ES2282156T3 - Vacuna de acido nucleico. - Google Patents
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Abstract
Una construcción de vacuna de ácido nucleico que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende un monómero VNTR de MUC-1 alterado, en la que la construcción comprende la secuencia mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, y en la que el polipéptido codificado, cuando es expresado, se puede unir al anticuerpo SM3.
Description
Vacuna de ácido nucleico.
La presente invención se refiere a
construcciones de vacuna de ácido nucleico que comprenden
polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos que son
variantes de glucosilación de la proteína MUC1, composiciones de
vacuna que comprenden las construcciones y uso de las construcciones
o composiciones para vacunar un mamífero.
La mucina celular epitelial MUC1 (también
conocida como episialina o mucina epitelial polimórfica, PEM) es
una glucoproteína de alto peso molecular expresada en muchas células
epiteliales. La proteína consiste en una cola citoplásmica, un
dominio transmembrana y un numero variable de repeticiones en serie
de un motivo de 20 aminoácidos (en la presente denominado monómero
VNTR, también puede conocerse como el epítopo VNTR, o la repetición
VNTR) que contiene una alta proporción de residuos de prolina,
serina y treonina. El número de repeticiones es variable debido al
polimorfismo genético del locus MUC1, y más frecuentemente varía en
el intervalo de 30-100 (Swallow y col., 1987, Nature
328:82-84). En epitelio ductal, la proteína
MUC1 se encuentra solamente en la superficie apical de la célula,
expuesta a la luz del conducto (Graham et al, 1996, Cancer
Immunol Immunother 42:71-80;
Barrat-Boyes y col., 1996, Cancer Immunol Immunother
43:142-151). Una de las características más
llamativas de la molécula MUC1 es su glucosilación enlazada por O
extensiva. Existen cinco sitios de glucosilación enlazada por O
disponibles con cada monómero VNTR de MUC1. De acuerdo al sistema
de numeración de la figura 1, estos son Thr-6,
Ser-7, Thr-11,
Ser-17 y Thr-18.
En carcinomas malignos que se originan por
transformación neoplásica de estas células epiteliales, varios
cambios afectan la expresión de MUC1. La expresión polarizada de la
proteína se pierde, y se encuentra dispersada sobre toda la
superficie de la célula transformada. La cantidad total de MUC1
también se incrementa, con frecuencia 10 veces o más (Strous &
Dekker, 1932, Crit Rev Biochem Mol Biol.
27:57-92). Lo más significativo es que la
cantidad y calidad de las cadenas de carbohidrato enlazadas por O
cambia notablemente. Pocos residuos de treonina y serina se
glucosilan. Aquellas cadenas de carbohidratos que se encuentran se
acortan de manera anormal, creando el antígeno carbohidrato
asociado a tumor STn (Lloyd y col., 1996, J Biol. Chem,
271:33325-33334). Como resultado de estos
cambios de glucosilación, varios epítopos en la cadena de péptido de
MUC1 que se seleccionaron previamente por las cadenas de
carbohidratos se vuelven accesibles. Un epítopo que se vuelve
accesible de esta manera se forma por la secuencia APDTR (Ala 8 -
Arg 12 en la figura 1) presentes en cada monómero VNTR de 20
aminoácidos (Burchel y col., 1989, Int J Cancer
44:691-696).
Es evidente que estos cambios en MUC1 significan
que una vacuna que pueda activar el sistema inmune frente a la
forma de MUC1 expresada en tumores puede ser eficaz contra tumores
de células epiteliales y, de hecho, otros tipos de células en los
que se encuentra MUC1, tales como linfocitos T. Uno de los
mecanismos efectores principales usados por el sistema inmune para
destruir células que expresan proteínas anómalas es una respuesta
inmune de linfocitos T citotóxicos (CTL) y esta respuesta es
deseable en una vacuna para tratar tumores, así como una respuesta
de anticuerpos. Una buena vacuna activará todas las ramas de la
respuesta inmune. No obstante, las actuales vacunas de
carbohidratos y péptidos tales como Theratope o BLP25 (Biomira Inc,
Edmonton, Canadá) activan preferentemente una rama de la respuesta
inmune - una respuesta humoral y celular, respectivamente, y la son
deseables mejores diseños de vacunas para generar una respuesta más
equilibrada.
Las vacunas de ácidos nucleicos proporcionan una
serie de ventajas sobre las vacunas de proteínas convencionales,
porque éstas son económicas, y fáciles de producir en grandes
cantidades. Incluso a pequeñas dosis se ha descrito que inducen
fuertes respuestas inmunes y pueden inducir respuesta inmune de
linfocitos T citotóxicos así como una respuesta de anticuerpos. No
obstante, existe una barrera técnica que previene el desarrollo de
vacunas de ácido nucleico eficaces contra MUC1.
En vacunas de ácidos nucleicos, una molécula de
ácido nucleico que codifica el antígeno de elección se introduce en
células normales del hospedador. Si la vacuna de ácido nucleico que
codifica un polipéptido MUC1 se suministra por transferencia de
genes mediados por péptidos (patente de Estados Unidos 5371015), las
células transfectadas más frecuentemente son posiblemente los
queratinocitos o células de Langerhams cutáneas. De igual modo, si
el ácido nucleico es suministrado por inyección intramuscular, los
tipos celulares diana principales son las células que presentan
antígeno derivadas de la médula ósea y células del músculo
esquelético. Cada una de estas células contiene un equilibrio
fisiológico de enzimas de glucosilación y, por ello, glucosilarán el
producto génico MUC1 codificado por la vacuna de un modo tal que se
parece más a MUC1 en epitelio normal, en lugar de a la forma
glucosilada de modo aberrante encontrada en células transformadas.
De hecho, casi cualquier célula que sea transfectada con un
polinucleótido que codifica MUC1 glucosilará el producto génico
codificado por la vacuna. Como resultado, aunque puede ser posible
ver algunos resultados, la vacuna será incapaz de estimular de
forma óptima inmunidad contra las células tumorales.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona construcciones de vacuna de ácido nucleico que codifican
un polipéptido que comprende el monómero VNTR o repeticiones o
fragmentos del mismo, que se han manipulado tal que la secuencia
codificada no puede ser totalmente glucosilada por los mecanismos
celulares normales. De forma sorprendente, los autores de la
presente invención han investigado para conseguir esto en un aspecto
por modificación genética de nuevas sustituciones de aminoácidos en
el polipéptido codificado. Los autores de la invención han
producido construcciones de vacuna de ácido nucleico que comprenden
polinucleótidos que codifican polipéptidos que retienen la
conformación de los epítopos MUC1, un requisito esencial para una
inmunogenicidad continuada de los polipéptidos alterados y que
tienen una glucosilación reducida, pareciéndose por ello más a la
forma de MUC1 expresada en tumores.
