuronales revela que
las células también expresan las proteínas que están asociadas a las
neuronas naturalmente diferenciadas. Tales proteínas incluyen, pero
no están limitadas a la tubulina, el TOAD y la sinaptofisina. La
detección del anticuerpo de colinacetiltransferasa y tirosina
hidroxilasa también puede ser evaluada.
Es evidente a partir de los datos descritos en
este documento que es posible diferenciar una célula estromal de la
médula ósea aislada en una célula neuronal in vitro. Las
células neuronales así diferenciadas son útiles en el tratamiento
de pacientes que padecen cualquiera de una amplia variedad de
enfermedades, trastornos o condiciones del sistema nervioso
central.
La invención también incluye un método para
producir una célula neuronal aislada a partir de células estromales
aisladas de la médula ósea como se expone en adelante en las
reivindicaciones (véase la reivindicación 7). El método comprende
diferenciar una célula estromal de la médula ósea de la misma manera
general que se cita anteriormente, produciéndose así una célula
neuronal aislada. Una población de células que comprenden es
definida en las reivindicaciones 13-12.
La célula neuronal aislada citada en ambos de
los métodos anteriores puede ser transfectada con un ácido nucleico
aislado que codifica una proteína terapéutica. La proteína
terapéutica, cuando se exprese, tratará a un paciente que tiene una
enfermedad, trastorno o condición del sistema nervioso central.
Una amplia plétora de proteínas beneficiosas es
muy conocida en la técnica y es expuesta en adelante en, por
ejemplo, los documentos WO 96/30031 y WO 99/43286. Tales ejemplos
incluyen, pero no están limitados a, citoquinas, quimiocinas,
neurotrofinas, otras proteínas alimentarias, factores de
crecimiento, anticuerpos y la proteína tóxica del glioma. Cuando
las células neuronales transfectadas que codifican tales proteínas
son administradas a un paciente, las células neuronales influirán
beneficiosamente en células que están ya presentes en el sistema
nervioso central. Por ejemplo, las células neuronales transfectadas
que son introducidas en el sistema nervioso central pueden ser
usadas para reparar cualquier daño del sistema nervioso central, y/o
combatir a los tumores del sistema nervioso central.
Las solicitudes de patentes internacionales WO
96/30031 y WO 99/43286 también describen el uso de las CEM en
terapias para una amplia variedad de enfermedades del SNC,
trastornos, o condiciones, que incluyen, pero no están limitadas, a
enfermedades genéticas del SNC (por ejemplo, la enfermedad de
Tay-Sach's, Sandhoffs, el síndrome de Hurler, la
enfermedad de Krabbe), daño traumático del SNC inducido por el
nacimiento, enfermedades adultas del SNC, trastornos o condiciones
(por ejemplo, las enfermedades de Parkinson, Alzheimer y Huntington,
demencia senil, epilepsia, esclerosis lateral amiotrófica,
esclerosis múltiple, traumatismo, tumores, apoplejía y similares) y
enfermedades degenerativas y daño traumático de la médula
espinal.
Entre los recién nacidos y los niños, pueden ser
usadas células neuronales transfectadas para el tratamiento de un
número de enfermedades genéticas del sistema nervioso central,
incluyendo, pero no limitadas, a la enfermedad de
Tay-Sachs y la enfermedad relacionada con Sandhoffs,
el síndrome de Hurler y la enfermedad asociada a mucopolisacaridosas
y de Krabbe. En grados variables, estas enfermedades también
producen lesiones en la médula espinal y los nervios periféricos y
también tienen efectos no neurológicos. Aunque los efectos no
neurológicos de estas enfermedades pueden ser tratables por
trasplantes de la médula ósea, los efectos del sistema nervioso
central no se mejoran a pesar del trasplante de la médula ósea. El
método de la presente invención es útil para tratar los efectos de
sistema nervioso central de estos tipos de enfermedades. Además, en
recién nacidos y niños, el traumatismo craneal durante el
nacimiento o después del nacimiento es tratable introduciendo a
estas células neuronales directamente en el sistema nervioso
central de los niños. La formación de tumores del sistema nervioso
central en niños es también tratable usando los métodos de la
presente invención.
Las enfermedades del sistema nervioso central en
adultos son también tratables administrando células neuronales
aisladas al adulto. Tales enfermedades de adultos incluyen, pero no
están limitadas a, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de
Alzheimer, el daño de médula espinal, apoplejía, traumatismo,
tumores, enfermedades degenerativas de la médula espinal tales como
esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington y
epilepsia. El tratamiento de la esclerosis múltiple también es
contemplado.
El tratamiento de los daños de la médula espinal
también se contempla según la presente invención. Los métodos de la
técnica anterior para tratar los daños de la médula espinal implican
usar fibroblastos para suministrar neurotrofinas al sitio de las
lesiones de la médula espinal en animales. Las neurotrofinas,
suministradas de esta manera, reducen la lesión o, por otra parte,
tratan el daño. Sin embargo, los fibroblastos producen grandes
cantidades de colágeno, causando fibrosis en el sitio de lesión,
negando así los efectos beneficiosos del tratamiento. La
administración de neurotrofinas a las lesiones de la médula espinal
usando células neuronales transfectadas es ventajosa respecto a los
métodos de la técnica anterior porque las células neuronales no
producen grandes cantidades de colágeno y, por lo tanto, no causan
la fibrosis.
