ES2288886T3 - Proteoliposomas que contienen una proteina integral de membrana que tiene uno o mas dominios transmembrana. - Google Patents

Abstract

Un proteoliposoma estable que comprende: una forma esférica o elipsoidal que tiene un ligando para una proteína integral de membrana anclado a la forma, en el que dicha superficie de la forma está rodeada por una membrana lipídica, en el que dicha membrana lipídica es una bicapa lipídica; y una proteína integral de membrana aislada unida a dicho ligando, en el que dicho(s) dominio(s) transmembrana de la proteína integral de membrana está(n) en dicha membrana lipídica, y en el que dicha proteína integral de membrana tiene una conformación de tipo natural.

Description

Proteoliposomas que contienen una proteína integral de membrana que tiene uno o más dominios transmembrana.

Esta invención fue apoyada por la beca AI41851 de los institutos nacionales de salud ("National Institutes of Health") y el gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la misma.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteoliposomas, a su construcción y a su uso. Preferiblemente el proteoliposoma contiene una proteína integral de membrana, que tiene al menos un dominio transmembrana.

Antecedentes de la invención

Los avances en genómica han dado como resultado el descubrimiento y la identificación de numerosas proteínas. Estos avances han hecho posible obtener transcritos y ADN que codifica una gama de proteínas, incluyendo supuestas proteínas integrales de membrana que tienen múltiples dominios transmembrana, así como las propias proteínas. La disponibilidad de tales proteínas hace posible identificar ligandos que interaccionan con estas proteínas, permitiendo un mejor entendimiento de la biología de estas proteínas y/o seleccionar compuestos que modulan la función de tales proteínas. Sin embargo, existen problemas cada vez mayores para saber lo que realmente hace una proteína específica y/o descubrir procedimientos simples y precisos que realmente identifiquen los ligandos que interaccionan con una proteína particular. Por ejemplo, una proteína tal como una proteína receptora para la que no se ha identificado todavía un ligando se denomina "proteína huérfana". Tales proteínas huérfanas se están volviendo más numerosas puesto que se encuentran disponibles más secuencias de ADN, incluyendo secuencias de ADN que codifican supuestos receptores. En estos casos, se clasifican el ADN y las proteínas basándose en homologías con respecto a proteínas conocidas. Por ejemplo, pueden reconocerse secuencias conservadas que se asemejan a un dominio conocido, tal como un dominio transmembrana, indicando así que la proteína identificada reside en una membrana (es decir, es una proteína integral de membrana).

Las proteínas transmembrana o proteínas integrales de membrana son anfipáticas, que tienen dominios hidrófobos que pasan a través de la membrana e interaccionan con las moléculas lipídicas hidrófobas en el interior de la bicapa, y los dominios hidrófilos que están expuestos al entorno acuoso en ambos lados de la membrana (por ejemplo, los entornos acuosos dentro y fuera de la célula). Las actividades biológicas de las proteínas integrales de membrana (por ejemplo, unión a ligandos) son dependientes de los dominios hidrófilos; en algunos casos, las regiones que atraviesan la membrana contribuyen a la función.

A pesar de nuestra capacidad para predecir las regiones extramembrana de proteínas con algo de confianza, la predicción de la estructura real de estas regiones y los ligandos unidos a la misma es mucho más endeble. Para la mayor parte, la identificación de ligandos naturales y no naturales de proteínas integrales de membrana es un procedimiento empírico.

La identificación de ligandos y el estudio de sus propiedades de unión son más complicados para proteínas integrales de membrana que para proteínas solubles en agua. Las proteínas solubles en agua pueden purificarse fácilmente en tampones acuosos y mantenerse en una conformación nativa en tales circunstancias. Las proteínas integrales de membrana no pueden solubilizarse en tampones acuosos pero deben mantenerse en un entorno que deje a la región que atraviesa la membrana mantener contactos hidrófobos. Esto se consigue con más frecuencia incluyendo detergentes en el tampón de solubilización. Cuando se mezcla con proteínas integrales de membrana, las regiones hidrófobas del detergente se unen a la región transmembrana de la proteína, desplazando las moléculas lipídicas de la
membrana.

Aunque solubilizar proteínas transmembrana en detergentes permite en teoría su purificación, en la práctica, normalmente es difícil aislar de manera eficaz esa proteína de otras proteínas de membrana mientras se conserva su conformación nativa durante periodos de tiempo prolongados. Por ejemplo, la bomba de calcio del retículo sarcoplásmico sólo puede aislarse con su estructura nativa intacta cuando se mantiene en el contexto de la membrana del retículo sarcoplásmico (Zhang et al. (1998), Nature 392: 835-39). De manera similar, sólo fue posible obtener un mapa tridimensional de la H+-ATPasa de la membrana plasmática cuando dos cristales bidimensionales se hicieron crecer directamente sobre las rejillas del microscopio electrónico (Auer et al. (1998), Nature 392: 840-3). Para muchas otras proteínas transmembrana, incluyendo el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), no ha sido posible todavía purificar la proteína durante periodos de tiempo prolongados mientras se mantiene la conformación de tipo natural.

Adicionalmente, identificar los ligandos reales que interaccionan con una proteína transmembrana de este tipo, aunque es extremadamente importante, presenta muchas dificultades. Por ejemplo, la proteína transmembrana necesita estar en la conformación apropiada con el fin de interaccionar con ligandos. Sin embargo, parte de la manera en la que las proteínas transmembrana mantienen su conformación es formando parte de una membrana celular. Las presentes soluciones a este problema son menos que óptimas. Para algunas proteínas integrales de membrana que atraviesan la membrana sólo una vez, los dominios extracelulares y/o intracelulares pueden sintetizarse como entidades independientes y, en algunos casos, se plegarán de manera apropiada. Sin embargo, esto no es siempre verdad. Además, las modificaciones postraduccionales realizadas a versiones solubles de los dominios extracelulares o intracelulares difieren a menudo de las de proteínas unidas a membrana de longitud completa. Estas diferencias pueden ejercer efectos marcados sobre la unión a ligandos u otras propiedades funcionales. Para la gran mayoría de proteínas integrales de membrana, que atraviesan la membrana más de una vez, incluso esta solución menos que ideal no es factible. Normalmente, se utilizan selecciones basadas en células para identificar ligandos de interés con estas proteínas. Se establecen líneas celulares que expresan la proteína integral de membrana de interés y se comparan con una línea celular original que no expresa la proteína. Sin embargo, en tales casos, es difícil aislar eficazmente la proteína de interés de otras proteínas que también están presentes en la membrana celular. En muchos casos, se expresa la proteína de interés en cantidades inferiores a otras proteínas integrales de membrana. Así, puede haber interferencia producida por un compuesto o ligando que interacciona con una proteína totalmente diferente. Para selecciones fenotípicas, puede ser que una proteína esté implicada en una fase de una ruta grande que implica múltiples proteínas. En tales casos, la lectura en el ensayo de selección puede estar afectada incluso cuando la proteína de interés no está afectada directamente. En consecuencia, sería deseable tener un procedimiento para observar una proteína integral de membrana específica en su conformación nativa en el que pueda aislarse de otras proteínas competidoras.

Siete segmentos transmembrana, receptores acoplados a proteínas G (GPCR) representan aproximadamente el 1-2 por ciento de las proteínas totales codificadas por el genoma humano y son dianas importantes para la intervención farmacéutica. Los GPCR tienen siete dominios transmembrana, y también incluyen receptores de quimiocina tales como CCR5 y CXCR4, que se han identificado como cofactores para permitir que el virus de inmunodeficiencia humano (VIH) se introduzca en las células. Generalmente, niveles bajos de expresión y la dependencia de la conformación nativa de los GPCR en el entorno hidrófobo del interior de la membrana han complicado el estudio de estas proteínas. Comúnmente se lleva a cabo el análisis de las interacciones de ligando con GPCR y la selección de inhibidores de tales interacciones usando células vivas o membranas celulares intactas. Normalmente, se usan la unión de ligandos radiomarcados a las células o la inducción de niveles de calcio intracelular por el ligando como lecturas en tales selecciones. Un inconveniente significativo de tales ensayos es el número de células extremadamente grande requerido para una selección de alto rendimiento. Además, tales estudios pueden complicarse por la presencia de numerosas proteínas de la superficie celular, muchas de las cuales se expresan a niveles mucho más elevados que el GPCR de interés. Se impiden así ciertos enfoques, tales como usar células que expresan GPCR para identificar ligandos o naturales o bien sintéticos en una mezcla compleja. Además, la generación de anticuerpos monoespecíficos dirigidos hacia un GPCR particular en el complejo entorno de la membrana celular es ineficaz. Además, para algunos GPCR, tales como los receptores de quimiocina, múltiples ligandos se unen a un único receptor, y a la inversa, un único ligando puede unirse a múltiples receptores. Por tanto, si la célula expresa más de un receptor para el ligando que está estudiándose, la interpretación de los resultados puede ser complicada.

Los procedimientos tradicionales para sintetizar y aislar una proteína recombinante y después someterla a prueba en varios ensayos han demostrado dificultad con proteínas integrales de membrana que tienen múltiples dominios que atraviesan la transmembrana porque normalmente no conservan la conformación de tipo natural en condiciones convencionales durante periodos de tiempo prolongados. Por ejemplo, Bieri et al. (1997), Nature Biotechnology 17:1105-1108, usó un chip detector cubierto con una monocapa lipídica mixta ensamblada por sí misma para estabilizar el receptor acoplado a proteínas G (GPCR), rodopsina. Sin embargo, al contrario que la mayoría de los GPCR, la rodopsina puede purificarse fácilmente y su función se conoce bien. Además, se expresa a niveles elevados y no se desnaturaliza tan fácilmente en detergentes agresivos como otros GPCR. Aún así, la proteína sólo era estable durante varias horas. Además, el procedimiento usado para detectar al ligando con el que interacciona, resonancia de plasmones superficiales (SPR), observa el desacoplamiento de los ligandos mediante los cambios en el peso molecular del complejo ligando-receptor. Si el ligando es aproximadamente equivalente en masa a las proteínas G, la pérdida de la proteína G acoplada inducida por la unión de un ligando de proteína daría como resultado un pequeño cambio global en la masa del complejo, y no se detectaría. Así, para la mayoría de los GPCR, establecer sistemas libres de células para seleccionar ligandos agonistas y antagonistas es todavía una meta difícil de alcanzar.

En consecuencia, sería deseable producir y aislar en forma purificada estas proteínas de múltiples dominios transmembrana mientras conservan su conformación de tipo natural. Sería deseable que estas proteínas pudiesen mantenerse en su conformación de tipo natural durante periodos de tiempo prolongados y en condiciones encontradas comúnmente in vivo. También sería deseable si esto pudiese aplicarse a una amplia gama de proteínas integrales de membrana. La purificación de proteínas integrales de membrana, particularmente aquellas que atraviesan la membrana más de una vez, en una conformación funcionalmente relevante debe acelerar la búsqueda de ligandos, tanto naturales como no naturales, que se unen a estas proteínas.

Sumario de la invención

Los autores ahora han descubierto un procedimiento para expresar proteínas integrales de membrana en grandes cantidades, purificarlas y aislarlas de otras proteínas, mientras se mantienen en una conformación de tipo natural durante periodos de tiempo prolongados.

Preferiblemente, la proteína integral de membrana (a la que se denomina a veces proteína transmembrana) tiene una pluralidad de dominios transmembrana. Las proteínas integrales de membrana conocidas pueden cruzar la membrana sólo una vez o, por ejemplo, hasta 16 veces. Una manera sencilla de clasificar estas proteínas es por el número de dominios transmembrana (tabla 1, a continuación). Las proteínas preferidas incluyen receptores acoplados a proteínas G (GPCR), canales iónicos, transportadores de aminoácidos, transportadores de glucosa, transportadores de fosfato, CFTR y proteínas complejas del receptor nuclear. Preferiblemente, las proteínas son proteínas de membrana eucariota, bacteriana o viral; todavía más preferiblemente, las proteínas son proteínas de membrana de mamíferos.

La proteína deseada se extiende por una etiqueta de epítopo peptídico corto, por ejemplo, la etiqueta C9, que puede reconocerse por un anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo 1D4). La etiqueta puede añadirse al extremo N-terminal o al extremo C-terminal de la proteína, dependiendo de la orientación final de la proteína en el proteoliposoma que se desea. Se expresa la proteína deseada en una célula. Puede usarse una optimización de codón para aumentar el nivel de expresión de la proteína. Se aísla entonces la proteína de la célula mediante un agente de solubilización que mantiene la conformación de la proteína. Preferiblemente, el agente de solubilización es un detergente. Los detergentes preferidos incluyen glucopiranósidos alquílicos (tales como C8CP, C10-M, C12-M, Cymal-5, Cymal-6 y Cymal-7), sacarosas alquílicas (tales como HECAMEG), digitonina, CHAPSO, hidroxietilglucamidas (tales como HEGA-10), derivados de oligoetilenglicol (tales como C8ES, C8E_{n} y C12E8), dodecilmaltopiranósido, y polioxetilenos fenílicos (tales como Triton X-100).

Se separa entonces la proteína solubilizada en el detergente de otros residuos celulares capturándola sobre una superficie sólida (por ejemplo, una perla esférica o elipsoidal). La perla tiene sobre su superficie un anticuerpo u otro ligando específico que capturará, orientará y concentrará la proteína sobre la superficie de la perla. Se mantiene esta proteína aislada en su conformación de tipo natural. Tras esto, se mezcla con un componente lipídico. Uno puede añadir también un atrayente para el lípido sobre al superficie de la perla. Por ejemplo, la perla puede estar revestida de estreptavidina y algún componente lipídico (por ejemplo, biotinil-DPPE) puede estar conjugado covalentemente a la biotina. Entonces se somete la perla con la mezcla a medios conocidos tales como diálisis para formar el proteoliposoma. La interacción estreptavidina-biotina, en este ejemplo, ayuda a unir la capa lipídica a la superficie de la perla a medida que se retira el detergente. El proteoliposoma resultante mantendrá la proteína integral de membrana en su conformación nativa en una forma aislada y/o purificada durante periodos de tiempo prolongados.

Estos proteoliposomas pueden usarse como inmunógenos para provocar reacciones inmunitarias. Como alternativa, pueden usarse para seleccionar bibliotecas de anticuerpos para un anticuerpo.

En una realización preferida, pueden usarse los proteoliposomas estables como antígenos para seleccionar bibliotecas de anticuerpos, incluyendo bibliotecas de anticuerpos de exposición en fago.

Estos proteoliposomas también pueden usarse en ensayos de selección tales como selección de fármacos e identificación de ligandos.

Estos proteoliposomas también pueden usarse para determinar la estructura de la proteína.

Estos proteoliposomas también pueden usarse como una vacuna.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una representación esquemática de la formación de un CCR5-proteoliposoma paramagnético. La superficie de las perlas paramagnéticas no porosas se conjugó covalentemente con estreptavidina y un anticuerpo que reconoce la etiqueta C9 C-terminal modificada por ingeniería genética sobre el CCR5. Se usaron las perlas conjugadas para capturar el CCR5 etiquetado con C9 desde el lisado celular. Tras un lavado extenso, se mezclaron las perlas con un lípido solubilizado en un detergente que contiene aproximadamente el 0,1%-1% de biotinil-DPPE. Durante la retirada del detergente por diálisis, la membrana de bicapa lipídica se ensambla por sí misma alrededor de las perlas y el CCR5 vuelve a su entorno lipídico nativo.

Las figuras 2A y 2B muestran el mantenimiento de la conformación nativa del CCR5 en tampones que contienen diferentes detergentes. Se lisaron aproximadamente 4 X 10^{6} células Cf2Th/PACH/synCCR5 marcadas con [^{35}S]Met/Cys en 1 ml de tampón de solubilización helado ((NH_{4})_{2}SO_{4} 100 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), glicerol al 10%) complementado con una mezcla de inhibidores de proteasas y el 1% (p/v) de diferentes detergentes. Tras 30 min de solubilización y 30 min de centrifugación, los lisados celulares aclarados se separaron en dos partes iguales. Se precipitó una parte con 2D7 (un anticuerpo dependiente de conformación frente a CCR5) y la otra parte con 1D4 (un anticuerpo que reconoce la etiqueta de epítopo C9 lineal). Se corrieron los precipitados sobre geles de SDS-poliacrilamida, y se examinaron dos parámetros: 1) la cantidad total de CCR5 precipitado por el anticuerpo 1D4, y 2) la proporción de CCR5 precipitado por el anticuerpo 2D7 con respecto al precipitado por el anticuerpo 1D4. La figura 2A muestra precipitados de células lisadas en tampón que contiene Cymal^{TM}-5, DHPC y Fos-Choline^{TM}-14. Se precipitaron niveles similares de CCR5 por el anticuerpo 1D4 a partir de estos lisados, pero el porcentaje de CCR5 conformacionalmente intacto varió (el 98% en Cymal^{TM}-5, el 10% en DHPC y el 13% en Fos-Choline^{TM}-14). La muestra que se corrió en el carril (asterisco) derecho era la misma que en el carril marcado 1D4 pero se calentó a ebullición antes de correr sobre el gel, un procedimiento que da como resultado la formación de multímeros de elevado peso molecular de CCR5. La figura 2B muestra las cantidades de CCR5 precipitadas por los anticuerpos 1D4 (\medcirc) y 2D7 (\medbullet) a partir de lisados celulares que contienen diferentes detergentes, a lo largo de un intervalo de valores de pH.