De acuerdo con una realización de la presente
invención, se proporciona una construcción de vacuna de ácido
nucleico que comprende un monómero VNTR de MUC-1
alterado en el que la construcción comprende la secuencia mostrada
en la Figura 2 o la Figura 3 y en la que el polipéptido
codificado, cuando es expresado, se puede unir al anticuerpo
SM3.
En un aspecto, el polipéptido codificado por la
construcción de vacuna de ácido nucleico consiste en una copia del
monómero VNTR de MUC1. En otro aspecto, el polipéptido codificado
por la construcción de vacuna de ácido nucleico consiste en un
fragmento del monómero VNTR de MUC1.
En otra realización de la invención se
proporciona una composición de vacuna que comprende una construcción
de vacuna de ácido nucleico definida en la presente memoria en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otra realización de la invención se
proporciona una construcción de vacuna de ácido nucleico o una
composición de vacuna como se define en la presente memoria para
usar en la vacunación de un mamífero contra tumores malignos.
En otra realización más de la invención, se
proporciona el uso de una construcción de vacuna de ácido nucleico
o una composición de vacuna como se define en la presente memoria
para la fabricación de un medicamento para usar en la vacunación de
un mamífero contra tumores malignos.
La invención se describirá con más detalle a
modo de ejemplo y con referencia a las siguientes figuras:
La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos
de tipo silvestre de un elemento de monómero VNTR de MUC1
(denominado en la presente VNTR).
La figura 2 muestra la secuencia de un
polipéptido denominado Mut51 codificado por un polinucleótido
aislado preferido comprendido por una construcción de vacuna de
acido nucleico de la invención. Las mutaciones comparadas con la
secuencia de tipo silvestre se muestran en negrita. También se
incluye en la figura 2 una secuencia de nucleótidos representativa
que codifica este polipéptido.
La figura 3 muestra la secuencia de un
polipéptido denominado Mut5V codificado por un polinucleótido
aislado preferido comprendido en una construcción de vacuna de
acido nucleico. Las mutaciones con la secuencia de tipo silvestre
se muestran en negrita. También se incluye en la figura 3 una
secuencia de nucleótidos representativa que codifica este
polipéptido.
La figura 4 muestra el anticuerpo que se une a
polipéptidos MUC1 de tipo silvestre, y los polipéptidos mutados
mostrados en la Tabla 1, a través de una gama de concentraciones de
anticuerpo. Estos resultados demuestran la capacidad del anticuerpo
SM3 (que reconoce el motivo APDTRP en los residuos
8-13) para reconocer los polipéptidos sin
glucosilar. Mut5P, Mut5A y Mut5N demostraron substancialmente los
mismos resultados que aquellos mostrados para Mut5W.
La figura 5 demuestra la estrategia de clonación
utilizada para producir las construcciones de vacuna de acido
nucleico que contienen las formas mutantes de Muc 1.
La figura 6 muestra el suero de anticuerpo
tomado de ratones inmunizados con construcciones de vacuna de acido
nucleico que codifican formas mutantes de MUC1. Esta figura muestra
la unión de ese suero a una forma de tipo silvestre de MUC1 en la
forma de un péptido sintético. Esto demuestra que las construcciones
de vacuna de acido nucleico de la invención pueden originar
anticuerpos in vivo que reconocen la forma sin mutar de
MUC1.
La figura 7 muestra un análisis FACS de la unión
de suero de anticuerpo de ratones inmunizados con construcciones de
vacuna de acido nucleico que codifican formas mutantes de MUC1 a
células de cáncer de mama en seres humanos.
Estos resultados demuestran que las
construcciones de vacuna de acido nucleico de la invención pueden
originar anticuerpos in vivo que reconocen la forma de MUC1
expresada en tumores.
La figura 8 muestra la secuencia de la porción
del extremo N de pVAC1-stc, como se describe en el
ejemplo 3.
\newpage
La figura 9 muestra los oligonucleótidos usados
para construir plásmidos MUC1 mutantes MUT4, como se describe en el
ejemplo 3. Todas las secuencias se escriben de 5' a 3'. El subrayado
indica los sitios de restricción, las letras cursivas indican las
secuencias utilizadas como cebadores de PCR cortos. Las letras en
minúscula indican las diferencias de la secuencia de tipo silvestre
necesarias para codificar las mutaciones deseadas. La notación
'Superior A', 'Inferior B' etc, se refiere a la estrategia mostrada
en la figura 5.
La Figura 10 muestra los oligonucleótidos usados
para construir plásmidos MUC1 MUT5N mutantes, como se describe en
el ejemplo 3. Todas las secuencias se escriben de 5' a 3'. El
subrayado indica los sitios de restricción, las letras cursivas
indican las secuencias utilizadas como cebadores de PCR cortos. Las
letras en minúscula indican las diferencias de la secuencia de tipo
silvestre necesarias para codificar las mutaciones deseadas. La
notación 'Superior A', 'Inferior B' etc, se refiere a la estrategia
mostrada en la figura 5.
A lo largo de toda la memoria descriptiva y las
reivindicaciones adjuntas, a no ser que el contexto lo requiera,
las palabras "comprende" e "incluye" o variaciones tales
como "que comprende", "comprendiendo", "incluyendo",
"que incluye" y similares se considerarán de forma inclusiva,
es decir, el uso de estas palabras implicará la posible inclusión
de elementos no especificados de forma explícita.
Tal como se describe en la presente memoria, la
presente invención se refiere a construcciones de vacuna de ácido
nucleico que comprenden polinucleótidos aislados, tales
construcciones son útiles en vacunación contra tumores. En el
contexto de esta invención, el término "aislado" se destina a
definir que el polinucleótido no están en estado silvestre, en
tanto en cuanto se ha purificado al menos en cierto grado o se ha
producido sintéticamente, por ejemplo, por procedimientos
recombinantes, o síntesis mecánica. El término "aislado"
incluye por tanto la posibilidad de que los polinucleótidos estén
en combinación con otros materiales biológicos o no biológicos,
tales como células, suspensiones de células o fragmentos de células,
proteínas, péptidos, vectores de expresión, disolventes orgánicos
o inorgánicos, u otros materiales según sea apropiado, pero excluye
la situación en la que el polinucleótido está en un estado tal como
se encuentra en la naturaleza.
