ES2291010T3 - Enzimas fosfodiesterasas. - Google Patents
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Abstract
Una enzima PDE-XIV constituida por una secuencia aminoacídica que se presenta en SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3 o SEC ID Nº 5, o que tiene al menos un 95% de identidad con éstas.
Description
Enzimas fosfodiesterasas.
La presente invención se refiere a una enzima.
La presente invención también se refiere a una secuencia
nucleotídica que la codifique.
En concreto, la presente invención se refiere a
nuevas secuencias de ácidos nucleicos que codifican nuevas enzimas
fosfodiesterasas.
La presente invención también se refiere al uso
de las nuevas secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos en el
diagnóstico y tratamiento de enfermedades.
La presente invención también se refiere al uso
de las nuevas secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos para
evaluar y/o seleccionar agentes que puedan modular la actividad
fosfodiesterasa.
La presente invención se refiere además a
células hospedadoras obtenidas por ingeniería genética que contienen
o expresan las nuevas secuencias de ácidos nucleicos y de
aminoácidos para evaluar y/o seleccionar agentes que puedan modular
la actividad fosfodiesterasa.
Los nucleótidos cíclicos, tales como AMPc y
GMPc, son importantes segundos mensajeros intracelulares. Las
fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos -también conocidas como
PDE- son una familia de enzimas que catalizan la degradación de los
nucleótidos cíclicos y, al hacerlo, se convierten en uno de los
componentes celulares que regulan la concentración de nucleótidos
cíclicos.
En los últimos años, se han definido al menos
diez enzimas PDE, así como muchos subtipos de estas enzimas,
basándose en su afinidad por sustratos y en sus requerimientos de
cofactores (Beavo JA y Reifsnyder DH, Trends Pharmacol. Sci. 11:150
[1990]; Beavo J, en: Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases:
Structure, Regulation and Drug Action., Beavo J y Housley MD (Eds.).
Wiley: Chichester, págs. 3-15 [1990]).
Los ejemplos de subfamilias incluyen: PDE1 (a
veces escrita como PDEI), dependiente de Ca^{2+}/calmodulina;
PDE2 (a veces escrita como PDEII), estimulada por GMPc; PDE3 (a
veces escrita como PDEIII), hidrolizante de AMPc inhibida por GMPc;
PDE4 (a veces escrita como PDEIV), específica de AMPc, sensible a
rolipram; PDE5 (a veces escrita como PDEV), específica de GMPc;
PDE6 (a veces escrita como PDEVI), fotorreceptor específico de
GMPc; PDE7 (a veces escrita como PDEVII), específica de AMPc,
insensible a rolipram; PDE8 (a veces escrita como PDEVIII),
específica de AMPc, insensible a IBMX; PDE9 (a veces escrita como
PDEIX), específica de GMPc, insensible a IBMX; PDE10 (a veces
escrita como PDEX) de doble sustrato, insensible a IBMX.
Las PDE contienen un dominio catalítico
C-terminal conservado de \sim270 aminoácidos
(Charbonneau y col. 1986 PNAS
83(24):9308-12) y un dominio
N-terminal implicado en la regulación de la
actividad catalítica mediante cofactores de unión, y en la
especificación de la localización subcelular (Juilfs y col. (1999)
Rev Physiol Biochem Pharmacol 135:67-104).
Cada familia PDE puede contener dos o más
isoformas (es decir, puede haber dos o más isoenzimas PDE). A modo
de ejemplo, se sabe que la PDE IV de mamíferos, la homóloga del gen
Dunce de Drosophila (Chen CN y col., Proc. Nat. Acad. Sci.
(USA) 83:9313 [1986]), tiene cuatro isoformas en la rata (Swinnen JV
y col., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 86: 5325 [1989]). También se
conoce que las PDE humanas aparecen como isoformas y tienen
variantes de corte y empalme. Por ejemplo, en 1990 se publicó la
clonación de una isoforma humana de la PDEIV de monocitos (Livi GP
y col., Mol. Cell. Bio., 10:2678 [1990]). A modo de ejemplo
adicional, otros investigadores han clonado independientemente tres
variantes de corte y empalme de PDEIV, que actualmente se denominan
hPDEIV-B1, hPDEIV-B2 y
hPDEIV-B3.
También pueden encontrarse enseñanzas sobre
fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos en los documentos
US-A-5932423 y
US-A-5932465.
Pueden encontrase enseñanzas sobre una
fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos adicional -denominada CN
PCDE8-en el documento
WO-A-97/35989. De acuerdo con el
documento WO-A-97/35989, CN PCDE8
tiene dos isoenzimas -que se denominaron CN PCDE8A y CN PCDE8B. Al
término "isozima" se refieren a veces en la técnica como
"isoforma".
Las enseñanzas sobre las fosfodiesterasas de
nucleótidos cíclicos humanas y los polinucleótidos que las codifican
pueden también encontrarse en el documento WO 00/77226 A1.
\newpage
De acuerdo con el documento
WO-A-97/35989, se han identificado
muchos inhibidores de diferentes PDE y algunos se han sometido a
una evaluación clínica. Por ejemplo, se están desarrollando
inhibidores de PDEIII como agentes antitrombóticos, agentes
antihipertensivos y agentes cardiotónicos útiles en el tratamiento
de la insuficiencia cardiaca congestiva. El rolipram, un inhibidor
de PDEIV, se ha utilizado en el tratamiento de la depresión y otros
inhibidores de PDEIV se están sometiendo a evaluación como agentes
antiinflamatorios. También se ha demostrado que el rolipram inhibe
el TNF-alfa inducido por lipopolisacárido (LPS), que
se ha demostrado que aumenta la replicación del
VIH-1 in vitro. Por lo tanto, el rolipram
puede inhibir la replicación del VIH-1 (Angel y
col. 1995 AIDS 9:1137-44). Adicionalmente, basándose
en su capacidad para suprimir la producción de TNF alfa y beta y de
interferón gamma, se ha demostrado que el rolipram es eficaz en el
tratamiento de la encefalomielitis, del modelo animal experimental
de la esclerosis múltiple (Sommer y col., 1995 Nat Med
1:244-248) y puede ser eficaz en el tratamiento de
la discinesia tardía (Sasaki y col., 1995 Eur J Pharmacol
282:71-76).
De acuerdo con el documento
WO-A-97/35989, existen también
inhibidores inespecíficos de PDE tales como la teofilina, que se
usa en el tratamiento del asma bronquial y de otras enfermedades
respiratorias, y la pentoxifilina, que se usa en el tratamiento de
la claudicación intermitente y de la enfermedad vascular periférica
inducida por diabetes. Se piensa que la teofilina actúa sobre la
función del músculo liso de las vías respiratorias así como por su
capacidad antiinflamatoria e inmunomoduladora en el tratamiento de
enfermedades respiratorias (Banner y col. 1995 Respir J
8:996-1000) donde se piensa que actúa inhibiendo la
hidrólisis tanto de AMPc como de GMPc por CN PDE (Banner y col.
1995 Monaldi Arch Chest Dis 50:286-292). La
pentoxifilina, que también se conoce que bloquea la producción de
TNF-alfa, puede inhibir la replicación del
VIH-1 (Angel y col. supra). Se proporciona
una lista de inhibidores de CN PDE en Beavo 1995 supra.
Se ha sugerido que los inhibidores selectivos de
PDE, además de sus isozimas y de sus subtipos, conducirán a una
terapia más eficaz con menores efectos secundarios. Por ejemplo,
véanse las enseñanzas en las revisiones de Wieshaar RE y col., (J.
Med. Chem., 28:537 [1985]), Giembycz MA (Biochem. Pharm., 43:2041
[1992]) y Lowe JA y Cheng JB (Drugs of the Future,
17:799-807 [1992]).
Por lo tanto, para algunas aplicaciones es
deseable tener una inhibición selectiva de un tipo individual de
PDE. Por lo tanto, la clonación y la expresión de una nueva PDE
contribuirán enormemente al descubrimiento de inhibidores
selectivos.
Los aspectos de la presente invención se
presentan en las reivindicaciones y en el comentario siguiente.
En resumen, algunos aspectos de la presente
invención se refieren a:
- 1.
- Nuevos aminoácidos.
- 2.
- Nuevas secuencias nucleotídicas.
- 3.
- Ensayos que utilizan dichas nuevas secuencias.
- 4.
- Compuestos/composiciones identificados mediante el uso de dichos ensayos.
- 5.
- Sistemas de expresión que contengan o expresen dichas nuevas secuencias.
- 6.
- Procedimientos de tratamiento basados en dichas nuevas secuencias.
- 7.
- Composiciones farmacéuticas basadas en dichas nuevas secuencias.
Otros aspectos que conciernen a la secuencia
aminoacídica y/o a la secuencia nucleotídica de la presente
invención incluyen: una construcción que contenga o sea capaz de
expresar las secuencias de la presente invención; un vector que
contenga o sea capaz de expresar las secuencias de la presente
invención; un plásmido que contenga o sea capaz de expresar las
secuencias de la presente invención; un tejido que contenga o sea
capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un
órgano que contenga o sea capaz de expresar las secuencias de la
presente invención; un hospedador transformado que contenga o sea
capaz de expresar las secuencias de la presente invención; y un
organismo transformado que contenga o sea capaz de expresar las
secuencias de la presente invención. La presente invención también
abarca los procedimientos para la expresión de las mismas, tales
como la expresión en un microorganismo; incluyendo los
procedimientos para la transferencia de las mismas.
Para facilitar la consulta, los aspectos de la
presente invención se discuten a continuación en las secciones
apropiadas. Sin embargo, las enseñanzas que se incluyen en cada
sección no se limitan necesariamente a cada sección en
particular.
En los siguientes comentarios, las expresiones
"secuencia nucleotídica de la presente invención" y
"secuencia aminoacídica de la presente invención" se refieren
respectivamente a una cualquiera o más de las secuencias
nucleotídicas que se presentan o analizan en este documento y a una
cualquiera o más de las secuencias aminoacídicas que se presentan o
analizan en este documento. También, y como se utiliza en este
documento, "secuencia aminoacídica" se refiere a secuencias
peptídicas o proteicas y puede referirse a porciones de las mismas.
Además, el término "secuencia aminoacídica de la presente
invención" es sinónimo de la expresión "secuencia polipeptídica
de la presente invención". También, el término "secuencia
nucleotídica de la presente invención" es sinónimo de la
expresión "secuencia polinucleotídica de la presente
invención".
De acuerdo con un primer aspecto de la presente
invención se proporciona una enzima PDE XIV constituida por la
secuencia aminoacídica como se presenta en SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3,
SEC ID Nº 5 o que tiene al menos un 95% de identidad con éstas.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente
invención se proporciona un gen PDE XIV constituido por la
secuencia nucleotídica que se presenta en SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 4
o SEC ID Nº 6, o que tiene al menos un 95% de identidad con
éstas.
De acuerdo con un tercer aspecto de la presente
invención se proporciona un vector que contiene el gen PDE XIV de
acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente
invención se proporciona una célula hospedadora aislada en la que se
ha incorporado el gen PDE XIV de acuerdo con los aspectos 2 ó 3 de
la presente invención.
De acuerdo con un quinto aspecto de la presente
invención se proporciona un procedimiento de ensayo para la
identificación de un agente que pueda afectar a la actividad de
PDE_XIV o a la expresión de la misma, comprendiendo el
procedimiento de ensayo el contacto de un agente con la enzima PDE
XIV de acuerdo con el primer aspecto de la invención o con el gen
PDE XIV de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, con el
vector del tercer aspecto o con la célula hospedadora del cuarto
aspecto o del sexto aspecto de la presente invención; y la medición
de la actividad o de la expresión de PDE_XIV; donde una diferencia
entre a) la actividad de la enzima PDE_XIV o su expresión en
ausencia del agente y b) la actividad de la enzima PDE_XIV o su
expresión en presencia del agente es indicativa de que el agente
puede afectar a la actividad de la enzima PDE_XIV o a su
expresión.
Preferiblemente el ensayo es para seleccionar
agentes que puedan ser útiles en el tratamiento de trastornos que
se encuentran en uno cualquiera o más de putamen, núcleo caudado del
cerebro, lóbulo occipital del cerebro, corazón, ovario, glándula
pituitaria, riñón, hígado, intestino delgado, timo, músculo
esquelético, regiones leucocitarias, ganglios de las raíces
dorsales, útero, cóclea, intestino delgado (duodeno), astrocitoma y
apéndice.
De acuerdo con un sexto aspecto de la presente
invención se proporciona una célula hospedadora del cuarto aspecto
donde la célula hospedadora está depositada con los números de
acceso NCIMB 40995, NCIMB 40996 o NCIMB 41027.
De acuerdo con un séptimo aspecto de la presente
invención se proporciona una secuencia nucleotídica que codifica
una PDE, donde la secuencia nucleotídica puede obtenerse de los
números de acceso NCIMB 40995 o NCIMB 40996 o NCIMB 41027.
De acuerdo con un octavo aspecto de la presente
invención se proporciona una PDE donde la PDE puede expresarse a
partir de una secuencia nucleotídica que puede obtenerse de los
números de acceso NCIMB 40995 o NCIMB 40996 o NCIMB 41027.
Otros aspectos de la presente invención se
presentan a continuación.
Una secuencia nucleotídica aislada o una
secuencia proteica aislada de acuerdo con la presente invención.
Una secuencia nucleotídica sustancialmente pura
o una secuencia proteica sustancialmente pura de acuerdo con la
presente invención.
Un procedimiento de ensayo para la
identificación de un agente que pueda afectar al patrón de expresión
de la secuencia nucleotídica de la presente invención o a la
actividad del producto de expresión de la misma, comprendiendo el
procedimiento de ensayo: la exposición de la secuencia nucleotídica
de la presente invención o del producto de expresión ("EP") de
la misma con un agente; la determinación de si el agente modula (tal
como que afecta al patrón de expresión o a su actividad) la
secuencia nucleotídica de la presente invención o el producto de
expresión de la misma.
Como se ha explicado anteriormente, la presente
invención se refiere a un nueva enzima PDE -que se ha denominado
PDE_XIV- y a la secuencia nucleotídica que la codifica. La presente
invención también se refiere al uso de las nuevas secuencias de
ácidos nucleidos y de aminoácidos en el diagnóstico y tratamiento de
enfermedades. La presente invención también se refiere al uso de
las nuevas secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos para
evaluar y/o seleccionar agentes que puedan modular la actividad
fosfodiesterasa. La presente invención se refiere además a células
hospedadoras obtenidas por ingeniería genética que contienen o
expresan las nuevas secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos
para evaluar y/o seleccionar agentes que puedan modular la actividad
fosfodiesterasa.
Como se usa en este documento, el término
"PDE_XIV" se refiere a una nueva familia de PDE que, hasta el
momento, no estaba caracterizada.
A modo de ejemplo, se ha identificado una
PDE_XIV humana (a la que a veces se hace referencia como HSPDE_XIV).
También se ha identificado una secuencia de ratón -que se ha
denominado PDE_XIV (a la que a veces se hace referencia como
MMPDE_XIV).
Por comodidad, y a menos que se indique lo
contrario, las referencias a PDE_XIV incluyen referencia a HSPDE_XIV
y/o MMPDE_XIV.
Se piensa que PDE_XIV está presente en, y puede
obtenerse de, una diversidad de fuentes.
A modo de ejemplo, PDE_XIV se encuentra en uno
cualquiera o más de putamen, núcleo caudado del cerebro, lóbulo
occipital del cerebro, corazón, ovario, glándula pituitaria, riñón,
hígado, intestino delgado, timo, músculo esquelético, regiones
leucocitarias, ganglios de las raíces dorsales, útero, cóclea,
intestino delgado (duodeno), astrocitoma y apéndice.
También se piensa que PDE_XIV está presente en
varias otras fuentes -tales como por ejemplo: rata, bovino, ovino,
porcino y equino.
Preferiblemente, la presente invención abarca
las PDE_XIV de mamíferos que incluyen, pero sin limitación,
cualquiera de las fuentes anteriores.
Más preferiblemente, la presente invención
incluye la PDE_XIV humana.
La PDE_XIV puede ser igual que la forma que
aparece naturalmente -para este aspecto, preferiblemente la PDE_XIV
es la secuencia aminoacídica no nativa (es decir, no está presente
en su entorno natural)- o es una variante, homólogo, fragmento o
derivado de la misma. Además, o como alternativa, la PDE_XIV es
PDE_XIV aislada y/o PDE_XIV purificada. La PDE_XIV puede obtenerse
o producirse por cualquier fuente adecuada, ya sea natural o no, o
puede ser sintética, semisintética o recombinante.
La secuencia codificante de PDE_XIV puede ser
igual que la forma que aparece naturalmente -para este aspecto,
preferiblemente la secuencia codificante de PDE_XIV es la secuencia
nucleotídica no nativa (es decir, no está presente en su entorno
natural)- o es una variante, homólogo, fragmento o derivado de la
misma. Además, o como alternativa, la secuencia codificante de
PDE_XIV es una secuencia codificante de PDE_XIV aislada y/o una
secuencia codificante de PDE_XIV purificada. La secuencia
codificante de PDE_XIV puede obtenerse de o producirse por
cualquier fuente adecuada, ya sea natural o no, o puede ser
sintética, semisintética o recombinante.
La PDE_XIV y/o su secuencia codificante y/o una
secuencia capaz de hibridar con ésta es/son útiles para analizar la
selectividad de los candidatos a fármacos entre diferentes PDE.
Se piensa que PDE_XIV es capaz de catalizar la
conversión del AMPc en AMP.
Los aspectos preferidos de la presente invención
incluyen una enzima PDE_XIV recombinante y una secuencia
nucleotídica recombinante que codifica una enzima PDE_XIV.
Preferiblemente, la enzima PDE_XIV recombinante
y/o la secuencia nucleotídica recombinante de la presente invención
son una enzima PDE_XIV de mamíferos recombinante y/o una secuencia
nucleotídica de mamíferos recombinante.
Preferiblemente, la enzima PDE_XIV recombinante
y/o la secuencia nucleotídica recombinante de la presente invención
son una enzima PDE_XIV humana recombinante y/o una secuencia
nucleotídica humana recombinante.
O la secuencia nucleotídica que codifica la
PDE_XIV o la propia enzima PDE_XIV o ambas pueden utilizarse para
seleccionar agentes que puedan afectar a la actividad de PDE_XIV. En
concreto, la secuencia nucleotídica que codifica la PDE_XIV o la
propia PDE_XIV pueden utilizarse para seleccionar agentes que puedan
inhibir la actividad PDE_XIV. Además, la secuencia nucleotídica que
codifica la PDE_XIV o la propia enzima PDE_XIV pueden utilizarse
para seleccionar agentes que afecten de manera selectiva a la
actividad de PDE_XIV, tal como inhibiendo selectivamente la
actividad de PDE_XIV.
Además, la secuencia nucleotídica que codifica
la PDE_XIV o una secuencia que sea complementaria a ésta pueden
también utilizarse en ensayos para detectar la presencia de
secuencias codificantes de PDE_XIV en células humanas. Estos
ensayos proporcionarán información con respecto a la distribución
tisular de esta enzima y a su importancia biológica con respecto a
patologías concretas.
\newpage
La presente invención también incluye
anticuerpos contra PDE_XIV (incluyendo un derivado, fragmento,
homólogo o variante de la misma). Los anticuerpos contra PDE_XIV
pueden utilizarse en ensayos para detectar la presencia de PDE_XIV
en células humanas. Estos ensayos proporcionarán información con
respecto a la distribución tisular de esta enzima y a su
importancia biológica con respecto a patologías concretas.
En concreto, una cualquiera o más de isozimas
PDE_XIV, las secuencias nucleotídicas que las codifican, las
secuencias nucleotídicas que son complementarias a las mismas, y los
anticuerpos dirigidos contra las mismas pueden utilizarse en
ensayos para seleccionar agentes que puedan afectar selectivamente a
una de las isozimas. Estos ensayos proporcionarán información con
respecto a la distribución tisular de cada una de las isozimas y
proporcionarán información con respecto a la importancia biológica
de cada una de las isozimas con respecto a patologías concretas.
Estos ensayos también permitirán a los investigadores analizar e
identificar agentes que sean útiles para afectar a la expresión de
o a la actividad de PDE_XIV -tal como en un tejido concreto o en una
patología concreta.
El término "polipéptido" -que es
intercambiable con el término "proteína"- incluye moléculas
polipeptídicas de cadena sencilla así como complejos de múltiples
polipéptidos donde los polipéptidos constituyentes individuales
están unidos por medios covalentes o no covalentes.
Preferiblemente, el polipéptido de la presente
invención es un polipéptido de cadena sencilla.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
estar en una forma sustancialmente aislada. Se entenderá que el
polipéptido puede estar mezclado con vehículos o diluyentes que no
interferirán con el uso deseado del polipéptido y todavía se le
considerará sustancialmente aislado. Un polipéptido de la presente
invención puede estar también en una forma sustancialmente
purificada, en cuyo caso generalmente estará constituida por
elpolipéptido en una preparación en la que más del 90%, por ejemplo
el 95%, el 98% o el 99% del polipéptido en la preparación es un
polipéptido de la presente invención. Los polipéptidos de la
presente invención pueden modificarse por ejemplo mediante la
adición de restos histidina para facilitar su purificación o
mediante la adición de una secuencia señal para promover su
secreción desde una célula como se discute a continuación.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
producirse por medios sintéticos (por ejemplo, como se describe en
Geysen y col., 1996) o recombinantes, como se describe a
continuación.
En una realización preferida, la secuencia
aminoacídica en síde la presente invención no incluye la PDE_XIV
nativa de acuerdo con la presente invención cuando está en su
entorno natural y cuando se ha expresado a partir de su secuencia
nucleotídica codificante nativa que está también en su entorno
natural y cuando esa secuencia nucleotídica está bajo el control de
su promotor nativo que está también en su entorno natural. Para
facilitar la consulta, hemos denominado a esta realización
preferida "secuencia aminoacídica no nativa".
Los términos "variante", "homólogo" o
"fragmento" en relación con la secuencia aminoacídica de la
enzima de la presente invención incluyen cualquier sustitución de,
variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de o adición
de uno (o más) aminoácidos de o con la secuencia que proporciona una
enzima resultante que tiene actividad PDE_XIV, preferiblemente que
sea al menos tan biológicamente activa como la enzima que se
presenta en los listados de secuencias que se adjuntan. En
concreto, el término "homólogo" abarca la homología con
respecto a la estructura y/o función. Con respecto a la homología de
la secuencia, preferiblemente tiene al menos un 95%, más
preferiblemente al menos un 98%, de homología con una cualquiera de
las secuencias que se presentan en los listados de secuencias que se
adjuntan.
