ES2292185T3 - Supresion y sustitucion genetica. - Google Patents

Abstract

ESTRATEGIA PARA SUPRIMIR DE FORMA ESPECIFICA, O PARCIALMENTE ESPECIFICA, UN GEN ENDOGENO, E INTRODUCIR UN GEN DE SUSTITUCION, COMPRENDIENDO DICHA ESTRATEGIA LOS PASOS DE: 1) PROPORCIONAR ACIDOS NUCLEICOS SUPRESORES U OTROS EFECTORES DE SUPRESION CAPACES DE FIJARSE A UN GEN ENDOGENO, TRANSCRIPCION DE GEN O PRODUCTO DE GEN QUE DEBA SUPRIMIRSE Y 2) PROPORCIONAR DNA O DNAC GENOMICO (COMPLETO O PARCIAL) QUE CODIFIQUE UN GEN DE SUSTITUCION, CARACTERIZADO PORQUE LOS ACIDO NUCLEICOS SUPRESORES SON INCAPACES DE FIJARSE A REGIONES EQUIVALENTES DEL DNA O DNAC GENOMICO PARA IMPEDIR LA EXPRESION DEL GEN DE SUSTITUCION. LOS ACIDOS NUCLEICOS DE SUSTITUCION TIENEN MODIFICACIONES EN UNA O MAS POSICIONES (INESTABLES) DE LA BASE TERCERA, POR LO QUE LOS CITADOS ACIDOS NUCLEICOS DE SUSTITUCION SIGUEN CODIFICANDO PARA LOS AMINOACIDOS DEL TIPO SILVESTRE O EQUIVALENTES.

Description

Supresión y sustitución genética.

La presente invención se refiere a una estrategia para suprimir un gen. En particular, la invención se refiere a la supresión de genes mutados que dan lugar a un efecto dominante o perjudicial, o bien monogénica o bien poligénicamente. La invención se refiere a una estrategia para suprimir un gen o un alelo patológico usando métodos que no seleccionan como diana el alelo patológico específicamente, sino que en cambio, pueden dirigirse hacia un amplio intervalo de secuencias en un gen particular. Una realización particular de la invención es el uso de estrategias de supresión para seleccionar como diana o bien sólo alelos patológicos o bien normales o para seleccionar como diana tanto alelos patológicos como normales. La invención emplea el uso de la hipótesis del titubeo (wobble) para permitir la expresión continuada de un gen beneficioso o normal de sustitución (un gen alterado a partir del tipo natural de modo que proporciona efecto(s) beneficioso(s) adicional(es)). El gen de sustitución tendrá cambios de nucleótidos con respecto al gen de tipo natural endógeno, pero codificará para aminoácidos idénticos a los del gen de tipo natural. La estrategia salva la necesidad de un tratamiento específico para cada mutación dentro de un gen dado. Además, la invención permite una mayor flexibilidad de elección de secuencia diana para la supresión de un alelo
patológico.

La invención se refiere también a un medicamento o medicamentos para su uso en la supresión de un alelo perjudicial que está presente en el genoma de uno o más individuos o animales.

Generalmente, la presente invención será útil cuando el gen, que está naturalmente presente en el genoma de un paciente, contribuye a un estado patológico. Generalmente, se mutará un alelo del gen en cuestión, es decir, tendrá alteraciones en su secuencia de nucleótidos, lo que afecta a la función o al nivel del producto génico. Por ejemplo, la alteración puede dar como resultado un producto proteico alterado a partir del gen de tipo natural, o un control alterado de la transcripción y el procesamiento. La herencia o adquisición somática de una mutación de este tipo puede dar lugar a un fenotipo patológico o puede predisponer a un individuo para tener un fenotipo patológico. Sin embargo, el gen de interés también podría ser de fenotipo de tipo natural, pero contribuir a un estado patológico de otra manera, de modo que la supresión del gen aliviaría o mejoraría el estado patológico o mejoraría la eficacia de un compuesto terapéutico administrado.

Generalmente, pueden emplearse efectores de supresión tales como ácidos nucleicos (sentido o antisentido), ribozimas, ácidos nucleicos peptídicos (ANP), oligonucleótidos que forman triple hélice, péptidos y/o anticuerpos dirigidos a secuencias en un gen, en transcritos o en proteína, en la invención para conseguir la supresión génica.

Antecedentes

Los estudios de estados oculares hereditarios degenerativos, incluyendo retinitis pigmentaria (RP) y diversas distrofias maculares, han dado como resultado una dilucidación sustancial de la base molecular de estas degeneraciones retinianas humanas debilitantes. Aplicando el enfoque del ligamiento genético, se han localizado genes de RP asociados a x (xlRP, x-linked RP) en el brazo corto del cromosoma X (Ott et al. 1990); posteriormente se ha identificado el gen implicado en una forma de xlRP. Se han localizado diversos genes implicados en formas autosómicas dominantes de RP (adRP). El primero de estos se mapeó en 3q próximo al gen que codifica para la proteína fotorreceptora de los bastones, la rodopsina (McWilliam et al. 1989; Dryja et al. 1990). De manera similar, se colocó un gen de adRP en 6p próximo al gen que codifica para la proteína fotorreceptora periferina (Farrar et al. 1991 a,b; Kajiwara et al. 1991). Se han mapeado otros genes de adRP en posiciones cromosómicas diferenciadas, sin embargo, los genes patológicos permanecen aún sin caracterizar. Al igual que para xlRP y adRP, se han localizado diversos genes implicados en la RP autosómica recesiva (arRP) y, en algunos casos, se han caracterizado defectos moleculares (Humphries et al. 1992; Farrar et al. 1993; Van Soest et al. 1994). De manera similar, se han mapeado varios genes implicados en distrofias maculares (Mansergh et al. 1995). El ligamiento genético, junto con técnicas de detección de mutaciones de genes posibles, permitía la identificación de mutaciones dominantes causales en los genes que codifican para rodopsina y periferina. Globalmente se han encontrado aproximadamente 100 mutaciones de rodopsina en pacientes con RP o ceguera nocturna congénita estacionaria. De manera similar, se han caracterizado aproximadamente 40 mutaciones en el gen de la periferina en pacientes con RP o distrofias maculares. El conocimiento de la etiología molecular de estas retinopatías ha estimulado la generación de modelos animales y la exploración de métodos de intervención terapéutica (Farrar et al. 1995; Humphries et al. 1997).

De manera similar a la RP, la osteogénesis imperfecta (OI) es un trastorno humano autosómico heredado de manera dominante cuya patogénesis molecular es, en extremo, genéticamente heterogénea. La OI se denomina a menudo "osteoporosis", aunque frecuentemente se observan síntomas adicionales, incluyendo hipoacusia, falta de crecimiento, magulladuras, articulaciones laxas, enfermedad de las escleróticas azules y dentinogénesis imperfecta (McKusick, 1972). Se han implicado en OI mutaciones en los genes que codifican para las dos cadenas de colágeno tipo I (colágeno 1A1 y 1A2) que comprenden el heterodímero de colágeno tipo I. De hecho, se han identificado cientos de mutaciones predominantemente activas en pacientes con OI en estos dos genes, de las que muchas son mutaciones individuales, aunque se han encontrado varias mutaciones de inserción y deleción (Willing et al. 1993; Zhuang et al. 1996). De manera similar, se han implicado también mutaciones en estos genes en los síndromes de Ehlers-Danlos y Marfan (Dalgleish et al. 1986; Phillips et al. 1990; D'Alessio et al. 1991; Vasan NS et al. 1991).

Generalmente, se han usado terapias génicas que utilizan sistemas de administración virales y no virales para tratar trastornos hereditarios, cánceres y enfermedades infecciosas. Sin embargo, muchos estudios se han centrado en trastornos heredados de manera recesiva, siendo el fundamento que la introducción y la expresión del gen de tipo natural puede ser suficiente para evitar/mejorar el genotipo patológico. Por el contrario, la terapia génica para trastornos dominantes requerirá la supresión del alelo patológico dominante. Notablemente, muchas de las mutaciones caracterizadas que provocan enfermedades hereditarias tales como RP u OI se heredan de una manera autosómica dominante. De hecho, existen más de 1.000 trastornos autosómicos heredados de manera dominante en el hombre. Además existen muchos trastornos poligénicos debido a la herencia conjunta de varios componentes genéticos que juntos dan lugar al estado patológico. Las terapias génicas eficaces para enfermedades dominantes o poligénicas pueden dirigirse al defecto primario y en este caso pueden requerir la supresión del alelo patológico, mientras que en muchos casos se mantiene todavía la función del alelo normal. Esto será especialmente relevante cuando la patología de la enfermedad se deba a un aumento de mutación funcional en lugar de deberse a niveles reducidos de proteína de tipo natural. Alternativamente, las terapias de supresión pueden dirigirse a los efectos secundarios asociados a la patología de la enfermedad: un ejemplo es la muerte celular programada (apoptosis) que se ha observado en muchos trastornos hereditarios.

Las estrategias para diferenciar entre alelos normales y patológicos, y para desconectar selectivamente el alelo patológico usando efectores de supresión, entre otros ADN/ARN, ANP, ribozimas o ADN de triple hélice, dirigidas hacia la mutación patológica pueden ser difíciles en muchos casos (a menudo los alelos patológicos y normales difieren sólo en un nucleótido). Una dificultad adicional que inhibe el desarrollo de terapias génicas es la naturaleza heterogénea de algunos trastornos dominantes (muchas mutaciones diferentes en el mismo gen dan lugar a un fenotipo patológico similar). El desarrollo de terapias génicas específicas para cada una de éstas puede ser prohibitivo con respecto al coste. Para salvar las dificultades asociadas a la selección como diana de manera específica de la mutación patológica y con la heterogeneidad genética presente en los trastornos hereditarios, en la invención se describe una estrategia novedosa para la supresión génica y la sustitución génica que se aprovecha de la degeneración del código genético, permitiendo así la flexibilidad en la elección de la secuencia diana para la supresión y proporcionando un medio de supresión génica que es independiente de la mutación patológica.

