ES2274388T3

ES2274388T3 - Procedimiento para la preparacion de muestras de ensayo.

Info

Publication number: ES2274388T3
Application number: ES04251544T
Authority: ES
Inventors: John J. Quinn; Uri Piran; Laurie A. Livshin; Claudine Z. Yannoni
Original assignee: Bayer Healthcare LLC
Current assignee: Bayer Healthcare LLC
Priority date: 2003-03-20
Filing date: 2004-03-18
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2024-03-18
Also published as: EP1475387A2; DE602004003163D1; DE602004003163T2; JP2004286749A; EP1475387A3; EP1475387B1; US20040185449A1

Abstract

Procedimiento para la preparación de una muestra para su utilización en un ensayo, que comprende las etapas siguientes: (a) añadir un polialquilenglicol y partículas magnéticas a una muestra para formar una mezcla, en el que las partículas magnéticas son capaces de unirse de manera no específica a los materiales que contienen proteínas contenidos en la mezcla, y en el que la mezcla presenta una concentración salina inferior o igual a aproximadamente 0, 2 M; (b) precipitar los materiales que contienen proteínas fuera de la mezcla cuando los materiales que contienen proteínas quedan unidos no específicamente a las partículas magnéticas, para formar un precipitado y un sobrenadante; (c) descartar el sobrenadante; y (d) aislar el precipitado para producir una muestra preparada.

Description

Procedimiento para la preparación de muestras de ensayo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una muestra para su utilización en un ensayo. Más particularmente, la presente invención se refiere a la utilización de un polialquilenglicol y de partículas magnéticas, y una concentración salina inferior o igual a aproximadamente 0,2 M, para la preparación de muestras para su utilización posterior en ensayos tales como los ensayos de hibridación y los inmunoensayos.

Antecedentes de la técnica

Se han utilizado partículas magnéticas acopladas a moléculas de unión específicas para la separación de moléculas pequeñas, macromoléculas, virus, bacterias y células de líquidos, mediante un procedimiento de unión específica. También se han utilizado partículas magnéticas sin ligantes específicos inmovilizados para separar ácidos nucleicos y virus, mediante un procedimiento de adsorción no específica (Lyle J. Arnold, Jr. et al., patente EP nº 0 281 390 B1, 1994; Bitton et al., "Removal of Escherichia coli bacteriophage T7 by Magnetic Filtration", Water Research 8:549, 1974; Warren, "New purification procedure for biological vaccines", Immunization Jap. Encephalitis conf., Hammon (editor), Williams & Williams, Baltimore, MD, páginas 152-154, 1972). Las partículas magnéticas presentan la ventaja de sedimentar por gravedad, mientras que la aplicación de un campo magnético sirve para acelerar este rápido proceso. De esta manera, la separación puede tener lugar en 1 ó 2 minutos, en lugar del procedimiento de centrifugación típico, de una hora de duración. Por desgracia, la adsorción no específica es excesivamente débil y no fiable cuando se utiliza con muestras biológicas, debido a la competición por los sitios de unión no específica por parte de macromoléculas no deseables y de moléculas pequeñas.

Los polialquilenglicoles, tales como el polietilenglicol (PEG) se han utilizado ampliamente para separar proteínas y virus de muestras biológicas (Fried et al., Enzymology 22:238, 1971). El PEG precipita proteínas mediante la unión al agua y excluyendo el agua que mantiene a las proteínas en solución. El tipo de proteína precipitada se determina a partir de la concentración de PEG. A concentraciones bajas, tales como del 4% p/v en combinación con concentraciones salinas de uno o dos molar, precipitan los virus y los bacteriófagos. Este es un procedimiento estándar para la separación y concentración de estos microorganismos. Este procedimiento también requiere habitualmente una incubación a 4ºC y la centrifugación posterior para sedimentar el precipitado (Yamamoto et al., Virology 40:734, 1971). La patente WO nº 2002/055727 da a conocer la purificación de ácidos nucleicos a partir de una muestra utilizando PEG como único reactivo.