Típicamente, los tipos de sustituciones
aminoacídicas que pueden realizarse deben mantener la
hidrofobicidad/
hidrofilicidad de la secuencia aminoacídica. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos, por ejemplo desde 1, 2 ó 3 hasta 10, 20 ó 30 sustituciones, siempre que la secuencia modificada mantenga su capacidad de actuar como enzima PDE de acuerdo con la presente invención. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos que no aparecen naturalmente, por ejemplo para incrementar su vida media en el plasma sanguíneo.
hidrofilicidad de la secuencia aminoacídica. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos, por ejemplo desde 1, 2 ó 3 hasta 10, 20 ó 30 sustituciones, siempre que la secuencia modificada mantenga su capacidad de actuar como enzima PDE de acuerdo con la presente invención. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos que no aparecen naturalmente, por ejemplo para incrementar su vida media en el plasma sanguíneo.
La secuencia aminoacídica de la presente
invención puede producirse mediante la expresión de una secuencia
nucleotídica que la codifique en un sistema de expresión
adecuado.
Además, o como alternativa, la propia proteína
puede producirse utilizando procedimientos químicos para sintetizar
una secuencia aminoacídica de PDE, en su totalidad o en parte. Por
ejemplo, los péptidos pueden sintetizarse mediante técnicas en fase
sólida, separarse de la resina, y purificarse mediante cromatografía
líquida de alta resolución preparativa (por ejemplo, Creighton
(1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and
Co, New York, NY). La composición de los péptidos sintéticos puede
confirmarse mediante análisis o secuenciación de aminoácidos (por
ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman).
La síntesis directa de péptidos puede realizarse
utilizando diversas técnicas en fase sólida (Roberge JY y col.
(1995) Science 269: 202-204) y la síntesis
automática puede conseguirse, por ejemplo, usando el ABI 43 1 A
Peptide Synthesizer (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones
proporcionadas por el fabricante. Adicionalmente, la secuencia
aminoacídica de la PDE, o cualquier parte de la misma, puede
alterarse durante la síntesis directa y/o combinarse usando
procedimientos químicos con una secuencia de otras subunidades, o
cualquier parte de la misma, para producir un polipéptido
variante.
En otra realización de la invención, una
secuencia natural, modificada o recombinante de PDE puede unirse a
una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por
ejemplo, para examinar bibliotecas de péptidos en busca de
inhibidores de la actividad de PDE, puede ser útil codificar una
proteína PDE quimérica que exprese un epítopo heterólogo que sea
reconocido por un anticuerpo disponible en el mercado. Una proteína
de fusión también puede diseñarse para que contenga un sitio de
escisión localizado entre la secuencia PDE y la secuencia proteica
heteróloga, de tal modo que la PDE pueda escindirse y purificarse
por separado de su fracción heteróloga.
La PDE puede también expresarse como una
proteína recombinante con la adición de uno o más dominios
polipeptídicos adicionales para facilitar la purificación de la
proteína. Tales dominios facilitadores de la purificación incluyen,
pero sin limitación, péptidos quelantes de metales tales como
módulos histidina-triptófano que permitan la
purificación sobre metales inmovilizados (Porath J (1992) Protein
Expr Purif 3-26328 1), dominios de proteína A que
permitan la purificación sobre inmunoglobulinas inmovilizadas, y el
dominio que se utiliza en el sistema de purificación FLAGS de
extensión/afinidad (Immunex Corp, Seattle, WA). La inclusión de una
secuencia de engarce escindible tal como el Factor XA o la
enteroquinasa (Invitrogen, San Diego; CA) entre el dominio de
purificación y la PDE es útil para facilitar la purificación. En un
aspecto preferido, la enzima se expresa con una señal de epítopo
FLAG a fin de facilitar el aislamiento y la purificación de la
enzima que se expresa.
Las secuencias aminoacídicas específicas de
PDE_XIV se presentan como SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 5.
Sin embargo, la presente invención abarca secuencias aminoacídicas
que codifican otros miembros de la familia PDE_XIV que incluirán
secuencias aminoacídicas que tengan al menos un 60% de identidad
(más preferiblemente al menos un 75% de identidad) con una
cualquiera de las secuencias aminoacídicas.
Los polipéptidos de la presente invención
también incluyen fragmentos de la secuencia aminoacídica que se
presenta y variantes de la misma. Los fragmentos adecuados tendrán
un tamaño de al menos 5, por ejemplo al menos 10, 12, 15 ó 20
aminoácidos.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
también modificarse para que contengan una o más (por ejemplo, al
menos 2, 3, 5, ó 10) sustituciones, deleciones o inserciones,
incluyendo sustituciones conservadoras. Estos aspectos se discuten
en una sección posterior.
El término "secuencia nucleotídica" como se
usa en este documento, se refiere a una secuencia oligonucleotídica
o a una secuencia polinucleotídica, y a sus variantes, homólogos,
fragmentos y derivados de la misma (tales como porciones de la
misma). La secuencia nucleotídica puede ser de ADN o ARN, que puede
ser de origen genómico o sintético o recombinante, que puede ser de
doble cadena o de cadena sencilla y representar tanto la cadena con
sentido como la antisentido.
Preferiblemente, el término "secuencia
nucleotídica" se refiere a ADN.
Más preferiblemente, el término "secuencia
nucleotídica" se refiere a ADN que se genera mediante el uso de
técnicas de ADN recombinante (es decir, ADN recombinante).
En una realización preferida, la secuencia
nucleotídica en síde la presente invención no incluye la secuencia
nucleotídica codificante nativa de acuerdo con la presente invención
en su entorno natural cuando está bajo el control de su promotor
nativo que está también en su entorno natural. Para facilitar la
consulta, se ha denominado a esta realización preferida "secuencia
nucleotídica no nativa".
Las secuencias nucleotídicas de la presente
invención pueden incluir dentro de ellas nucleótidos sintéticos o
modificados. En la técnica se conocen varios tipos diferentes de
modificaciones de oligonucleótidos. Éstas incluyen estructuras
metilfosfonato y fosforotioato, la adición de cadenas de acridina o
polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines
de la presente invención, debe entenderse que las secuencias
nucleotídicas que se describen en este documento pueden modificarse
por cualquier procedimiento disponible en la técnica. Tales
modificaciones pueden realizarse para aumentar la actividad in
vivo o la vida útil de las secuencias nucleotídicas de la
presente
invención.
invención.
La presente invención también incluye secuencias
nucleotídicas que son complementarias a las secuencias que se
presentan en este documento, o a cualquier derivado, fragmento o
derivado de las mismas. Si la secuencia es complementaria a un
fragmento de la misma entonces la secuencia puede usarse como sonda
para identificar secuencias codificantes similares en otros
organismos, etc.
La presente invención también incluye secuencias
nucleotídicas que son capaces de hibridar con las secuencias que se
presentan en este documento, o con cualquier derivado, fragmento o
derivado de las mismas.
La presente invención también incluye secuencias
nucleotídicas que son capaces de hibridar con las secuencias que
son complementarias a las secuencias que se presentan en este
documento, o con cualquier derivado, fragmento o derivado de las
mismas.
El término "variante" también incluye
secuencias que son complementarias a las secuencias que son capaces
de hibridar con las secuencias nucleotídicas que se presentan en
este documento.
Preferiblemente, el término "variante"
incluye las secuencias que son complementarias a las secuencias que
son capaces de hibridar en condiciones rigurosas (por ejemplo, 55ºC
y SSC 0,2x {SSC 1x = NaCl 0,15, citrato de Na_{3} 0,015 M a pH
7,0}) con las secuencias nucleotídicas que se presentan en este
documento.
Más preferiblemente, el término "variante"
incluye las secuencias que son complementarias a las secuencias que
son capaces de hibridar en condiciones muy rigurosas (por ejemplo,
65ºC y SSC 0,1x {SSC 1x = NaCl 0,15 M, citrato de Na_{3} 0,015 M a
pH 7,0}) con las secuencias nucleotídicas que se presentan en este
documento.
La presente invención también se refiere a
secuencias nucleotídicas que pueden hibridar con las secuencias
nucleotídicas de la presente invención (incluyendo secuencias
complementarias de las que se presentan en este documento).
La presente invención también se refiere a
secuencias nucleotídicas que son complementarias a las secuencias
que pueden hibridar con las secuencias nucleotídicas de la presente
invención (incluyendo secuencias complementarias de las que se
presentan en este documento).
También se incluyen dentro del alcance de la
presente invención secuencias polinucleotídicas que son capaces de
hibridar con las secuencias nucleotídicas que se presentan en este
documento en condiciones de rigurosidad intermedia a máxima.
En un aspecto preferido, la presente invención
incluye secuencias nucleotídicas que pueden hibridar con la
secuencia nucleotídica de la presente invención, o con la
complementaria de la misma, en condiciones rigurosas (por ejemplo,
55ºC y SSC 0,2x).
En un aspecto más preferido, la presente
invención incluye secuencias nucleotídicas que pueden hibridar con
la secuencia nucleotídica de la presente invención, o con la
complementaria de la misma, en condiciones muy rigurosas (por
ejemplo, 65ºC y SSC 0,1x).
Los ácidos nucleicos ejemplares pueden
caracterizarse alternativamente como las secuencias nucleotídicas
que codifican una proteína PDE_XIV e hibridan con una cualquiera o
más de las secuencias de ADN que se presentan en los listados de
secuencias que se adjuntan. Se prefieren las secuencias que
codifican PDE_XIV que hibridan en condiciones muy rigurosas con una
cualquiera de las secuencias que se presentan en los listados de
secuencias que se adjuntan o de las complementarias de las
mismas.
Ventajosamente, la invención proporciona
secuencias de ácidos nucleicos que son capaces de hibridar, en
condiciones rigurosas, con un fragmento de una cualquiera de las
secuencias que se presentan en los listados de secuencias que se
adjuntan o de las complementarias de las mismas. Preferiblemente, el
fragmento tiene una longitud de entre 15 y 50 bases. Ventajosamente,
es de aproximadamente 25 bases de longitud.
Los términos "variante", "homólogo" o
"fragmento" en relación con la secuencia nucleotídica que
codifica la enzima preferida de la presente invención incluyen
cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo
de, deleción de o adición de uno (o más) ácidos nucleicos de o con
la secuencia que proporciona una secuencia nucleotídica resultante
que codifica o es capaz de codificar una enzima que tenga actividad
PDE_XIV, preferiblemente que sea al menos tan biológicamente activa
como la enzima codificada por una cualquiera de las secuencias que
se presentan en los listados de secuencias que se adjuntan. En
concreto, el término "homólogo" abarca la homología con
respecto a la estructura y/o función que proporciona la secuencia
nucleotídica resultante que codifica o es capaz de codificar una
enzima que tenga actividad PDE_XIV. Con respecto a la homología de
la secuencia, preferiblemente tiene al menos un 75%, más
preferiblemente al menos un 85%, más preferiblemente al menos un
90% de homología con una secuencia nucleotídica que codifica la
secuencia aminoacídica que se presenta como Fórmula I. Más
preferiblemente tiene al menos un 95%, más preferiblemente al menos
un 98% de homología con una secuencia nucleotídica que codifica la
secuencia aminoacídica que se presenta como Fórmula I.
Preferiblemente, con respecto a la homología de la secuencia,
preferiblemente tiene al menos un 75%, más preferiblemente al menos
un 85%, más preferiblemente al menos un 90% de homología con una
cualquiera de las secuencias que se presentan en los listados de
secuencias que se adjuntan. Más preferiblemente tiene al menos un
95%, más preferiblemente al menos un 98%, de homología con una
cualquiera de las secuencias que se presentan en los listados de
secuencias que se adjuntan.
Como se indica, la presente invención se refiere
a una secuencia de ADN (preferiblemente una secuencia de ADNc) que
codifica PDE_XIV. En concreto, la presente invención se refiere a
secuencias de ADNc que codifican PDE_XIV.
La presente invención también se refiere a
segmentos de ADN que comprenden la secuencia de ADN de una
cualquiera de las secuencias que se presentan en los listados de
secuencias que se adjuntan o de variaciones alélicas de tales
secuencias.
La presente invención también se refiere a
polipéptidos que se producen mediante la expresión en una célula
hospedadora en la que se han incorporado las secuencias de ADN
anteriores o variaciones alélicas de las mismas.
La presente invención también se refiere a ADN
que comprende la secuencia de ADN de una cualquiera de las
secuencias que se presentan en los listados de secuencias que se
adjuntan o una variación alélica de la misma.
La presente invención también se refiere a ADN
no nativo que comprende la secuencia de ADN de una cualquiera de
las secuencias que se presentan en los listados de secuencias que se
adjuntan o una variación alélica de la misma.
Un aspecto muy preferido de la presente
invención se refiere a ADN recombinante que comprende la secuencia
de ADN de una cualquiera de las secuencias que se presentan en los
listados de secuencias que se adjuntan o una variación alélica de la
misma.
Los polinucleótidos de la presente invención
incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican los
polipéptidos de la presente invención. Se entenderá que un
intervalo de diferentes polinucleótidos codifican una secuencia
aminoacídica dada como consecuencia de la degeneración del código
genético
Mediante el conocimiento de las secuencias
aminoacídicas que se presentan en este documento, es posible
elaborar secuencias de ácidos nucleicos parciales y completas tales
como ADNc y/o clones genómicos que codifican los polipéptidos de la
presente invención. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente
invención pueden obtenerse usando PCR degenerada que utiliza
cebadores diseñados para dirigirse a secuencias que codifican las
secuencias aminoacídicas que se presentan en este documento. Los
cebadores contendrán típicamente múltiples posiciones degeneradas.
Sin embargo, para minimizar la degeneración, se seleccionarán
secuencias que codifican regiones de las secuencias aminoacídicas
que se presentan en este documento que contengan aminoácidos tales
como metionina que están codificados por un único triplete. Además,
se seleccionarán las secuencias teniendo en cuenta el uso de
codones en el organismo cuyo ácido nucleico se utiliza como molde de
ADN para el procedimiento de PCR. La PCR se utilizará en
condiciones de rigurosidad menores que las utilizadas para la
clonación de secuencias con cebadores de secuencia única (no
degenerados) contra secuencias conocidas.
Las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas
mediante PCR que codifican fragmentos de polipéptidos de la presente
invención pueden utilizarse después para obtener secuencias más
largas usando técnicas de hibridación de examen de bibliotecas. Por
ejemplo, puede marcarse un clon de PCR con átomos radiactivos y
utilizarse para examinar una biblioteca genómica o de ADNc de otra
especie, preferiblemente de otra especie de mamíferos. Las
condiciones de hibridación serán típicamente condiciones de
rigurosidad media a alta (por ejemplo cloruro sódico 0,03 M y
citrato sódico 0,03 M a una temperatura de aproximadamente 50ºC
hasta aproximadamente 60ºC).
Las sondas de ácidos nucleicos degeneradas que
codifican toda o parte de la secuencia aminoacídica pueden también
utilizarse para sondear bibliotecas de ADNc y/o genómicas de otras
especies, preferiblemente de otras especies de mamíferos. Sin
embargo, se prefiere realizar inicialmente técnicas de PCR para
obtener una secuencia sencilla para utilizar en los procedimientos
de selección adicionales.
De acuerdo con la presente invención, las
secuencias polinucleotídicas PDE_XIV que codifican PDE_XIV,
fragmentos del polipéptido, proteínas de fusión o equivalentes
funcionales de las mismas, pueden utilizarse para generar moléculas
de ADN recombinante que dirijan la expresión de PDE_XIV en células
hospedadoras apropiadas. Debido a la degeneración intrínseca del
código genético, otras secuencias de ADN que codifican
sustancialmente la misma o una secuencia aminoacídica
funcionalmente equivalente, pueden utilizarse para clonar y expresar
PDE_XIV. Como entenderán los especialistas en la técnica, puede ser
ventajoso producir secuencias nucleotídicas que codifiquen PDE que
posean codones que no aparecen naturalmente. Los codones preferidos
por un hospedador procariota o eucariota concreto (Murray E y col.
(1989) Nuc Acids Res 17:477-508) pueden
seleccionarse, por ejemplo, para incrementar el índice de expresión
de PDE_XIV o producir transcritos de ARN recombinante que tengan las
propiedades deseadas, tales como
una mayor vida media, que los transcritos que se producen a partir de una secuencia que aparece naturalmente.
una mayor vida media, que los transcritos que se producen a partir de una secuencia que aparece naturalmente.
Las secuencias polinucleotídicas de la presente
invención que se obtienen utilizando las técnicas que se han
descrito anteriormente pueden utilizarse para obtener secuencias
homólogas adicionales y variantes usando las técnicas que se han
descrito anteriormente. Pueden también modificarse para utilizarse
en la expresión de los polipéptidos de la presente invención en una
diversidad de sistemas de células hospedadoras, por ejemplo para
optimizar las preferencias de codón para una célula hospedadora
concreta en la que se expresan las secuencias polinucleotídicas.
Pueden desearse otros cambios en la secuencia a fin de introducir
sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar
las propiedades o la función de los polipéptidos codificados por los
polinucleótidos.
Las secuencias polinucleotídicas PDE_XIV
alteradas que pueden utilizarse de acuerdo con la invención incluyen
las deleciones, inserciones o sustituciones de diferentes restos
nucleotídicos que produzcan un polinucleótido que codifique la
misma o una PDE funcionalmente equivalente. La proteína puede
también tener deleciones, inserciones o sustituciones de restos
aminoacídicos que produzcan un cambio silencioso y que produzcan una
PDE funcionalmente equivalente. Pueden realizarse sustituciones
deliberadas de aminoácidos en base a similitudes en la polaridad,
la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o
la naturaleza anfipática de los restos mientras se mantenga la
actividad biológica de la PDE. Por ejemplo, los aminoácidos cargados
negativamente incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico; los
aminoácidos cargados positivamente incluyen la lisina y la
arginina; y los aminoácidos con grupos principales polares no
cargados que tienen valores similares de hidrofilicidad incluyen la
leucina, la isoleucina, la valina, la glicina, la alanina, la
asparagina, la glutamina, la serina, la treonina, la fenilalanina y
la tirosina.
Los alelos de PDE se incluyen dentro del alcance
de la presente invención. Como se usa en este documento, un
"alelo" o "secuencia alélica" es una forma alternativa de
PDE. Los alelos se producen por una mutación, es decir, un cambio
en la secuencia de ácido nucleico, y generalmente producen ARNm o
polipéptidos alterados cuya estructura o función pueden estar o no
alteradas. Cualquier gen dado puede no tener ninguna, una o muchas
formas alélicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a
alelos se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o
sustituciones de aminoácidos. Cada uno de estos tipos de cambios
pueden aparecer solos, o en combinación con los otros, una o más
veces en una secuencia dada.
El término "alelo" también incluye
polimorfismos genéticos, tales como SNP (polimorfismos de un solo
nucleótido).
Las secuencias nucleotídicas de la presente
invención pueden diseñarse a fin de alterar una secuencia
codificante de PDE por una diversidad de razones, incluyendo pero
sin limitación, alteraciones que modifiquen la clonación, el
procesamiento y/o la expresión del producto génico. Por ejemplo,
pueden introducirse mutaciones usando técnicas que se conocen bien
en la técnica, por ejemplo, la mutagénesis dirigida para insertar
nuevos sitios de restricción, para alterar los patrones de
glicosilación o para cambiar la preferencia de codones.
Los polinucleótidos de la presente invención
pueden utilizarse para producir un cebador, por ejemplo un cebador
de PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa,
una sonda marcada, por ejemplo, con un marcador de revelado por
medios convencionales usando marcadores radiactivos o no
radiactivos, o los polinucleótidos pueden clonarse en vectores.
Tales cebadores, sondas y otros fragmentos serán de al menos 15,
preferiblemente de al menos 20, por ejemplo de al menos 25, 30 ó 40
nucleótidos de longitud, y se incluyen también bajo el término de
polinucleótidos de la presente invención como se usa en este
documento.
Los polinucleótidos o cebadores de la presente
invención pueden llevar un marcador de revelado. Los marcadores
adecuados incluyen radioisótopos tales como ^{32}P o ^{35}S,
marcadores enzimáticos, u otros marcadores proteicos tales como
biotina. Tales marcadores pueden añadirse a los polinucleótidos o
cebadores de la presente invención y pueden detectarse usando las
técnicas que se conocen en sí .
Los polinucleótidos tales como un polinucleótido
de ADN y los cebadores de acuerdo con la presente invención pueden
producirse de manera recombinante, de manera sintética o por
cualquier medio disponible para los especialistas en la técnica.
Pueden también clonarse mediante técnicas convencionales.
En general, los cebadores se producirán por
medios sintéticos, que implican una fabricación progresiva de la
secuencia de ácido nucleico deseada nucleótido por nucleótido. Las
técnicas para conseguir esto utilizando técnicas automatizadas están
fácilmente disponibles en la técnica.
Los polinucleótidos más largos se producirán
generalmente por medios recombinantes, por ejemplo utilizando
técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
Esto implicará la generación de un par de cebadores (por ejemplo,
de aproximadamente 15-30 nucleótidos) para una
región de la secuencia nucleotídica que se desee clonar, la puesta
en contacto de los cebadores con el ARNm o el ADNc obtenido a partir
de células de hongos, plantas o procariotas, la realización de una
reacción en cadena de la polimerasa en condiciones que ocasionen la
amplificación de la región deseada, el aislamiento del fragmento
amplificado (por ejemplo, mediante la purificación de la mezcla de
reacción en un gel de agarosa) y la recuperación del ADN
amplificado. Los cebadores pueden diseñarse para que contengan
sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados de tal
modo que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación
adecuado.
Las moléculas de ADN pueden modificarse para
incrementar su estabilidad intracelular y su vida media. Las
posibles modificaciones incluyen, pero sin limitación, la adición de
secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3' de la molécula o
el uso de fosforotioato o 2' O-metilo en lugar de
enlaces fosfodiéster dentro de la estructura de la molécula.
Como se ha mencionado anteriormente, la presente
invención también se refiere a secuencias nucleotídicas que son
capaces de hibridar con toda o parte de una cualquiera de las
secuencias que se presentan en los listados de secuencias que se
adjuntan o con una variación alélica de la misma. Estas secuencias
nucleotídicas pueden usarse en técnicas antisentido para modificar
la expresión de PDE_XIV. Como alternativa, estas secuencias (o
porciones de las mismas) pueden utilizarse como sondas, o para la
amplificación de toda o parte de tal secuencia cuando se usan como
cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa.
Además de las secuencias de ADN recombinante,
las secuencias genómicas son también de utilidad en el contexto del
descubrimiento de fármacos. Puede ser más valioso inhibir la
transcripción de ARNm de una isoforma concreta que inhibir su
proteína traducida. Esto puede ser cierto para PDE_XIV, si hay
variantes de corte y empalme y donde esas variantes de corte y
empalme diferentes pueden transcribirse a partir de diferentes
promotores. Hay precedentes de múltiples promotores que dirigen la
transcripción de la 2',3'-nucleótido cíclico
3'-fosfodiesterasa del cerebro de ratón (Kurihara T
y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 170:1074 [1990]).
