ES2275246T3

ES2275246T3 - Sensor optico para la mencion de analitos in situ.

Info

Publication number: ES2275246T3
Application number: ES05004258T
Authority: ES
Inventors: Anders Weber; Christopher John Stanley
Original assignee: Precisense AS
Current assignee: Precisense AS
Priority date: 1998-07-03
Filing date: 1999-07-02
Publication date: 2007-06-01
Anticipated expiration: 2019-07-02
Also published as: EP1095273A1; AU4632799A; EP1542014B1; EP1542014A1; CA2336397A1; DK1095273T3; CY1105923T1; DK1542014T3; DE69927157T2; ATE304175T1; DE69933717T2; ES2245108T3; US6625479B1; DE69927157D1; CA2336397C; JP4331404B2; EP1095273B1; AU757642B2; NZ509716A; DE69933717D1

Abstract

Un método para la detección o medida cuantitativa de un analito en el fluido subcutáneo de un mamífero, método que comprende las etapas de (d) permitir que un ensayo de un sensor inyectado o implantado subcutáneamente para la detección o medida cuantitativa de un analito en fluido subcutáneo alcance un equilibrio termodinámico, estando caracterizado el sensor porque puede funcionar en un emplazamiento subcutáneo sin conexión física con el medio exterior, incorporando dicho sensor un ensayo para dicho analito cuya lectura de salida es una señal óptica detectable o medible, la cual, cuando el sensor está funcionando en una ubicación subcutánea, puede ser enviada transcutáneamente por medios ópticos exteriores; y siendo dicho sensor biodegradable e hidrolizable in vivo; (e) enviar la señal de lectura de salida de dicho ensayo usando medios ópticos; y (f) relacionar la medida obtenida en (b) con la concentración de analito.

Description

Sensor óptico para la medición de analitos in situ.

La presente invención se refiere a un método de medida o control de analitos en el fluido subcutáneo utilizando técnicas ópticas para enviar la señal a un sensor inyectado o implantado. El sensor es especialmente adecuado para su uso en situaciones en las cuales los niveles de analito tienen que ser controlados con mucha atención, por ejemplo con fármacos que deben mantenerse dentro de una ventana terapéutica estrecha o cuando las medidas de analito se tienen que llevar a cabo de manera repetida, como en la diabetes a largo plazo.

En el control de la diabetes, es esencial la medida con regularidad de la glucosa en la sangre, con el fin de asegurar la dosificación correcta de insulina. Además, se ha demostrado que en el cuidado a largo plazo del paciente diabético un mejor control de los niveles de glucosa en la sangre puede retrasar, si no evitar, la aparición de retinopatías, problemas circulatorios y otras enfermedades degenerativas asociadas con frecuencia a la diabetes. En consecuencia, es necesario que los pacientes diabéticos tengan un autocontrol fiable y preciso de los niveles de glucosa en la sangre.

Actualmente, los pacientes diabéticos controlan la glucosa en la sangre utilizando unas tiras para ensayos colorimétricos o biosensores electroquímicos (por ejemplo, electrodos de enzimas) disponibles comercialmente, todos los cuales necesitan del empleo habitual de un instrumento tipo lanceta para sacar una cantidad de sangre adecuada cada vez que se realiza una medida. En promedio, la mayor parte de los pacientes diabéticos usarían tales instrumentos dos veces al día para tomar una medida de glucosa en la sangre. Sin embargo, el Instituto Nacional de la Salud de Estados Unidos recomendó recientemente que las pruebas de glucosa se llevaran a cabo al menos cuatro veces al día, recomendación que ha sido respaldada por la Asociación Americana para la Diabetes. Este aumento en la frecuencia de las pruebas de glucosa en sangre impone una carga considerable al paciente diabético, tanto en términos de coste económico como en término de dolor y molestias, especialmente en los diabéticos crónicos que tienen que hacer uso habitual de una lanceta para extraer sangre de las yemas de los dedos. De modo que, claramente, es necesario tener en pacientes crónicos un sistema de control de glucosa mejor que no implique sacar sangre al paciente.

Ha habido un cierto número de propuestas recientes para técnicas de medida de glucosa que no necesitan que se saque sangre del paciente. Se han realizado diversos intentos para construir dispositivos en los cuales se coloca un biosensor con electrodo de enzima al final de una aguja o catéter que se inserta en un vaso sanguíneo (E. Wilkins y P. Atanasov, Med. Eng. Phys. (1996), 18: 273-288). Mientras que el propio dispositivo detector se sitúa en un vaso sanguíneo, la aguja o el catéter mantienen la conexión con el medio ambiente exterior. En la práctica, tales dispositivos no son adecuados para ser usados en pacientes humanos, en primer lugar porque la inserción de una aguja o un catéter en un vaso sanguíneo representa un riesgo de infección y además resulta incómoda para el paciente y, por tanto, no es adecuada para un uso continuo. En segundo lugar, los dispositivos de este tipo no han conseguido la aprobación para su uso en pacientes humanos porque se ha sugerido que el propio dispositivo, al final de una aguja o un catéter, puede ser responsable de producir trombosis en la circulación del paciente. Esto supone, obviamente, un riesgo muy grave para la salud del paciente.

Mansouri y Schultz (Biotechnology 1984), Meadows y Schultz (Anal. Chim. Acta. (1993) 280: pp 21-30) y el documento de la patente de Estados Unidos número 4.344.438 describen todos ellos dispositivos para el control in situ de compuestos de bajo peso molecular en la sangre, mediante métodos ópticos. Estos dispositivos se diseñan para ser insertados en un vaso sanguíneo o para ser colocados subcutáneamente, pero necesitan conexión mediante fibra óptica a una fuente de luz externa y a un detector externo. De nuevo, la ubicación de estos dispositivos en un vaso sanguíneo lleva asociada un riesgo de promover trombosis y, además, en una realización, la necesidad de mantener una conexión de fibra óptica con el medio exterior no es práctica para su uso a largo plazo y conlleva un riego de infección.

