ES2278215T3 - Sustrato capilar para el almacenamiento a baja temperatura de muestras de suspensiones con abertura de ventilacion. - Google Patents
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Abstract
Dispositivo de crioalmacenamiento (100) con un bloque portador (10) sobre el cual está dispuesta al menos una cámara de muestras (20) de forma capilar para alojar una muestra en suspensión de modo que un primer extremo (21) de la cámara de muestras (20) está fijo sobre el bloque portador (10) y un segundo extremo opuesto (22) de la cámara de muestras (20) sobresale libremente del bloque portador (10), caracterizado porque la al menos una cámara de muestras (20) presenta una abertura de compensación de presión (23) separada del segundo extremo (22).
Description
Sustrato capilar para el almacenamiento a baja
temperatura de muestras de suspensiones con abertura de
ventilación.
La invención se refiere a un dispositivo para el
almacenamiento a baja temperatura (en especial crioalmacenamiento,
crioconservación) de muestras de suspensiones, en especial un
dispositivo de crioalmacenamiento para células biológicas
suspendidas, grupos de células o componentes celulares, y a un
procedimiento para el almacenamiento a baja temperatura.
El crioalmacenamiento de muestras biológicas
posee numerosas aplicaciones, que se dirigen a un almacenamiento de
las muestras manteniendo su estado de vitalidad. Los dispositivos
que se usan para esto están adaptados a las respectivas muestras y
a los requisitos de la manipulación de las muestras. A bajas
temperaturas se pueden almacenar por ejemplo órganos en la medicina
de transplantes o donaciones de sangre en la medicina de
transfusión. Estas técnicas están limitadas a la aplicación con un
volumen de muestra relativamente grande (intervalo de ml hasta
1).
En biología celular y cada vez más en la
biotecnología molecular existe el objetivo de almacenar y dado el
caso procesar las más pequeñas muestras (células individuales,
grupos celulares o componentes celulares) en estado congelado. Se
conoce depositar muestras para la crioconservación sobre superficies
de sustrato (véanse por ejemplo las patentes EP804073, DE19921236).
Esta técnica puede poseer desventajas a causa del elevado gasto de
espacio y del peligro de contaminación.
Como alternativa a la deposición de muestras
sobre sustratos es conocido el uso de cámaras criogénicas de
muestras (por ejemplo, en forma de capilares o tubos de paredes
finas, véase por ejemplo la patente WO02/46719). Las cámaras de
muestras forman un recipiente cerrado al menos parcialmente y
ofrecen por lo tanto una protección mejorada para las muestras. Una
desventaja general de las cámaras criogénicas de muestras es sin
embargo que se deben tomar precauciones especiales para cargar y
mantener las cámaras de muestras en el medio criogénico.
En la patente US4262494 se describe un
dispositivo de crioalmacenamiento con varias cámaras de muestras de
forma capilar que están dispuestas en un contenedor refrigerador
portátil. Estas cámaras de muestras están dispuestas separadas
entre sí alejadas de una pared del contendor refrigerador. En la
figura 5 se muestra una vista lateral esquemática de este soporte
convencional. Se prevé un bloque portador 10' en el que se
introducen cámaras de muestras de forma tubular 20'. Para ello, en
el bloque portador 10' están previstos orificios 11' con un
diámetro correspondiente. Con esta estructura se pueden fijar las
cámaras de muestras 20' y soportarse separadas entre sí. Sin
embargo se producen desventajas en relación a la carga de las
cámaras de muestras y la estabilidad del soporte en especial
durante un almacenamiento a largo plazo en condiciones
criogénicas.
También en la patente WO 99/20104 se describen
cámaras de muestras para el crioalmacenamiento. Las cámaras de
muestras se colocan sobre un cuerpo de refrigeración, produciéndose
igualmente desventajas durante la carga de las cámaras de
muestras.
El objetivo de la invención es proporcionar un
dispositivo de crioalmacenamiento con el que se superen las
desventajas de los dispositivos de crioalmacenamiento convencionales
y posibilite especialmente una carga de una pluralidad de células
suspendidas, grupos de células o componentes celulares en tiempos
cortos y una extracción selectiva parcial de componentes de
muestra. El dispositivo de crioalmacenamiento debe posibilitar
especialmente también el registro y la lectura de datos que
pertenezcan a las respectivas muestras almacenadas. El objetivo de
la invención también es especificar un procedimiento mejorado de
crioalmacenamiento.