Técnica anterior

Anteriormente se han usado efectores de supresión para conseguir la supresión específica de la expresión génica. Se han usado ADN y ARN antisentido para inhibir la expresión génica en muchos casos. Se han realizado modificaciones, tales como fosforotioatos, en los oligonucleótidos para aumentar la resistencia a la degradación por nucleasa, la afinidad de unión y la captación (Cazenave et al. 1989; Sun et al. 1989; McKay et al. 1996; Wei et al. 1996). En algunos casos, el uso de estrategias antisentido y de supresión de ribozimas ha conducido a la inversión de un fenotipo tumoral reduciendo la expresión de un producto génico o escindiendo un transcrito mutante en el sitio de la mutación (Carter y Lemoine 1993; Lange et al. 1993; Valera et al. 1994; Dosaka-Akita et al. 1995; Feng et al. 1995; Quattrone et al. 1995; Ohta et al. 1996). Por ejemplo, se obtuvo la reversión neoplásica usando una ribozima dirigida a una mutación de H-ras en células de carcinoma de vejiga (Feng et al. 1995). Las ribozimas se han propuesto también como un medio tanto para inhibir la expresión génica de un gen mutante como para corregir el mutante mediante corte y empalme en trans dirigido (Sullenger y Cech 1994; Jones et al. 1996). Pueden diseñarse ribozimas para provocar la escisión autocatalítica de dianas de ARN, sin embargo, el efecto inhibidor de algunas ribozimas puede deberse en parte a un efecto antisentido debido a las secuencias antisentido que flanquean el núcleo catalítico que especifican el sitio diana (Ellis y Rodgers 1993; Jankowsky y Schwenzer 1996). Puede aumentarse la actividad de las ribozimas mediante el uso de, por ejemplo, oligonucleótidos mediadores o proteínas de unión a ácido nucleico no específicas (Herschlag et al. 1994; Jankowsky y Schwenzer 1996). Se han sugerido ribozimas de múltiples dianas (conectadas o aleatorias) como un medio para mejorar la eficacia de las ribozimas para la supresión génica (Ohkawa et al. 1993). También se han investigado enfoques de triple hélice para determinar la supresión génica específica de secuencia; se ha encontrado que, en algunos casos, los oligonucleótidos que forman triple hélice se unen de una manera específica de secuencia (Postel et al. 1991; Duval-Valentin et al. 1992; Hardenbol y Van Dyke 1996; Porumb et al. 1996). De manera similar, se ha demostrado que los ácidos nucleicos peptídicos inhiben la expresión génica (Hanvey et al. 1992; Knudson y Nielsen 1996; Taylor et al. 1997). Pueden unirse poliamidas de unión de surco menor de una manera específica de secuencia a dianas de ADN y por tanto, pueden representar moléculas pequeñas útiles para la futura supresión a nivel de ADN (Trauger et al. 1996). Además, se ha obtenido la supresión mediante la interferencia al nivel de proteína usando anticuerpos y péptidos mutantes negativos dominantes (Herskowitz 1987; Rimsky et al. 1989; Wright et al. 1989). En algunos casos, las estrategias de supresión han conducido a una reducción en los niveles de ARN sin una reducción concomitante en las proteínas, mientras que en otros, las reducciones en el ARN se han reflejado en reducciones en las proteínas.

Ahora existen recursos terapéuticos con los que obtener la supresión génica. Esto, junto con un mejor entendimiento de la etiología molecular de la enfermedad, da como resultado un número siempre creciente de dianas de enfermedad para las terapias basadas en la supresión. En muchos casos, ha sido difícil de conseguir la supresión completa de la expresión génica. Posiblemente puede ayudar a esto un enfoque combinado usando varios efectores de supresión. Para algunos trastornos puede ser necesario bloquear la expresión de un alelo patológico completamente para evitar los síntomas de la enfermedad, mientras que para otros pueden tolerarse niveles bajos de la proteína mutante. En paralelo con un mayor conocimiento de los defectos moleculares que producen enfermedad, ha estado la compresión de que muchos trastornos son genéticamente heterogéneos. Los ejemplos en los que múltiples genes y/o múltiples mutaciones dentro de un gen pueden dar lugar a un fenotipo patológico similar incluyen osteogénesis imperfecta, hipercolesterolemia familiar retinitis pigmentaria y muchos otros. En la invención se promueve la utilidad de la generación del código genético (hipótesis del titubeo) para permitir la supresión de uno o ambos alelos de un gen y la introducción de un gen de sustitución de modo que escape a la supresión.

La invención trata las deficiencias de la técnica anterior proporcionando un enfoque novedoso para el diseño de efectores de supresión dirigidos a alelos diana de un gen que porta una mutación deletérea. La supresión de cada mutación que da lugar a un fenotipo patológico puede ser costosa y problemática. Las mutaciones patológicas son a menudo cambios de un solo nucleótido. Como resultado, puede ser difícil la diferenciación entre los alelos patológicos y los normales. Algunos efectores de supresión requieren dianas de secuencia específica, por ejemplo, las ribozimas de tipo cabeza de martillo escinden en los sitios NUX y por tanto, es posible que no puedan seleccionar como diana muchas mutaciones. Notablemente, el amplio espectro de mutaciones observadas en muchas enfermedades añade una complejidad adicional al desarrollo de estrategias terapéuticas para tales trastornos (algunas mutaciones pueden producirse sólo una vez en un solo paciente). Un problema adicional asociado a la supresión, es el alto nivel de homología presente en las secuencias codificantes entre los miembros de algunas familias de genes. Esto puede limitar la variedad de sitios diana para la supresión, lo que permitirá la supresión específica de un único miembro de una familia de genes de este tipo.

La presente invención salva las deficiencias de la técnica anterior utilizando la degeneración del código genético. En la invención se diseñan específicamente efectores de supresión para secuencias en regiones codificantes de genes o en productos génicos. Normalmente, un alelo del gen contiene una mutación con un efecto perjudicial. La supresión dirigida a secuencias codificantes proporciona una mayor flexibilidad en la elección de la secuencia diana para la supresión en contraste con la supresión dirigida hacia mutaciones patológicas individuales. Adicionalmente, la invención proporciona la introducción de un gen de sustitución con secuencias modificadas, de modo que el gen de sustitución se protege de la supresión. El gen de sustitución se modifica en las posiciones de titubeo de la tercera base y, por tanto, proporciona el producto génico de tipo natural. Notablemente, la invención tiene la ventaja de que podría usarse la misma estrategia de supresión para suprimir, en principio, muchas mutaciones en un gen. Esto es particularmente relevante cuando grandes números de mutaciones en un solo gen producen patología de la enfermedad. El gen de sustitución proporciona (si es necesario) la expresión del producto proteico normal cuando se requiere para mejorar la patología asociada a niveles reducidos de proteína de tipo natural. El mismo gen de sustitución podría usarse en principio junto con la supresión de muchas mutaciones patológicas diferentes en un gen dado. Las secuencias diana pueden encontrarse en cualquier parte de la secuencia codificante. La supresión en la secuencia codificante tiene la ventaja de que tales secuencias están presentes tanto en los ARN precursor como maduro, permitiendo así que los supresores seleccionen como diana todas las formas de ARN.

En resumen, la invención implica la supresión génica de alelos patológicos y normales que seleccionan como diana secuencias codificantes en un gen y la sustitución génica de modo que el gen de sustitución no puede suprimirse. Los genes de sustitución se modifican en posiciones de la tercera base (posiciones de titubeo) de modo que codifican para los aminoácidos correctos pero están protegidos completa o parcialmente de la supresión. Pueden usarse las mismas etapas de supresión y sustitución para muchas mutaciones patológicas en un gen dado. La supresión y la sustitución pueden producirse juntas o por separado.

Descripción de la invención

Según la presente invención se proporciona un método tal como se define en la reivindicación 7. El método emplea una estrategia para suprimir la expresión de un gen endógeno con una mutación deletérea, en el que dicha estrategia comprende proporcionar efectores de supresión tales como ácidos nucleicos antisentido que pueden unirse a las secuencias de un gen que va a suprimirse, para evitar la expresión funcional del mismo.

Generalmente, los términos efectores de supresión significa ácidos nucleicos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), péptidos, anticuerpos o formas modifica de éstos usados para silenciar o reducir la expresión génica de una manera específica de secuencia.

Los efectores de supresión, tales como ácidos nucleicos antisentido pueden ser ADN o ARN, normalmente pueden dirigirse a la secuencia codificante, sin embargo, los efectores de supresión pueden dirigirse a la secuencia codificante y pueden dirigirse también a regiones no traducidas en 5' y/o en 3' y/o intrones y/o regiones control y/o secuencias adyacentes a un gen o a cualquier combinación de tales regiones de un gen. Los ácidos nucleicos antisentido que incluyen tanto secuencia codificante como no codificante pueden usarse, si es necesario, para ayudar a optimizar la supresión. La unión del/de los efector(es) de supresión evita o disminuye la expresión funcional del gen endógeno.

Generalmente los términos "expresión funcional" significa la expresión de un producto génico que puede funcionar de una manera equivalente a o mejor que un producto de tipo natural. En el caso de una "expresión funcional" de gen mutante o gen de predisposición significa la expresión de un producto génico cuya presencia da lugar a un efecto perjudicial o predispone a un efecto perjudicial. Mediante efecto perjudicial se quiere expresar dar lugar a o predisponer a la patología de la enfermedad o alterar el/los efecto(s) y/o la eficacia de un compuesto administrado.

En una realización particular de la invención, la estrategia emplea además ribozimas que pueden diseñarse para provocar la escisión de los ARN diana. La estrategia emplea además nucleótidos que forman ADN de triple hélice. La estrategia puede emplear ácidos nucleicos peptídicos para la supresión. Pueden modificarse los ácidos nucleicos para obtener ácidos nucleicos peptídicos, de triple hélice, ribozimas y antisentido para aumentar la estabilidad, las eficacias de unión y la captación (véase la técnica anterior). Los ácidos nucleicos pueden incorporarse a un vector. Los vectores incluyen vectores de plásmido de ADN, ADN desnudo, vectores de virus de ARN o ADN, lípidos, polímeros u otros derivados y compuestos para ayudar en la expresión y administración del gen.

En el presente documento se describe el uso de nucleótidos antisentido, ribozimas, APN, nucleótidos de triple hélice u otros efectores de supresión solos o en un vector o vectores, en el que los ácidos nucleicos pueden unirse de manera específica o de manera parcialmente específica a las secuencias codificantes de un gen para evitar o reducir la expresión funcional del mismo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad poligénica autosómica dominante o para aumentar la utilidad y/o la acción de un compuesto administrado.

En una realización adicional de la invención, las secuencias diana para la supresión pueden incluir secuencias no codificantes del gen.

Según un segundo aspecto de la presente invención se proporciona un uso tal como se define en la reivindicación 5. La invención puede suponer una estrategia para suprimir de manera específica o de manera parcialmente específica un gen endógeno y (si se requiere) introducir un gen de sustitución, comprendiendo dicha estrategia las etapas
de:

1.

proporcionar ácidos nucleicos u otros efectores de supresión que pueden unirse a un gen endógeno, transcrito de gen que va a suprimirse y

2.

proporcionar ADN genómico o ADNc (completo o parcial) que codifica para un gen de sustitución en el que los ácidos nucleicos no pueden unirse a regiones equivalentes en el ADN genómico o ADNc para evitar la expresión del gen de sustitución. Los ácidos nucleicos de sustitución no se reconocerán por los ácidos nucleicos de supresión o se reconocerán de manera menos eficaz que el gen endógeno. Puede alterarse la secuencia codificante de los ácidos nucleicos de sustitución para evitar o reducir la eficacia de la supresión. Los ácidos nucleicos de sustitución tienen modificaciones en una o más posiciones de tercera base (titubeo), de modo que los ácidos nucleicos de sustitución codifican aún para aminoácidos de tipo natural o equivalentes.