En el proceso de búsqueda de técnicas de control de glucosa menos invasivas se ha prestado también atención al uso de la espectroscopia infrarroja para medir directamente la concentración de glucosa en la sangre en vasos sanguíneos en tejidos como el lóbulo de la oreja o la yema de los dedos que son relativamente "transparentes a la luz" y que tienen vasos sanguíneos situados cerca de la superficie de la piel (J. Jaremko y O. Rorstad, Diabetes Care 1998, 21: 444-450 y E.J. Fogt, Clin. Chem. (1990), 36: 1573-80). Este enfoque resulta obviamente mínimamente invasivo, para ha demostrado ser poco práctico debido al hecho de que el espectro infrarrojo de la glucosa en la sangre es tan parecido al del tejido que la rodea que, en términos prácticos, es virtualmente imposible separar los dos espectros.

Se ha observado que la concentración de analitos en el fluido subcutáneo está en correlación con la concentración de dichos analitos en la sangre; en consecuencia, ha habido varios informes que tratan del empleo de dispositivos de control de glucosa que se colocan en una ubicación subcutánea. En especial, Atanasov et al (Med. Eng. Phys. (1996), 18: pp 632-640) describen el uso de un dispositivo detector de glucosa implantable (de dimensiones 5,0 x 7,0 x 1,5 cm) para controlar la glucosa en el fluido subcutáneo de un perro. El dispositivo consiste en un detector de glucosa amperométrico, un potenciostato en miniatura, un transmisor de señal FM y una fuente de alimentación y se puede mandar la señal de forma remota, por medio de una antena y un receptor ligados a un sistema de adquisición de datos basado en un ordenador, sin necesidad de conexión a un medio externo. Sin embargo, las grandes dimensiones de este dispositivo lo harían, obviamente, poco práctico para ser usado en pacientes humanos.

En el documento de la patente WO 91/09312 se describe un método y un dispositivo subcutáneos que emplean un ensayo de afinidad para la glucosa en el que se envía la señal remotamente por medios ópticos. En el documento de la patente WO 97/19188 se describe un ejemplo adicional de un sistema de ensayo para glucosa implantable que produce una señal óptica que se puede leer de manera remota. Los dispositivos descritos en los documentos de las patentes WO 91/09312 y WO 97/19188 continuarán existiendo en el cuerpo durante períodos prolongados después de que la química del ensayo haya dejado de funcionar correctamente y esto es un inconveniente principal para aplicaciones crónicas. La eliminación de estos dispositivos necesitará un procedimiento quirúrgico.

Continúa existiendo una clara necesidad de técnicas de control de glucosa en sangre sensibles y precisas que no necesiten la extracción habitual de sangre del paciente, que no impliquen un riesgo de infección o incomodidad y que no experimenten las desventajas prácticas de los dispositivos implantables descritos previamente.

De acuerdo con ello, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para la detección o medida cuantitativa de un analito en el fluido subcutáneo de un mamífero, método que comprende las etapas de:

(a): permitir que un ensayo de un sensor inyectado o implantado subcutáneamente para la detección o medida cuantitativa de un analito en fluido subcutáneo alcance un equilibrio termodinámico, estando caracterizado el sensor porque puede funcionar en un emplazamiento subcutáneo sin conexión física con el medio exterior, incorporando dicho sensor un ensayo para dicho analito cuya lectura de salida es una señal óptica detectable o medible, la cual, cuando el sensor está funcionando en una ubicación subcutánea, puede ser enviada transcutáneamente por medios ópticos exteriores; y siendo dicho sensor biodegradable e hidrolizable in vivo;

(b): enviar la señal de lectura de salida de dicho ensayo usando medios ópticos; y

(c): relacionar la medida obtenida en (b) con la concentración de analito.

El sensor de la invención incorpora medios de ensayo para detectar un analito o para medir la cantidad de un analito, siendo la lectura de salida del ensayo una señal óptica. Debido a que el sensor se sitúa justo por debajo de la piel, una señal óptica generada en el sensor se puede detectar transcutáneamente (es decir, a través de la piel), evitando de este modo la necesidad de cualquier conexión directa entre el sensor y el medio exterior. Una vez que el sensor está colocado en su ubicación subcutánea, las medidas de analito se pueden hacer con tanta frecuencia como sea necesario, sin ningún efecto adverso. Esto es una ventaja especial con respecto al cuidado a largo plazo de los pacientes diabéticos, porque si se toman medidas de glucosa más frecuentemente, se puede mantener un control más estrecho de los niveles de glucosa en la sangre y se reducirá el riesgo de desarrollar condiciones relacionadas con los niveles mal regulados de glucosa en sangre, como retinopatía, artritis y mala circulación.

Debido a que el sensor de la invención no contiene en si mismo ninguno de los componentes ópticos necesarios para mandar la señal de salida de lectura del ensayo (puesto que éstos se proporcionan de manera separada y se localizan en el exterior del cuerpo), el sensor puede proporcionarse fácilmente en una forma que es inyectable, con molestias mínimas para el paciente. En una realización preferida, los componentes del ensayo se incorporan en un material matriz que es permeable al fluido subcutáneo, permitiendo de este modo que los analitos como la glucosa entren en el sensor por difusión y que interaccionen con los componentes del ensayo. El material matriz puede ser una formulación inyectable que forma un gel en el punto de inyección bajo la piel del paciente. Si no, el sensor se puede formar a partir de un material matriz polimérico sólido que incorpore los componentes del ensayo, el cual, de nuevo, se inyecta subcutáneamente, siendo el material polimérico de un tamaño adecuado para su inyección a través de una aguja de calibre estrecho, para hacer mínimas las molestias que se causan al paciente. Cuando se sitúa subcutáneamente el material polimérico sólido absorbe agua y se expande para formar un gel, hidratando de este modo los componentes del ensayo.

