ES2291253T3

ES2291253T3 - Procedimiento para la produccion de implantes de cartilago por medio de condrocitos cultivados in vitro.

Info

Publication number: ES2291253T3
Application number: ES01117785T
Authority: ES
Inventors: Brigitte Dr. Jeschke; Jorg Dr. Meyer; Peter Dr. Adamietz; Norbert Dr. Meenen; Christiane Gopfert
Original assignee: Biomet Deutschland GmbH
Current assignee: Biomet Deutschland GmbH
Priority date: 2000-08-29
Filing date: 2001-08-02
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2021-08-02
Also published as: ATE370227T1; DK1201749T3; PT1201749E; DE10042484A1; US6730314B2; CA2356024C; CA2356024A1; EP1201749A1; JP2002078484A; EP1201749B1; DE50112855D1; US20020052044A1; CY1107771T1

Abstract

Un procedimiento para la producción de un implante de cartílago humano a partir de condrocitos cultivados in vitro, caracterizado por las siguientes características: se aíslan condrocitos a partir de cartílagos del propio paciente de manera habitual mediante la adición de diferentes disoluciones enzimáticas; se siembran los condrocitos aislados en frascos de cultivo celular y se cultivan en un solución nutritiva, mezclada con suero humano y/o bovino y factores de crecimiento; se recogen los condrocitos purificados en una disolución tampón que contiene alginato, realizándose la encapsulación inmediata, posteriormente cultivando varias semanas a 34-39ºC bajo presión parcial de oxígeno reducida y aislando las células del alginato mediante la adición de disoluciones tampón de citrato; se centrifugan los condrocitos aislados, se cultivan algunos días con factores de crecimiento condrogénicos, suero humano y la solución nutritiva que contiene otros aditivos, se transfiere el agregado a una cavidad recubierta con agarosa de una placa y se cultivan las células agregadas en las mismas condiciones que en la fase de alginato, aunque a presión parcial de O 2 del 21%.

Description

Procedimiento para la producción de implantes de cartílago por medio de condrocitos cultivados in vitro.

La invención se refiere a un procedimiento para la producción de implantes de cartílago humanos a partir de condrocitos cultivados in vitro. El cartílago articular sufre de una capacidad muy limitada para la reparación de daños de la superficie articular. Un concepto sostenible para el tratamiento quirúrgico de daños de la superficie articular basándose en cartílago producido in vitro, implica entre otros lograr obtener implantes de cartílago a partir de células autólogas (condrocitos o células madre mesenquimatosas), que con respecto a su composición bioquímica y sus propiedades biomecánicas se acercan lo más posible al original. En principio son adecuados tanto los condrocitos como las células madre mesenquimatosas para este fin.

Dado que las células autólogas están a disposición sólo en un número reducido en forma de una biopsia, surge la necesidad de una expansión eficaz in vitro. Esto es un reto especial. Puesto que tal como se conoce a partir de la bibliografía, siempre se observa una pérdida progresiva con el número de pases del fenotipo diferenciado. Esto significa: mientras que en caso de la utilización de células primarias o de células del primer pase puede favorecerse la síntesis de cartílago ya mediante intensificación de los contactos célula-célula, este procedimiento falla cuando las células deben pasarse más a menudo con fines de proliferación. Tampoco se ha logrado hasta ahora en células humanas detectar la disminución del potencial condrogénico durante la fase de proliferación mediante aditivos distintos tales como determinados sueros o determinados factores del crecimiento tales como bFGF. Ya se conoce la proliferación de células de cartílago humanas en un frasco/placa de cultivo celular en presencia tanto de suero bovino como de suero humano (Gruber, R. et al Untersuchungen zur in-vitro-Kultivierung von Humanchondrozyten bei Einsatz von autologem Humanserum als Mediumzusatz: Minimierung des möglichen Risikos einer Infektion mit Erregern von Prionen-Erkrankungen Laryngo-Rhino-Otol. 1996 75: 105-108), desdiferenciándose las (células en este cultivo en monocapa), rediferenciando posteriormente las células en gel de alginato. Posteriormente se analizan las células y la matriz que las envuelve con procedimientos diferentes dentro del alginato o tras liberar las células del alginato (Bonaventure J. et al., Exp. Cell Res. 212 (1): 97-104 (1994) Reexpression of cartilage-specific genes by dedifferentiated human articular chondrocytes cultures in alginate; Yaeger P. C. et al. Exp. Cell Res. 237: 318-325 (1997) Synergistic Action of Transforming Growth Factor-\beta and Insulin-like Growth Factor-I induces Expression of Type II Collagen and Aggrecan Genes in adult human articular Chondrocytes).