En una realización particular de la invención se proporciona una estrategia para la supresión génica dirigida a secuencias codificantes del gen que va a suprimirse. La supresión será específica o parcialmente específica para un alelo, por ejemplo, para el alelo que porta una mutación deletérea. Los supresores se dirigen a regiones codificantes de un gen o a una combinación de regiones codificantes y no codificantes de un gen. Los supresores pueden dirigirse a una característica de un alelo de un gen de modo que la supresión sea específica para un alelo de un gen (documento WO 97/32024). La invención proporciona además el uso de ácidos nucleicos de sustitución con secuencias codificantes alteradas, de modo que los ácidos nucleicos de sustitución no se reconocerán (o se reconocerán de manera menos eficaz) por los ácidos nucleicos de supresión que se dirigen de manera específica o de manera parcialmente específica a un alelo del gen que va a suprimirse. Los ácidos nucleicos de sustitución proporcionan el producto génico de tipo natural, un producto génico equivalente o un producto génico mejorado, pero se protegen completa o parcialmente de efectores de supresión dirigidos a secuencias codificantes.

En una realización adicional de la invención se proporcionan ácidos nucleicos de sustitución de modo que los ácidos nucleicos de sustitución no se reconocerán por supresores que se producen de forma natural que se encontró que inhiben o reducen la expresión génica en uno o más individuos, animales o plantas. La invención proporciona el uso de ácidos nucleicos de sustitución que tienen secuencias alteradas seleccionadas como diana por supresores del gen, de modo que se evita completa o parcialmente la supresión mediante supresores que se producen de forma natural.

En una realización adicional de la invención se proporcionan ácidos nucleicos de sustitución con la secuencia de nucleótidos alterada en regiones codificantes de modo que los ácidos nucleicos de sustitución codifican para un producto con uno o más aminoácidos alterados. Los ácidos nucleicos de sustitución proporcionan un producto génico que es equivalente a o mejorado en comparación con el producto génico de tipo natural endógeno que se produce de forma natural.

En una realización adicional de la invención se proporciona una estrategia para suprimir un gen en la que el transcrito del gen o producto génico interfiere con la acción de un compuesto administrado.

La invención puede implicar el uso de un vector o vectores que contienen efectores de supresión en forma de ácidos nucleicos, estando dirigidos dichos ácidos nucleicos hacia secuencias codificantes o combinaciones de secuencias codificantes y no codificantes del gen diana y vector(es) que contienen ADN genómico o ADNc que codifica para una secuencia génica de sustitución a la que no pueden unirse los ácidos nucleicos para la supresión (o se unen de manera menos eficaz), en la preparación de un medicamento combinado para el tratamiento de una enfermedad poligénica o autosómica dominante. Pueden proporcionarse ácidos nucleicos para ácidos nucleicos génicos de supresión o de sustitución en el mismo vector o en vectores separados. Los ácidos nucleicos para ácidos nucleicos génicos de supresión o de sustitución pueden proporcionarse como una combinación de ácidos nucleicos solos o en vectores.

En el presente documento se describe un método de tratamiento para una enfermedad producida por un gen mutante endógeno, comprendiendo dicho método la introducción secuencial o concomitante de

(a) ácidos nucleicos en las regiones codificantes de un gen que va a suprimirse y/o ácidos nucleicos en las regiones codificantes y cualquier combinación de regiones no traducidas en 5' y/o en 3', regiones intrónicas, regiones control o regiones adyacentes a un gen que va a suprimirse

(b) ácidos nucleicos de sustitución con secuencias que permiten que se exprese el gen de sustitución.

El ácido nucleico para la supresión génica puede administrarse antes, después o al mismo tiempo en que se administra el gen de sustitución.

La invención proporciona además un kit tal como se define en la reivindicación 13. El kit puede usarse en el tratamiento de una enfermedad producida por una mutación deletérea en un gen, comprendiendo el kit ácidos nucleicos para la supresión que pueden unirse al gen que va a suprimirse y un ácido nucleico de sustitución para sustituir el gen mutante que tiene la que secuencia que le permite expresarse y escapar completa o parcialmente a la supresión.

Los nucleótidos pueden administrarse como ARN o ADN desnudo. Los nucleótidos pueden administrarse en vectores. Los ácidos nucleicos desnudos o ácidos nucleicos en vectores pueden administrarse con lípidos u otros derivados que ayudan a la administración del gen. Los nucleótidos pueden modificarse para hacerlos más estables, por ejemplo, resistentes a nucleasas celulares, mientras que todavía soportan la degradación de ARN mediada por ARNasa H, o con eficacias de unión aumentadas (véase la técnica anterior). Los anticuerpos o péptidos pueden generarse para seleccionar como diana el producto proteico del gen que va a suprimirse.

La estrategia descrita en el presente documento tiene aplicaciones para aliviar enfermedades autosómicas dominantes. Puede ser difícil de conseguir el silenciamiento completo de un alelo patológico usando enfoques antisentido, de APN, de ribozima y de triple hélice o cualquier combinación de enfoques de silenciamiento de genes. Sin embargo pueden tolerarse pequeñas cantidades de producto mutante en algunos trastornos autosómicos dominantes. En otros, una reducción significativa en la proporción de producto mutante con respecto a normal puede dar como resultado una mejoría de los síntomas de enfermedad. Por tanto, esta invención puede aplicarse a cualquier enfermedad heredada de manera poligénica o autosómica dominante en el hombre, en la que se ha establecido o se entiende parcialmente la base molecular de la enfermedad. Esta estrategia permitirá que se use la misma terapia para tratar una variedad de diferentes mutaciones patológicas dentro del mismo gen. El desarrollo de tales enfoques será importante para futuras terapias para enfermedades poligénicas y autosómicas dominantes, siendo la clave para una estrategia general que salva la necesidad de una terapia específica para cada mutación que produce o predispone a una enfermedad. Esto es particularmente relevante en algunos trastornos, por ejemplo, RP autosómica dominante asociada a rodopsina, en la que, hasta la fecha, se han observado aproximadamente cien mutaciones diferentes en el gen de rodopsina en los pacientes con adRP. Asimismo, se han identificado cientos de mutaciones de los genes de colágeno de tipo I 1A1 y 1A2 humano en osteogénesis imperfecta autosómica dominante. En la actualidad, los costes para desarrollar terapias para cada mutación son prohibitivos. Se requerirán invenciones que como ésta usan un enfoque general para la terapia. Los enfoques generales pueden dirigirse al defecto primario tal como es el caso con esta invención, o a efectos secundarios tales como la apoptosis.

Esta invención puede aplicarse en enfoques de terapia génica para trastornos poligénicos biológicamente importantes que afectan a grandes proporciones de poblaciones del mundo tales como degeneración macular relacionada con la edad, glaucoma, depresión maníaca, cánceres que tienen un componente familiar y muchísimos otros. Las enfermedades poligénicas requieren la herencia de más de una mutación (componente) para dar lugar al estado patológico. Notablemente, una mejoría en los síntomas de la enfermedad puede requerir la reducción en la presencia de sólo uno de estos componentes, es decir, la supresión de un genotipo que, junto con otros conduzca al fenotipo patológico, puede ser suficiente para evitar o mejorar los síntomas de la enfermedad. En algunos casos puede requerirse la supresión de más de un componente para mejorar los síntomas de la enfermedad. Esta invención puede aplicarse a posibles futuras terapias intervencionistas para enfermedades poligénicas comunes para suprimir un/unos genotipo(s) particular(es)
usando etapas de supresión y si es necesario de sustitución.

La presente invención se ilustra a modo de ejemplo usando cuatro genes: rodopsina humana, rodopsina de ratón, periferina humana y colágeno 1A2 humano. Los primeros de estos genes son específicos de la retina. Por el contrario, el colágeno 1A2 se expresa en una variedad de tejidos que incluyen piel y hueso. Aunque estos cuatro genes se han usado como ejemplos, no existe ninguna razón por la que la invención no podría utilizarse para la supresión de muchos otros genes en los que las mutaciones producen o predisponen a un efecto perjudicial. Muchos ejemplos de genes mutantes que dan lugar a fenotipos de enfermedad están disponibles a partir de la técnica anterior; todos estos genes representan dianas para la invención. La presente invención se ilustra a modo de ejemplo usando ribozimas de tipo cabeza de martillo con hebras antisentido para provocar la escisión del ARN. No existe ninguna razón por la que no podrían usarse otros efectores de supresión dirigidos hacia genes, transcritos de gen o productos génicos para conseguir la supresión génica. Se recogen muchos ejemplos de la técnica anterior que detallan el uso de efectores de supresión, entre otros, ARN/ADN antisentido, triple hélice, APN y péptidos para conseguir la supresión de la expresión génica (véase la técnica anterior). La presente invención se ilustra a modo de ejemplo usando ribozima de tipo cabeza de martillo con hebras antisentido para provocar la escisión específica de secuencia de transcritos de los genes implicados en trastornos dominantes y la no escisión de transcritos de los genes de sustitución que contienen modificaciones de secuencia en posiciones de titubeo, de modo que el gen de sustitución todavía codifica para la proteína de tipo natural. La presente invención se ilustra a modo de ejemplo usando efectores de supresión que seleccionan como diana sitios en regiones codificantes de los genes de rodopsina humana y de ratón, de periferina humana y de colágeno 1A2 humano. Podrían usarse sitios diana que incluyen secuencias de regiones transcritas pero no traducidas de genes, intrones, regiones implicadas en el control de la expresión génica, regiones adyacentes al gen o cualquier combinación de éstos, para conseguir la supresión génica. Podrían usarse múltiples efectores de supresión, por ejemplo, ribozimas aleatorias para optimizar la eficacia de la supresión si fuera necesario. Adicionalmente, cuando se requiera, puede usarse para proporcionar el producto génico la expresión de un gen de sustitución modificado, de modo que el producto génico de sustitución esté alterado con respecto al producto de tipo natural, de modo que proporcione un efecto beneficioso.

Materiales y métodos Vectores de clonación

Se clonaron moldes de ADNc y ribozimas en vectores de expresión comerciales (pCDNA3, pZeoSV o pBluescript) que permiten la expresión en un tubo de ensayo a partir de promotores de T7, T3 o SP6 o la expresión en células de mamífero a partir de promotores de CMV o SV40. Se colocaron los insertos en el sitio de clonación múltiple (SCM) de estos vectores normalmente en o cerca de los extremos terminales del SCM para delecionar la mayoría de los SCM y evitar así cualquier posible problema con la eficacia de la expresión posterior a la clonación.

Protocolos de secuenciación

Se secuenciaron clones que contenían ADNc molde y ribozimas mediante el mecanismo de secuenciación automática ABI usando protocolos convencionales.

Expresión de los ARN

Se obtuvo ARN a partir de clones in vitro usando un sistema de expresión Ribomax (Promega) comercialmente disponible y protocolos convencionales. Se realizaron purificaciones de ARN usando el kit de purificación de ARN Bio-101 o una disolución de acetato de sodio 0,3 M y SDS al 0,2% tras el aislamiento a partir de geles de poliacrilamida. Se realizaron reacciones de escisión usando protocolos convencionales con concentraciones de MgCl_{2} variables (0-15 mM) a 37ºC, normalmente durante 3 horas. Se realizaron puntos de tiempo a las concentraciones de MgCl_{2} óptimas predeterminadas durante hasta 5 horas. Se obtuvieron productos de ARN marcados radiactivamente que incorporaban a-P32 rUTP (Amersham) en las reacciones de expresión (Gaughan et al. 1995). Se hicieron correr los productos de ARN marcados sobre geles de poliacrilamida antes de que se realizaran las reacciones de escisión para el fin de la purificación del ARN y después de las reacciones de escisión para establecer si se había conseguido la escisión del ARN. Se realizaron reacciones de escisión con Tris-HCl 5 mM pH 8,0 y concentraciones variables de MgCl_{2} a 37ºC.