Otra utilidad de la invención es que las
secuencias de ADN, una vez conocidas, proporcionan la información
necesaria para diseñar ensayos para detectar específicamente
isoenzimas o variantes de corte y empalme. Pares de cebadores de
PCR específicos de isozima no son sino un ejemplo de un ensayo que
depende completamente del conocimiento de la secuencia de ADN
específica de la isozima o de la variante de corte y empalme. Un
ensayo de este tipo permite la detección de ARNm para la isozima
para evaluar la distribución tisular y la importancia biológica de
cada isozima en una patología concreta. También permite la
identificación de líneas celulares que puedan expresar de manera
natural una única isozima -un descubrimiento que obviaría la
necesidad de expresar genes recombinantes. Si se demuestra que
isozimas específicas de PDE_XIV están asociadas con una patología
concreta, la invención sería valiosa en el diseño de ensayos
diagnósticos para detectar la presencia de ARNm de la isozima.
Un nivel anormal de secuencias nucleotídicas que
codifican una PDE_XIV en una muestra biológica puede reflejar una
aberración cromosómica, tal como una deleción de un ácido nucleico o
una mutación. Por consiguiente, las secuencias nucleotídicas que
codifican una PDE_XIV proporcionan la base para sondas que pueden
usarse de manera diagnóstica para detectar aberraciones
cromosómicas tales como deleciones, mutaciones o translocaciones
cromosómicas en el gen que codifica la PDE. La expresión génica de
PDE_XIV puede alterarse en tales patologías o puede haber presente
una aberración cromosómica en la región del gen que codifica una
PDE_XIV.
En una realización alternativa de la invención,
la secuencia codificante de PDE pudo sintetizarse, en su totalidad
o en parte, usando procedimientos químicos que se conocen bien en la
técnica (véase Caruthers MH y col. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser
215-23, Horn T y col. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser
225-232).
Como se usa en este documento, la expresión
"que aparece naturalmente" se refiere a una PDE_XIV con una
secuencia aminoacídica que se encuentra en la naturaleza.
Como se usan en este documento, los términos
"aislada" y "purificada" se refieren a moléculas, o a
secuencias de ácidos nucleicos o a secuencias de aminoácidos, que
se retiran de su entorno natural y se aíslan o separan de al menos
otro componente con el que están naturalmente asociadas.
Como se usa en este documento, la expresión
"biológicamente activa" se refiere a una PDE_XIV de acuerdo con
la presente invención -tal como una PDE_XIV recombinante- que tiene
una función estructural similar (pero no necesariamente en el mismo
grado), y/o una función reguladora similar (pero no necesariamente
en el mismo grado), y/o una función bioquímica similar (pero no
necesariamente en el mismo grado) y/o una actividad inmunológica
similar (pero no necesariamente en el mismo grado) que la PDE_XIV
que aparece naturalmente. En concreto, una PDE_XIV de la presente
invención tiene la capacidad de hidrolizar un nucleótido cíclico,
que es una de las actividades características de la enzima PDE de la
presente invención.
Como se usa en este documento, la "actividad
inmunológica" se define como la capacidad de la PDE_XIV natural,
recombinante o sintética o de cualquier oligopéptido de la misma,
para inducir una respuesta inmune específica en animales o células
apropiadas y unirse con anticuerpos específicos.
El término "derivado" como se usa en este
documento en relación con la secuencia aminoacídica incluye la
modificación química de una PDE_XIV. El reemplazo de un hidrógeno
por un grupo alquilo, acilo o amino sería ilustrativo de tales
modificaciones.
Como se usa en este documento, una
"deleción" se define como un cambio en una secuencia o
nucleotídica o aminoacídica en el que uno o más nucleótidos o
restos aminoacídicos, respectivamente, están ausentes.
Como se usa en este documento, una
"inserción" o "adición" es un cambio en una secuencia
nucleotídica o aminoacídica que tiene como resultado la adición de
uno o más nucleótidos o restos aminoacídicos, respectivamente, en
comparación con la PDE que aparece naturalmente.
\newpage
Como se usa en este documento, una
"sustitución" se produce por el reemplazo de uno o más
nucleótidos o aminoácidos por diferentes nucleótidos o aminoácidos,
respectivamente.
El término "homólogo" con respecto a la
secuencia nucleotídica de la presente invención y a la secuencia
aminoacídica de la presente invención puede ser sinónimo de las
variaciones alélicas de las secuencias.
En concreto, el término "homología" como se
usa en este documento puede equipararse al término "identidad".
En este documento, la homología de la secuencia con respecto a la
secuencia nucleotídica de la presente invención y a la secuencia
aminoacídica de la presente invención puede determinarse mediante
comparación sencilla "visual" (es decir, una comparación
rigurosa) de una cualquiera o más de las secuencias con otra
secuencia para ver si esa otra secuencia tiene al menos un 75% de
identidad con la(s) secuencia(s). La homología
relativa de secuencias (es decir, la identidad de secuencias) puede
también determinarse mediante programas de ordenador disponibles en
el mercado que pueden calcular el % de homología entre dos o más
secuencias. Un ejemplo típico de tales programas de ordenador es el
CLUSTAL.
El % de homología puede calcularse sobre
secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra
secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente
con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, resto por
resto. Éste se denomina alineamiento "sin huecos". Típicamente,
tales alineamientos sin huecos se realizan sólo sobre un número
relativamente pequeño de restos (por ejemplo menos de 50 aminoácidos
contiguos).
Aunque éste es un procedimiento muy sencillo y
constante, no tiene en cuenta que, por ejemplo, en una pareja de
secuencias en otras circunstancias idénticas, una inserción o
deleción ocasionará que los restos aminoacídicos siguientes queden
fuera del alineamiento, produciendo por lo tanto potencialmente una
gran reducción en el % de homología cuando se realice un
alineamiento global. Por consiguiente, la mayoría de los
procedimientos de comparación de secuencias se diseñan para
producir alineamientos óptimos que tienen en cuenta posibles
inserciones y deleciones sin penalizar excesivamente la puntuación
de homología total. Esto se consigue mediante la inserción de
"huecos" en el alineamiento de secuencias para intentar
maximizar la homología local.
Sin embargo, estos procedimientos más complejos
asignan "penalizaciones por huecos" a cada hueco que aparece
en el alineamiento de tal modo que, para el mismo número de
aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencias con el menor
número de huecos posible -reflejando una mayor relación entre las
dos secuencias comparadas- alcanzará una puntuación más alta que
otra con muchos huecos. Típicamente se usan "valores de huecos
afines" que penalizan con un valor relativamente alto la
existencia de un hueco y una penalización menor para cada resto
posterior al hueco. Éste es el sistema de puntuación de huecos más
comúnmente utilizado. Las penalizaciones por huecos elevadas
producirán naturalmente alineamientos con menos huecos. La mayoría
de los programas de alineamiento permiten modificar las
penalizaciones por huecos. Sin embargo, se prefiere utilizar los
valores por defecto cuando se utiliza tal software para la
comparación de secuencias. Por ejemplo, cuando se usa el paquete
GCG Wisconsin Bestfit (véase más adelante), la penalización por
huecos por defecto para secuencias aminoacídicas es de -12 para un
hueco y de -4 para cada extensión.
El cálculo del % máximo de homología requiere,
por lo tanto, en primer lugar, la producción de un alineamiento
óptimo, teniendo en cuenta las penalizaciones por huecos. Un
programa de ordenador adecuado para realizar un alineamiento de
este tipo es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de
Wisconsin, EEUU; Devereux y col., 1984, Nucleic Acids Research
12:387). Los ejemplos de otros software que pueden realizar
comparaciones de secuencias incluyen, pero sin limitación, el
paquete BLAST (véase Ausubel y col., 1999 ibídem - Capítulo 18),
FASTA (Atschul y col., 1990, J. Mol. Biol., 403-410)
y la serie de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST
como FASTA están disponibles para búsquedas tanto en línea como
fuera de línea (véase Ausubel y col., 1999 ibídem, páginas
7-58 a 7-60). Sin embargo, para
algunas aplicaciones se prefiere utilizar el programa GCG
Bestfit.
Aunque el % final de homología puede medirse en
cuanto a la identidad, en algunos casos, el procedimiento de
alineamiento mismo no se basa típicamente en una comparación de
parejas todo o nada. En cambio, se utiliza generalmente una matriz
escalar de puntuaciones de similitud que asigna valores a cada
pareja de comparaciones basándose en su similitud química o en la
distancia evolutiva. Un ejemplo de tal matriz que se utiliza
comúnmente es la matriz BLOSUM62 -la matriz por defecto en la serie
de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin utilizan
generalmente los valores públicos por defecto o una tabla de
comparación de símbolos habitual si se suministra (véase el manual
de usuario para detalles adicionales). Se prefiere utilizar los
valores públicos por defecto para el paquete GCG, o en el caso de
otros software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
Una vez que el software produce un alineamiento
óptimo, es posible calcular el % de homología, preferiblemente el %
de identidad de las secuencias. El software típicamente realiza esto
como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado
numérico.
Como se indica, para algunas aplicaciones, la
homología de secuencias (o identidad) puede determinarse usando
cualquier algoritmo de homología adecuado, utilizando por ejemplo
los parámetros por defecto. El algoritmo BLAST se emplea de manera
provechosa fijando los parámetros en los valores por defecto. El
algoritmo BLAST se describe con detalle en
http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html. Los parámetros de
búsqueda se definen como sigue, y se fijan de manera provechosa en
los parámetros por defecto definidos. De manera ventajosa, cuando
BLAST calcula una "homología sustancial" se identifica con
secuencias que se corresponden con un valor ESPERADO de al menos
aproximadamente 7, preferiblemente de al menos aproximadamente 9 y
más preferiblemente de 10 o más. El umbral por defecto para el
valor ESPERADO en la búsqueda BLAST es normalmente 10.
BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineamientos
Locales Básicos) es el algoritmo heurístico de búsqueda que emplean
los programas blastp, blastn, blastx, tblastn, y tblastx; estos
programas atribuyen significación a sus resultados usando los
procedimientos estadísticos de Karlin y Altschul (véase
http://www.ncbi.nih.govBLAST/blast_help.html) con algunas mejoras.
Los programas BLAST se confeccionaron para la búsqueda de
similitudes de secuencias, por ejemplo para identificar homólogos
de una secuencia consulta. Los programas no son útiles generalmente
para la búsqueda de tipos de motivos. Para una discusión sobre
cuestiones básicas de la búsqueda de similitud en las bases de
datos de secuencias, véase Altschul y col. (1994) Nature Genetics
6:119-129.
Los cinco programas BLAST disponibles en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov realizan las siguientes tareas:
- blastp
- compara una secuencia aminoacídica consulta con una base de datos de secuencias proteicas;
- blastn
- compara una secuencia nucleotídica consulta con una base de datos de secuencias nucleotídicas;
- blastx
- compara los productos de traducción de las seis fases de lectura conceptuales de una secuencia nucleotídica consulta (ambas cadenas) con una base de datos de secuencias proteicas;
- tblastn
- compara una secuencia proteica consulta con una base de datos de secuencias nucleotídicas dinámicamente traducidas en sus seis posibles fases de lectura (ambas cadenas);
- tblastx
- compara las traducciones de las seis fases de lectura de una secuencia nucleotídica consulta con las traducciones de las seis fases de lectura de una base de datos de secuencias nucleotídicas.
BLAST utiliza los siguientes parámetros de
búsqueda:
HISTOGRAMA. Muestra un histograma de
puntuaciones para cada búsqueda; el valor por defecto es sí. (Véase
el parámetro H en el Manual de BLAST).
DESCRIPCIONES. Restringe el número de
descripciones cortas de secuencias emparejadas que se presentan al
número que se especifica; el límite por defecto es de 100
descripciones. (Véase el parámetro V en la página del manual).
Véanse también ESPERADO y LÍMITE.
ALINEAMIENTOS. Restringe las secuencias de bases
de datos al número que se especifica para las que se presentan
emparejamientos de segmentos de alta puntuación (HSP); el límite por
defecto es 50. Si más de estas secuencias de bases de datos
alcanzan el umbral de significación estadística para presentarse
(véanse ESPERADO y LÍMITE más adelante), sólo se presentan los
emparejamientos con la mayor significación estadística. (Véase el
parámetro B en el Manual BLAST).
ESPERADO. El umbral de significación estadística
para presentar emparejamientos con secuencias de bases de datos; su
valor por defecto es 10, tal que se espera encontrar 10
emparejamientos meramente por azar, de acuerdo con el modelo
estocástico de Karlin y Altschul (1990). Si la significación
estadística que se atribuye a un emparejamiento es mayor que el
umbral ESPERADO, el emparejamiento no se presentará. Los umbrales
ESPERADOS más bajos son más rigurosos, lo que conduce a una menor
presentación de emparejamientos por azar. Se aceptan valores
fraccionarios (Véase el parámetro E en el Manual BLAST).
LÍMITE. La puntuación límite para presentar
segmentos emparejados de alta puntuación. El valor por defecto se
calcula a partir del valor ESPERADO (véase anteriormente). Los HSP
se presentan para una secuencia de base de datos sólo si la
significación estadística que se les atribuye es al menos tan alta
como la que se atribuiría a un HSP solitario que tuviera una
puntuación equiparable al valor LÍMITE. Valores LIMITE más altos son
más estrictos, lo que conduce a una menor presentación de
emparejamientos por azar. (Véase el parámetro S en el Manual
BLAST). Típicamente, los umbrales de significación pueden manejarse
más intuitivamente usando ESPERADO.
MATRIZ. Especifica una matriz de puntuación
alternativa para BLASTP, BLASTX, TBLASTN y TBLASTX. La matriz por
defecto es BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff, 1992). Las opciones
alternativas válidas incluyen: PAM40, PAM120, PAM250 e IDENTIDAD.
No hay matrices de puntuación alternativas para BLASTN; especificar
la directiva MATRIZ en las consultas BLASTN devuelve una respuesta
error.
CADENA. Restringe una búsqueda TBLASTN a sólo la
cadena superior o inferior de las secuencias de bases de datos; o
restringe una búsqueda BLASTN, BLASTX o TBLASTX a sólo las fases de
lectura en la cadena superior o inferior de la secuencia
consulta.
FILTRO. Desenmascara segmentos de la secuencia
consulta que tienen una baja complejidad de composición, como se
determina con el programa SEG de Wootton y Federhen (1993) Computers
and Chemistry 17:149-163, o segmentos que consisten
en repeticiones internas de baja periodicidad, como se determina con
el programa XNU de Claverie y States (1993) Computers and Chemistry
17:191-201, o, para BLASTN, mediante el programa
DUST de Tatusov y Lipman (véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov). El
filtrado puede eliminar entradas estadísticamente significativas
pero biológicamente no interesantes del resultado del blast (por
ejemplo, coincidencias con regiones ácidas, básicas o ricas en
prolina comunes), dejando las regiones más biológicamente
interesantes disponibles para el emparejamiento específico con
secuencias de bases de datos.
Las secuencias de baja complejidad que encuentra
un programa filtro se sustituyen usando la letra "N" en las
secuencias nucleotídicas (por ejemplo, "NNNNNNNNNNNNN") y la
letra "X" en las secuencias proteicas (por ejemplo,
"XXXXXXXXX").
El filtrado sólo se aplica a la secuencia
consulta (o a sus productos de traducción), no a las secuencias de
bases de datos. El filtrado por defecto es DUST para BLASTN, SEG
para otros programas.
No es nada raro que esté enmascarado por SEG,
XNU, o ambos, cuando se aplica a secuencias en el
SWISS-PROT, por lo que no debe esperarse que el
filtrado produzca siempre un efecto. Además, en algunos casos, las
secuencias están enmascaradas en su totalidad, indicando que
debería dudarse de la significación estadística de cualquier
emparejamiento con la consulta no filtrada que se presente.
NCBI-gi. Origina identificadores
NCBI gi para mostrar en el resultado, además del nombre de acceso
y/o del locus.
Más preferiblemente, las comparaciones de
secuencias se realizan usando el algoritmo simple de búsqueda BLAST
que se proporciona en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.
Si se utilizan Penalizaciones por Huecos en la
determinación de la identidad de secuencias, entonces se usan
preferiblemente los siguientes parámetros:
\vskip1.000000\baselineskip
Otros procedimientos de programas de ordenador
para determinar la identidad y la similitud entre las dos secuencias
incluyen pero sin limitación el paquete de programas GCG (Devereux y
col. 1984 Nucleic Acids Research 12: 387) y FASTA (Atschul y col.
1990 J Molec Biol 403-410).
Los términos "variante" o "derivado"
en relación con las secuencias aminoacídicas de la presente
invención incluyen cualquier sustitución de, variación de,
modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de uno (o más)
aminoácidos de o con la secuencia que proporciona la secuencia
aminoacídica resultante que tiene actividad PDE, preferiblemente
que tenga al menos la misma actividad que uno cualquiera de los
polipéptidos que se presentan en los listados de secuencias.
Las secuencias de la presente invención pueden
modificarse para su uso en la presente invención. Típicamente, se
realizan modificaciones que mantienen la actividad PDE de la
secuencia. Pueden realizarse sustituciones aminoacídicas, por
ejemplo desde 1, 2 ó 3 hasta 10, 20 ó 30 sustituciones, siempre que
la secuencia modificada mantenga la actividad PDE. Las
sustituciones aminoacídicas pueden incluir el uso de análogos que no
aparecen naturalmente, por ejemplo para incrementar la vida media
en el plasma sanguíneo de un polipéptido que se administre
terapéuticamente.
Pueden realizarse sustituciones conservativas,
por ejemplo de acuerdo con la Tabla presentada a continuación. Los
aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y
preferiblemente en la misma línea en la tercera columna pueden
sustituirse unos por otros.
Como se ha indicado anteriormente, las proteínas
de la invención se realizan típicamente por medios recombinantes,
por ejemplo como se describen en este documento, y/o mediante el uso
de medios sintéticos que utilizan técnicas bien conocidas por los
especialistas tales como la síntesis en fase sólida. Las variantes y
derivados de tales secuencias incluyen las proteínas de fusión,
donde las proteínas de fusión contienen al menos la secuencia
aminoacídica de la presente invención unida (directa o
indirectamente) a otra secuencia aminoacídica. Estas otras
secuencias aminoacídicas -a las que se hace referencia a veces como
proteínas acompañantes de proteínas de fusión- le conferirán
típicamente una funcionalidad favorable -tal como facilitar la
extracción y purificación de la secuencia aminoacídica de la
presente invención. Los ejemplos de proteínas acompañantes de
proteínas de fusión incluyen la
glutatión-S-transferasa (GST), la
6xHis, la GAL4 (dominios de unión a ADN y/o de activación
transcripcional) y la \beta-galactosidasa. Puede
también ser conveniente incluir un sitio de escisión proteolítica
entre la proteína acompañante de la proteína de fusión y la
secuencia proteica de la presente invención de tal modo que permita
la retirada de ésta última. Preferiblemente, la proteína acompañante
de la proteína de fusión no obstaculizará la función de la proteína
de la presente
invención.
invención.
Los términos "variante" o "derivado"
en relación con la secuencia nucleotídica de la presente invención
incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de,
reemplazo de, deleción de o adición de uno (o más) ácidos nucleicos
de o con la secuencia que proporciona la secuencia nucleotídica
resultante que codifica un polipéptido que tiene actividad PDE,
preferiblemente que tenga al menos la misma actividad que las
secuencias que se presentan en los listados de secuencias.
Como se ha indicado anteriormente, en cuanto a
la homología de secuencia, preferiblemente tienen al menos un 75%,
más preferiblemente al menos un 85%, más preferiblemente al menos un
90% de homología con las secuencias que se presentan en los
listados de secuencias de este documento. Más preferiblemente tienen
al menos un 95%, más preferiblemente al menos un 98%, de homología.
Las comparaciones de homología de nucleótidos pueden realizarse
como se ha descrito anteriormente. Para algunas aplicaciones, un
programa de comparación de secuencias preferido es el programa GCG
Wisconsin Bestfit que se ha descrito anteriormente. La matriz de
puntuaciones por defecto tiene un valor de emparejamiento de 10
para cada nucleótido idéntico y de -9 para cada mal emparejamiento.
La penalización por generación de huecos por defecto es de -50 y la
penalización por cada extensión de huecos es de -3 para cada
nucleótido.
Como se usan en este documento, los términos
"variante", "homólogo", "fragmento" y "derivado"
incluyen las variaciones alélicas de las secuencias.
El término "variante" también incluye las
secuencias que son complementarias a las secuencias que son capaces
de hibridar con las secuencias nucleotídicas que se presentan en
este documento.
El término "hibridación", como se utiliza
en este documento, debe incluir "el procedimiento por el cual una
cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a
través del emparejamiento de bases" (Coombs J (1994) Dictionary
of Biotechnology, Stockton Press, New York, NY) así como el
procedimiento de amplificación que se lleva a cabo en las
tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa como se describe
en Dieffenbach CW y GS Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY).
Las condiciones de hibridación se basan en la
temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión de ácidos
nucleicos, como se enseña en Berger y Kimmel (1987, Guide to
Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152,
Academic Press, San Diego CA), y confieren una "rigurosidad"
definida como se explica más adelante.
La rigurosidad de la hibridación se refiere a
las condiciones en las cuales los híbridos de ácidos polinucleicos
son estables. Tales condiciones son evidentes para los especialistas
en el campo. Como conocen los especialistas en la técnica, la
estabilidad de los híbridos se refleja en la temperatura de fusión
(Tm) del híbrido que desciende aproximadamente de 1 a 1,5ºC con
cada descenso del 1% en la homología de la secuencia. En general,
la estabilidad de un híbrido es una función de la concentración del
ión sodio y de la temperatura. Típicamente, la reacción de
hibridación se realiza en condiciones de mayor rigurosidad, seguida
de lavados de rigurosidad variable.
Como se usa en este documento, una rigurosidad
alta se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de
sólo las secuencias de ácidos nucleicos que formen híbridos estables
en Na+ 1 M a 65-68ºC.
La rigurosidad máxima se produce típicamente a
una Tm de aproximadamente -5ºC (5ºC por debajo de la Tm de la
sonda).
Una rigurosidad alta se produce a una
temperatura de aproximadamente 5ºC a 10ºC por debajo de la Tm de la
sonda. Pueden proporcionarse condiciones de rigurosidad alta, por
ejemplo, mediante la hibridación en una solución acuosa que
contenga SSC 6x, Denhardt 5x, SDS al 1% (dodecil sulfato sódico),
pirofosfato Na+ 0,1 y 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado como competidor inespecífico. Después de la
hibridación, pueden realizarse lavados de rigurosidad alta en
varias etapas, con un lavado final (de aproximadamente 30 min) a la
temperatura de hibridación en SSC 0,2-0,1x, SDS al
0,1%.
Moderada o intermedia, la rigurosidad
típicamente se produce a aproximadamente 10ºC a 20ºC por debajo de
la Tm de la sonda.
