ES2277862T3

ES2277862T3 - Polipeptidos derivados del receptor nuclear de la vitamina d, y sus utilizaciones en particular en el ambito del cribado de analogos de la vitamina d.

Info

Publication number: ES2277862T3
Application number: ES00981458T
Authority: ES
Inventors: Dino Moras; Epouse Guiberteau Natacha Rochel; Jean-Marie Wurtz
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1999-11-22
Filing date: 2000-11-22
Publication date: 2007-08-01
Anticipated expiration: 2020-11-22
Also published as: AU1870001A; JP4124592B2; DE60032931D1; JP2003514579A; EP1232180A1; DE60032931T2; FR2801311B1; CA2390898A1; FR2801311A1; CA2390898C; WO2001038393A1; EP1232180B1; US7199219B1

Abstract

Polipéptidos derivados del receptor nuclear de la vitamina D en el hombre o las distintas especies del reino animal que presentan dicho receptor, comprendiendo dicho receptor nuclear un dominio de unión al ligando, o LBD, conteniendo el LBD un dominio de inserción flexible, caracterizándose dichos polipéptidos derivados porque comprenden las secuencias peptídicas de dichos receptores nucleares en los que se suprime el fragmento peptídico delimitado: * por una parte, por un aminoácido situado aproximadamente en una de las posiciones 155 a 175 de las secuencias peptídicas de los receptores nucleares de la vitamina D de origen humano o animal, y más particularmente por el aminoácido situado en una de las posiciones 159 a 168 de estas secuencias, * y, por otra parte, por un aminoácido situado aproximadamente en una de las posiciones 204 a 225 de las secuencias peptídicas de los receptores nucleares de la vitamina D de origen humano o animal, presentando dichos polipéptidos derivados las características siguientes: * las propiedades de unión al ligando y de transactivación del LBD del receptor de la vitamina D se conservan, * son estables, es decir, pueden ser conservados, principalmente en NaCl 100 mM a pH 7 durante por lo menos aproximadamente una semana, sin que sean afectadas, por lo tanto, las propiedades mencionadas anteriormente del LBD, en contraste con el LBD no modificado, que es inestable en las condiciones mencionadas anteriormente, * son cristalizables en los disolventes acuosos, principalmente a 4ºC mediante el procedimiento de difusión de vapor en gota suspendida, * y, son solubles en los disolventes acuosos.

Description

Polipéptidos derivados del receptor nuclear de la vitamina D, y sus utilizaciones en particular en el ámbito del cribado de análogos de la vitamina D.

La invención tiene por objeto los polipéptidos derivados del receptor nuclear de la vitamina D, las secuencias nucleotídicas que codifican estos polipéptidos, así como la utilización de estos polipéptidos en el ámbito, en particular, del cribado de análogos sintéticos de la vitamina D, o en la puesta a punto de ensayos (por ejemplo, doble o triple híbrido), para la identificación de otras proteínas (activador, represor,...) que interaccionan con el receptor de la vitamina D por la utilización de construcciones que contienen el polipéptido fusionado, por ejemplo, con Gal4, o en el ámbito del análisis de l a estructura tridimensional de los complejos formados entre estos polipéptidos y una molécula particular, mediante técnicas de cristalografía o de MRN.

El receptor de la vitamina D (VDR) es un regulador transcripcional que depende del ligando, que pertenece a la superfamilia de los receptores nucleares (NR) (Mangelsdorf et al., 1995).

Los miembros de esta familia poseen la misma estructura modular con un dominio de unión al ADN (DBD) altamente conservado y un dominio de unión al ligando (LBD) más variable (Mangelsdorf et al., 1995; Wurtz et al., 1996).

El VDR se une al elemento correspondiente de respuesta, de tipo DR3, en la región promotora de los genes diana bajo forma de heterodímero, con el receptor X del ácido retinoico (RXR), lo que lleva a la activación o a la represión de la transcripción mediante una interacción con los cofactores transcripcionales y la maquinaria transcripcional basal (Deluca & Zierold, 1998).

Los metabolitos de la vitamina D se utilizan, o son susceptibles de serlo, en tratamientos variados en el ámbito de la osteodistrofia, la osteoporosis, la psoriasis, el cáncer y las enfermedades autoinmunes (Bouillon et al., 1995).

La hipercalcemia inducida por la vitamina D (o la 1-\alpha 25-dihidroxivitamina D_{3}, o 1,25(OH)_{2}D_{3}), limita la utilización del ligando natural en estas aplicaciones clínicas, lo que lleva al desarrollo de análogos susceptibles de presentar efectos secundarios reducidos.

La secuencia del LBD de hVDR se conserva débilmente en comparación con las secuencias del receptor del ácido retinoico \gamma humano (hRAR\gamma) y del receptor X del ácido retinoico \alpha humano (hRXR\alpha) (el 25% y el 17% respectivamente de identidad con el hVDR).

La presencia de un dominio de inserción en el LBD de los VDR que conectan las hélices H1 y H3, representa una característica típica de los VDR. El tamaño de esta región de conexión está comprendido entre 72 y 81 residuos en la familia de los VDR, mientras que v lo hace entre 15 y 25 residuos en los otros receptores nucleares.

Conviene indicar en adelante, la numeración de los aminoácidos utilizada para las secuencias peptídicas de los distintos VDR, corresponde a la numeración de los aminoácidos del VDR humano. La extensión de esta numeración a otras secuencias que las del VDR humano, puede hacerse sin ambigüedad partir de la alineación proporcionada en la figura adjunta.

La tasa de conservación de secuencia de este dominio de inserción es muy débil (9% de identidad entre los aminoácidos 157-215 del hVDR). Esta región es accesible a las proteasas, y contiene un sitio de fosforilación a nivel de la serina en posición 208, para el que no ha podido definirse ningún papel funcional.

La presencia de este dominio podría explicar las dificultades encontradas hasta ahora para cristalizar los LBD de los VDR. Efectivamente, este dominio está débilmente estructurado como lo muestran los análisis de la estructura secundaria que únicamente predicen algunas fibras cortas con estadísticas bastante débiles, y contiene un porcentaje muy elevado de residuos cargados negativamente. Estos dos factores podrían aumentar el número de conformómeros de este bucle, que afecta de este modo a la estabilidad de la proteína, y favoreciendo a los contactos no específicos que interfieren con el proceso de cristalización.

La presente invención tiene por objeto procurar polipéptidos derivados de los receptores nucleares de la vitamina D, bajo forma soluble, pudiéndose cristalizar.

