ES2287988T3 - Reactivo estabilidad y metodo para determinar la creatinkinasa. - Google Patents
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Abstract
Reactivo para la determinación de creatinkinasa en un material de muestras biológico que consta de dos reactivos parciales, de manera que un primer reactivo parcial contiene los sustratos y coenzimas apropiados que pueden ser transformados por la CK, un activador de la CK y opcionalmente otros componentes que se requieren para una o más reacciones posteriores en un medio tamponado acuoso, que se caracteriza por que el segundo pero no el primer reactivo parcial contiene una sal de ditionita y/o una sal de sulfito de iones alcalinos o alcalinotérreos donde la sal de ditionita y/o de sulfito está presente en una cantidad submolar respecto a dicho activador de CK.
Description
Reactivo estabilizado y método para determinar
la creatinkinasa.
La presente invención se refiere a un método
mejorado o bien a un reactivo estabilizado para la determinación
fotométrica de la creatinkinasa en muestras biológicas, como el
suero o el plasma sanguíneo del hombre. El reactivo se caracteriza
básicamente porque al menos contiene una ditionita y/o una sal de
sulfito de iones alcalinos o alcalinotérreos en una proporción
estequiométrica.
La determinación de creatinkinasa en suero o
plasma tiene un importante papel en el diagnóstico del infarto de
miocardio. Como método estándar se emplea para ello una prueba
fotométrica, en la cual en una reacción acoplada enzimática de
fosfato de creatina y
adenosin-5'-difosfato (ADP) se crea
o fabrica la adenosin-5'-trifosfato
(ATP) de creatina a través de la creatinkinasa (CK) contenida en la
muestra; con la ATP se forma, por ejemplo, la
glucosa-6-fosfato a partir de la
glucosa en presencia de la hexokinasa (HK), que es oxidada en la
reacción catalizada por la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G6P-DH) con la transformación simultánea de
NAD^{+} o NADP^{+} en NADH o NADPH y la creación de
gluconato-6-fosfato:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como parámetro de medición sirve el aumento de
la extinción que tiene lugar por la formación de
NAD(P)H, a una temperatura determinada, habitualmente
entre 25 y 37ºC, en un intervalo de tiempo predeterminado, que es
proporcional a la actividad de la CK en el volumen de muestra. Para
que la CK pueda desplegar toda su actividad enzimática, la
determinación se realiza frecuentemente en presencia de activadores
de la CK, por ejemplo, de los compuestos de tiol, como el
glutatión, ditiotreitol, tioglicerol,
2-mercaptoetanol y
N-acetilcisteina.
Además se añaden al reactivo en el que se basa
la prueba de la CK unos inhibidores para las miokinasas existentes
eventualmente en la muestra (adenilato-kinasa), como
por ejemplo, el
adenosin-5'-monofosfato (AMP) y/o el
di-adenosin-pentafosfato. A pesar
de estas adiciones la reacción puede transcurrir del modo
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
donde de ADP se forma ATP de forma
no específica. Esto puede conducir a una formación de
NAD(P)H que falsifica o mejor dicho falsea la
determinación de CK. La alteración o el trastorno por una
adenilato-kinasa parcialmente inhibida, que aparece
especialmente en las muestras hemolíticas, puede ser eliminada de
manera que antes del inicio propiamente de la reacción de la CK por
la adición del fosfato de creatina se determina la actividad de la
adenilato-kinasa y ésta es sustraída (lo que se
conoce como "rate blanking") de la actividad total (CK y
adenilato-kinasa). Esencialmente se trata de que
existan todos los componentes necesarios para la detección de la
cantidad de ATP formada sobre el adenilato-kinasa en
la primera solución de reacción (hasta el fosfato de
creatina).
Para la determinación de las isoenzimas de
creatin-kinasa se pueden añadir al reactivo además
unos inhibidores específicos, como por ejemplo, los anticuerpos
dirigidos contra determinadas isoenzimas CK.
Para aumentar la sensibilidad de detección la
glucosa-6-fosfato puede contener
además 6-fosfogluconolactonasa y
gluconato-6-fosfato-deshidrogenasa;
en este caso se sintetizarán dos moles de NADH o de NADPH por mol de
ATP formado o de glucosa-6-fosfato
(R. Vormbrock y R. Helger, Enzyme 38, Suppl. I(1987), págs.