Una rigurosidad baja aparece típicamente a
aproximadamente 20ºC a 25ºC por debajo de la Tm de la sonda.
Como entenderán los especialistas en la técnica,
puede utilizarse una rigurosidad de hibridación máxima para
identificar o detectar secuencias polinucleotídicas idénticas
mientras que una rigurosidad intermedia (o baja) de hibridación
puede utilizarse para identificar o detectar secuencias
polinucleotídicas similares o relacionadas.
Una rigurosidad moderada se refiere a
condiciones equivalentes a la hibridación en la solución descrita
anteriormente pero a aproximadamente 60-62ºC. En
este caso el lavado final se realiza a la temperatura de hibridación
en SSC 1x, SDS al 0,1%.
Una rigurosidad baja se refiere a condiciones
equivalentes a la hibridación en la solución descrita anteriormente
a aproximadamente 50-52ºC. En este caso, el lavado
final se realiza a la temperatura de hibridación en SSC 2x, SDS al
0,1%.
Para algunas aplicaciones, puede ser útil usar
unas condiciones de rigurosidad baja a media para identificar
secuencias codificantes de enzimas similares de organismos
diferentes.
Se entiende que estas condiciones pueden
adaptarse y repetirse utilizando una variedad de tampones, por
ejemplo tampones a base de formamida, y temperaturas. La solución
de Denhardt y el SSC son bien conocidos por los especialistas en la
técnica así como otros tampones de hibridación adecuados (véase, por
ejemplo, Sambrook y col., eds. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York o
Ausubel y col., eds. (1990) Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, Inc.). Las condiciones óptimas de
hibridación tienen que determinarse empíricamente, ya que la
longitud y el contenido de GC de la sonda también desempeñan un
papel.
Los polinucleótidos de la invención capaces de
hibridar selectivamente con las secuencias nucleotídicas que se
presentan en este documento, o con sus complementarias, tendrán
generalmente al menos un 70%, preferiblemente al menos un 80 ó 90%
y más preferiblemente al menos un 95% ó 98% de homología con las
secuencias nucleotídicas correspondientes que se presentan en este
documento sobre una región de al menos 20, preferiblemente de al
menos 25 ó 30, por ejemplo de al menos 40, 60 ó 100 o más
nucleótidos contiguos.
El término "hibridable de forma selectiva"
significa que el polinucleótido que se usa como sonda se utiliza en
condiciones en las que se observa que un polinucleótido diana de la
invención hibrida con la sonda a un nivel significativamente por
encima del fondo. La hibridación de fondo puede ocurrir porque estén
presentes otros polinucleótidos, por ejemplo, en la biblioteca de
ADNc o de ADN genómico que se está examinando. En este caso, el
fondo implica un nivel de señal que se genera por la interacción
entre la sonda y un miembro inespecífico de ADN de la biblioteca
que es menor que 10 veces, preferiblemente menor que 100 veces la
intensidad de la interacción específica que se observa con el ADN
diana. La intensidad de la interacción puede medirse, por ejemplo,
radiomarcando la sonda, por ejemplo con ^{32}P.
\newpage
En un aspecto preferido, la presente invención
incluye las secuencias nucleotídicas que pueden hibridar con una
cualquiera o más de las secuencias nucleotídicas de la presente
invención en condiciones rigurosas (por ejemplo, 60ºC y SSC 0,2x
{SSC 1x = NaCl 0,15 M, citrato de Na_{3} 0,015 M a pH 7,0}).
En un aspecto más preferido, la presente
invención incluye las secuencias nucleotídicas que pueden hibridar
con una cualquiera o más de las secuencias nucleotídicas de la
presente invención en condiciones de rigurosidad alta (por ejemplo,
65ºC y SSC 0,1x {SSC 1x = NaCl 0,15 M, citrato de Na_{3} 0,015 M a
pH 7,0}).
Cuando el polinucleótido de la presente
invención es de doble cadena, ambas cadenas del dúplex, o
individualmente o en combinación, se incluyen en la presente
invención. Cuando el polinucleótido es de cadena sencilla, debe
entenderse que la secuencia complementaria de ese polinucleótido se
incluye también dentro del alcance de la presente invención.
Los polinucleótidos que no tienen una homología
del 100% con las secuencias de la presente invención pero que están
dentro del alcance de la invención pueden obtenerse de varias
formas. Otras variantes de las secuencias que se describen en este
documento pueden obtenerse, por ejemplo, sondeando bibliotecas de
ADN generadas a partir de una serie de individuos, por ejemplo
individuos de poblaciones diferentes. Además, pueden obtenerse
otros homólogos virales/bacterianos, o celulares, particularmente
homólogos celulares que se encuentran en las células de mamíferos
(por ejemplo, células de rata, de ratón, bovinas o de primates), y
tales homólogos y fragmentos de los mismos en general serán capaces
de hibridar de forma selectiva con las secuencias que se presentan
en los listados de secuencias de este documento. Tales secuencias
pueden obtenerse sondeando bibliotecas de ADNc generadas a partir
de o bibliotecas de ADN genómico de otras especies animales, y
sondeando tales bibliotecas con sondas que contienen toda o parte
de una cualquiera de las secuencias de los listados de secuencias
que se adjuntan en condiciones de rigurosidad media o alta. Se
aplican consideraciones similares a la obtención de homólogos de
especie y variantes alélicas del polipéptido o de las secuencias
nucleotídicas de la invención.
También pueden obtenerse variantes y homólogos
de variedad/especie usando PCR degenerada que utilizará cebadores
diseñados para dirigirse a secuencias dentro de las variantes y
homólogos que codifican secuencias aminoacídicas conservadas dentro
de las secuencias de la presente invención. Las secuencias
conservadas pueden predecirse, por ejemplo, mediante el
alineamiento de las secuencias aminoacídicas de diversos
variantes/homólogos. Los alineamientos de secuencias pueden
realizarse usando un software de ordenador conocido en la técnica.
Por ejemplo el programa GCG Wisconsin PileUp se utiliza mucho
Los cebadores que se utilizan en la PCR
degenerada contendrán una o más posiciones degeneradas y se
utilizarán en condiciones de rigurosidad menores que las que se
usan para clonar secuencias con cebadores de secuencia única contra
secuencias conocidas.
Como alternativa, tales polinucleótidos pueden
obtenerse mediante mutagénesis dirigida de secuencias
caracterizadas. Esto puede ser útil cuando, por ejemplo, las
secuencias requieren cambios silenciosos de codones para optimizar
las preferencias de codón para una célula hospedadora concreta en la
que se expresan las secuencias polinucleotídicas. Pueden desearse
otros cambios en la secuencia a fin de introducir sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar las
propiedades o la función de los polipéptidos codificados por los
polinucleótidos.
Los polinucleótidos de la invención pueden
utilizarse para producir un cebador, por ejemplo un cebador de PCR,
un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda
marcada, por ejemplo, con un marcador de revelado por medios
convencionales usando marcadores radiactivos o no radiactivos, o los
polinucleótidos pueden clonarse en vectores. Tales cebadores,
sondas y otros fragmentos tendrán una longitud de al menos 15,
preferiblemente de al menos 20, por ejemplo de al menos 25, 30 ó 40
nucleótidos, y se incluyen también bajo el término de
polinucleótidos de la invención como se utiliza en este
documento.
Los polinucleótidos tales como polinucleótidos
de ADN y las sondas de acuerdo con la invención pueden producirse
por medios recombinantes, sintéticos o por cualquier medio
disponible para los especialistas en la técnica. También pueden
clonarse mediante técnicas convencionales.
En general, los cebadores se producirán por
medios sintéticos, implicando una fabricación progresiva de la
secuencia de ácidos nucleicos deseada nucleótido por nucleótido. Las
técnicas para realizar esto usando técnicas automatizadas están
fácilmente disponibles en la técnica.
Los polinucleótidos más largos se producirán
generalmente usando medios recombinantes, por ejemplo usando
técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
Esto implica la generación de un par de cebadores (por ejemplo, de
aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanqueen la región de la
secuencia lipídica diana que se desea clonar, la puesta en contacto
de los cebadores con el ARNm o el ADNc obtenido de una célula
animal o humana, la realización de la reacción en cadena de la
polimerasa en condiciones que provocan la amplificación de la
región deseada, el aislamiento del fragmento amplificado (por
ejemplo, mediante la purificación de la mezcla de reacción en un
gel de agarosa) y la recuperación del ADN amplificado. Los
cebadores pueden diseñarse para que contengan sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción adecuados de tal modo que
el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación
adecuado.
Preferiblemente, el polinucleótido de la
presente invención está unido operativamente a una secuencia
reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la
secuencia codificante, tal como por la célula hospedadora
seleccionada. A modo de ejemplo, la presente invención incluye un
vector que contiene el polinucleótido de la presente invención
unido operativamente a tal secuencia reguladora, es decir, el vector
es un vector de expresión.
El término "unido operativamente" se
refiere a una yuxtaposición en la que los componentes que se
describen están en una relación que les permite funcionar de la
manera que se pretende. Una secuencia reguladora "unida
operativamente" a una secuencia codificante está unida de tal
manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en
condiciones compatibles con las secuencias control.
El término "secuencias reguladoras" incluye
promotores y potenciadores y otras señales de regulación de la
expresión.
El término "promotor" se utiliza en su
sentido normal en la técnica, por ejemplo un sitio de unión para una
ARN polimerasa.
La expresión aumentada del polinucleótido que
codifica el polipéptido de la presente invención puede también
conseguirse mediante la selección de regiones reguladoras
heterólogas, por ejemplo, regiones promotoras, líder de secreción y
regiones de terminación, que sirven para incrementar la expresión y,
si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés a
partir del hospedador de expresión elegido y/o para proporcionar un
control inducible de la expresión del polipéptido de la presente
invención.
Preferiblemente, la secuencia nucleotídica de la
presente invención puede estar unida operativamente a al menos un
promotor.
Aparte del promotor nativo del gen que codifica
el polipéptido de la presente invención, pueden utilizarse otros
promotores para dirigir la expresión del polipéptido de la presente
invención. El promotor puede seleccionarse por su eficacia en la
dirección de la expresión del polipéptido de la presente invención
en el hospedador de expresión deseado.
En otra realización, puede seleccionarse un
promotor constitutivo para dirigir la expresión del polipéptido
deseado de la presente invención. Tal construcción de expresión
puede proporcionar ventajas adicionales ya que evita la necesidad de
cultivar hospedadores de expresión en un medio que contenga un
sustrato inductor.
Son ejemplos de potentes promotores
constitutivos y/o inducibles que se prefieren para el uso en
hospedadores de expresión fúngicos los que pueden obtenerse de los
genes fúngicos para los promotores de xilanasa (xlnA),
fitasa, ATP-sintetasa, subunidad 9 (oliC),
triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa
(AdhA), \alpha-amilasa (amy),
amiloglucosidasa (AG -del gen glaA), acetamidasa
(amdS) y
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (gpd).
Son ejemplos de promotores de levaduras potentes
los que pueden obtenerse de los genes para la alcohol
deshidrogenasa, la lactasa, la 3-fosfoglicerato
quinasa y la triosa fosfato isomerasa.
Son ejemplos de promotores bacterianos potentes
los promotores de la \alpha-amilasa y de
SP02 así como promotores de genes de proteasas
extracelulares.
Pueden también usarse promotores híbridos para
mejorar la regulación inducible de la construcción de expresión.
El promotor puede incluir adicionalmente
características que aseguren o incrementen la expresión en un
hospedador adecuado. Por ejemplo, las características pueden ser
regiones conservadas tales como una caja Pribnow o una caja TATA.
El promotor puede incluso contener otras secuencias que afecten (tal
como que mantengan, aumenten o disminuyan) los niveles de expresión
de la secuencia nucleotídica de la presente invención. Por ejemplo,
otras secuencias adecuadas incluyen el intrón Shl o un intrón ADH.
Otras secuencias incluyen elementos inducibles -tales como
elementos inducibles de temperatura, químicos, de luz o estrés.
Además, pueden estar presentes elementos adecuados para potenciar
la transcripción o la traducción. Un ejemplo de este último elemento
es la secuencia señal 5' de TMV (véase Sleat Gene 217 [1987]
217-225; y Dawson Plant Mol. Biol. 23 [1993]
97).
Con frecuencia, es deseable que el polipéptido
de la presente invención se secrete a partir del hospedador de
expresión al medio de cultivo de donde el polipéptido de la presente
invención puede recuperarse más fácilmente. De acuerdo con la
presente invención, la secuencia líder de secreción puede
seleccionarse en base al hospedador de expresión deseado. Pueden
usarse también secuencias señal híbridas en el contexto de la
presente invención.
Son ejemplos típicos de secuencias líder de
secreción heterólogas las que se obtienen del gen de la
amiloglucosida fúngica (AG) (glaA -tanto las versiones de 18
como las de 24 aminoácidos, por ejemplo, de Aspergillus), del
gen del factor \alpha (de levaduras, por ejemplo
Saccharomyces y Kluyveromyces) o del gen de la
\alpha-amilasa (Bacillus).
El término "construcción" -que es sinónimo
de términos tales como "conjugado", "casete" e
"híbrido"- incluye la secuencia nucleotídica de acuerdo con la
presente invención directa o indirectamente unida a un promotor. Un
ejemplo de una unión indirecta es el suministro de un grupo
espaciador adecuado tal como una secuencia intrónica, tal como el
intrón Sh1 o el intrón ADH, entre el promotor y la secuencia
nucleotídica de la presente invención. Esto mismo es cierto para el
término "fusionado" en relación con la presente invención que
incluye la unión directa o indirecta. En cada caso, los términos no
incluyen la combinación natural de la secuencia nucleotídica que
codifica la proteína generalmente asociada con el promotor del gen
silvestre y cuando ambos están en su entorno natural.
La construcción puede incluso contener o
expresar un marcador que permita la selección de la construcción
genética en, por ejemplo, una bacteria, preferiblemente del género
Bacillus, tal como Bacillus subtilis, o plantas a las que se
haya transferido. Existen diversos marcadores que pueden usarse,
tales como por ejemplo los que codifican la
manosa-6-fosfato isomerasa
(especialmente para plantas) o los marcadores que proporcionan
resistencia a antibióticos -por ejemplo resistencia a G418,
higromicina, bleomicina, kanamicina y gentamicina.
Preferiblemente, la construcción de la presente
invención contiene al menos la secuencia nucleotídica de la presente
invención unida operativamente a un promotor.
El término "vector" incluye vectores de
expresión y vectores de transformación y vectores lanzadera.
La expresión "vector de expresión" se
refiere a una construcción capaz de producir expresión in
vivo o in vitro.
La expresión "vector de transformación" se
refiere a una construcción capaz de transferirse de una entidad a
otra entidad -que puede ser de la misma especie o de diferente
especie. Si la construcción es capaz de transferirse de una especie
a otra -tal como de un plásmido de E. coli a una bacteria,
tal como del género Bacillus, entonces el vector de transformación
se denomina a veces "vector lanzadera". Puede incluso ser una
construcción capaz de transferirse de un plásmido de E. coli
a un Agrobacterium o a una planta.
Los vectores de la presente invención pueden
utilizarse para transformar una célula hospedadora adecuada como se
describe a continuación para proporcionar la expresión de un
polipéptido de la presente invención. Por lo tanto, en un aspecto
adicional, la invención proporciona un procedimiento para generar
polipéptidos de acuerdo con la presente invención que comprende el
cultivo de una célula hospedadora transformada o transfectada con
un vector de expresión como se ha descrito anteriormente en
condiciones para proporcionar la expresión por el vector de una
secuencia codificante que codifica los polipéptidos, y la
recuperación de los polipéptidos expresados. Los vectores pueden
ser, por ejemplo, vectores plasmídicos, virus o fagos que se
proporcionan con un origen de replicación, opcionalmente un
promotor para la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente
un regulador del promotor.
Los vectores de la presente invención pueden
contener uno o más genes marcadores seleccionables. Los sistemas de
selección más adecuados para los microorganismos industriales son
los formados por el grupo de marcadores de selección que no
requieren una mutación en el organismo hospedador. Son ejemplos de
marcadores de selección fúngicos los genes para acetamidasa
(amdS), ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC),
orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa
(pvrA), resistencia a fleomicina y benomil (benA). Son
ejemplos de marcadores de selección no fúngicos el gen de
resistencia a G418 bacteriano (éste también puede usarse en
levaduras, pero no en hongos filamentosos), el gen de resistencia a
ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a neomicina
(Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que
codifica la \beta-glucuronidasa (GUS).
Los vectores pueden utilizarse in vitro,
por ejemplo para la producción de ARN o utilizarse para transformar
o transfectar una célula hospedadora.
Por lo tanto, los polinucleótidos de la presente
invención pueden incorporarse en un vector recombinante (típicamente
en un vector replicable), por ejemplo un vector de clonación o de
expresión. El vector puede utilizarse para replicar el ácido
nucleico en una célula hospedadora compatible. De este modo, en una
realización adicional, la invención proporciona un procedimiento
para generar los polinucleótidos de la presente invención mediante
la introducción de un polinucleótido de la presente invención en un
vector replicable, la introducción del vector en una célula
hospedadora compatible, y el desarrollo de la célula hospedadora en
condiciones que produzcan la replicación del vector. El vector
puede recuperarse de la célula hospedadora. Las células hospedadoras
idóneas se describen a continuación en conexión con los vectores de
expresión.
La presente invención también se refiere al uso
de células hospedadoras obtenidas por ingeniería genética que
expresan una PDE_XIV o una variante, homólogo, fragmento o derivado
de la misma en procedimientos de selección para la identificación
de inhibidores y antagonistas de la PDE_XIV que modularían la
actividad fosfodiesterasa modulando así los niveles de nucleótidos
cíclicos. Tales células hospedadoras obtenidas por ingeniería
genética pueden utilizarse para examinar bibliotecas peptídicas o
moléculas orgánicas capaces de modular la actividad de PDE_XIV.
Antagonistas e inhibidores de PDE_XIV, tales como anticuerpos,
péptidos o moléculas orgánicas pequeñas proporcionarán la base para
las composiciones farmacéuticas para el tratamiento de las
enfermedades asociadas con, por ejemplo, PDE_XIV. Tales inhibidores
o antagonistas pueden administrarse solos o en combinación con otras
terapias para el tratamiento de tales enfermedades.
La presente invención también se refiere a
vectores de expresión y a células hospedadoras que contienen
secuencias polinucleotídicas que codifican PDE_XIV o una variante,
homólogo, fragmento o derivado de la misma para la producción in
vivo o in vitro de la proteína PDE_XIV o para seleccionar
agentes que puedan afectar a la expresión o a la actividad de
PDE_XIV.
El término "tejido", como se usa en este
documento, incluye al tejido en sí y a los órganos.
El término "célula hospedadora" -en
relación con la presente invención incluye cualquier célula que
pueda contener la secuencia nucleotídica que codifica la proteína
recombinante de acuerdo con la presente invención y/o los productos
que se obtienen de la misma, donde un promotor puede permitir la
expresión de la secuencia nucleotídica de acuerdo con la presente
invención cuando está presente en la célula hospedadora.
Por lo tanto, una realización adicional de la
presente invención proporciona células hospedadoras transformadas o
transfectadas con un polinucleótido de la presente invención.
Preferiblemente es un vector para la replicación y la expresión de
dichos polinucleótidos el que transporta dicho polinucleótido. Se
escogerán células que sean compatibles con dicho vector y pueden
ser, por ejemplo, células procariotas (por ejemplo bacterianas),
fúngicas, de levaduras o de plantas.
La bacteria gram-negativa E.
coli se utiliza mucho como hospedador para la expresión génica
heteróloga. Sin embargo, grandes cantidades de proteína heteróloga
tienden a acumularse en el interior de la célula. La purificación
posterior de la proteína deseada a partir de la masa de proteínas
intracelulares de E. coli puede ser difícil a veces. En
comparación con E. coli, las bacterias del género
Bacillus son muy adecuadas como hospedadores heterólogos
debido a su capacidad para secretar proteínas al medio de cultivo.
Otras bacterias adecuadas como hospedadores son las de los géneros
Streptomyces y Pseudomonas.
Dependiendo de la naturaleza del polinucleótido
que codifica el polipéptido de la presente invención, y/o la
conveniencia de un procesamiento adicional de la proteína que se
expresa, pueden preferirse hospedadores eucariotas tales como
levaduras u otros hongos. En general, las células de levadura se
prefieren sobre las células de hongo debido a que son más sencillas
de manipular. Sin embargo, algunas proteínas o se secretan
débilmente a partir de la célula de levadura, o en algunos casos no
se procesan correctamente (por ejemplo, hiperglicosilación en la
levadura). En estos casos, debe seleccionarse un organismo
hospedador fúngico diferente.
Son ejemplos de hospedadores de expresión
adecuados dentro del alcance de la presente invención hongos tales
como especies de Aspergillus (tales como las que se describen
en los documentos EP-A-0184438 y
EP-A-0284603) y especies de
Trichoderma; bacterias tales como especies de Bacillus
(tales como las que se describen en los documentos
EP-A-0134048 y
EP-A-0253455), especies de
Streptomyces y especies de Pseudomonas; y levaduras
tales como especies de Kluyveromyces (tales como las que se
describen en los documentos
EP-A-0096430 y
EP-A-0301670) y especies de
Saccharomyces. A modo de ejemplo, pueden seleccionarse
hospedadores de expresión típicos de entre Aspergillus niger,
Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori,
Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus orvzae,
Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis,
Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis y
Saccharomyces cerevisiae.
El uso de células hospedadoras adecuadas -tales
como células hospedadoras de levaduras, hongos y plantas- puede
proporcionar modificaciones post-traduccionales (por
ejemplo, miristoilación, glicosilación, truncado, lapidación y
fosforilación de tirosinas, serinas o treoninas) ya que pueden ser
necesarias para conferir una actividad biológica óptima a los
productos de la expresión recombinante de la presente invención.
El término "organismo", en relación con la
presente invención, incluye cualquier organismo que pueda contener
la secuencia nucleotídica que codifica la proteína recombinante de
acuerdo con la presente invención y/o los productos que se obtienen
de la misma, donde un promotor puede permitir la expresión de la
secuencia nucleotídica de acuerdo con la presente invención cuando
está presente en el organismo. Los ejemplos de organismos pueden
incluir un hongo, una levadura o una planta.
El término "organismo transgénico", en
relación con la presente invención, incluye cualquier organismo que
contiene la secuencia nucleotídica que codifica la proteína de
acuerdo con la presente invención y/o los productos que se obtienen
de la misma, donde el promotor puede permitir la expresión de la
secuencia nucleotídica de acuerdo con la presente invención dentro
del organismo. Preferiblemente la secuencia nucleotídica se
incorpora en el genoma del organismo.