Los polipéptidos codificados por los
polinucleótidos aislados comprendidos en las construcciones de
vacuna de ácido nucleico de la presente invención se han denominado
"polipéptidos codificados" a lo largo de la memoria
descriptiva y las reivindicaciones. Dichos polipéptidos codificados
comprenden al menos cinco residuos aminoacídicos consecutivos del
monómero VNTR de MUC1 en los que uno o más de dichos aminoácidos es
un sitio de glucosilación y la glucosilación se ha prevenido o
alterado en al menos uno de dichos sitios de glucosilación. Con
preferencia, dichos polipéptidos codificados comprenden al menos
10, por ejemplo 13, 15, 16, 17, 18 ó 19 aminoácidos del monómero
VNTR de MUC1. Más preferiblemente, dichos polipéptidos codificados
comprenden al menos 20 aminoácidos del monómero VNTR de MUC1. Los
aminoácidos consecutivos pueden proceder totalmente de un monómero
VNTR, o pueden extenderse a través de monómeros, por ejemplo, tres
de dichos aminoácidos consecutivos pueden proceder del extremo N
terminal de un monómero VNTR y los dos aminoácidos siguientes pueden
proceder del extremo C terminal de un segundo monómero VNTR.
El término "al menos 5 aminoácidos
consecutivos" incluye el caso en el que uno o más de dichos
aminoácidos se ha alterado con respecto al tipo silvestre por una
mutación de aminoácidos. Así, por ejemplo, un polipéptido
codificado que tiene una secuencia que contiene tres aminoácidos de
acuerdo con la secuencia de tipo silvestre, luego una sustitución
de aminoácido por el siguiente aminoácido de tipo silvestre, luego
otros tres aminoácidos de acuerdo con la secuencia de tipo
silvestre se considera que tiene al menos cinco aminoácidos
consecutivos del monómero VNTR de MUC1.
En una realización, el polinucleótido aislado
comprendido en las construcciones de vacuna de ácido nucleico de la
invención es tal que el polipéptido codificado consiste en entre una
y diez copias del monómero VNTR. En otra realización el
polinucleótido aislado comprendido en las construcciones de vacuna
de ácido nucleico de la invención es tal que el polipéptido
codificado consiste en 10 o más copias del monómero VNTR, por
ejemplo 20, 30, 50, 60, 75, 90 ó 100 o más copias del monómero
VNTR. En otra realización, el polinucleótido aislado comprendido en
las construcciones de vacuna de ácido nucleico de la invención es
tal que el polipéptido codificado consiste en una combinación de
repeticiones y fragmentos, por ejemplo, un monómero VNTR y un
fragmento, de 1 a 10 repeticiones y de 1 a 10 fragmentos, 10 o más
repeticiones y 10 o más fragmentos, 10 o más repeticiones y 10 o
menos fragmentos o 10 o más fragmentos y 10 o menos repeticiones. En
otra realización, el polinucleótido aislado comprendido en las
construcciones de vacuna de ácido nucleico de la invención es tal
que el polipéptido codificado consiste en una combinación de
fragmentos, por ejemplo, un número de copias de un fragmento, o un
número de diferentes fragmentos. En cada caso, cuando esté presente
en el polipéptido codificado más de un fragmento, los fragmentos
pueden ser iguales o diferentes.
Con preferencia, la alteración o prevención de
la glucosilación se consigue mediante mutación de los aminoácidos
que forman los sitios de glucosilación en los polipéptidos
codificados. El término "mutación de aminoácido" tal y como se
usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones
significa que uno o más aminoácidos en los polipéptidos codificados
difiere de la secuencia del monómero VNTR de MUC1 de tipo silvestre
tal como se muestra en la figura 1. Este cambio puede ser, por
ejemplo, eliminación, inserción o sustitución de uno o más
aminoácidos.
Estas mutaciones se consiguen diseñando la
secuencia del polinucleótido aislado comprendido en la construcción
de vacuna de ácido nucleico tal que el polipéptido codificado tiene
mutaciones de aminoácidos en uno o más sitios de glucosilación.
Cuando la mutación de aminoácido deseada sea una sustitución, los
tres nucleótidos que codifican dicho aminoácido en la secuencia de
tipo silvestre serán cambiados por los nucleótidos que codifican el
aminoácido deseado. Cuando la mutación de aminoácido deseada sea una
eliminación, los tres nucleótidos que codifican dicho aminoácido en
la secuencia de tipo silvestre serán eliminados. Cuando la mutación
de aminoácido deseada sea una inserción, los tres nucleótidos que
codifican el aminoácido deseado se insertarán en la secuencia de
nucleótidos de tipo silvestre.
Un experto en la técnica podrá determinar
fácilmente la secuencia del polinucleótido requerida aplicando el
código genético al polipéptido codificado deseado. Una vez que se ha
determinado la secuencia requerida, se puede producir la
construcción de vacuna de ácido nucleico que comprende el
polinucleótido aislado con la secuencia deseada como se describe en
los ejemplos. Un experto en la técnica podrá adaptar fácilmente
cualquier parámetro necesario, tales como cebadores y condiciones
de la PCR. También se sobreentiende por un experto en la técnica
que, debido a la degeneración del código genético, existe
posiblemente más de una secuencia de polinucleótido aislado que se
puede usar para producir un polipéptido codificado deseado.
En una realización, la construcción de vacuna de
ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que comprende
la secuencia mostrada en la figura 2, o la secuencia mostrada en la
figura 3.
En una realización preferida, la secuencia del
polinucleótido aislado es tal que la mutación de aminoácido es una
sustitución. En una realización más preferida, la secuencia del
polinucleótido aislado es tal que la mutación de aminoácido es la
sustitución de un residuo serina o treonina con otro aminoácido que
carezca de grupo hidroxilo que forma el sitio de unión de la
glucosilación enlazada por O. Con preferencia, la secuencia del
polinucleótido aislado es tal que la serina o treonina es
reemplazada por valina, isoleucina, alanina, asparagina,
fenilalanina o triptófano. Más preferiblemente, la secuencia del
polinucleótido aislado es tal que la treonina o serina es
sustituida por valina o isoleucina. Incluso más preferiblemente, la
secuencia del polinucleótido aislado es tal que treonina es
sustituida por valina o isoleucina. En una realización
particularmente preferida, la secuencia del polinucleótido aislado
es tal que el polipéptido codificado tiene la treonina 11
sustituida por valina o isoleucina, y se prefieren especialmente las
secuencias mostradas en las figuras 2 ó 3, con las sustituciones de
aminoácidos resaltadas. Con preferencia, la secuencia del
polinucleótido aislado es tal que los polipéptidos codificados han
sido mutados tal que la glucosilación se ha alterado o prevenido en
al menos un 60%, por ejemplo 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 100% de los
sitios de glucosilación presentes en los polipéptidos.