Estructuras secundarias de ARN

Se obtuvieron predicciones de las estructuras secundarias de ARNm de rodopsina humana y de ratón, periferina humana y colágeno 1A2 humano usando el programa ARNPlotFold. Se diseñaron ribozimas y oligonucleótidos antisentido para seleccionar como diana zonas del ARN que se predijo que eran accesibles para los efectores de supresión, por ejemplo estructuras de bucle abierto. Se evaluó la integridad de las estructuras de bucle abierto a partir de las 10 estructuras de ARN más probables. Adicionalmente, se generaron estructuras de ARN predichas para productos de ARN truncado y se comparó la integridad de los bucles abiertos entre ARN truncados y de longitud completa.

Moldes y ribozimas Rodopsina humana ADNc molde

Se clonó el ADNc de rodopsina humana en los sitios HindIII y EcoRI del SCM de pCDNA3 en una orientación de 5' a 3' lo que permitía la posterior expresión del ARN a partir del promotor de T7 o CMV en el vector. Se insertó la secuencia 5'UTR de longitud completa en este clon usando mutagénesis por PCR dirigida por cebador y un fragmento de ADN de HindIII (en pCDNA3) a BstEII (en la secuencia codificante del ADNc de la rodopsina humana)
(secuencia 1).

ADNc con secuencia alterada en una posición de titubeo

Se introdujo ADNc híbrido de rodopsina humana, con una alteración de una sola base, un cambio C- ->G (en la posición 477), en el ADNc de la rodopsina humana, usando un casete de PCR de HindIII a BstEII, mediante mutagénesis por PCR dirigida por cebador. Este cambio de secuencia se produce en una posición silenciosa (no da lugar a una sustitución de aminoácido), sin embargo elimina el sitio de escisión de ribozima (GUX - ->GUG). Se clonó la rodopsina híbrida en pCDNA3 en una orientación de 5' a 3' lo que permitía la posterior expresión del ARN a partir del promotor de T7 o CMV en el vector (secuencia 2).

ADNc de rodopsina que porta una mutación de adRP, Pro23Leu

Se introdujo una mutación de adRP de rodopsina humana, un cambio C- ->T (en el codón 23) en el ADNc de rodopsina humana usando un casete de PCR de HindIII a BstEII mediante mutagénesis por PCR dirigida por cebador. Este cambio de secuencia da como resultado la sustitución de un residuo de prolina por un residuo de leucina. Adicionalmente, el cambio de nucleótidos crea un sitio de escisión de ribozima (CCC- ->CTC). Se clonó la rodopsina mutada en los sitios HindIII y EcoRI de pCDNA3 en una orientación de 5' a 3' lo que permitía la posterior expresión del ARN a partir del promotor de T7 o CMV en el vector (secuencia 3).

Constructos de ribozima

Se clonó una ribozima de tipo cabeza de martillo (denominada Rz10) diseñada para seleccionar como diana una gran estructura de bucle abierto conservada en el ARN a partir de las regiones codificantes del gen después de la síntesis e hibridación en los sitios HindIII y XbaI de pCDNA3, permitiendo de nuevo la expresión de ARN a partir del promotor de T7 o CMV en el vector (secuencia 4). El sitio diana era GUC (la regla de GUX) en la posición 475-477 de la secuencia de rodopsina humana. Se clonó una ribozima de tipo cabeza de martillo (denominada Rz20) diseñada para seleccionar como diana una estructura de bucle abierto en el ARN a partir de la región codificante de un gen de rodopsina mutante con una mutación Pro23Leu después de la síntesis e hibridación en los sitios HindIII y XbaI de pCDNA3, permitiendo de nuevo la expresión de ARN a partir del promotor de T7 o CMV en el vector (secuencia 5). El sitio diana era CTC (la regla de NUX) en el codón 23 de la secuencia de rodopsina humana (número de registro: K02281). Están subrayados los flancos antisentido.

Rz10: GGACGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGTAGAG

Rz20: TACTCGAACTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGGCTGC

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Rodopsina de ratón ADNc molde

Se clonó el ADNc de rodopsina de ratón en los sitios EcoRI del SCM de pCDNA3 en una orientación de 5' a 3' lo que permitía la posterior expresión del ARN a partir del promotor de T7 o CMV en el vector (secuencia 6).

ADNc con secuencia alterada en una posición de titubeo

Se introdujo el ADNc híbrido de rodopsina de ratón con una alteración de una sola base, un cambio T- ->C (en la posición 1460) en el ADNc de rodopsina de ratón, usando un casete de PCR de HindIII a Eco47III, mediante mutagénesis por PCR dirigida por cebador. Este cambio de secuencia se produce en una posición silenciosa (no da lugar a una sustitución de aminoácido), sin embargo elimina el sitio de escisión de ribozima (TTT- ->TCT). Se clonó la rodopsina híbrida en pCDNA3 en una orientación de 5' a 3' lo que permitía la posterior expresión del ARN a partir del promotor de T7 o CMV en el vector (secuencia 7).

Constructos de ribozima

Se clonó una ribozima de tipo cabeza de martillo (denominada Rz33) diseñada para seleccionar como diana una gran estructura de bucle abierto resistente en el ARN a partir de las regiones codificantes del gen después de la síntesis e hibridación en los sitios HindIII y XbaI de pCDNA3, permitiendo de nuevo la expresión del ARN a partir del promotor de T7 o CMV en el vector (secuencia 8). El sitio diana era TTT (la regla NUX) en la posición 1459-1461 de la secuencia de rodopsina de ratón. (Número de registro: M55171). Están subrayados los flancos antisentido.

Rz33: GGCACATCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAAAATTGG

Periferina humana ADNc molde

Se clonó el ADNc de periferina humana de longitud completa en los sitios EcoRI del SCM de pCDNA3 en una orientación de 5' a 3' lo que permitía la posterior expresión del ARN a partir del promotor de T7 o CMV en el vector (secuencia 9).

ADN con secuencia alterada en una posición de titubeo

Se introdujo un ADN híbrido de periferina humana con una alteración de una sola base, un cambio A- ->G (en la posición 257) en ADN de periferina humana mediante mutagénesis por PCR dirigida por cebador (cebador directo para la mutación 257 (5'CATGGCGCTGCTGAAAGTCA3'), el cebador inverso para 257 era complementario al cebador directo). Este cambio de secuencia se produce en una posición silenciosa (no da lugar a una sustitución de aminoácido) sin embargo elimina el sitio de escisión de ribozima (CTA- ->CTG) (secuencia 10). Se introdujo un segundo ADN híbrido de periferina humana con una alteración de una sola base, un cambio A- ->G (en la posición 359) en el ADN de periferina humana, de nuevo mediante mutagénesis por PCR dirigida por cebador (cebador directo para la mutación 359 (5'CATCTTCAGCCTGGGACTGT3'), el cebador inverso para 359 era complementario al cebador directo) (secuencia 11). De manera similar, este cambio de secuencia se produce en una posición silenciosa (no da lugar a una sustitución de aminoácido), sin embargo elimina de nuevo el sitio de escisión de ribozima (CTA- ->CTG). Los sitios de escisión de ribozima en 255-257 y 357-359 se producen en diferentes estructuras de bucle abierto tal como se predice mediante el programa ARNPlotFold. Los ADN de periferina híbrida incluían la secuencia del promotor de T7 lo que permitía la posterior expresión del ARN.

Constructos de ribozima

Se clonaron ribozimas de tipo cabeza de martillo (denominadas Rz30 y Rz31), diseñadas para seleccionar como diana estructuras de bucle abierto resistentes en el ARN a partir de regiones codificantes del gen, después de la síntesis e hibridación en los sitios HindIII y XbaI de pCDNA3, permitiendo de nuevo la expresión de ARN a partir del promotor de T7 o CMV en el vector (secuencias 12 + 13). Los dos sitios diana eran CTA (la regla de NUX) en las posiciones 255-257 y 357-359 respectivamente de la secuencia de periferina humana. (Número de registro: M73531). Están subrayados los flancos antisentido.

Rz30: ACTTTCAGCTGTGAGTCCGTGAGGACGAAAGCGCCA

Rz31: ACAGTCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGGCTGAA

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Colágeno de tipo I humano - COL1A2 ADNc molde

Se obtuvo un ADNc de colágeno de tipo I 1A2 humano a partir del ATCC (número de registro: Y00724). Anteriormente se ha encontrado un polimorfismo que se produce de forma natural en el colágeno 1A2 en las posiciones 907 del gen que implica un cambio de nucleótido T- ->A (Filie et al. 1993). El polimorfismo se produce en una estructura de bucle abierto predicha de ARN de colágeno 1A2 humano. Se generaron variantes polimórficas de colágeno 1A2 humano mediante mutagénesis dirigida por PCR, usando un casete de PCR de HindIII a XbaI. Los clones resultantes contenían el siguiente polimorfismo: colágeno 1A2 (A) tiene un nucleótido A en la posición 907 (secuencia 14). Por el contrario, el colágeno 1A2 humano (B) tiene un nucleótido T en la posición 907 (secuencia 15). En el colágeno 1A2 (B) existe un sitio diana de ribozima, que es un sitio GTC (906-908), sin embargo este sitio de escisión se pierde en el colágeno 1A2 (A) ya que la secuencia se altera para dar GAC (906-908), perturbando así el sitio diana de ribozima.

Constructos de ribozima

Se diseñó una ribozima de tipo cabeza de martillo (denominada Rz907) para seleccionar como diana una estructura de bucle abierto predicha en el ARN a partir de la región codificante de la variante polimórfica del gen de colágeno 1A2 humano. Se sintetizaron cebadores de oligonucleótidos de Rz907, se hibridaron y clonaron en los sitios HindIII y XbaI de pCDNA3, lo que permitía de nuevo la posterior expresión del ARN a partir del promotor de T7 o CMV en el vector (secuencia 16). El sitio diana era un sitio GUX en la posición 906-908 de la secuencia de colágeno de tipo I 1A2 humano (número de registro: Y00724). Están subrayados los flancos antisentido.

Rz907: CGGCGGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACCAGCA

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Leyendas de las figuras

Diagrama 1

Se cortó pBR322 con MspI, se marcó de manera radiactiva y se hizo correr sobre un gen de poliacrilamida para permitir la separación de los fragmentos de ADN resultantes. Los tamaños de estos fragmentos se facilitan en el diagrama 1. Luego se usó este marcador de tamaño molecular del ADN sobre posteriores geles de poliacrilamida (4-8%) para proporcionar una estimación del tamaño de los productos de ARN que se hicieron correr sobre los geles. Sin embargo existe una diferencia significativa en la movilidad entre ADN y ARN dependiendo del porcentaje de poliacrilamida y las condiciones de desplazamiento en el gel, (por tanto, el marcador proporciona una estimación del tamaño de los transcritos).