La invención además contempla tratar a un
paciente humano que tiene una enfermedad, trastorno o condición del
sistema nervioso central administrando las células neuronales
diferenciadas de la invención al sistema nervioso central del
paciente como se define en las reivindicaciones (véanse las
reivindicaciones 8-12). Los métodos para tratar a
un paciente humano usando las CEM son descritos en los documentos WO
96/30031 y WO 99/43286, que se incorporan como referencia en su
totalidad en este documento. Los métodos para administrar células
neuronales diferenciadas a un paciente son idénticos a los usados
para las CEM como se describe en los documentos WO 96/30031 y WO
99M3286. Los métodos abarcan introducir un ácido nucleico aislado
que codifica una proteína beneficiosa en células neuronales
diferenciadas y también abarcan a las propias células neuronales
diferenciadas en terapias celulares en las que un paciente está en
necesidad de la administración de tales células. Las células
neuronales diferenciadas de la presente invención deben ser
administradas preferiblemente a un ser humano, y además, las
células neuronales deben ser administradas preferiblemente al
sistema nervioso central del ser humano. En algunos casos, las
células neuronales diferenciadas deben ser administradas a la parte
del cuerpo estriado del cerebro humano. El sitio exacto de
administración de las células neuronales dependerá de un diverso
número de factores, incluyendo, pero no limitados a, el sitio de la
lesión que se trate, el tipo de enfermedad que se trate, la edad
del ser humano y la severidad de la enfermedad, y otros similares.
La determinación del sitio de administración corresponde al experto
en la técnica versado en la administración de células a
mamíferos.
El modo de administración de las células
neuronales diferenciadas al sistema nervioso central del ser humano
puede variar dependiendo de diversos factores incluyendo, pero no
limitados a, el tipo de enfermedad que se trate, la edad del ser
humano, si las células neuronales tienen ADN aislado introducido
dentro, y otros similares. Un ejemplo de administración de células
neuronales directamente en el tejido cerebral es proporcionado en
este documento en la sección de detalles experimentales.
Generalmente, las células son introducidas en el cerebro de un
mamífero mediante la creación primero de un orificio en el cráneo
por el cual las células son pasadas dentro del tejido cerebral. Las
células pueden ser introducidas por inyección directa, usando una
anastomosis, o por cualquier otro medio usado en la técnica para la
introducción de compuestos en el sistema nervioso central.
Los artículos "un" y "uno/una" se usan
en este documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a
al menos uno) del objeto gramatical del artículo. De modo
ilustrativo, "un elemento" significa un elemento o más de un
elemento.
Según se usa en este documento, el "sistema
nervioso central" debe ser interpretado para que incluya el
cerebro y/o la médula espinal de un mamífero. La expresión también
puede incluir a los ojos y a los nervios ópticos en algunos
casos.
Según se usa en este documento, "células
estromales", "células estromales de la médula ósea aisladas"
y las "CEM" son usados de manera intercambiable y se proponen
para referirse a la pequeña fracción de células en la médula ósea
que puede servir como precursores tipo de células madre de
osteocitos, condrocitos y adipocitos y que se aislan a partir de la
médula ósea por su capacidad de adherirse a placas de plástico. Las
células estromales de la médula ósea pueden ser derivadas a partir
de cualquier animal. En algunas realizaciones, las células
estromales son derivadas a partir de primates, preferiblemente seres
humanos.
Según se usa en este documento, el término
"antioxidante" se propone para referirse a aquellas sustancias
que inhiben la oxidación o las reacciones promovidas por oxígeno o
peróxidos. Los ejemplos de antioxidantes incluyen, pero no están
limitados a, \beta-mercaptoetanol,
dimetilsulfóxido, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado,
ácido ascórbico, dimetilfumarato y
n-acetilcisteína.
Según se usa en este documento, las expresiones
"proteína beneficiosa" y "proteína terapéutica" son usados
de manera intercambiable y se proponen para referirse a una
proteína que puede compensar la proteína codificada por una
expresión génica defectuosa y/o génica insuficiente que está
vinculada causalmente a la enfermedad o a los síntomas de la
enfermedad, trastorno o condición caracterizada por un defecto
génico. La presencia de la proteína alivia, reduce, previene o
causa que se alivien, reduzcan o prevengan las causas y/o los
síntomas que caracterizan a la enfermedad, trastorno o
condición.
Según se usa en este documento, una enfermedad,
un trastorno o una condición que puede ser tratada con una proteína
beneficiosa o terapéutica se proponen para referirse a una
enfermedad, trastorno o condición que puede ser tratado o prevenido
por la presencia de una proteína que alivia, reduce, previene o
causa que se alivien, reduzcan o prevengan las causas y/o los
síntomas que caracterizan a la enfermedad, el trastorno o la
condición. Las enfermedades, trastornos y condiciones que pueden ser
tratadas con una proteína beneficiosa incluyen las enfermedades,
los trastornos y las condiciones caracterizadas por un defecto
génico así como las que no están caracterizadas por un defecto
génico, pero que, sin embargo, pueden ser tratadas o prevenidas por
la presencia de una proteína que alivie, reduzca, prevenga o cause
que se alivien, reduzcan o prevengan las causas y/o los síntomas
que caracterizan a la enfermedad, el trastorno o la condición.
La expresión "ácido nucleico aislado" debe
ser interpretado para referirse a una secuencia de ácidos nucleicos
o segmento o fragmento que ha sido purificado a partir de las
secuencias que la flanquean en un estado natural, por ejemplo, un
fragmento de ADN que haya sido eliminado a partir de las secuencias
que están normalmente adyacentes al fragmento, por ejemplo, las
secuencias adyacentes al fragmento en un genoma en el que se da
naturalmente. La expresión también se aplica a los ácidos nucleicos
que han sido sustancialmente purificados a partir de otros
componentes que acompañan naturalmente al ácido nucleico, por
ejemplo, el ARN o el ADN o las proteínas que naturalmente lo
acompañan en la célula.