La invención tiene asimismo por objeto proporcionar secuencias nucleotídicas que codifiquen estos polipéptidos derivados, así como procedimientos de preparación de dichos polipéptidos derivados, mediante transformación de células apropiadas con dichas secuencias nucleotídicas.

La invención tiene asimismo por objeto proporcionar nuevos procedimientos para el cribado de compuestos análogos de la vitamina D y/o del análisis de la estructura tridimensional de los complejos formados entre estos polipéptidos y una molécula particular, llevándose a cabo dichos procedimientos mediante los polipéptidos derivados mencionados anteriormente.

La invención tiene asimismo por objeto proporcionar equipos para la puesta en marcha de los procedimientos mencionados anteriormente.

La invención se ilustrará mediante las figuras siguientes:

- Figura 1

a): alineación de las secuencias peptídicas de los VDR de distintas especies (hVDR: VDR de homo sapiens [humano]; bVDR: VDR de bos taurus [bovino]; gVDR:VDR de codorniz gallus [pollo]; rVDR: VDR de ratus norvegicus [rata]; mVDR: VDR de mus musculus [ratón]: cVDR: VDR de cotumic japonica [japonesa]; xVDR:VDR de xenopus laevi [rana africana] con las secuencias del RXR\alpha humano (hRXR\alpha) y del RAR\gamma humano (hRAR\gamma). Los dominios de inserción de los VDR que se han suprimido son los que están encuadrados.

b): conformación general del dominio de unión al ligando de hVDR; las hélices están representadas por cilindros y las láminas \beta por flechas.

- Figura 2

a): análisis de Scatchard de la unión de 1, 25(OH)_{2}D_{3} al LBD del hVDR salvaje (118-427; curva punteada indicada por triángulos) y en el LBD del mutante derivado del hVDR (118-427 \Delta 165-215; curva plena indicada por rombos); la cantidad de 1,25(OH)_{2}D_{3} marcada unida, está indicada en abscisas en nM, y la relación B/U entre los LBD salvaje o mutante unidos (B) y no unidos (U) se indica en ordenadas.

b): actividades CAT del hVDR salvaje y del hVDR mutante; estas actividades se indican en ordenadas porcentualmente; la columna 1 corresponde a la actividad CAT medida en ausencia de la vitamina D (VD), de hVDR salvaje (salvaje) y de hVDR mutante (truncado); la columna 2 corresponde a la actividad CAT medida en presencia de VD, y en ausencia de hVDR salvaje y de HVDR mutante; la columna 3 corresponde a la actividad CAT medida en presencia de hVDR salvaje y en ausencia de VD y de hVDR mutante; la columna 4 corresponde a la actividad CAT medida en presencia de VD y de hVDR mutante, y en ausencia de hVDR salvaje; la columna 5 corresponde a la actividad CAT medida en presencia del hVDR mutante y en ausencia de VD y de hVDR salvaje; la columna 6 corresponde a la actividad de CAT medida en presencia de hVDR mutante y de VD, y en ausencia de hVDR salvaje.

- Figura 3

a): representación de la región de la lámina \beta de RAR\gamma;

b): representación de la región de la lámina \beta del VDR en la misma orientación que la de RAR\gamma anterior,

c): representación de las interacciones intramoleculares de la hélice H12 en el VDR,

d): interfase entre el LBD del VDR y la hélice H3n de una molécula vuelta a unirse simétricamente

- Figura 4

a): esquema de 1,25(OH)_{2}D_{3},

b): representación esquemática del espacio de unión al ligando del hVDR,

c): vitamina D en su densidad electrónica contorneada en 1\sigma,

d): cavidad del ligando

- Figura 5: secuencia nucleotídica que codifica el hVDR salvaje (SEC ID nº:1), y secuencia peptídica del hVDR salvaje (SEC ID nº:2),

- Figura 6: secuencia nucleotídica (SEC ID nº: 3) que codifica el polipéptido mutante derivado del hVDR (1-427 \Delta 165-215), y secuencia peptídica de dicho polipéptido (SEC ID nº:4)

- Figura 7: secuencia nucleotídica (SEC ID nº:5) que codifica el polipéptido mutante derivado del hVDR (118-427 \Delta 165-215), y secuencia peptídica de dicho polipéptido (SEC ID nº:6)

- Figura 8: secuencia nucleotídica (SEC ID nº:7) que codifica el polipéptido mutante derivado del hVDR (124-427 \Delta165-215), y secuencia peptídica de dicho polipéptido (SEC ID nº:8)

La presente invención tiene por objeto los polipéptidos derivados del receptor nuclear de la vitamina D en el hombre o las distintas especies del reino animal que poseen tal receptor, comprendiendo dicho receptor nuclear un dominio de unión al ligando, o LBD, conteniendo este LBD un dominio de inserción flexible, caracterizándose dichos polipéptidos derivados porque comprenden:

-: las secuencias peptídicas de dichos receptores nucleares en las cuales:

\text{*}: el dominio de inserción flexible del LBD está modificado por sustitución o supresión de por lo menos, aproximadamente 30 aminoácidos, y preferentemente, de por lo menos, aproximadamente 40 aminoácidos, o de la totalidad de los aminoácidos que componen este dominio de inserción (a saber, de aproximadamente 50 \pm 10 aminoácidos),

\text{*}: y, en caso necesario, uno o varios o la totalidad de los aminoácidos situados en las posiciones 1 a aproximadamente la 125, principalmente en las posiciones 1 a 117 ó 123, de las secuencias peptídicas de dichos VDR, son modificados por sustitución o supresión,

: polipéptidos derivados que poseen las características siguientes:

\text{*}: las propiedades de unión al ligando y de transactivación del LBD del receptor de la vitamina D se conservan,

\text{*}: son estables, es decir, pueden conservarse, principalmente en NaCl 100 mM a pH 7 durante por lo menos aproximadamente una semana, sin que sean afectadas, por lo tanto, las propiedades mencionadas anteriormente del LBD, contrariamente al LBD no modificado, que es inestable en las condiciones mencionadas anteriormente,

\text{*}: son cristalizables en disolventes acuosos, principalmente a 4ºC mediante el procedimiento de difusión de vapor en gota suspendida,

\text{*}: y, son solubles en disolventes acuosos,

-: o las secuencias peptídicas derivadas de las secuencias peptídicas definidas anteriormente, principalmente por supresión, adición o sustitución de uno o varios aminoácidos, poseyendo dichas secuencias derivadas las características mencionadas anteriormente de dichos polipéptidos derivados.