Los polipéptidos codificados preferentemente
mantienen similitud inmunológica con la forma de MUC1 encontrada en
tumores. El termino "similitud inmunológica" se pretende que
signifique que a pesar de la mutación de uno o mas aminoácidos, la
conformación de uno o mas epítopos en el polipéptido codificado
permanece suficientemente sin cambios de manera que un anticuerpo
que reconocería un epítopo en el monómero VNTR de la forma de MUC1
expresada en tumores reconocería también ese epítopo en los
polipéptidos codificados. El termino "similitud inmunológica"
comprende no solamente la situación en la que todos los anticuerpos
que reconocen la forma de MUC1 expresada en tumores también
reconocen los polipéptidos codificados, sino también cualquier
situación en donde al menos un epítopo permanece suficientemente
sin cambiar para al menos un anticuerpo anti-MUC1
para reconocer los polipéptidos codificados. Es particularmente
preferido que los anticuerpos originados por los polipéptidos
codificados puedan distinguir entre la forma de MUC1 expresada en
células de tumor, y la forma de MUC1 expresada en células normales,
por ejemplo uniéndose al primero pero no al segundo.
En una realización, los polipéptidos
codificados, cuando son expresados, son aquellos que pueden ser
reconocidos por el anticuerpo anti-MUC1 SM3.
Las construcciones de vacuna de ácido nucleico
de la invención también pueden comprender otro polinucleótido
aislado que codifica un polipéptido heterólogo, con preferencia un
polipéptido inmunógeno. Este polinucleótido aislado está situado en
la construcción de vacuna de ácido nucleico de modo tal que, cuando
es expresado, el polipéptido heterólogo se enlaza o fusiona con el
polipéptido codificado expresado. Con preferencia, el
polinucleótido aislado que codifica el polipéptido heterólogo es
contiguo al polinucleótido aislado que codifica los polipéptidos
codificados.
En una realización, los polipéptidos heterólogos
codificados pueden actuar a modo de portadores para dirigir los
polipéptidos codificados, por ejemplo, el polipéptido heterólogo se
puede unir a un receptor en una célula diana. En otra realización,
el polipéptido heterólogo puede actuar como un inmunógeno para
potenciar la respuesta inmune originada por los polipéptidos
codificados. Polipéptidos heterólogos adecuados incluyen hemocianina
de lapa bocallave, ovoalbúmina, proteína de la superficie del virus
de la hepatitis B, proteína del núcleo del virus de la hepatitis B,
toxina del tétano, glutatión S transferasa o citocromo C de paloma.
En una realización preferida, el polipéptido heterólogo es toxina
del tétano o proteína del núcleo del virus de la hepatitis B. Las
secuencias de nucleótidos que codifican estos polipéptidos están
disponibles fácilmente para un experto en la técnica.
Además, la construcción de vacuna de ácido
nucleico comprenderá iniciadores, promotores, potenciadores
adecuados y otros elementos, tales como por ejemplo, señales de
poliadenilación que pueden ser necesarios y que están situados en
la orientación correcta, para permitir la expresión de la proteína
en una célula de mamífero.
El promotor puede ser un promotor eucariótico
por ejemplo un promotor CD68, promotor Gal1, Gal10 o NMT1, un
promotor procariótico, por ejemplo promotor Tac, Trc o Lac, o un
promotor viral, por ejemplo el promotor de citomegalovirus, el
promotor SV40, el promotor de polihedrina, el promotor P10, o el
promotor LTR de virus respiratorio sincitial. Con preferencia, el
promotor es un promotor viral. Se prefiere de forma particular que
el promotor sea el promotor inmediato de citomegalovirus.
Los elementos reguladores de la transcripción
pueden comprender potenciadores, por ejemplo, la región sin
traducir 3' del antígeno de superficie de la hepatitis B, el
potenciador CMV; intrones, por ejemplo, el intrón CD68, o el intrón
CMV A, o regiones reguladoras, por ejemplo, la región sin traducir
5' de CMV.
La estructura de la construcción de vacuna de
ácido nucleico puede ser ARN o ADN, por ejemplo ADN plasmídico, ADN
viral, ADN bacteriano, ADN cromosómico artificial bacteriano, ADN
cromosómico artificial de levadura, ADN sintético. También es
posible que la construcción de vacuna de ácido nucleico sea un ácido
nucleico artificial, por ejemplo, ARN o ADN fosforotioato. Con
preferencia, la construcción es ADN, se prefiere de forma particular
el ADN plasmídico.
El polinucleótido aislado comprendido en la
construcción de vacuna de ácido nucleico que codifica un polipéptido
codificado puede ser ARN, por ejemplo ARNm, o puede ser ADN, por
ejemplo ADN genómico, ADNc o ADN de síntesis. Con preferencia, el
polinucleótido es ADN, es particularmente preferido el ADNc. El
polinucleótido está enlazado de forma operativa preferiblemente al
promotor en la construcción de vacuna de ácido nucleico tal que
cuando se inserta la construcción en una célula de mamífero, el
polinucleótido se expresa para producir un polipéptido
codificado.
Las construcciones de vacuna de ácido nucleico
de la presente invención producen polipéptidos codificados cuando
se expresan en una célula de mamífero. Dicha célula de mamífero
puede estar in vitro, en una línea celular en cultivo en un
laboratorio, por ejemplo, células HEK293T, CHO, HeLa o COS. En este
caso, los polipéptidos expresados se pueden recolectar y usarse tal
cual para la vacunación. Más preferiblemente, las células de
mamífero están in vivo y la construcción de vacuna de ácido
nucleico se administra directamente a un mamífero, por ejemplo, un
ratón, perro, gato, conejo, cerdo, vaca, caballo o rata o, con
preferencia particular un ser humano.
La presente invención también incluye
composiciones de vacuna, que comprenden una cantidad
terapéuticamente eficaz de una construcción de vacuna de ácido
nucleico de la invención, preferiblemente en combinación con un
vehículo farmacéuticamente aceptable tal como solución salina
tamponada con fosfato (PBS), solución salina, dextrosa, agua,
glicerol, etanol o combinaciones de los mismos. La composición de
vacuna puede comprender de forma alternativa una cantidad
terapéuticamente eficaz de una construcción de vacuna de ácido
nucleico de la invención, formulada sobre microesferas de oro. Como
alternativa, la composición puede comprender las construcciones de
vacuna de ácido nucleico formuladas con liposomas. La construcción
de vacuna de ácido nucleico será de tal modo que cuando se
administra a un mamífero, el polipéptido es expresado en dicho
mamífero. El polipéptido expresado o administrado generará entonces
una respuesta inmune, que preferiblemente implica tanto inmunidad
humoral como celular.
La presente invención también incluye
construcciones de vacuna de ácido nucleico o composiciones de vacuna
como las que se han descrito en la presente para usar en la vacuna
de un mamífero contra tumores, tanto para profilaxis como para
tratamiento. Con preferencia, el mamífero es un ser humano. La
vacuna puede estar dirigida contra un tumor de cualquier tipo
celular que exprese MUC1 y así el tumor pueda ser sensible a
anticuerpos que reconozcan el monómero VNTR de MUC1. En una
realización, los tumores son de linfocitos T. Con preferencia, la
vacuna está dirigida contra tumores de células epiteliales, más
preferiblemente la vacuna está dirigida contra cáncer de mama o
cáncer de pulmón amicrocítico.