El dispositivo de la presente invención es biodegradable o hidrolizable in vivo. Cuando está en funcionamiento, este sensor se coloca en una ubicación subcutánea, pero luego se degrada lentamente durante un cierto período de tiempo. Una vez que el sensor se ha degradado hasta un extremo tal que ha dejado de funcionar de manera eficaz para el control de los analitos, se puede simplemente inyectar o implantar un nuevo sensor y no hay necesidad de eliminar quirúrgicamente el sensor antiguo. Por razones de seguridad, es conveniente que el sensor se degrade en materiales que se eliminen completamente del cuerpo. En la práctica, esto requiere que el sensor se degrade en materiales que sean capaces de pasar a través de la membrana del riñón humano, para poder ser excretados en la orina, o que puedan ser metabolizados por el organismo.

Según se usa en el presente documento, el término "biodegradable" debería tomarse en el sentido de que el dispositivo sensor de la invención se degrada dentro del organismo en materiales que pueden ser eliminados sustancialmente de manera completa del cuerpo, sin dejar residuos, y que una vez colocado en el cuerpo, el sensor de la invención deviene degradado hasta el punto de que es eliminado del cuerpo sustancialmente de manera completa dentro de una escala de tiempo razonable, respecto de la duración de la vida activa de los componentes reactivos incorporados en el dispositivo. En otras palabras, el dispositivo sensor de la invención idealmente debería ser completamente eliminado del organismo poco después de que haya dejado de ser eficaz para medir/controlar el analito con precisión. De este modo, una vez que el sensor deja de ser eficaz, simplemente se puede colocar en su lugar un sensor nuevo y se evitará el problema de acumular dentro del cuerpo dispositivos viejos o gastados. Preferentemente, el sensor de la invención se degradará de tal forma que sea eliminado de manera sustancialmente completa durante un período de menos de un año, más preferentemente durante un período de varios meses.

Entre los materiales adecuados para la construcción de tales sensores biodegradables se incluyen copolímeros de bloque biodegradables como los descritos por Jeong et al., Nature 388: pp 860-862. Las disoluciones acuosas de estos materiales son termosensibles, mostrando transiciones sol-gel reversibles dependientes de la temperatura. El material polimérico se puede cargar con los componentes del ensayo a una temperatura elevada, a la que el material forma un sol. En esta forma, el material es inyectable y bajo inyección subcutánea y posterior enfriamiento rápido a la temperatura del cuerpo el material forma una matriz de gel. Los componentes del ensayo están suspendidos dentro de esta matriz de gel que constituye, de este modo, un sensor adecuado para detectar o medir analitos en el fluido subcutáneo. Los analitos de bajo peso molecular, como la glucosa, se pueden difundir libremente en la matriz de gel desde el fluido subcutáneo que la rodea. Esta realización particular de la invención tiene la ventaja de que no se necesita un procedimiento quirúrgico para la implantación del sensor. La inyección subcutánea del material en la fase sol no causa ni dolor apreciable ni daños en los tejidos.

Como una alternativa al sensor a base de gel que se acaba de describir, el sensor se puede construir a partir de un material de matriz polimérica biodegradable de tipo gel o sólido, dentro del cual se distribuyen los componentes del ensayo. Cuando el sensor polimérico sólido se inyecta o se implanta subcutáneamente, el sensor se hidrata, se hincha y el analito penetra a través de la estructura para encontrarse con los componentes del ensayo.

En una realización adicional, el sensor se puede construir en forma de una cámara hueca, estando construidas las paredes de dicha cámara de un material polimérico biodegradable sólido o de un vidrio soluble y definiendo un espacio central en el cual están contenidos los componentes del ensayo. Los analitos de bajo peso molecular son capaces de difundirse en el espacio central a través de las paredes de la cámara o a través de un tapón en el extremo permeable y, de este modo, llegar a contactar con los componentes del ensayo. Las paredes de la cámara hueca se degradarían gradualmente con el tiempo.

Tanto los sensores de polímero sólido como los sensores de cámara hueca se pueden introducir en una ubicación o emplazamiento subcutáneo mediante implantación o inyección, si bien se prefiere la inyección para los sensores de diámetro inferior a 2 mm. Ambos tipos de sensores se pueden conformar en una amplia variedad de formas geométricas, según se desee, antes de su inyección o implantación, si bien se prefieren especialmente los sensores cilíndricos.

Entre los materiales biodegradables adecuados para ser usados en la construcción de la cámara hueca y de los sensores de polímero sólido se incluyen proteínas reticuladas como albúmina humana; geles de fibrina; polisacáridos como almidón o agarosa, poli (DL-lactida) y poli (DL-glicólido); polianhidridos; mezclas ácido graso/colesterol que forman derivados semisólidos; hialuronatos y cristales líquidos de monololeína y agua.