La invención tiene más particularmente por objeto los polipéptidos derivados de los VDR de origen humano o animal tal como los definidos anteriormente, estando caracterizados dichos polipéptidos derivados porque comprenden las secuencias peptídicas de dichos receptores nucleares en las cuales está suprimido el fragmento peptídico delimitado:

-: por una parte, por un aminoácido situado aproximadamente en una de las posiciones 155 a 175 de las secuencias peptídicas de los receptores nucleares de la vitamina D de origen humano o animal, principalmente de las secuencias peptídicas de los VDR representados en la figura 1a, y más particularmente, por el aminoácido situado en una de las posiciones 159 a 168 de estas secuencias,

-: y, por otra parte, por un aminoácido situado aproximadamente en una de las posiciones 204 a 225 de las secuencias peptídicas de los receptores nucleares de la vitamina D de origen humano o animal, principalmente de las secuencias peptídicas de los VDR representados en la figura 1a.

La invención se refiere más particularmente a los polipéptidos derivados tales como los definidos anteriormente, seleccionándose dichos polipéptidos derivados de entre los que comprenden:

-: la secuencia en aminoácidos delimitada por los aminoácidos situados en las posiciones 118 y 427, o en las posiciones 124 y 427 de las secuencias peptídicas de los VDR de origen humano o animal, principalmente de las secuencias peptídicas de los VDR representados en la figura 1a, y en la que los residuos situados en las posiciones 165 a 215 de dichas secuencias peptídicas de los VDR, son suprimidas,

-: o una secuencia peptídica derivada de la secuencia en aminoácidos mencionada anteriormente, principalmente por supresión, adición o sustitución de uno o varios aminoácidos, poseyendo dicha secuencia derivada las características mencionadas anteriormente de dicho polipéptido derivado.

La invención se refiere más particularmente a los polipéptidos derivados tales como los definidos anteriormente seleccionados de entre los siguientes:

-: el polipéptido SEC ID nº 4 derivado del VDR de origen humano, en el que el fragmento peptídico delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 165 y 215, es suprimido,

-: el polipéptido SEC ID nº:6 [denominado también hVDR (118-427 \Delta 165-215)] derivado del VDR de origen humano, en el que el fragmento peptídico delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 1 y 117, y el fragmento peptídico delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 165 y 215, son suprimidos,

-: el polipéptido SEC ID nº:8 [denominado también hVDR (124-427 \Delta 165-215)] derivado del VDR de origen humano, en el cual el fragmento peptídico delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 1 y 123, y el fragmento peptídico delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 165 y 215, son suprimidos.

La invención se refiere asimismo a las secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido derivado, tal como el definido anteriormente.

A este respecto, la invención tiene más particularmente como objeto las secuencias nucleotídicas seleccionadas de entre:

-: las secuencias SEC ID nº:3, SEC ID nº:5 y SEC ID nº:7, representadas respectivamente en las figuras 6, 7 y 8,

-: o una secuencia nucleotídica derivada por degeneración del código genético de las secuencias nucleotídicas anteriormente mencionadas, y que codifica un polipéptido derivado del hVDR tal como se ha definido anteriormente,

-: o una secuencia nucleotídica derivada de las secuencias nucleotídicas mencionadas anteriormente, principalmente por sustitución, supresión o adición de uno o varios nucleótidos, y que codifica una secuencia peptídica derivada de los polipéptidos derivados del hVDR definidos anteriormente, y que posee las características mencionadas antes de dichos polipéptidos derivados.

La invención tiene asimismo por objeto las secuencias nucleotídicas recombinantes que comprenden una secuencia nucleotídica tal como la definida anteriormente, en asociación con los elementos necesarios para la transcripción de esta última secuencia, principalmente con un promotor y un terminador de la transcripción.

La invención se refiere asimismo a los vectores, principalmente plásmidos o virus tales que los baculovirus, que contienen una secuencia nucleotídica tal como la definida anteriormente.

La invención tiene asimismo por objeto las células huésped transformadas por un vector mencionado anteriormente, estando seleccionadas dichas células principalmente de entre las bacterias como E. Coli, o las células de insectos susceptibles de estar infectadas por un baculovirus.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de un polipéptido derivado tal como el definido anteriormente, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

-: transformación de las células mediante un vector recombinante tal como el definido anteriormente,

-: cultivo de las células así transformadas, y recuperación de dicho polipéptido producido por dichas células, en caso necesario, después de purificación.

La invención se refiere asimismo a los polipéptidos derivados del receptor nuclear de la vitamina D tales como los definidos anteriormente, unidos a la vitamina D o a un análogo de la vitamina D, principalmente a cualquier ligando capaz de unirse a dichos polipéptidos con una alta afinidad, es decir, una afinidad superior a 10^{-6} M aproximadamente.

La invención se refiere asimismo a los polipéptidos derivados del receptor nuclear de la vitamina D, tales como los definidos anteriormente, en caso necesario, unidos a la vitamina D o a un análogo de la vitamina D, y que se presentan bajo forma de cristales.

Ventajosamente, los cristales mencionados de la presente invención se obtienen por difusión de vapor en presencia principalmente de sulfato amónico precipitante, o de otro agente de precipitación.

Ventajosamente todavía, los cristales de la invención son utilizables en el ámbito de las técnicas de cristalografía mediante rayos X.

Los cristales mencionados pueden alcanzar una resolución determinada por cristalografía mediante rayos X inferior a 25 \ring{A}, que procura una información a nivel atómico de la interacción entre una molécula diana y el receptor.

La invención tiene más particularmente por objeto los cristales de hVDR (118-427 \Delta 165-215) que forma complejo con 1,25(OH)_{2}D_{3}), caracterizados porque pertenecen al grupo de espacio ortorómbico (P2_{1}, 2_{1} 2_{1}) con a = 45.193 \ring{A}, b = 52.443 \ring{A}., c = 133.286 \ring{A}., & = \beta = \gamma = 90º.

La invención tiene asimismo por objeto la utilización de un polipéptido como el definido anteriormente, en caso necesario bajo forma de los cristales mencionados anteriormente, para la puesta a punto de un procedimiento para el cribado de análogos sintéticos de la vitamina D.

La invención tiene más particularmente por objeto la utilización mencionada anteriormente de un polipéptido tal como el definido antes, en caso necesario, bajo la forma de cristales mencionados anteriormente, para la puesta en práctica de un procedimiento para el cribado de análogos agonistas o antagonistas de la vitamina D, susceptibles de ser utilizados en composiciones farmacéuticas, principalmente en el ámbito del tratamiento de patologías cancerosas, de ósteodistrofia, de osteoporosis, de psoriasis, de las enfermedades autoinmunes.