Las construcciones de vacuna de ácido nucleico y
las composiciones de vacuna que incluyen las mismas se pueden
administrar en una diversidad de formas, por ejemplo, por vía oral,
nasal, pulmonar, intramuscular, subcutánea o intradérmica. Estas se
pueden administrar a un individuo como una composición inyectable,
por ejemplo, como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente
isotónica. Una técnica particularmente preferida implica el
bombardeo con partículas (que también se conoce como tecnología de
"pistola génica" y se describe en la patente de Estados Unidos
nº 5371015). Aquí, las partículas inertes (tales como microesferas
de oro) se revisten con un ácido nucleico y se aceleran a
velocidades suficientes para permitir que las mismas penetren en una
superficie de un receptor (por ejemplo, la piel), por ejemplo por
medio de descarga a presión desde un dispositivo de proyección.
(Las partículas recubiertas con construcciones de vacuna de ácido
nucleico de la invención están dentro del alcance de la presente
invención, como son los dispositivos cargados con tales partículas).
Otros procedimientos de administración de construcciones de vacuna
de ácido nucleico o composiciones que contienen dichas
construcciones directamente a un receptor incluyen ultrasonidos,
estimulación eléctrica, electropermeación y microsiembra, que se
describen en el documento US 5.697.901.
También se puede administrar una construcción de
vacuna de ácido nucleico de la presente invención por medio de
vectores de suministro especializados útiles en terapia génica. Las
técnicas de terapia génica se describen por ejemplo por Verme et
al, Nature 1997, 389:239-242. Se pueden
usar tanto sistemas virales como no virales. Los sistemas basados
en virus incluyen sistemas basados en retrovirus, lentivirus,
adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus y virus vaccinia. Los
sistemas no basados en virus incluyen la administración directa de
ácidos nucleicos y sistemas basados en liposomas. Por ejemplo, los
vectores se pueden encapsular por liposomas o en partículas de
polilactida coglicolida (PLG).
También se puede administrar una construcción de
vacuna de ácido nucleico de la presente invención por medio de
células transformadas. Tales células incluyen células recogidas de
un sujeto. La construcción de vacuna de ácido nucleico se puede
introducir en tales células in vitro y las células
transformadas se pueden devolver posteriormente al sujeto. La
construcción de vacuna de ácido nucleico de la invención se puede
integrar en ácido nucleico ya presente en una célula por sucesos de
recombinación homóloga. Si se desea, una célula transformada puede
reproducirse in vitro y se pueden usar una o más de las
células resultantes en la presente invención. Las células pueden
disponerse en un sitio apropiado en un paciente por técnicas
quirúrgicas o microquirúrgicas conocidas (por ejemplo, injerto,
microinyección y similares).
La cantidad de construcciones de vacuna de
ácido nucleico o composición que las contiene que se suministra
variará significativamente, dependiendo de la especie y el peso de
mamífero que se está inmunizando, de la naturaleza del estado de
enfermedad frente al que se está tratando/protegiendo, el protocolo
de vacunación adoptado (es decir, administración única frente a
dosis repetidas), la vía de administración y la potencia y dosis
del compuesto coadyuvante elegido. En base a estas variables, un
médico o veterinario practicante puede determinar fácilmente el
nivel de dosis apropiado pero éste puede ser, por ejemplo, 0,5 - 5
\mu/kg de las construcciones de vacuna de ácido nucleico o
composición que las contiene. En particular, la dosis variará
dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, cuando se usa
administración intradérmica en microesferas de oro, la dosis total
variará preferiblemente de 1 \mug a 10 ng, de forma
particularmente preferida, la dosis variará de 10 \mug a 1 ng.
Cuando la construcción de vacuna de ácido nucleico se administra
directamente, la dosis total es por lo general mayor, por ejemplo,
de 50 \mug a 1 o más miligramos. Las dosis anteriores son
ejemplos del caso medio. Naturalmente, puede haber casos
individuales en los que sean necesarias intervalos de dosis mayores
o menores y tales están dentro del alcance de esta
invención.
invención.
Es posible que la construcción de vacuna de
ácido nucleico que comprende la secuencia de polinucleótidos que
codifica el péptido antigénico o la composición que comprende la
construcción de vacuna de ácido nucleico, se administre de una vez
o se administra de forma repetida, por ejemplo, de 1 a 7 veces, con
preferencia de 1 a 4 veces, en intervalos de aproximadamente 1 día
a aproximadamente 18 meses, con preferencia 1 mes. Esto puede estar
seguido opcionalmente por la dosificación en intervalos regulares de
1 a 12 meses durante un período de hasta el resto de la vida del
paciente. De nuevo una vez más no obstante, esta pauta de
tratamiento se variará significativamente dependiendo del peso y
especie de animal en cuestión, la cantidad de construcción de
vacuna de ácido nucleico o composición administrada, la vía de
administración, la potencia y dosis de cualquier compuesto
coadyuvante usado y de otros factores que serán evidentes para un
médico o veterinario practicante.
La presente invención se describirá a
continuación a modo de ejemplo en la siguiente sección
experimental.
\vskip1.000000\baselineskip
A lo largo de los siguientes ejemplos de la
invención, se hace uso de diversas técnicas conocidas en biología
molecular y celular. Los detalles prácticos de estas se pueden
encontrar en una serie de libros de texto que incluyen Sambrook
et al, 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press.
La numeración de los residuos en el VNTR de MUC1
es de acuerdo con lo que se muestra en la Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los pépticos sintéticos se diseñan conteniendo
mutaciones en los sitios de glucosilación. La atención particular
se centró en sustituciones en el residuo de treonina en esta
secuencia (T11). La Tabla 1 de abajo indica los péptidos que se
diseñaron y sus sitios de glucosilación mutados. Los péptidos que
contienen dos copias idénticas del VNTR designados se sintetizan en
Genemed Synthesis Inc (San Francisco, CA). Estos péptidos se
seleccionan por su habilidad para unirse a un numero de anticuerpos
monoclonales anti-MUC1 en un ELISA.