En una realización adicional más, el sensor se puede formar como una suspensión de micropartículas de diámetro preferido <100 \mum, cada una de las cuales contiene los componentes del ensayo, bien encapsulados dentro de una micropartícula hueca o bien dispersos dentro del material de una micropartícula sólida. Tal suspensión de micropartículas es fácilmente inyectable subcutáneamente. Preferentemente, las micropartículas se forman a partir de un material que es biodegradable e hidrolizable in vivo. Alternativamente, se pueden usar liposomas que contienen los componentes del ensayo. Se ha demostrado que liposomas de 0,3 a 2,0 \mum de diámetro permanecen en el lugar de inyección (A.J. Jackson, Drug Metab. Dispos. 1981 9, 535-540), de manera que serían adecuados para ser usados en el sensor. En una realización adicional, el sensor comprende una mayoría de eritrocitos vacíos que se han cargado con componentes de ensayo y luego inyectado subcutáneamente. Los eritrocitos vacíos, también conocidos como "fantasmas de eritrocitos" se pueden preparar exponiendo eritrocitos intactos a una disolución hipotónica de tal forma que se hinchen y rompan para liberar su contenido citoplasmático. Los eritrocitos vacíos se pueden luego cargar con los componentes de ensayo antes de dejar que las membranas de plasma se vuelvan a cerrar.

En las realizaciones preferidas del sensor, (es decir, gel, polímero sólido, cámara hueca o micropartículas), resulta ventajoso que los componentes de ensayo tengan una difusión restringida, con el fin de minimizar su pérdida del sensor. Esto se puede conseguir asegurándose de que el gel o el material biodegradable tenga un tamaño de poro que permita la difusión de analitos de bajo peso molecular, pero no de los mismos componentes de ensayo. Estos se perderían solamente a medida de que el material o el gel se degraden con el tiempo. Los componentes de ensayo son preferentemente de alto peso molecular, como proteínas o polímeros con el fin de limitar su pérdida del
sensor.

Hay varios mecanismos distintos mediante los cuales se puede degradar un sensor biodegradable en materiales que se puedan eliminar por el organismo, entre los que se incluyen: hidrólisis, disolución y división de los enlaces susceptibles mediante acción enzimática, incluyendo la acción de los componentes del sistema inmune. En última instancia, el mecanismo de degradación es dependiente de la naturaleza del material de que esté construido el sensor. Por ejemplo, la mayoría de los materiales poliméricos biodegradables como polilactidas o poliglicólidos son hidrolizables por el agua. Un dispositivo sensor que comprende una matriz de polímero hidrolizable en la cual están embebidos o incrustados los componentes reactivos de ensayo se degrada, por lo tanto, como resultado de la hidrólisis de la matriz, liberando gradualmente los componentes reactivos. El tiempo global necesario para que la matriz se degrade dependerá generalmente de la concentración de polímero en el material de la matriz y de las dimensiones globales del sensor. Una vez liberados del material de la matriz, los componentes reactivos del ensayo, sean a base de proteínas o de carbohidratos, o bien son recogidos por el hígado y de este modo eliminados o bien son descompuestos in situ por la acción de enzimas.

Entre los ensayos adecuados para ser usados en el sensor se incluyen reacciones como hidrólisis y oxidación que conducen a un cambio óptico detectable, es decir, un aumento o apagado ("quenching") de la fluorescencia que se pueda observar transcutáneamente. Un ensayo preferido para usarse en el sensor de la invención es un ensayo de enlace o aglutinación, cuya salida de lectura es una señal óptica medible o detectable que se puede mandar transcutáneamente utilizando medios ópticos. El ensayo de enlace que genera la señal óptica debería ser preferentemente reversible, de tal forma que pueda conseguirse un control continuo de los niveles fluctuantes del analito. Esta reversibilidad es una ventaja especial del uso de un formato de ensayo de enlace o aglutinación, en el que no se consumen los componentes del ensayo. Se prefiere usar también los ensayos de aglutinación en el sensor por razones de seguridad, ya que no pueden generar productos indeseados como podrían ser generados por una reacción enzimática o electroquímica.

Entre las configuraciones de aglutinación o enlace preferidas para ser usadas en el sensor de la invención se incluye un ensayo de enlace o aglutinación competitivo reversible, limitado en reactivo, entre cuyos componentes se incluyen un análogo del analito y un agente de aglutinación del analito capaz de enlazarse reversiblemente tanto al analito de interés como al análogo del analito. El analito de interés y el análogo del analito compiten por enlazarse en el mismo sitio de enlace sobre el agente de enlace del analito. Tales configuraciones de ensayo de aglutinación o enlace competitivo son bien conocidas en la técnica de diagnóstico clínico y se describen, a modo de ejemplo, en The Immunoassay Handbook, ed. David Wild, Macmillan Press 1994. Entre los agentes de enlace para el analito adecuados para ser usados en este ensayo podrían incluirse anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se quedan con un sitio de enlace de analitos (por ejemplo, fragmentos Fab), lectinas (por ejemplo, concanavalina A), receptores de hormonas, receptores de fármacos, aptámeros y polímeros estampados molecularmente. Preferentemente, el análogo del analito debería ser una sustancia de peso molecular más alto que el del analito, de tal modo que no se pueda difundir libremente fuera del sensor. Por ejemplo, un ensayo para glucosa podría emplear como análogo del analito un polímero de glucosa de peso molecular elevado, como dextrano.

Entre las señales ópticas adecuadas que se pueden utilizar como salida de lectura del ensayo de acuerdo con la invención se incluye cualquier señal óptica que se pueda generar en un ensayo de proximidad, como aquellas generadas por transferencia de energía de fluorescencia, polarización de fluorescencia, apagado ("quenching") de fluorescencia, técnicas de fosforescencia, incremento de luminiscencia, apagado ("quenching") de luminiscencia, difracción o resonancia de plasmones, todas ellas bien conocidas per se en la técnica.