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Figura 1

A: Se expresó ADNc de rodopsina humana a partir del promotor de T7 hasta el sitio BstEII de la secuencia codificante. Se mezcló el ARN resultante con ARN de Rz10 en cloruro de magnesio 15 mM y se incubó a 37ºC durante tiempos variables. Carriles 1-4: ARN de rodopsina humana y ARN de Rz10 tras incubación a 37ºC con cloruro de magnesio 15 mM durante 0, 1, 2 y 3 horas, respectivamente. Los tamaños de los productos de escisión y los ARN expresados son tal como se espera (tabla 1). Se obtuvo la escisión completa del ARN de rodopsina humana con una pequeña cantidad residual de ARN intacto presente en 1 hora. El carril 6 es ARN de rodopsina humana no adaptado intacto (BstEII) solo. El carril 5 es ARN de rodopsina humana no adaptado (FspI) solo y se refiere a la figura 1B. De arriba a abajo, se señala con flechas el ARN de rodopsina humana y los dos productos de escisión de
este ARN.

B: Se expresó el ADNc de rodopsina humana no adaptado a partir del promotor de T7 hasta el sitio FspI de la secuencia codificante. Se expresó el ADNc de rodopsina humana adaptado a partir del promotor de T7 hasta el sitio BstEII de la secuencia codificante. Carriles 1-4: se mezclaron los ARN resultantes junto con Rz10 y cloruro de magnesio 15 mM y se incubaron a 37ºC durante tiempos variables (0, 1, 2 y 3 horas respectivamente). Se escindieron los transcritos de rodopsina no adaptados más pequeños mediante Rz10, mientras que los transcritos adaptados más grandes estaban protegidos de la escisión mediante Rz10. La escisión de los transcritos protegidos adaptados habrá dado como resultado productos de 564 bases y 287 bases, (el producto de 564 bases claramente no está presente), el producto de 287 pb se genera también mediante la escisión de los transcritos de rodopsina humana no adaptados y, por tanto, está presente (FspI). Tras 3 horas, se ha escindido mediante Rz10 la mayoría de los transcritos de rodopsina no adaptados. El carril 5 contiene el ARN adaptado intacto de rodopsina humana (BstEII) solo. De arriba a abajo, se señala con flechas los transcritos de rodopsina humana no escindidos adaptados, los transcritos de rodopsina humana no escindidos no adaptados residuales y los productos de escisión más grandes de los transcritos de rodopsina humana no adaptados. El producto de escisión de 22 bases más pequeño de los transcritos de rodopsina humana no adaptados se ha salido del gel.

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Figura 2

A: Se expresaron ADNc adaptado y no adaptado de rodopsina humana a partir del promotor de T7 hasta el sitio AcyI tras la secuencia codificante y el sitio BstEII de la secuencia codificante, respectivamente. Los tamaños de los productos de escisión y los ARN expresados fueron tal como se predijeron (tabla 1). Se mezclaron los ARN resultantes junto con ARN de Rz10 a concentraciones variables de cloruro de magnesio y se incubaron a 37ºC durante 3 horas. Carril 1: ARN de rodopsina humana no adaptado intacto (AcyI) solo. Carriles 2-5: ARN de rodopsina humana adaptado y no adaptado y ARN de Rz10 tras incubación a 37ºC con MgCl_{2} 0, 5, 10 y 15 mM, respectivamente. Se obtuvo la escisión casi completa del ARN de rodopsina humana no adaptado más grande con una pequeña cantidad residual de ARN intacto presente a MgCl_{2} 5 mM. Por el contrario, el ARN de rodopsina humana adaptado permaneció intacto. De arriba a abajo, se señala con flechas los ARN de rodopsina adaptado y no adaptado, y los dos productos de escisión del ARN de rodopsina humana no adaptado. El carril 6 es ARN adaptado intacto de rodopsina humana (BstEII) solo.

B: Se expresó el ADNc de rodopsina humana adaptado a partir del promotor de T7 hasta el sitio BstEII de la secuencia codificante. Carriles 1-4: se mezcló el ARN resultante junto con Rz10 y cloruro de magnesio 0, 5, 10 y 15 mM, y se incubó a 37ºC durante 3 horas, respectivamente. Los transcritos de rodopsina adaptados no se escindieron mediante Rz10. La escisión de los transcritos adaptados habrá dado como resultado productos de escisión de 564 bases y 287 bases que claramente no están presentes. Carril 5: ARN de rodopsina humana adaptado intacto (BstEII) solo. Carril 4: El ARN está ausente, debido a degradación o un error de carga. Está señalado con una flecha el ARN de rodopsina humana no escindido adaptado.

C: Se expresaron los ADNc de rodopsina humana adaptado y no adaptado a partir del promotor de T7 hasta el sitio AcyI tras la secuencia codificante y el sitio BstEII de la secuencia codificante, respectivamente. Los tamaños de los productos de escisión y los ARN expresados fueron tal como se predijeron (tabla 1). Se mezclaron los ARN resultantes junto con ARN de Rz10 a concentraciones variables de cloruro de magnesio y se incubaron a 37ºC durante 3 horas. Carril 1: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. Carriles 2-5: ARN de rodopsina humana adaptado y no adaptado y ARN de Rz10 tras incubación a 37ºC con MgCl_{2} 0, 5, 10 y 15 mM, respectivamente. Se obtuvo la escisión casi completa del ARN de rodopsina humana no adaptado más grande con una pequeña cantidad residual de ARN intacto presente a MgCl_{2} 5 y 10 mM. Por el contrario, el ARN de rodopsina humana adaptado permaneció intacto. Carril 6: ARN de rodopsina humana adaptado (BstEII) solo. Carril 7: ARN de rodopsina humana no adaptado (AcyI) solo. Carril 8: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. De arriba a abajo, se señala con flechas los ARN de rodopsina adaptado y no adaptado, y dos productos de escisión del ARN de rodopsina humana no adaptado. La separación del ARN de rodopsina humana adaptado (851 bases) y los productos de escisión más grandes del ARN no adaptado (896 bases) es incompleta en este gel (se requeriría hacer correr el gel adicionalmente para conseguir la separación), sin embargo, la separación de estos dos ARN se muestran en la
figura 2A.

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Figura 3

Se expresó el ADNc de rodopsina humana mutante (Pro23Leu) a partir del promotor de T7 hasta el BstEII en la secuencia codificante. Asimismo, se expresó el clon de Rz20 hasta el sitio XbaI. Se mezclaron los ARN resultantes junto con concentraciones de cloruro de magnesio 10 mM a 37ºC durante tiempos variables. Los tamaños de los productos de escisión y los ARN expresados fueron tal como se predijeron (tabla 1). Carril 1: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. Carriles 2: ARN de rodopsina humana de Pro23Leu solo. Carriles 3-7: ARN de rodopsina humana de Pro23Leu y ARN de Rz20 tras incubación a 37ºC con MgCl_{2} 10 mM durante 0 min, 30 min, 1 h, 2 h y 5 h, respectivamente. Se obtuvo la escisión casi completa de los transcritos de rodopsina mutantes quedando una cantidad residual de ARN intacto incluso tras 5 horas. Carril 8: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. De arriba a abajo, se señala con flechas el ARN de rodopsina mutante intacto y los dos productos de escisión del ARN de rodopsina humana mutante.

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Figura 4

Se expresó el ADNc de rodopsina humana mutante (Pro23Leu) a partir del promotor de T7 hasta el BstEII de la secuencia codificante. Asimismo, se expresó el clon de Rz10 hasta el sitio XbaI. Se mezclaron los ARN resultantes junto con concentraciones de cloruro de magnesio 10 mM a 37ºC durante tiempos variables. Los tamaños de los productos de escisión y los ARN expresados fueron tal como se predijeron (tabla 1). Carril 1: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. Carriles 2: ARN de rodopsina humana de Pro23Leu solo. Carriles 3-7: ARN de rodopsina humana de Pro23Leu y ARN de Rz10 tras incubación a 37ºC con MgCl_{2} 10 mM durante 0 min., 30 min., 1 h, 2 h y 5 h respectivamente. Se obtuvo la escisión casi completa del ARN de rodopsina humana mutante con una cantidad residual de ARN intacto que permanecía incluso tras 5 horas (carril 7). Carril 8: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. De arriba a abajo, se señala con flechas el ARN de rodopsina mutante intacto y los dos productos de escisión del ARN de rodopsina humana mutante.

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Figura 5

Se expresó el clon de ADNc de rodopsina de ratón in vitro a partir del promotor de T7 hasta el sitio Eco47III de la secuencia codificante. Asimismo, se expresó el clon de Rz33 hasta el sitio XbaI. A: Se mezclaron los ARN resultantes junto con cloruro de magnesio 10 mM a 37ºC durante tiempos variables. Los tamaños de los productos de escisión y los ARN expresados fueron tal como se predijeron (tabla 1). Marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. Carril 1: ARN de rodopsina de ratón solo. Carriles 2-5: ARN de rodopsina de ratón y ARN de Rz33 tras incubación a 37ºC con MgCl_{2} 10 mM a MgCl_{2} 0, 5, 7,5 y 10 mM, respectivamente, durante 3 horas. Se obtuvo la escisión de ARN de rodopsina de ratón tras la adición de iones divalentes (carril 3). Se señala con flechas el ARN de rodopsina de ratón no escindido residual y los dos productos de escisión del ARN de rodopsina de ratón. B: se expresó el clon de ADNc de rodopsina de ratón adaptado con un cambio de base en la posición 1460 in vitro a partir del promotor de T7 hasta el sitio Eco47III de la secuencia codificante. Asimismo, se expresó el clon de Rz33 hasta el sitio XbaI. Se mezclaron los ARN resultantes junto con diversas concentraciones de cloruro de magnesio a 37ºC durante 3 horas. Los tamaños de los productos de escisión y los ARN expresados fueron tal como se predijeron (tabla 1). Carril 1: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. Carril 2: ARN de rodopsina de ratón adaptado solo. Carriles 3-6: ARN de rodopsina de ratón adaptado y ARN de Rz33 tras incubación a 37ºC con MgCl 0, 5, 7,5 y 10 mM durante 3 horas a 37ºC. No se observó escisión del ARN de rodopsina de ratón adaptado. Se señala con una flecha el ARN de rodopsina de ratón adaptado intacto.