Los pépticos se preparan como soluciones acuosas
en tampón bicarbonato sódico 50 mM pH 9,6 y se revisten en placas
Nunc Maxisorp a 4ºC durante la noche a un intervalo de
concentraciones entre 50 \mug/ml y 25 ng/ml. Después de enjuague
extensivo con TBS-Tween (solución salina tamponada
con Tris, pH 7,4, que contiene 0,05% de Tween 20), las placas se
bloquean con solución de bloqueo (3% p/v de albúmina de suero bovino
en TBS-Tween) durante 2 horas a temperatura
ambiente. Los anticuerpos anti-MUC1 HMGF1
(Novocastra, Newcastle, RU), HMGF2 (Novocastra), SM3 (Girling y
col., 1989, Int J Cancer 43:1072-1076) y ATR1
(Bynum et al.. 1995, Hybridoma
14:587-591) se diluyen en solución de
bloqueo, se añaden a la placa e incuban a temperatura ambiente
durante una hora. Después de aclarar, el anticuerpo unido se marca
por incubación con IgG anti-ratón
HRP-conjugado (P260, Dako, Dinamarca) en dilución
1/2000 en tampón de bloqueo. La placa se aclara de nuevo y se
detecta el conjugado unido utilizando reactivos de color Fast OPD
(Sigma, Poole, RU). La reacción se detiene por la adición de ácido
sulfúrico 3M, y el producto OPD se cuantifica al medir la
absorbancia a 490 nm.
Los resultados de este experimento se muestran
en la Tabla 2. La señal ELISA para cada combinación de anticuerpo y
péptido se clasifica de acuerdo con una escala semicuantitativa, en
la que +++ indica unión fuerte, ++ indica unión normal, + indica
unión débil y - indica unión no significativa.
Estos datos demuestran que es posible alterar
todos los sitios de glucosilación enlazada por O en el monómero
VNTR de MUC1, en tal manera que evite la glucosilación, sin
perturbar la estructura total del antígeno, como se evidencia por
el mantenimiento de la unión de un numero de anticuerpos
anti-MUC1. Un descubrimiento especialmente
sorprendente y útil es que las versiones Mut51 y Mut5V del VNTR
mantienen la unión para el anticuerpo SM3. Cuando se utiliza en
estudios inmunoquímicos de muestras clínicas, SM3 muestra fuerte
coloración selectiva por MUC1 expresada en células tumorales
oponiéndose a MUC1 expresada en tejido normal circundante (Girling
et al., 1989). Estos descubrimientos muestran claramente que
es posible obtener variantes de VNTR que adoptan una conformación
similar a los epítopos formados por la forma tumoral de MUC1 - una
propiedad altamente deseable para un inmunógeno de vacuna.
Los polipéptidos descritos en la tabla 1
anterior se utilizan de nuevo en este experimento. La metodología
es esencialmente similar al Ejemplo 1 excepto que los péptidos se
revisten sobre una placa ELISA a una concentración fija de 3
\mug/ml, y se aplican diferentes concentraciones de anticuerpo
SM3. Los resultados se muestran en la figura 4. Mut5p, Mut5A y
Mut5N muestran patrones de unión de anticuerpo esencialmente iguales
que los mostrados para Mut5W.
Los datos mostrados en la figura 4 no solamente
confirman lo mostrado anteriormente, sino que también ilustran que
la mutación de Thr-11 a Ile y Val en Mut5l y Mut5V
reduce poco la afinidad de anticuerpo SM3 por el péptido, indicando
que los mutantes no glucosilados, en realidad, pueden ser
imitaciones muy similares de la secuencia nativa.
El plásmido pVAC1 (Thomsen, et
al. Immunology 95:S1, OP106, 1998) es un vector
de expresión eucariótico optimizado para vacuna de ADN. Contiene un
promotor CMV operablemente enlazado a un sitio de clonación
múltiple en el cual las inserciones que codifican los antígenos
pueden colocarse. Puede colocarse una inserción que contiene una
señal de inicio de traducción Kozak, la señal de secreción de
mamífero y los sitios de clonación se preparan por PCR utilizando
como molde el plásmido pMNM1 (Ellis y col., J Immunology
156:2700-2709, 1996) y como cebadores SSF y
SSR (tabla 3). El fragmento de PCR se separa con Rsr II y Xhol para
crear una inserción de 120 pb que se clona en los sitios Rsr II y
Xho I de pVAC1 para generar el plásmido pVac-1ss2.
La secuencia de ADN se confirma utilizando los cebadores de
amplificación de PCR como cebadores de secuenciación. La segunda
etapa fue la introducción de un fragmento C de toxina de tétano
"en marco", (FrC), gen fusionado al sitio SgrA codificado por
el cebador SSR, permitiendo la adición de epítopos antigénicos "en
marco" en este sitio. Esto se logra por amplificación de PCR del
gen FrC del plásmido plC9Tet15, (Clare y col., Methods in
Molecular Biology 103:193-208, 1998)
utilizando cebadores marcados con ADN que codifica un péptido
bisagra y sitios de enzima de restricción para SgrA I y Xho I (FrCF
y FrCR respectivamente). El fragmento PCR separado por 1,3 kb SgrA
I/Xho I se clona en sitios SgrA I y Xho I de
pVac-1ss2 para generar el plásmido
pVac-1stc. La secuencia de ADN se confirma por
secuenciación fluorescente utilizando cebadores de amplificación PCR
y las secuencias derivadas FrC internas FrCS1 a FrCS6 (Tabla 3). La
secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos en el extremo
terminal N de la proteína de fusión FrC que muestra los sitios de
fusión de epítopo se muestra en la figura 8.
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Los conjuntos de oligonucleótidos sintéticos se
diseñan de manera que el templado y clonación posterior en el
plásmido pVac-1stc permitiría codificar un conjunto
en serie de cinco copias del epítopo VNTR de MUC1
(PAHGVT
SAPDTRPAPGSTAP). Se diseñaron dos variantes: ambas fueron versiones mutantes en las cuales cuatro o cinco de los residuos de serina y treonina sujetos a glucosilación en cada copia del epítopo se han reemplazado por aminoácidos no modificables: PAHGVVAAPDTRPAPGAVAP, cuatro mutaciones, (MUT4), y PAHGVVAAPDNRPAPGAVAP, cinco mutaciones (MUT5N). En todos los casos, las secuencias MUC1 se expresan como una parte de una proteína de fusión FrC. Los oligonucleótidos se listan en las figuras 9 y 10 (los sitos para las enzimas de restricción SgrA1 y SaM están subrayados, las letras minúsculas indican mutaciones que se alejan de la secuencia de tipo silvestre). En la figura 5 se muestra la estrategia utilizada, (después del tratamiento con quinasa de polinucleótido T4 para fosforilar los extremos 5' de los oligonucleótidos), para producir las repeticiones en serie. La estrategia se utiliza para generar un plásmido similar que contiene dos disposiciones en serie de VNTR MUT5N Muc-1 "en marco" a FrC (pVAC-1stcMUC-1 MUT5N), formada por recombinación homóloga y eliminación de cinco secuencias repetidas. Para generar un plásmido similar que contiene los VNTRs de MUT4, se empleó una modificación de la estrategia descrita en la Figura 5 porque después de la etapa de ligación, los oligonucleótidos se sometieron a amplificación por PCR. Los cebadores utilizados fueron las secuencias ADN en cursiva en las figuras 9 y 10, y las condiciones PCR fueron 25 ciclos a 94ºC durante 45 segundos, 69-75ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 1 minuto. Las reacciones de PCR se procesan entonces como en la figura 5, pero solamente el producto limpio más grande, (generalmente alrededor de 150-200 pb de tamaño), se purifico por gel y se clono. Utilizando este planteamiento se generó un plásmido que contiene una repetición y media de MUT4 Muc-1, (pVAC-1stcMUC-1MUT4), VNTR fusionado "en marco" a FrC, formado por eliminación y salto de cadena mediado por PCR de las cinco secuencias repetidas.