Según se usa en este documento, "células
transfectadas" se proponen para referirse a células a las cuales
ha sido proporcionada una construcción génica usando cualquier
tecnología usada para introducir moléculas de ácidos nucleicos en
células tales como, pero no limitadas a, la transfección clásica
(transfección mediada por fosfato de calcio o dextrano DEAE),
electroporación, microinyección, transferencia mediada por
liposomas, transferencia mediada por sustancias químicas,
transferencia mediada por ligando o transferencia con un vector
viral recombinante.
El término "diferenciación", según se usa
en este documento, debe ser interpretado para que signifique la
inducción de un fenotipo diferenciado en una célula no diferenciada
cultivando conjuntamente la célula no diferenciada en presencia de
una población sustancialmente homogénea de células diferenciadas, en
presencia de productos de células diferenciadas o en presencia de
un inductor de la diferenciación celular.
La expresión "célula neuronal", según se
usa en este documento, debe ser interpretado para que signifique una
CEM diferenciada tal que expresa al menos uno de los siguientes
marcadores neuronales: enolasa neuroespecífica (ENE), NeuN,
neurofilamento-M o la proteína tau.
El término "neurona", según se usa en este
documento, debe ser interpretado para que signifique una célula
nerviosa capaz de recibir y conducir impulsos eléctricos del sistema
nervioso central. Una célula nerviosa o "neurona" típicamente
comprenden un cuerpo celular, un axón, terminales de axón y
dendritas.
La expresión "compuesto que induce la
diferenciación neuronal" se propone para referirse a aquellos
compuestos capaces de inducir la diferenciación de una célula
estromal en una célula neuronal. Estos compuestos incluyen, pero no
están limitados a, antioxidantes, factores tróficos y factores de
crecimiento.
La invención además es descrita detalladamente
en cuanto a los ejemplos experimentales siguientes. Estos ejemplos
son proporcionados sólo con objetivos de ilustración, y no son
requeridos para limitar, a no ser que se especifique de otra forma.
Así, la invención de ninguna manera debe ser interpretada como que
está limitada por los ejemplos siguientes, sino que más bien
debería ser interpretada para abarcar a algunas y a todas las
variaciones como se define en las reivindicaciones que se hacen
evidentes como consecuencia de la enseñanza proporcionada en
este
documento.
documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos presentados en este ejemplo
pueden ser resumidos en lo siguiente.
Las células estromales de la médula ósea exhiben
múltiples rasgos de una población de células madre. Pueden ser
incrementadas in vitro enormemente, y pueden ser inducidas a
diferenciarse en múltiples tipos de células mesenquimales (véanse,
por ejemplo, los documentos WO 96/30031 y WO 99/43286). Sin embargo,
la diferenciación en destinos no mesenquimales no ha sido
demostrada. En esta invención, las células estromales de rata adulta
fueron cultivadas como células no diferenciadas en un cultivo en
más de 14 pasos, indicando su gran capacidad proliferativa. Además,
un nuevo protocolo de tratamiento indujo a las células estromales a
exhibir un fenotipo neuronal, expresando varios marcadores
neuroespecíficos, es decir, enolase neuroespecífica (ENE), NeuN,
neurofilamento-M, tau, nestina, y trkA.
Además, los cuerpos celulares refractiles de las
células tratadas extendieron largas proyecciones que terminaban en
conos de crecimiento y filopodias típicas de las células neuronales.
El tinte fluorescente, FM1-43, marcó los conos de
crecimiento, lo que es compatible con la liberación del transmisor y
el reciclado de vesículas sinápticas por las células tratadas. Las
líneas celulares clonales, establecidas a partir de células solas,
proliferaron, proporcionando tanto células no diferenciadas como
células que exhibían un fenotipo neuronal.
Las células estromales de la médula ósea
tratadas usando el nuevo protocolo descrito en este documento se
diferenciaron en neuronas de modo similar a las rCEM lo que demostró
que el protocolo no estaba limitado a las células estromales de
roedores. Por consiguiente, los datos descritos en este documento
demuestran, por primera vez, que se puede inducir a que las células
estromales que la médula ósea de mamíferos superen su compromiso
mesenquimal y puedan constituirse como un depósito celular abundante
y accesible para el tratamiento de una variedad de enfermedades
neurológicas, trastornos o condiciones.
Los materiales y los métodos usados en los
experimentos presentados en este ejemplo se describen a
continuación.
Fueron cultivadas CEM de rata inicialmente en
medio Eagle \alpha-modificado
(\alpha-MEM) suplementado con FBS del 20%,
L-glutamina 2 mM, 100 unidades por mililitro de
penicilina, 100 miligramos por mililitro de estreptomicina y 25
nanogramos por mililitro de anfotericina B. Para cada paso, las
células fueron puestas en placas con aproximadamente 8.000 células
por centímetro cuadrado y fueron cultivadas hasta confluencia. En
el paso 6, las células fueron transferidas a DMEM (pH 8,0)/FBS 20%
sin ninguna suplementación adicional y fueron mantenidas hasta más
allá del paso 14. Fueron obtenidas CEM de rata con un protocolo y
con los procedimientos aprobados por el IACUC Institucional. Las
muestras humanas fueron obtenidas a partir de voluntarios con su
consentimiento informado y de acuerdo con un protocolo aprobado por
el Comité Examinador Institucional.
Treinta miligramos de extracto de proteína a
partir de cultivos de rCEM no tratado (U) e inducido por BME (I)
fueron separados en un gel de acrilamida con un gradiente del 4%-20%
y fueron transferidos por electroforesis a una membrana de nilón.