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Figura 6

Se expresó el clon de ADNc de periferina humana in vitro a partir del promotor de T7 hasta el sitio BgIII de la secuencia codificante. Asimismo, se expresó Rz30 (seleccionando como diana un sitio de escisión en 255-257) hasta el sitio XbaI. A: se mezclaron los ARN resultantes junto con cloruro de magnesio 10 mM a 37ºC durante tiempos variables. Carril 1: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. Carril 2: ARN de periferina humana intacto solo. Carriles 3-7: ARN de periferina humana y ARN de Rz30 tras incubación a 37ºC con MgCl 10 mM durante 3 h, 2 h, 1 h, 30 min y 0 min, respectivamente. Carril 8: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. De arriba a abajo, se señala con flechas el ARN de periferina humana intacto y los dos productos de escisión del ARN de periferina humana. B: se mezclaron los ARN resultantes con ARN de Rz30 a concentraciones variables de cloruro de magnesio y se incubaron a 37ºC durante 3 h. Carril 1: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. Carriles 2-5: ARN de periferina humana y Rz30 tras incubación a 37ºC con cloruro de magnesio 10, 7,5, 5 y 0 mM, respectivamente, durante 3 h. Carril 6: ARN de periferina humana intacto solo. Los tamaños de los productos de escisión y los ARN expresados son tal como se esperaban (tabla 1). Se obtuvo una escisión significativa del ARN de periferina humana con una cantidad residual de ARN intacto presente a cada concentración de MgCl_{2}. De arriba a abajo, se señala con flechas el ARN de periferina humana y los dos productos de escisión de este ARN. C: se expresó el ADN de periferina humana adaptado con un cambio de una sola base en la posición 257 a partir del promotor de T7 hasta el sitio AvrII de la secuencia codificante. Se mezcló el ARN resultante con Rz30 a diversas concentraciones de cloruro de magnesio y se incubó a 37ºC durante 3 h. Carril 1: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. Carril 2: ARN de periferina humana adaptado intacto solo. Carriles 3-6: ARN de periferina humana adaptado y Rz30 tras incubación a 37ºC con cloruro de magnesio 0, 5, 7,5 y 10 mM, respectivamente, durante 3 h. Carril 7: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. D: se expresaron el ADNc de periferina humana no adaptado y el fragmento de ADN de periferina humana adaptado con un cambio de una sola base en la posición 257 a partir del promotor de T7 hasta los sitios BgIII y AvrII, respectivamente, de la secuencia codificante. Se mezclaron los ARN resultantes con Rz30 a diversas concentraciones de cloruro de magnesio y se incubaron a 37ºC durante 3 h. Carril 1: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. Carril 2: ARN de periferina humana no adaptado intacto solo. Carril 3: ARN de periferina humana adaptado intacto solo. Carriles 4-7: ARN de periferina humana adaptado y no adaptado y Rz30 tras incubación a 37ºC con cloruro de magnesio 0, 5, 7,5 y 10 mM, respectivamente, durante 3 h a 37ºC. No se observó escisión del ARN de periferina humana adaptado incluso tras 3 horas, mientras que se observó una reducción significativa en el ARN no adaptado durante el mismo margen de tiempo. Carril 8: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. De arriba a abajo, se señala con flechas el ARN de periferina humana no adaptado residual, el ARN de periferina humana adaptado y los dos productos de escisión.

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Figura 7

Se expresó el clon de ADNc de periferina humana in vitro a partir del promotor de T7 hasta el sitio BgIII en la secuencia codificante. Asimismo, se expresó la Rz31 (seleccionando como diana un sitio de escisión en 357-359) hasta el sitio XbaI. A: se mezclaron los ARN resultantes junto con cloruro de magnesio 10 mM a 37ºC durante tiempos variables. Carril 1: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. Carriles 2-6: ARN de periferina humana y ARN de Rz31 tras incubación a 37ºC con MgCl 10 mM durante 3 h, 2 h, 1 h, 30 min y 0 min, respectivamente. Se obtuvo una escisión aumentada del ARN de rodopsina de ratón a lo largo del tiempo, sin embargo permaneció ARN intacto residual significativo incluso tras 3 horas (carril 2). Carril 7: ARN de periferina humana intacto solo. Carril 8: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. De arriba a abajo, se señala con flechas el ARN de periferina humana intacto y los dos productos de escisión del ARN de periferina humana. B: Se mezclaron los ARN resultantes con ARN de Rz31 a concentraciones variables de cloruro de magnesio y se incubaron a 37ºC durante 3 h. Carril 1: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. Carriles 2-5: ARN de periferina humana y Rz31 tras incubación a 37ºC con cloruro de magnesio 10, 7, 5, 5 y 0 mM, respectivamente, durante 3 h. Los tamaños de los productos de escisión y los ARN expresados son tal como se esperaban (tabla 1). Se obtuvo una escisión significativa del ARN de periferina humana con una cantidad residual de ARN intacto presente a cada concentración de MgCl_{2} (carriles 2-4). Carril 6: ARN de periferina humana intacto solo. Carril 7: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. De arriba a abajo, se señala con flechas el ARN de periferina humana y los dos productos de escisión de este ARN. C: se expresó el ADN de periferina humana adaptado con un cambio de una sola base en la posición 359 a partir del promotor de T7 hasta el sitio BglII de la secuencia codificante. Se mezcló el ARN resultante con Rz31 a diversas concentraciones de cloruro de magnesio y se incubó a 37ºC durante tres horas. Carril 1: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. Carril 2: ARN de periferina humana adaptado intacto solo. Carriles 3-6: ARN de periferina humana adaptado y RZ31 tras incubación a 37ºC con cloruro de magnesio 0, 5, 7,5 y 10 mM, respectivamente, durante tres horas. No se observó escisión del ARN de periferina humana adaptado incluso tras 3 horas.

Carril 7: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1.

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Figura 8

A: Se expresaron los clones de ADNc de colágeno 1A2 humano que contienen los alelos A y T del polimorfismo en la posición 907 a partir del promotor de T7 hasta los sitios MvnI y XbaI en el inserto y del vector, respectivamente. Se mezclaron los ARN resultantes junto con Rz907 y diversas concentraciones de MgCl_{2} y se incubaron a 37ºC durante 3 horas. Carril 1: ARN intacto del colágeno 1A2 humano (A) que contiene el alelo A del polimorfismo de 907. Carril 2: ARN intacto del colágeno 1A2 humano (B) que contiene el alelo T del polimorfismo de 907. Carriles 3-5: colágeno 1A2 humano (A) y (B) que representan los ARN del alelo A y T y Rz907 incubados con MgCl_{2} 0, 5, y 10 mM a 37ºC durante 3 horas. Se escinden transcritos de ARN del alelo T que contiene el sitio diana 906-908 mediante Rz907 tras la adición de iones divalentes; se obtiene la escisión casi completa con una cantidad residual de transcrito del alelo T restante (carril 5). Por el contrario, no se escindieron transcritos expresados a partir del alelo A (que son de tamaño más pequeño para distinguir entre los alelos A (MvnI) y T (XbaI)) mediante Rz907 (no se observaron productos de escisión). De arriba a abajo, se señala con flechas el ARN del alelo T, el alelo A y los dos productos de escisión del alelo T. Carril 6: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1.

B: se expresaron los clones de ADNc de colágeno 1A2 humano (A) + (B) que contenían los alelos A y T del polimorfismo en 907 a partir del promotor de T7 hasta los sitios MvnI y XbaI del inserto y del vector, respectivamente. Se mezclaron los ARN resultantes junto con Rz907 y cloruro de magnesio 10 mM y se incubaron a 37ºC durante tiempos variables. Carril 1: marcador de tamaño molecular de ADN tal como en el diagrama 1. Carril 2: ARN intacto del colágeno 1A2 humano (A) con el alelo A del polimorfismo de 907. Carril 3: ARN intacto del colágeno 1A2 humano (B) con el alelo T del polimorfismo 907. Carriles 4-9: ARN del alelo T y colágeno 1A2 humano y Rz907 incubado con MgCl_{2} 10 mM a 37ºC durante 0, 30 min, 1 hora, 2 horas, 3 horas y 5 horas, respectivamente. Se escinden los transcritos de ARN del alelo T que contiene el sitio diana de 906-908 mediante Rz907 (se obtiene la escisión casi completa tras 5 horas). Por el contrario, no se escindieron los transcritos expresados a partir del alelo A (que eran de tamaño más pequeño para distinguir entre los alelos A (MvnI) y T (XbaI)) mediante Rz907 (no se observaron productos de escisión). De arriba a abajo, se señala con flechas el ARN del alelo T, el alelo A y los dos productos de escisión del alelo T.

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Secuencias

Secuencia 1

El ADNc de rodopsina humana en pCDNA3.

Secuencia 2

El ADNc de rodopsina humana en pCDNA3 con un cambio de base en un sitio silencioso (477).

Secuencia 3

ADNc de rodopsina humana mutante (Pro23Leu) en pCDNA3.

Secuencia 4

Rz10 clonada en pCDNA3. Obsérvese que hay un apareamiento erróneo de bases en una hebra antisentido de Rz10.

Secuencia 5

Rz20 clonada en pCDNA3.

Secuencia 6

El ADNc de rodopsina de ratón en pCDNA3.

Secuencia 7

El ADNc de rodopsina de ratón en pCDNA3 con un cambio de base en un sitio silencioso (1460).

Secuencia 8

Rz33 clonada en pCDNA3.

Secuencia 9

El ADNc de periferina humana en pCDNA3.

Secuencia 10

El fragmento de ADN de periferina humana con un cambio de base en un sitio silencioso (257).

Secuencia 11

El fragmento de ADN de periferina humana con un cambio de base en un sitio silencioso (359).

Secuencia 12

Rz30 clonada en pCDNA3.

Secuencia 13

Rz31 clonada en pCDNA3.

Secuencia 14

Secuencia de colágeno 1A2 (A) que contiene el polimorfismo A en la posición 907. (Obsérvese que hay un sitio polimórfico adicional en la posición 902).

Secuencia 15

Secuencia de colágeno 1A2 (B) que contiene el polimorfismo T en la posición 907. (Obsérvese que hay un sitio polimórfico adicional en la posición 902).

Secuencia 16

Rz907 clonada en pCDNA3.

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Nota:

La calidad de la secuencia no fue buena en la región del cambio silencioso en 359 de periferina humana, el cebador de secuenciación estaba demasiado lejos del sitio diana como para conseguir una secuencia de buena calidad (secuencia 11).

Resultados

Se expresaron in vitro clones de ADNc de rodopsina humana y de ratón, periferina humana y colágeno 1A2 humano. También se expresaron in vitro ribozimas que seleccionan como diana sitios específicos en los ADNc de rodopsina humana y de ratón, periferina humana y colágeno 1A2 humano. Se cortaron clones de ADNc con diversas enzimas de restricción dando como resultado la producción de transcritos de diferentes tamaños tras la expresión. Esto ayudó en la diferenciación entre los ARN expresados a partir de ADNc adaptados y no adaptados. En la tabla 1 más adelante se facilitan las enzimas de restricción usadas para cortar cada clon, los tamaños de los transcritos resultantes y los tamaños predichos de los productos tras la escisión mediante ribozimas diana. Los tamaños exactos de los productos de expresión pueden variar en una pocas bases con respecto a los estimados, ya que puede haber alguna ambigüedad en cuanto a, entre otros, la base específica en la que comienza la transcripción.