SAPDTRPAPGSTAP). Se diseñaron dos variantes: ambas fueron versiones mutantes en las cuales cuatro o cinco de los residuos de serina y treonina sujetos a glucosilación en cada copia del epítopo se han reemplazado por aminoácidos no modificables: PAHGVVAAPDTRPAPGAVAP, cuatro mutaciones, (MUT4), y PAHGVVAAPDNRPAPGAVAP, cinco mutaciones (MUT5N). En todos los casos, las secuencias MUC1 se expresan como una parte de una proteína de fusión FrC. Los oligonucleótidos se listan en las figuras 9 y 10 (los sitos para las enzimas de restricción SgrA1 y SaM están subrayados, las letras minúsculas indican mutaciones que se alejan de la secuencia de tipo silvestre). En la figura 5 se muestra la estrategia utilizada, (después del tratamiento con quinasa de polinucleótido T4 para fosforilar los extremos 5' de los oligonucleótidos), para producir las repeticiones en serie. La estrategia se utiliza para generar un plásmido similar que contiene dos disposiciones en serie de VNTR MUT5N Muc-1 "en marco" a FrC (pVAC-1stcMUC-1 MUT5N), formada por recombinación homóloga y eliminación de cinco secuencias repetidas. Para generar un plásmido similar que contiene los VNTRs de MUT4, se empleó una modificación de la estrategia descrita en la Figura 5 porque después de la etapa de ligación, los oligonucleótidos se sometieron a amplificación por PCR. Los cebadores utilizados fueron las secuencias ADN en cursiva en las figuras 9 y 10, y las condiciones PCR fueron 25 ciclos a 94ºC durante 45 segundos, 69-75ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 1 minuto. Las reacciones de PCR se procesan entonces como en la figura 5, pero solamente el producto limpio más grande, (generalmente alrededor de 150-200 pb de tamaño), se purifico por gel y se clono. Utilizando este planteamiento se generó un plásmido que contiene una repetición y media de MUT4 Muc-1, (pVAC-1stcMUC-1MUT4), VNTR fusionado "en marco" a FrC, formado por eliminación y salto de cadena mediado por PCR de las cinco secuencias repetidas.
Una manera alterativa para generar las
secuencias descritas seria la síntesis directa de oligonucleótidos
que contienen menos copias de las repeticiones VNTR con una
estrategia de clonación y digestión similar a aquella descrita
arriba.
El plásmido pPA1 contiene el gen para el
antígeno del núcleo del HBV (serotipo ADW) con un sitio NheI único
en la región de bucle E1 (Chambers et al., J. Virol
70:4045-4052, 1996). Este sitio de clonación
permite la inserción de un fragmento pequeño de ADN que codifica un
epítopo clave de una proteína externa. El bucle E1 de la proteína
se expone en la superficie del antígeno del núcleo expresado. La
inserción de núcleo de HBV formada se amplifica por PCR utilizando
cebadores HBV1F y HBV1R (Tabla 3), y clona en pCR2.1 (Invitrogen)
por el método de TA protuberante para crear
pCR2.1-HepBE1. La construcción se secuencia antes de
utilizarse.
Se utiliza PCR entonces para amplificar los
fragmentos que codifican dos repeticiones en serie del monómero
VNTR de MUC1 de los plásmidos
pVAC-1stcMUC-1MUT4 y
pVAC-1stcMUC-1MUT5N. Las dos
inserciones MUT5N de repetición en serie se preparan por PCR
utilizando pVAC-1stcMUC-1MUT5N como
molde y cebadores
MUT5NF y MUT5NR (Tabla 3).
MUT5NF y MUT5NR (Tabla 3).
El plásmido
pVAC-1stcMUC-1MUT4 solamente
contenía una repetición en serie completa del monómero
VNTR de MUC1. Este plásmido se utiliza como molde en PCR de dos etapas utilizando un cebador en avance común (MUT4F) y dos cebadores inversos diferentes. En la primera reacción, el cebador inverso (MUT4R1) agrega parte de la secuencia adicional requerida para generar una segunda repetición completa de la versión MUT4 de la secuencia de MUC1 (es decir, mitad de una repetición en serie) a la repetición en serie existente. El producto PCR resultante se utiliza entonces como un molde por una PCR de segunda ronda utilizando un segundo cebador inverso (MUT4R2) para agregar en los residuos requeridos para completar la repetición, junto con el sitio de clonación NheI requerido.
VNTR de MUC1. Este plásmido se utiliza como molde en PCR de dos etapas utilizando un cebador en avance común (MUT4F) y dos cebadores inversos diferentes. En la primera reacción, el cebador inverso (MUT4R1) agrega parte de la secuencia adicional requerida para generar una segunda repetición completa de la versión MUT4 de la secuencia de MUC1 (es decir, mitad de una repetición en serie) a la repetición en serie existente. El producto PCR resultante se utiliza entonces como un molde por una PCR de segunda ronda utilizando un segundo cebador inverso (MUT4R2) para agregar en los residuos requeridos para completar la repetición, junto con el sitio de clonación NheI requerido.
Los productos PCR MUT4 o MUT5 se digirieron con
NheI y clonaron en el vector pCR2.1 HepBEl cortado con NheI. Los
clones resultantes se orientan y la secuencia se verifica por
secuenciación de dideoxi fluorescente. El núcleo de HepB completo +
región de módulo MUC1 TR se corta entonces utilizando Sail y Xhol y
se clona en pVAC1ss2 cortado con Xhol. Las construcciones finales
se verifican todas por análisis de secuencia completo, creando
pVAC1.ss2.MUT4.MUC1.HepB (codifica dos copias de la variante MUT4
del monómero VNTR de MUC1 en el ciclo E1 de proteína del núcleo de
HBV); y pVAC1.ss2.MUT5N.MUC1.HepB (codifica dos copias de la
variante MUT5N del monómero VNTR MUC1 en el ciclo E1 de la proteína
del núcleo de HBV).