La inmunotransferencia fue sondada para la expresión de tubulina
usando un anticuerpo monoclonal antitubulina (compañía química
Sigma, San Louis, MO) seguido del anticuerpo secundario conjugado
con peroxidasa de rábano picante (HRP). El desarrollo del color fue
realizado usando un reactivo de quimioluminiscencia potenciado
(Amersham, Piscataway, NJ). La tinción entonces fue segregada y
sondada para la expresión de ENE usando el anticuerpo policlonal
anti-ENE (ICN). De nuevo, los anticuerpos
secundarios fueron conjugados con HRP, y el color fue desarrollado
usando los reactivos ECL.
Las rCEM cultivadas fueron fijadas con
paraformaldehído del 4%, fueron incubadas con el anticuerpo primario
de la noche a la mañana a 4ºC, fueron incubadas con el anticuerpo
secundario durante una hora, seguido por la exposición al complejo
de avidina-biotina durante una hora a 25ºC. El
diaminobencideno (DAB) sirvió como sustrato cromogénico para la
HRP.
Fueron tratados cultivos con DMSO/BHA en medio
sin suero (SFM) durante aproximadamente 4 horas. Las células fueron
mantenidas durante 30 minutos adicionales en fluido cerebroespinal
artificial (aCSF)/BHA. Las células fueron marcadas en aCSF que
contenía FM1-43 1 milimolar y KCl 75 mM durante 60
segundos. La mezcla de marcaje fue retirada, los cultivos fueron
lavados dos veces con aCSF, y las células fueron incubadas en aCSF
durante 60 minutos para reducir la tinción de fondo. Los cultivos
fueron fijados con paraformaldehído del 4% y fueron empapados
durante 24 horas en una solución salina tamponada con fosfato (PBS)
antes del análisis.
Los Resultados de los experimentos presentados
en este ejemplo se describen a continuación.
Fueron aisladas células estromales mesenquimales
de rata (rCEM) a partir de fémures de ratas adultas y fueron
propagadas in vitro (Azizi et al., 1998, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95: 3908-3913). Los
datos descritos en la figura 1A demuestran que la distribución de
células teñidas con el anticuerpo frente a CD 11b (no relleno) no
se diferencia de él del control del isotipo (relleno), indicando que
los cultivos de rCEM no contienen números significativos de células
que expresen CD11b contaminates. Además, los datos descritos en la
figura 1B también demuestran que la intensidad de tinción no se
diferencia entre los perfiles del anticuerpo CD45 (no relleno) y
control (llenos), indicando que las rCEM cultivadas no están
contaminadas por las células que expresan CD45. La clasificación de
células fluorescentes en el paso uno también demostró que las
células eran negativas para CD11b (figura 1A), y CD45 (figura 1B),
que son marcadores de la superficie celular asociados a las células
linfohematopoyéticas. Por lo tanto, no hubo ninguna prueba de
precursores hematopoyéticos en los cultivos.
Por el contrario, los datos descritos en este
documento demuestran que las rCEM expresaban CD90 (figura 1C), lo
que es compatible con su estado no diferenciado. Con una densidad de
revestimiento baja, las rCEM crecieron como una monocapa de células
grandes y planas. Según las células se acercaban a la confluencia,
éstas asumieran una morfología fibroblástica más larga y delgada.
En los comienzos de los estudios de diferenciación neuronal
descritos en otra parte en este documento, las rCEM no tratadas
además fueron caracterizadas mediante tinción para los marcadores
de la superficie celular CD44 y CD71. Las células fueron reactivas
para la expresión de CD44 y CD71, lo que es compatible con
publicaciones anteriores (Pittenger et al., 1999,
Science 284:143-147; Bruder et
al., 1998, Clin. Orthop. Relat. Res.
355S:S247-5256).
Para inducir el fenotipo neuronal, las rCEM
fueron mantenidas inicialmente en cultivos
sub-confluentes en medio suplementado con
\beta-mercaptoetanol 1 mM (BME) durante 24 horas.
En estas condiciones, no fue evidente ningún cambio en la
morfología. Para efectuar la diferenciación neuronal, las células
fueron transferidas a medio sin suero que contenía BME
1-10 milimolar (SFM/BME). El porcentaje de células
que adoptaban una morfología neuronal aumentó a concentraciones de
BME más altas, y fue realzado por el pretratamiento con BME. A los
60 minutos antes de la exposición a SFM/BME, fueron evidentes
cambios en la morfología de algunas de las rCEM (figura 2C). Las
células sensibles asumieron cada vez más características
morfológicas neuronales en las 3 primeras horas. Al principio, el
citoplasma en las rCEM planas se retiró hacia el núcleo, formando un
cuerpo celular contraído multipolar, abandonando las extensiones
tipo proyección de membrana periféricamente (0-90
minutos).
Las células tratadas exhibieron una mayor
expresión del marcador neuronal ENE 30 minutos antes del
tratamiento. Sobre las 2 horas subsecuentes, los cuerpos celulares
se hicieron cada vez más esféricos y refráctiles, exhibiendo un
aspecto neuronal pericarial típico. Las proyecciones se continuaron
elaborando, desarrollando expansiones terminales del tipo cono de
crecimiento y extensiones filopodiales (véanse, por ejemplo, figuras
2G y 2H). Las proyecciones celulares exhibieron ramificaciones
primarias y secundarias, y sufrieron un crecimiento dinámico. La
retractación, así como la extensión, era evidente como se demuestra
por el hecho de que la célula marcada por una flecha a los 120
minutos (figura 2E) se puso en contacto una proyección vecina
inicalmente (marcado por ">"), que se retrajo a los 180
minutos (figura 2G), con la pérdida del contacto.
Para caracterizar además la diferenciación
neuronal potencial, fueron teñidos cultivos tratados con BME para
detectar la expresión del marcador neuronal enolasa neuroespecífico
(ENE). Las rCEM insensibles planas expresaron niveles de la
proteína ENE muy bajos, pero detectables, lo que es compatible con
la detección anterior de cantidades minutas de proteína y/o mensaje
en células de origen de la médula ósea (Pechumer et al.,
1993, Lab. Invest. 89:743-749; Reid
et al., 1991, Clin. Pathol.