Ya se ha estudiado la influencia de la presión parcial de oxígeno y la presión hidrostática durante el cultivo de alginato (Domm, C. et al., Die Redifferenzierung von dedifferenzierten Gelenkknorpelzellen in Alginatkultur, Orthopädie, 2000, 29: 911-99) del mismo modo que el significado de la adición de factores del crecimiento durante el proceso de rediferenciación (Möller, H.D. et al., TGF\beta-1-Gentransfer in Gelenkknorpelzellen, Orthopädie, 2000, 29: 75-79; Schulze, M. et al. Adulte humane Chondrozyten in Alginatkultur, Orthopädie, 2000, 29: 100-106).

Es ahora objetivo de la presente invención exponer un procedimiento para cultivar un tejido cartilaginoso (no células individuales) diferenciado en gran parte de tamaño suficiente, que evita los inconvenientes del estado de la técnica mencionados anteriormente, de modo que el tejido cartilaginoso puede implantarse con ajuste a presión ("press-fit", es decir, con asiento estable a la rotación) en defectos del cartílago articular.

Este objetivo se soluciona mediante un procedimiento para la producción de un implante de cartílago humano a partir de condrocitos cultivados in vitro con los rasgos caracterizadores expuestos en la reivindicación 1.

El procedimiento representando en la reivindicación 1 puede aplicarse no sólo a condrocitos humanos. También es adecuado para condrocitos de cerdo, tal como pudo mostrarse en un modelo animal. También es concebible una utilización con condrocitos de otras especies (por ejemplo camello, dromedario, caballo, perro, gato).

A este respecto, el procedimiento según la invención utiliza el procedimiento habitual, tal como ya se mencionó anteriormente, incluir condrocitos en un gel de alginato, para rediferenciarlos. Sin embargo son determinantes para el éxito las condiciones de cultivo modificadas, siendo esenciales el uso de un suero humano (en lugar de un suero bovino fetal) como adición al medio hasta el 20% en volumen, la adición de factores del crecimiento condrogénicos (IGF-I y TGF-\beta) y la reducción de la presión parcial de oxígeno hasta por debajo del 10% en volumen. Sólo estas condiciones, aplicadas durante un periodo de varias semanas, conducen a condrocitos, que pueden agregarse posteriormente para la propia formación de cartílago. Como alternativa puede usarse en lugar de IGF-I también IGF-II. Además, la adición de la citocina Interleucina 4 (IL-4) estimula la formación de cartílago.

En el caso de los condrocitos expandidos in vitro se describió hasta ahora la inclusión en gel de alginato como procedimiento, que es adecuado para determinar el potencial condrogénico básico (Yaeger P. C. et al. Exp. Cell Res. 237: 318-325 (1997) Synergistic Action of Transforming Growth Factor-\beta and Insulin-like Growth Factor-I induces Expression of Type II Collagen and Aggrecan Genes in adult human articular Chondrocytes). Sin embargo, en el caso del procedimiento según la invención este procedimiento (sin el uso del suero humano y la reducción de la presión parcial de oxígeno) no es adecuado para el uso preparativo. Las estructuras de tipo condrón resultantes (a continuación denominadas "condrones") que pueden obtenerse mediante la disolución cuidadosa del gel por formadores de quelato tales como el citrato, presentan un alto contenido en colágeno de tipo I y no muestran la propensión con la agregación, de formar un tejido cartilaginoso, cuando no se cumple una de las condiciones citadas esenciales de la invención.