La realización más preferida del sensor de la invención incorpora un ensayo de enlace o aglutinación competitivo, de reactivo limitado, que genera una salida de lectura óptica que utiliza la técnica de transferencia de energía de fluorescencia. En este formato de ensayo el análogo del analito se etiqueta con un primer cromóforo (denominado a partir de aquí en el texto como cromóforo dador) y el agente de enlace con el analito se etiqueta con un segundo cromóforo (al que a partir de aquí se denomina en el texto como cromóforo aceptor). Una característica esencial del ensayo es que el espectro de emisión de fluorescencia del cromóforo dador se solapa con el espectro de emisión de fluorescencia del cromóforo aceptor, de tal modo que cuando los cromóforos dador y aceptor se sitúan muy próximos entre sí mediante el enlace del análogo de analito con el agente de enlace del analito, una parte de la señal fluorescente emitida por el cromóforo dador (que sigue a la irradiación con radiación incidente de una longitud de onda absorbida por el cromóforo dador) será absorbida por el cromóforo aceptor proximal, proceso conocido en la técnica como transferencia de energía de fluorescencia, con el resultado de que una parte de la señal fluorescente emitida por el cromóforo dador se apaga y, en algunos casos, que el cromóforo aceptor emite fluorescencia. La transferencia de energía de fluorescencia solo ocurrirá cuando los cromóforos aceptor y dador se sitúen muy próximos entre sí merced al enlace del análogo del analito con el agente de enlace del analito. De este modo, en presencia del analito, que compite con el análogo del analito por enlazarse con el agente de enlace del analito, se reduce la cantidad de "quenching" (o apagado) (lo cual da como resultado un aumento medible de la intensidad de la señal fluorescente emitida por el cromóforo dador o una disminución de la intensidad de la señal emitida por el cromóforo aceptor), puesto que el análogo del analito etiquetado es desplazado del enlace con el agente de enlace del analito. La intensidad de la señal fluorescente emitida por el cromóforo dador se relaciona de este modo con la concentración de analito en el fluido subcutáneo que baña el sensor.

Una característica ventajosa adicional del formato de ensayo de transferencia de energía de fluorescencia proviene del hecho de que cualquier señal fluorescente emitida por el cromóforo aceptor que sigue a la excitación con un haz de radiación incidente a una longitud de onda dentro del espectro de absorción del cromóforo aceptor no se ve afectada por el proceso de transferencia de energía de fluorescencia. Por lo tanto, es posible utilizar la intensidad de la señal fluorescente emitida por el cromóforo aceptor como una señal de referencia interna, por ejemplo en la calibración continua del sensor o para controlar el grado hasta el cual se ha degradado el sensor y, de este modo, indicar la necesidad de implantar o inyectar un sensor nuevo. A medida que sensor se degrada, la cantidad de cromóforo aceptor presente en el sensor disminuirá y, por tanto, la intensidad de la señal fluorescente detectada tras la excitación del cromóforo aceptor disminuirá también. La caída de esta señal por debajo de un nivel de línea de base aceptable indicaría la necesidad de implantar o inyectar un sensor nuevo.

Los ensayos de enlace competitivos que utilizan la técnica de transferencia de energía de fluorescencia que son capaces de ser adaptados para su uso en el sensor de la invención se conocen en la técnica. El documento de la patente de Estados Unidos número 3.996.345 describe inmunoensayos que emplean anticuerpos y transferencia de energía de fluorescencia entre un par cromofórico apagador ("quencher")-productor de fluorescencia. Meadows y Schultz (Anal. Chim. Acta (1993) 280: pp 21-30) describen un método de ensayo homogéneo para la medida de glucosa basado en transferencia de energía de fluorescencia entre un análogo de glucosa etiquetado (dextrano etiquetado con FITC, isotiocianato de fluoresceína, por sus siglas en inglés) y un agente de enlace de glucosa etiquetado (concanavalina A etiquetada con rodamina). En todas estas configuraciones, los cromóforos/apagadores ("quenchers") aceptor y dador se pueden enlazar bien al agente de enlace o bien al análogo del analito.

Una alternativa a la transferencia de energía de fluorescencia es la técnica de apagado ("quenching") de fluorescencia. En este caso, se usa un un compuesto con capacidad para apagar la fluorescencia en vez del cromóforo aceptor específico y la señal óptica en un ensayo de enlace competitivo aumentará cuando aumenta el analito. Tyagi et al, en Nature Biotechnology (1998) 18: p49, proporcionan un ejemplo potente y no específico de apagador ("quencher") de fluorescencia.

El sensor de la invención se puede adaptar para la detección o medida cuantitativa de cualquier analito presente en el fluido subcutáneo. Entre los analitos preferidos se incluyen glucosa (en relación con el control de la diabetes a largo plazo), urea (en relación con enfermedades o malfuncionamientos del riñón), lactato (en relación con la evaluación del rendimiento de los músculos en medicina deportiva), iones como sodio, calcio o potasio y fármacos terapéuticos cuya concentración en la sangre se debe controlar con precisión, como, por ejemplo, digoxina, teofilina o fármacos inmunosupresores. Los analitos anteriores se listan solamente a título de ejemplo y debe entenderse que la naturaleza precisa de los analitos que se midan no es asunto de la invención.