El término "organismo transgénico" no
incluye la secuencia nucleotídica codificante nativa de acuerdo con
la presente invención en su entorno natural cuando está bajo el
control de su promotor nativo que está también en su entorno
natural. Además, la presente invención no incluye la proteína nativa
de acuerdo con la presente invención cuando está en su entorno
natural ni cuando se expresa mediante su secuencia nucleotídica
codificante nativa que está también en su entorno natural ni cuando
esta secuencia nucleotídica está bajo el control de su promotor
nativo que está también en su entorno natural.
Por lo tanto, el organismo transgénico de la
presente invención incluye un organismo que contiene una cualquiera
de o combinaciones de, la secuencia nucleotídica que codifica la
secuencia aminoacídica de acuerdo con la presente invención,
construcciones de acuerdo con la presente invención (incluyendo
combinaciones de las mismas), vectores de acuerdo con la presente
invención, plásmidos de acuerdo con la presente invención, células
de acuerdo con la presente invención, tejidos de acuerdo con la
presente invención o los productos de los mismos. La célula u
organismo transformado puede generar cantidades aceptables del
compuesto deseado que pueden recuperarse fácilmente de la célula u
organismo.
La presente invención también abarca los
organismos que se han modificado de tal modo que expresan elevados
niveles de la enzima.
La presente invención también abarca organismos
que se han modificado de tal modo que la actividad de la enzima se
ha atenuado o incluso eliminado. Un ejemplo de tal realización es
una rata o ratón knock-out donde la secuencia
codificante natural se ha retirado y reemplazado por, por ejemplo,
un gen informador -tal como \beta-gal. Como alternativa,
el promotor puede silenciarse de tal modo que no se produzca la
expresión génica. Estos tipos de organismos pueden generarse
mediante el uso de técnicas convencionales.
Como se ha indicado anteriormente, el organismo
hospedador puede ser un organismo procariota o eucariota. Los
ejemplos de hospedadores procariotas adecuados incluyen a E.
coli y Bacillus subtilis. Las enseñanzas sobre la
transformación de hospedadores procariotas están bien documentadas
en la técnica, por ejemplo véase Sambrook y col. (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor
Laboratory Press) y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular
Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.
Si se utiliza un hospedador procariota, entonces
puede que sea necesario modificar adecuadamente la secuencia
nucleotídica antes de la transformación -tal como mediante retirada
de intrones.
En otra realización, el organismo transgénico
puede ser una levadura. En este aspecto, también se han utilizado
mucho las levaduras como vehículo para la expresión génica
heteróloga. La especie Saccharomyces cerevisiae tiene una
larga historia de uso industrial, incluyendo su uso para la
expresión génica heteróloga. La expresión de genes heterólogos en
Saccharomyces cerevisiae se ha revisado en Goodey y col.
(1987, Yeast Biotechnology, D R Berry y col., eds., págs.
401-429, Allen and Unwin, London) y en King y col.
(1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton y G T
Yarronton, eds., págs. 107-133, Blackie,
Glasgow).
Por varias razones Saccharomyces
cerevisiae es ideal para la expresión génica heteróloga. En primer
lugar, no es patógena para humanos y es incapaz de producir ciertas
endotoxinas. En segundo lugar, tiene una larga historia de uso
seguro después de siglos de explotación comercial con diversos
propósitos. Esto ha conducido a la aceptación del gran público. En
tercer lugar, el uso comercial generalizado y la investigación
dedicada al microorganismo ha tenido como resultado una abundancia
de conocimientos sobre la genética y la fisiología así como sobre
las características de fermentación a gran escala de
Saccharomyces cerevisiae.
Una revisión de los principios de la expresión
génica heteróloga en Saccharomyces cerevisiae y la secreción
de los productos génicos se aporta en E Hinchcliffe y E Kenny (1993,
"Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes",
Yeasts, Vol. 5, Anthony H Rose y J Stuart Harrison, eds., 2ª
edición, Academic Press Ltd.).
Están disponibles varios tipos de vectores de
levaduras, incluyendo vectores de integración, que requieren la
recombinación con el genoma del hospedador para el mantenimiento y
la replicación autónoma de los vectores
plasmídicos.
plasmídicos.
A fin de generar el Saccharomyces transgénico,
las construcciones de expresión se generan mediante la inserción de
la secuencia nucleotídica de la presente invención en una
construcción diseñada para la expresión en levaduras. Se han
desarrollado varios tipos de construcciones que se usan para
expresión heteróloga. Las construcciones contienen un promotor
activo en levaduras fusionado con la secuencia nucleotídica de la
presente invención, se utiliza generalmente un promotor de origen
levadura, tal como el promotor GAL1. Generalmente se utiliza una
secuencia señal de origen levadura, tal como la secuencia que
codifica el péptido señal SUC2. Un terminador activo en levaduras
finaliza el sistema de expresión.
\newpage
Para la transformación de levaduras se han
desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo,
puede generarse un Saccharomyces transgénico de acuerdo con la
presente invención siguiendo las enseñanzas de Hinnen y col. (1978,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75,
1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); y Ito, H y col.
(1983, J Bacteriology 153, 163-168).
Las células de levadura transformadas se
seleccionan usando diversos marcadores selectivos. Entre estos
marcadores que se utilizan para la transformación hay varios
marcadores auxotróficos tales como LEU2, HIS4 y TRP1, y marcadores
de resistencia a antibióticos dominante tales como marcadores de
antibióticos aminoglicósidos, por ejemplo G418.
Otro organismo hospedador es una planta. El
principio básico en la construcción de plantas modificadas
genéticamente es insertar la información genética en el genoma de
la planta para obtener el mantenimiento estable del material
genético insertado.
Existen varias técnicas para insertar la
información genética, siendo los dos principios fundamentales la
introducción directa de la información genética y la introducción de
la información genética mediante el uso de un sistema vector. Puede
encontrarse una revisión de las técnicas generales en los artículos
de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991]
42:205-225) y Christou
(Agro-Food-Industry
Hi-Tech marzo/abril 1994 17-27).
Pueden encontrarse enseñanzas adicionales sobre la transformación de
plantas en el documento
EP-A-0449375.
Por lo tanto, la presente invención también
proporciona un procedimiento para la transformación de una célula
hospedadora con una secuencia nucleotídica presentada como una
cualquiera de las secuencias que se presentan en los listados de
secuencias que se adjuntan o un derivado, homólogo, variante o
fragmento de la misma.
Las células hospedadoras que se transforman con
una secuencia nucleotídica codificante de PDE pueden cultivarse en
condiciones adecuadas para la expresión y la recuperación de la
proteína codificada del cultivo celular. La proteína que se produce
por una célula recombinante puede secretarse o quedar contenida
intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o del vector que se
use. Como entenderán los especialistas en la técnica, los vectores
de expresión que contienen secuencias codificantes de PDE pueden
diseñarse con secuencias señal que dirijan la secreción de las
secuencias codificantes de PDE a través de una membrana celular
procariota o eucariota concreta. Otras construcciones recombinantes
pueden unir la secuencia codificante de PDE con una secuencia
nucleotídica que codifique un dominio polipeptídico que facilite la
purificación de proteínas solubles (Kroll DJ y col. (1993) ADN Cell
Biol 12:441-53, véase también la discusión anterior
sobre vectores que contienen proteínas de fusión).
De acuerdo con la presente invención, la
producción del polipéptido de la presente invención puede efectuarse
mediante el cultivo de, por ejemplo, hospedadores de expresión
microbianos, que se hayan transformado con uno o más
polinucleótidos de la presente invención, en un medio de
fermentación con nutrientes convencionales. La selección del medio
adecuado puede basarse en la elección de los hospedadores de
expresión y/o basarse en los requerimientos reguladores de la
expresión de la construcción. Tales medios son bien conocidos por
los especialistas en la técnica. El medio puede, si se desea,
contener componentes adicionales que favorezcan a los hospedadores
de expresión transformados sobre otros microorganismos
potencialmente contaminantes.
Por lo tanto, la presente invención también
proporciona un procedimiento para la producción de un polipéptido
que tenga actividad PDE_XIV, comprendiendo el procedimiento las
etapas de a) transformación de una célula hospedadora con una
secuencia nucleotídica presentada como una cualquiera de las
secuencias que se presentan en los listados de secuencias que se
adjuntan o un derivado, homólogo, variante o fragmento de la misma;
y b) cultivo de la célula hospedadora transformada en condiciones
adecuadas para la expresión de dicho polipéptido.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para la producción de un polipéptido que tenga
actividad PDE_XIV, comprendiendo el procedimiento las etapas de a)
cultivo de una célula hospedadora que se ha transformado con una
secuencia nucleotídica presentada como una cualquiera de las
secuencias que se presentan en los listados de secuencias que se
adjuntan o un derivado, homólogo, variante o fragmento de la misma
en condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido; y
b) recuperación de dicho polipéptido a partir del cultivo de células
hospedadoras.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para la producción de un polipéptido que tenga
actividad PDE_XIV, comprendiendo el procedimiento las etapas de a)
transformación de una célula hospedadora con una secuencia
nucleotídica presentada como una cualquiera de las secuencias que se
presentan en los listados de secuencias que se adjuntan o un
derivado, homólogo, variante o fragmento de la misma; b) cultivo de
la célula hospedadora transformada en condiciones adecuadas para la
expresión de dicho polipéptido; y c) recuperación de dicho
polipéptido a partir del cultivo de células hospedadoras.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas
capaces de catalizar la escisión específica del ARN. El mecanismo
de acción de la ribozima implica la hibridación específica de
secuencia de la molécula de ribozima con una diana de ARN
complementaria, seguida de una escisión endonucleolítica. Dentro del
alcance de la invención están moléculas de ribozimas con motivos
cabeza de martillo obtenidas por ingeniería genética que catalizan
específicamente y eficazmente la escisión endonucleolítica de las
secuencias de ARN de PDE.
Inicialmente se identifican sitios específicos
de escisión por ribozimas dentro de una diana potencial de ARN
mediante la exploración de la molécula diana en busca de sitios de
escisión por ribozimas que incluyen las siguientes secuencias, GUA,
GUU y GUC. Una vez que se identifican, pueden evaluarse secuencias
cortas de ARN de entre 15 y 20 ribonucleótidos que se corresponden
con la región del gen diana que contiene el sitio de escisión en
busca de características estructurales secundarias que puedan dar
lugar a una secuencia oligonucleotídica inoperable. La idoneidad de
las dianas candidatas puede también evaluarse mediante el análisis
de la accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos
complementarios usando ensayos de protección frente a
ribonucleasas.
Tanto las moléculas de ARN como las de ADN
antisentido y las ribozimas de la invención pueden generarse por
cualquier procedimiento conocido en la técnica para la síntesis de
moléculas de ARN. Éstos incluyen técnicas para la síntesis química
de oligonucleótidos tales como la síntesis química de fosforamidita
en fase sólida. Como alternativa, las moléculas de ARN pueden
generarse mediante la transcripción in vitro o in vivo
de secuencias de ADN que codifiquen la molécula de ARN antisentido.
Tales secuencias de ADN pueden incorporarse en una gran diversidad
de vectores con promotores de ARN polimerasa adecuados tales como T7
o SP6. Como alternativa, pueden introducirse construcciones
antisentido de ADNc que sinteticen ARN antisentido de manera
constitutiva o inducible en líneas celulares, células o tejidos.
La presencia de la secuencia polinucleotídica
codificante de PDE puede detectarse mediante hibridación
ADN-ADN o ADN-ARN o mediante
amplificación usando sondas, porciones o fragmentos de la secuencia
presentada como una cualquiera de las secuencias que se presentan
en los listados de secuencias que se adjuntan. Los ensayos basados
en la amplificación de ácidos nucleicos implican el uso de
oligonucleótidos u oligómeros basados en la secuencia codificante
de PDE para detectar transformantes que contengan ADN o ARN de PDE.
Como se usan en este documento, los términos
"oligonucleótidos" u "oligómeros" pueden referirse a una
secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 10
nucleótidos y de hasta aproximadamente 60 nucleótidos,
preferiblemente de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos, y más
preferiblemente de aproximadamente 20-25
nucleótidos, que puede utilizarse como una sonda o amplímero.
Preferiblemente, los oligonucleótidos se obtienen de la región 3' de
la secuencia nucleotídica presentada como una cualquiera de las
secuencias que se presentan en los listados de secuencias que se
adjuntan.
Se conocen en la técnica una diversidad de
protocolos para detectar y medir la expresión del polipéptido PDE,
tales como mediante el uso de anticuerpos o policlonales o
monoclonales específicos para la proteína. Los ejemplos incluyen el
ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el
radioinmunoensayo (RIA) y la separación de células activadas por
fluorescencia (FACS). Se prefiere un inmunoensayo de dos sitios,
basado en monoclonales que utiliza anticuerpos monoclonales
reactivos con dos epítopos no interferentes en los polipéptidos PDE,
pero puede emplearse un ensayo de unión competitiva. Estos y otros
ensayos se describen, entre otros lugares, en Hampton R y col.
(1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul
MN) y Maddox DE y col. (1983, J Exp Med 15 8:121 1).
Los especialistas en la técnica conocen una gran
diversidad de marcadores y técnicas de conjugación y pueden
utilizarse en diversos ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos.
Los medios para producir sondas marcadas de hibridación o PCR para
la detección de secuencias polinucleotídicas de PDE incluyen el
marcaje de oligos, el marcaje por traslado de mella, el marcaje del
extremo o la amplificación por PCR usando un nucleótido marcado.
Como alternativa, la secuencia codificante de PDE, o una porción de
ella, puede clonarse en un vector para la producción de una sonda
de ARNm. Tales vectores se conocen en la técnica, están disponibles
en el mercado, y pueden utilizarse para sintetizar sondas de ARN
in vitro mediante la adición de una ARN polimerasa apropiada
tal como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados.
Varias compañías tales como Pharmacia Biotech
(Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), y US Biochemical Corp
(Cleveland, OH) suministran kits comerciales y protocolos para
estos procedimientos. Moléculas informadoras o marcadores adecuados
incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes,
quimoluminiscentes, o cromogénicos así como sustratos, cofactores,
inhibidores, partículas magnéticas y similares. Las patentes que
enseñan el uso de tales marcadores incluyen los documentos
US-A-3817837;
US-A-3850752;
US-A-3939350;
US-A-3996345;
US-A-4277437;
US-A-4275149 y
US-A-4366241. Además, las
inmunoglobulinas recombinantes pueden producirse como se demuestra
en el documento US-A-4816567.
Los procedimientos adicionales para cuantificar
la expresión de una molécula particular incluyen el radiomarcaje
(Melby PC y col. 1993 J Immunol Methods 159:235-44)
o la biotinilación de nucleótidos (Duplaa C y col. 1993 Anal
Biochem 229-36), la coamplificación de un ácido
nucleico control, y las curvas patrón sobre las que se interpolan
los resultados experimentales. La cuantificación de múltiples
muestras puede acelerarse mediante la realización de un ensayo en
formato ELISA donde el oligómero de interés se presenta en varias
diluciones y una respuesta espectrofotométrica o calorimétrica da
una rápida cuantificación. Aunque la presencia/ausencia de
expresión del gen marcador sugiere que el gen de interés está
también presente, debe confirmarse su presencia y su expresión. Por
ejemplo, si la secuencia codificante de PDE se inserta dentro de la
secuencia de un gen marcador, se pueden identificar las células
recombinantes que contienen regiones codificantes de PDE por la
ausencia de la función del gen marcador. Como alternativa, puede
situarse un gen marcador en tándem con la secuencia codificante de
PDE bajo el control de un único promotor. La expresión del gen
marcador en respuesta a la inducción o a la selección generalmente
indica la expresión de PDE también.
Como alternativa, las células hospedadoras que
contienen la secuencia codificante de PDE y que expresan regiones
codificantes de PDE pueden identificarse mediante una variedad de
procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica. Estos
procedimientos incluyen, pero sin limitación, la hibridación
ADN-ADN o ADN-ARN y el bioensayo de
proteínas o las técnicas de inmunoensayo que incluyen tecnologías
basadas en membranas, soluciones o chips para la detección y/o
cuantificación del ácido nucleico o proteína.
La secuencia aminoacídica de la presente
invención puede también utilizarse para generar anticuerpos -tal
como mediante el uso de técnicas convencionales- contra la secuencia
aminoacídica.
Los procedimientos que se conocen bien en la
técnica pueden utilizarse para la producción de anticuerpos contra
polipéptidos PDE_XIV. Tales anticuerpos incluyen, pero sin
limitación, policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena
sencilla, fragmentos Fab y fragmentos producidos mediante una
biblioteca de expresión de Fab. Los anticuerpos neutralizadores, es
decir, los que inhiben la actividad biológica de los polipéptidos
PDE, se prefieren especialmente para diagnósticos y terapias.
Para la producción de anticuerpos, varios
hospedadores que incluyen cabras, conejos, ratas, ratones, etc.
pueden inmunizarse mediante la inyección con el inhibidor o con
cualquier porción, variante, homólogo, fragmento o derivado del
mismo o con un oligopéptido que mantenga sus propiedades
inmunogénicas. Dependiendo de la especie del hospedador, pueden
utilizarse diversos adyuvantes para incrementar la respuesta
inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, pero sin limitación, el de
Freund, los geles minerales tales como el hidróxido de aluminio, y
las sustancias activas de superficie tales como lisolecitina,
polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas,
hemocianina de lapa, y dinitrofenol. El BCG (Bacilli
Calmette-Guerin) y el Corynebacterium
parvum son adyuvantes humanos potencialmente útiles que pueden
emplearse.
Los anticuerpos monoclonales contra la secuencia
aminoacídica pueden incluso generarse usando cualquier técnica que
proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas
celulares continuas en cultivo. Éstas incluyen, pero sin
limitación, la técnica del hibridoma originalmente descrita por
Koehler y Milstein (1975 Nature 256:495-497), la
técnica del hibridoma de células B humanas (Kosbor y col. (1983)
Immunol Today 4:72; Cote y col. (1983) Proc Natl Acad Sci
80:2026-2030) y la técnica del hibridoma del EBV
(Cole y col. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan
R Liss Inc, págs. 77-96). Además, pueden utilizarse
las técnicas que se han desarrollado para la producción de
"anticuerpos quiméricos", el corte y empalme de genes de
anticuerpos de ratón con genes de anticuerpos humanos para obtener
una molécula con especificidad antigénica apropiada y con actividad
biológica (Morrison y col. (1984) Proc Natl Acad Sci
81:6851-6855; Neuberger y col. (1984) Nature
312:604-608; Takeda y col. (1985) Nature
314:452-454). Como alternativa, las técnicas que se
han descrito para la producción de anticuerpos de cadena sencilla
(documento US-A-4946779) pueden
adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla inhibidores
específicos.
Los anticuerpos pueden también producirse in
vivo mediante la inducción de la producción en la población de
linfocitos o mediante la exploración de bibliotecas de
inmunoglobulinas recombinantes o paneles de reactivos de unión
altamente específicos como se describe en Orlandi y col. (1989, Proc
Natl Acad Sci 86: 3833-3837), y Winter G y Milstein
C (1991; Nature 349:293-299).
Pueden también generarse fragmentos de
anticuerpos que contienen sitios de unión específicos para PDE_XIV.
Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero sin limitación,
fragmentos F(ab')_{2} que pueden producirse mediante la
digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y fragmentos Fab
que pueden generarse mediante la reducción de los puentes disulfuro
de los fragmentos F(ab')_{2}. Como alternativa, pueden
construirse bibliotecas de expresión de Fab para permitir la
identificación rápida y sencilla de fragmentos de Fab monoclonales
con la especificidad deseada (Huse WD y col. (1989) Science
256:1275-128 1).
Una técnica alternativa implica la exploración
de las bibliotecas de expresión en fagos donde, por ejemplo, el
fago expresa fragmentos scFv en la superficie de su cubierta con una
gran variedad de regiones determinantes complementarias (CDR). Esta
técnica se conoce bien en la técnica.
Los anticuerpos específicos de PDE_XIV son
útiles para el diagnóstico de condiciones y enfermedades asociadas
con la expresión del polipéptido PDE_XIV. Se conocen bien en la
técnica diversos protocolos para la unión competitiva o ensayos
inmunoradiométricos que usan anticuerpos o policlonales o
monoclonales con especificidades establecidas. Tales inmunoensayos
típicamente implican la formación de complejos entre los
polipéptidos PDE_XIV y su anticuerpo específico (o molécula similar
de unión a PDE_XIV) y la medición de la formación de complejos. Se
prefiere un inmunoensayo de dos sitios, basado en monoclonales que
utiliza anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopos no
interferentes en una proteína PDE_XIV específica, pero también puede
emplearse un ensayo de unión competitiva. Estos ensayos se
describen en Maddox DE y col. (1983, J Exp Med 158:121 1).
Los anticuerpos anti-PDE_XIV son
útiles para el diagnóstico de la inflamación, las condiciones
asociadas con la proliferación de células hematopoyéticas y la
infección por VIH u otros trastornos o enfermedades que se
caracterizan por la expresión anormal de una PDE_XIV. Los ensayos
diagnósticos para PDE_XIV incluyen procedimientos que utilizan el
anticuerpo y un marcador para detectar un polipéptido PDE_XIV en
fluidos, células, tejidos o secciones o extractos de tales tejidos
del cuerpo humano. Los polipéptidos y los anticuerpos de la presente
invención pueden utilizarse con o sin modificación. Con frecuencia,
los polipéptidos y los anticuerpos se marcan mediante su unión, o
covalentemente o no covalentemente, con una molécula informadora.
Los especialistas en la técnica conocen una gran diversidad de
moléculas informadoras.
Los anticuerpos pueden utilizarse en
procedimientos de detección de polipéptidos de la invención
presentes en muestras biológicas mediante un procedimiento que
comprende: (a) la provisión de un anticuerpo de la invención; (b)
la incubación de una muestra biológica con dicho anticuerpo en
condiciones que permitan la formación de un complejo
antígeno-anticuerpo; y (c) la determinación de si el
complejo antígeno-anticuerpo que contiene dicho
anticuerpo se forma.
Dependiendo de las circunstancias, las muestras
adecuadas pueden incluir extractos de tejidos tales como tejidos de
cerebro, mama, ovario, pulmón, colon, páncreas, testículo, hígado,
músculo y hueso o de crecimientos neoplásicos derivados de tales
tejidos.