El significado especial de la utilización de "condrones" para la formación de cartílago hialino con un contenido mínimo en colágeno de tipo I se ha determinado también en un modelo animal. Sólo cuando a los condrocitos del cerdo expandidos in vitro incluidos en gel de alginato durante 8 a 12 días se les da la oportunidad de formar una matriz extracelular de tipo condrón, se dan las condiciones para la formación posterior de cartílago hialino con un contenido mínimo en colágeno de tipo I. Mientras que la rediferenciación en condrocitos humanos requiere un cultivo de varias semanas en las condiciones mencionadas anteriormente, en el caso de los condrocitos del cerdo son suficientes de 8-12 días a presión parcial de oxígeno (21%) normal y la adición de factores del crecimiento condrogénicos, para formar cartílago hialino con un alto cociente de colágeno de tipo II/colágeno de tipo I.

Además se prefiere un procedimiento según la reivindicación 2, en el que los condrocitos aislados a partir del alginato tras la centrifugación sobre una superficie plana forman cartílago con forma plana. Los condrocitos se centrifugan en un tubito de centrífuga de base plana. A este respecto se forman más bien agregados de cartílago planos tal como se necesitan para la implantación. La forma plana de los implantes ofrece debido a los cortos trayectos de difusión además más bien una ventaja para la introducción/eliminación, durante el cultivo in vitro. Se prefiere además un procedimiento según la reivindicación 3, en el que como factores de crecimiento condrogénicos se añaden IGF-I y TGF-\beta en la proporción 5 - 10 : 1 (p : p). De la misma manera se prefiere la adición de 0,1 - 3 ng/ml de Interleucina 4 para la estimulación adicional de la condrogénesis.

Además se prefiere un procedimiento, en el que se reduce la presión parcial de oxígeno hasta por debajo del 10%. Se prefiere especialmente una presión parcial reducida del 5%. De la figura 1 que se encuentra en el anexo puede deducirse la importancia de la influencia de la presión parcial de oxígeno reducida sobre la proporción de colágeno de tipo I a colágeno de tipo II para la diferenciación de condrocitos humanos.

Se prefiere además un procedimiento, en el que se usa como adición al medio hasta el 20% en volumen de suero humano para la producción del cultivo de agregado. Se prefiere especialmente una adición al medio del 10% en volumen de suero humano.

Se prefiere también un procedimiento según la reivindicación 6, en el que pueden mantenerse los condrocitos de manera ventajosa hasta el pase 12º, con especial preferencia hasta el pase 7º, en cultivo en monocapa.

Se prefiere además un procedimiento según la reivindicación 8, en el que resulta un cociente alto de colágeno de tipo II/colágeno de tipo I. Un cociente alto de colágeno de tipo II/colágeno de tipo I es un indicio de que el colágeno de tipo I está presente preferiblemente en la capa externa fina tal como se desea. A partir de los análisis inmunológicos pueden derivarse afirmaciones cuantitativas precisas, sin embargo dependen del tamaño absoluto de las muestras. A partir del estado de la técnica se dan valores del 10-20% para la capa de superficie compuesta preferiblemente por colágeno de tipo I (T. Minas & S. Nehrer Orthopedics 20 (6): 525-538 (1997) Current concepts in treatment of articular cartilage defects).

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Las abreviaturas citadas anteriormente y a continuación tienen el siguiente significado:

PBS: Disolución de cloruro de sodio tamponada con fosfato (Phosphate buffered Saline, solución salina tamponada con fosfato)

DMEM: Medio de Eagle modificado por Dulbecco, glucosa alta

DMEM/Ham's F12: \\[2.1mm] ......./mezcla de nutrientes F12 (1:1)

bFGF: Factor de crecimiento de fibroblasto básico

EGF: Factor de crecimiento epidérmico

HEPES: Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etan-sulfónico

IGF o IGF-|: Factor 1 de crecimiento de tipo insulina

TGF-\beta: Factor \beta de crecimiento transformante

IL-4: Interleucina 4

p : p: Peso en peso.