Estos objetivos se consiguen mediante
dispositivos y procedimientos con las características según las
reivindicaciones 1 ó 10. De las reivindicaciones subordinadas se
deducen formas de realización y aplicaciones preferidas de la
invención.
Una idea básica de la invención es modificar un
dispositivo de crioalmacenamiento con un bloque portador y al menos
una cámara de muestras dispuesta sobre este para alojar una muestra
de suspensión que está fijada con su primer extremo al bloque
portador y con el segundo extremo opuesto sobresale del bloque
portador de tal manera que en la al menos una cámara de muestras
esté provista a distancia del segundo extremo libre sobresaliente
una abertura de compensación de presión. Mediante esta
característica se posibilita la carga de la al menos una cámara de
muestras bajo la acción de fuerzas de capilaridad en un estado en el
que la cámara de muestras esté fija en el bloque portador. Se evita
así el uso de complicados dispositivos dispensadores.
Según una forma de realización preferida de la
invención, la abertura de compensación de presión está prevista
inmediatamente en el primer extremo de la cámara de muestras. De
forma ventajosa, con ello se aprovecha todo el volumen interno de
la cámara de muestras para alojar la muestra. La abertura de
compensación de presión se puede formar a través del mismo extremo
de la cámara de muestras o en una escotadura en la pared de la
cámara de muestras en su primer extremo. Además pueden estar
previstas varias aberturas de compensación de presión.
Cuando la al menos una cámara de muestras está
fijada con su primer extremo sobre la superficie fundamentalmente
plana del bloque portador, se pueden producir ventajas en relación a
una estructura especialmente simple del dispositivo de
crioalmacenamiento. Cuando de forma alternativa están dispuestas
hendiduras en la superficie del bloque portador como elementos de
alojamiento, en los que la al menos una cámara de muestras se pueda
disponer al menos parcialmente hundida, se pueden producir ventajas
en relación a la estabilidad del dispositivo de
crioalmacenamiento.
La al menos una cámara de muestras está unida
preferiblemente mediante un lugar de rotura teórica con el bloque
portador. Al ejercer una fuerza mecánica en el extremo sobresaliente
de la cámara de muestras se puede separar ésta de forma
reproducible del bloque portador. Gracias a esto se puede facilitar
la extracción de muestras parciales.
Se prefiere especialmente una forma de
realización del dispositivo de crioalmacenamiento según la invención
en la que se disponen una pluralidad de cámaras de muestras en
forma de aguja verticalmente sobre el bloque portador. De forma
ventajosa se pueden proporcionar las cámaras de muestras
distanciadas entre sí y no obstante con alta densidad, de modo que
el dispositivo de crioalmacenamiento posee una gran cabida. Se
pueden producir otras ventajas para la carga de muestras cuando
todas las cámaras de muestras poseen el mismo tamaño, de manera
que los segundos extremos sobresalientes de las cámaras de muestras
estén dispuestos en un mismo plano de referencia. Esto posibilita
una carga simultánea mediante la inmersión de los primeros extremos
en un depósito de muestras.
Según formas de realización adicionales
ventajosas de la invención, el bloque portador está equipado con un
dispositivo de almacenamiento de datos, un dispositivo sensor y/o al
menos una superficie de refrigeración. Esta conexión del
dispositivo de almacenamiento de datos con el bloque portador posee
la ventaja de la continua asignación de datos de muestra a las
muestras de suspensiones almacenadas. El dispositivo sensor que
comprende por ejemplo un sensor de temperatura posibilita una
supervisión de las condiciones de almacenamiento. La refrigeración
de las muestras en las cámaras de muestras se puede acelerar por
medio de la superficie de refrigeración en el bloque portador.
Es también un objeto de la invención un
procedimiento de crioalmacenamiento de muestras de suspensiones en
el que éstas son alojadas bajo la acción de fuerzas de capilaridad
en la al menos una cámara de muestras del dispositivo de
crioalmacenamiento según la invención y en éste se transforman a un
estado crioconservado. El crioalmacenamiento según la invención se
lleva a cabo en general a una temperatura por debajo de la
temperatura ambiente, en la que sea posible un almacenamiento
continuo que mantenga la vitalidad de las muestras. La temperatura
elegida y la duración del almacenamiento se eligen en función de la
aplicación. La invención se puede realizar especialmente ventajosa
en almacenamientos a baja temperatura a temperaturas por debajo de
-100ºC y especialmente a temperaturas de nitrógeno líquido.