Los anticuerpos de la invención pueden estar
unidos a un soporte sólido y/o empaquetados dentro de kits en un
recipiente adecuado junto con reactivos, controles, instrucciones y
similares adecuados.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento de ensayo para la detección de la presencia de
PDE_XIV en células (tales como células humanas) que comprende: (a)
la realización de una reacción en cadena de la
polimerasa-transcriptasa inversa sobre ARN (tal como
ARN total) de tales células usando un par de cebadores para la
reacción en cadena de la polimerasa que son específicos para
PDE_XIV, como se determina a partir de la secuencia de ADN de una
cualquiera de las secuencias que se presentan en los listados que se
adjuntan o una variación alélica de la misma; y (b) el análisis de
la aparición de un fragmento de PCR (reacción en cadena de la
polimerasa) de un tamaño adecuado -tal como mediante electroforesis
en gel de agarosa.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento de identificación de agentes (tales como compuestos,
otras sustancias o composiciones compuestas por los mismos) que
afecten (tal como que inhiban o si no modifiquen) a la actividad de
PDE_XIV y/o a la expresión de la misma, comprendiendo el
procedimiento el contacto de la PDE_XIV o de la secuencia
nucleotídica que la codifica con el agente y después la medición de
la actividad de PDE_XIV y/o de la expresión de la misma.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento de identificación de agentes (tales como compuestos,
otras sustancias o composiciones compuestas por los mismos) que
afecten de manera selectiva (tal como que inhiban o si no
modifiquen) a la actividad de PDE_XIV y/o a la expresión de la
misma, comprendiendo el procedimiento el contacto de la PDE_XIV o
de la secuencia nucleotídica que la codifica con el agente y después
la medición de la actividad de PDE_XIV y/o de la expresión de la
misma.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento de identificación de agentes (tales como compuestos,
otras sustancias o composiciones compuestas por los mismos) que
afecten de manera selectiva (tal como que inhiban o si no
modifiquen) a la actividad de PDE_XIVA1 o PDE_XIVA2 o PDE_XIVA3 o
PDE_XIVA4 y/o a la expresión de las mismas, comprendiendo el
procedimiento el contacto de la PDE_XIV pertinente o de la secuencia
nucleotídica que la codifica con el agente y después la medición de
la actividad de la PDE_XIV pertinente y/o de la expresión de la
misma.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento de identificación de agentes (tales como compuestos,
otras sustancias o composiciones compuestas por los mismos) que
afecten (tal como que inhiban o si no modifiquen) a la actividad de
PDE_XIV y/o a la expresión de la misma, comprendiendo el
procedimiento la medición de la actividad de PDE_XIV y/o de la
expresión de la misma en presencia del agente o después de la
adición del agente en: (a) una línea celular en la que se ha
incorporado ADN recombinante constituido por la secuencia de ADN de
una cualquiera de las secuencias que se presentan en los listados de
secuencias que se adjuntan o una variación alélica de la misma, o
(b) una población celular o línea celular que exprese selectivamente
de manera natural PDE_XIV. Preferiblemente, la actividad de PDE_XIV
se determina mediante el procedimiento de ensayo que se ha descrito
anteriormente.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento de identificación de agentes (tales como compuestos,
otras sustancias o composiciones compuestas por los mismos) que
afecten de manera selectiva (tal como que inhiban o si no
modifiquen) a la actividad de PDE_XIV y/o a la expresión de la
misma, comprendiendo el procedimiento la medición de la actividad
de PDE_XIV y/o de la expresión de la misma en presencia del agente o
después de la adición del agente en: (a) una línea celular en la
que se ha incorporado ADN recombinante constituido por la secuencia
de ADN de una cualquiera de las secuencias que se presentan en los
listados de secuencias que se adjuntan o una variación alélica de
la misma, o (b) una población celular o línea celular que exprese
selectivamente de manera natural PDE_XIV. Preferiblemente, la
actividad de PDE_XIV se determina mediante el procedimiento de
ensayo que se ha descrito anteriormente.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento de identificación de agentes (tales como compuestos,
otras sustancias o composiciones compuestas por los mismos) que
afecten de manera selectiva (tal como que inhiban o si no
modifiquen) a la actividad de PDE_XIVA1 o PDE_XIVA2 o PDE_XIVA3 o
PDE_XIVA4 y/o a la expresión de las mismas, comprendiendo el
procedimiento la medición de la actividad de la PDE_XIV respectiva
y/o de la expresión de la misma en presencia del agente o después
de la adición del agente en: (a) una línea celular en la que se ha
incorporado ADN recombinante constituido por la secuencia de ADN de
una cualquiera de las secuencias que se presentan en los listados
de secuencias que se adjuntan o una variación alélica de la misma,
o (b) una población celular o línea celular que exprese
selectivamente de manera natural la PDE_XIV respectiva.
Preferiblemente, la actividad de PDE_XIV se determina mediante el
procedimiento de ensayo que se ha descrito anteriormente.
La presente invención también proporciona un
procedimiento de selección de un agente para la modulación
(preferiblemente para la modulación específica) de la actividad de
PDE_XIV (o de un derivado, homólogo, variante o fragmento de la
misma) o de la expresión de la secuencia nucleotídica que la
codifica (incluyendo a un derivado, homólogo, variante o fragmento
de la misma), comprendiendo el procedimiento las etapas de: a)
provisión de un agente candidato; b) combinación de la PDE_XIV (o
del derivado, homólogo, variante o fragmento de la misma) o de la
secuencia nucleotídica que la codifica (o al derivado, homólogo,
variante o fragmento de la misma) con el agente candidato durante
un tiempo suficiente para permitir la modulación en condiciones
adecuadas; y c) detección de la modulación de PDE_XIV (o del
derivado, homólogo, variante o fragmento de la misma) o de la
secuencia nucleotídica que la codifica (o al derivado, homólogo,
variante o fragmento de la misma) por el agente candidato a fin de
determinar si el agente candidato modula la actividad de PDE_XIV (o
del derivado, homólogo, variante o fragmento de la misma) o la
expresión de la secuencia nucleotídica que la codifica (o al
derivado, homólogo, variante o fragmento de la misma).
La presente invención también proporciona un
procedimiento de selección de un agente con afinidad específica de
unión con PDE_XIV (o con un derivado, homólogo, variante o fragmento
de la misma) o con la secuencia nucleotídica que la codifica
(incluyendo a un derivado, homólogo, variante o fragmento de la
misma), comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) provisión
de un agente candidato; b) combinación de la PDE_XIV (o del
derivado, homólogo, variante o fragmento de la misma) o de la
secuencia nucleotídica que la codifica (o al derivado, homólogo,
variante o fragmento de la misma) con el agente candidato durante un
tiempo suficiente para permitir la unión en condiciones adecuadas;
y c) detección de la unión del agente candidato con PDE_XIV (o con
un derivado, homólogo, variante o fragmento de la misma) o con la
secuencia nucleotídica que la codifica (o al derivado, homólogo,
variante o fragmento de la misma) a fin de determinar si el agente
candidato se une a PDE_XIV (o a un derivado, homólogo, variante o
fragmento de la misma) o a la secuencia nucleotídica que la codifica
(o al derivado, homólogo, variante o fragmento de la misma).
La presente invención también proporciona un
procedimiento de identificación de un agente que es capaz de
modular la PDE_XIV, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a)
contacto del agente con PDE_XIV (o con un derivado, homólogo,
variante o fragmento de la misma) o con la secuencia nucleotídica
que la codifica (o al derivado, homólogo, variante o fragmento de
la misma), b) incubación de la mezcla de la etapa a) con un
nucleótido cíclico en condiciones adecuadas para la hidrólisis del
nucleótido cíclico, c) medición de la cantidad de hidrólisis de
nucleótidos cíclicos, y d) comparación de la cantidad de hidrólisis
de nucleótidos cíclicos de la etapa c) con la cantidad de
hidrólisis de nucleótidos cíclicos que se obtiene con PDE_XIV (o con
un derivado, homólogo, variante o fragmento de la misma) o con la
secuencia nucleotídica que la codifica (o al derivado, homólogo,
variante o fragmento de la misma) incubada sin el compuesto,
determinando de ese modo si el agente afecta (tal como estimulando
o inhibiendo) a la hidrólisis de nucleótidos cíclicos.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones de la
presente invención, PDE_XIV o una variante, homólogo, fragmento o
derivado de la misma y/o una línea celular que expresa la PDE_XIV o
una variante, homólogo, fragmento o derivado de la misma puede
utilizarse para seleccionar anticuerpos, péptidos, u otros agentes,
tales como moléculas orgánicas o inorgánicas, que actúen como
moduladores de la actividad fosfodiesterasa o de la expresión de la
misma, identificando de ese modo a un agente terapéutico capaz de
modular los niveles de nucleótidos cíclicos. Por ejemplo, los
anticuerpos anti-PDE_XIV capaces de neutralizar la
actividad de PDE_XIV pueden utilizarse para inhibir la hidrólisis
de nucleótidos cíclicos, incrementando de ese modo sus niveles. Como
alternativa, la exploración de bibliotecas peptídicas o de
bibliotecas orgánicas generadas mediante química combinatoria con
PDE_XIV o con una variante, homólogo, fragmento o derivado de la
misma expresada de manera recombinante o de líneas celulares que
expresen PDE_XIV o una variante, homólogo, fragmento o derivado de
la misma pueden ser útiles para la identificación de agentes
terapéuticos que funcionen mediante la modulación de la hidrólisis
de nucleótidos cíclicos por PDE_XIV. Compuestos sintéticos,
productos naturales, y otras fuentes de materiales potencialmente
activos biológicamente pueden seleccionarse de diversas formas
consideradas de rutina por los especialistas en la técnica. Por
ejemplo, las secuencias nucleotídicas que codifican la región
N-terminal de PDE_XIV pueden expresarse en una línea
celular que puede utilizarse para la selección de moduladores
alostéricos, o agonistas o antagonistas, de la actividad de PDE_XIV.
Como alternativa, las secuencias nucleotídicas que codifican el
dominio catalítico conservado de PDE_XIV pueden expresarse en líneas
celulares y utilizarse para seleccionar inhibidores de la
hidrólisis de nucleótidos cíclicos.
La capacidad de un agente de ensayo para
interferir con la actividad de PDE_XIV o con la hidrólisis de
nucleótidos cíclicos puede determinarse mediante la medición de los
niveles de PDE_XIV o de los niveles de nucleótidos cíclicos (como
se describe en Smith y col. 1993 Appl. Biochem. Biotechnol.
41:189-218). Hay también kits de inmunoensayo
disponibles en el mercado para la medición de AMPc y de GMPc (por
ejemplo Amersham International, Arlington Heights, IL y DuPont,
Boston, MA). La actividad de PDE_XIV puede también monitorizarse
mediante la medición de otras respuestas tales como la
fosforilación o desfosforilación de otras proteínas usando técnicas
convencionales desarrolladas para este propósito.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un procedimiento de identificación de un compuesto que
es capaz de modular la actividad fosfodiesterasa de nucleótidos
cíclicos de una PDE_XIV, o de una variante, homólogo, fragmento o
derivado de la misma, que comprende las etapas de a) contacto del
compuesto con una PDE_XIV, o con una variante, homólogo, fragmento
o derivado de la misma; b) incubación de la mezcla de la etapa a)
con un nucleótido cíclico en condiciones adecuadas para la
hidrólisis del nucleótido cíclico; c) medición de la cantidad de
hidrólisis de nucleótidos cíclicos; y d) comparación de la cantidad
de hidrólisis de nucleótidos cíclicos de la etapa c) con la
cantidad de hidrólisis de nucleótidos cíclicos que se obtiene con
la PDE_XIV, o con una variante, homólogo, fragmento o derivado de la
misma, incubada sin el compuesto, determinando de ese modo si el
compuesto estimula o inhibe la hidrólisis de nucleótidos cíclicos.
En una realización del procedimiento, el fragmento puede ser de la
región N-terminal de la PDE_XIV y proporciona un
procedimiento para identificar moduladores alostéricos de la
PDE_XIV. En otra realización de la presente invención, el fragmento
puede ser de la región carboxi-terminal de la
PDE_XIV y proporciona un procedimiento para identificar inhibidores
de la hidrólisis de nucleótidos cíclicos.
Un polipéptido PDE_XIV, sus fragmentos
inmunogénicos u oligopéptidos del mismo pueden utilizarse para
seleccionar compuestos terapéuticos en cualquiera de diversas
técnicas de selección de fármacos. El polipéptido que se emplea en
un ensayo de este tipo puede estar libre en solución, fijado a un
soporte sólido, portado sobre una superficie celular, o localizado
intracelularmente. Puede medirse la supresión de actividad o la
formación de complejos de unión entre un polipéptido PDE_XIV y el
agente que se está analizando.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un procedimiento para la selección de uno o de una
pluralidad de compuestos para la modulación (preferiblemente la
modulación específica, tal como la afinidad específica de unión) de
PDE_XIV o de la expresión de la misma, o de una porción de la misma
o variante, homólogo, fragmento o derivado de la misma,
comprendiendo la provisión de uno o de una pluralidad de compuestos;
la combinación de una PDE_XIV o de una secuencia nucleotídica que
la codifica o de una porción de la misma o variante, homólogo,
fragmento o derivado de la misma con el o con cada uno de los
compuestos de la pluralidad durante un tiempo suficiente para
permitir la modulación en condiciones adecuadas; y la detección de
la unión de una PDE_XIV, o de una porción de la misma o variante,
homólogo, fragmento o derivado de la misma, con cada uno de los
compuestos de la pluralidad, identificando de ese modo el compuesto
o los compuestos que modulan a una PDE_XIV o a una secuencia
nucleotídica que la codifique. En un ensayo de este tipo, la
pluralidad de compuestos puede generarse mediante técnicas de
química combinatoria conocidas por los especialistas en la
técnica.
Otra técnica para la selección de fármacos
proporciona una selección de alto rendimiento de compuestos que
tienen una afinidad de unión idónea con los polipéptidos PDE_XIV y
se basa en el procedimiento que se describe con detalle en Geysen,
Solicitud de Patente Europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre
de 1984. En resumen, se sintetiza un gran número de compuestos de
ensayo peptídicos pequeños sobre un sustrato sólido, tal como sobre
alfileres de plástico o sobre alguna otra superficie. Los compuestos
de ensayo peptídicos se hacen reaccionar con fragmentos de PDE_XIV
y se lavan. Se detecta entonces la PDE_XIV unida -tal como mediante
procedimientos que se adaptan apropiadamente bien conocidos en la
técnica. Puede también utilizarse una PDE_XIV purificada
directamente para revestir placas para usarlas en las técnicas
anteriormente mencionadas de selección de fármacos. Como
alternativa, pueden utilizarse anticuerpos no neutralizadores para
capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido.
Esta invención también contempla el uso de
ensayos competitivos de selección de fármacos en los que los
anticuerpos neutralizadores capaces de unirse específicamente con
una PDE_XIV compiten con un compuesto de ensayo para unirse a una
PDE_XIV. De esta manera, los anticuerpos pueden utilizarse para
detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más
determinantes antigénicos con una PDE_XIV.
El procedimiento de ensayo de la presente
invención puede ser una selección alto rendimiento (HTS). A este
respecto, las enseñanzas del documento WO 84/03564 pueden adaptarse
para la PDE de la presente invención.
Las enseñanzas del documento
US-A-5738985 pueden adaptarse para
el procedimiento de ensayo de la presente invención. La presente
invención también proporciona uno o más agentes identificados
mediante los procedimientos de ensayo y los procedimientos de
identificación de la presente invención.
El agente de la presente invención puede ser,
por ejemplo, un compuesto orgánico o un compuesto inorgánico. El
agente puede ser, por ejemplo, una secuencia nucleotídica que sea
antisentido a toda o a parte de las secuencias que se presentan en
los listados de secuencias que se adjuntan.
La invención proporciona adicionalmente un
agente de la presente invención (o incluso una sal farmacéuticamente
aceptable de la misma, o un solvato farmacéuticamente aceptable de
la misma) o una composición farmacéutica que contenga cualquiera de
los anteriores, para su uso como medicamento.
La presente invención también proporciona el uso
de un agente que afecte a la actividad de PDE_XIV (tal como
inhibiendo, modulando o como agonista) en uno cualquiera o más de
putamen, núcleo caudado del cerebro, lóbulo occipital del cerebro,
corazón, ovario, glándula pituitaria, riñón, hígado, intestino
delgado, timo, músculo esquelético, regiones leucocitarias,
ganglios de las raíces dorsales, útero, cóclea, intestino delgado
(duodeno), astrocitoma y apéndice.
La presente invención también proporciona una
composición diagnóstica para la detección de secuencias
polinucleotídicas de PDE_XIV. La composición diagnóstica puede
comprender una cualquiera de las secuencias que se presentan en los
listados de secuencias que se adjuntan o una variante, homólogo,
fragmento o derivado de la misma, o una secuencia capaz de hibridar
con toda o parte de una cualquiera de las secuencias que se
presentan en los listados de secuencias que se adjuntan o con una
variación alélica de la misma.
A fin de proporcionar una base para el
diagnóstico de una enfermedad, deben establecerse valores normales
o estándar de la expresión de un polipéptido PDE_XIV. Esto se
consigue mediante la combinación de fluidos corporales o de
extractos celulares tomados de sujetos normales, o animales o
humanos, con un anticuerpo contra un polipéptido PDE_XIV en
condiciones adecuadas para la formación de complejos que se conocen
bien en la técnica. La cantidad estándar de formación de complejos
puede cuantificarse comparándola con diluciones seriadas de
controles positivos donde una cantidad conocida de anticuerpo se
combina con concentraciones conocidas de un polipéptido PDE_XIV
purificado. Después, los valores estándar obtenidos de las muestras
normales pueden compararse con los valores que se obtienen de
muestras de sujetos potencialmente afectados por un trastorno o
enfermedad relacionada con la expresión de un polipéptido PDE_XIV.
La desviación entre los valores estándar y los valores del sujeto
establece la presencia de la patología.
Un polinucleótido PDE_XIV, o cualquier parte del
mismo, puede proporcionar la base para un compuesto diagnóstico y/o
terapéutico. Para propósitos diagnósticos, las secuencias
polinucleotídicas de PDE_XIV pueden utilizarse para detectar y
cuantificar la expresión génica en condiciones, trastornos o
enfermedades en las que la actividad de PDE_XIV pueda estar
implicada.
La secuencia polinucleotídica que codifica
PDE_XIV puede utilizarse para el diagnóstico de enfermedades que se
producen por la expresión de PDE_XIV. Por ejemplo, las secuencias
polinucleotídicas que codifican PDE_XIV pueden utilizarse en los
ensayos de hibridación o de PCR de tejidos de biopsias o autopsias o
de fluidos biológicos, tales como suero, líquido sinovial o biopsia
tumoral, para detectar anormalidades en la expresión de PDE_XIV.
Los tipos de tales procedimientos cualitativos o cuantitativos
pueden incluir el análisis Southern o Northern, el dot blot u otras
tecnologías basadas en membranas; tecnologías de PCR; tecnologías de
dipstick, pines o chips; y ELISA u otras tecnologías formales de
múltiples muestras. Todas estas técnicas se conocen bien en la
técnica y son de hecho la base de muchos kits diagnósticos
disponibles en el mercado.
Tales ensayos pueden adaptarse para evaluar la
eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico concreto y pueden
utilizarse en estudios animales, en ensayos clínicos, o en la
monitorización del tratamiento de un paciente individual. A fin de
proporcionar una base para el diagnóstico de una enfermedad, debe
establecerse un perfil normal o estándar de expresión de PDE. Esto
se consigue mediante la combinación de fluidos corporales o de
extractos celulares tomados de sujetos normales, o animales o
humanos, con PDE_XIV o con una porción de la misma, en condiciones
adecuadas para la hibridación o la amplificación. La hibridación
estándar puede cuantificarse por comparación de los valores que se
obtienen de los sujetos normales con diluciones seriadas de
controles positivos que se realizan en el mismo experimento donde se
utiliza una cantidad conocida de PDE_XIV purificada. Los valores
estándar obtenidos de las muestras normales pueden compararse con
los valores que se obtienen de muestras de sujetos potencialmente
afectados por un trastorno o enfermedad relacionada con la
expresión de la secuencia codificante de PDE. La desviación entre
los valores estándar y los valores del sujeto establece la
presencia de la patología. Si la enfermedad se encuentra
establecida, se administra un agente terapéutico existente, y
pueden generarse perfiles o valores de tratamiento. Por último, el
ensayo puede repetirse regularmente para evaluar si los valores
continúan progresando o vuelven al patrón normal o estándar. Pueden
utilizarse perfiles de tratamiento sucesivos para demostrar la
eficacia del tratamiento durante un periodo de varios días o de
varios meses.
Por lo tanto, la presente invención se refiere
al uso de un polipéptido PDE_XIV, o de una variante, homólogo,
fragmento o derivado del mismo, para producir anticuerpos
anti-PDE_XIV que pueden, por ejemplo, utilizarse de
manera diagnóstica para detectar y cuantificar los niveles de
PDE_XIV en las patologías.
La presente invención proporciona adicionalmente
ensayos y kits diagnósticos para la detección de PDE_XIV en células
y tejidos que contienen una PDE_XIV purificada que puede utilizarse
como control positivo, y anticuerpos anti-PDE_XIV.
Tales anticuerpos pueden utilizarse en tecnologías basadas en
soluciones, membranas, o tejidos para detectar cualquier patología
o condición relacionada con la expresión de la proteína PDE_XIV o
con la expresión de deleciones o de una variante, homólogo,
fragmento o derivado de la misma.
\newpage
Otro aspecto de la presente invención es el
suministro de sondas de ácidos nucleicos de hibridación o de PCR
que son capaces de detectar secuencias polinucleotídicas, incluyendo
secuencias genómicas, que codifican la región codificante de PDE o
moléculas estrechamente relacionadas, tales como alelos. La
especificidad de la sonda, es decir, si la sonda procede de una
región o dominio altamente conservado, conservado o no conservado,
y la rigurosidad de la hibridación o de la amplificación (alta,
intermedia o baja) determinará si la sonda identifica únicamente la
secuencia codificante de PDE que aparece naturalmente, o secuencias
relacionadas. Las sondas para la detección de secuencias de ácidos
nucleicos relacionadas se seleccionan entre regiones nucleotídicas
conservadas o altamente conservadas de los miembros de la familia de
PDE de nucleótidos cíclicos, tal como la región 3', y tales sondas
pueden utilizarse en una combinación de sondas degeneradas. Para la
detección de secuencias de ácidos nucleicos idénticas, o cuando se
desea una especificidad máxima, las sondas de ácidos nucleicos se
seleccionan entre regiones nucleotídicas no conservadas o regiones
únicas de polinucleótidos PDE. Como se usa en este documento, el
término "región nucleotídica no conservada" se refiere a una
región nucleotídica que es única para la secuencia codificante de
PDE que se describe en este documento y que no aparece en los
miembros de la familia relacionados, tales como PDE de nucleótidos
cíclicos conocidas.
La PCR como se describe en los documentos
US-A-4683195,
US-A-4800195 y
US-A-4965188 proporciona usos
adicionales para oligonucleótidos basados en la secuencia de
PDE_XIV. Tales oligómeros se sintetizan por lo general químicamente,
pero pueden generarse enzimáticamente o producirse a partir de una
fuente recombinante. Los oligómeros generalmente comprenden dos
secuencias nucleotídicas, una con orientación con sentido
(5'\rightarrow3') y otra con antisentido (3'\leftarrow5') que
se emplean en condiciones optimizadas para la identificación de un
gen o de una condición específica. Los dos mismos oligómeros,
conjuntos anidados de oligómeros, o incluso una combinación
degenerada de oligómeros pueden emplearse en condiciones menos
rigurosas para la detección y/o la cuantificación de secuencias de
ADN o ARN estrechamente relacionadas.