44:483-486; vanObberghen et al., 1988,
J. Neurosci. Res. 19:450-456).
La transición progresiva de las rCEM a un
fenotipo neuronal coincidió con una mayor expresión de ENE (figura
3A). Las células que exhibieron cuerpos celulares contraídos y
proyecciones se tiñeron de marrón oscuro para la expresión de ENE
(flechas), mientras que las rCEM planas e insensibles (>),
mostraron una tinción de ENE mínima. Las células en etapas
intermedias en la secuencia de diferenciación (\rightarrow)
exhibieron morfologías de transición y una tinción marrón claro,
indicando una sincronía de diferenciación morfológica y molecular.
Las neuronas derivadas de rCEM mostraron morfologías neuronales
distintas (figura 3B), desde células bipolares simples
(\ding{116}) a multipolares grandes y ampliamente ramificadas
(flecha). Pocas neuronas reactivas con ENE exhibieron morfologías
de células piramidales (figura 3C), mientras que las neuronas que
elaboraban largas proyecciones con evidentes varicosidades (flechas)
fueron más comunes (figura 3D). Los grupos de células diferenciadas
exhibieron reactividad con ENE intensa, y las proyecciones formaron
redes extensas (figura 3E). Incluso dentro de estos grupos, las
rCEM típicas planas (>) sólo fueron teñidas ligeramente, lo que
es compatible con su estado de no diferenciadas.
El análisis de inmunotransferencia (figura 3F)
confirmó la expresión de bajos niveles de proteína ENE en las rCEM
no inducidas. La inducción del fenotipo neuronal causó un aumento
drástico de la expresión de ENE, lo que es compatible con los datos
inmunocitoquímicos.
Para investigar además las características
neuronales, los cultivos diferenciados fueron teñidos para NeuN, un
marcador neuroespecífico expresado en células postmitóticas (Sarnat
et al., 1998, Brain Res.
20:88-94). Un subconjunto de células que
exhibían cuerpos celulares redondeados y proyecciones (flecha) se
tiñeron por la expresión de NeuN, mientras que las células no
diferenciadas (<) permanecieron negativas respecto a NeuN
(figura 4A). Compatible con las publicaciones anteriores que
describen la tinción con NeuN en células neuronales (Sarnat et
al., 1998, Brain Res. 20:88-94),
la tinción con NeuN fue limitada al núcleo y al citoplasma
circundante de las células reactivas, y no se extendió a las
proyecciones. Algunas células que exhibían distintas morfologías
neuronales no expresaron NeuN (\rightarrow), mientras que células
vecinas fueron altamente positivas (flecha) (figura 4B). Este
modelo contrasta con el establecido para la tinción de ENE, en la
que cada célula que exhibe una morfología neuronal demostró una
mayor expresión de ENE. Sin desear vincularse a ninguna teoría
particular, estos datos sugieren que un subconjunto de células
reactivas de ENE son neuronas postmitóticas. También sin desear
vincularse a ninguna teoría particular, puede ser que las
propiedades antioxidantes de BME, que realzan la supervivencia
neuronal in vitro (Ishii et al., 1993, Neurosci.
Lett. 163:159-162), puedan mediar, en
parte, la inducción de la diferenciación neuronal en las CEM,
aunque este resultado sorprendente fuera inesperado basado en
estudios anteriores.
\newpage
La nestina, una proteína filamentosa intermedia,
se expresa en células madre precursoras neuronales neuroepiteliales,
con una expresión decreciente según la neurona madura. Los datos
experimentales muestran que cuando las células neuronales
diferenciadas por CEM son teñidas para detectar nestina, la
expresión de nestina disminuye con el tiempo (figuras
9A-9C). Además, la tinción para trkA, un receptor
del factor de crecimiento nervioso de alta afinidad que está
presente en neuronas, demuestra que los niveles de trkA permanecen
inalterados en todas las partes del proceso de maduración de la
célula neuronal diferenciada por CEM (figuras
9D-9F).
Para comenzar a examinar la hipótesis de las
propiedades antioxidantes de la inducción mediada por BME de la
diferenciación neuronal en CEM, fueron tratadas rCEM con otros
antioxidantes, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), hidroxianisol
butilado (BHA) o hidroxitolueno butilado (BHT), ácido ascórbico,
fumarato de dimetilo, n-acetilcisteina y similares,
tanto solos como en combinación entre ellos. Además, el tratamiento
con el antioxidante ditiotreitol (DTT) en combinación con BHA
también indujo la diferenciación neuronal por CEM sugiriendo que el
DTT solo puede también obtener una diferenciación neuronal.
Cada tratamiento con antioxidante (por ejemplo,
DMSO, BHA, BHT, ácido ascórbico, dimetilfumarato,
n-acetilcisteina y similares, tanto solos como en
combinación) produjeron morfologías neuronales con un curso de
tiempo similar a los efectos de BME. Además, los datos preliminares
sugirieron que el tratamiento usando aproximadamente 2% (v/v) de
DMSO y aproximadamente BHA 200 milimolar (DMSO/BHA) era preferido
aunque un amplio intervalo de concentraciones produjeran la
diferenciación neuronal.
Para caracterizar además la identidad neuronal,
las CEM tratadas con DMSO/BHA fueron teñidas con
neurofilamento-M (NF-M), un
filamento intermedio neuroespecífico que ayuda a iniciar la
elongación de neuritas (Carden et al., 1987,
Neurosci. 7:3489-3504). Los datos
descritos antes en otra parte en este documento demostraron que el
tratamiento de CEM con BME causaba una mayor expresión de
NF-M en células que exhibían morfologías
neuronales. La mayor parte de las células que mostraban cuerpos
celulares redondeados con proyecciones (flecha) después de la
exposición a DMSO/BHA expresaban niveles altos de
NF-M, mientras que las células planas no
diferenciadas (>) no lo hicieron (figura 5A). La preadsorción
del anticuerpo de NF-M con la proteína
NF-M purificada suprimió la tinción (figura 5B),
estableciendo la especificidad.