20/21).
Además es posible, por ejemplo, realizar la
detección de CK de forma que a partir del fosfato de creatina y de
ADP el ATP formado por medio de glicerina y glicerokinasa,
preferiblemente en presencia de iones de magnesio, sea transformado
en glicerina-3-fosfato, el cual en
presencia de oxígeno se transforme enzimáticamente en peróxido de
hidrógeno y pueda ser detectado de forma convencional por medio de
peroxidasa y de indicadores redox.
Fundamentalmente todos los componentes
necesarios para la determinación de CK, es decir enzimas y
sustratos, se presentan en un único reactivo. En particular en los
analizadores se realiza preferiblemente la determinación de manera
que la muestra es incubada previamente durante algunos minutos con
un primer reactivo parcial que contiene además de fosfato de
creatina todos los componentes requeridos para la reacción de
detección y otros aditivos posibles, como por ejemplo la
N-acetilcisteina, los inhibidores de
adenilato-kinasa así como si es preciso inhibidores
del isoenzima de la CK, y a continuación se inicia la reacción de
detección mediante la adición de un segundo reactivo parcial que
contiene básicamente fosfato de creatina en una solución
tamponada.
Además de evitar una formación de NAD (P) H
ocasionada por la CK en la fase de la activación del enzima que
transcurre en presencia del compuesto de tiol añadido, además es
posible de este modo evitar las falsificaciones del resultado de
medición debidas a excesivas actividades en
adenilato-kinasa que no son inhibidas por los
insuficientes inhibidores de adenilato-kinasa, como
por ejemplo, las que pueden aparecer en las muestras hemolíticas.
Para ello tras la mezcla de la muestra y del primer reactivo parcial
se realiza una primera medición de la velocidad de formación de
NAD(P)H y el resultado se resta de la velocidad de
formación del NAD(P)H tras la adición del segundo
reactivo parcial que contiene fosfato de creatina.
Un inconveniente para el usuario de dichos
reactivos reside en que ahora, en particular, los reactivos deben
ser fabricados antes de su uso mediante la disolución de componentes
sólidos, como por ejemplo, liofilizados, granulados o comprimidos y
estos son estables pocos días o semanas en un almacenamiento en frío
de 2 hasta 8ºC. Por motivos de racionalización en un laboratorio
clínico existe hoy en día la necesidad creciente de reactivos
listos para el uso con una estabilidad de cómo mínimo 12 meses a 2
hasta 8ºC. Este requisito no se puede cumplir actualmente por falta
de estabilidad. En realidad la inestabilidad del reactivo utilizado
es debida a la inestabilidad de la N-acetilcisteina
(NAC, activador de CK).
El problema de la estabilidad se puede resolver
ciertamente como en EP 0 686 561, mediante el almacenamiento de NAC
(junto con NAD(P)) en una segunda solución a pH 3,0, sin
embargo con grandes inconvenientes. En esta fórmula de reactivo la
activación de la CK se lleva a cabo inicialmente con el inicio de la
reacción de la CK. Para la medición libre de la fase de reposo se
requiere por tanto un tiempo de espera elevado antes de iniciar la
propia medición y se limita con ello la zona de medición del método.
Otro inconveniente es que no es posible la eliminación de la
alteración de adenilato-kinasa por el rate blanking.
En la patente EP 0 774 514 se han descrito ciertamente medidas de
estabilización para los correspondientes reactivos líquidos para
determinar la CK, como por ejemplo, la adición de una fosfina y un
compuesto de sulfhidrilo, por ejemplo, el ditiotreitol, el DTT. Sin
embargo, la adición de DTT está ligada al inconveniente de que éste
desestabiliza el enzima auxiliar G6P-DH y de ese
modo la adición de otro componente en forma de un compuesto de
hidroxilamina (como por ejemplo, el hidrocloruro de
carboximetoxilamina) hace posible la estabilización de la
G6P-DH (EP 0 640 686).