La invención se refiere asimismo a procedimientos para el cribado de análogos de la vitamina D, o de cofactores, que comprende las etapas siguientes:

-: presentación de un polipéptido derivado como el definido anteriormente, en caso necesario, bajo forma de los cristales mencionados, unido ventajosamente a un soporte sólido, con el análogo o cofactor que se ensaye, estando uno de dichos derivados polipéptidos, o el análogo de la vitamina D, marcado ventajosamente mediante, principalmente, un marcador fluorescente, radioactivo o enzimático.

-: detección de la eventual unión entre dicho polipéptido derivado y el análogo ensayado midiendo el marcador utilizado, después principalmente de enjuagar el soporte utilizado en la etapa precedente.

La invención tiene asimismo como objeto la utilización de un polipéptido derivado tal como el definido anteriormente, bajo forma de los cristales mencionados, para poner en práctica un procedimiento de análisis de la estructura tridimensional de los complejos formados entre dicho polipéptido y una molécula determinada.

A este respecto, la invención se refiere más particularmente a un procedimiento de análisis de la estructura tridimensional de los complejos formados entre un polipéptido derivado tal como el definido anteriormente, en caso necesario bajo la forma de los cristales mencionados, y una molécula determinada, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

-: poner en contacto un polipéptido derivado tal como el definido anteriormente, en caso necesario, bajo forma de los cristales mencionados, con la molécula determinada,

-: cristalización del complejo formado entre dicho polipéptido derivado y la molécula determinada, principalmente por difusión de vapor, y análisis tridimensional de dicho complejo, principalmente por reemplazo molecular,

-: o análisis tridimensional de dicho complejo en solución, principalmente por RMN.

La invención se refiere asimismo a la aplicación del procedimiento de análisis mencionado anteriormente a la concepción de compuestos susceptibles de ser agonistas o antagonistas de la vitamina D, tales como los definidos anteriormente.

La invención tiene particularmente por objeto los análogos agonistas o antagonistas de la vitamina D, tales como los obtenidos por la puesta en marcha del procedimiento para el cribado anteriormente mencionado, así como las composiciones farmacéuticas que comprenden estos análogos en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención tiene asimismo por objeto los kits (o estuches) para poner en marcha de un procedimiento para el cribado o el procedimiento de análisis anteriormente mencionados, comprendiendo dichos kits un polipéptido derivado tal como el definido anteriormente, en caso necesario, bajo forma de los cristales mencionados, en asociación con uno o varios reactivos, para la puesta en marcha del procedimiento o del método anteriormente mencionado.

La invención se ilustrará más mediante la descripción detallada siguiente de la preparación del polipéptido derivado hVDR (118-427 \Delta 165-215),y del análisis de la estructura cristalina y de las propiedades del polipéptido derivado así obtenido.

El polipéptido derivado representado en la figura 7 (también denominado mutante LBD VDR (residuos 118-427 \Delta 165-215)), se preparó sin su dominio de inserción flexible, suprimiendo los residuos 165 a 215 de hVDR (Figura 1a) y dejando una treintena de residuos con el fin de conectar las hélices H1 y H3.

El mutante LBD VDR (residuos 118-427 \Delta 165-215) se sobreexpresó en E. Coli y se purificó mediante cromatografía de afinidad y de intercambio de iones, y mediante filtración en gel, según el procedimiento adjunto descrito.

A) Expresión y purificación del mutante LBD VDR 118-427 \Delta 165-215

El receptor VDR mutado (residuos 118-427 \Delta 165-215) se sobreprodujo bajo forma peptídica identificándolo con hexahistidina. El ADNc amplificado mediante PCR se subclonó en los sitios NdeI-BamHI del vector pET15b (Novagen). El plásmido se amplificó a continuación en las bacterias E. Coli XL Blue con el fin de controlar la secuencia, y se ha introducido en las bacterias E. Coli BL21DE3 para la sobreexpresión. Un precultivo de 200 ml de LB con 200 \mug de ampicilina/ml, se ha utilizado para inocular 6 x 1 l de LB que contenían 200 \mug de ampicilina/ml. Las células se cultivaron a 37ºC hasta lograr una absorbancia de 0,6, induciéndose a continuación la expresión de la proteína añadiendo 1 mM de IPTG en el medio de cultivo durante 6 horas a 20ºC. Las células se sedimentaron mediante ultracentrifugación y se conservaron a -80ºC.

El sedimento celular que representa 1l de cultivo se volvió a depositar en 25 ml de tampón que contenía 20 mM Tris pH 8,0, 250 mM NaCl, 5 mM Imidazol, glicerol al 5%, 0,5 \mug/ml del coctel del inhibidor de proteasas, 1 mM de \beta-mercaptoetanol y 1 mM de PMSF. La lisis de las células se efectuó mediante ultrasonidos y se obtiene el extracto en bruto por ultracentrifugación a 45 K durante 1 h 30. La purificación se llevó a cabo en tres etapas. El extracto en bruto se carga en un primer tiempo en una columna de afinidad metálica (Talon, Clonetech). Después del lavado, la proteína se eluyó con un tampón que contenía 20 mM Tris pH 8,0, 250 mM NaCl, 150 mM de Imidazol y glicerol al 5%. La proteína se concentró a continuación en Centriprep 30 y se diluyó con 4 volúmenes de tampón 20 mM Tris oH 7,5, NaCl 50 mM y DTT 5 mM. La muestra se cargó a continuación en una columna de intercambio aniónico Q15 (Sartorius) y se eluyó mediante un gradiente de NaCl (0 \rightarrow 1M). Con el fin de eliminar la marca identificadora de hexahistidina, se digirió la proteína por la trombina (1 unidad por mg de proteína) a 4ºC durante 12 horas en presencia de CaCl2 5 mM. Finalmente, la proteína se cargó en gel de filtración Superdex 75 16/60 (Pharmacia), se equilibró con 10 mM tris pH 7,0, 100 mM NaCl, 10 mM DTT y se eluyó con este mismo tampón. El ligando se añadió entonces en exceso y se incubó con la proteína a 4ºC durante 12 horas. El complejo se concentró entonces en Centricon 30 para la cristalización.

La cantidad de proteína purificada es de 2 mg/l de cultivo. la calidad y la homogeneidad de la proteína se analizaron mediante electroforesis en condiciones originales y de desnaturalización. La proteína es pura en más del 95% y se observa una banda única en el gel original. Según la elución de la filtración en gel y las mediciones de difusión de la luz, la proteína es monomérica. La concentración proteica se midió por Bradford y espectrofotometría. La muestra es monodispersa según las mediciones de difusión de la luz.