Al sensor se le envía una señal transcutáneamente utilizando medios ópticos, es decir, no se necesita una conexión física entre el sensor y los medios ópticos. Cuando el sensor incorpora un ensayo de enlace competitivo, limitado en reactivo, empleando la técnica de la transferencia de energía de fluorescencia, los medios ópticos deberían proporcionar un primer haz de radiación incidente a una longitud de onda dentro del espectro de absorción del cromóforo dador y preferentemente un segundo haz de radiación incidente a una longitud de onda dentro del espectro de absorción del cromóforo aceptor. Además los medios ópticos deberían ser capaces de medir las señales ópticas generadas en el sensor a dos longitudes de onda diferentes; longitud de onda 1 dentro del espectro de emisión del cromóforo dador (la señal generada en relación con la medida del analito) y la longitud de onda 2 en el espectro de emisión del cromóforo aceptor (que podría ser la señal del analito o la referencia interna o señal de calibración).

Entre los medios ópticos adecuados para su uso en el envío remoto de la señal del dispositivo de la invención se incluye un fluorímetro simple de alto rendimiento que comprende una fuente de luz de excitación como, por ejemplo, un diodo emisor de luz (azul, verde o rojo > 1000 mCa), un filtro de luz de excitación (filtro dicroico), un filtro de luz fluorescente (filtro de color o dicroico) y un detector de luz fluorescente (configuración diodo PIN). Un fluorímetro con estas características puede presentar una sensibilidad de concentraciones de fluoróforo de picomolares a femtomolares.

Un montaje adecuado de fluorímetro se muestra en la figura 1 que acompaña al texto y se describe en los ejemplos que se incluyen en el texto. El fluorímetro mide de manera separada los parámetros siguientes:

A la longitud de onda 1 (cromóforo dador):

: Intensidad de luz de excitación, I (1,0)

: Intensidad de luz ambiente, I (1,1)

: Intensidad de luz ambiente y fluorescente combinadas, I (1,2).

A la longitud de onda 2 (cromóforo aceptor):

: Intensidad de luz de excitación, I (2,0)

: Intensidad de luz ambiente, I (2,1)

: Intensidad de luz ambiente y fluorescente combinadas, I (2,2).

Las medidas se toman manteniendo el fluorímetro cercano a la piel y alineado con el sensor. Cuando se hacen medidas transcutáneas de las señales de fluorescencia generadas en el sensor es necesario tener en cuenta la absorción de la señal por la piel; se encuentra experimentalmente que la capacidad de absorción de la piel humana es mínima en el intervalo de 400 nm a 900 nm. La salida final proporcionada es la relación normalizada entre la intensidad fluorescente de los dos fluoróforos, definida por la relación siguiente (ecuación 1):

(I(1,2) - I(1,1)) I(2,0)

(I(2,2) - I(2,1)) I(1,0)

La salida final procedente de los medios ópticos (por ejemplo el fluorímetro), según está dada por la ecuación 1, se convierte a concentración de analito preferentemente por medio de un ordenador utilizando datos de calibración que se pueden obtener sobre la base de los principios que se establecen a continuación.

Se puede establecer una curva de calibración empíricamente midiendo la respuesta frente a la concentración de analito para un intervalo de concentraciones de analito que sea pertinentes fisiológicamente. Preferentemente esto tiene lugar in vitro, como parte del proceso de producción del dispositivo sensor. El procedimiento de calibración se puede simplificar considerablemente utilizando la relación matemática entre la respuesta y la concentración de analito en un sensor de afinidad competitiva que se deriva como sigue:

La respuesta de un sensor de afinidad competitiva viene gobernada por las reacciones:

RC \rightarrow R + C

RL \rightarrow R + L

que designan la disociación de los complejos RC y RL, formados por la combinación del agente de enlace del analito (R) con el analito (L) o el análogo del analito (C).

Las correspondientes constantes de equilibrio de disociación son:

K_{1} = \frac{C_{R}C_{C}}{C_{RC}}

y

K_{2} = \frac{C_{R}C_{L}}{C_{RL}}

donde C designa el número de moles de la especie dividido por el volumen del sensor. Utilizando esta medida de concentración, se tratan de la misma manera las especies inmovilizadas y las especies en disolución.

Las ecuaciones de balance de masa son:

T_{C} = C_{C} + C_{RC}

para la concentración de análogo de analito total y:

T_{R} = C_{R} + C_{RC} + C_{RL}

para la concentración de agente de enlace del analito total.

Utilizando las expresiones anteriores, se obtiene la relación entre respuesta y concentración de analito:

(2)\frac{T_{C} - C_{C}}{C_{C}}K_{1}=\frac{T_{R} - (T_{C} - C_{C})}{1+(C_{L}/K_{2})}

Utilizando esta relación se puede reducir la cantidad de datos necesarios para la calibración a dos parámetros clave: concentración del agente de enlace del analito total y concentración del análogo de analito total. La curva de calibración se determina de este modo con dos puntos sobre la curva.

La presente invención se entenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitadores, junto con las figuras acompañantes, en las cuales:

La figura 1 es un diagrama esquemático de la parte óptica de un fluorímetro de fibra óptica.

La figura 2 es un diagrama esquemático de un circuito conductor/amplificador utilizado junto con la parte óptica del fluorímetro de fibra óptica.

Ejemplo 1

Se desarrolló un ensayo de glucosa, de acuerdo con Meadows y Schultz (Talanta, 35, 145-150, 1988), utilizando concavalina A-rodamina y dextrano-FITC (ambos de Molecular Probes Inc, Oregón, Estados Unidos). El principio del ensayo es la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia entre los dos fluoróforos cuando están muy próximos; en presencia de glucosa, la transferencia de energía de resonancia se inhibe y la señal fluorescente que proviene del FITC (fluoresceína) aumenta. De este modo, el aumento de fluorescencia se relaciona con el aumento de glucosa. Se encontró que el ensayo de glucosa respondía a la glucosa, según informó Schultz, con recuperación de aproximadamente 50% de la señal de fluorescencia de la fluoresceína a 20 mg/dl de glucosa. La fluorescencia se midió en un fluorímetro Perkin-Elmer, adaptado para medidas de flujo a través utilizando un dispositivo para sorber.