Además en EP 0 721 986 se han descrito unos
reactivos estables para la determinación de la creatinkinasa, que
contienen determinados compuestos SH como la tioglicerina (TG), el
2-mercaptoetanol (2ME) o bien el ácido
2-mercaptoetanosulfónico (2MES) en concentraciones
molares. Contrariamente a otros activadores, estos no inhiben la
actividad CK en forma oxidada. Las concentraciones relativamente
elevadas de los compuestos SH correspondientes pueden provocar, no
obstante, unos efectos secundarios no deseados, como por ejemplo, la
inactivación de las enzimas auxiliares (por ejemplo,
G6P-DH). Estos activadores no se recomiendan
actualmente para la determinación de la actividad de la CK (por
ejemplo, según 1fcC, DGkCh).
Es habitual que se comparen los sistemas de
prueba correspondientes teniendo en cuenta los isoenzimas y las
diferentes especies de CK.
\newpage
La técnica más indicada se ha descrito en
JP-A-09-070298 y WO
95/30769. La
JP-A-09-070298
publica el uso de un reactivo estabilizado, que contiene un oxácido
con un átomo de azufre central en combinación con un compuesto que
contiene un grupo tiol como activador de CK, para la determinación
de la actividad de la CL. El reactivo puede constar de dos
reactivos parciales, de manera que el oxácido existe o bien en el
propio reactivo parcial como activador de la CK, o en ambos
reactivos parciales. La utilización del oxácido como estabilizador
en uno de los reactivos parciales, en el que no contiene activador
de CK, no se ha publicado.
La WO 95/30769 describe el uso de los compuestos
orgánicos del sudor, el sulfóxido de dimetilo, la dimetiltiourea,
N-2-mercaptopropionilglicina y el
glutatión para la estabilización de una solución reactivo para
determinar la CK. La solución contiene un compuesto que tiene un
grupo tiol, por ejemplo, la A-acetilcisteina (NAC)
como activador. Sin embargo, no se prefiere un compuesto sulfurado
como estabilizador sino manitol en concentraciones de hasta 5
mM.
En especial para poder racionalizar los trabajos
en un laboratorio clínico bajo una presión económica creciente,
existe actualmente cada día más la necesidad de reactivos
estabilizados, que sean estables y puedan ser almacenados en forma
líquida durante al menos 12 meses a 2 hasta 8ºC, sin que sea preciso
calibrarlos y donde el riesgo de reacciones poco específicas debido
a determinados aditivos sea mínimo.
Este cometido se resuelve conforme a la
invención mediante un reactivo, definido en la reivindicación 1, que
contiene un sistema tampón adecuado, unos sustratos que son
transformados por la CK o bien los coenzimas correspondientes, un
activador de CK así como los componentes necesarios para una o
varias reacciones enzimáticas y al menos una ditionita y/o una sal
de sulfito de los iones alcalinos o alcalinotérreos de carga molar
respecto al activador de CK. Los activadores de CK son conocidos
por el técnico. De acuerdo con la invención se prefiere un reactivo
que contenga adenosin-5'-difosfato
(ADP)y fosfato de creatina como sustratos transformables por
la CK. Se prefiere especialmente un reactivo, que contenga glucosa,
un enzima que forme
glucosa-6-fosfato, como por ejemplo
hexokinasa, ADP, fosfato de creatina, un activador de CK, si se
diera el caso el
adenosin-5'-monofosfato, una
coenzima en forma oxidada, como la NAD^{+}, NADP^{+} o derivados
de este tipo, una G6P-deshidrogenasa y si se diera
el caso uno o varios inhibidores de adenilato-kinasa
y/o activadores y al menos una ditionita y/o una sal de sulfito de
iones alcalinos o alcalinotérreos en una relación estequiométrica.
Se prefieren especialmente las sales disódicas para la
estabilización de reactivos para la determinación de CK.
La concentración en el reactivo de los
componentes sulfurosos conforme a la invención es del orden del
enzima que va a ser determinado (CK) y es como máximo de 20 mmol/l.
Se prefieren concentraciones entre aproximadamente 0,01 y 5 mmol/l,
especialmente de 0,1 hasta 1,0 mmol/l de componentes sulfurosos.
Todos los componentes restantes así como otros
aditivos si fuera preciso, que incluyen la
6-fosfogluconolactonasa y la
gluconato-6-fosfato-deshidrogenasa,
se emplearán en las concentraciones habituales.