Los cultivos tratados con DMSO/BHA fueron
entonces examinados por la presencia de tau, una proteína
neuroespecífica asociada a los microtubulos expresada por la
diferenciación de neuronas (Kosik y Finch, 1987, J. Neurosci.
7:3142-3153). Las células que exhibían una
morfología neuronal (flecha) expresaban la proteína tau en el cuerpo
celular así como en las proyecciones (*), mientras que las células
planas no diferenciadas fueron negativas para tau (<) (figuras
5C y 5D). Los datos descritos en este documento indican que el
método descrito en este documento induce la diferenciación neuronal
de células estromales de la médula ósea.
Para caracterizar además las propiedades
neuronales, fueron tratados cultivos con el tinte de estirilo
FM1-43, que marca la dispersión exterior de las
vesículas sinápticas en la liberación del transmisor dependiente de
la actividad (Betz y Bewick, 1992, Science
255:200-203; Betz et al., 1992, J.
Neurosci. 12: 363-375; Diefenbach et
al., 1999, J. Neurosci. 19:
9436-9444). La exposición frente a las
concentraciones despolarizantes de K^{+} causó el marcaje
fluorescente de los conos de crecimiento (\rightarrow), sugiriendo
que las células estaban reciclando las vesículas sinápticas
consiguientes a la liberación del transmisor dependiente de la
actividad.
Para determinar si las rCEM individuales
exhibían características propias de las células madre de
autorenovación y pluripotencialidad, fueron analizados clones
individuales. Para establecer los clones, las rCEM fueron puestas
en placas con aproximadamente 10 células por centímetros cuadrado,
fueron cultivadas en 50-150 células por colonia,
fueron aisladas con cilindros clonantes, fueron transferidas para
separar pocillos y en frascos individuales eventualmente. Las
células solas se replicaron como rCEM típicas y se diferenciaron en
neuronas reactivas con ENE después del tratamiento con BME.
El análisis de cuatro líneas clonales distintas
se muestra en la figura 7A-7D. Cada clon individual
generó células refractiles, que tenían proyecciones, reactivas con
ENE después del tratamiento con BME. Las rCEM no diferenciadas
(>) y las células de transición (\rightarrow) fueron evidentes
en cada línea clonal. Por lo tanto, los clones derivados a partir
de una célula sola pueden dar lugar tanto a rCEM como a neuronas,
indicando las características de la célula madre.
El potencial neuronal de las CEM no era único en
roedores como se demuestra en los experimentos siguientes usando
las CEM obtenidas a partir de seres humanos (hCEM). Las hCEM fueron
aisladas a partir de un donante adulto sano y fueron cultivadas
in vitro (Bjornson et al., 1999, Science
283:534-537). Las hCEM imitaban a sus
homólogas de roedor, creciendo como grandes células planas en estado
no diferenciado.
Las células del paso dos fueron sometidas al
protocolo de diferenciación neuronal y fueron teñidas para la
expresión con ENE o NF-M. Después del tratamiento
con BME, las hCEM lograron características neuronales y aumentaron
la expresión de ENE en un plazo de tiempo similar al observado para
las rCEM. Los cuerpos celulares contraídos elaboraron proyecciones
y se tiñeron fuertemente para la expresión de ENE a las 3 horas
(figuras 8A y 8B). También fueron evidentes células de transición
(\rightarrow). Muchas proyecciones elaboradas por neuronas
derivadas de hCEM exhibieron bulbos terminales (flecha en 8B), que
pueden representar conos de crecimiento. Las morfologías del cono
de crecimiento con extensiones filopodiales (\leftrightarrow) eran
claramente evidentes en las proyecciones elaboradas por neuronas
apareadas representadas en la imagen en la figura 8C. Estas células
también expresaron NF-M, lo que es compatible con su
diferenciación neuronal (figura 8D).
Los datos descritos en este documento demuestran
que las CEM de rata y ser humano conservan la capacidad de
diferenciarse en derivados no mesenquimales, específicamente en
neuronas, sugiriendo que los mecanismos genómicos intrínsecos de
compromiso, la restricción del linaje y el destino de la célula son
mutables. Las señales ambientales al parecer pueden producir la
expresión de la pluripotencialidad que se extiende bien más allá de
las restricciones del destino aceptadas de células que provienen de
capas germinales embrionarias clásicas. Estas células adultas son
ambas autorenovadoras y multipotenciales (Owens y Friedenstein,
1988, "Ciba Foundation Symp. 136", Chichester, U.K. págs.
42-60; Prockop, 1997, Science 276;
71-74; Ferrari et al., 1998, Science
279:1528-1530; Caplan, 1991, J. Orthop.
Res. 9:641-650; Pereira et al.,
1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:4857-4861; Kuznetsov et al.,1997,
Brit. J. Haemotology 97:561-570;
Majumdar et al., 1998, J. Cell. Physiol.
176:57-66; Pittenger et al., 1999,
Science 284: 143-147), satisfaciéndose
así muchos de los criterios de una población de células madre.