B) Análisis y propiedades del VDR 118-427 \Delta 165-215

La capacidad de la proteína mutante para unirse a 1,25(OH)_{2}D_{3} se determinó mediante el procedimiento de Scatchard utilizando extractos en bruto de la proteína recombinante (Figura 2a: los análisis de Scatchard se llevaron a cabo en Dextrano/carbon; los extractos en bruto de E. Coli BL21 (DE3) que expresan hVDR salvaje o mutante/pET 15b, se diluyeron 1.000 veces y se incubaron con cantidades crecientes (^{3}H'-26,27, Amersham) 1,25 (OH)_{2}D_{3} en Tris 20 mM, NaCl 250 mM, ditiotreitol (DTT) 5 mM, glicerol al 10% durante 16 horas a 4ºC; después de incubación, se añadieron 25 \mul de Dextrano/carbón (1,5%) a 25 \mul de mezcla de proteínas; después de 5 minutos, se centrifugaron los tubos a 13000 rpm durante 5 minutos; se determinaron las concentraciones del ligando unido (B) mediante contaje de centelleo líquido sobre el sobrenadante; se determinaron las concentraciones en el ligando total mediante contaje de centelleo líquido sobre 15 \mul de mezcla de proteínas añadiendo Dextrano/carbono; U representa el ligando no unido; cada punto representa la media de tres valores; los resultados se analizaron mediante el procedimiento no lineal de cuadrado mínimo según el procedimiento descrito por Claire et al, 1978; la curva continua y la de puntos corresponden respectivamente a los resultados experimentales obtenidos con el polipéptido mutante derivado y la proteína salvaje, con los parámetros N = 0,073\pm0,006 nM, Kd = 0,37\pm0,05 nM, \beta = 0,058\pm0,002 para el polipéptido mutante derivado, y N = 0,10\pm0,01 nM, Kd = 0,55 \pm 0,08 nM, \beta = 0,051\pm0,003 para la proteína salvaje, con N = número de sitios, Kd = constante de disociación, y \beta = unión no específica; los experimentos se repitieron dos veces).

No se observó ningún cambio significativo entre las constantes de disociación de los VDR del tipo salvaje y mutante, siendo los valores similares a los descritos anteriormente para el receptor entero (Bouillon et al, 1995). Con el fin de comparar las propiedades de transactivación de las dos proteínas, los LBD salvaje y mutantes se fusionaron al dominio de unión al ADN del activador GAL4 de la levadura. Las proteínas quiméricas se expresaron mediante transfección en las células Cos, y la transactivación se midió con un informador apropiado que respondía a GAL4. Las dos proteínas presentan propiedades de transactivación comparables en este sistema (Figura 2b: los LBD de VDR salvaje o mutante se fusionaron al dominio de unión al ADN del activador Gal4 (1-147) de la levadura por clonación del ADNc e en los sitios XhoI-BamHI del vector pXJ440 (Xiao et al., 1991); las células Cos se transfectaron según el procedimiento descrito por Xiao et al, 1991, con los vectores (250 ng) que contienen los LBD salvajes o mutantes de hVDR con 2 \mug del gen informador 17 m5-TATA-CAT y 2 \mug de un recombinante de control interno pCH110lacZ (Pharmacia) que expresa la \beta-galactosidasa completada a 20 \mug con un ADN soporte; las células se trataron con EtOH o 1,25(OH)_{2}D_{3} 10^{-7} M; las actividades CAT, normalizadas en unidades iguales de \beta-galactosidasa, se expresan con relación a la actividad CAT (100%) inducida por el VDR salvaje en presencia de 1,25(OH)_{2}D_{3}).

En consecuencia, la deleción del dominio de inserción no tiene un efecto importante en la unión del ligando, la transactivación o la dimerización con el LBD de RXR\alpha.

La supresión del dominio de inserción flexible en el LBD de VDR ha conducido a una proteína más soluble, que puede cristalizarse bajo forma de complejo con 1,25(OH)_{2}D_{3}. Se han podido obtener cristales mediante técnicas de difusión de vapor, utilizando sulfato amónico como precipitante. La estructura del cristal se ha resuelto por una combinación de reemplazamiento molecular, utilizando un modelo parcial de RAR\gamma (Renaud et al, 1995; Klaholz et al, 1998), y de reemplazamiento isomorfo con un derivado del mercurio Los resultados obtenidos se resumen en la tabla I siguiente.

TABLA 1

1

(Tabla 1: los experimentos de cristalización se realizaron a 4ºC mediante el procedimiento de difusión de vapor en gota suspendida; la proteína se concentró de 4 a 10 mg/ml; los cristales de hVDR (118-427 \Delta 165-215) formando complejo con 1,25(OH)_{2}D_{3} se obtuvieron en 4 días a partir de una solución conteniendo sulfato amónico 0,7 M, tampón Mes 50 mM pH 6,0, Tris 5 mM, DTT 5 mM equilibrado contra un depósito que contenía sulfato amónico 1,4 M, Mes 0,1 M pH = 6,0; los cristales pertenecen al grupo de espacio ortorómbico (P2_{1} 2_{1} 2_{1}) con a = 45.193 \ring{A}, b = 52.443 \ring{A}, c = 133.286 \ring{A}, \alpha = \beta = \gamma = 90º; la unidad asimétrica contiene un monómero; el contenido en disolvente de los cristales es del 48%; el factor B estimado mediante el procedimiento de Wilson es 29. El derivado con átomos pesados se obtuvo templando los cristales en Thiormesal (etil mercuriltiosalicilato) durante 4 días; los resultados de difusión a los rayos X de los cristales naturales se midieron a 4ºC, alineados con el haz BW7B en el sincrotón de Hambourg; los resultados se trataron utilizando los programas DENZO y SCALEPACK (Otwinoswski et al,. 1997); las fases iniciales se obtuvieron mediante reemplazamiento molecular con AMORE (Navaza et al., 1994), utilizando el RAR\gamma como modelo de inicio; este modelo contiene las hélices conservadas H1, H3-H5, H7-H10 (Figura 1a); la solución tiene una correlación del 31% y un factor R de 53,6% después de reemplazamiento del cuerpo rígido AMORE; completadas por las fases obtenidas mediante el derivado mercurial cuyos datos de difracción se registraron en un detector de imagen bidimensional Mar Research en el laboratorio a 4ºC; los sitios derivados se encontraron y afinados con el programa SOLVE (Tervillger et al., 1987).