La figura 3 muestra una cuantificación del lípido adquirido por las perlas de CCR5-proteoliposoma paramagnético. Se reconstituyeron aproximadamente 10^{8} perlas conjugadas de ID4/estreptavidina con CCR5 y diferentes cantidades de lípidos. Las mezclas lipídicas contenían POPC/POPE/DPPA en una proporción molar de 6:3:1, así como el 1% (en peso) cada una de biotinil-DPPE y rodamina-DOPE. La intensidad de la fluorescencia de la rodamina B de lisamina, que se midió por FACS, mostró un valor medio de 20.000 cuentas. Los puntos de datos mostrados representan el promedio de tres experimentos independientes, con las desviaciones estándar indicadas. Dentro del recuadro está la fórmula mediante la cual se calculó la masa aproximada de lípido (m) total necesario para completar la encapsulación de un número de perlas (n) dado mediante una única membrana de bicapa lipídica. S es la superficie eficaz estimada de la perla Dynal de 2,5 micrómetros de diámetro. Se consideró que el área aproximada ocupada por una molécula lipídica en la membrana (P) de bicapa es 60 A^{2}. N_{A} es el número de Avogadro y M el peso molecular promedio de los lípidos usados para la reconstitución de la membrana.

La figura 4 muestra la composición de la proteína celular de CCR5-proteoliposomas. Se usó el lisado marcado con ^{35}S-cisteína/metionina de células Cf2Th-CCR5 para la formación de CCR5-proteoliposoma. Se incubaron aproximadamente 3 x 10^{7} CCR5-proteoliposomas con tampón de la muestra de SDS durante 1 hora a 55ºC antes de cargarlos sobre un minigel de poliacrilamida-SDS al 11%, que se corrió en condiciones reductoras. Se trató el gel durante 1 hora con Enhance (NEN), se secó y se autorradiografió.

Las figuras 5A-F muestran microscopía confocal de CCR5-proteoliposomas marcados por fluorescencia. Excepto las perlas control (figura 5A), se reconstituyeron todas las perlas con una mezcla lipídica de POPC/POPE/DMPA (en una proporción molar de 6:3:1) que contenía el 1% de biotinil-DPPE. (Figura 5B) Se visualizó la membrana lipídica alrededor de CCR5-proteoliposomas usando el lípido Rho-DOPE fluorescente, que se había añadido en una concentración del 1% durante la formación del proteoliposoma. (Figura 5D) Se marcaron los CCR5-proteoliposomas con el anticuerpo 2D7 anti-CCR5 conjugado con ficoeritrina (2D7-PE). En un experimento control, (la figura 5C), se trataron los CCR5-proteoliposomas con un anticuerpo irrelevante frente a CXCR4, 12G5-PE. Se incubaron las perlas control con sólo membrana (figura 5E) y CCR5-proteoliposomas (figura 5F) con el complejo de CD4 soluble en gp120 JR-FL, el anticuerpo C11 frente a gp120 y IgG-FITC de cabra anti humano. Se analizaron las muestras usando el microscopio confocal invertido Nikon Diaphot 300 y un software de imágenes Oncor.

Las figuras 6A y 6B muestran las propiedades de unión a ligandos de los CCR5-proteoliposomas. La figura 6A muestra la unión reversible del anticuerpo 2D7 dependiente de la conformación a CCR5-proteoliposomas. Se incubaron los CCR5-proteoliposomas durante 1 hora a 22ºC con un anticuerpo de control irrelevante, IgG-PE (control), o con el anticuerpo 2D7 conjugado a ficoeritrina frente a CCR5 (+2D7-PE). Se incubó una fracción de los proteoliposomas con 2D7-PE unido durante 15 minutos en glicina-HCl 100 mM (pH 3,0), se lavó dos veces en el mismo tampón y se resuspendió después en tampón FACS (PBS + suero de ternero fetal al 5%) y se analizó por FACS (lavado). Volvieron a incubarse de nuevo parte de estos CCR5-proteoliposomas con 2D7-PE durante 1 hora a 22ºC y se analizó por FACS. Los resultados indican que el anticuerpo 2D7-PE vuelve a unirse de manera esencialmente completa a los CCR5-proteoliposomas libres de ácido. La figura 6B muestra la unión de gp120 marcado con ^{35}S-cisteína/metionina a los CCR5-proteoliposomas. Se incubaron cantidades equivalentes de glucoproteínas gp120 marcadas con ^{35}S-cisteína/metionina del aislado HXBc2 que usa CXCR4 o el aislado ADA que usa CCR5 con CCR5-proteoliposomas en ausencia o presencia de CD4 soluble (CD4s). En un experimento, se incubaron los CCR5-proteoliposomas con el anticuerpo 2D7 anti-CCR5 antes de la incubación con los complejos ADA gp120/CD4s. Se muestran las proteínas unidas a los CCR5-proteoliposomas, con marcadores de peso molecular (en KDa) indicados a la izquierda.

La figura 7 es un análisis de FACS de células Cf2Th, con o sin synCCR5.

Las figuras 8A-D muestran la expresión de CCR5. Las figuras 8A y 8C muestran la expresión de la superficie celular de CCR5, con expresión aumentada de CCR5 tras el tratamiento de las células con butirato de sodio (figura 8C). La figura 8B muestra la expresión de CCR5 en lisados celulares por inmunoprecipitación o por tinción con azul de coomassie (figura 8D).

La figura 9 muestra la unión del anticuerpo 12G5 a CXCR4-proteoliposomas y a células que expresan CXCR4. Se prepararon los CXCR4-proteoliposomas tal como se describe en el texto a partir de células que expresan CXCR4 de seres humanos con una etiqueta C9 C-terminal. Se muestra la unión del anticuerpo 12G5, que reconoce una estructura dependiente de la conformación en CXCR4, a las células que expresan CXCR4 y a CXCR4-proteoliposomas. La afinidad aparente del anticuerpo 12G5 por el CXCR4 sobre la superficie del proteoliposoma es al menos tan buena como para CXCR4 sobre células. Se obtuvo un resultado similar para el anticuerpo FAB173 dirigido a CXCR4, dependiente de la conformación (datos no mostrados).

La figura 10 muestra la unión de SDF-1I a CXCR4 sobre células y proteoliposomas. Se incubó el SDF-1I radiomarcado, el ligando CXCR4 natural, con células que expresan CXCR4 o bien proteoliposomas que portan CXCR4 o CCR5. Se añadió SDF-1I no marcado (frío) en cantidades crecientes, y se midió la cantidad de SDF-1I radiomarcado unido a las células o proteoliposomas. Se unió el SDF-1I con alta afinidad a las células que expresan CXCR4 y CXCR4-proteoliposomas, pero no a los CCR5-proteoliposomas.

La figura 11 muestra una representación esquemática de los proteoliposomas de gp160 reconstituidos.

Las figuras 12A-B muestran el análisis de los proteoliposomas de gp160. La figura 12A muestra el análisis de FACS de los proteoliposomas teñidos con anticuerpos, incluyendo los sueros de un paciente con sida. La figura 12B muestra el análisis del contenido en proteínas de los proteoliposomas de gp160 sobre geles de poliacrilamida con SDS.

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La figura 13 muestra el análisis de FACS de proteoliposomas con y sin una membrana reconstituida. El pico A es un control de proteoliposoma de gp160 teñido con un FITC a-humano; el pico B son proteoliposomas de gp160 con una membrana reconstituida teñida con IgG-PE de a-ratón; el pico C son glucoproteínas gp160 sobre perlas sin membrana, teñidas con IgG-PE de a-ratón.

La figura 14A-B muestra curvas de unión generadas por FACS. La figura 14A muestra curvas de unión generadas por FACS del anticuerpo IgGb12 a células 293 T que expresan gp160 o a proteoliposomas de gp160. La figura 14B muestra curvas de unión generadas por FACS del anticuerpo C11 a células 293 T que expresan gp160 o proteoliposomas de gp160. Los valores eran la unión máxima normalizada para comparación.

Las figuras 15A-B muestran análisis de FACS de anticuerpos de cadena sencilla. Se representa la tinción de células 293T que expresan gp160 mediante los picos sombreados, y se representan las células control que no lo expresan mediante los picos no sombreados. La figura 15A muestra tinción con suero de ratón en \alpha-gp120 policlonal y anti-ratón-PE. La figura 15B muestra la tinción con medio bacteriano que contiene fago/anticuerpos de cadena sencilla (dilución 1:2), IgG de ratón \alpha-fago y \alpha-ratón-PE.

La figura 16 muestra un análisis ELISA de sueros de ratones inmunizados frente a proteoliposomas de gp160 y sueros control. Se usó un suero de presangrado como suero de control negativo; el suero PADRE se refiere a ratones inmunizados previamente con glucoproteínas gp120-PADRE que sirvieron como un control positivo.

Las figuras 17A-B muestran imágenes de microscopía fluorescente de proteoliposomas de pg160. La figura 17A muestra autofluorescencia. La figura 17B muestra proteoliposomas de gp160 reconstituidos con una preparación lipídica que contiene DOPE-rodamina al 1%.

Descripción detallada de la invención

Los autores han descubierto ahora un procedimiento para expresar proteínas integrales de membrana en grandes cantidades, purificarlas y aislarlas de otras proteínas, mientras se mantienen en una conformación de tipo natural durante periodos de tiempo prolongados. Puede saberse que la proteína de interés es una proteína integral de membrana o puede ser una supuesta proteína integral de membrana, basándose en predicciones de la estructura a partir de su distribución de aminoácidos hidrófobos. Preferiblemente, la proteína integral de membrana tiene múltiples dominios transmembrana. Más preferiblemente, la proteína tiene al menos 3 dominios transmembrana. Los dominios transmembrana tienen características especiales y que se mantienen. Por ejemplo, las partes de la cadena polipeptídica que están metidas en el entorno hidrófobo de la membrana celular (por ejemplo, bicapa lipídica) se componen en gran parte de residuos de aminoácidos con cadenas laterales no polares. Para atravesar una membrana, cada tramo de los residuos hidrófobos debe tener 10-25 aminoácidos de longitud. La presencia de tales tramos característicos de aminoácidos significa que la organización general de una proteína transmembrana puede predecirse con frecuencia a partir de la distribución de sus aminoácidos hidrófobos en una secuencia de aminoácidos deducida. En una realización, las proteínas de un único dominio pueden formar multímeros (por ejemplo, glucoproteínas de la envuelta viral). Así, la proteína resultante tiene problemas conformacionales complejos que se efectúan por la membrana. La presente invención también funciona bien con tales proteínas multiméricas.

Tal como se usa en el presente documento, un periodo de tiempo prolongado es al menos 12 horas; preferiblemente al menos un día; todavía más preferiblemente al menos una semana. Incluso más preferiblemente un periodo de tiempo prolongado es al menos un mes. Aún más preferiblemente, al menos dos meses.

Cualquier procedimiento de expresión puede usarse para expresar la proteína integral de membrana deseada en una célula, antes de su purificación por la presente invención.

La lista de proteínas integrales de membrana, también denominadas a veces proteínas transmembrana, es extensa. Las proteínas transmembrana pueden cruzar la membrana sólo una vez o más de veinte veces. Muchas proteínas transmembrana se asocian con otras proteínas transmembrana para formar complejos más grandes. Tales complejos pueden estar constituidos por dos subunidades idénticas (tales como homodímeros) o dos subunidades de proteínas diferentes (tales como heterodímeros). Existen ejemplos de complejos incluso más grandes de tres (canal iónico de sodio, Na^{+}/K^{+} ATPasa), cuatro (acuaporina), cinco (canales catiónicos de receptores nicotínicos, canales aniónicos de receptores de glicina) o más (centro de fotorreacción, cadena respiratoria mitocondrial) subunidades homólogas o heterólogas.

Las proteínas transmembrana contribuyen a una amplia variedad de funciones celulares, que incluyen el transporte de moléculas e iones dentro o fuera de células, reconocimiento celular, comunicación de célula a célula y adhesión celular. Una manera sencilla de clasificar las proteínas transmembrana es por su número de dominios transmembrana (tabla 1).

El grupo de proteínas transmembrana que sólo cruza la membrana una vez (también conocidas como proteínas de único paso) es particularmente variado tanto estructural como funcionalmente. Esta clase incluye un gran número de proteínas de receptores de la superficie celular. Por ejemplo, el receptor EGF se une al factor de crecimiento epidérmico, lo que conduce a la activación de la actividad tirosina quinasa del receptor. Otros ejemplos de proteínas transmembrana de único paso incluyen las integrinas y cadherinas, que actúan en la comunicación célula-célula mediante la unión a moléculas extracelulares.

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Otra gran clase de receptores de la superficie celular son los receptores acoplados a proteínas G (GPCR), que atraviesan la membrana siete veces. A diferencia de muchos de estos receptores de único paso, estas proteínas no tienen actividad enzimática por sí mismas sino que están ligadas funcionalmente a proteínas de señalización conocidas como proteínas G. El receptor de quimiocina CCR5 que sirve como el principal correceptor para VIH-1 es un ejemplo típico de un receptor acoplado a proteínas G.

Otros elementos bien estudiados de esta clase incluyen transducina, que detecta la luz, y el receptor de acetilcolina, que se une a un neurotransmisor en la sinapsis neuronal.

Debido a su interior hidrófobo, la membrana plasmática es sumamente impermeable a la mayoría de moléculas polares incluyendo moléculas pequeñas tales como iones, azúcares, aminoácidos, nucleótidos, y muchos metabolitos celulares. Las proteínas de transporte de la membrana entran dentro de dos clases generales: a) proteínas portadoras, que unen el soluto específico que va a transportarse y someterse a un cambio conformacional para permitir su tránsito, y b) proteínas de canal, que permiten que solutos específicos, con más frecuencia iones inorgánicos, atraviesen la membrana cuando están abiertos y formen un canal.

Las proteínas portadoras bien estudiadas incluyen los transportadores ABC (que atraviesan la membrana 6 veces), que unen el soluto así como el ATP y cambian la conformación con la hidrólisis de ATP a ADP. Muchas bombas iónicas son ejemplos de proteínas portadoras que están reguladas, tales como la subunidad catalítica que atraviesa la membrana 10 veces de la bomba de calcio.

Los iones también atraviesan la membrana en proteínas de canal, que normalmente están reguladas, de modo que sólo se abren en respuesta a una señal específica (tal como un cambio en el potencial de la membrana). Los ejemplos incluyen algunos canales de potasio (por ejemplo el canal Kcs K^{+}), que atraviesa la membrana dos veces, y los canales de potasio regulados por el voltaje tales como la proteína Shaker de Drosophila (que atraviesa la membrana 6 veces).

En una realización preferida, las proteínas transmembrana son proteínas de la envuelta. Todavía más preferiblemente, las proteínas son proteínas lentivirales. Las proteínas lentivirales pueden incluir, por ejemplo, proteínas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de inmunodeficiencia felina (VIF), o el virus visna. Preferiblemente, la proteína transmembrana se compone de multímeros de la unidad básica, tal como picos triméricos formados por proteínas de la envuelta del VIH-1 o VIH-2.

La proteína lentiviral es preferiblemente de un lentivirus de primate, todavía más preferiblemente un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1), por ejemplo gp120 del VIH-1 o gp160 del VIH-1.

Los complejos oligoméricos que contienen proteínas lentivirales pueden incluir cualquier proteína lentiviral y cualquier proteína que se una a proteínas lentivirales. En otra realización preferida, el proteoliposoma contiene la glucoproteína de la envuelta lentiviral y un receptor celular tal como CD4. En una realización adicional, el proteoliposoma contiene la glucoproteína de la envuelta lentiviral, CD4, y un receptor de quimiocina, tal como CCR5 o CXCR4.

Otros ejemplos de proteínas de la envuelta viral incluyen, por ejemplo, proteínas de envuelta de filovirus (tal como el virus Ébola), ortomixovirus (tal como el virus de la gripe), VSV-G, alfavirus (tales como el virus del bosque Semliki y el virus Sindbis), arenavirus (tal como el virus de la coriomeningitis linfocítica), flavivirus (tales como el virus de la encefalitis vector-garrapata y el virus Dengue), rabdovirus (tales como el virus de la estomatitis vesicular y el virus de la rabia), virus de la leucemia de Moloney, VHS, VZV, virus de las paperas, rinovirus, sarampión, rubéola, arbovirus, enterovirus (tales como el virus de la polio, el virus Coxsackie, ecovirus), virus de la polio, virus Coxsackie B, A y ecovirus, rinovirus, virus de la hepatitis, virus Norwalk, astrovirus, togavirus, alfavirus, pestivirus, virus corona, virus de la parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial (VRS), bunyavirus, reoviridae, reovirus, rotavirus, HTLV, virus del papiloma, adenovirus, parvovirus, VEB, CMV, virus varicela-zoster, virus del herpes y virus de la viruela.