En el mejor de los conocimientos de los
solicitantes, ésta es la primera publicación de que células
mesenquimales periféricas puedan diferenciarse en neuronas in
vitro. Además, la presente invención proporciona, por primera
vez, los métodos para dirigir la diferenciación de CEM en neuronas
in vitro. Las CEM son útiles en el tratamiento de una amplia
variedad de enfermedades neurológicas, trastornos y condiciones, y
estas células ofrecen ventajas significativas respecto a otras
células denominadas "madre". Es decir, las células de la
médula ósea son fácilmente obtenibles, evitando los riesgos de
obtener células madre neurales a partir del cerebro, y proporcionar
una población reanudable que puede ser ampliada in vitro,
permitiendo así complejas manipulaciones génicas que se realizan
para terapias génicas ex vivo y/o para terapias celulares
para las enfermedades del SNC, trastornos o condiciones que
requieren administrar células a un sitio del SNC. Además, el
trasplante autólogo supera las preocupaciones éticas e inmunológicas
asociadas al uso del tejido fetal. Además, las CEM crecen
rápidamente en cultivos, excluyendo la necesidad de la
inmortalización, y se diferencian en neuronas exclusivamente usando
los protocolos descritos en este documento.
Los datos descritos en este documento demuestran
que las células neuronales diferenciadas a partir de CEM, según se
describe en este documento, expresan varias proteínas relacionadas
con las neuronas. Por ejemplo, el análisis inmunocitoquímico de
estas neuronas diferenciadas reveló la expresión de
\beta-3 tubulina. Además, TOAD 64, una proteína
neuronal de función desconocida, es también detectable usando
técnicas inmunocitoquímicas, así como la sinaptofisina, que está
relacionada con la sinápsis y las vesículas sinápticas. Usando los
procesos policlonales y monoclonales basados en anticuerpos, se ha
demostrado que estas células expresan la colinacetiltransferasa,
una enzima responsable de la síntesis del neurotransmisor
acetilcolina. Finalmente, la tirosina hidroxilasa, la enzima
limitante de la velocidad en la biosíntesis de catecolaminas,
también fue detectada inmunocitoquímicamente en una población de
estas neuronas diferenciadas.
Es evidente que debido a la presencia de estos
productos génicos neuronales, las neuronas diferenciadas pueden ser
terapéuticamente beneficiosas en el tratamiento de aquellas
enfermedades que afecten a los sistemas colinérgicos y
catecolaminérgicos, tales como, por ejemplo, la enfermedad de
Alzheimer, la enfermedad de Parkinson o la esquizofrenia.
Las neuronas diferenciadas generadas, según se
describe en este documento, fueron además analizadas para determinar
su viabilidad in vivo. Las neuronas fueron trasplantadas,
usando una técnica estéril y procesos neuroqurúrgicos conocidos y
aceptados (1997, Grill et al.; 1995, Gage et al.;
1994, Dunnett et al.), en el hipocampo o estriado del
cerebro o el asta dorsal de la médula espinal de ratas individuales.
Cada rata recibió un trasplante en una de las zonas anteriormente
mencionadas. Las ratas fueron devueltas a sus jaulas y se les
proporcionó un cuidado postoperatorio estándar con acceso a
alimentos y agua ad libitum.
Para determinar si la viabilidad de las neuronas
era mantenida in vivo, fue llevado a cabo un estudio
postoperatorio de las ratas que recibían el trasplante. Las ratas
que recibieron el trasplante neuronal fueron examinadas 42 días
después de la operación del trasplante. Usando microscopía de
fluorescencia para detectar las células trasplantadas reactivas
respecto a bisbencimida, los estudios histológicos del hipocampo y
de las regiones estriales del cerebro revelaron que las neuronas
trasplantadas sobrevivían en el hipocampo. Este resultado indica
que la supervivencia a largo plazo de las neuronas trasplantadas y
diferenciadas es posible. Un examen de las ratas que recibieron las
neuronas trasplantadas en el asta dorsal de la médula espinal
demostró un período de supervivencia de al menos tres días. Además,
las proyecciones de las neuronas trasplantadas en esta zona
crecieron al menos de dos a tres veces más en longitud que el
diámetro del cuerpo celular.
\newpage
Como es evidente a partir de estos resultados,
las neuronas trasplantadas y diferenciadas expresan muchas
proteínas neuronales, conservan la viabilidad in vivo, y
evidentemente no ejercen ningún efecto deletéreo detectable sobre
el animal vivo. Por consiguiente, estas neuronas crean un potencial
tratamiento terapéutico para una variedad de enfermedades del
cerebro y de la médula espinal, incluyendo, pero no limitadas a, la
enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la
esquizofrenia y el daño de médula espinal como consecuencia de un
traumatismo o una degeneración.
Aunque la invención ha sido descrita con
referencia a realizaciones específicas es evidente que otras
realizaciones y variaciones de esta invención, según se define en
las reivindicaciones, pueden ser inventadas por otros expertos en
la técnica sin abandonar el verdadero espíritu y el alcance de la
invención. Las reivindicaciones añadidas son requeridas para que se
interprete que incluyen todas tales realizaciones y variaciones
equivalentes.
Claims (22)
1. Un método para inducir la diferenciación de
células estromales de la médula ósea en neuronas, comprendiendo
dicho método transferir células estromales de la médula ósea
aisladas en un medio sin suero que contiene al menos un
antioxidante, induciendo así la diferenciación de dichas células
estromales de la médula ósea aisladas en neuronas.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
dichas células estromales de la médula ósea aisladas son células
humanas.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el
que dicho antioxidante se selecciona a partir del grupo que consiste
en \beta-mercaptoetanol, dimetilsulfóxido,
hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, ácido ascórbico,
dimetilfumarato y n-acetilcisteína.
4. El método de la reivindicación 3, en el que
dicho antioxidante es \beta-mercaptoethanol.
5. El método de la reivindicación 3, en el que
dicho antioxidante es dimetilsulfóxido.
6. El método de la reivindicación 3, en el que
dicho antioxidante es dimetilsulfóxido e hidroxianisol butilado.