Según una forma de realización preferida del
procedimiento según la invención, en un dispositivo de
crioalmacenamiento con una pluralidad de cámaras de muestras se
cargan éstas simultáneamente mediante inmersión en un depósito de
muestra. De forma ventajosa, el depósito de muestra puede estar
dividido en una pluralidad de compartimentos cuya disposición
corresponda a la colocación de los extremos de las cámaras de
muestras del dispositivo de crioalmacenamiento, de manera que en
las diferentes cámaras de muestras se puedan alojar específicamente
diferentes muestras de suspensiones.
Según otra forma de realización ventajosa de la
invención se liberan en estado de baja temperatura una o varias
cámaras de muestras mediante separación mecánica del bloque
portador. Con ello se pueden producir ventajas en el procesamiento
de muestras parciales.
Otras ventajas y particularidades de la
invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción
de los dibujos adjuntos. Muestran:
Las figuras 1 a 3: diferentes formas de
realización de dispositivos de crioalmacenamiento según la
invención,
La figura 4: una ilustración de
la carga de un dispositivo de crioalmacenamiento según la invención
y
La figura 5: una vista lateral
esquemática de un dispositivo de crioalmacenamiento convencional
(estado de la técnica).
La figura 1 muestra en forma de sección ampliada
una primera forma de realización de un dispositivo de
crioalmacenamiento según la invención 100 en vista lateral
esquemática. El dispositivo de crioalmacenamiento 100 comprende un
bloque portador 10 sobre cuya superficie 11está dispuesta una cámara
de muestras 20. El bloque portador 10 está compuesto por ejemplo de
plástico (por ejemplo TPX, polisulfona, PE), de un material
semiconductor o de cerámica. Las dimensiones geométricas del bloque
portador se eligen en función de los requerimientos concretos y
ascienden por ejemplo a 1 x 1 x 1 cm^{3}.
La cámara de muestras 20 se compone de un tubo
capilar con un diámetro interno que es tan reducido que una muestra
de suspensión es arrastrada al interior de la cámara de muestras 20
bajo la acción de las fuerzas de capilaridad. El diámetro interno
mide por ejemplo de 3 \mum a 4 mm, en especial de 5 \mum a 3 mm.
La longitud de la cámara de muestras 20 mide por ejemplo de 1 mm a
3 cm. El tubo capilar está compuesto por ejemplo de vidrio, de un
material semiconductor, cerámica, metal u otro material inerte.
El material de la pared de las cámaras de
muestras puede estar conformado en función de los requerimientos
deseados para el crioalmacenamiento impermeable o permeable. Se
puede usar especialmente un material permeable a los iones tal como
se conoce de los túbulos de diálisis. En el material de pared de las
cámaras de muestras o sobre su superficie pueden estar previstos
adicionalmente sensores (por ejemplo sensores de temperatura).
La cámara de muestras 20 está fijada en su
primer extremo (inferior) sobre la superficie 11 del bloque portador
10. El segundo extremo opuesto 22 del tubo capilar sobresale del
bloque portador 10. Forma una abertura de admisión a través de la
cual se lleva a cabo el alojamiento de la muestra. Según la
invención, se prevé al menos una abertura de compensación de
presión 23 distanciada del segundo extremo 22 que posibilita una
succión de una muestra de suspensión bajo la acción de fuerzas de
capilaridad tras la inmersión en el depósito de muestra. La
separación de la abertura de compensación de presión 23 del segundo
extremo se elije en función de la aplicación. Cuanto mayor es la
separación, mayor es la cabida de la cámara de muestras 20. Por
ello, la abertura de compensación de presión 23 preferiblemente se
coloca en el primer extremo 21 de la cámara de muestras 20. Dado
que la función de la abertura de compensación de presión 23 está
exclusivamente en el paso del gas desalojado al rellenar la cámara
de muestras 20, la abertura de compensación de presión 23 puede
estar formada con un diámetro mínimo en el intervalo de \mum a
mm. Según la figura 1, la abertura de compensación de presión 23 es
una brecha lateral en la pared del tubo capilar que forma la cámara
de muestras 20.