El mapa obtenido por las fases combinadas se ha calculado con una resolución de 3 \ring{A} utilizando una corrección del disolvente. El refinamiento se ha realizado con el programa CNS (Brünger et al., 1998). Ciclos de construcción del modelo con el programa O (Jones et al, 1991) y una minimización del cuadrado mínimo, seguido por un refinamiento anisotrópico individual de factor B, han conducido al modelo final. Todos los resultados entre 20 y 1,8 \ring{A} se incluyeron en el refinamiento sin umbrales de corte. Las moléculas de disolvente de la primera capa de hidratación se localizaron con el programa CNS en un mapa F_{0}-F_{c} en 3 sigma. Los valores máximos del factor B (40-50) corresponden a los residuos en el bucle antes de H1, la unión y los bucles H9-H10 y H11-H12. La calidad del modelo final se analizó por el programa PROCHECK (Laskowski et al, 1993). La distribución del ángulo Ramachadran indica un 92,4% de conformaciones más favorables, y un 7,6% de conformaciones autorizadas.

El modelo final contiene 250 residuos, 166 moléculas de agua y una molécula del ligando No se observó ninguna densidad clara para los dos primeros residuos N-terminales y los cuatro últimos residuos C-terminales. Tres residuos adicionales, 375 a 377 en el bucle H9-H10, no se incluyeron en el afinado debido a la calidad moderada del mapa de densidad electrónica en esta región.

La topología global del LBD de VDR (figura 1b) es similar a la de los otros LBD de receptores nucleares, con 13 hélices dispuestas en sándwich en 3 capas y una lámina \beta con tres hebras. La nomenclatura se funda en la estructura de hRXR\alpha (Bourget et al, 1995). El dominio que une las hélices H1 y H3 contiene dos pequeñas hélices H2 y H3n. La nueva hélice H3n forma el fondo de la estructura y reemplaza al bucle \Omega en la estructura de RAR\gamma. La flexibilidad intrínseca de los tres residuos de glicina (162-164) situados en la unión, favorece una fácil adaptación.

Este fragmento de tres residuos está más bien alejado del ligando, y es, en consecuencia, poco probable que juegue un papel en la unión al ligando. La estructura VDR está más cercana de la del RAR\gamma que forma complejo con los agonistas. Las proteínas se superponen con un rmsd de 1,2 \ring{A} sobre 179 residuos (umbral de corte de 2,5 \ring{A} sobre C\alpha), siendo las regiones excluidas el péptido que conecta H1 a H3, la hebra \beta2, la hélice H6 y algunos bucles de conexión.

La diferencia más notable se sitúa a nivel de la conexión entre las hélices H1 y H3, que en el RAR\gamma rodea la lámina \beta, y en el VDR sigue un camino entre H3 y el extremo de la lámina \beta, idéntico al de ER\alpha (Brzozowski et al, 1997). En consecuencia, el extremo de la lámina \beta se desplaza hacia el exterior y agranda la cavidad de unión a la vitamina D (Figura 3a y 3b). Todas las hebras \beta poseen residuos en contacto con el ligando. En la hebra \beta1, Trp 286, específico de los receptores VDR, juega un papel importante en la posición del ligando. Forma parte de una red de enlaces hidrógeno que implican a la Ser 275, la cual también se une, ella misma, mediante enlaces de hidrógeno a Gln 317 y al carbonilo de Met 272. El extremo de la lámina \beta se estabiliza asimismo por uniones de hidrógeno entre los grupos carbonilos de Glu 292 y Lys 294, y Arg 158 del bucle de conexión entre las hélices H2 y H3n.

La hélice H12, cuyo posicionamiento es importante para la unión de coactivación y la transactivación, está en posición agonista (Figura 3c). La hélice se estabiliza en esta orientación mediante contactos hidrófobos (Ile 268 de H5 y Phe 422 de H12) e interacciones polares. En estas últimas interacciones están involucrados el puente conservado Lys 264-Glu 420, y una unión hidrógeno entre Ser 235 de H3 y Thr 415. Además, los grupos carbonilos de Met 412 y de Leu 414 del bucle H11-H12, están unidos mediante unión H a Arg 154 (extremo de H12), el cual hace él mismo uniones H con Asp 232 (H3). Todos estos residuos se conservan en los receptores VDR. La mutagénesis dirigida de los residuos Lys 264 y Glu 420 que establecen el puente salino, ha permitido revelar que estas mutaciones suprimen la transactivación dependiente del ligando, pero no tiene efecto sobre la unión al ligando, la heterodimerización con RXR o la unión al ADN (Nakajima et al, 1998).

Se observa un intenso contacto cristalino entre la hélice H3n y las hélices H3, H4 y H12 de una molécula que se ha vuelto a unir simétricamente (Figura 3d). H3 imita los contactos del péptido SRC1 observados en el complejo ternario de PPAR (Nolte et al., 1998), aunque no contiene el motivo LXXLL encontrado en la mayor parte de los coactivadores. Esta hélice está anclada mediante contactos polares a través de las uniones H entre la región N-terminal de H3n (Ser 216, Val 217 y Thr 218) y Glu 420 (H12). A nivel de la región C-terminal de la hélice H3n, Ser 222 se une mediante enlace de hidrógeno a Lys 246 (extremo de la hélice H3). La importancia funcional de esta lisina se ha demostrado mediante mutación en glicina que afecta intensamente a la transactivación (Whitfield et al, 1995). Entre los residuos Lys 246 y Glu 420, se forma una cavidad hidrófoba por las hélices H3, H4 y H12. Los residuos de la hélice H3n (Val 217, Thr 218, Leu 219, Leu 221 y Ser 222) están en contacto mediante unión por fuerzas de Van der Waals con Ile 242 (H3), Ile 260 (H4), Leu 417 y Val 421 (H12). Esta observación muestra que otras sustancias que LXXLL deben tomarse en consideración en el ámbito del proceso de reconocimiento de los receptores nucleares.