Ejemplo 2

Se añadieron los componentes del ensayo de glucosa del ejemplo 1 a disoluciones agitadas (1 ml) de 1%, 1,5% y 2% peso/volumen de una agarosa de baja temperatura de fusión (tipo IX, Sigma, San Luis, Estados Unidos) a 45ºC. Después de la dispersión se bajó la temperatura a 20ºC y se detuvo la agitación. Cuando se formó el gel (después de aproximadamente 3 horas), se colocó en un mortero cerámico y se molió hasta un tamaño de partícula de 50 a 100 \mum, tomando como referencia visual una preparación de bolitas de poliestireno con el mismo diámetro. La preparación de partículas se suspendió en una disolución salina al 0,9% peso/volumen y se filtró a través de una malla de nailon para eliminar las partículas más grandes. Las partículas que pasaron a través de la malla se centrifugaron después en una centrífuga de banco a 500 g y se descartó el sobrenadante que contenía las partes finas. Durante el proceso, las partículas guardaron su fluorescencia, según se observó mediante inspección visual y midiendo la fluorescencia de la rodamina en el fluorímetro Perkin-Elmer. La adición de glucosa a 20 mg/dl a una muestra de las partículas suspendidas dio como resultado una aumento en la señal de fluorescencia de la fluoresceína durante un período de 30 minutos. De este modo, los componentes de ensayo contenidos dentro del gel de agarosa eran sensibles a la glucosa.

Los componentes químicos del ensayo de glucosa son intrínsecamente biodegradables (o excretables) en el cuerpo humano, puesto que se basan en materiales peptídicos o carbohidratados. La degradación por digestión enzimática y/o el simple transporte al hígado o al riñón asegurarán que los componentes del ensayo serán eliminados del cuerpo después de la implantación o de la inyección subcutánea.

Ejemplo 3

Se colocaron muestras de 1 ml de las suspensiones de partículas de agarosa que contenían reactivos para el ensayo de glucosa (descritas en el ejemplo 2) en un baño de agua a 37ºC para simular la temperatura del cuerpo humano. Durante las siguientes seis semanas, se perdió la estructura de las partículas a medida que las estructuras se degradaban; los geles de concentración mayor presentaron la degradación más lenta. La señal de dispersión de luz medida utilizando el fluorímetro también cayo a medida que las partículas se dispersaron, indicando la degradación de las partículas. Este experimento simula las condiciones en el cuerpo humano; se espera que las partículas sean eliminadas finalmente del sitio de inyección y que los componentes químicos del ensayo se degradarán bien in situ o bien siendo transportados al hígado para procesado posterior, o excretados en la orina.

Ejemplo 4

Se montó un espectrómetro de fibra óptica como sigue:

Se montó la parte óptica de un fluorímetro de fibra óptica en un micro banco, a partir de componentes estándar. El sistema, que comprendía un LED rojo como fuente de luz, lentes, un divisor de haz dicroico y filtros y diodos detectores, era como se muestra en la figura 1. Brevemente, el fluorímetro comprende un diodo emisor de luz (1) que proporciona un haz de luz de excitación que pasa a través de un condensador (2) que contiene un filtro de excitación (3) y que incide sobre un divisor de haz (4). Parte del haz de excitación se desvía de este modo a una óptica de lanzamiento (5) y entra en una fibra óptica (6). Cuando se está utilizando el fluorímetro para enviar una señal a un sensor situado subcutáneamente, el extremo de la fibra óptica (6) se coloca cercano a la superficie de la piel, alineado con el sensor subcutáneo, de tal forma que el haz de luz de excitación incida sobre el sensor. Una parte de la señal óptica emitida por el sensor después de la excitación entra en la fibra óptica (6) y, de este modo, es conducida al fluorímetro donde pasa a través de un filtro de bloqueo (8) y se mide mediante un diodo detector de señal (7). El fluorímetro contienen también un diodo detector de referencia (9) que proporciona una medida de referencia de la luz de excitación emitida por el LED (1). Se pulieron los extremos de una fibra óptica Ensign Beckford de 1 m de larga, 0,5 mm de diámetro y apertura numérica de 0,65 hasta un acabado espejo utilizando pasta de diamante y pasta de vidrio. Se montó un extremo de la fibra en un soporte XYZ enfrente del objetivo de un microscopio de 20 aumentos. Se conectaron los diodos (LED (1) y diodos detectores (7) y (9)) a un circuito conductor/amplificador hecho a medida, según se muestra en la figura 2. El circuito comprende un transmisor (10); amplificadores de corriente, (11) y (12); multiplexores, (13) y (14); integradores, (15) y (16), y un divisor analógico (17). El circuito conductor se ajustó para manejar el LED (1) a 238 Hz y las señales procedentes de los diodos detectores (7) y (9) se cambiaron entre tierra y los condensadores de almacenamiento (integrador con una constante de tiempo de 1 segundo) sincronizadas con la señal conductora. Las dos señales integradas corresponden a la señal fluorescente corregida por el fondo y al nivel de luz de excitación corregido por el fondo (intensidad del LED). La primera dividida por la última fue soportada por un divisor analógico, como se muestra en la figura 2. Para fines de ensayo, se sumergió el extremo distal de la fibra (6) en disoluciones diluidas de rodamina y se ajustó la óptica para obtener la señal máxima a partir del divisor analógico.

El fluorímetro/espectrómetro funciona con baterías (consumo de potencia característico: 150 mA a 9 V) y, por conveniencia, se puede construir con la forma y dimensiones de una pluma.