La fijación de la cámara de muestras 20 sobre la
superficie 11 se lleva a cabo por ejemplo mediante una unión
adhesiva 24. La unión adhesiva 24 representa ventajosamente un lugar
de rotura teórica en el que se puede llevar a cabo la separación de
la cámara de muestras 20 del bloque portador 10 ejerciendo una
fuerza mecánica en el segundo extremo 22. De forma alternativa, la
cámara de muestras 20 puede estar formada de una pieza con el
bloque portador 10. Mediante la abertura de compensación de presión
23, en esta configuración se forma el lugar de rotura teórica
inmediatamente en el primer extremo 21.
Los segundos extremos 22 respectivamente libres
de las cámaras de muestras 20 pueden estar equipados según la
invención con un cierre. El cierre comprende por ejemplo un tapón de
molde o una tapa que se coloca tras la carga de las cámaras de
muestras que forman un sellado. Dado que la muestra de suspensión se
mantiene en la cámara de muestras 20 bajo la acción de fuerzas de
capilaridad, la misma muestra puede formar un cierre fluido que
está expuesto sin embargo a contaminación por el entorno. En el
primer extremo también puede estar previsto un cierre después de la
carga.
En la forma de realización aplicada según la
figura 2, el bloque portador 10 está conformado con una hendidura
para cada cámara de muestras 20, que representa respectivamente un
elemento de alojamiento 12. La cámara de muestras 20 está hundida o
introducida al menos parcialmente con su primer extremo 21 en el
elemento de alojamiento 12. El elemento de alojamiento 12 es una
perforación cuyo diámetro interno es escasamente mayor que el
diámetro exterior de la cámara de muestras 20. En la forma de
realización según la figura 2, la abertura de compensación de
presión 23 se forma a través del primer extremo 21. La cámara de
muestras 20 está soportada en el elemento de alojamiento 12
separada de su suelo, de modo que se puede producir la compensación
de presión hacia fuera a través del espacio libre entre la cámara
de muestras 20 y el bloque portador 10. La fijación de la cámara de
muestras 20 en el elemento de alojamiento 12 se lleva a cabo por
ejemplo con al menos una unión adhesiva 24 que está prevista por
ejemplo en el borde superior del elemento de alojamiento 12.
La abertura de compensación de presión lateral
23 puede también estar prevista en la configuración según la figura
2, en especial cuando la cámara de muestras se asienta sobre el
suelo del elemento de alojamiento 12.
La figura 3 muestra otra forma de realización
del dispositivo de crioalmacenamiento 100 según la invención, en la
que están previstas una pluralidad de cámaras de muestras 20. Las
cámaras de muestras 20 se sitúan verticalmente en forma de aguja
sobre el bloque portador 10, que forma un sustrato, una carcasa o un
encapsulado para un almacenamiento de datos de un dispositivo de
almacenamiento de datos 30. Las cámaras de muestras 20 están
dispuestas por ejemplo en forma de matriz en filas y columnas rectas
con una medida de trama elegida en función de la aplicación. Las
cámaras de muestras 20 pueden estar dispuestas por ejemplo con
separaciones sobre el bloque portador 10 que corresponden a
aproximadamente el 10% del diámetro exterior de las cámaras de
muestras. La forma de realización según la figura 3 posee la
ventaja de que el alojamiento de la muestra se puede realizar
simplemente de forma definida mediante inmersión de las segundas
aberturas 22 en muestras de reserva (véase más adelante). Además se
simplifica la extracción de muestras parciales.
La figura 3 ilustra como características
adicionales del dispositivo de crioalmacenamiento según la invención
100 un dispositivo de almacenamiento de datos 30, un dispositivo
sensor 40 y al menos una superficie de refrigeración 50. Estas
características pueden estar previstas según la invención
individualmente o combinadas.