Existe una configuración especial del reactivo
conforme a la invención que es cuando los componentes
correspondientes para la determinación de CK se presentan por
separado en dos reactivos parciales, de manera que en un primer
reactivo parcial se encuentra el activador de la CK y todo el
conjunto de sustancias y enzimas necesarias para la determinación
de la CK hasta el fosfato de creatina y en un segundo reactivo
parcial se encuentra el fosfato de creatina y por ejemplo glucosa.
El componente sulfurado conforme a la invención se encuentra por
tanto en un segundo reactivo parcial y no en el primer reactivo
parcial. Se ha comprobado que se prefiere que el compuesto de
azufre se añada al primer reactivo más complejo, el cual contiene
también activador de CK, justo directamente antes de la medición,
por ejemplo, sobre la segunda solución reactivo.
Otra configuración especial de la reacción será
un reactivo que contenga glucosa en una concentración baja en la
combinación de NAD (P)^{+}G6P-DH en un
reactivo parcial, preferiblemente en una proporción de unos 5
mmol/l o menos, mientras se prefieren 0,5 hasta 1,0 mmol/l de
glucosa.
El reactivo acuoso conforme a la invención se
caracteriza por una estabilidad especial después de un periodo de
almacenamiento largo entre 2 y 8ºC, es decir después de un periodo
de tiempo de varios meses de hasta 12 meses sin una nueva
calibración y se caracteriza por una elevada especificidad. En la
prueba de la función de la CK se podía constatar únicamente una
desviación mínima frente a un reactivo recién fabricado, es decir,
los índices de recuperación de la CK eran aproximadamente del
100%.
Otro objetivo de la invención es un método para
la determinación enzimática de la creatin-kinasa en
un material de ensayo biológico utilizando el reactivo
anteriormente especificado.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Determinación de la actividad de la CK
añadiendo Na_{2}SO_{3} (0 hasta 4 mmol/l); tiempo de
almacenamiento: 14 días, temperatura: 35ºC en comparación a 2 hasta
8ºC.
Figura 2: Influencia de Na_{2}SO_{3} (0
hasta 4 mmol/l) en la G6P-DH; tiempo de
almacenamiento: 14 días, temperatura: 35ºC en comparación a 2 hasta
8ºC.
Figura 3: Determinación de la actividad de la CK
añadiendo Na_{2}SO_{3} (1 mmol/l); tiempo de almacenamiento:
192 días, temperatura: 2 hasta 8ºC (2 muestras).
Figura 4: Influencia de diferentes
concentraciones de Na_{2}SO_{3} (0, 1, 2, 3, 4, 5,10 y 20
mmol/l) en la actividad de la CK; Temperatura: 2 hasta 8ºC.
Figura 5: Influencia de Na_{2}SO_{3} (1
mmol/l) en comparación a DTT (10 mmol/l) en la
G6P-DH; tiempo de almacenamiento: 136 días,
temperatura: 2 hasta 8ºC.
Los ejemplos siguientes aclaran la
invención:
\vskip1.000000\baselineskip
| Reactivo 1 (R1): | Imidazol (pH 6,6) | 100 mmol/l |
| Glucosa | 1 mmol/l | |
| Acetato de magnesio | 10 mmol/l | |
| EDTA | 2 mmol/l | |
| ADP | 2 mmol/l | |
| AMP | 5 mmol/l | |
| Di-adenosin-pentafosfato | 10 \mumol/l | |
| NADP^{+} | 2 mmol/l | |
| N-acetilcisteina | 20 mmol/l | |
| Hexokinasa | 3 U/ml | |
| G6P-deshidrogenasa | 3 U/ml | |
| Na_{2}SO_{3} | 0 hasta 4 mmol/l | |
| Reactivo 2 (R2): | Capso (pH 9,3) | 20 mmol/l |
| Glucosa | 110 mmol/l | |
| Fosfato de creatina | 170 mmol/l |
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación se mezclan 250 \mul de
R1 con 10 \mul de muestra, se incuban durante 5 minutos, se
inicia la reacción con 50 \mul de R2 y se mide la actividad de la
CK tras otra incubación de 1 minuto. La determinación de la
actividad enzimática, de la CK o bien G6P-Dh se
realizaba tras el almacenamiento a 2 hasta 8ºC o bien 35ºC en
momentos diferentes (tablas 1-3, figuras
1-3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La composición del reactivo y la realización de
la prueba tenían lugar en principio análogamente al ejemplo 1.