Ejemplo 5

Se lavaron varias veces partículas de agarosa al 1,5% peso/volumen de aproximadamente 50\mum de diámetro que contenían los componentes del ensayo (según se describe en el ejemplo 2), mediante centrifugación y resuspensión en disolución salina del 0,9% peso/volumen. Este procedimiento de lavado eliminó el exceso de los reactivos que no estaban atrapados dentro de la estructura del gel. Las partículas continuaron siendo altamente fluorescentes durante este proceso. Luego, se cargó la suspensión de partículas en una jeringa desechable estándar (Becton Dickinson, Estados Unidos) y se inyectó subcutáneamente bajo la piel en el dorso de la mano de un voluntario humano. Se dirigió un espectrómetro de fibra óptica (ver ejemplo 4) a la piel y se obtuvo una señal de fluorescencia de rodamina, indicando que se pueden hacer medidas transdérmicas en sensores biodegradables implantados.

Ejemplo 6

Se llenó parcialmente un capilar de vidrio de dimensiones 10 mm x 2 mm compuesto de un vidrio soluble a base de fosfato (Pilkington CRS, Wrexham, GB) con una disolución de reactivos de ensayo de glucosa. Se sellaron luego los extremos del capilar sumergiéndolo en una disolución al 1% peso/volumen de agarosa de baja temperatura de fusión calentada a 45ºC y enfriando luego hasta temperatura ambiente (22ºC). Se sellaron ambos extremos del capilar de esta forma. El capilar sellado se colocó sobre una superficie plana y se posicionó el espectrómetro de fibra óptica (ver ejemplo 4) para tomar una lectura de fluorescencia del contenido. La fuerte fluorescencia de la rodamina indicaba que los reactivos se habían incorporado al capilar. Luego, se colocó el capilar en una disolución agitada por la parte superior de 20 mg/dl de glucosa en disolución salina al 0,9% peso/volumen, durante 16 horas a temperatura ambiente (22ºC). Se sacó luego el capilar de la disolución de glucosa, se secó la superficie externa y se colocó sobre una superficie plana. Una lectura con el espectrómetro de fibra óptica indicó que se había producido un aumento en la fluorescencia de la fluoresceína, mostrando que la glucosa había penetrado en el capilar por difusión a través de los tapones de gel de agarosa. Luego, se volvió a colocar el capilar en la disolución salina al 0,9% peso/volumen agitada por la parte superior a 37ºC. Después de 200 horas, la estructura del capilar había empezado a desplomarse a medida que la pared de vidrio de fosfato se rompía y se vertía el contenido en el fluido que la rodeaba. Después de otros 20 días adicionales, no quedaba ningún resto de la estructura del capilar de vidrio y los tapones del gel de agarosa se habían disuelto también. Se demostró de este modo que todo el sensor basado en el capilar era totalmente degradable en condiciones fisiológicas.

Claims

1. Un método para la detección o medida cuantitativa de un analito en el fluido subcutáneo de un mamífero, método que comprende las etapas de

(d): permitir que un ensayo de un sensor inyectado o implantado subcutáneamente para la detección o medida cuantitativa de un analito en fluido subcutáneo alcance un equilibrio termodinámico, estando caracterizado el sensor porque puede funcionar en un emplazamiento subcutáneo sin conexión física con el medio exterior, incorporando dicho sensor un ensayo para dicho analito cuya lectura de salida es una señal óptica detectable o medible, la cual, cuando el sensor está funcionando en una ubicación subcutánea, puede ser enviada transcutáneamente por medios ópticos exteriores; y siendo dicho sensor biodegradable e hidrolizable in vivo;

(e): enviar la señal de lectura de salida de dicho ensayo usando medios ópticos; y

(f): relacionar la medida obtenida en (b) con la concentración de analito.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho ensayo es un ensayo de enlace o aglutinación, cuya salida de lectura es una señal óptica detectable o medible.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que dicho ensayo de enlace es un ensayo de enlace competitivo cuyos componentes incluyen un agente de enlace del analito y un análogo del analito.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que dicho análogo del analito se etiqueta con un primer cromóforo y dicho agente de enlace del analito se etiqueta con un segundo cromóforo, solapándose el espectro de emisión de dicho primer cromóforo con el espectro de absorción de dicho segundo cromóforo.

5. Un método según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que el agente de enlace es un anticuerpo, un fragmento Fab, una lectina, un receptor hormonal, un receptor de fármacos, un aptámero o un polímero impreso molecularmente.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dicha señal óptica detectable o medible se genera por transferencia de energía de fluorescencia, polarización de fluorescencia, apagado ("quenching") de fluorescencia, fosforescencia, aumento de luminiscencia, apagado ("quenching") de luminiscencia, difracción o resonancia de plasmones.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sensor comprende un material matriz inyectable o implantable, estando suspendidos los componentes de dicho ensayo en dicho material matriz.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el sensor comprende una pluralidad de micropartículas.

9. Un método según la reivindicación 8, en el que dichas micropartículas son micropartículas sólidas y los componentes de dicho ensayo están dispersos uniformemente en dichas micropartículas sólidas.

10. Un método según la reivindicación 8, en el que dichas micropartículas son micropartículas huecas y los componentes de dicho ensayo están encapsulados dentro de dichas micropartículas huecas.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el sensor comprende una pluralidad de liposomas, estando los componentes de dicho ensayo encapsulados dentro de dichos liposomas.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el sensor comprende una cámara hueca que tiene una parte de la pared que encierra un espacio central que contiene los componentes de dichos medios de ensayo.

13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el sensor comprende una pluralidad de eritrocitos vacíos que se han cargado con los componentes de dicho ensayo.