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Las secuencias de estas proteínas están ampliamente disponibles en la bibliografía y a partir de bases de datos en ordenadores tales como Genbank. Así, se puede obtener fácilmente el gen que codifica una proteína particular de interés. Este gen puede expresarse mediante cualquier medio conocido. Esto incluye producir un casete de expresión, en el que el gen está unido funcionalmente a un promotor. Se conocen otros elementos potenciadores y pueden usarse también. Los codones usados para sintetizar la proteína de interés pueden optimizarse, convirtiéndolos a codones que se usan preferiblemente en células de mamíferos. También se conocen codones óptimos para la expresión de proteínas en células que no sean de mamífero, y pueden usarse cuando la célula huésped es una célula que no es de mamífero (por ejemplo, células de insectos, células de levadura, bacterias).

Después se introduce el gen dentro de una célula para la expresión mediante medios conocidos. Por ejemplo, pueden incluir vectores; liposomas, ADN desnudo, ADN ayudado por adyuvantes, pistola génica, catéteres, etc. Los vectores incluyen conjugados químicos, plásmidos, fagos, etc. Los vectores pueden ser cromosómicos, no cromosómicos o sintéticos. Se conocen bien en la técnica los vectores de expresión comerciales, por ejemplo pcDNA 3.1, pcDNA4 HisMax, pACH, pMT4, PND, etc. Se conocen bien en la técnica los promotores que pueden usarse para expresar el gen. Se selecciona el promotor elegido basándose en la célula huésped en la que se expresa la proteína. Estos incluyen el promotor temprano intermedio del citomegalovirus (CMV), una LTR viral tal como la LTR del virus del sarcoma de Rous, LTR del VIH, LTR del HTLV-1, el promotor temprano del virus del simio 40 (SV40), el promotor lac UV5 de E. coli y el promotor del virus del herpes simplex tk.

Los vectores preferidos incluyen vectores virales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de la leucemia murina de Moloney. Otros vectores incluyen vectores de viruela tales como vectores de ortopox o viruela aviar, vectores del virus herpes tales como el virus del herpes simplex I (VHS) (Geller, A.I. et al., (1995), J. Neurochem, 64: 487; Lim, F., et al., (1995) in ADN Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed., Oxford Univ. Press, Oxford England; Geller, A.I. et al. (1993), Proc Natl. Acad Sci.: U.S.A. 90:7603; Geller, A.I., et al., (1990) Proc Natl. Acad Sci USA 87:1149), vectores de adenovirus (LeGal LaSalle et al. (1993), Science, 259:988; Davidson, et al. (1993) Nat. Genet 3: 219; Yang, et al., (1995) J. Virol. 69: 2004) y vectores asociados a adenovirus (Kaplitt, M.G., et al. (1994) Nat. Genet. 8: 148).

El vector particular elegido dependerá de la célula huésped usada.

La introducción del gen dentro de la célula huésped puede realizarse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, infección, transfección, transducción o transformación. Ejemplos de modos de transferencia génica incluyen por ejemplo, ADN desnudo, precipitación con CaPO_{4}, DEAE dextrano, electroporación, fusión de protoplastos, lipofección, microinyección celular, y vectores virales.

Puede insertarse una etiqueta antigénica en la proteína para ayudar en su purificación y para orientar la proteína sobre la superficie sólida. Preferiblemente, la etiqueta está presente en cualquiera de los extremos N-terminal o C-terminal de la proteína. La etiqueta tiene preferiblemente una longitud de 6 a 15 aminoácidos, todavía más preferiblemente aproximadamente de 6 a 9 aminoácidos. Se selecciona la etiqueta y su secuencia de codificación se inserta dentro del gen que codifica la proteína de una manera que no resulte afectada la función o conformación global de la proteína. Las etiquetas pueden incluir HA, polioma, C9, FLAG, etc.

La célula que expresa la proteína integral de membrana se lisa entonces en un tampón con el detergente apropiado e inhibidores de proteasas de modo que la proteína puede separarse de otros residuos celulares mediante medios convencionales sin dañar la proteína.

En general, debido a sus propiedades anfipáticas, las proteínas transmembrana sólo pueden solubilizarse por agentes que rompen las asociaciones hidrófobas y destruyen la bicapa lipídica de membrana. Los agentes usados normalmente son pequeñas moléculas anfipáticas que tienden a formar micelas en agua. Preferiblemente, el agente es un detergente. Cuando se mezcla con las membranas, las regiones hidrófobas del detergente se unen al dominio transmembrana de las proteínas, desplazando las moléculas lipídicas. Los extremos polares de los detergentes pueden estar o cargados (iónicos) o bien no cargados (no iónicos). Aunque las proteínas integrales de membrana pueden mantenerse en una conformación nativa en una disolución de detergente, con el tiempo muchas proteínas solubilizadas experimentan desnaturalización y agregación.

Cuando se retira un disolvente de un complejo proteína transmembrana-detergente en ausencia de un fofoslípido, normalmente las moléculas de la proteína de membrana se desnaturalizan, se agregan y precipitan en la disolución. Sin embargo, si se mezcla la proteína purificada con un fosfolípido antes de que se retire el detergente, la proteína activa puede insertarse dentro de la bicapa lipídica formada por los fosfolípidos. De esta manera, las proteínas de membrana funcionalmente activas pueden reconstituirse a partir de los componentes purificados. Una proteína integral de membrana reconstituida de forma apropiada dentro de su entorno lipídico nativo es estable durante periodos de tiempo prolongados.

Adicionalmente, un factor crítico para mantener una conformación funcional de una proteína de membrana durante su purificación es la elección del detergente usado para solubilizar la proteína. Normalmente, el detergente más adecuado para una proteína de membrana dada se determina empíricamente. Si la proteína se ha investigado anteriormente, la bibliografía indicará los detergentes satisfactorios. Además, se puede confiar en los resultados obtenidos con proteínas relacionadas para determinar los detergentes que serán satisfactorios con otras proteínas. Así, la investigación sobre una proteína relacionada indica el tipo de detergente con más posibilidades de extraer la proteína en una forma activa.

Los detergentes pueden clasificarse generalmente, dependiendo de la naturaleza de su extremo polar, en tres grupos: no iónicos, zwitteriónicos e iónicos. Los detergentes iónicos fuertes (tales como SDS) pueden solubilizar la mayoría de las proteínas de membrana, pero tienden a desplegar la proteína en el procedimiento, haciéndolas menos útiles para reconstituir conformaciones activas. En general, se prefirieren detergentes no iónicos más suaves.

Los detergentes recomendados para la solubilización moderada de las proteínas de membrana incluyen glucopiranósidos alquílicos (tales como C8-GP y C9-GP), tioglucopiranósidos alquílicos (tales como C8-tGP, C10-M, C12-M, Cymal-5, Cymal-6, y Cymal-7), sacarosas alquílicas (tales como HECAMEG), digitonina, CHAPSO, hidroxietilglucamidas (tales como HEGA-10), derivados de oligoetilenglicol (tales como C8E5, C8En, y C12E8), dodecilmaltopiranósido, y polioxietilenos fenílicos (tales como Triton X-100).

Los detergentes preferidos incluyen tioglucopiranósidos alquílicos, dodecilmaltopiranósido y polioxietilenos fenílicos. Más preferiblemente, Cymal-5, Cymal-6, Cymal-7, HEGA-10, digitonina, CHAPSO, dodecilmaltopiranósido, y Triton X-100. Todavía más preferiblemente Cymal-5, Cymal-6, Cymal-7, CHAPSO, y dodecilmaltopiranósido.

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También están disponibles kits comerciales para ayudar a elegir un detergente apropiado para una proteína de membrana dada. Por ejemplo, tanto Anatrace como Calbiochem ofrecen una variedad de kits que contienen mezclas de diferentes detergentes.

Existen muchos ejemplos conocidos de detergentes que se han usado con éxito para purificar proteínas de membrana funcionalmente activas. Por ejemplo, se usó decilmaltósido para purificar el canal de K^{+} (Ksc K^{+}) de Streptomyces lividans, dejando que se determinase la estructura mediante cristalografía de rayos X (Doyle et al., Science (1998) 280: 69-77). Cymal-5, Cymal-6, Cymal-7, CHAPSO y dodecilmaltopiranósido son los detergentes preferidos para los GCPR, más preferiblemente para los receptores de quimiocina (Mirzabekov, T. et al. (1999), J. Biol. Chem. 274: 28745-50).

El lisado celular aclarado que contiene todas las proteínas de membrana solubilizadas y otras proteínas celulares solubles en agua pueden separarse de otros residuos celulares por medios convencionales. Por ejemplo, el uso de centrifugación de alta velocidad, tal como 150.000 x g. Se usan los anticuerpos dirigidos contra la etiqueta del epítopo en la proteína de interés para capturar esta proteína desde el lisado celular sobre el soporte sólido (por ejemplo, perlas). Tras la unión de la proteína integral de membrana a los anticuerpos inmovilizados sobre el soporte sólido, se lava el soporte sólido. Tras esto, se forma la mezcla de proteína-detergente purificada dentro de un proteoliposoma tal como se describe a continuación.

El proteoliposoma comprende una forma esférica o elipsoidal tal como una perla u otro gránulo. Preferiblemente, la perla o gránulo es de al menos aproximadamente el 15% del tamaño de una célula eucariota; todavía más preferiblemente es de al menos aproximadamente el 20% del tamaño de tal célula; e incluso más preferiblemente es de al menos aproximadamente el 25% del tamaño de tal célula. La forma es tridimensional de modo que puede revestirse sobre todos los lados. Sin embargo, puede existir variabilidad sustancial en la forma exacta usada. La forma exacta elegida dependerá de la manera en que se use el proteoliposoma. Así, en algunas realizaciones se prefieren copos a perlas, por ejemplo, tal como un inmunógeno, en otros, puede preferirse un elipsoide más grueso.

La forma esférica o elipsoidal, por ejemplo una perla, se reviste preferiblemente con una sustancia que ayudará a atraer y a fijar una capa lipídica. Sin embargo, esto no es necesario. Por ejemplo, se puede usar un compuesto tal como estreptavidina o avidina para revestir la forma esférica o elipsoidal tal como una perla y añadir una pequeña cantidad de lípido biotinilado en la mezcla lipídica. Por ejemplo, se puede usar un lípido sintético modificado en el grupo superior, tal como dipalmitoilfosfoetanolamina-N-biotinil (Biotinil-DPPE) o dioleoilfosfoetanolamina-Rodamina B de lisamina (Rho-DOPE) en disolución con lípidos. Una mezcla de este tipo formará un revestimiento uniforme con, por ejemplo, una perla revestida de estreptavidina.

La forma esférica o elipsoidal (tal como una perla) también tendrá un ligando de anclaje tal como un anticuerpo unido a él que unirá específicamente la etiqueta del antígeno o una parte específica conocida de la proteína integral de membrana que va a unirse a la perla, orientando así la proteína. Se añade la disolución lipídica que contiene el lípido biotinilado a las perlas con la proteína de interés capturada. Tras esto, se retira el detergente lentamente mediante medios conocidos. Por ejemplo, mediante diálisis, durante por ejemplo, al menos 24 horas. El proteoliposoma que contienen la proteína integral de membrana resultante es estable durante un periodo de tiempo prolongado. Tal como se usa a continuación en el presente documento, un periodo de tiempo prolongado significa de al menos 12 horas; todavía más preferiblemente de al menos un día; incluso más preferiblemente de al menos una semana; todavía más preferiblemente de al menos un mes; e incluso más preferiblemente de al menos dos meses. No sólo conservará la proteína su conformación en estos proteoliposomas durante largos periodos de tiempo, sino que lo hará en un amplio intervalo de condiciones, tales como pH y temperatura.

Preferiblemente, la superficie esférica o elipsoidal que se usa es una perla magnética. Las perlas magnéticas se conocen bien en la técnica y pueden obtenerse comercialmente. Por ejemplo, Dynabeads® M activadas con tosilo (Bikker, J.A., Trumpp-Kallmeyer, S., y Humblet, C. (1998) J. Med. Chem. 41, 2911-2927)0 (Dynal, Inc., Lake Success, Nueva York). Estas son particularmente útiles para ayudar en la purificación de la proteína. Se pueden usar tales proteoliposomas como productos intermedios y transferir el proteoliposoma estabilizado hasta otra superficie. Por ejemplo, un copo. Cuando se usa el proteoliposoma para inyección en un individuo, es preferible que la superficie esté hecha de un material biodegradable.

Aunque normalmente el proteoliposoma contendrá sólo la proteína integral de membrana de interés, hay ejemplos en los que se puede querer usar más de una proteína. Por ejemplo, se sabe que el receptor de quimiocina CCR5 actúa conjuntamente con la única proteína que atraviesa la membrana, CD4, en su interacción con la proteína gp120 del VIH. Así, se pueden preparar proteoliposomas que contienen CD4 así como la glucoproteína de la envuelta. En otra realización, se puede tener tanto CCR5 como CD4 así como la glucoproteína de la envuelta. Esto puede realizarse fácilmente etiquetando las proteínas con la misma etiqueta del epítopo en el extremo C-terminal y preparando perlas con el anticuerpo adecuado que reacciona con la etiqueta. Como alternativa, las proteínas pueden etiquetarse con diferentes etiquetas y se pueden preparar perlas que tienen mezclas de diferentes anticuerpos. Esto permitiría variar las proporciones de las dos proteínas en el proteoliposoma.

Las proteínas integrales de membrana usadas tienen preferiblemente una pluralidad de dominios transmembrana. Las proteínas preferidas incluyen GPCR (tales como receptores de quimiocina), canales iónicos, transportadores de aminoácidos, transportadores de glucosa, transportadores de fosfato, ATPasas de transporte, CFTR, y proteínas complejas de receptores nucleares. Se prefieren canales iónicos tales como canales de potasio, canales de calcio y canales de cloruro, canales de acuaporina, canales de orgánulos intracelulares tales como un canal de porina de mitocondrias o VDAC, canales de calcio del retículo endoplasmático, canal de porina de cloroplastos, y los canales de porina de bacterias. Preferiblemente las proteínas son proteínas de membrana eucariotas bacterianas, y virales. Todavía más preferiblemente las proteínas son de mamíferos.

Los proteoliposomas estables pueden producirse usando kits. Un kit preferido contiene viales que contienen reactivos para formar la membrana lipídica, un recipiente que contiene formas esféricas y elipsoidales, preferiblemente detergentes para extraer la proteína de interés y todavía más preferiblemente reactivos para obtener células que expresan la proteína de interés. Un kit contendrá preferiblemente instrucciones para preparar los proteoliposomas.

Los proteoliposomas estabilizados pueden usarse en una variedad de procedimientos diferentes.

Por ejemplo, como resultado de la homogeneidad de la proteína reconstituida, se puede usar los proteoliposomas para la caracterización estructural de la proteína reconstituida.

Pueden obtenerse concentraciones elevadas de la proteína sobre la perla. De esta manera puede usarse el proteoliposoma como un inmunógeno para obtener anticuerpos contra la conformación nativa de la proteína. Pueden usarse proteoliposomas para obtener anticuerpos contra diferentes epítopos expuestos durante diferentes conformaciones de una proteína. Por ejemplo, una proteína puede ensamblarse dentro de varios complejos multiméricos diferentes, dependiendo, por ejemplo, de la disponibilidad de los diferentes componentes de unión. Pueden usarse proteoliposomas que llevan diferentes complejos como inmunógenos, generando así anticuerpos contra diferentes epítopos sobre una única proteína que se exponen diferencialmente dependiendo de su unión a otras proteínas.

Los proteoliposomas pueden usarse para generar y también identificar un intervalo de anticuerpos. Por ejemplo, anticuerpos contra gp120 y gp41. Por ejemplo, pueden seleccionarse directamente anticuerpos que afectan a la interacción con los sitos de unión del receptor, por ejemplo usando un ensayo de unión directa. Por ejemplo, puede usarse un marcador fluorescente o radiactivo para marcar el proteoliposoma de gp120 y añadir CD4 soluble, o más preferiblemente un proteoliposoma que contiene CD4. Existen diversos CD4 solubles conocidos en la técnica incluyendo una versión de dos dominios (D1D2 sCD4) y de cuatro dominios. Los proteoliposomas de CD4 pueden añadirse a un medio que contiene un proteoliposoma de gp120 y puede seleccionarse un anticuerpo que bloqueará la unión entre los dos proteoliposomas. En otro ejemplo, el proteoliposoma puede contener tanto gp120 como CD4 y pueden observarse las interacciones con CCR5. Como alternativa, cuando se usa un derivado de gp120 trópica de células T podría usarse un proteoliposoma que contiene CXCR4. Entonces la unión puede medirse directamente. El anticuerpo de interés puede añadirse antes o tras la adición del proteoliposoma etiquetado y puede determinarse el efecto del anticuerpo sobre la unión comparando el grado de unión en esa situación frente a un patrón de referencia con ese proteoliposoma, en ausencia del anticuerpo.