El dispositivo de almacenamiento de datos 30
contiene al menos un almacén de datos que está dispuesto en una
carcasa 31. La carcasa 31 está preferiblemente unida de forma fija
con el bloque portador 10 o formada de una pieza con este. El
bloque portador puede ser por ejemplo una parte de un encapsulado de
un almacén de datos. El almacén de datos (no representado) posee un
lugar en sección para alojar al menos momentáneamente una conexión
de enchufe con conducciones de unión eléctricas a través de las
cuales se puede unir el almacén de datos con un dispositivo de
control.
Como almacén de datos está previsto un chip de
almacenamiento en sí conocido en el que están almacenados datos de
forma eléctrica o magnética en función de la aplicación. Se usa por
ejemplo un almacén flash. En el dispositivo de almacenamiento de
datos 30 también puede estar previsto un almacén óptico. Los datos
almacenados comprenden por ejemplo en el caso de aplicaciones
médicas datos de identificación para determinar el donante y los
tipos de las células suspendidas, otras características del
donante, como por ejemplo el grupo sanguíneo, dado el caso datos
bibliográficos relevantes relativos a los tipos celulares
suspendidos y dado el caso datos de mediciones y/o datos de imagen
ya existentes. Los datos de imagen comprenden por ejemplo
ilustraciones de microscopía óptica o electrónica de células
suspendidas, que sirven para la caracterización específica de
donante de las células y la posterior comparación. Los datos
almacenados se consultan y/o completan durante el
crioalmacenamiento.
El dispositivo sensor mostrado esquemáticamente
40 comprende por ejemplo un sensor de temperatura con el que se
puede registrar continuamente la temperatura del dispositivo de
crioalmacenamiento 100. El sensor de temperatura está
preferiblemente unido con el dispositivo de almacenamiento de datos
30 para almacenar las temperaturas medidas en este intervalo de
tiempo y para supervisar las condiciones del crioalmacenamiento
también a largo plazo. El sensor de temperatura comprende por
ejemplo un sensor de tipo PT 100.
La al menos una superficie de refrigeración 50
comprende una o más curvaturas en forma de capas o placas del
bloque portador 10. La superficie de refrigeración 50 aumenta la
superficie del bloque portador 10 y acelera con ello su
enfriamiento en un medio de refrigeración fluido. La al menos una
superficie de refrigeración 50 está preferiblemente formada de una
pieza con el material del bloque portador 10.
El uso de un dispositivo de crioalmacenamiento
según la invención, por ejemplo según la figura 3 se lleva a cabo
de forma correspondiente a las siguientes etapas. En primer lugar se
lleva a cabo una carga de las cámaras de muestras. Se alojan
muestras de suspensiones bajo la acción de fuerzas de capilaridad a
partir de recipientes de reserva, por ejemplo los pocillos de una
placa de titulación, en las cámaras de muestras.
El dispositivo de crioalmacenamiento 100 se
hunde preferiblemente según la figura 4 sobre la cabeza en un
depósito de muestra 60, en el que se mantienen previamente
suspensiones iguales o diferentes en una pluralidad de
compartimentos 61. Las aberturas de admisión de las cámaras de
muestras 20 se proyectan respectivamente en uno de los
compartimentos. Bajo la acción de las fuerzas de capilaridad, las
muestras de suspensiones son absorbidas en las cámaras de muestras
20. Los compartimentos 61 están posicionados con diferentes
separaciones de forma correspondiente a la disposición de las
cámaras de muestras 20. El depósito de muestra 60 se forma por
ejemplo mediante una placa de micro o nanotitulación.
Los datos para la caracterización de las
muestras de suspensiones alojadas se escriben en el dispositivo de
almacenamiento de datos 30. Finalmente se lleva a cabo la etapa de
conservación. El dispositivo de crioalmacenamiento se traslada a al
menos con las cámaras de muestras 20, preferiblemente no obstante
también con el dispositivo de almacenamiento de datos 30 a un
entorno con temperatura reducida. Este entorno se da por ejemplo en
un recipiente criogénico con nitrógeno líquido o con nitrógeno
gaseoso a una temperatura de -120ºC.