La estructura del VDR unida a su ligando natural ha permitido resolver diversas ambigüedades y cuestiones relacionadas con la conformación de la vitamina D activa. La comparación entre la estructura cristalográfica de la molécula libre de vitamina D (Suwinska et al, 1996), muestra que los dos ligandos tienen una conformación idéntica para los núcleos A, C y D (Figura 4a). La diferencia más apreciable es la geometría no plana del trieno conjugado en el complejo, resultante de la forma curva del ligando necesario para su fijación en el receptor. El espacio de unión al ligando está bordeada de residuos hidrófobos predominantes (Figuras 4b y 4c). El ligando extendido engloba a la hélice H3 con su núcleo A (Figuras 3b y 3c), orientado hacia los extremos C-terminales de la hélice H5 y el grupo hidroxilo-25 cercano a las hélices H7 y H11. El grupo metilo 27 forma una débil interacción con la hélice H12 (Val 418). Las distancias que separan las partes hidroxilo-25 de los grupos hidroxilos del núcleo A, 1-OH y 3-OH, son de 13 \ring{A} y de 15,4 \ring{A}, respectivamente.

En el complejo, el núcleo A adopta una conformación B en forma de silla con los grupos 1-OH y 3-OH respectivamente en orientaciones ecuatoriales y axiales. La parte hidroxilo en posición 1 forma dos uniones H con Ser 237 (H3) y Arg 274, mientras que el grupo 3-OH forma dos uniones H con Ser 278 (H5) y Tyr 143 que se conserva únicamente en los mamíferos. Arg 274 está comprendido en una red apretada de uniones H con las moléculas de agua y el carbonilo de Thr 142 en el extremo de H1 (Figura 4c).

El trieno conjugado (Figura 4a), que conecta los núcleos A y C está situado en un canal hidrófobo apresado en sándwich entre Ser 275 (bucle H5-\beta) y Trp 286 (\beta1) a uno de los lados, y Leu 233 (H3) al otro lado. La unión única C_{6}-C_{7} presenta una conformación trans que se desvía un 30% respecto a la geometría plana. Esta desviación explica la falta de actividad biológica de los análogos que tienen una conformación trans o cis de la unión C6-C7 (Norman et al,. 1997). De forma exclusiva, residuos hidrófobos rodean esta cadena. El grupo 25-hidroxilo está unido mediante H a His 305 (bucle H6-H7) y His 397 (H11) (figura 4). Una red de unión H alrededor de los residuos histidina indica que His 305 y His 397 son respectivamente los aceptores y donantes de la unión H. Todos los residuos implicados en la red de unión H, con excepción de Ser 306, se conservan entre los VDR. Los mutantes naturales que se encuentran en el raquitismo resistente a la vitamina D, Arg274Leu e His305Gln (Kristjansson et al, 1933), confirman el papel crítico para la unión al ligando de Arg274 y His 305, implicados respectivamente en el anclaje de 1-OH y 25-OH .

De acuerdo con el hecho de que el ligando 1,25(OH)_{2}D_{3} es más grande que el estradiol, la progesterona y el ácido retinoico todos trans, el espacio de unión al ligando del VDR es más grande (697 \ring{A}^{3}) (Figura 4d) que la de ER (369 \ring{A}^{3}), del PR (427 \ring{A}^{3}), del RAR\gamma(421 \ring{A}^{3}). Sin embargo, el aumento del tamaño no es proporcional, ya que 1,25 (OH)_{2}D_{3} ocupa solamente un 56% de la unión al ligando del VDR, en comparación con los 63, 67 y 66% calculados respectivamente con el estradiol, la progesterona y el ácido retinoico, todos trans.

El volumen accesible de la cavidad de los VDR muestra una expansión del espacio cercano a la posición 2 del núcleo A, que está ocupado por dos moléculas de agua y representa 40 \ring{A}^{3}. Este espacio adicional podría recibir el grupo metilo masivo del ligando sintético 2\alpha-metil 1,25(OH)_{2}D_{3} que, en efecto, presenta una afinidad de unión 4 veces más importante que el ligando natural (Fujishima et al., 1998). Además, el espacio adicional alrededor de la cadena alifática podría permitir el hospedaje de distintas longitudes de cadena.

Varios análogos de la vitamina D se han mostrado como comportándose de modo distinto del ligando natural, tratándose de la transactivación y del reclutamiento de coactivador (Takeyama et al., 1999; Rachez et al., 1998). Con el fin de comprender esta especificidad, se han realizado estudios preliminares del modelado del ligando. Los ligandos sintéticos que poseen una cadena alifática más bien rígida en posición 17, tal como MC 903 (22eno-26,27-ciclopropil-1\alpha,24S(OH)_{2}D_{3}) o EB 1089 (22,24 dieno-24,26,27 tri-homo 1\alpha, 25(OH)_{2}D_{3}) una o dos uniones dobles respectivamente), pueden albergarse en el espacio de unión con solamente algunos ajustes menores de la geometría de 1,25 (OH)_{2}D_{3}. Los núcleos C y D deben desplazarse solamente, con el fin de alojar a los grupos metilos en posición 26 y 27 de EB1089 o el núcleo ciclopropil de MC 903. Para los análogos 20-epi-1,25(OH)_{2}D_{3} y KH 1060, sólo los conformómeros de energía débil, con una conformación antiizquierda alrededor de C20, pueden alojarse. Con dicha geometría, el grupo metilo en C21 asoma en la misma cavidad como el ligando natural, mientras que el resto de la cadena, debido a la combinación de la conformación anti de C20-C22 y de la epimerización de C20, bordea el lado opuesto de la cavidad de unión. Esta variación de ruta conduce a diferentes contactos para los dos epímeros. La distancia de la parte 1-hidroxilo hasta la parte 25-hidroxilo es más corta que en el análogo 20-epi, de manera que las cadenas largas, como en el caso de KH1060, pueden alojarse. Los ligandos con una cadena alifática más larga adoptan una conformación más compacta y forman contactos de fuerzas de van der Waals adicionales con la cavidad de unión que puede a continuación estabilizar la hélice en posición H12 y/o afectar a regiones menos rígidas del espacio de unión como el bucle H6-H7.

Estos diferentes contactos con una cavidad de unión más bien rígida pueden explicar las diferencias en las semividas y las actividades transcripcionales.

La estructura de la vitamina D ha sido objeto de numerosos estudios estos últimos diez años. La presente invención suministra por primera vez una imagen de 1,25(OH)_{2}D_{3} en su conformación activa. Hasta ahora, la cadena lateral natural de 1,25(OH)_{2}D_{3} ha constituido la diana principal de las modificaciones químicas para descubrir nuevos ligandos agonistas más específicos.

El esqueleto compuesto de los núcleos A a D no se ha podido modificar sin pérdida de la capacidad de unión al ligando. Los análogos a los que les faltan los núcleos enteros C y/o D, pero que tienen una separación normal de los grupos hidroxilos, pueden hacer puntos de contacto normales en el interior del espacio de unión, explicando su potencial biológico normal (Verstuyf et al, 1988).