Un ensayo preferido usa el proteoliposoma marcado, por ejemplo, que contiene un trímero de gp120 derivado de una cepa trópica M tal como JR-FL, yodado usando por ejemplo lactoperoxidasa en fase sólida (que tiene en un ejemplo una actividad específica de 20 \muCi/\mug). El proteoliposoma que contiene el receptor de quimiocina en este ejemplo contendría CCR5. Puede estar presente CD4 soluble.

Derivados de gp120

El proteoliposoma puede contener una variedad de derivados de gp120.

En una realización, el trímero de gp120 está compuesto por gp120 o gp125 con la región variable delecionada tal como se describe en las patentes estadounidenses números 5.858.366 y 5.817.316. Por ejemplo, la parte de gp120 conformacional debe contener un número suficiente de residuos de aminoácidos para definir el sitio de unión de la gp120 al receptor de quimiocina (por ejemplo, residuos 415-425 y el bucle V3) y un número suficiente de aminoácidos para mantener la conformación del péptido en una conformación que se aproxima a la de gp120 de tipo natural unida al CD4 soluble con respecto al sitio de unión al receptor de la quimiocina. En otras realizaciones, el bucle V3 puede retirarse para retirar los residuos de aminoácidos de enmascaramiento. Con el fin de mantener la conformación del polipéptido pueden insertarse residuos ligadores que permitan posibles giros en la estructura de los polipéptidos. Por ejemplo, residuos de aminoácidos tales como Gly, Pro y Ala. Se prefiere Gly. Preferiblemente, el residuo ligador es tan pequeño como sea necesario para mantener la configuración global. Normalmente, debe ser inferior al número de aminoácidos en la región variable que está delecionándose. Preferiblemente, el ligador tiene 8 residuos de aminoácidos o menos, más preferiblemente 7 residuos de aminoácidos o menos. Incluso más preferiblemente, la secuencia del ligador tiene 4 residuos de aminoácidos o menos. En una realización preferida la secuencia del ligador tiene un residuo. Preferiblemente el residuo ligador es Gly.

En una realización preferida, la parte de gp120 también contiene un sitio de unión a CD4 (por ejemplo desde los residuos 368 y 370 de la región C3, y desde los residuos 427 y 457 de la región C4). El sitio de unión a la quimiocina es un sitio de unión discontinuo que incluye partes de las regiones C2, C3, C4 y V3. Mediante deleción de las partes no esenciales del polipéptido gp120 (tales como deleciones de las partes de las regiones variables no esenciales (por ejemplo V1/V2) o partes en las regiones constantes (por ejemplo C1, C5)), puede aumentarse la exposición del sitio de unión a CD4. Otra realización se refiere a una parte de gp120 que contiene un sitio de unión a quimiocina. De forma similar, delecionando las partes no esenciales de la proteína, puede aumentarse la exposición del sitio de unión de la quimiocina. La exposición aumentada potencia la capacidad para generar un anticuerpo contra el receptor de CD4 o el receptor de quimiocina, inhibiendo así la entrada de virus. Se realiza la retirada de estas regiones mientras se requiere que el derivado para retener una conformación global que se aproxima a la de la proteína de tipo natural con respecto a la región de unión de gp120 nativa, por ejemplo, la región de unión a quimiocina cuando se forma un complejo con CD4. Además, pueden retirarse los sitios de glucosilación que pueden desecharse para un plegamiento apropiado. Puede logarse mantener la conformación usando los residuos ligadores descritos anteriormente que permiten posibles giros en la estructura de derivados de gp120 para mantener la estructura tridimensional global. Los residuos de aminoácidos preferidos que pueden usarse como ligadores incluyen Gly y Pro. También pueden usarse otros aminoácidos como parte del ligador, por ejemplo Ala. Se describen ejemplos de cómo preparar tales péptidos más completamente en Wyatt, R., et al., J. Virol. 69: 5723-5733,1995; Thali, M., et al., J. Virol. 67: 3978-3988, 1993; y las patentes estadounidenses números 5.858.366 y 5.817.316, que se incorporan al presente documento como referencia.

Un derivado de gp120 alternativo es uno en el que los ligadores usados dan como resultado una conformación para el derivado de modo que el sitio de unión discontinuo con el receptor de quimiocina se aproxima a la conformación del sitio de unión discontinuo para el receptor de quimiocina en el complejo gp 120 de tipo natural/CD4. Pueden prepararse fácilmente estos derivados por un experto en la técnica basándose en las metodologías descritas anteriormente y seleccionadas en los ensayos mostrados en el presente documento para garantizar que se obtiene una unión apropiada.

En una realización, se deleciona al menos un sitio de adición de azúcares. Preferiblemente el sitio de adición de azúcares está cerca de un epítopo conformacional. Esto puede lograrse por medios conocidos. Por ejemplo, puede delecionarse el aminoácido. En una realización ese aminoácido delecionado puede reemplazarse por otro residuo que no formará un sitio de adición de azúcares.

En una realización preferida, pueden delecionarse múltiples sitios de adición de azúcares. En una realización todavía más preferida los sitios de adición de azúcares pueden delecionarse de los monómeros delecionados del bucle variable.

Generación de anticuerpos

Los proteoliposomas pueden usarse para generar una reacción inmunitaria en un huésped por medios convencionales. Por ejemplo, puede suministrarse el proteoliposoma en un adyuvante.

Preferiblemente se administran el proteoliposoma con un adyuvante. Los adyuvantes se conocen bien en la técnica e incluyen hidróxido de aluminio, adyuvante de Ribi, etc. Preferiblemente, el proteoliposoma está compuesto por material biodegradable.

Pueden administrarse estos proteoliposomas a individuos mediante una variedad de medios. Por ejemplo, pueden incluirse en geles o espumas vaginales que se usan como medidas preventivas para evitar la infección y aplicarse antes de que la gente tenga relaciones sexuales.

Cuando se usan los proteoliposomas para administración se preparan en condiciones asépticas con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las dosis de las composiciones farmacéuticas variarán dependiendo del sujeto y de la vía particular de administración usada. Las dosificaciones pueden oscilar desde 0,1 \mug/kg hasta 100.000 \mug/kg al día, más preferiblemente de 1 \mug/kg a 10.000 \mug/kg.

Las vías de administración incluyen oral, parenteral, rectal, intravaginal, tópica, nasal, oftálmica, de inyección directa, etc.

Una composición farmacéutica a modo de ejemplo es una cantidad farmacéuticamente eficaz de un oligómero, anticuerpo, etc., que afecta por ejemplo a la capacidad del receptor para facilitar la infección por VIH, o que puede inducir una reacción inmunitaria, actuando así como un inmunógeno profiláctico, incluido opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable y compatible. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable y compatible" tal como se usa en el presente documento, y descrita más en detalle a continuación, incluye uno o más diluyentes de carga sólidos o líquidos compatibles o sustancias de encapsulación que son adecuadas para la administración a un ser humano u otro animal. En la presente invención, el término "vehículo" indica así un componente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combinan las moléculas de al invención para facilitar la aplicación. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" es esa cantidad de la presente composición farmacéutica que produce un resultado deseado o ejerce una influencia deseada sobre el estado particular que se está tratando. Por ejemplo, la cantidad necesaria para producir una reacción inmunitaria para proporcionar protección profiláctica. Normalmente, cuando está usándose la composición como un inmunógeno profiláctico se administrará al menos una "dosis de refuerzo" en un intervalo periódico tras la administración inicial. Pueden usarse diversas concentraciones en la preparación de composiciones que incorporan el mismo componente para prever las variaciones en la edad del paciente que va a tratarse, la gravedad del estado, la duración del tratamiento y el modo de administración.

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En un procedimiento preferido de inmunización se cebará con un proteoliposoma que contiene el trímero de gp120 con el bucle variable delecioando, y después suministrar una dosis de refuerzo con un proteoliposoma que contiene un trímero de gp120 que se aproxima más a la glucoproteína viral de tipo natural hasta al menos una dosis de refuerzo final con proteoliposomas que contienen el trímero de tipo natural estabilizado. Por ejemplo, si se delecionan múltiples regiones variables y sitios de adición de azúcares del trímero cebador, la siguiente dosis de refuerzo será con un trímero en el que están presentes más aminoácidos de región variable y/o están presentes sitios de adición de azúcares. Cada dosis de refuerzo se acercará más a la configuración de tipo natural hasta que se logre esa configuración.

Las dosis de las composiciones farmacéuticas de la invención variarán dependiendo del sujeto y de la vía particular de administración usada. Las dosificaciones pueden oscilar desde 0,1 \mug/kg hasta 100.000 \mug/kg por día, más preferiblemente de 1 \mug/kg a 10.000 \mug/kg. Únicamente a modo de ejemplo, podría usarse un intervalo de dosis global desde aproximadamente, por ejemplo, 1 microgramo hasta aproximadamente 300 microgramos para su uso por seres humanos. Esta dosis puede administrarse a intervalos periódicos basándose en la composición. Por ejemplo al menos en dos ocasiones por separado, preferiblemente espaciadas por aproximadamente 4 semanas. En la realización en la que el cebador es el proteoliposoma que contiene los trímeros de gp120 con el bucle variable delecionado, con la dosis de refuerzo de proteoliposomas que contienen gp120 nativa, o gp120 nativa, se prefiere actualmente tener una serie de la menos 2 dosis de refuerzo, preferiblemente de 3 a 5 dosis de refuerzo extendidas durante un año. Otros compuestos pueden administrarse diariamente. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden administrarse a un sujeto según una variedad de otros protocolos bien caracterizados. Por ejemplo, ciertos regimenes de inmunización aceptados actualmente pueden incluir lo siguiente: (i) los tiempos de administración son una primera dosis en la fecha elegida; una segunda dosis un mes tras la primera dosis; y una tercera dosis en una fecha posterior, por ejemplo, 5 meses tras la segunda dosis. Véase la información del producto, Physician's Desk Reference, Merck Sharp & Dohme (1990), en las págs. 1442-43 (por ejemplo, el protocolo del tipo de la vacuna contra la hepatitis B); (ii) por ejemplo, con otras vacunas la administración recomendada para niños es una primera dosis en la fecha elegida (a las 6 semanas de edad o más); una segunda dosis 4-8 semanas tras la primera dosis; una tercera dosis 4-8 semanas tras la segunda dosis; una cuarta dosis 6-12 meses tras la tercera dosis; una quinta dosis a los 4-6 años de edad; y dosis de refuerzo adicionales cada 10 años tras la última dosis. Véase la información del producto, Physician's Desk Reference, Merck Sharp & Dohme (1990), pág. 879 (por ejemplo, protocolos de vacunas del tipo de difteria, tétanos y tosferina). Los intervalos de tiempo deseados para la administración de múltiples dosis de una composición particular pueden determinarse por un experto en la técnica sin emplear nada más que la experimentación rutinaria.

Anticuerpos

Se pretende que el término "anticuerpos" incluya anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y anticuerpos preparados por técnicas de ácido nucleico recombinante que son selectivamente reactivas con polipéptidos codificados por secuencias de nucleótidos de la presente invención. La expresión "selectivamente reactivo" se refiere a aquellos anticuerpos que reaccionan con uno o más determinantes antigénicos por ejemplo en gp120 y no reaccionan con otros polipéptidos. Los determinantes antigénicos consisten normalmente en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y tienen características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas. Los anticuerpos pueden usarse para aplicaciones de diagnóstico o con fines de investigación, así como para bloquear las interacciones de unión.

Para la preparación de anticuerpos dirigidos contra los proteoliposomas inmunogénicos, puede usarse cualquier técnica que prevé la producción de moléculas de anticuerpos.

Por ejemplo, pueden inmunizarse ratones dos veces por vía intraperitoneal con aproximadamente 50 microgramos de inmunógeno de proteoliposoma por ratón. Pueden someterse a prueba los sueros de tales ratones inmunizados para determinar la actividad del anticuerpo mediante inmunohistología o inmunocitología en cualquier sistema huésped que expresa tal polipéptido o contra otro proteoliposoma o mediante ELISA con el polipéptido expresado. Para la inmunohistología, pueden identificarse los anticuerpos activos de la presente invención usando una inmunoglobulina anti-ratón conjugada con biotina seguida por avidinperoxidasa y un sustrato de peroxidasa cromogénico. Las preparaciones de tales reactivos están disponibles comercialmente; por ejemplo, de Zymed Corp., San Francisco, California. Los ratones cuyos sueros contienen anticuerpos activos que pueden detectarse según la invención pueden sacrificarse tres días más tarde y extirparse sus bazos para fusión y producción de hibridomas. Pueden identificarse los sobrenadantes positivos de tales hibridomas usando los ensayos descritos anteriormente mediante, por ejemplo, análisis de inmunotransferencia de tipo Western.

Otro procedimiento para preparar anticuerpos es usar ARNm de hibridomas o ARNm esplénico como una plantilla para la amplificación de PCT de tales genes [Huse, et al., Science 246:1276 (1989)]. Por ejemplo, pueden derivarse intracuerpos de hibridomas monoclonales murinos [Richardson, J. H., et al., Biochem and Biophys Res Comm. 197: 422-427 (1993); Mhashilkar, A. M., et al., EMBO J. 14:1542-1551 (1995)]. Estos hibridomas proporcionan una fuente fiable de reactivos bien caracterizados para la construcción de anticuerpos y son particularmente útiles cuando se ha caracterizado previamente la afinidad y reactividad de su epítopo. Otra fuente para tal construcción incluye el uso de líneas celulares que producen anticuerpos monoclonales humanos [Marasco, W. A., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:7889-7893 (1993); Chen, S. Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-5936 (1994)]. Otro ejemplo incluye el uso de tecnología de presentación en fagos de anticuerpos para construir nuevos anticuerpos contra diferentes epítopos en una molécula diana [Burton, D. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-1-137 (1991); Hoogenboom, H. R., et al., Immunol. Rev. 130:41-68 (1992); Winter, G., et al., Ann. Rec. Immunol. 12:433-355 (1994); Marks, J. D., et al., J. Biol. Chem. 267:16007-16010 (1992); Nissim, A., et al., EMBO J. 13:692-698 (1994); Vaughan, T. J., et al., Nature Bio. 14:309-314 (1996); Marks, C., et al., New Eng. J. Med 335: 730-733 (1996)]. Por ejemplo, se han creado y pueden crearse bibliotecas muy grandes de sFV humano no tratado para ofrecer una gran fuente de genes de anticuerpos transpuestos contra una plétora de moléculas diana. Pueden construirse bibliotecas más pequeñas a partir de individuos con trastornos autoinmunitarios [Portolano, S., et al., J. Immunol. 151:2839-2851 (1993); Barbas, S. M., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:2529-2533 (1995)] o enfermedades infecciosas [Barbas, C. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9339-9343 (1992); Zebedee, S. L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:3175-3179 (1992)] con el fin de aislar anticuerpos específicos contra la enfermedad.

Otras fuentes incluyen ratones transgénicos que contienen un locus de inmunoglobulina humana en vez del locus de ratón correspondiente así como hibridomas estables que segregan anticuerpos específicos contra antígenos humanos [Lonberg, N., et al., Nature 368:856-859 (1994); Green, L.L., et al., Nat. Genet. 7:13-21 (1994)]. Tales animales transgénicos proporcionan otra fuente de genes de anticuerpos humanos mediante tecnología de hibridoma convencional o bien en combinación con tecnología de presentación en fagos. Se han notificado procedimientos in vitro para manipular la afinidad y encontrar especificidad del sitio de unión a antígenos incluyendo la clonación por repertorio [Clackson, T., et al., Nature 352: 624-628); Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991); Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)], maduración de afinidad in vitro [Marks, J.D., et al., Biotech 10: 779-783 (1992); Gram, H., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 3576-3580 (1992)], bibliotecas semisintéticas [Hoogenboom, H. R., citado anteriormente; Barbas, C. F., citado anteriormente; Akamatsu, Y., et al., J. Immunol. 151: 4631-4659 (1993)] y selección guiada [Jespers, L.S. et al., Bio Tech 12: 899-902 (1994)]. Los materiales de partida para estas estrategias basadas en ADN recombinante incluyen ARN de bazos de ratón [Clackson, t., citado anteriormente] y linfocitos de sangre periférica humana [Portolano, S., et al., citado anteriormente; Barbas, C.F., et al., citado anteriormente; Marks, J.D., et al., citado anteriormente; Barbas, C.F., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88: 7978-7982 (1991)] y órganos linfoides y médula ósea de donantes infectados con VIH-1 [Burton, D. R., et al., citado anteriormente; Barbas, C.F., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:9339-9343 (1992)].

Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los proteoliposomas, puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas. Por ejemplo, la técnica del hibridoma desarrollada originariamente por Kohler y Milstein (Nature, 256: 495-7,1973), así como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., Immunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma del EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos, y similares, están dentro del alcance de la presente invención. Véase, en general, Larrick et al., patente estadounidense 5.001.065 y referencias citadas en la misma. Además, también están disponibles procedimientos de anticuerpos de cadenas sencillas (SCA) para producir anticuerpos contra polipéptidos codificados por una secuencia de nucleótidos eucariotas de la invención (Ladner et al., patentes estadounidenses 4.704.694 y 4.976.778).