La combinación de partículas magnéticas y PEG no es frecuente, aunque se ha sugerido para la separación mejorada de proteínas (Munro et al., Biotechnology Letters 3:297, 1981). La combinación se describe asimismo en la patente US nº 5.681.946 de Reeve para la unión no específica de bacteriófago y virus, y típicamente utiliza concentraciones salinas elevadas (por ejemplo cloruro sódico 2,5 M). La combinación se describe asimismo en la patente US nº 5.665.554 de Reeve et al., como reactivo de precipitación de ácidos nucleicos (por ejemplo polietilenglicol en cloruro sódico acuoso) para la recuperación de un material tal como ADN de plásmido, de una solución que contiene ADN genómico y residuos celulares. Aparentemente el bacteriófago, el virus y el ADN de plásmido que precipitan se adsorben fácilmente en un mecanismo no específico a las partículas magnéticas, permitiendo de esta manera la separación magnética más rápida y conveniente, sustituyendo a las técnicas de centrifugación estándar. Las separaciones indicadas anteriormente se han realizado con fines preparativos aunque no analíticos.

A pesar de los avances de la técnica, sigue existiendo una necesidad de mejores procedimientos analíticos. En particular, existe una necesidad de proporcionar procedimientos de ensayo y análisis más rápidos y exactos. La presente invención se dirige a estas necesidades proporcionando un procedimiento de preparación de muestras para la utilización en ensayos. La presente invención implica la utilización de combinaciones específicas de reactivos de un polialquilenglicol y partículas magnéticas que encuentran particular utilidad en aplicaciones analíticas, tales como la preparación de muestras que deben analizarse en inmunoensayos o en ensayos de hibridación. Al contrario que las soluciones de polialquilenglicol utilizadas en las separaciones anteriores de ácidos nucleicos y de proteínas, la invención utiliza un tampón de baja fuerza iónica. Inesperadamente, se ha descubierto que tanto la minimización como la omisión de la sal proporcionan mejores resultados experimentales, por ejemplo a elevadas concentraciones salinas el precipitado no se adhiere a las partículas magnéticas. Además, una menor concentración salina proporciona una muestra universal que puede utilizarse en una diversidad de ensayos.

Exposición de la invención

Un aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para preparar una muestra para la utilización en un ensayo, que comprende: (a) añadir un polialquilenglicol y partículas magnéticas a una muestra para formar una mezcla, en el que las partículas magnéticas son capaces de unión no específica a materiales que contienen proteínas contenidos dentro de la mezcla, y en el que la mezcla presenta una concentración salina inferior o igual a aproximadamente 0,2 M; (b) precipitar el material que contiene proteína de la mezcla cuando los materiales que contienen proteína quedan unidos no específicamente a las partículas magnéticas, formando un precipitado y un sobrenadante; (c) descartar el sobrenadante; y (d) aislar el precipitado, produciendo una muestra preparada.

Un aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para preparar una muestra de sangre para la utilización en una ensayo, que comprende las etapas siguientes: (a) añadir un polialquilenglicol y partículas magnéticas a una muestra de sangre para formar una mezcla, en la que las partículas magnéticas son capaces de unirse no específicamente a células contenidas en la mezcla, y en la que la mezcla presenta una concentración salina inferior o igual a aproximadamente 0,2 M; (b) precipitar las células fuera de la mezcla cuando las células quedan unidas no específicamente a las partículas magnéticas, formando un precipitado y un sobrenadante; (c) descartar el sobrenadante; y (d) aislar el precipitado para producir una preparación de muestra de sangre.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit que resulta útil para preparar muestras para la utilización en un ensayo, que comprende: (a) un polialquilenglicol; (b) partículas magnéticas que son capaces de unirse no específicamente a materiales que contienen proteínas dentro de las muestras; (c) sales a una concentración inferior o igual a aproximadamente 0,2 M; y (d) instrucciones para preparar las muestras.

Descripción detallada de la invención

La presente invención comprende un procedimiento y kits que resultan útiles en la preparación de muestras para la utilización en una diversidad de ensayos. La adición de un polialquilenglicol y partículas magnéticas a una muestra de sangre, bajo condiciones de baja concentración salina (concentración salina inferior o igual a aproximadamente 0,2 M), permite la unión no específica de células contenidas dentro de la solución de muestra, y la precipitación posterior de las células unidas. El sobrenadante se descarta y el precipitado se aisla y se utiliza inmediatamente en un ensayo o se almacena para su utilización posterior, bajo condiciones de almacenamiento apropiadas.

Una de las ventajas de este procedimiento de preparación es que proporciona un medio rápido para preparar muestras. Mediante la utilización de los procedimientos descritos en la presente memoria, las muestras pueden prepararse en cuestión de minutos, en comparación con las técnicas comunes de centrifugación, que pueden tardar hasta una hora o más, y eliminan la necesidad de costosos equipos de centrifugación. Otra ventaja es que las técnicas de separación magnética se automatizan con mayor facilidad.