7. Un método in vitro para producir
células neuronales aisladas, comprendiendo dicho método aislar
células estromales de la médula ósea, transferir las células
estromales de la médula ósea aisladas a un medio sin suero que
contiene un antioxidante, en el que dicho antioxidante induce a
dichas células estromales de la médula ósea aisladas a diferenciarse
en células neuronales aisladas, produciéndose así dichas células
neuronales aisladas.
8. El uso de una población aislada de células
que comprenden células neuronales obtenidas a partir de una muestra
de médula ósea a partir de un donante humano, después del
aislamiento de las células estromales a partir de dicha muestra de
médula ósea y la inducción de dichas células estromales para
diferenciarse en células neuronales aisladas transfiriendo las
células estromales aisladas de la médula ósea en un medio sin suero
que contiene al menos un antioxidante, para preparar un medicamento
para efectuar el tratamiento de una enfermedad, trastorno o
condición del sistema nervioso central de un paciente humano.
9. El uso de la reivindicación 8, en el que
dicha enfermedad, trastorno o condición del sistema nervioso central
se selecciona a partir del grupo que consiste en la enfermedad de
Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington,
esclerosis lateral amiotrófica, un tumor, un traumatismo, demencia
senil, la enfermedad de Tay-Sach, la enfermedad de
Sandhoffs, el síndrome de Hurler, la enfermedad de Krabbe, daño
traumático del sistema nervioso central inducido en el nacimiento,
epilepsia, esclerosis múltiple, traumatismo, tumor, apoplejía y daño
de la médula espinal.
10. El uso de la reivindicación 8, en el que
dichas células neuronales aisladas habían sido transfectadas con un
ácido nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica, en el
que dicha proteína es expresada en dichas células, lo que sirve para
efectuar el tratamiento de dicha enfermedad, trastorno o
condición.
11. El uso de la reivindicación 10, en el que
dicho ácido nucleico aislado codifica una proteína terapéutica
seleccionada a partir del grupo de una citoquina, una quimiocina,
una neurotrofina, otra proteína alimentaria, un factor de
crecimiento, un anticuerpo y una proteína tóxica de glioma.
12. El uso de una población de células que
comprenden células neuronales obtenidas a partir de células
estromales de la médula ósea de un paciente humano, después de la
propagación de dichas células estromales de la médula ósea en un
cultivo en condiciones que inducen a su diferenciación en células
neuronales, inducidas transfiriendo células estromales aisladas de
la médula ósea en un medio sin suero que contiene un antioxidante,
para preparar un medicamento para el tratamiento de un paciente
humano en necesidad de dichas células neuronales.
13. Una población aislada de células que
comprenden neuronas hechas por un método para inducir la
diferenciación de células estromales de la médula ósea aisladas,
comprendiendo dicho método transferir células estromales de la
médula ósea aisladas en un medio sin suero que contiene al menos un
antioxidante, induciendo así la diferenciación de dichas células
estromales de la médula ósea aisladas en dichas células
neuronales.
14. La población de la reivindicación 13, en el
que dichas células son células humanas.
15. Una población aislada de células que
comprenden células neuronales hechas por un método para inducir la
diferenciación de células estromales de la médula ósea aisladas,
comprendiendo dicho método transferir células estromales de la
médula ósea aisladas en un medio sin suero que contiene al menos un
antioxidante, induciendo así la diferenciación de dichas células
estromales de la médula ósea aisladas en dichas células neuronales,
en el que dichas células neuronales además son transfectadas con un
ácido nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica y,
además, en el que, cuando dicha proteína es expresada en células,
dicha proteína sirve para efectuar el tratamiento de una enfermedad,
trastorno o condición del sistema nervioso central.
16. La población de la reivindicación 15, en el
que dicho ácido nucleico aislado codifica una proteína seleccionada
a partir del grupo que consiste en una citoquina, una quimiocina,
una neurotrofina, otra proteína alimentaria, un factor de
crecimiento, un anticuerpo y una proteína tóxica de glioma.
17. La población de la reivindicación 15, en el
que dichas células son células humanas.
18. Una población aislada de células que
comprenden células neuronales hechas por un método in vitro
para producir células neuronales aisladas, comprendiendo dicho
método aislar células estromales de la médula ósea, transferir las
células estromales de la médula ósea aisladas a un medio sin suero
que contiene un antioxidante, en el que dicho antioxidante induce a
que dichas células estromales de la médula ósea aisladas se
diferencien en dichas células neuronales aisladas, produciéndose así
dicha población aislada que comprende células neuronales.
19. La población de la reivindicación 18, en el
que dichas células son células humanas.
20. Una población aislada de células que
comprenden células neuronales hechas por un método in vitro
para producir células neuronales aisladas, comprendiendo dicho
método aislar células estromales de la médula ósea, transferir las
células estromales de la médula ósea aisladas en un medio sin suero
que contiene un antioxidante, en el que dicho antioxidante induce a
que dichas células estromales de la médula ósea aisladas se
diferencien en dichas células neuronales aisladas, produciéndose así
dichas células neuronales aisladas, en el que dichas células
neuronales además son transfectadas con un ácido nucleico aislado
que codifica una proteína terapéutica, y además en el que cuando
dicha proteína es expresada en dichas células, dicha proteína sirve
para efectuar el tratamiento de una enfermedad, trastorno o
condición del sistema nervioso central.
21. La población de la reivindicación 20, en el
que dicho ácido nucleico aislado codifica una proteína seleccionada
a partir del grupo que consiste en una citoquina, una quimiocina,
una neurotrofina, otra proteína alimentaria, un factor de
crecimiento, un anticuerpo y una proteína tóxica de glioma.
22. La población de la reivindicación 21, en el
que dichas células son células humanas.
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