Los anticuerpos monoclonales pueden ser anticuerpos monoclonales humanos o anticuerpos monoclonales quiméricos de ser humano-ratón (u otras especies). La presente invención proporciona moléculas de anticuerpos así como fragmentos de tales moléculas de anticuerpos.

Los expertos en la técnica reconocerán que puede acoplarse una gran variedad de posibles restos a los anticuerpos resultantes o preferiblemente a los trímeros estabilizados o a otras moléculas de la invención. Véase, por ejemplo, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse y R. E. Lewis, Jr (eds.), Carger Press, Nueva York, 1989, cuyo contenido total se incorporan por referencia en el presente documento.

Puede lograrse el acoplamiento mediante cualquier reacción química que una las dos moléculas siempre y cuando el anticuerpo y el otro resto conserven sus actividades respectivas. Esta unión puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo, enlace covalente, unión por afinidad, intercalación, enlace de coordinación y formación de complejos. Sin embargo, la unión preferida es el enlace covalente. Puede lograrse un enlace covalente mediante condensación directa de las cadenas laterales existentes o bien mediante la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes de ligamiento bivalentes o polivalentes son útiles para acoplar moléculas de proteínas, tales como los anticuerpos de la presente invención, a otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, disocianatos, glutaraldehídos, diazobencenos y hexametilendiaminas. La lista no pretende ser exhaustiva de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la técnica, sino que más bien, es a modo de ejemplo de los agentes de acoplamiento más comunes (véase Killen and Lindstrom, J. Immunol. 133:1335-2549,1984; Jansen, F. K., et al., Imm. Rev. 62:185-216, 1982; y Vitetta et al., citado anteriormente).

Se describen los ligadores preferidos en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Ramakrishnan, S., et al., Cancer Res. 44: 201-208 (1984), que describe el uso de MBS (éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Véase también Umemoto et al., patente estadounidense 5.030.719, que describe el uso de de un derivado de acetilhidrazida halogenado acoplado a un anticuerpo mediante un ligador oligopeptídico. Los ligadores particularmente preferidos incluyen: (i) EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodiimida;) (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)-tolueno) (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G)); (iii) SPDP (hexanoato de succinimidil-6-[3-(2-piridilditio)-propionamido]) (Pierce Chem. Co., número de catálogo 21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (hexanoato de sulfosuccinimidil-6-[3-(2-piridilditio)-propianamida]) (Pierce Chem. Co. número de catálogo 2165-G); y (v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida: Pierce Chem. Co., número de catálogo 24510) conjugado con EDC.

Los ligadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen diferentes atributos, conduciendo así a conjugados con propiedades fisico-químicas diferentes. Por ejemplo, los ésteres sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son más estables que los ésteres sulfo-NHS de carboxilatos aromáticos. Los ligadores que contienen ésteres de NHS son menos solubles que los ésteres de sulfo-NHS. Además, el ligador SMPT contiene un enlace disulfuro estéricamente impedido, y puede formar conjugados con estabilidad aumentada. Los enlaces disulfuro son, en general, menos estables que otros enlaces puesto que el enlace disulfuro se rompe in vitro, dando como resultado menos conjugado disponible. En particular, el sulfo-NHS puede potenciar la estabilidad de los acoplamientos de carbodiimida. Los acoplamientos carbodiimida (tales como EDC) cuando se usan junto con sulfo-NHS, forman ésteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodiimida sola.

Pueden detectarse los complejos que se forman con moléculas de la presente invención mediante los ensayos apropiados, tales como el ensayo de unión directo analizado anteriormente y mediante otros tipos convencionales de inmunoensayos.

En una realización preferida, se puede explorar una biblioteca de presentación en fago buscando para encontrar anticuerpos contra una proteína dada o para encontrar ligandos que se unirán a la proteína.

También pueden usarse estos proteoliposomas para explorar bibliotecas para determinar un compuesto deseado. Se pueden usar también estos proteoliposomas para explorar bibliotecas químicas complejas de compuestos de bajo peso molecular (<1000 daltons) para identificar ligandos de afinidad elevada. Estos compuestos podrían servir como los principales compuestos para el descubrimiento de fármacos agonistas y antagonistas.

Si se conoce un ligando que interacciona con la proteína, se pueden usar estos proteoliposomas en ensayos para seleccionar compuestos que modulan tales interacciones con la proteína. Por ejemplo, en los proteoliposomas que contienen CCR5/CD4 mencionados anteriormente, se puede añadir gp120 a la mezcla y añadir otros compuestos para observar su efecto sobre la formación o estabilidad del complejo CD4/gp120/CCR5.

También se puede usar la etiqueta del anticuerpo para orientar a la inversa el proteoliposoma. Tal como se usa en el presente documento una proteína orientada a la inversa tendrá la parte de la proteína que está normalmente presente intracelularmente presente sobre la superficie del proteoliposoma. Entonces se pueden seleccionar compuestos o proteínas que llevan a cabo interacciones intracelulares. Por ejemplo, se puede analizar la unión de ligandos intracelulares así como extracelulares, así como compuestos y proteínas que afectarán las uniones intracelulares así como extracelulares.

El presente procedimiento no se limita a múltiples proteínas que atraviesan la membrana que unen ligandos pequeños. Puede estudiarse prácticamente cualquier proteína integral de membrana.

También puede usarse este procedimiento para identificar pequeños antagonistas en un ensayo que analiza compuestos que afectan a la unión de un ligando conocido. Por ejemplo, la entrada del virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1) dentro de células huésped requiere normalmente la interacción secuencial de la glucoproteína de la envuelta exterior de gp120 con la glucoproteína CD4 y un receptor de quimiocina sobre la membrana celular. La unión de CD4 induce cambios conformacionales en gp120 que permiten una unión de alta afinidad al receptor de quimiocina. EL receptor de \theta-quimiocina CCR5 es el principal correceptor del VIH-1 usado durante la infección natural y transmisión. Los individuos con defectos homocigóticos en CCR5 están sanos pero relativamente resistentes a la infección por VIH-1. Aunque algunos aislados del VIH-1 pueden adaptarse en cultivos tisulares para replicarse sobre células que carecen de CD4, la unión al receptor de quimiocina parece ser esencial para la entrada del virus dentro de la célula huésped. Estas observaciones sugieren que la inhibición de la interacción gp120-CCR5 podría ser un enfoque profiláctico o terapéutico útil contra la infección por VIH-1. Se han identificado un análogo de la quimiocina, AOP-RANTES (Simmons, G. et al. (1997), Science: 276: 276-279), y un compuesto de bajo peso molecular (TaKeda) (Baba, M. et al. (1999), Proc. Natl. Acad Sci. USA 96: 5698-5703) que unen CCR5 e inhiben la infección por VIH-1 en cultivos tisulares, aunque todavía falta por demostrar la utilidad clínica.

Cuando se solubilizan usando condiciones de sal y detergente específicas, el CCR5 humano puede conservar su capacidad para unir complejos de gp120-CD4 del VIH-1 y anticuerpos monoclonales dependientes de la conformación (Mirzabekov et al., JBC). Sin embargo, el CCR5 solubilizado en detergente muestra requisitos muy estrictos con respecto a las condiciones en las que se conserva la conformación nativa y tiene duración limitada. Así, no es práctico usar preparaciones purificadas de CCR5 solubilizado en ensayos de selección. Los CCR5-proteoliposomas tienen CCR5 nativo, homogéneo fijado a la superficie de una perla paramagnética de una manera orientada. La preparación de CCR5-proteoliposomas es relativamente independiente de la densidad de CCR5 sobre la superficie de las células usadas como una fuente del receptor de quimiocina, y también permite la concentración de CCR5 sobre la superficie de la perla. Una bicapa lipídica, tal como la reconstituida alrededor de la perla, proporciona un entorno de membrana natural para la proteína CCR5, permitiendo el mantenimiento a largo plazo de la conformación de CCR5 nativa.

En consecuencia, el presente procedimiento produce una bicapa lipídica esférica fácilmente manipulable que contiene una cantidad relativamente grande de proteína integral de membrana estable, orientada, y pura. Esto permite que estas proteínas se usen en aplicaciones que estaban restringidas anteriormente al uso de proteínas purificadas solubles.

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Como un ejemplo específico, pueden prepararse perlas no porosas, paramagnéticas rodeadas de una bicapa de membrana lipídica que contiene CCR5 humano en una conformación nativa tal como se expone a continuación. Puede expresarse CCR5 en timocitos caninos Cf2Th transfectados con un gen de CCR5 optimizado por codón. La proteína CCR5 contiene una etiqueta nonapeptídica (C9) en el C-terminal que se reconoce por el anticuerpo monoclonal 1D4. En un primer enfoque, se prepararon los lisados de células Cf2Th que expresan CCR5 (Cf2Th-CCR5) usando los detergentes que mostraron permitir la retención de la formación de CCR5 nativo. Se purificó por afinidad el CCR5 de los lisados que usaban perlas de 1D4-Sepharose y se eluyeron usando el nonapéptido C9 correspondiente a la etiqueta del epítopo C-terminal. Se añadió CCR5 en una disolución de detergente, junto con una mezcla lipídica solubilizada en detergentes que contenía DPPE-biotina al 1%, a perlas revestidas con estreptavidina. Durante la posterior retirada del detergente por diálisis, se incorporaron moléculas de CCR5 dentro de la membrana lipídica que se ensambla por sí misma alrededor de la perla. El análisis de FACS de estas perlas reveló un reconocimiento equivalente de CCR5 por dos anticuerpos, el anticuerpo 5C7 dirigido contra un epítopo de CCR5 N-terminal lineal y el anticuerpo 1D4 contra la etiqueta del epítopo C-terminal (datos no mostrados). Puesto que se espera que los epítopos de 5C7 y 1D4 residan en lados opuestos de la membrana en el CCR5 nativo, este resultado sugiere una orientación aleatoria (el 50% al derecho, el 50% al revés) del CCR5 en la membrana lipídica. Para examinar el estado conformacional del CCR5 en la membrana, se comparó el reconocimiento por el anticuerpo 5C7 con el del anticuerpo 2D7, que reconoce un epítopo dependiente de la conformación en el ectodomino del CCR5. El reconocimiento del CCR5 reconstituido por 2D7 fue inferior que por el 5C7 (datos no mostrados), indicando que sólo una fracción de CCR5 conservaba una conformación nativa.

En un segundo enfoque, se capturó CCR5 solubilizado en detergente sobre perlas paramagnéticas conjugadas con el anticuerpo 1D4. Tras la adición de lípidos solubilizados en detergente y diálisis, se reconstituyó la membrana basándose únicamente en la atracción de moléculas lipídicas a las regiones hidrófobas que atraviesan la membrana de CCR5. Se realizó el análisis microscópico confocal y de FACS de estos proteoliposomas usando los anticuerpos 5C7 y 2D7 conjugados con ficoeritrina. En algunos experimentos, se visualizó la bicapa de la membrana lipídica preparando los proteoliposomas con DOPE conjugado con rodamina. Estos resultados indicaron que las perlas adquirieron una membrana con mucha menor eficacia que en el procedimiento descrito anteriormente. Además, una fracción de CCR5 parecía estar desnaturalizada (datos no mostrados).

En un tercer enfoque, se usó el procedimiento de la presente invención (figura 1). Se conjugaron las perlas paramagnéticas tanto con el anticuerpo 1D4 como con la estreptavidina. El anticuerpo 1D4 permitió una purificación y concentración sencillas de CCR5 a partir de lisados celulares, así como su orientación sobre la superficie de las perlas. La estreptavidina permitió la reconstitución estable y de saturación de la membrana alrededor de la perla. Se descubrió que una proporción molar 10:1 de anticuerpo 1D4:estreptavidina era óptima con respecto a la densidad más alta del CCR5 reconstituido y la terminación de la membrana en los proteoliposomas paramagnéticos (datos no mostrados). Es posible variar la proporción de anticuerpo:estreptavidina, si fuese necesario, desde 100:1 hasta 1:1000 o menos en diferentes aplicaciones.

De los tres enfoques empleados, los CCR5-proteoliposomas preparados mediante el tercer enfoque mostraron el reconocimiento más eficaz por el anticuerpo 2D7 dependiente de la conformación. De hecho, el reconocimiento por el anticuerpo 2D7 fue prácticamente igual al del anticuerpo 5C7 (datos no mostrados), lo que indicaba que una gran parte de CCR5 en estas preparaciones de proteoliposomas está en conformación nativa.

Se discuten a continuación las propiedades de y los procedimientos en los que pueden usarse estos proteoliposomas:

a)

Pureza de la proteína reconstituida: El procedimiento para la producción del proteoliposoma, por ejemplo, CCR5-proteoliposomas, permite la purificación de la proteína antes de la reconstitución en membranas lipídicas. Esta característica permitió examinar la unión del ligando tal como la unión de gp120 de VIH-1 a CCR5 esencialmente puro en la membrana proteoliposomal. En este caso, no pareció requerirse ninguna otra proteína celular en cantidades estequiométricas para la unión eficaz de gp120 a CCR5, distinta de la glucoproteína de s CD4. En consecuencia, se puede usar esta tecnología de proteoliposomas para tratar si las proteínas celulares (por ejemplo, proteínas distintas de CD4 y CCR5) son necesarias para la fusión a la membrana mediada por glucoproteinas de la envuelta del VIH-1.

La pureza de la proteína reconstituida es ventajosa para el uso de proteoliposomas paramagnéticos para identificar ligandos de bibliotecas de proteínas recombinantes o compuestos químicos. Por ejemplo, se han seleccionado recientemente anticuerpos dirigidos contra CCR5 usando CCR5-proteoliposomas paramagnéticos para explorar una biblioteca de presentación en fago de fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla (Kontos et al., datos no publicados). De forma similar, es posible el examen de las bibliotecas de compuestos químicos por incubación de proteoliposomas paramagnéticos con mezclas complejas, seguida de la retirada y análisis de los restos que interaccionan con la proteína de membrana reconstituida de interés. En otro formato, pueden usarse los proteoliposomas paramagnéticos que contienen la proteína de membrana diana de interés y marcadas de forma fluorescente para detectar ligandos entre una serie grande de compuestos químicos anclados sobre un soporte sólido.

La presencia de antígeno de proteínas puras en los proteoliposomas paramagnéticos provocará la generación de respuestas inmunitarias más específicas en animales inmunizados con estas preparaciones.

La pureza de la proteína de membrana reconstituida en los proteoliposomas puede ser una desventaja para algunas aplicaciones. Por ejemplo, si la unión de un ligando de interés depende de otros restos celulares, los estudios con proteoliposomas pueden imitar de forma imperfecta los acontecimientos de unión que ocurren en la superficie de una célula. Por ejemplo, no se ha podido demostrar la unión eficaz de la \beta-quimiocina, MIP-1\alpha, a los CCR5-proteoliposomas (datos no mostrados), lo que indica que los requisitos para la unión de gp120 de VIH-1 y MIP-1\alpha a CCR5 pueden diferir. Se ha sugerido que la unión eficaz de algunas quimiocinas a sus receptores depende de proteoglucanos sobre la superficie celular o de la dimerización o acoplamiento a la proteína G del receptor (Zeng, F. Y. et al (1999), J. Biol. Chem. 274:19487-19497). Sin embargo, se pueden producir proteoliposomas de CCR5 que contienen estos factores adicionales para confirmar su papel en la unión de ligandos.

b)

Homogeneidad de la proteína reconstituida. El protocolo que se prefiere utiliza perlas conjugadas tanto con estreptavidina como con un anticuerpo tal como el anticuerpo 1D4 contra la etiqueta del epítopo C-terminal sobre CCR5. La inclusión de estreptavidina permite la fijación del lípido biotinilado a la superficie de la perla y da como resultado una membrana más estable y completa alrededor de la perla. Por ejemplo, el CCR5 reconstituido dentro de estas membranas mostró una homogenedidad conformacional superior basándose en el reconocimiento relativo por los anticuerpos 5C7 y 2D7. La homogeneidad de la proteína reconstituida en los proteoliposomas puede ser importante para la caracterización estructural de la proteína reconstituida.

c)

Concentración de la proteína reconstituida. Se determina la concentración de la proteína reconstituida en los proteoliposomas por la densidad del anticuerpo de captura conjugado sobre la superficie de la perla y la concentración de la proteína de interés en los lisados celulares. Pueden manipularse estos dos parámetros mediante medios conocidos para permitir la concentración adecuada de proteínas de interés que se expresan sólo en niveles moderados en las células productoras.

d)

Orientación de la proteína reconstituida. La conjugación a las perlas de los anticuerpos particulares que reconocen las partes extracelulares o intracitoplásmicas de la proteína reconstituida de interés permiten su orientación en la membrana de los proteoliposomas. Por ejemplo, además del uso del anticuerpo 1D4 contra la etiqueta del epítopo C-terminal de CCR5 para orientar el CCR5, también se puede conjugar el anticuerpo 2D7 a la superficie de las perlas, permitiendo una orientación al revés (inversa) de CCR5 en el proteoliposoma (datos no mostrados). La capacidad para lograr ambas orientaciones de la proteína en los proteoliposomas paramagnéticos permite que se estudie la unión de ligandos intracelulares así como extracelulares.