La invención se explica y se describe más detalladamente a continuación mediante dos ejemplos de realización.

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Ejemplo de realización 1

Aislamiento de los condrocitos

Se peló el cartílago articular de la cabeza del radio de una paciente de 60 años de edad, se liberó de todos los restos de sangre y tejido y se trituró en una placa Petri con escalpelos. Los trozos de cartílago se colocaron en el tamiz de una cámara de digestión con agitador magnético y se agitó con 50 ml de disolución de hialuronidasa (25 mg de hialuronidasa en 50 ml de PBS) durante 25 min. a 37ºC. Después se incubó el tejido con 50 ml de EDTA/tripsina al 0,25% en peso (agitación, 45 min., 37ºC) y se lavó durante 5 min. con 50 ml de DMEM + FKS (suero bovino fetal) al 10% en volumen. La liberación de los condrocitos de la formación de tejido se realizó con un tratamiento de colagenasa (colagenasa 1a) en tres veces, en el que se incubó el tejido con 50 ml de disolución de colagenasa (25 mg en 50 ml de DMEM + FKS al 10% en volumen + 100 u/ml de penicilina + estreptomicina 100 \mug/ml) con agitación a 37ºC y se separaron por centrifugación (500 x g, 5 min.) las células de la disolución goteada. Se digirió el tejido en primer lugar durante 2 horas, después dos veces durante la noche con colagenasa. Posteriormente se lavaron células adicionales mediante la adición de DMEM + FKS al 10% en volumen del tejido y se separaron por centrifugación como anteriormente.

Cultivo en monocapa

Los condrocitos aislados se sembraron en frascos de cultivo celular a una densidad de 10^{4} células/cm^{2} y se cultivaron con DMEM/Ham's F12 (1/1) + FKS al 10% en volumen + bFGF 10 ng/ml + EGF1 ng/ml. Se realizó un cambio del medio dos veces por semana, en el que se pasaron las células una vez por semana con EDTA/tripisina al 0,25% en peso. Se mantuvieron los condrocitos hasta el 7º pase en cultivo en monocapa.

Cultivo de alginato

Tras una etapa de lavado en tampón NH (NaCl 0,15 M + Hepes 25 mM, pH 7,4) se recogieron las células en tampón NH + alginato de potasio al 1,2% en peso (densidad de 1 millón de células/ml). Se goteó en cada caso 1 ml de la suspensión celular en una cavidad de una placa de 12 (rellena con 3 ml de CaCl_{2} 0,1 M/Hepes 25 mM). Se realizó inmediatamente la encapsulación de las células en alginato. Las bolitas de alginato se lavaron tras 15 minutos dos veces en tampón NH. Posteriormente se recogieron las células encapsuladas en el alginato en DMEM + suero humano al 10% en volumen + ácido ascórbico 50 \mug/ml + IGF 100 ng/ml + TGF-\beta 10 ng/ml y se cultivaron en una incubadora con cambio del medio tres veces por semana durante 3 semanas a 37ºC, CO_{2} al 5%, 95% de humedad del aire relativa. A este respecto se sometieron a prueba diferentes sueros humanos como también FKS. Se compararon entre sí las presiones parciales de O_{2} del 5% y del 21% (véase la figura 1).

Para el aislamiento de las células del alginato éstas se lavaron en primer lugar dos veces con tampón NH, antes de que mediante la adición de tampón NH + citrato de sodio 55 mM se disolviera el alginato con oscilación durante 15 minutos.