Variaba únicamente la cantidad de sulfito sódico (0 hasta 20 mmol/l)
que se añadía al reactivo 1. El resultado se extrae de la tabla 4 o
bien de la figura 4.
| Reactivo(R): | Imidazol (pH 6,6) | 100 mmol/l |
| Glucosa | 1 mmol/l | |
| Acetato de magnesio | 10 mmol/l | |
| EDTA | 2 mmol/l | |
| ADP | 2 mmol/l | |
| AMP | 5 mmol/l | |
| Di-adenosin-pentafosfato | 10 \mumol/l | |
| NADP^{+} | 2 mmol/l | |
| N-acetilcisteina | 20 mmol/l | |
| Hexokinasa | 3 U/ml | |
| G6P-deshidrogenasa | 3 U/ml | |
| Ditiotreitol | 10 mmol/l |
El reactivo R se describía en el ejemplo 1, se
purificaba con la muestra a medir y se determinaban las actividades
enzimáticas correspondientes (tabla 5, figura 5).
| Reactivo 1(R1): | Imidazol (pH 6,6) | 100 mmol/l |
| Glucosa | 1 mmol/l | |
| Acetato de magnesio | 10 mmol/l | |
| EDTA | 2 mmol/l | |
| ADP | 2 mmol/l | |
| AMP | 5 mmol/l | |
| Di-adenosin-pentafosfato | 10 \mumol/l | |
| NADP^{+} | 2 mmol/l | |
| N-acetilcisteina | 20 mmol/l | |
| Hexokinasa | 3 U/ml | |
| G6P-deshidrogenasa | 3 U/ml | |
| Reactivo 2(R2) | Capso (pH 9,3) | 20 mmol/l |
| Glucosa | 110 mmol/l | |
| Fosfato de creatina | 170 mmol/l | |
| N_{2}SO_{3} | 10 mmol/l |
Mezcla de R1, R2 y la muestra correspondiente y
la determinación siguiente se realizaba conforme al ejemplo 1.
Claims (6)
1. Reactivo para la determinación de
creatinkinasa en un material de muestras biológico que consta de dos
reactivos parciales, de manera que un primer reactivo parcial
contiene los sustratos y coenzimas apropiados que pueden ser
transformados por la CK, un activador de la CK y opcionalmente otros
componentes que se requieren para una o más reacciones posteriores
en un medio tamponado acuoso, que se caracteriza porque el
segundo pero no el primer reactivo parcial contiene una sal de
ditionita y/o una sal de sulfito de iones alcalinos o
alcalinotérreos donde la sal de ditionita y/o de sulfito está
presente en una cantidad submolar respecto a dicho activador de
CK.
2. Reactivo conforme a la reivindicación 1, que
se caracteriza porque el segundo reactivo parcial contiene
un máximo de 20 mmol/l de una sal de ditionita y/o de sulfito de
iones alcalinos o alcalinotérreos.
3. Reactivo conforme a la reivindicación 1 ó 2,
que se caracteriza porque el reactivo contiene glucosa,
fosfato de creatina, G6P deshidrogenasa,
adenosin-5'-difosfato, un enzima que
forma la glucosa-6-fosfato,
NAD^{+} ó NADP^{+} y uno o más inhibidores de adenilato
kinasa.
4. Reactivo conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 3, donde el primer reactivo parcial contiene
glucosa, G6P des- hidrogenasa,
adenosin-5'-difosfato, una
hexokinasa, NAD^{+} ó NADP^{+} y un activador de CK y el
segundo reactivo parcial contiene fosfato de creatina y al menos una
sal de ditionita y/o de sulfito de iones alcalinos o
alcalinotérreos.
5. Reactivo conforme a una de las
reivindicaciones 3 ó 4, que se caracteriza porque la
concentración máxima de glucosa es de 5 mmol/l.
6. Método para la determinación enzimática de
creatinkinasa en material de prueba biológico usando un reactivo
conforme a las reivindicaciones 1 a 5.
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