Los proteoliposomas paramagnéticos son estables durante periodos de tiempo prolongados. Se conservó la integridad del epítopo de CCR5 dependiente de la conformación reconocido por el anticuerpo 2D7 tras la exposición de CCR5-proteoliposomas a condiciones agresivas (pH alto o bajo, extremos de fuerza iónica, intervalos de temperatura). Debido a que varias de estas condiciones han mostrado que desnaturalizan CCR5 solubilizado en detergentes (Mirzabekov), la estabilidad conformacional observada indica que el CCR5 en los proteoliposomas está en un entorno, presumiblemente dentro de la membrana lipídica, que es fuertemente propicio para la conservación de la estructura nativa. Esta propiedad permite el intercambio rápido de tampones externos que son útiles para estudios funcionales de varios tipos de proteínas integrales de membrana. También se facilita el almacenamiento a largo plazo de los proteoliposomas por la estabilidad de la conformación nativa de la proteína de interés en este contexto.

Ejemplos Ejemplo 1 Proteoliposomas que contienen CCR5 Construcción y expresión de CCR5 de codón optimizado (synCCR5)

Se realizó el análisis del uso de codones para 45 GPCR que representaban diferentes subfamilias de proteínas con datos del GenBank^{TM} y software desarrollado por el grupo de secuencias genómicas de la universidad de Wisconsin ("University of Wisconsin Genome Sequence Group"). Se optimizó la secuencia que codifica CCR5 humano para el uso de codones de células de mamíferos (Andre, S., et al. (1999). J. Virology 72: 1497-1503) utilizando los siguientes codones: alanina (GCC), arginina (CGC), asparagina (AAC), ácido aspartico (GAC), cisteína (TGC), ácido glutámico (GAG), glutamina (CAG), glicina (GGC), histidina (CAC), isoleucina (ATC), leucina (CTG), lisina (AAG), metionina (ATG), fenilalanina (TTC), prolina (CCC), serina (TCC), treonina (ACC), triptófano (TGG), tirosina (TAC) y valina (GTG). Se modificaron las secuencias en 5' y 3' que flanquean la secuencia de codificación de CCR5. Tras los sitios de restricción para EcoRV, EcoRI y HindIII, se colocó el consenso de Kozak (GCCGCCACCATGG) (SEQ ID NO:1) inmediatamente en 5' con respecto al marco de lectura de CCR5. Se introdujo inmediatamente una secuencia que codifica un único residuo de glicina seguido de la etiqueta peptídica C9 de rodopsina bovina (TETSQVAPA) (SEQ ID NO:2) en 5' con respecto al codón de terminación natural de CCR5. En el extremo 3' del gen de CCR5 marcado con etiqueta con el epítopo, se introdujeron los sitios de restricción XbaI, SalI, y NotI. Se prepararon constructos análogos para el gen de CCR5 humano de tipo natural y el gen de rodopsina bovino, excepto que no se alteraron los codones y, en el último caso, la secuencia C9 C-terminal estaba presente de forma natural.

Se construyeron un total de 34 oligonucleótidos, cada uno de aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, correspondiente a las cadenas sentido y antisentido del gen de synCCR5 y las secuencias flanqueantes, de modo que aproximadamente el 50% de sus secuencias eran complementarias a las de cada una de los dos oligonucleótidos complementarios de la cadena opuesta. Se desprotegieron los oligonucleótidos en hidróxido de amonio puro a 65ºC durante 4 h, tras lo cual se evaporó el hidróxido de amonio, y se disolvieron los oligonucleótidos en agua hasta una concentración final de 2 nM. Para la síntesis del gen, se separaron los 34 oligonucleótidos en cinco grupos (6 u 8 oligonucleótidos por grupo) y se realizaron 25 ciclos de la reacción en cadena de la polimerasa usando polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) y un exceso molar de 3 veces de los oligonucleótidos 5' y 3' terminales en cada grupo. Esta etapa generó cinco segmentos pequeños del gen synCCR5 con extremos complementarios y superpuestos. Se combinaron cantidades iguales de cada producto de reacción en cadena de la polimerasa con un exceso molar de 3 veces de los oligonucleótidos 5' y 3' terminales de la secuencia de synCCR5 completa. Una segunda ronda de 25 ciclos de reacción en cadena de la polimerasa rindió la secuencia de synCCR5 completa. Se secuenció el producto para garantizar que la secuencia era correcta.

Se clonaron syncCCR5, CCR5 de tipo natural y secuencias de rodopsina bovina en los siguientes vectores: PMT4 (una donación del Dr. Reeves, Massachusetts Institute of Technology, PACH (una donación del Dr. Velan, Israel Institute for Biological Research, pcDNA 3.1(+) y pcDNA4/ HisMax (Invitrogen), y PND (una donación del Dr. Rhodes, (Universidad de California, Davis). Tras clonar el gen de synCCR5 en el vector pcDNA4/ HisMax, se retiró la secuencia que codifica la región HisMax N-terminal por mutagénesis QuikChange (Stratagene). Se transfectaron diferentes líneas celulares con los genes de synCCR5 y CCR5 de tipo natural usando el reactivo de transfección GenePorter (San Diego, CA). Tras la transfección, se seleccionaron las células que expresan CCR5 con 0,8 mg/ml de neomicina (G418). Se seleccionaron las células que expresan los niveles superficiales más elevados de CCR5 mediante FACS tras la tinción de las células con el anticuerpo 2D7-PE anti-CCR5 conjugado con R-ficoeritrina (Pharmingen, San Diego, CA). Entre todas las células sometidas a prueba (timocitos caninos Cf2Th, células HEK- 293T del riñón de embriones humanos, COS-1, y HeLa (Colección americana de cultivos tipo)), se observaron los niveles de expresión de CCR5 más elevados en células Cf2Th y HEK-293T transfectadas con gen synCCR5 en el vector PACH. Se seleccionaron los clones que expresan syn-CCR5 más elevados por FACS de un total de 76 clones de células Cf2Th y 62 clones de células HEK-293T.

Radiomarcado e inmunoprecipitación de CCR5

Aproximadamente 4 X 10^{6} células Cf2Th o HEK-293T que expresaban CCR5 que se hicieron crecer hasta confluencia completa en placas de 100 mm se lavaron dos veces en PBS y se les dejó de alimentar durante 1 h a 37ºC en medio de Eagle modificado por Dulbecco sin cisteína y metionina (Sigma) o en medios libres de sulfato (ICN, Costa Mesa, CA). Se retiró el medio de inanición y se añadieron 200 TCi de [^{35}S]metionina y [^{35}S]cisteína cada uno o se añadieron 500 TCi de [^{35}S]sulfato (NEN Life Science Products) en 4 ml de medio a las células durante diversos tiempos para experimentos de pulso y seguimiento (pulse-chase) o durante la noche (12 h) en todos los demás casos. Se lavaron las células dos veces con PBS y se lisaron en 1 ml de medio de solubilización constituido por (NH_{4})_{2}SO_{4} 100 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), glicerol al 10%, detergente al 1% (p/v) (véase a continuación), y mezcla de inhibidores de proteasas (un comprimido de Complete^{TM} (Roche Molecular Biochemicals) por 25 ml). Se incubó el lisado a 4ºC durante 30 min sobre una plataforma oscilante, y se retiró el residuo celular por centrifugación a 14.000 x g durante 30 min. Se precipitó CCR5 con 20 1l de perlas de 1D4-Sepharose (Reeves, P., Thurmond, R. L., y Khorana, G. G. (1996) Proc. Natl. Acad Sci. USA 4: 7784-90) durante la noche, tras lo cual se lavaron las perlas seis veces en el medio de solubilización y se granularon. Se añadió un volumen igual de tampón de muestra-SDS 2X a las perlas, seguido de resuspensión e incubación durante 1 h a 55ºC. Se corrieron las muestras sobre minigeles de SDS-poliacrilamida al 11%, que se visualizaron por autorradiografía o se analizaron sobre un sistema de detección y cuantificación de la radiactividad Dinámico molecular (Sunnyvale, CA).

Se sometió a prueba un total de 18 detergentes en los tampones de solubilización. Los detergentes, con abreviaturas y concentraciones de micelas críticas entre paréntesis, fueron n-octil-\beta-D-glucopiranósido (23,4 mM), n-decil-\beta-D-maltósido (1,8 mM), n-dodecil-\beta-D-maltósido (DDM) (0,17 mM), ciclohexil-butil-\beta-D-maltósido (Cymal^{TM}-4, 7,6 mM), ciclohexil-pentil-\beta-D-maltósido (Cymal^{TM}-5, 2,4 mM), ciclohexil-hexil-\beta-D-maltósido (Cymal^{TM}-6, 0,56 mM), ciclohexil-heptil-\beta-D-maltósido (Cymal^{TM}-7, 0,19 mM), ciclo-hexilpropanoil-N-hidroxietilglucamida (108 mM), ciclohexilbutanoil-N-hidroxietilglucamida (35 mM), ciclohexilpentanoil-N-hidroxietilglucamida (11,5 mM), N-octilfosfocolina (Fos-Choline^{TM} 8, 114 mM), N-decilfosfocolina (Fos-Choline^{TM} 10, 11 mM), N-dodecilfosfocolina (Fos-Choline^{TM} 12, 1,5 mM),N-tetradecilfosfocolina (Fos-Choline^{TM}14, 0,12 mM), Triton X-100 (0,02 mM), CHAPS (8 mM), Nonidet P-40 (0,02 mM), y diheptanoil-fosfocolina (DHPC) (1,4 mM). Todos los detergentes se adquirieron de Anatrace (Maumee, OH) excepto por DHPC, que se adquirió de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).

Purificación de CCR5

Se incubaron células Cf2Th/PACH/synCCR5 estables, que se habían hecho crecer hasta la confluencia completa en una placa de 150 mm, con medio que contenía butirato de sodio 4 mM durante 40 h, se lavaron en PBS, se separaron mediante tratamiento con EDTA 5 mM/PBS, se sedimentaron, y volvieron a lavarse en PBS. Se solubilizaron las células durante 30 min con 3 ml del medio de solubilización que contenía Cymal^{TM}-5 y se centrifugaron durante 30 min a 14.000 x g. Se incubó el lisado celular con 50 ll de perlas de 1D4-Sepharose sobre una plataforma oscilante a 4ºC durante 10-12 h. Se lavaron las perlas de Sepharose cinco veces con el tampón de lavado ((NH_{4})_{2}SO_{4} 100 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), glicerol al 10%, y Cymal^{TM}-5 al 1%) y una vez con tampón de lavado más MgCl_{2} 500 mM. Se eluyó CCR5 de las perlas mediante tres lavados sucesivos con 50 ll de medio que contenía péptido C9 200 lM (SEQ ID NO:2) (TETSQVAPA), MgCl_{2} 500 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4}, 100 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), glicerol al 10%, y Cymal^{TM}-5 al 0,5%. Se estimó la cantidad total de CCR5 recogido mediante tinción con azul de Coomassie de una serie en gel de SDS-poliacrilamida con cantidades habituales de albúmina sérica bovina.

Unión de glucoproteínas de envuelta gp 120 del VIH-1 a CCR5 solubilizado

Se marcaron aproximadamente 4 x 10^{6} células Cf2Th/PACH/synCCR5 durante 12 h con [^{35}S]Met/Cys y se lisaron en tampón de solubilización que contenía Cymal^{TM}-5 al 1%. Se incubó un ml de lisado celular con 100-500 ll de las disoluciones que contenían gp120. Se produjo la gp120 de JR-FL sin marcar en células de Drosophila (Wu, L., et al. (1996), Nature 384, 179-183), y se produjeron las glucoproteínas gp120 de ADA 190/197 R/S a partir de células 293T transfectadas de manera transitoria que se habían radiomarcado con [^{35}S]Met/Cys durante la noche. Excepto en el caso de la variante de gp120 independiente de CD4, 190/197 R/S, se incubaron previamente las glucoproteínas gp120 (2-4 lg) con sCD4 (2-4 lg) en 20 ml de PBS durante 1 h a 22ºC antes de la adición a los lisados que contenían CCR5. Tras 12 h a 4ºC, se precipitaron los complejos gp120-CCR5 con el anticuerpo C11 anti-gp120 (generosamente proporcionado por el Dr. James Robinson, Tulane University Medical School) o bien con el anticuerpo 1D4.

Expresión de CCR5 en células de mamífero

Se comparó el uso de codón para las opsinas, los únicos GPCR que se expresan sumamente de manera natural, con el uso de codón para otros 45 GPCR que representan un espectro de diferentes subfamilias de GPCR. Los codones de las opsinas están sesgados frente a los que se muestra que son óptimos para la traducción eficaz en células de mamífero (Andre, S., et al. (1998), J. Virol. 72: 1497-1503), mientras que otros GPCR, incluyendo CCR5, están asociados con codones que son más aleatorios y, en muchos casos, traducidos ineficazmente (datos no mostrados). Se diseñó un gen de CCR5 optimizado por codón, se sintetizó usando la reacción en cadena de la polimerasa, y se expresó transitoriamente en varias líneas celulares diferentes, usando cinco vectores de expresión diferentes (pcDNA 3.1, PACH, PND, PMT4, y pcDNA4/ HisMax). El nivel de expresión de CCR5 dirigido por el gen optimizado por codón fue 2-5 veces el dirigido por el gen CCR5 de tipo natural. Entre las líneas celulares sometidas a prueba, la expresión de CCR5 fue superior en los timocitos caninos Cf2Th (datos no mostrados), de manera que se usaron estas células para generar líneas celulares estables. Se usó el vector PACH para expresar el gen optimizado por codón que codificaba el CCR5 humano que contenía una etiqueta de epítopo C-terminal de 9 residuos (la etiqueta C9) derivada de rodopsina bovina. La presencia de la etiqueta C9 permite el reconocimiento de la proteína CCR5 por el anticuerpo 1D4 (Oprian, D. D., et al. (1987), Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84: 8874-8878). La expresión de CCR5 en la línea celular estable, denominada Cf2Th/PACH/synCCR5, pudo potenciarse 2-3 veces mediante el tratamiento de las células con butirato de sodio. Tras este tratamiento, pudieron aislarse aproximadamente 3-5 lg de CCR5 de alta pureza a partir de 10^{7} células Cf2Th/PACH/synCCR5, usando las técnicas descritas a continuación.

Formas precursora y madura de CCR5

Se estudiaron la síntesis y renovación de CCR5 y en células Cf2Th mediante análisis de pulso y seguimiento. Se realizó un seguimiento de un precursor de aproximadamente 40 kDa en la forma madura de CCR5, que migró como una banda ancha de aproximadamente 43 kDa. El precursor de CCR5 mostró una semivida de aproximadamente 25 min. La semivida de la forma madura de CCR5 fue 11-14 h, independientemente de si la expresión de CCR5 estaba dirigida por el gen de CCR5 de tipo natural u optimizado por codón. Las semividas de las formas precursora y madura de CCR5 en células HEK-293 fueron similares a aquellas en células Cf2Th (datos no mostrados). En varias líneas celulares diferentes, apareció una forma de masa molecular inferior (aproximadamente 36 kDa) de CCR5 en paralelo con la proteína madura. Esta forma de masa molecular inferior de CCR5 se expresó a niveles inferiores que la forma madura de CCR5 y no se ha caracterizado completamente. Se confirmó su identidad como isoforma de CCR5 mediante su precipitación por el anticuerpo 1D4 y el anticuerpo 2D7 anti-CCR5 y mediante espectrometría de masas (figura 2 y datos no mostrados).

Solubilización de CCR5 nativo

La purificación de proteína de membrana requiere al solubilización de las membranas, normalmente mediante el uso de detergentes. Se estudió un amplio espectro de condiciones para llegar a la composición del tampón que permitió la solubilización y aislamiento de CCR5 nativo. Se guió esta optimización mediante la comparación de la cantidad de CCR5 solubilizado que podía precipitarse por el anticuerpo 2D7, que reconoce un epítopo de CCR5 dependiente de la conformación (Wu, L., et al. (1997), J. Exp. Med. 186: 1373-1381), con la que podía precipitarse por el anticuerpo 1D4 dirigido contra la etiqueta de epítopo C9 lineal. De esta manera, pudo estimarse el porcentaje de CCR5 solubilizado que permanecía en una conformación nativa (figura 2A). Se estudiaron dieciocho detergentes, la mayoría de los cuales estaban diseñados específicamente para la extracción y purificación de proteínas de membrana. En cuando a la cantidad de proteína CCR5 aislada, así como el porcentaje de proteína en una conformación que podía reconocerse por el anticuerpo 2D7, los detergentes más eficaces fueron DDM, Cymal^{TM}-5, y Cymal^{TM}-6 (figura 2B). De estos detergentes, Cymal^{TM}-5 muestra la mayor concentración de micelas crítica (2,4 mM), facilitando la diálisis del detergente a partir de la disolución de proteínas para los fines de reconstitución y/o cristalización de membranas. También se encontró que una conformación de CCR5 competente para la unión de gp120 del VIH-1 se conservaba mejor en tampones que contenían Cymal^{TM}-5 (véase a continuación). Por tanto, se usó Cymal^{TM}-5 para un refinado adicional del protocolo de solubilización / aislamiento de CCR5, explorando varias variables (composición y concentración de sales, pH, temperatura, y aditivos minoritarios) que se sabe que influyen en la estabilidad de proteínas solubilizadas (Hamaguchi, K. (1992) The Protein Molecule. Conformation, Stability and Folding, Japan Scientific Societies Press, Springer-Verlag, Nueva York). Se encontró que el sulfato de amonio y el glicerol prolongaban la existencia de una conformación de CCR5 que podía reconocerse por el anticuerpo 2D7 (datos no mostrados). El tampón de solubilización de CCR5 optimizado estaba compuesto por (NH_{4})_{2}SO4 100 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), glicerol al 10%, y Cymal^{TM}-5 al 1%.