La extracción de muestras del dispositivo de
crioalmacenamiento según la invención se lleva a cabo en función de
la aplicación de forma correspondiente a uno de los siguientes
principios. En primer lugar es posible descongelar todo el
dispositivo de crioalmacenamiento y extraer el contenido de la al
menos una cámara de muestras. Esto se lleva a cabo por ejemplo
mediante instalaciones de una presión reducida en uno de los
extremos de la al menos una cámara de muestras. De forma
alternativa es posible extraer muestras o muestras parciales en
estado congelado separando (por ejemplo rompiendo) cámaras de
muestras o partes de cámaras de muestras individuales con un
dispositivo de separación de forma mecánica del resto del
dispositivo de crioalmacenamiento.
Las características de la invención dadas a
conocer en la anterior descripción, en las reivindicaciones y en
los dibujos pueden ser de importancia tanto individualmente como en
combinación para la realización de la invención en sus diferentes
configuraciones.
Claims (13)
1. Dispositivo de crioalmacenamiento
(100) con un bloque portador (10) sobre el cual está dispuesta al
menos una cámara de muestras (20) de forma capilar para alojar una
muestra en suspensión de modo que un primer extremo (21) de la
cámara de muestras (20) está fijo sobre el bloque portador (10) y un
segundo extremo opuesto (22) de la cámara de muestras (20)
sobresale libremente del bloque portador (10), caracterizado
porque la al menos una cámara de muestras (20) presenta una
abertura de compensación de presión (23) separada del segundo
extremo (22).
2. Dispositivo de crioalmacenamiento
según la reivindicación 1, en el cual la abertura de compensación
de presión (23) está dispuesta en el primer extremo (21) de la al
menos una cámara de muestras (20).
3. Dispositivo de crioalmacenamiento
según una de las reivindicaciones precedentes, en el cual el primer
extremo (21) de la al menos una cámara de muestras (20) está
dispuesto sobre una superficie (11) del bloque portador (10).
4. Dispositivo de crioalmacenamiento
según una de las reivindicaciones precedentes 1 ó 2, en el cual el
primer extremo (21) de la al menos una cámara de muestras (20) está
dispuesto en un elemento de alojamiento (12) del bloque portador
(10).
5. Dispositivo de crioalmacenamiento
según una de las reivindicaciones precedentes, en el cual la al
menos una cámara de muestras (20) está unida a través de una zona de
rotura teórica (23) con el bloque portador (10).
6. Dispositivo de crioalmacenamiento
según una de las reivindicaciones precedentes, en el cual están
previstas una pluralidad de cámaras de muestras (20) que están
dispuestas verticalmente en forma de aguja sobre el bloque portador
(10).
7. Dispositivo de crioalmacenamiento
según una de las reivindicaciones precedentes, en el cual están
previstas una pluralidad de cámaras de muestra (20) cuyos segundos
extremos distanciados (22) están dispuestos en un plano de
referencia conjunto.
8. Dispositivo de crioalmacenamiento
según una de las reivindicaciones precedentes, en el cual el bloque
portador (10) está unido con un dispositivo de almacenamiento de
datos (30).
9. Dispositivo de crioalmacenamiento
según una de las reivindicaciones precedentes, en el cual el bloque
portador (10) está unido con al menos un sensor (40), en especial
con un sensor de temperatura y/o superficies de refrigeración
(50).
10. Procedimiento para almacenar al menos
una muestra en suspensión en un estado de baja temperatura con las
etapas:
- -
- alojamiento de la al menos una muestra en suspensión en al menos una cámara de muestras (20) de un dispositivo de crioalmacenamiento según una de las reivindicaciones precedentes, sumergiéndose la al menos una cámara de muestras (20) con el segundo extremo en una reserva de suspensión y arrastrándose la muestra bajo la acción de fuerzas de capilaridad en la cámara de muestras (20), y
- -
- traslado de la muestra en suspensión a un estado de baja temperatura mediante el posicionamiento de al menos una parte del dispositivo de crioalmacenamiento en un medio criogénico.
11. Procedimiento según la reivindicación
10, en el cual la reserva de suspensión está dispuesta en un
depósito de muestras (60) con una pluralidad de compartimentos
separados (61), en el cual se sumergen simultáneamente una
pluralidad de cámaras de muestras (20) para su carga.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 10 a 11, en el cual se libera al menos una cámara
de muestra (20) en estado de baja temperatura mediante separación
mecánica del bloque portador
(10).
(10).
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 10 a 12, en el cual los segundos extremos (22) de
la al menos una cámara de muestras (20) se cierran tras la
carga.
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