La secuencia de ácidos nucleicos de PDE_XIV
puede también utilizarse para generar sondas de hibridación como se
ha descrito anteriormente, para mapear la secuencia genómica
endógena. La secuencia puede mapearse en un cromosoma concreto o en
una región específica del cromosoma usando técnicas bien conocidas.
Éstas incluyen la hibridación in situ con extensiones
cromosómicas (Verma y col. (1988) Human Chromosomes: A Manual of
Basic Techniques, Pergamon Press, New York City), preparaciones
cromosómicas sometidas a citometría de flujo, o construcciones
cromosómicas artificiales tales como YAC, cromosomas artificiales
bacterianos (BAC), construcciones PI bacterianas o bibliotecas de
ADNc de un solo cromosoma.
La hibridación in situ de las
preparaciones cromosómicas y las técnicas de mapeo físico tales como
el análisis de unión usando marcadores cromosómicos establecidos
tienen un valor incalculable en la extensión de los mapas
genéticos. Pueden encontrarse ejemplos de mapas genéticos en Science
(1995; 270:410f y 1994; 265:1981f). Con frecuencia la ubicación de
un gen en un cromosoma de otra especie de mamífero puede revelar
marcadores asociados incluso si el número o el brazo de un cromosoma
humano concreto no se conoce. Pueden asignarse nuevas secuencias a
los brazos cromosómicos, o a partes de los mismos, mediante el mapeo
físico. Esto proporciona una información de gran valor a los
investigadores que buscan genes de enfermedades usando clonación
posicional u otras técnicas de descubrimiento de genes. Una vez que
una enfermedad o síndrome, tal como la ataxia telangiectasia (AT),
ha sido localizada a grandes rasgos mediante unión genética con una
región genómica concreta, por ejemplo, AT con
11q22-23 (Gatti y col. (1988) Nature
336:577-580), cualquier secuencia que mapee en esa
área puede representar genes asociados o reguladores para
investigaciones adicionales. La secuencia nucleotídica del tema de
la invención puede también usarse para detectar diferencias en la
localización cromosómica debidas a translocación, inversión, etc.
entre individuos normales, portadores o afectados.
La presente invención también proporciona una
composición farmacéutica para el tratamiento de un individuo que
tenga necesidad del mismo debido a la actividad de PDE_XIV,
comprendiendo la composición una cantidad terapéuticamente eficaz
de un agente que afecta (tal como que inhibe) a dicha actividad y un
vehículo, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
Por lo tanto, la presente invención también
abarca las composiciones farmacéuticas que incluyen los agentes de
la presente invención (un agente capaz de modular el patrón de
expresión de la secuencia nucleotídica de la presente invención o
la actividad del producto de expresión de la misma y/o un agente
identificado mediante un ensayo de acuerdo con la presente
invención). A este respecto, y en particular para terapia en
humanos, aunque los agentes de la presente invención pueden
administrarse solos, generalmente se administrarán mezclados con un
vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico seleccionado con
respecto a la vía de administración deseada y a la práctica
farmacéutica convencional.
A modo de ejemplo, en las composiciones
farmacéuticas de la presente invención, los agentes de la presente
invención pueden mezclarse con cualquier aglutinante(s),
lubricante(s), agente(s) suspensor(es),
agente(s) de revestimiento, o agente(s)
solubilizante(s) adecuados.
\newpage
En general, una dosis terapéuticamente eficaz
diaria oral o intravenosa de los agentes de la presente invención
es probable que oscile de 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal del
sujeto a tratar, preferiblemente de 0,1 a 20 mg/kg. Los agentes de
la presente invención también pueden administrarse por infusión
intravenosa, a una dosis que es probable que oscile entre
0,001-10 mg/kg/h.
Los comprimidos o cápsulas de los agentes pueden
administrarse solos o dos o más a la vez, como sea apropiado.
También es posible administrar los agentes de la presente invención
en preparaciones de liberación sostenida.
Por lo tanto, la presente invención también
proporciona un procedimiento para el tratamiento de un individuo
que tenga necesidad del mismo debido a la actividad de PDE_XIV que
comprende la administración a dicho individuo de una cantidad eficaz
de la composición farmacéutica de la presente invención.
Típicamente, el médico determinará la dosis
exacta que será más adecuada para un paciente individual y ésta
variará con la edad, el peso y la respuesta del paciente concreto.
Las dosis anteriores son ejemplares del caso medio. Puede, por
supuesto, haber casos individuales que merezcan intervalos de dosis
mayores o menores, y tales casos están dentro del alcance de esta
invención.
Cuando sea apropiado, las composiciones
farmacéuticas pueden administrarse mediante inhalación, en forma de
un supositorio o supositorio vaginal, por vía tópica en forma de una
loción, solución, crema, ungüento o polvos secantes, mediante el
uso de un parche dérmico, por vía oral en forma de comprimidos que
contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u
óvulos solos o mezclados con excipientes, o en forma de elixires,
soluciones o suspensiones que contienen agentes aromatizantes o
colorantes, o pueden inyectarse por vía parenteral, por ejemplo por
vía intracavernosa, intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para la
administración parenteral, las composiciones pueden usarse mejor en
forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras
sustancias, por ejemplo sales o monosacáridos suficientes para
hacer que la solución sea isotónica con la sangre. Para la
administración vía bucal o sublingual, las composiciones pueden
administrarse en forma de comprimidos o grageas que pueden
formularse de manera convencional.
Para algunas aplicaciones, las composiciones se
administran preferiblemente por vía oral en forma de comprimidos
que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en
cápsulas u óvulos o solos o mezclados con excipientes, o en forma
de elixires, soluciones o suspensiones que contienen agentes
aromatizantes o colorantes. Para la administración parenteral, las
composiciones se usan mejor en forma de una solución acuosa estéril
que puede contener otras sustancias, por ejemplo sales o
monosacáridos suficientes para hacer que la solución sea isotónica
con la
sangre.
sangre.
Para la administración por vía bucal o
sublingual las composiciones pueden administrarse en forma de
comprimidos o grageas que pueden formularse de manera
convencional.
Para la administración por vía oral, parenteral,
bucal y sublingual a sujetos (tales como pacientes), el nivel de
dosificación diaria de los agentes de la presente invención puede
estar típicamente entre 10 y 500 mg (en una sola dosis o en dosis
repartidas). Por lo tanto, y a modo de ejemplo, los comprimidos o
cápsulas pueden contener de 5 a 100 mg de agente activo para la
administración única, o de dos o más a la vez, como sea apropiado.
Como se ha indicado anteriormente, el médico determinará la dosis
exacta que será más adecuada para un paciente individual y ésta
variará con la edad, el peso y la respuesta del paciente concreto.
Debe señalarse que aunque las dosis anteriormente mencionadas son
ejemplares del caso medio puede, por supuesto, haber casos
individuales que merezcan intervalos de dosificación mayores o
menores y tales intervalos de dosificación están dentro del alcance
de esta invención.
En algunas aplicaciones, por lo general, en
humanos, la administración oral de los agentes de la presente
invención es la vía preferida, siendo la más conveniente y pudiendo
en algunos casos evitar las desventajas que se asocian con otras
vías de administración -tales como las asociadas con la
administración intracavernosa (i.c.). En las circunstancias en las
que el destinatario padece un trastorno de la deglución o una
alteración de la absorción de fármacos tras la administración oral,
el fármaco se administrará por vía parenteral, por ejemplo, por vía
sublingual o bucal.
Para uso veterinario, el agente de la presente
invención se administra típicamente como una formulación aceptable
adecuada de acuerdo con la práctica veterinaria normal y el
veterinario determinará el régimen de dosificación y la vía de
administración que será más apropiada para un animal concreto. Sin
embargo, como con el tratamiento en humanos, puede ser posible
administrar el agente solo para tratamientos veterinarios.
Típicamente, las composiciones farmacéuticas
-que pueden ser para uso en humanos o animales- comprenderán uno
cualquiera o más de diluyentes, vehículos, excipientes o adyuvantes
farmacéuticamente aceptables. La preferencia de un vehículo,
excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto
a la vía de administración y a la práctica farmacéutica
convencional. Como se ha indicado anteriormente, las composiciones
farmacéuticas pueden comprender como-o además del-
vehículo, excipiente o diluyente, cualquier aglutinante(s),
lubricante(s), agente(s) suspensor(es),
agente(s) de revestimiento, o agente(s)
solubilizante(s) adecuados.
En algunas realizaciones de la presente
invención, las composiciones farmacéuticas comprenderán uno o más
de: un agente que se ha seleccionado mediante un ensayo de la
presente invención; un agente que es capaz de interaccionar con una
cualquiera de las secuencias que se presentan en los listados de
secuencias que se adjuntan incluyendo derivados, fragmentos,
homólogos o variantes de las mismas o secuencias capaces de hibridar
con una cualquiera de las secuencias que se presentan en los
listados de secuencias que se adjuntan.
Se incluyen en el alcance de la invención las
secuencias oligonucleotídicas, moléculas de ARN y ADN antisentido y
ribozimas, que funcionan desestabilizando el ARNm de PDE_XIV o
inhibiendo la traducción de una PDE_XIV. Tales secuencias
nucleotídicas pueden utilizarse en las condiciones en las que es
preferible incrementar los niveles de nucleótidos cíclicos, tales
como en la inflamación.
Una molécula antisentido de PDE_XIV puede
proporcionar la base para el tratamiento de diversas condiciones
anormales relacionadas con, por ejemplo, un incremento de la
actividad de PDE_XIV.
Una molécula de ácido nucleico antisentido de
PDE_XIV puede utilizarse para bloquear la actividad de PDE_XIV en
condiciones en las que es preferible elevar los niveles de
nucleótidos cíclicos.
Los vectores de expresión que proceden de
retrovirus, adenovirus, herpesvirus o vaccinia, o de diversos
plásmidos bacterianos, pueden utilizarse para liberar moléculas de
PDE_XIV recombinante con sentido o antisentido en la población
celular diana. Pueden utilizarse procedimientos bien conocidos por
los especialistas en la técnica para construir vectores
recombinantes que contengan PDE_XIV. Como alternativa, la PDE_XIV
recombinante puede liberarse en las células diana mediante
liposomas.
La secuencia de ADNc completa y/o sus elementos
reguladores posibilitan a los investigadores el uso de PDE_XIV como
una herramienta en las investigaciones con sentido (Youssoufian H y
HF Lodish 1993 Mol Cell Biol 13:98-104) o
antisentido (Eguchi y col. (1991) Annu Rev Biochem
60:631-652) de la función génica. Los
oligonucleótidos, diseñados a partir del ADNc o de las secuencias
control obtenidas del ADN genómico pueden utilizarse in vitro
o in vivo para inhibir la expresión. Tal tecnología
actualmente se conoce bien en la técnica, y los oligonucleótidos
con sentido o antisentido o fragmentos más largos pueden diseñarse a
partir de diversas localizaciones a lo largo de las regiones
codificantes o control. Los olinucleótidos apropiados, que pueden
tener una longitud de 20 nucleótidos, pueden utilizarse para aislar
secuencias de PDE_XIV o moléculas estrechamente relacionadas a
partir de bibliotecas humanas.
Además, la expresión de PDE_XIV puede modularse
mediante la transfección de una célula o tejido con vectores de
expresión que expresen niveles elevados de un fragmento de PDE_XIV
en condiciones en las que es preferible bloquear la actividad
fosfodiesterasa incrementando de ese modo los niveles de nucleótidos
cíclicos. Tales construcciones pueden inundar las células con
secuencias no traducibles con sentido o antisentido. Aun en
ausencia de integración en el ADN, tales vectores pueden seguir
transcribiendo moléculas de ARN hasta que las nucleasas endógenas
inutilicen todas las copias del vector. Tal expresión transitoria
puede durar un mes o más con un vector no replicante y aún más si
los elementos de replicación apropiados forman parte del sistema
vector.
Pueden obtenerse modificaciones de la expresión
génica mediante el diseño de secuencias antisentido de las regiones
de control del gen PDE, tales como promotores, potenciadores e
intrones.
Se prefieren los oligonucleótidos que proceden
del sitio de iniciación de la transcripción, por ejemplo, entre las
regiones -10 y +10 de la secuencia líder. Las moléculas de ARN y ADN
antisentido pueden también diseñarse para bloquear la traducción
del ARNm impidiendo la unión del transcrito a ribosomas. De manera
análoga, puede alcanzarse la inhibición usando la metodología de
apareamiento de bases de Hogeboom, también conocida como el
apareamiento de bases en "triple hélice". El apareamiento en
triple hélice compromete la capacidad de la doble hélice para
abrirse lo suficiente para la unión de las polimerasas, de los
factores de transcripción, o de las moléculas reguladoras.
Por lo tanto, la invención proporciona una
composición farmacéutica que comprende un agente de la presente
invención (o incluso una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo) junto con
diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. La
composición farmacéutica puede ser para uso veterinario (es decir,
animal) o para uso humano.
Por lo tanto, la presente invención se refiere
también a composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades
eficaces de inhibidores o antagonistas de la proteína PDE_XIV
(incluyendo secuencias de ácidos nucleicos antisentido) mezcladas
con un diluyente, vehículo, excipiente o adyuvante farmacéuticamente
aceptable (incluyendo combinaciones de los mismos).
La presente invención se refiere a composiciones
farmacéuticas que pueden contener todo o porciones de las
secuencias polinucleotídicas de PDE_XIV, moléculas antisentido de
PDE_XIV, polipéptidos PDE_XIV, proteínas, péptidos o moduladores
orgánicos de la bioactividad de PDE_XIV, tales como inhibidores,
antagonistas (incluyendo anticuerpos) o agonistas, solos o en
combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto
estabilizante, y que pueden administrarse en cualquier vehículo
farmacéutico estéril, biocompatible, incluyendo, pero sin
limitación, suero salino, tampón salino, dextrosa y agua.
\newpage
Aunque en general las técnicas que se han
mencionado en este documento se conocen bien en la técnica, puede
hacerse referencia en particular a Sambrook y col., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (1989) y Ausubel y col., Short
Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª Ed., John Wiley & Sons,
Inc. La PCR se describe en los documentos
US-A-4683195,
US-A-4800195 y
US-A-4965188.
Las siguientes muestras se depositaron de
acuerdo con el Tratado de Budapest en el depositario reconocido de
la Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marinas del Reino
Unido (NCIMB) en 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB2 1RY el
18 de diciembre de 1998:
E. coli pHS-PDE_XIVNCIMB
número NCIMB 40995
E. coli pMM-PDE_XIV NCIMB
número NCIMB 40996
La siguiente muestra se depositó de acuerdo con
el Tratado de Budapest en el depositario reconocido de la Colección
Nacional de Bacterias Industriales y Marinas del Reino Unido (NCIMB)
en 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB2 1RY el 9 de
septiembre de 1999:
NCIMB número NCIMB 41027 es E. coli
pHS-PDE_XIVhm
La presente invención también incluye las
secuencias que pueden derivarse y/o expresarse a partir de los
depósitos y las realizaciones que las comprendan. La presente
invención también incluye las secuencias parciales que pueden
derivarse y/o expresarse a partir de esos depósitos y las
realizaciones que las comprendan, donde esas secuencias parciales
codifican sitios enzimáticos activos. La presente invención también
incluye las proteínas constituidas por las secuencias que pueden
derivarse y/o expresarse a partir de esos depósitos y las
realizaciones que las comprendan. La presente invención también
incluye las proteínas constituidas por secuencias parciales que
pueden derivarse y/o expresarse a partir de esos depósitos y las
realizaciones que las comprendan, donde esas secuencias parciales
codifican sitios enzimáticamente activos.
La presente invención también incluye las
secuencias que pueden derivarse y/o expresarse a partir de esos
depósitos y las realizaciones que las comprendan.
La presente invención se describirá a
continuación, únicamente a modo de ejemplo, con referencia a los
dibujos que la acompañan:
figura 1, que presenta una imagen
fotográfica;
figura 2, que presenta una imagen
fotográfica;
figura 3, que presenta una tabla y una imagen
fotográfica;
figura 4, que presenta un alineamiento de
secuencias nucleotídicas (aquí las secuencia humana es una secuencia
truncada);
figura 5, que presenta un alineamiento de
secuencias proteicas (aquí las secuencia humana es una secuencia
truncada); y
figura 6, que presenta un gráfico.
Se prehibridaron manchas de transferencia de
Northern, obtenidas de Clontech, durante 1 hora en la solución de
hibridación ExpressHyb (Clontech) a 55ºC antes de añadir un
fragmento radiomarcado de PDE_XIV (el ADN se marcó utilizando un
sistema Megaprime de marcaje aleatorio (Amersham) siguiendo
rigurosamente las instrucciones del fabricante con 50 uCi de
dATP-^{32}P) a ExpressHyb fresca e hibridarlo con
la transferencia durante toda la noche a 55ºC, con agitación suave.
Las manchas de transferencia se lavaron tres veces a temperatura
ambiente durante 10 minutos cada vez en SSC 2x (NaCl 150 mM, citrato
de Na 30 mM) seguido de 2 lavados en SSC 0,2x (NaCl 15 mM, citrato
de Na 3 mM) a 55ºC durante 20 minutos cada uno. Las manchas de
transferencia se expusieron después en una película
autorradiográfica.
Las PCR se realizaron usando reactivos y
condiciones convencionales. En resumen, todos los tampones de
reacción y enzimas se obtuvieron en formato kit de Clontech (para
reacciones de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE)) o de
Life Technologies para PCR convencional. Los oligonucleótidos se
obtuvieron de un proveedor comercial (OSWEL DNA services) y se
usaron a una concentración de 400 nM. Las reacciones se realizaron
en un termociclador MJ Research PTC-200, usando los
parámetros de ciclos que recomendase el fabricante del kit que se
estuviera usando.
El clon (IMAGE clon id 1364394, EMBL ID:
A1006099) se obtuvo de Research Genetics (2130, Memorial Pkwy, SW
Huntsville, AL 358801, EEUU) como cultivo en picado en L-ágar. Las
bacterias del cultivo en picado se sembraron en estrías en una
placa de L-ágar de 37 mm en presencia de ampicilina a una
concentración de 100 mg/ml. Después del crecimiento durante toda la
noche a 37ºC se cogió un único clon, usando una técnica estéril, en
5 ml de caldo LB con ampicilina a una concentración de 100 mg/ml y
se dejó crecer a 37ºC durante toda la noche en agitación (220 rpm).
El ADN plasmídico se aisló de la bacteria usando un kit de minipreps
convencional disponible en el mercado (Qiagen^{TM}) y siguiendo
rigurosamente las instrucciones del fabricante. El ADN aislado se
sometió después a una secuenciación completa, usando kits y
reactivos patentados convencionales y un secuenciador ABI (PE
Applied Biosystems Incorporated) automático.
Para facilitar el aislamiento de un ADNc murino
completo de PDE_XIV que contenga la región codificante completa y
un codón de terminación, se determinó la expresión de PDE_XIV en una
selección de tejidos usando la hibridación Northern. Estos datos
(Figuras 1 y 2) muestran que mientras el ARN mensajero (de 5,5 kb de
longitud), que hibrida con PDE_XIV, está presente en varios
tejidos, su expresión está particularmente elevada en el cerebro,
el músculo esquelético y el hígado del ratón y en los siguientes
estadíos del desarrollo embrionario, a los 10,5, a los 13,5, y a
los 15,5 días. La biblioteca de ADNc embrionario murino a día 13,5
se usó en un procedimiento de selección de ADNc positivo
(GeneTrapper, Life Technologies, Inc.) para aislar la PDE_XIV. El
procedimiento se realizó según las instrucciones del fabricante. La
secuencia EST original del clon 1364394, EMBL ID: A1006099 estaba
en la orientación inversa, por lo tanto, el diseño del
oligonucleótido de selección tenía que ser idéntico a la cadena que
codifica en sentido 5' a 3'; esta etapa fue crítica para el éxito de
la estrategia de clonación. El oligonucleótido que se usó para la
selección y reparación se detalla a continuación.
| Oligo 1: | |
| Selectl | 5'-GGT CAC AGA ACT GCC ACT ATG GTT AAA TGT-3' |
Para aislar el homólogo humano de la PDE_XIV
murina, se diseñaron cebadores de PCR basados en la secuencia EST
1364394 conocida, EMBL ID: A1006099, (Cebador 1 y Cebador 2) y se
usaron para explorar un panel de bibliotecas de ADNc. Las PCR que
se realizaron usando estos cebadores (la PCR se montó usando los
reactivos que se obtuvieron de un kit PCR Reagent System (Life
Technologies) y siguiendo las instrucciones del fabricante, con
parámetros de ciclos convencionales) dieron como resultado la
generación de un fragmento del tamaño esperado, 164 pb, obtenido de
la biblioteca de ADNc de la línea celular humana HELA (Life
Technologies, Inc.); el clon humano se aisló usando el mismo
oligonucleótido de selección/reparación (Oligo 1).
| Cebador 1: | |
| newPDE1 | 5'-ACC GCT CAG AGA TTT CAC AGC A-3' |
| Cebador 2: | |
| newPDE2 | 5'-CCC GTC TGA CCC CTT AGT CGT A-3' |
Los clones a investigar se seleccionaron a
través de la selección mediante PCR de las colonias usando los
cebadores anteriores y el siguiente procedimiento. Usando un palillo
estéril se cogió una única colonia y se añadió a un tubo que
contenía 25 \mul de 1*PCR supermix (Life Technologies, Inc) y una
concentración de 200 nM de los cebadores. El tubo se agitó con
vórtice durante 1 segundo, se centrifugó durante 2 segundos a 14000
x g. Los tubos se colocaron entonces en un termociclador
precalentado a 94ºC (termociclador MJ Research
PTC-200). La PCR se realizó usando el siguiente
programa: 1 ciclo; 94ºC, 1 minuto, seguido de 30 ciclos de: 94ºC,
30 segundos, 55ºC, 30 segundos, 72ºC, 1 minuto. Los productos de PCR
se analizaron mediante electroforesis en gel utilizando
procedimientos convencionales.
El análisis del clon murino aislado permitió el
ensamblaje de una secuencia contigua de 2823 pb que contiene una
ORF de 446 restos. La secuencia completa del ADNc para la PDE_XIV
murina se presenta como SEC ID Nº 7 con la traducción de la fase de
lectura abierta más grande dentro de este ADNc que se presenta como
SEC ID Nº 1. La región codificante se presenta como SEC ID Nº
2,
El análisis del clon humano aislado permitió el
ensamblaje de una secuencia contigua de 2992 pb que contiene una
ORF de 288 restos. La secuencia completa del ADNc para la PDE_XIV
humana se presenta como SEC ID Nº 8 con la traducción de la fase de
lectura abierta más grande dentro de este ADNc que se presenta como
SEC ID Nº 3. La región codificante se presenta como SEC ID Nº 4.