Células que expresan CCR5

Se generó la línea celular (Cf2Th/CCR5) que expresaba de manera estable aproximadamente 10^{6} moléculas de CCR5 por célula mediante transfección de timocitos caninos Cf2Th con el gen de CCR5 optimizado por codón descrito anteriormente. El extremo C-terminal del CCR5 expresado consiste en un residuo de glicina seguido por el nonapéptido C9 TETSQVAPA (SEQ ID NO: 2), que contiene el epítopo para el anticuerpo 1D4. Se ha mostrado que moléculas de CCR5 de tipo natural y con etiqueta en el extremo C-terminal son funcionalmente comparables. Las células Cf2Th/CCR5 que se habían hecho crecer hasta la confluencia completa en placas de 150 mm se recogieron usando EDTA 5 mM en PBS, se lavaron en PBS, se sedimentaron y se congelaron hasta que se necesitaron.

Radiomarcaje de células que expresan CCR5 o gp120

Se radiomarcaron células Cf2Th/ CCR5 en placas de 150 mm durante 12 horas con 10 ml/placa de DMEM libre de Met-Cys complementado con 400 \muCi de cada una de ^{35}S-metionina y ^{35}S-cisteína (NEN Life Science Products, Boston, MA). Se recogieron células marcadas usando EDTA 5 mM en PBS, se sedimentaron y se congelaron hasta que se necesitaron.

Para marcar la glucoproteína de envuelta gp120 del VIH-1, las células HEK-293T (Colección Americana de Cultivos Tipo) que se habían hecho crecer hasta una confluencia del 70-80% se transfectaron (reactivo de transfección Geneporter, Gene Therapy Systems, San Diego, CA) con plásmidos que expresaban gp120 secretada de las cepas ADA y HXBc2 del VIH-1 (referencia Kolchinsky). Veinticuatro horas tras la transfección, se sustituyó el medio por medio de marcaje, tal como se describió anteriormente. Se recogieron los sobrenadantes celulares que contenían gp120 marcada con ^{35}S-cisteína/metionina cada 48 horas un total de tres veces. Se purificó la gp120 marcada a partir de los sobrenadantes combinados usando una columna de proteína A-Sepharose-anticuerpo F105, tal como se describe (referencia Wu et al).

Revestimiento de Dynabeads por anticuerpos y estreptavidina

Se conjugaron Dynabeads® M-280 activadas con tosilo (Dynal, Inc., Lake Success, NY) con anticuerpo 1D4 (Centro Nacional de Cultivos Celulares, Minneapolis, MN), y estreptavidina (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) con una proporción molar de 10:1 a menos que se mencione específicamente. Se agitaron con vórtex aproximadamente 6 x 10^{8} perlas en un volumen de 1 ml, se sedimentaron sobre un separador magnético (Dynal) y volvieron a suspenderse en 1 ml de tampón de unión (fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,4) que contenía 1 mg de anticuerpo 1D4 y 30 Tg de estreptavidina. Tras la incubación sobre una plataforma oscilante durante 20 horas a 37ºC, se inactivaron los grupos reactivos en la superficie no unidos sobre las perlas mediante tratamiento con Tris-HCl 0,2 M (pH 8,5) durante 4 horas a 37ºC. Se eliminaron las proteínas absorbidas de manera no covalente mediante una incubación de una hora en medio compuesto por detergente ciclohexilpentil-\beta-D-maltósido al 1% (Cymal^{TM}-5) (Anatrace, Maumee, OH), Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), (NH_{4})_{2}SO_{4} 100 mM y NaCI 1 M. Después se lavaron las perlas de 1D4/estreptavidina dos veces y se almacenaron a 4ºC en PBS. La eficacia de conjugación del anticuerpo a las perlas, que se estimó mediante FACS usando IgG conjugada con ficoeritrina R anti-ratón (IgG-PE) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, EN), fue de aproximadamente 5 x 10^{4} moléculas de anticuerpo/perla. La conjugación 2D7/estreptavidina se logró usando el mismo protocolo.

Preparación de disoluciones de lípidos para la reconstitución de la membrana liposomal

Todos los lípidos se obtuvieron como disoluciones en cloroformo de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Se secó un total de 10 mg de lípidos disueltos en cloroformo 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE) y ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA), mezclados en una proporción molar de 6:3:1, en un tubo de polietileno de 2 ml a vacío hasta que se eliminó todo el disolvente. Se añadió un mililitro de PBS al tubo y se obtuvo una disolución liposomal mediante ultrasonicación durante 1-2 min en un baño de hielo usando un procesador ultrasónico (Heat Systems, Inc., Farmingdale, NY). Se prepararon de manera similar disoluciones liposomales de lípidos totales a partir de membranas de células Cf2Th, que se extrajeron con cloroformo/metanol (referencia Folch), usando una concentración de lípidos final de 10 mg/ml. Se prepararon por separado disoluciones liposomales de los lípidos sintéticos con el grupo de cabeza modificado dipalmitoilfosfoetanolamina-N-biotinilo (biotinil-DPPE) y dioleoilfosfoetanolamina- rodamina B de lisamina (Rho-DOPE), a una concentración final de 1 mg/ml, usando el mismo protocolo. Todas las disoluciones liposomales se conservaron en N_{2} líquido hasta su uso.

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Formación de proteoliposomas con CCR5 purificado

Se lisaron aproximadamente 10^{8} células Cf2Th/CCR5 en 10 ml de tampón de solubilización (tampón S) compuesto por (NH_{4})_{2}SO_{4} 100 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), glicerol al 10%, Cymal^{TM}-5 al 0,5% (p/v) y mezcla de inhibidores de proteasas (un comprimido de Complete^{TM} (Boehringer Mannheim) por 50 ml) durante 30 minutos a 4ºC. Se eliminaron los residuos celulares mediante centrifugación durante 30 min a 150.000 x g. Se añadieron aproximadamente 5 x 10^{8} perlas revestidas con 1D4/estreptavidina lavadas en tampón S al lisado celular aclarado y se incubaron en el mismo durante 1 h a 4ºC sobre una plataforma oscilante. Entonces se retiraron las perlas unidas a CCR5 del lisado celular y se lavaron extensamente en tampón S. Para la formación de la membrana lipídica alrededor de las perlas que contenían CCR5, se combinó 1 mg de liposomas compuestos por mezclas de lípidos sintéticos o bien lípidos de células Cf2Th con 10 mg de liposomas preparados a partir de biotinil-DPPE y se solubilizaron en 1 ml de tampón S. Cuando se deseaba el marcaje fluorescente de la membrana lipídica, se añadieron 10 \mug de Rho-DOPE a la mezcla. Se añadió esta mezcla que contenía detergente a perlas que contenían CCR5 y, tras 1 hora de incubación a 4ºC, se eliminó lentamente el detergente mediante diálisis durante 24 horas a 4ºC en tubos de diálisis de 12.000 kDa frente a (NH_{4})_{2}
SO_{4} 100 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) y glicerol al 10%. Se eliminó el exceso de detergente residual y los lípidos no unidos sobre un separador magnético y se almacenaron los proteoliposomas en PBS a 4ºC durante hasta dos meses.

Se analizó la composición de proteínas de CCR5-proteoliposomas mediante tinción con plata o, cuando se usó CCR5 marcado con ^{35}S-cisteína/metionina, mediante autoradiografía. Para estos fines, volvieron a suspenderse 10^{7} proteoliposomas en tampón de SDS al 2%-muestra y, tras 1 hora de incubación a 55ºC, se hizo pasar la muestra eluida sobre un minigel de poliacrilamida al 11% en condiciones de reducción.

Unión de ligando a CCR5-proteoliposomas

Se analizó la unión del anticuerpo 2D7 anti-CCR5 anticuerpo mediante FACS y microscopía confocal, usando 2D7 conjugado con ficoeritrina R (2D7-PE). Se suspendieron CCR5-proteoliposomas en BSA al 5%, suero de ternera fetal en PBS o, en algunos experimentos, en tampón de unión (véase a continuación) y se incubaron con 2D7-PE durante una hora a 22ºC. Entonces se lavaron los proteoliposomas en el mismo tampón, se fijaron el formaldehído al 2% en PBS, y se analizaron mediante FACS o microscopía confocal.

Se analizó la unión de la glucoproteína gp120 del VIH-1 a CCR5-proteoliposomas mediante FACS usando gp120 sin marcar (cepa JR-FL) o mediante análisis en gel de SDS-poliacrilamida de proteínas gp120 unidas, radiomarcadas. Para el análisis de FACS, se suspendieron CCR5-proteoliposomas en 0,5 ml de tampón de unión (NaCl 150 mM, CaCl_{2} 5 mM, MgCl_{2} 2 mM, Tris 20 mM, pH 7,5) y se incubaron durante una hora a 22ºC con 3-5 mg de gp120 de JR-FL o con gp120 de JR-FL que se había incubado previamente durante una hora a 37ºC con una concentración equimolar de sCD4. Posteriormente, se añadieron el anticuerpo C11 anti-gp120 (generosamente proporcionado por el Dr. James Robinson, Tulane University) y una IgG de cabra anti-humana conjugada con fluoresceína (Pharmingen), cada una de ellas a una concentración final de 3-5 Tg/ml. Tras la incubación a 22ºC durante una hora, se lavaron los CCR5-proteoliposomas en el tampón de unión, se fijaron en formaldehído al 2% en PBS, y se usaron para FACS y microscopía confocal.

Para los estudios de unión de gp120 del VIH-1 radiomarcada a CCR5-proteoliposomas, se emplearon las glucoproteínas gp120 metabólicamente marcadas de una cepa de VIH-1 que usa CCR5, ADA, y de una cepa de VIH-1 que usa CXCR4, HXBc2. Se incubaron las glucoproteínas gp120 en presencia o bien en ausencia de sCD4 (concentración final de 10 nM) durante una hora a 37ºC. Volvieron a suspenderse aproximadamente 10^{7} CCR5-proteoliposomas en 1 ml de tampón de unión y se incubaron con las glucoproteínas gp120 durante 1 hora a 22ºC. Se lavaron extensamente los proteoliposomas en el tampón de unión y luego volvieron a suspenderse en tampón de SDS-muestra que contenía \beta-mercaptoetanol al 5%. Tras la ebullición durante 2 minutos, se cargaron las muestras sobre minigeles de poliacrilamida a 10% y se analizaron mediante autoradiografía.

Composición de proteínas de CCR5-proteoliposomas

Para examinar las proteínas celulares incorporadas en los proteoliposomas, se marcaron metabólicamente células Cf2Th-CCR5 con ^{35}S-cisteína y ^{35}S-metionina y se usaron para la formación de proteoliposomas. Se incubaron los proteoliposomas en tampón de SDS-muestra a 55ºC durante una hora y se analizaron las proteínas marcadas sobre geles de poliacrilamida (figura 3). Se observaron bandas prominentes asociadas con CCR5 maduro (43 kDa) y un derivado de CCR5 previamente observado (36 kDa), así como bandas débiles asociadas con agregados de peso molecular superior de CCR5. Otras proteínas celulares estaban aparentemente presentes sólo a niveles de traza. Estos resultados indican que CCR5 es la principal proteína celular en los proteoliposomas.

También se exploraron las proteínas en los proteoliposomas paramagnéticos mediante tinción con plata de geles de poliacrilamida de los lisados de SDS. Las únicas bandas visibles además de las bandas de CCR5 descritas anteriormente fueron las asociadas con las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 1D4 (55 y 25 KDa, respectivamente) y la estreptavidina (60 KDa) (datos no mostrados). Esto demuestra que aparentemente no se incorporan proteínas celulares distintas de CCR5 de manera estequiométrica en los proteoliposomas paramagnéticos.

Análisis de la membrana de bicapa lipídica en CCR5-proteoliposomas

Se determinó la cantidad total de lípidos incorporados en los proteoliposomas. El análisis de FACS de CCR5-proteoliposomas formados con cantidades crecientes de lípidos que contenían rodamina-DOPE al 1% reveló se adquirieron aproximadamente 80-90 Tg de los lípidos por 10^{8} perlas (figura 4). Esto es superior a la cantidad de lípidos (aproximadamente 40 Tg) que se necesita teóricamente para formar bicapas que rodean a perlas de 2,8 Tm de diámetro (véase la fórmula en la figura 4, dentro del marco). Esta diferencia puede explicarse mediante la irregularidad de la superficie de la perla, que se documentó mediante microscopía electrónica de barrido (datos no mostrados), y que puede contribuir a la formación de pequeñas estructuras de tipo micela en las grietas de la superficie de la perla. Adicionalmente, parte de los lípidos introducidos pueden haberse perdido durante la diálisis.

También se estudiaron los CCR5-proteoliposomas mediante microscopía confocal (figuras 5A y 5B). Las perlas paramagnéticas de control no mostraron fluorescencia indicativa de incorporación de rodamina-DOPE. En cambio, los CCR5-proteoliposomas que se habían formado con rodamina-DOPE al 1% mostraron una fluorescencia intensa y uniforme. No se observaron vesículas lipídicas ni otras estructuras superiores a 0,1 \mum sobre la superficie de los CCR5-proteoliposomas marcados de manera fluorescente. Estos datos concuerdan con que los CCR5-proteoliposomas están rodeados por una única membrana de bicapa lipídica con como mucho pequeñas irregularidades.

Propiedades de unión a ligando de CCR5-proteoliposomas

Los CCCR5-proteoliposomas se unen eficazmente al anticuerpo 2D7, que reconoce un epítopo dependiente de la conformación sobre el ectodominio de CCR5 (figuras 5C y 5D).

Para explorar la capacidad de los CCR5-proteoliposomas para unirse a la glucoproteína de envuelta exterior del VIH-1, se incubó previamente la glucoproteína gp120 de la cepa JR-FL que usa CCR5 con una forma soluble de CD4 (sCD4) para inducir la interacción de alta afinidad con CCR5. Se incubó el complejo gp120/sCD4 con CCR5-proteoliposomas, tras lo cual se detectaron los complejos unidos mediante el anticuerpo C11 anti-gp120. Se detectó fácilmente la unión de los complejos de glucoproteína gp120/sCD4 a los CCR5-proteoliposomas, pero no a los proteoliposomas control que carecían de CCR5 (figura 5E y 5F).

También se exploró la unión de la glucoproteína gp120 del VIH-1 a los CCR5-proteoliposomas en un ensayo diferente. Se añadieron cantidades equivalentes de glucoproteínas gp120 marcadas metabólicamente de una cepa de VIH-1, HXBc2, que no usa la proteína CCR5 como co-receptor y de la cepa ADA, que usa CCR5 como co-receptor, a los CCR5-proteoliposomas. Sólo la glucoproteína gp120 de ADA se unió de manera detectable a los CCR5-proteoliposomas (figura 6A). Se potenció esta unión mediante la adición de sCD4. Se inhibió la unión del complejo gp120 de ADA/sCD4 a los CCR5-proteoliposomas mediante incubación previa de los proteoliposomas con el anticuerpo 2D7 anti-CCR5. Estos resultados indican que la glucoproteína gp120 de un VIH-1 que usa CCR5 se une específicamente a CCR5 en el proteoliposoma, y que la unión de CD4 potencia la interacción gp120-CCR5, tal como se observó con CCR5 de superficie celular (Wu, L. et al. (1996) Nature 384: 179-183; Trkola, A. et al. (1996), Nature 384: 184-187).