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Ejemplo 1 A: Rodopsina humana

Se cortaron el ADNc de rodopsina humana no adaptado y el ADNc de rodopsina humana con una sustitución de un solo nucleótido en la secuencia codificante con BstEII y se expresaron in vitro. Se produce el cambio de una sola base en la posición de la tercera base o la posición de titubeo del codón (en la posición 477) y por tanto, no altera el aminoácido codificado por este triplete. Se cortó el clon de Rz10 con XbaI y se expresó in vitro. Se mezclaron los ARN de rodopsina humana y ribozima resultantes con concentraciones variables de MgCl_{2} para optimizar la escisión del ARN de molde mediante Rz10. En la figura 1A se facilita un perfil de la escisión del ARN de rodopsina humana mediante Rz10 a lo largo del tiempo. En la figura 2B se facilita el perfil de curva de MgCl_{2} usado para probar si los transcritos de rodopsina humana adaptados podrían escindirse mediante Rz10. Se cortaron ADNc de rodopsina humana adaptado y no adaptado con FspI y BstEII, respectivamente, se expresaron y se mezclaron junto con ARN de Rz10 para determinar la escisión (figura 1B) a lo largo del tiempo. Asimismo, se cortaron ADNc de rodopsina humana adaptado y no adaptado con AcyI y BstEII, respectivamente, se expresaron ambos in vitro y se mezclaron los transcritos resultantes con ARN de Rz10 a concentraciones variables de MgCl_{2} para determinar la escisión (figura 2A, 2C). En todos los casos, los ARN expresados eran del tamaño predicho. De manera similar, en todos los casos se escindieron los transcritos no adaptados para dar productos del tamaño predicho. La escisión del ARN de rodopsina humana no adaptado fue casi completa (permaneció poco ARN no escindido residual). En todos los casos, los ARN de rodopsina humana adaptado con un cambio de una sola base en un sitio silencioso permanecieron intactos, es decir, no se escindieron mediante Rz10. Claramente, se escindieron los transcritos del ADNc de rodopsina humana no adaptado mediante Rz10, mientras que los transcritos del gen de sustitución adaptado que se ha modificado en una manera que se aprovecha la degeneración del código genético, están protegidos de la escisión. Cabe observar que la enzima AcyI corta tras el codón de terminación y, por tanto, el ARN resultante incluye la secuencia codificante completa del
gen.

B: Rodopsina humana

Se cortó Rz20 con XbaI y se expresó in vitro. De manera similar, se cortó el ADNc de rodopsina que contenía una mutación Pro23Leu con BstEII y se expresó in vitro. Se mezclaron los ARN resultantes y se incubaron a 37ºC con MgCl_{2} 10 mM durante tiempos variables. Se diseñó Rz20 para provocar la escisión específica de mutación de los transcritos que contenían una mutación de rodopsina Pro23Leu. Todos los productos expresados y los productos de escisión eran del tamaño correcto. La figura 3 muestra la escisión específica de mutación del ARN mutante a lo largo del tiempo incubado a 37ºC con MgCl_{2} 10 mM. Se estudió la escisión de los transcritos de rodopsina mutantes mediante Rz10 que selecciona como diana un sitio 3' de escisión de ribozima del sitio de la mutación Pro23Leu de la secuencia codificante de rodopsina. Se cortaron los clones de ADNc de rodopsina mutante y de Rz10 con BstEII y XbaI, respectivamente y se expresaron in vitro. Se mezclaron los ARN resultantes y se incubaron con MgCl_{2} 10 mM durante tiempos variables (figura 4). Todos los productos expresados y los productos de escisión eran del tamaño correcto. Rz10 escindió los transcritos de rodopsina mutante. Usando un gen de sustitución con un cambio de secuencia alrededor del sitio de escisión de Rz10 que está en una posición de titubeo, se demuestra en el ejemplo 1A que los transcritos del gen de sustitución permanecen intactos debido a la ausencia del sitio diana Rz10 (figuras 1B, 2A y 2B). Por tanto, podría usarse Rz10 para escindir transcritos mutantes de una manera independiente de la mutación patológica en sí (es decir, usando este sitio), mientras que los transcritos del gen de sustitución que codifican para la proteína correcta permanecerían intactos y por tanto, podrían administrar la proteína de tipo
natural.

Ejemplo 2 Rodopsina de ratón

Se cortó Rz33 con XbaI y se expresó in vitro. De manera similar, se cortó el ADNc de rodopsina de ratón con Eco47III y se expresó in vitro. Se mezclaron los ARN resultantes y se incubaron con concentraciones variables de MgCl_{2}. Todos los productos expresados y los productos de escisión eran del tamaño correcto. La figura 5A muestra la escisión específica del ARN de rodopsina de ratón con diversas concentraciones de MgCl_{2} incubado a 37ºC durante 3 horas. Usando un gen de sustitución con un cambio de secuencia alrededor del sitio de escisión de Rz33 (TTT- ->TCT) que está en una posición de titubeo, se demostró que los transcritos del gen de sustitución permanecen intactos debido a la ausencia del sitio diana Rz33 (figuras 5B). Por tanto, podría usarse Rz33 para escindir los transcritos mutantes de una manera independiente de la mutación patológica en sí (es decir, usando este sitio), mientras que los transcritos del gen de sustitución que codifican para la proteína correcta permanecerían intactos y por tanto, podrían administrar la proteína de tipo natural.

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Ejemplo 3 Periferina humana

Se cortaron el ADNc de periferina humana no adaptado y dos fragmentos de ADN de periferina humana generados mediante mutagénesis por PCR con una sustitución de un solo nucleótido en la secuencia codificante con BgIII y AvrII, respectivamente, y se expresaron in vitro. Los cambios de una sola base en los ADN adaptados se producen en las posiciones de la tercera base o posiciones de titubeo del codón (en la posición 257 y 359) y por tanto, no alteran el aminoácido codificado por estos tripletes. Se cortaron los clones de Rz30 y Rz31 con XbaI y se expresaron in vitro. Se mezclaron los ARN de rodopsina no adaptados y las ribozimas resultantes con concentraciones variables de MgCl_{2} para optimizar la escisión del ARN molde mediante Rz30 y Rz31. En la figura 6 se facilitan los perfiles de la escisión del ARN de periferina humana mediante Rz30 con diversas concentraciones de MgCl_{2} y a lo largo del tiempo. De manera similar, en la figura 7 se facilitan los perfiles de la escisión del ARN de periferina humana mediante Rz31 con diversas concentraciones de MgCl_{2} y a lo largo del tiempo. En todos los casos, los ARN expresados eran del tamaño predicho. De manera similar, en todos los casos se escindieron los transcritos no adaptados para dar productos del tamaño predicho. Se mezclaron los ARN de rodopsina humana adaptados junto con ARN de Rz30 y Rz31 con diversas concentraciones de MgCl_{2} para probar si podrían escindirse los transcritos de periferina humana adaptados mediante Rz30 y Rz31 (figuras 6 + 7). Los ARN expresados eran del tamaño predicho. En todos los casos, los ARN de periferina humana adaptados con cambios de una sola base en sitios silenciosos permanecieron intactos, es decir, no se escindieron mediante Rz30 o Rz31. Claramente, se escinden los transcritos del ADNc de periferina humana no adaptado mediante Rz30 y Rz31, mientras que los transcritos de los ADN de sustitución adaptados que se han modificado de una manera que realiza la degeneración del código genético están protegidos de la escisión.

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Ejemplo 4 Colágeno 1A2 humano

Se cortaron los clones de Rz907 que seleccionan como diana un sitio polimórfico en la secuencia de colágeno 1A2 humano con XbaI y se expresaron in vitro. Se cortaron los clones de ADNc de colágeno 1A2 humano (A y B) que contenían dos formas alélicas de un polimorfismo en la secuencia codificante del gen en las posiciones 907 con MvnI y XbaI, respectivamente, se expresaron in vitro y se mezclaron los ARN junto con ARN de Rz907 para someter a prueba la escisión de los transcritos mediante esta ribozima. Todos los transcritos expresados eran del tamaño predicho. Se mezclaron los ARN con concentraciones variables de MgCl_{2} para optimizar la escisión de los ARN mediante Rz907 (figura 8). Notablemente, se escinde la mayoría de los transcritos de ARN de colágeno 1A2 humano (B) que tiene un nucleótido T en la posición 907 mediante Rz907 (figura 8). Esta forma alélica del gen tiene un sitio de escisión de ribozima en 906-908. Notablemente, la situación se invierte con los transcritos del colágeno 1A2 humano (A), en los que en esta forma alélica del gen se ha perdido el sitio de escisión de ribozima debido a la naturaleza del polimorfismo presente en la posición 907. Al contrario de los transcritos de colágeno humano (B), se protegieron los transcritos de colágeno humano (A) de la escisión mediante Rz907 debido a la alteración en la secuencia alrededor del sitio de escisión de ribozima (figura 8). La escisión del colágeno 1A2 (B) mediante Rz907 fue eficaz, lo que concuerda con las predicciones de 2-D de las estructuras de bucle abierto de ARN para el polimorfismo (en el alelo que contiene el sitio de escisión de ribozima Rz907, se encuentra el sitio diana bastante constantemente en una estructura de bucle abierto). Este polimorfismo encontrado en una estructura de bucle abierto del transcrito demuestra claramente la viabilidad y utilidad de usar la degeneración del código genético en la supresión de un gen endógeno (o bien suprimiendo ambos alelos o bien un solo alelo en un sitio polimórfico) y el restablecimiento de la expresión génica usando un gen que codifica para la misma proteína pero que tiene modificaciones de secuencia en posiciones de titubeo de la tercera base que protegen al gen de sustitución de la supresión.

TABLA 1

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100

101

TABLA 2

102

104

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Discusión

En los ejemplos explicados anteriormente, se expresó ARN partir de los ADNc que codifican para cuatro proteínas diferentes: rodopsina humana y de ratón, periferina humana y colágeno de tipo I 1A2 humano. Se han usado rodopsina y periferina para ilustrar a modo de ejemplo la invención para retinopatías tales como adRP; los efectores de supresión se han dirigido a las secuencias codificantes de estos genes. En el caso del gen de colágeno 1A2 humano, se ha usado un polimorfismo que se produce de forma natural para demostrar la invención y uso potencial de la invención para trastornos tales como OI, sin embargo, podrían usarse regiones no polimórficas del gen de 1A2 para conseguir la supresión. Los efectores de supresión de elección en la invención han sido ribozimas de tipo cabeza de martillo con flancos antisentido para definir la especificidad de secuencia. Las ribozimas de tipo cabeza de martillo requieren sitios de escisión NUX en estructuras de bucle abierto de ARN. Notablemente, podrían utilizarse otros efectores de supresión en la invención y podrían conducir a una elección más flexible de las secuencias diana para la supresión. Los transcritos expresados a partir de los cuatro genes se han atacado significativamente in vitro usando efectores de supresión dirigidos hacia los sitios de escisión diana. En los cuatro ejemplos, las ribozimas dirigidas a los sitios de escisión tuvieron éxito para escindir los ARN diana de la manera predicha. Se usó con éxito el oligonucleótido antisentido complementario a las secuencias que rodeaban a los sitios de escisión para provocar la unión y escisión de los ARN diana de una manera específica de secuencia. Adicionalmente, se protegieron completamente de la escisión mediante ribozimas los transcritos de genes de sustitución, modificados usando la degeneración del código genético de modo que codifican para proteína de tipo natural.