Este clon se ha utilizado para seleccionar una transferencia master
de ARN (Clontech) usando procedimientos convencionales de
transferencia Northern para identificar la distribución en tejidos
de este ADNc. Los resultados (véase Figura 3) demuestran que el
transcrito tiene una expresión elevada en el putamen y en el núcleo
caudado del cerebro, además de en el lóbulo occipital del cerebro,
el corazón, el ovario, la glándula pituitaria, el riñón, el hígado,
el intestino delgado, el timo y el apéndice.
Como todas las fosfodiesterasas de mamíferos que
se han secuenciado hasta ahora, la PDE_XIV contiene una secuencia
de dominio catalítico conservada de aproximadamente 250 aminoácidos
en la mitad carboxilo terminal de la proteína que se piensa que es
esencial para su actividad catalítica. Este segmento comprende los
aminoácidos 108 a 413 de la SEC ID 1 y presenta una conservación de
secuencia con la región correspondiente de otras PDE. En el
alineamiento de nucleótidos (véase Figura 4) y en el alineamiento de
proteínas (véase Figura 5) se observa claramente que el clon de la
PDE_XIV humana está truncado en el extremo 3' debido a un codón de
terminación prematuro en la posición 1102 pb.
Se compró una biblioteca de ADNc de cerebro
fetal humano a Life Technologies, Inc (LTI). 100 ml de Caldo Luria
(10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl/litro) +
100 \mug/ml de ampicilina se inocularon con 2,5 x 10^{9} u.f.c.
de cada biblioteca de ADNc. Cada biblioteca se cultivó y generó
individualmente. Los cultivos se dejaron crecer a 30ºC durante toda
la noche y se obtuvo el ADN plasmídico como se describe en el
protocolo de GeneTrapper^{TM} (LTI). Los procedimientos detallados
para la selección positiva de clones de ADNc usando
GeneTrapper^{TM} (LTI) se resumen en los protocolos del kit, y se
siguieron excepto por las modificaciones siguientes. La biblioteca
de ADNc de cadena sencilla se combinó con 20 ng de oligonucleótidos
de captura biotinilados y se hibridaron a 37ºC durante 1 hora. El
ADN de cadena sencilla eluido se reparó usando el oligonucleótido
de captura como cebador para la extensión por la ADN polimerasa.
Las bibliotecas de ADNc reparadas se introdujeron por
electroporación en una diversidad de E. coli DH10B (LTI)
usando el protocolo del fabricante.
Para facilitar el aislamiento de un ADNc
completo, el perfil de expresión de PDE_XIV se determinó en una
selección de tejidos de ratón usando la hibridación Northern. Esto
identificó un transcrito de 5,0 kb de expresión particularmente
elevada en el embrión de ratón de 13,5 días y en el corazón, el
cerebro y el hígado del ratón adulto. Este transcrito también está
presente a bajos niveles en embriones de 8,5, 10,5, 15,5 días y en
el músculo esquelético, el riñón y el pulmón del adulto. No se
detectaron transcritos ni en bazo ni en testículos. Basándose en los
datos se usó una biblioteca de ADNc de un embrión de 13,5 días
(LTI) como molde para aislar la secuencia completa utilizando una
técnica de selección positiva de ADNc, GeneTrapper (LTI). Esto se
consiguió utilizando un oligonucleótido específico de PDE_XIV. Se
realizó una PCR y se pudieron identificar ADNc que contenían al
menos el fragmento EST. La digestión con endonucleasas de
restricción identificó varios clones que contenían un inserto de
2885 pb y el análisis de la secuencia completa demostró que estos
clones codificaban una ORF de 446 aminoácidos con una masa molecular
predicha de 51,3 kDA.
Además, el ADNc humano completo se aisló
mediante GeneTrapper usando el mismo oligonucleótido de captura
específico y una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano como
molde. Se aislaron varios clones que contenían un inserto de 2653
pb y el análisis de la secuencia completa identificó una ORF de 450
restos con una masa molecular predicha de 51,8 kDA. Usando el ADNc
humano completo se sondeó una transferencia master de ARN. Esto
identificó que el ARNm para la PDE_XIV humana tiene una elevada
expresión en núcleo caudado, putamen y lóbulo occipital del
cerebro, y de manera periférica en corazón, ovario, glándula
pituitaria, riñón, hígado, intestino delgado y timo. Se observaron
menores niveles en músculo esquelético, colon, vejiga, útero,
próstata, estómago, glándulas adrenales y glándula tiroides. No se
observó el transcrito en testículo, bazo, páncreas, leucocitos
periféricos, ganglios linfáticos, médula ósea, aorta ni en
cerebelo.
La comparación de secuencias de la PDE_XIV de
ratón y humana demuestra que comparten un 91% de identidad de
aminoácidos. La ORF humana predicha se extiende por 4 aminoácidos;
éste es el resultado de una inserción de 5 aminoácidos en la
posición 428 y de la deleción de un solo aminoácido en la posición
441 en la secuencia del ratón. Adicionalmente, los dos ADNc
contienen un único sitio de fosforilación de la proteína quinasa
AMPc en la serina 45. Un alineamiento filogenético de los 230
aminoácidos del dominio catalítico de PDE_XIV (aminoácidos
172-420) con representantes de otras PDE demuestra
que la PDE_XIV tiene una mayor homología y se agrupa con PDE7A
(aproximadamente un 70% de identidad). Un análisis bioinformático
adicional demuestra que este dominio comparte menos de un 50% de
identidad de secuencia con regiones equivalentes de otras
subfamilias PDE conocidas y por lo tanto puede indicar que PDE_XIV
puede ser un segundo representante de la familia PDE7.
La secuencia de PDE_XIV contiene dos supuestos
motivos de unión con cationes divalentes
HXXXHX_{8-20}D (aminoácidos
173-180, 213-270), que se piensa que
son esenciales para su actividad hidrolítica. Por lo tanto, ésta es
una evidencia adicional de que PDE_XIV codifica una enzima
fosfodiesterasa funcional.
Los clones de ADNc de PDE_XIV tanto murinos como
humanos se introdujeron por transfección en la línea celular de
mamíferos COS7 (ATCC) usando lipofectamina (Life Technologies, Inc)
y procedimientos convencionales. Las células COS7 se recogieron 72
h después de la transfección y se analizó su actividad PDE usando la
siguiente actividad fosfodiesterasa, un kit SPA (ensayo de
proximidad de centelleo ) disponible en el mercado (Amersham) para
análisis por SPA de AMPc (Amersham). Se generaron diluciones
seriadas de los lisados celulares en tampón de lisis (HEPES 50 mM a
pH 7,2, MgCl_{2} 1,92 mM, KCl 50 mM, EGTA 10 mM, 1 comprimido de
inhibidor de proteasas/50 ml) para diluir cualquier efecto
inhibitorio endógeno. A 25 ml del lisado bruto diluido, se añadieron
25 ml de tampón D (Tampón C + BSA a 2 mg/ ml) seguido de 50 ml de
tampón C (Tris.HCl 20 mM (pH 7,4), MgCl_{2}.6H_{2}O 5 mM) que
contiene 500 nM de sustrato AMPc, (20 \mul de AMPc [^{3}H] (1
\muM, 4 \muCi/ml) más 423 \mul de AMPc frío, 10 \muM/5 ml).
La reacción se incubó durante 30 minutos a 30ºC. Se añadieron
entonces 50 \mul de perlas SPA, centrifugando inmediatamente a
2000 rpm durante 5 minutos. Las lecturas se recogieron en un
contador de centelleo Topcount (Wallac).
Los resultados (véase Figura 6) ilustran que los
clones de PDE_XIV tanto humanos como murinos son activos, 10 veces
más que el control de transfección simulada.
PDE_XIV se expresó en Baculovirus cuando se
fusionó con una señal FLAG N-terminal -los detalles
se presentan más adelante.
Usando Ensayos de Proximidad de Centelleo de
AMPc sobre PDE_XIV expresada purificada con concentraciones de AMPc
en un intervalo de 0-10 \muM, la PDE_XIV expresada
demostró una fuerte actividad de AMPc con una Km de 0,08 \muM
(como se determinó mediante la representación de Hanes que procede
de la curva cinética). Los estudios también revelaron que la
PDE_XIV no tiene actividad contra GMPc. Por lo tanto, la PDE_XIV
puede ser específica para AMPc.
Se encontró que PDE_XIV no es sensible a los
inhibidores de PDE milrinona, Rolipram y Ariflo. Sin embargo, se
observó inhibición de la actividad de PDE_XIV con dipiridamol y IBMX
con valores de CI50 de 10,72 \muM y 9,32 \muM respectivamente.
Los datos de estos estudios se presentan en la siguiente tabla.
Los siguientes estudios demuestran que la enzima
PDE de la presente invención -denominada PDE en este documento para
acortar- puede generarse usando un sistema de expresión en
baculovirus.
Los siguientes estudios también demuestran que
la PDE muestra actividad hidrolítica de nucleótidos cíclicos cuando
se expresa en un sistema de baculovirus.
La enzima PDE se generó usando el sistema de
expresión en baculovirus basado en la infección de células del
insecto Spodoptera frugiperda (células Sf9) con el
virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica
(AcNPV).
En estos estudios, se clonó el ADNc que codifica
la PDE en el plásmido donante pFASTBAC-FLAG que
contiene un elemento de transposición mini-Tn7. El
plásmido recombinante se utilizó para transformar células
competentes DH10BAC que contienen el bácmido parental bMON14272
(ADN infeccioso de AcNPV) y un plásmido auxiliar. El elemento
mini-Tn7 en el donante pFASTBAC puede transponerse
al sitio de unión attTn7 en el bácmido introduciendo por lo tanto el
gen PDE en el genoma viral. Las colonias que contienen bácmidos
recombinantes se identifican por la interrupción del gen
lacZ. La construcción PDE/bácmido puede aislarse e infectar
células de insectos (células Sf9) dando como resultado la
producción de partículas de baculovirus recombinante infecciosas y
la expresión de la proteína de fusión recombinante
PDE-FLAG.
Se midió la actividad fosfodiesterasa de
extractos celulares brutos.
Las células se recogieron y los extractos se
obtuvieron 24, 48 y 72 horas después de la transfección.
Estos resultados confirman que el ADNc de PDE
codifica una fosfodiesterasa que es capaz de hidrolizar AMPc.
El material lisado bruto se purificó por FPLC
usando una columna que contiene perlas de agarosa (gel de afinidad
M2) con las que se ha conjugado un anticuerpo monoclonal IgG_{1}
anti-FLAG purificado mediante un enlace hidrazida
(Eastman Kodak). Esto permite la retención específica del material
recombinante en la columna (ya que está fusionado al epítopo FLAG)
mientras que las proteínas endógenas de insectos se lavan en el
eluido. Se lava después el material recombinante en condiciones de
pH bajo. Este material purificado era más adecuado para los
estudios detallados enzimáticos y de inhibidores. La pureza del
material se evalúa mediante tinción de coomassie después de
electroforesis en gel de dodecil sulfato
sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) o a
través de transferencia western sobre una membrana de nitrocelulosa
de SDS-PAGE no teñido (conteniendo la PDE
recombinante) y el análisis con el anticuerpo monoclonal IgG_{1}
anti-epítopo FLAG. La proteína de fusión
PDE-FLAG se detecta debido a la interacción entre
el anticuerpo anti-FLAG y el epítopo FLAG que está
fusionado con la proteína PDE.
La actividad fosfodiesterasa de la proteína de
fusión PDE-FLAG purificada se analizó usando un kit
SPA (ensayo de proximidad de centelleo) disponible en el mercado
(Amersham - Amersham place, Little Chalfont, Bucks, HP7 9NA UK)
para la actividad hidrolítica de AMPc y/o GMPc. Éste puede
utilizarse para permitir la determinación del valor de Km para PDE
contra AMPc mediante la determinación de la actividad de la enzima
en un intervalo de concentraciones de sustrato que permitan el
cálculo de un valor de Vmáx aproximado para la enzima.
Los resultados de estos experimentos demuestran
que el ADNc de PDE codifica una fosfodiesterasa que es capaz de
hidrolizar AMPc.
En resumen, la presente invención proporciona y
los ejemplos demuestran, entre otros:
- 1.
- Nuevos aminoácidos.
- 2.
- Nuevas secuencias nucleotídicas.
- 3.
- Ensayos que utilizan dichas nuevas secuencias.
- 4.
- Compuestos/composiciones identificados mediante el uso de dichos ensayos.
- 5.
- Sistemas de expresión que contienen o expresan dichas nuevas secuencias.
- 6.
- Procedimientos de tratamiento basados en dichas nuevas secuencias.
- 7.
- Composiciones farmacéuticas basadas en dichas nuevas secuencias.
Se presentan las siguientes
secuencias:
\vskip1.000000\baselineskip
| SEC ID Nº 1 = secuencia aminoacídica murina |
| SEC ID Nº 2 = secuencia nucleotídica codificante murina |
| SEC ID Nº 3 = secuencia aminoacídica humana truncada |
| SEC ID Nº 4 = secuencia nucleotídica codificante humana truncada |
| SEC ID Nº 5 = secuencia aminoacídica humana |
| SEC ID Nº 6 = secuencia nucleotídica codificante humana |
| SEC ID Nº 7 = secuencia de ADNc murino |
| SEC ID Nº 8 = secuencia de ADNc humano truncada |
| SEC ID Nº 9 = Fórmula I |
\vskip1.000000\baselineskip
(Debe apreciarse que en el texto
anterior, las referencias a la SEC ID Nº 2 se aplican igualmente a
la SEC ID Nº 7. Además, las referencias a la SEC ID Nº 4 o a la SEC
ID Nº 6 se aplican igualmente a la SEC ID Nº
8).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 3
\newpage
SEC ID Nº 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 5
\vskip1.000000\baselineskip
La SEC ID Nº 5 es la secuencia
aminoacídica que se presenta como HS_PDEXIV. Por referencia, la
secuencia MM_PDEXIV es la SEC ID Nº 1. Se usó el alineamiento de
múltiples secuencias CLUSTAL W
(1.74).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC ID Nº 6
\vskip1.000000\baselineskip
La SEC ID Nº 6 es la secuencia
nucleotídica que se presenta como HS_PDEXIV. Por referencia, la
secuencia MM_PDEXIV es la SEC ID Nº 2. Se usó el alineamiento de
múltiples secuencias CLUSTAL W
(1.74).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 7
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC ID Nº 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº 9
\vskip1.000000\baselineskip
Véase la Fórmula I
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Pfizer Limited Pfizer Inc
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Enzimas Fosfodiesterasas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P005894EP CTH
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 99308902.8
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-11-09
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 9828603.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-12-23
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 9922123.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-09-17
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 446
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 450
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1353
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2823
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2992
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 413
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier secuencia peptídica o
aminoácido Z1 - Z26 puede separarse de otra de dichas secuencias
peptídicas o aminoácidos Z1 - Z26 mediante una secuencia peptídica o
resto aminoacídico adecuado.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fórmula I
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z2
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z5
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z6
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z7
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (49)..(50)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z8
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (51)..(104)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z9
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (105)..(130)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z10
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (131)..(156)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z11
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (157)..(255)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z12
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (256)..(293)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z13
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (294)..(334)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z14
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (335)..(362)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z15
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (363)..(373)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z16
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (374)..(385)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z17
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (386)..(398)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z18
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (399)..(401)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z19
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (402)..(404)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z20
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (405)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z21
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (406)..(407)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z22
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (408)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z23
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (409)..(410)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z24
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (411)..(412)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z25
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (413)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 437
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12, 16, 18, 20, 29, 38, 55, 58,
113, 140, 167, 305, 347)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa se selecciona independientemente
de una secuencia peptídica o aminoácido opcional adecuado.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (376, 388, 401, 415, 419, 423, 425,
428, 430, 433, 436)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa se selecciona independientemente
de una secuencia peptídica o aminoácido opcional adecuado.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fórmula II
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 445
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fórmula III
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Val o Ile
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Asn
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Asp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = un péptido que contiene al
menos dos o más de Ser, Val, Asn o Ala
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Val o Ile
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Pro o Arg
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (56)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Asn o Ser
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (59)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = His o Tyr
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (114)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Thr o Met
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (141)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Thr
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (168)..(169)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = un péptido que contiene al
menos dos o más de Gly, His, Ser, Gln
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (307)..(308)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = un péptido que contiene al
menos dos o más de Asp, Ala, Asn, Val
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (350)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Asp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (379)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Thr
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (391)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = His o Arg
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (404)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Ser
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (418)..(419)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = un péptido que comprende al
menos dos o más de Pro, Arg, Ser, Asn
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
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<222> (423)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Arg
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (427)..(428)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = un péptido que contiene al
menos dos o más de Ser, Gly, Pro, Asp, His, Gln
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
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<222> (430)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = His o Leu
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (433)..(434)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = un péptido que contiene al
menos dos o más de Gln, Gly, Thr, Pro, Ala
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
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<222> (436)..(437)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = un péptido que contiene al
menos dos o más de Ser, Glu, Thr, Leu
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
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<222> (440)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Thr opcional
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (443)..(444)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = un péptido que contiene al
menos dos o más de Asp, Ser, Ala, Thr
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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<210> 12
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<211> 446
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<220>
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<221> SITIO
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<222> (12)
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<223> Xaa = Val o Ile
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<220>
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<221> SITIO
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<222> (18)
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<222> (20)..(21)
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<223> Xaa = Val o Ile
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<223> Xaa = Pro o Arg
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<222> (59)
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<222> (114)
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<222> (168)..(169)
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<223> Xaa Xaa = Gly His o Ser Gln
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
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<222> (307)..(308)
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<223> Xaa Xaa = Asp Ala o Asn Val
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<220>
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<221> SITIO
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<222> (379)
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<223> Xaa = Ser o Thr
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<222> (391)
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<223> Xaa = His o Arg
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<222> (423)
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<223> Xaa = Ser o Arg
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<222> (430)
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<223> Xaa = His o Leu
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<222> (433)..(435)
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<223> Xaa Xaa Xaa = Gln Gly Thr o Pro Ala
Pro
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<220>
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<223> Xaa = Thr opcional
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<222> (444)..(445)
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<223> Xaa Xaa = Asp Ser o Ala Thr
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<223> Fórmula IV
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<210> 13
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<211> 451
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fórmula IV
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<222> (12)
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<223> Xaa = Val o Ile
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<223> Xaa = Ser o Asn
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<222> (18)
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<223> Xaa = Glu o Asp
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<223> Xaa = Val o Ile
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<222> (379)
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<223> Xaa = Ser o Thr
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<223> Z1 en las fórmulas I - IV
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Z5 en las fórmulas I - IV
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<400> 16
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\sa{Lys Cys Val Cys Met Leu Gly Asp}
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Z6 en las fórmulas I - IV
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<400> 17
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\sa{Arg Leu Arg Gly Gln Thr Gly Val}
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<223> Z7 en las fórmulas I - IV
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\sa{Ala Glu Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Phe Ile Asp
Phe Arg Leu Leu Asn}
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<211> 54
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<223> Z9 en las fórmulas I - IV
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<211> 26
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Z10 en las fórmulas I - IV
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 20
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<210> 21
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<211> 26
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<223> Z11 en las fórmulas I - IV
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<400> 21
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<210> 22
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<223> Z12 en las fórmulas I - IV
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<223> Z13 en las fórmulas I - IV
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<400> 23
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<223> Z14 en las fórmulas I - IV
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<223> Z15 en las fórmulas I - IV
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<223> Z16 en las fórmulas I - IV
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\sa{Tyr Ile Val Glu Pro Leu Phe Arg Glu Trp
Ala}
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<223> Z17 en las fórmulas I - IV
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<400> 27
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\sa{Phe Thr Gly Asn Ser Thr Leu Ser Glu Asn Met
Leu}
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<223> Z18 en las fórmulas I - IV
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<400> 28
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\sa{His Leu Ala His Asn Lys Ala Gln Trp Lys Ser
Leu Leu}
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<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<400> 29
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<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia sintética
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<211> 268
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido
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<400> 32
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\hskip-.1em\dddseqskipggtcacagaa ctgccactat ggttaaatgt
\hfill30
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
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<400> 33
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\hskip-.1em\dddseqskipaccgctcaga gatttcacag ca
\hfill22
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
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<400> 34
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\hskip-.1em\dddseqskipcccgtctgac cccttagtcg ta
\hfill22
Claims (10)
1. Una enzima PDE-XIV
constituida por una secuencia aminoacídica que se presenta en SEC ID
Nº 1, SEC ID Nº 3 o SEC ID Nº 5, o que tiene al menos un 95% de
identidad con éstas.
2. Un gen PDE-XIV constituido
por una secuencia nucleotídica que se presenta en SEC ID Nº 2, SEC
ID Nº 4 o SEC ID Nº 6 o que tiene al menos un 95% de identidad con
éstas.
3. Un vector que contiene el gen
PDE-XIV de acuerdo con la reivindicación 2.
4. Una célula hospedadora aislada en la que se
ha incorporado el gen PDE-XIV de acuerdo con la
reivindicación 2 o con la reivindicación 3.
5. Una célula hospedadora de acuerdo con la
reivindicación 4, donde la célula hospedadora está depositada bajo
los Números de Acceso NCIMB 40995, NCIMB 40996 o NCIMB 41027.
6. Un procedimiento de ensayo para la
identificación de un agente que pueda afectar a la actividad
enzimática o a la expresión de PDE-XIV,
comprendiendo el procedimiento de ensayo,
poner en contacto un agente con la enzima
PDE-XIV de acuerdo con la reivindicación 1 o con el
gen PDE-XIV de acuerdo con la reivindicación 2, con
el vector de acuerdo con la reivindicación 3, o con la célula
hospedadora de acuerdo con la reivindicación 4 o con la
reivindicación 5; y
la medición de la actividad o de la expresión de
la enzima PDE-XIV,
donde una diferencia entre a) la enzima
PDE-XIV o su expresión en ausencia del agente y b)
la enzima PDE-XIV o su expresión en presencia del
agente es indicativa de que el agente puede afectar a la actividad
enzimática de PDE-XIV o a su expresión.
7. El uso de un gen que codifica la enzima
PDE-XIV de acuerdo con la reivindicación 1 o su
producto de expresión, para seleccionar agentes que puedan modular
la actividad de la enzima PDE-XIV.
8. Un anticuerpo generado contra la enzima
PDE-XIV constituida por la secuencia aminoacídica
que se presenta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o que tiene al menos
un 95% de identidad con éstas.
9. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimérico, un
anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento Fab o un fragmento
producido por una biblioteca de expresión de Fab.
10. Un hibridoma que produce el anticuerpo de
acuerdo con la reivindicación 8 o con la reivindicación 9.
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