Estabilidad de CCR5-proteoliposomas

Se exploraron los efectos de alteraciones en el pH, fuerza iónica y temperatura sobre la estabilidad de los CCR5-proteoliposomas. Se expusieron CCR5-proteoliposomas marcados con rodamina-DOPE a condiciones ácidas (pH = 3) o básicas (pH = 10) durante 30 minutos, tras lo cual se devolvieron a un entorno de pH neutro. La intensidad de fluorescencia medida mediante FACS fue comparable a la observada para CCR5-proteoliposomas control no tratados (datos no mostrados). La intensidad de fluorescencia tampoco se vio afectada por la incubación en disoluciones de diferentes fuerzas iónicas, que oscilaban desde menos de NaCl 1 mM hasta NaCl 3 M (datos no mostrados). Se alteró completamente la unión del anticuerpo 2D7 a CCR5-proteoliposomas mediante incubación del complejo anticuerpo-proteoliposoma a pH 3,0 durante 30 minutos (figura 5B). Sin embargo, se restauró completamente la capacidad del anticuerpo 2D7 para volver a unirse a CCR5-proteoliposomas devolviendo el pH hasta 7,0. Los CCR5-proteoliposomas fueron estables a temperaturas hasta 50ºC durante cortos periodos de tiempo (menos de dos horas) y pudieron almacenarse durante al menos dos meses en PBS a 4ºC sin pérdida de propiedades de unión.

Así se a demostrado que una proteína integral de membrana tal como CCR5 de GPCR puede expresarse en niveles razonablemente altos en células de mamífero y purificarse en su estado nativo en disoluciones que contienen detergente. Se ha mostrado que el CCR5 purificado puede reconstituirse en un entorno de membrana lipídica nativa formado sobre la superficie de perlas paramagnéticas. En consecuencia, con ajustes menores, el enfoque puede aplicarse a muchas proteínas integrales de membrana.

Ejemplo 2 Proteoliposomas que contienen CXCR4 Purificación de proteoliposomas de CXCR4

Se hicieron crecer células CXCR4-Cf2Th hasta la confluencia completa en placas de cultivo celular de 100 mm. Se separaron las células de las placas con 1 x PBS/EDTA 5 mM y se sedimentaron en tubos de microcentrifugadora a 1 x 10^{8} células/sedimento. Volvió a suspenderse el sedimento en un tampón helado que contenía (NH_{4})_{2}SO_{4} 100 mM, Tris 20 mM pH 7,5, glicerol al 20%, 1x cóctel inhibidor de proteasa Complete (Roche) y un 1% de CHAPSO (Anatrace) o bien de Cymal-7 (Anatrace). Se incubaron las células resuspendidas durante 5 minutos sobre hielo seguido de 25 minutos a 4ºC en un Nutator (Fisher Scientific). Tras la incubación, se eliminó el residuo celular mediante centrifugación a 14.000 xg durante 30 minutos a 4ºC. Se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrifugadora y se añadieron 5 x 10^{8} de perlas Dynal M-280 conjugadas con 1D4. Se incubó el lisado celular con perlas durante 2,5 horas a 4ºC en un Nutator. Entonces se colocó el tubo en un imán MPC-S de Dynal para eliminar las perlas. Se lavaron las perlas dos veces con tampón de lavado helado (un 1% de CHAPSO o bien de Cymal-7, (NH_{4})_{2}SO_{4} 100 mM, Tris 20 mM pH 7,5 y glicerol al 20%). Tras el lavado, volvieron a suspenderse las perlas preparadas con CHAPSO en 2,5 ml de tampón de lavado de CHAPSO helado que contenía 1,5 mg de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 0,75 mg 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 0,225 mg de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfato y 0,025 mg de biotinil-fosfoetanolamina. Volvieron a suspenderse las perlas preparadas con Cymal-7 en tampón de lavado de Cymal-5 al 1% helado que contenía los lípidos descritos anteriormente. Entonces se inyectó la disolución en un instrumento Slide-A-Lyzer (Pierce, 10 kDMWCO) y se dializó durante 24 horas frente a tampón de lavado que no contenía detergente a 4ºC. Se dializaron las muestras en una máquina diseñada especialmente que hacía girar constantemente el instrumento Slide-A-Lyzer para evitar la sedimentación de las perlas. Tras diálisis, se retiraron los proteoliposomas paramagnéticos del instrumento Slide-A-Lyzer y se lavaron dos veces en 1 x PBS/FBS al 2% para eliminar lípidos no unidos y cualquier detergente restante. Se almacenaron los proteoliposomas en 1 x PBS/FBS al 2%/azida de sodio al 0,02% durante hasta dos meses a 4ºC.

Ejemplo 3 Proteoliposomas que contienen gp160 Construcción y expresión de gp160

Se han producido proteoliposomas de gp120-gp41 paramagnéticos en fase sólida mediante la siguiente metodología. Se expresaron de manera transitoria glucoproteínas de envuelta de VIH-1 derivadas del aislado primario de VIH-1 YU2 en células 293T a partir del plásmido de expresión pSVIII. Se hicieron las glucoproteínas defectuosas para la rotura mediante dos cambios de aminoácidos R por S adyacentes al sitio de rotura de gp120-gp41 para generar glucoproteínas gp160 defectuosas para la rotura. Las glucoproteínas se modificaron adicionalmente mediante truncamiento de la cola citoplasmática, lo que aumentó la expresión en la superficie celular varias veces (datos no mostrados), y mediante la adición de una etiqueta de epítopo C9 C-terminal derivada del extremo C-terminal de rodopsina.

Preparación de proteoliposomas de gp160

Se lisaron células que expresaban las glucoproteínas gp160sobre su superficie celular en tampón que contenía detergente Cymal-5 al 1%. Entonces se capturaron las proteínas sobre perlas de Dynal paramagnéticas, activadas con tosilo que se habían acoplado covalentemente con el anticuerpo murino específico para C9, 1D4. Durante el procedimiento, también se acopló simultáneamente estreptavidina a la perla con una proporción molar de IgG a estreptavidina de 10:1. Tras varios lavados en tampón de lisis, se dializaron las proteínas capturadas por afinidad frente a PBS en presencia de lípidos polares. La mezcla de lípidos contenía lípidos biotinilados al 1% para permitir la fijación a la estreptavidina derivatizada sobre la superficie de la perla. Este procedimiento se diseñó para nuclear una bicapa lipídica anclada, reconstituida, que rodea la perla y que rodea la región transmembrana de las moléculas de gp160. En la figura 11 se muestra un esquema de los proteoliposomas de gp160.

Composición de proteína y membrana de bicapa lipídica membrana de proteoliposomas de gp160

Se realizaron análisis considerables de los proteoliposomas de gp160 para confirmar tanto que las moléculas de gp160 se capturaban en un estado nativo como que de hecho se reconstituía una membrana lipídica sobre la superficie de la perla. Se analizaron las perlas mediante FACS para confirmar que los oligómeros de gp160 podían detectarse sobre la superficie de las perlas tanto mediante sueros de pacientes con SIDA, mediante el anticuerpo IgGb12 para CD4BS, varios otros anticuerpos monoclonales sensibles a la conformación como mediante CD4-IgG (figura 10A y datos no mostrados). Los sueros de pacientes con SIDA reconocieron la gp160 sobre la superficie de manera más eficaz que cualquier anticuerpo monoclonal individual (figura 12A). Este efecto se debe probablemente a la mezcla policlonal de los anticuerpos anti-gp160 presentes en el suero que reconoce muchos epítopos específicos de envuelta. También se confirmó que las glucoproteínas gp160 capturadas eran relativamente puras mediante ebullición y reducción de los proteoliposomas de gp160 reconstituidos y análisis del contenido en proteínas de las perlas sobre geles de SDS-poliacrilamida (figura 12B).

Se confirmó que la bicapa lipídica estaba reconstituida visualizando la incorporación de lípido conjugado con rodamina (rodamina-DOPE) en la membrana de proteoliposoma utilizando microscopía fluorescente (figura 16). Sin la reconstitución anterior de membrana de las perlas, hubo una tinción fluorescente no detectable de las perlas por rodamina-DOPE (datos no mostrados).

Además, se analizaron con sondas las perlas que contenían glucoproteínas gp160 capturadas con o bien sin una membrana reconstituida con un anticuerpo secundario IgG anti-ratón para determinar si la membrana impediría el acceso del anticuerpo secundario al anticuerpo murino 1D4 conjugado a la perla. El anticuerpo secundario conjugado con PE reconoció las perlas que contenían una membrana reconstituida en un grado significativamente menor que las perlas con gp160 que carecían de una membrana cuando se analizaron mediante FACS (figura 11, pico B comparado con el pico C). Se interpretó que estos datos significan que se ha reconstituido una membrana alrededor de la superficie de la perla en un grado significativo.

Para confirmar que la conformación de los oligómeros de gp160 no estaba alterada de aquella sobre la superficie celular mediante el procedimiento de reconstitución y captura de proteoliposoma, se realizó un ensayo de unión comparativo mediante FACS. Mediante este análisis, el reconocimiento de las glucoproteínas de envuelta oligoméricas por IgGb12 fue equivalente a sobre la superficie celular o sobre la superficie de los gp160-proteoliposomas (figura 12A). Se logró la unión semimáxima del anticuerpo IgGb12 a una concentración inferior a 1 mg/ml de anticuerpo. Esta concentración concuerda con las estimaciones previas de que la afinidad de IgG b12 está en el intervalo nanomolar inferior para el virus YU2 sumamente resistente a la neutralización (Burton et al., Science (1994) 266: 1024-1027). En cambio, el anticuerpo conformacional de C1/C5 no neutralizante, C11, requirió concentraciones al menos de 10 a 15 veces superiores para lograr una unión semimáxima estimada (figura 12B). Esto puede ser una subestimación de la concentración de anticuerpo requerida para lograr la unión semimáxima ya que no se logró la unión de saturación en este experimento particular. En cualquier caso, estos resultados resaltan el hecho de que los proteoliposomas se comportan de una manera coherente con la afirmación de que las glucoproteínas gp160 están en una conformación nativa sobre la superficie de la perla con respecto a la conformación de las glucoproteínas de envuelta sobre el virus.

Ejemplo 4 Exploración de una biblioteca de presentación en fagos con proteoliposomas que contienen gp160

Se usaron los gp 160-proteoliposomas reconstituidos definidos para cribar una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpo de cadenas en sencillas humano, sumamente compleja, generada en el laboratorio del Dr. Wayne Marasco en el Dana-Farber Cancer Institute. Tras cuatro rondas de cribado, se analizaron 96 clones; 87 de los 96 clones fueron específicos para gp120 según se determinó mediante ELISA (datos no mostrados). Los 9 clones no reactivos pueden representar anticuerpos específicos de oligómeros o reactividades irrelevantes. Para confirmar que el fago aislado presentaba anticuerpos de cadena única específicos para gp160, se realizó un análisis de FACS sobre células que expresaban gp160 comparando suero específico anti-gp120 con el sobrenadante bacteriano, una IgG de ratón anti-fago M13 y anti-ratón-PE (figura 15). Hay análisis adicionales de los anticuerpos de cadenas sencillas presentados en fagos solubles en curso para determinar su especificidad. En cualquier caso, estos datos preliminares intrigantes pueden demostrar el potencial de los gp160-proteoliposomas para seleccionar y posiblemente provocar reactividades dirigidas a la envuelta únicas.

Ejemplo 5 Anticuerpos contra proteoliposomas que contienen gp160

Para confirmar que los proteoliposomas de gp160 podían provocar anticuerpos específicos frente a glucoproteínas de envuelta, se inmunizaron ratones Balb/c por vía i.p. con 5 x 10^{7} proteoliposomas. Mediante análisis en gel, se estimó que cada ratón recibió 1-2 \mug de glucoproteína de envuelta por inoculación. Para garantizar que el adyuvante no alteraría la integridad de la membrana reconstituida, se inmunizaron previamente ratones para experimentos por vía i.p. con adyuvante de Ribi 24 horas antes de la inoculación de las perlas. Posteriormente se realizaron estudios de estabilidad de la membrana mediante incubación de proteoliposomas de gp160 teñidos con rodamina-DOPE en adyuvante de Ribi durante 2 y 24 horas. Se visualizaron las perlas mediante microscopía fluorescente y no se observó ninguna reducción en la señal de rodamina-DOPE sobre las perlas expuestas al adyuvante (datos no mostrados). Pueden inmunizarse ratones adicionales con perlas en adyuvante de Ribi mediante diversas vías para optimizar las respuestas de anticuerpos cuantitativas.

Para el estudio inicial, se usaron 2 \mug de gp120 de YU2 monomérica en adyuvante de Ribi como control positivo y se usaron perlas con membrana reconstituida que carecían de glucoproteína gp160 como controles negativos. Tras 3 inoculaciones, se detectaron anticuerpos anti-gp120 en los sueros de los ratones tanto del grupo control de gp120 monomérica como del grupo de perla de gp160, pero no de los sueros de ratones control negativos (figura 17). Este estudio demuestra la viabilidad de utilizar los proteoliposomas de gp160 como inmunógenos para determinar si provocan mejor anticuerpos neutralizantes o pueden provocar anticuerpos específicos de trimeros que pueden aislarse y caracterizarse mediante análisis monoclonal. Tales reactivos son herramientas valiosas para la aclaración adicional de la estructura de orden superior de la glucoproteína de envuelta de VIH-1.

Claims (19)

1. Un proteoliposoma estable que comprende:

una forma esférica o elipsoidal que tiene un ligando para una proteína integral de membrana anclado a la forma, en el que dicha superficie de la forma está rodeada por una membrana lipídica, en el que dicha membrana lipídica es una bicapa lipídica; y una proteína integral de membrana aislada unida a dicho ligando, en el que dicho(s) dominio(s) transmembrana de la proteína integral de membrana está(n) en dicha membrana lipídica, y en el que dicha proteína integral de membrana tiene una conformación de tipo natural.

2. El proteoliposoma estable según la reivindicación 1, que comprende además un atrayente para un resto en dicha bicapa lipídica, en el que dicho atrayente está sobre dicha superficie de la forma, y se forma dicha membrana lipídica revistiendo dicha superficie de la forma con una disolución lipídica que contiene dicho resto que se une a dicho atrayente.

3. El proteoliposoma estable según la reivindicación 1 ó 2, en el que la conformación de la proteína integral de membrana es estable durante al menos un día.

4. El proteoliposoma estable según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que dicha proteína integral de membrana tiene al menos dos dominios transmembrana.

5. El proteoliposoma estable según la reivindicación 2 ó 3, en el que el atrayente es estreptavidina o avidina y el resto en la membrana lipídica es biotina.

6. El proteoliposoma estable según la reivindicación 5, en el que el ligando es un anticuerpo.

7. El proteoliposoma estable según la reivindicación 5, en el que la proteína integral de membrana tiene al menos dos dominios transmembrana.

8. El proteoliposoma estable según la reivindicación 6 o reivindicación 7, en el que se selecciona la proteína integral de membrana del grupo constituido por receptores acoplados a proteínas G, canales iónicos, transportadores de aminoácidos, transportadores de glucosa, transportadores de fosfato, receptores de quimiotaxis, conexinas, canales CIC y reguladores de conductancia transmembrana de la fibrosis quística.

9. El proteoliposoma estable según la reivindicación 8, en el que dicha proteína integral de membrana es un receptor acoplado a proteínas G.

10. El proteoliposoma según la reivindicación 8, para su uso como un antígeno.

11. Un procedimiento para preparar un proteoliposoma estable según la reivindicación 1 que comprende:

a)

aislar una proteína integral de membrana de una célula que expresa dicha proteína integral de membrana con un detergente en condiciones que mantienen la conformación de tipo natural de dicha proteína integral de membrana;

b)

añadir dicho detergente que contiene la proteína integral de membrana aislada a una forma esférica o elipsoidal, en el que dicha forma tiene un ligando para dicha proteína integral de membrana anclado a la superficie de la forma;

c)

añadir una disolución lipídica a la forma de la etapa (b) para formar una membrana lipídica; y

d)

retirar el detergente de la forma de la etapa (c) rodeada por una membrana lipídica en condiciones que no cambian la conformación de la proteína integral de membrana.

12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que se reviste dicha forma con un atrayente para un resto en dicha membrana lipídica, en el que se forma dicha membrana lipídica revistiendo dicha superficie de la forma con una disolución lipídica que contiene dicho resto que se une a dicho atrayente y dicha disolución lipídica tiene un resto que se une al atrayente, formando una forma rodeada por una membrana lipídica.

13. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que el proteoliposoma formado mantiene de manera estable la conformación de la proteína integral de membrana durante un periodo de al menos un día.

14. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que la proteína integral de membrana tiene al menos dos dominios transmembrana.

15. El procedimiento según la reivindicación 11, 12, 13 ó 14, en el que el ligando es un anticuerpo.

16. El procedimiento según la reivindicación 11, 12, 13 ó 14, en el que se selecciona el detergente del grupo constituido por CHAPSO, glucopiranósidos alquílicos, sacarosas alquílicas, digitonina, hidroxietilglucamidas, derivados de oligoetilenglicol, dodecilmaltopiranósido y polioxietilenos fenílicos.

17. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que el atrayente es estreptavidina o avidina y el resto en la disolución lipídica es biotina.

18. El procedimiento según la reivindicación 17, en el que el detergente es ciclohexil-pentil-\beta-D-maltósido, ciclohexil-hexil-\beta-D-maltósido o ciclohexil-heptil-\beta-D-maltósido.

19. El procedimiento según la reivindicación 18, en el que la proteína integral de membrana es un receptor acoplado a proteínas G.