El ADN plasmídico se precipita sobre
microesferas de oro de 2 \mum de diámetro utilizando cloruro de
calcio y espermidina. Las microesferas cargadas se revisten sobre
un tubo flexible Tefzel como se describe (Eisenbraum et al, ADN
Cell Biology 12:791-797, 1993; Pertmer
et al., J. Virol 70:6119-6125,
1996). El bombardeo de partículas se realiza utilizando el sistema
de suministro de gen Accell (documento PCT WO 95/19799). Para cada
plásmido, se inmunizaron cinco ratones hembra C56BI/6 con 3
administraciones de plásmido en los días 0, 21 y 42. Cada
administración consistía en dos bombardeos con ADN/oro,
proporcionando una dosis total de aproximadamente 2,5 \mug de
plásmido.
Las muestras de suero se obtienen de los
animales por venipunción en los días 1, 20, 41 y 55, y se analizaron
para la presencia de anticuerpos anti-MUC1. Se
realizó un ELISA utilizando placas Nunc Maxisorp revestidas durante
la noche a 4ºC con 3 \mug/ml de peso de secuencia MUC1 (40 mer
correspondiente a 2 repeticiones en serie). Después de enjuagar con
TBS-Tween (solución salina tamponada con Tris, pH
7,4 que contiene 0,05% de Tween 20) las placas se bloquean con BSA
al 3% en tampón TBS-Tween durante 2 h a temperatura
ambiente. Todos los sueros se incubaron en dilución 1:100 durante 1
h a TA en tampón TBS-Tween. Las placas se enjuagan
de nuevo y se detecta el conjugado enlazado utilizando reactivos de
color Fast OPD (Sigma, Poole, RU). La reacción se detiene por la
adición de acido sulfúrico 3M, y el producto OPD se cuantifica al
medir la absorbancia a 490 nm.
Los resultados de este análisis se muestran en
la figura 6. Estos demuestran que las secuencias mutantes de
glucosilación de la presente invención pueden utilizarse como
vacunas para producir respuestas inmunes capaces de reconocer la
secuencia MUC1 de tipo silvestre.
Con objeto de demostrar que todos los
anticuerpos evocados por estas vacunas son capaces de reconocer
células tumorales, las muestras de antisuero de estos ratones se
utilizan para marcar varias líneas de células tumorales, y el
marcado se visualiza por citometría de flujo.
Las células (T67-D,
MCF-7, B16F0 y B16F0MUC1; 1x10^{6}) se enjuagan en
tampón PBS complementado con FCS al 5% e incuban a 4ºC durante 15
min con suero de ratón en dilución 1:100. Después del enjuague, las
células se incubaron con el segundo anticuerpo (IgG
anti-ratón de Oveja, Dako, Dinamarca, en dilución
1:10) en las mismas condiciones. Las células control se incuban con
tampón FACS en lugar del anticuerpo de la primera etapa antes de la
coloración con el reactivo de la segunda etapa. El análisis FACS se
realiza utilizando un FACSan (Becton Dikinson). Se miden
simultáneamente mil células por muestra para FSC (difusor de luz de
ángulo en avance) como SSC (difusor de luz integrado) así como
fluorescencias verdes (FL1) y rojas (FL3) (expresadas como
logaritmo de la luz de fluorescencia integrada). Los registros se
hacen solamente en células negativas de yoduro de propidio (viable)
de la fluorescencia roja, excluyendo los agregados cuyos FCS
estuvieron fuera de rango. Los datos se expresan como histogramas
representados como números de células (eje Y) frente a intensidad
de fluorescencia (eje X) para los diferentes tipos de suero de ratón
unido a la superficie de la célula tumoral.
Los resultados pueden observarse en la figura 7,
Esta figura muestra que el suero de ratones inmunizados con las
construcciones de MUC1 mutante de glucosilación en realidad
contienen IgG anti-MUC1 capaz de unirse tanto a
células tumorales humanas como murinas que expresan MUC1 de
superficie de células nativas. T47D es la línea de células de tumor
de mama humano. B16F0 es una línea de células B16 parental, y estas
células que carecen de expresión de MUC1 no se marcan.
B16-muc1 (B16F0 transfectado con Muc1) sin embargo,
se marcan.
Claves para la figura 7:
Solamente seg = solamente control del segundo
anticuerpo para dar niveles de fluorescencia de fondo.
No inm = suero control de animales no
inmunizados
hepB cont = suero control de animales
inmunizados con vector vacío (sin ADN de MUC1)
hepB2TR mut4 & hepB2TR mut5 son sueros de
animales inmunizados con estos ADN de MUC1 mutante.
Estos datos confirman la utilidad de estas
secuencias VNTR variantes en vacunación de acido nucleico.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Glaxo Group Limited Ellis, Jonathan
H Crowe, James S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Mejoras en vacuna de ácido
nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PG3886
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/G BOO/04906
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
20-12-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 9930359.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
22-12-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
Arg Pro Ala Pro Gly}
\sac{Ser Thr Ala Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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Arg Pro Ala Pro Gly}
\sac{Ala Val Ala Pro Pro Ala His Gly Val Val
Ala Ala Pro Asp Ile Arg}
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Arg Pro Ala Pro Gly}
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Arg Pro Ala Pro Gly}
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Ala Ala Pro Asp Pro Arg}
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\sa{Pro Ala His Gly Val Val Ala Ala Pro Asp Val
Arg Pro Ala Pro Gly}
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Ala Ala Pro Asp Val Arg}
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<213> Artificial
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\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 31
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Mut5N
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<221> CDS
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Construcción de vacuna
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<221> Características diversas
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<212> RNA
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<213> Artificial
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<220>
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\hfill18
Claims (9)
1. Una construcción de vacuna de ácido
nucleico que comprende un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que comprende un monómero VNTR de MUC-1
alterado, en la que la construcción comprende la secuencia mostrada
en la Figura 2 o la Figura 3, y en la que el polipéptido
codificado, cuando es expresado, se puede unir al anticuerpo
SM3.
2. Una construcción de vacuna de ácido
nucleico según la reivindicación 1, que comprende además una
secuencia de polinucleótido adicional que codifica un polipéptido
heterólogo.
3. Una construcción de vacuna de ácido
nucleico según la reivindicación 2, en la que el polipéptido
heterólogo es toxina del tétano, proteína del núcleo del virus de
la hepatitis B, proteína de la superficie del virus de la hepatitis
B, ovoalbúmina, glutatión S transferasa, hemocianina de lapa
bocallave o citocromo C de paloma.
4. Una composición de vacuna que comprende un
ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones
anteriores en combinación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
5. Una construcción de vacuna de ácido
nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una
composición según la reivindicación 4 para usar en vacunación de un
mamífero contra tumores.
6. Uso de una construcción de vacuna de ácido
nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una
composición según la reivindicación 4 en la fabricación de un
medicamento para usar en vacunación de un mamífero contra
tumores.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que
la construcción o composición se administra usando una pistola
génica.
8. Uso según la reivindicación 6 ó 7, en el
que los tumores son tumores de células epiteliales.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que
los tumores son tumores cancerosos de mama.
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