El complejo según la invención revela ampliamente la disposición tridimensional del espacio de unión alrededor de 1,25(OH)_{2}D_{3} y suministra nuevas perspectivas para la concepción de esqueletos originales.

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<110> CNRS

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<120> POLIPÉPTIDOS DERIVADOS DEL RECEPTOR NUCLEAR DE LA VITAMINA D, Y SUS UTILIZACIONES EN PARTICULAR EN EL ÁMBITO DEL CRIBADO DE ANÁLOGOS DE LA VITAMINA D

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<130> WOB 99 CNR VID3

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<140>

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<141>

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<150> FR9914633

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<151> 1999-11-22

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<160> 8

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1284

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1281)

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<400> 1

2

3

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<210> 2

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<211> 427

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

4

5

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<210> 3

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<211> 1131

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido derivado del receptor nuclear de la vitamina D humano

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1128)

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<400> 3

6

7

8

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<210> 4

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<211> 376

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 4

9

10

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<210> 5

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<211> 780

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(777)

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<400> 5

11

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<210> 6

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<211> 259

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 6

13

14

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<210> 7

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<211> 762

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(759)

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<400> 7

15

16

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<210> 8

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<211> 253

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 8

17

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Claims

1. Polipéptidos derivados del receptor nuclear de la vitamina D en el hombre o las distintas especies del reino animal que presentan dicho receptor, comprendiendo dicho receptor nuclear un dominio de unión al ligando, o LBD, conteniendo el LBD un dominio de inserción flexible, caracterizándose dichos polipéptidos derivados porque comprenden las secuencias peptídicas de dichos receptores nucleares en los que se suprime el fragmento peptídico delimitado:

\bullet: por una parte, por un aminoácido situado aproximadamente en una de las posiciones 155 a 175 de las secuencias peptídicas de los receptores nucleares de la vitamina D de origen humano o animal, y más particularmente por el aminoácido situado en una de las posiciones 159 a 168 de estas secuencias,

\bullet: y, por otra parte, por un aminoácido situado aproximadamente en una de las posiciones 204 a 225 de las secuencias peptídicas de los receptores nucleares de la vitamina D de origen humano o animal,

: presentando dichos polipéptidos derivados las características siguientes:

\text{*}: son estables, es decir, pueden ser conservados, principalmente en NaCl 100 mM a pH 7 durante por lo menos aproximadamente una semana, sin que sean afectadas, por lo tanto, las propiedades mencionadas anteriormente del LBD, en contraste con el LBD no modificado, que es inestable en las condiciones mencionadas anteriormente,

\text{*}: son cristalizables en los disolventes acuosos, principalmente a 4ºC mediante el procedimiento de difusión de vapor en gota suspendida,

\text{*}: y, son solubles en los disolventes acuosos.

2. Polipéptidos derivados según la reivindicación 1, siendo seleccionados dichos polipéptidos derivados de entre los que comprenden la secuencia en aminoácidos delimitada por los aminoácidos situados en las posiciones 118 y 427, o en las posiciones 124 y 427 de las secuencias peptídicas de los VDR de origen humano o animal, y en la que los residuos situados en las posiciones 165 a 215 de dichas secuencias peptídicas de los VDR son suprimidos.

3. Polipéptidos derivados según una de las reivindicaciones 1 ó 2, seleccionados de entre los polipéptidos SEC ID nº:4, SEC ID nº:6, y SEC ID nº 8.

4. Cristales que comprenden un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, en caso necesario en asociación con la vitamina D, o con un análogo agonista o antagonista de la vitamina D.

5. Secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 5, seleccionada de entre:

-: las secuencias SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 5 y SEC ID nº: 7,

-: o una secuencia nucleotídica derivada por degeneración del código genético de las secuencias nucleotídicas mencionadas anteriormente, y que codifican un polipéptido derivado del hVDR según la reivindicación 3.

7. Secuencia nucleotídica recombinante que comprende una secuencia nucleotídica según la reivindicación 5 ó 6, en asociación con los elementos necesarios para la transcripción de esta secuencia, principalmente con un promotor y un terminador de transcripción.

8. Vector, principalmente plásmido, que contiene una secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 5 a 7.

9. Células huésped transformadas por un vector según la reivindicación 8, seleccionándose dichas células huésped principalmente de entre las bacterias tales como E. Coli, o las células de insectos susceptibles de ser infectadas por un baculovirus.

10. Procedimiento para la preparación de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

-: transformación de células mediante un vector recombinante según la reivindicación 8,

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-: cultivo de las células así transformadas, y recuperación de dicho polipéptido producido por dichas células, en caso necesario después de purificación.

11. Utilización de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, o de cristales según la reivindicación 4, para la puesta en práctica de un procedimiento para el cribado de análogos de la vitamina D.

12. Utilización según la reivindicación 11, para la puesta en práctica de un procedimiento para el cribado de análogos de agonistas o antagonistas de la vitamina D, susceptibles de ser utilizados en composiciones farmacéuticas, principalmente en el ámbito del tratamiento de patologías cancerosas, de la psoriasis, de enfermedades autoinmunes, de la osteodistrofia o de la osteoporosis.

13. Procedimiento para el cribado de análogos de la vitamina D, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

-: poner en contacto un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, o de cristales según la reivindicación 4, unido ventajosamente a un soporte sólido, con el análogo que se ensaya, estando marcado ventajosamente uno de dichos polipéptido o análogo de la vitamina D, mediante principalmente un marcador fluorescente, radioactivo o enzimático,

-: detección de la unión eventual entre dicho polipéptido, o dichos cristales, y el análogo ensayado mediante medición del marcador utilizado, principalmente después de enjuague del soporte utilizado en la etapa anterior.

14. Utilización de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, o de cristales según la reivindicación 4, para la puesta en práctica de un procedimiento de análisis de la estructura tridimensional de los complejos formados entre dicho polipéptido o dichos cristales, y una molécula determinada.

15. Procedimiento de análisis de la estructura tridimensional de los complejos formados entre un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, o de cristales según la reivindicación 4, y una molécula determinada, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

-: poner en contacto dicho polipéptido derivado, o dichos cristales, con la molécula determinada,

-: cristalización del complejo formado entre dicho polipéptido derivado, o dichos cristales, y la molécula determinada, principalmente por difusión de vapor, y análisis tridimensional de dicho complejo, principalmente mediante reemplazo molecular,

-: o análisis tridimensional de dicho complejo en fase soluble, principalmente mediante RMN.