Cultivo de agregado

Se lavaron de nuevo las células aisladas con tampón NH y se centrifugaron (50 x g, 10 min.) sobre la base cubierta con resina sintética de un tubito Greiner de 15 ml. Tras el cultivo durante 2 días con DMEM + suero humano al 10% en volumen + ácido ascórbico 50 \mug/ml + IGF 100 ng/ml + TGF-\beta 10 ng/ml, se transfirió el agregado a una cavidad recubierta con agarosa de una placa de 12. Se realizó el cultivo de las células agregadas en DMEM + suero humano al 10% en volumen + IGF 100 ng/ml + TGF-\beta 10 ng/ml + penicilina/ estreptomicina durante 2-3 semanas en las mismas condiciones que para el cultivo de alginato, pero a presión parcial de O_{2} del 21%. El procedimiento fue exitoso con distintos sueros humanos pero no con FKS.

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Ejemplo de realización 2

Se realizó el aislamiento de los condrocitos y el cultivo en monocapa tal como se describió en el ejemplo 1. También se realizó la producción del cultivo de alginato y de agregado tal como se describió en el ejemplo 1. Sin embargo, para la estimulación adicional de la condrogénesis se añadieron 2 ng/ml de la citocina IL-4 durante el cultivo de alginato y de agregado.

Descripción de la figura 1

FCS = FKS; HS1 - HS4 = distintos sueros humanos

CII = colágeno II (control)

Cl = colágeno I (control).

A O_{2} al 21% las bandas son más gruesas que a O_{2} al 5%. Pero a O_{2} al 21% se produce también más colágeno de tipo I \rightarrow. El cociente de colágeno de tipo II/ de tipo I es desfavorable. A O_{2} al 5% se forma sólo poco colágeno de tipo I en el caso del uso de suero humano. Si por el contrario se utiliza FKS, entonces se empeora claramente la proporción de colágeno de tipo II/de tipo I.

1

Claims

1. Un procedimiento para la producción de un implante de cartílago humano a partir de condrocitos cultivados in vitro, caracterizado por las siguientes características:

: se aíslan condrocitos a partir de cartílagos del propio paciente de manera habitual mediante la adición de diferentes disoluciones enzimáticas;

: se siembran los condrocitos aislados en frascos de cultivo celular y se cultivan en un solución nutritiva, mezclada con suero humano y/o bovino y factores de crecimiento;

: se recogen los condrocitos purificados en una disolución tampón que contiene alginato, realizándose la encapsulación inmediata, posteriormente cultivando varias semanas a 34-39ºC bajo presión parcial de oxígeno reducida y aislando las células del alginato mediante la adición de disoluciones tampón de citrato;

: se centrifugan los condrocitos aislados, se cultivan algunos días con factores de crecimiento condrogénicos, suero humano y la solución nutritiva que contiene otros aditivos, se transfiere el agregado a una cavidad recubierta con agarosa de una placa y se cultivan las células agregadas en las mismas condiciones que en la fase de alginato, aunque a presión parcial de O_{2} del 21%.

2. El procedimiento para la producción de un implante de cartílago según la reivindicación 1, caracterizado porque se cultivan los condrocitos aislados, que se siembran en frascos de cultivo celular, en una solución nutritiva mezclada con suero humano y/o bovino y factores de crecimiento así como citocinas.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 y/ó 2, caracterizado porque los condrocitos aislados del alginato forman tras la centrifugación sobre una superficie plana cartílago con forma plana.

4. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque como factores de crecimiento condrogénicos se añaden IGF-I y TGF-\beta en la proporción 5 - 10 : 1.

5. El procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque como citocina se añade IL-4 en la concentración desde 0,1 ng/ml hasta 3 ng/ml.

6. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se reduce la presión parcial de oxígeno hasta por debajo del 10%.

7. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque para la producción del cultivo de agregado se usa hasta el 20% en volumen de suero humano como adición al medio.

8. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se mantienen los condrocitos en cultivo en monocapa hasta el 12º pase.

9. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se mantienen los condrocitos en cultivo en monocapa hasta el 7º pase.

10. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque resulta un cociente alto de colágeno de tipo II/colágeno de tipo I.