La utilidad de una ribozima individual diseñada para seleccionar como diana un sitio NUX en una estructura de bucle abierto de transcritos a partir de un gen dependerá en parte de la naturaleza resistente de la estructura de bucle abierto del ARN cuando también están presentes diversas mutaciones deletéreas en el transcrito. Para evaluar esto, se analizaron los datos de ARNPlotFold para seis adRP diferentes que producían mutaciones en el gen de rodopsina. Para cada uno de éstos, se predijo que la gran estructura de bucle abierto de ARN, que se selecciona como diana por Rz10, se mantenía en los transcritos mutantes (tabla 2A). Esto se demuestra claramente en el ejemplo 1B (figura 3) usando una mutación de rodopsina Pro23Leu. Rz10 escinde claramente el transcrito mutante de manera eficaz in vitro. La mutación Pro23Leu crea un sitio de escisión de ribozima y puede escindirse in vitro mediante Rz20, una ribozima que selecciona como diana de manera específica este sitio, sin embargo éste no es el caso para muchas mutaciones. Por el contrario, se ha mostrado que el sitio de escisión de ribozima Rz10 está disponible para diferentes rodopsinas mutantes y podría usarse potencialmente para suprimir múltiples mutaciones usando un enfoque de supresión y sustitución.

En algunos casos, disminuir los niveles de ARN puede conducir a una disminución paralela de los niveles de proteína, sin embargo esto puede no ser siempre el caso. En algunas situaciones, los mecanismos pueden evitar una disminución significativa en los niveles de proteína a pesar de una disminución sustancial en los niveles de ARN. Sin embargo, en algunos casos, se ha demostrado que la supresión a nivel del ARN es eficaz (véase la técnica anterior). En algunos casos, se cree que las ribozimas provocan la supresión no sólo mediante escisión del ARN sino también mediante un efecto antisentido debido a las hebras antisentido de la ribozima que rodean al núcleo catalítico.

En todos los ejemplos, las ribozimas proporcionadas se diseñaron para escindir en sitios diana específicos. Se seleccionaron los sitios diana para cuatro de las ribozimas utilizadas en estructuras de bucle abierto de las regiones codificantes de los transcritos de los tres genes retinianos (rodopsina humana y de ratón y periferina humana). En todos los casos, se obtuvo la escisión específica de secuencia en los sitios de escisión diana (figuras 1-7). Se seleccionaron los sitios diana en estructuras de bucle abierto para optimizar la escisión. Adicionalmente, se seleccionaron sitios diana de modo que pudieran eliminarse mediante cambios de un solo nucleótido en posiciones de titubeo de la tercera base y, por tanto, que codificaran para el mismo aminoácido (tabla 2B). A su vez, esto permitió la generación de genes de sustitución con alteraciones de un solo nucleótido que codifican para proteína de tipo natural. En todos los casos, se protegieron los transcritos sometidos a prueba de genes de sustitución de la escisión mediante ribozimas. Podrían hacerse modificaciones adicionales en los genes de sustitución en posiciones de titubeo, por ejemplo, para limitar la capacidad de unión de las hebras antisentido que flanquean el núcleo catalítico de la ribozima. Los ejemplos proporcionados para rodopsina y periferina implican la supresión de la expresión de los alelos tanto patológicos como de tipo natural de un gen retiniano y, el restablecimiento de la proteína de tipo natural usando un gen de sustitución. Sin embargo, puede haber muchas situaciones en las que pueden seleccionarse como diana alelos individuales de manera específica o de manera parcialmente específica (documento WO 97/32024).

En un ejemplo, con colágeno 1A2 humano, se usó Rz907 para seleccionar como diana un sitio polimórfico que se produce de forma natural en el aminoácido 187, (GGA (glicina) - -> GGT (glicina), situado en una estructura de bucle abierto de las conformaciones bidimensionales predichas (figura 8, tabla 2B). La ribozima Rz907 escindió transcritos que contenían la secuencia GGT, pero los transcritos con GGA estaban protegidos de la escisión. Podrían escindirse transcritos de ambos alelos de individuos homocigóticos para el polimorfismo GGT mediante Rz907, mientras que en el caso de la escisión de individuos heterocigóticos podría dirigirse a alelos individuales (en particular a alelos que contienen mutaciones deletéreas (documento WO 97/32024). En ambas situaciones, los genes de sustitución podrían tener la secuencia GGA y por tanto, podrían protegerse de la escisión mediante Rz907. La presencia de muchos de tales polimorfismos silenciosos que se producen de forma natural señala que los genes de sustitución podrían modificarse de manera similar en posiciones de titubeo y deberían producir la mayoría de los casos proteína de tipo natural funcional. Podrían realizarse múltiples modificaciones en genes de sustitución en posiciones de titubeo, lo que aumentarían la protección frente a los efectores de supresión. Por ejemplo, en situaciones en las que se usaron ácidos nucleicos antisentido para la supresión, los transcritos de genes de sustitución con múltiples alteraciones se protegerían parcial o completamente de la unión antisentido.

En los cuatro ejemplos proporcionados, se escindieron los transcritos de clones de ADNc in vitro de una manera específica de secuencia en sitios de escisión de ribozima. Adicionalmente, se produce una base del sitio de escisión de ribozima en una posición de titubeo y además puede alterarse de modo que se elimina el sitio de escisión. En los ejemplos dados, los sitios de escisión de ribozima se destruyeron cambiando secuencias de nucleótidos de modo que se rompió la secuencia de consenso para los sitios de escisión de la ribozima. Sin, embargo puede ser que en algunos casos pudiera destruirse el sitio de escisión alterando la secuencia de nucleótidos de una manera que alterara la estructura bidimensional del ARN y destruyera la estructura de bucle abierto seleccionada como diana por la ribozima. Se generaron ADNc o fragmentos de ADN con secuencias alteradas en las regiones seleccionadas como diana por las ribozimas. Se protegieron los ARN expresados a partir de estos ADNc o fragmentos de ADN completamente de la escisión debido a la ausencia del sitio de escisión de ribozima para cada una de las ribozimas sometidas a prueba. Es de particular interés el hecho de que una alteración de un solo nucleótido puede eliminar un sitio diana de ribozima, evitando así la escisión del ARN. Aunque se han usado ribozimas en la demostración de la invención, podrían usarse otros efectores de supresión para conseguir el silenciamiento de genes. De nuevo, podrían generarse genes de sustitución con las secuencias alteradas (en posiciones de titubeo de la tercera base) de modo que estén protegidos parcial
o completamente del silenciamiento de genes y proporcionen el producto génico de tipo natural (o beneficioso).

Tal como se señaló anteriormente en el texto, usando la invención puede usarse el mismo método de supresión (seleccionando como diana secuencias codificantes de un gen) y si es necesario la sustitución de genes (usando un gen de sustitución con una secuencia modificada en posiciones de tercera base para restablecer la expresión génica) como un enfoque terapéutico para muchas mutaciones diferentes dentro de un gen dado. Dado la dilucidación continua de la patogénesis molecular de enfermedades poligénicas y dominantes, está aumentando rápidamente el número de objetivos para esta invención.

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Zhuang J et al. (1996) Hum Mut 7: 89-99.

Claims (14)

1. Método in vitro para suprimir o suprimir parcialmente un gen endógeno asociado a una mutación patológica e introducir un gen de sustitución, comprendiendo dicho método las etapas de:

a)

proporcionar efector(es) de supresión que pueden silenciar o reducir la expresión de un gen endógeno, o transcrito(s) del gen que va a suprimirse, en el que dicho(s) efector(es) de supresión actúa(n) en un sitio independiente de la mutación patológica, en el que dicho sitio está en la secuencia codificante y en el que dicho(s) efector(es) de supresión puede(n) actuar tanto en alelos patológicos como normales; y

b)

proporcionar ácido(s) nucleico(s) de sustitución que proporciona(n) un gen de sustitución en el que el/los ácido(s) nucleico(s) de sustitución se han alterado en uno o más sitios de titubeo para evitar o reducir la eficacia de la supresión mediante dichos efectores de supresión de modo que puede expresarse dicho gen de sustitución.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el efector de supresión es una ribozima y el ácido nucleico de sustitución está alterado en uno o más sitios de titubeo de modo que el ácido nucleico de sustitución no contiene un sitio de escisión de ribozima.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el/los ácido(s) nucleico(s) de sustitución codifica(n) para la proteína rodopsina humana, rodopsina de ratón o periferina humana.

4. Uso de:

a.

efector(es) de supresión, pudiendo suprimir dicho(s) efector(es) de supresión la expresión de un gen endógeno diana asociado a una mutación patológica, o transcrito(s) del gen que va a suprimirse, en el que dicho(s) efector(es) de supresión actúa(n) en un sitio independiente de la mutación patológica y puede(n) actuar tanto en alelos patológicos como normales, en el que dicho sitio está en la secuencia codificante, y

b.

ácidos nucleicos de sustitución que proporcionan un gen de sustitución en el que los ácidos nucleicos de sustitución se han alterado en uno o más sitios de titubeo para evitar o reducir la eficacia de la supresión mediante dichos efectores de supresión de modo que puede expresarse dicho gen de sustitución,

en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autosómica dominante producida por el gen endógeno en el que la enfermedad se produce por diferentes mutaciones en el mismo gen.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que la enfermedad es una retinopatía.

6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en el que el/los ácido(s) nucleico(s) de sustitución codifica(n) para proteína rodopsina humana, rodopsina de ratón o periferina humana.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el efector de supresión es una ribozima y el gen endógeno está alterado en uno o más sitios de titubeo de modo que el gen de sustitución no contiene un sitio de escisión de ribozima.

8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que los efectores de supresión y/o ácidos nucleicos de sustitución se proporcionan en uno o más vector(es).

9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que los efectores de supresión y/o ácidos nucleicos de sustitución no se proporcionan en un vector.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que los efectores de supresión y/o ácidos nucleicos de sustitución se combinan con lípidos u otros derivados que ayudan a la administración del gen.

11. Kit para su uso en el tratamiento de una enfermedad poligénica o autosómica dominante producida por mutación/mutaciones en un gen endógeno diana, comprendiendo el kit

(i)

al menos un efector de supresión que puede suprimir la expresión del gen endógeno, en el que dicho efector de supresión actúa en un sitio independiente de la mutación patológica en el que dicho sitio está en la secuencia codificante y en el que dicho efector de supresión puede actuar tanto en alelos patológicos como normales; y

(ii)

ácidos nucleicos de sustitución, proporcionando dichos ácidos nucleicos de sustitución un gen de sustitución, en el que los ácidos nucleicos de sustitución se han alterado en uno o más sitios de titubeo para evitar o reducir la eficacia de la supresión mediante dichos efectores de supresión de modo que puede expresarse dicho gen de sustitución.

12. Kit según la reivindicación 11, en el que la enfermedad es una retinopatía.

13. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en el que el/los ácido(s) nucleico(s) de sustitución codifica(n) para proteína rodopsina humana, rodopsina de ratón o periferina humana.

14. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el efector de supresión es una ribozima y el gen endógeno está alterado en uno o más sitios de titubeo de modo que el gen de sustitución no contiene un sitio de escisión de ribozima.