Antes de describir las formas de realización detalladas de la invención, resulta útil proporcionar las definiciones que se utilizan en la descripción de la invención. Las definiciones proporcionadas se aplican únicamente a los términos tal como se utilizan en la presente patente y pueden no resultar aplicables en los mismos términos que los utilizados en otros sitios, por ejemplo en la literatura científica o en otras patentes o solicitudes, incluyendo solicitudes por los presentes inventores o asignadas a propietarios comunes. La descripción siguiente de las formas de realización preferidas y los ejemplos se proporcionan a título de explicación y de ilustración. Así, no deben contemplarse como limitativos del alcance de la invención tal y como está definido por las reivindicaciones, cuando se proporcionan los ejemplos, pretenden ser únicamente ejemplificativos y no limitativos. Por ejemplo, cuando se dice que un ejemplo "incluye" una característica específica, se pretende dar a entender que podría presentar la característica, pero no que el ejemplo se encuentra limitado a los que incluyen dicha característica.

Debe indicarse que, tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un material" incluye una mezcla de dos o más de estos materiales, la referencia a "un detergente" incluye las mezclas de dos o más de estos detergentes, y similares.

Al describir y reivindicar la presente invención, la terminología siguiente se utiliza de acuerdo con las definiciones indicadas a continuación.

El término "ensayo" se utiliza en la presente memoria para referirse a un ensayo in vitro llevado a cabo en una muestra biológica (típicamente sangre) para medir la presencia (cualitativa) o la concentración (cuantitativa) de un analito dado (material de interés) in vitro.

El término "célula" se utiliza en la presente memoria para referirse a células que se encuentran típicamente en la sangre, así como a las que se encuentran en pacientes infectados por un organismo vírico o bacteriano. Entre éstos se incluyen, a título de ilustración no limitativo, eritrocitos (glóbulos rojos), leucocitos (glóbulos blancos), incluyendo los leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) y los leucocitos mononucleares (monocitos y linfocitos), trombocitos (plaquetas), células inmunológicas o células de linaje comprometido, células cancerosas, células víricas y retrovíricas, bacteriófagos y otras células bacterianas, otras células patogénicas, etc.

La expresión "ensayo de hibridación" se utiliza en la presente memoria para referirse a un ensayo que utiliza una reacción de hibridación para medir la presencia o concentración de un analito polinucleótido dado. Entre los analitos polinucleótidos ejemplares se incluyen ácidos nucleicos, genes, cromosomas, plásmidos, genomas de bacterias, levaduras, virus, viroides, mohos, hongos, plantas, animales, seres humanos, y fragmentos de los mismos, etc. La expresión "ácido nucleico" incluye ADN (incluyendo ADNss, de cadena única, ADNds, de doble cadena, y ADNb, ramificado), ARN (incluyendo ARNt, ARNm y ARNr), ADN y ARN mitocondrial, ADN y ARN de cloroplasto, híbridos de ADN-ARN y mezclas de los mismos. Entre los ensayos de hibridación se incluyen, a título de ilustración no limitativo, ensayos de ADNb, reacción en cadena de la polimerasa y reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa, ensayos de hibridación de sándwich, amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos, ensayos de protección frente a ARNasa, secuenciación, ensayos de ligación, extensión de cebador, etc.

El término "inmunoensayo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un ensayo que utiliza una reacción inmunológica para medir la presencia o la concentración de un analito dado (por ejemplo de un antígeno). Entre los inmunoensayos se incluyen, a título de ilustración no limitativo, inmunoensayos ELISA de fase sólida, inmunoensayos competitivos, ensayos sándwich, radioinmunoensayos, inmunoensayos de fluorescencia, etc.

La expresión "unión no específica" se utiliza en la presente memoria para referirse a la unión no covalente de las partículas magnéticas a células contenidas dentro de una solución de muestra.

La expresión "materiales que contienen proteínas" se utiliza en la presente memoria para referirse a células, inmunoglobulinas, proteínas, enzimas, etc.

El término "muestra" se utiliza en la presente memoria para referirse a una muestra biológica que debe analizarse mediante un procedimiento de ensayo, y por lo tanto que resulta adecuada para la utilización en los procedimientos de la invención. La muestra se obtiene típicamente a partir de un individuo y, de esta manera, puede ser una muestra de tejido sólida (por ejemplo una muestra de tejido obtenida a partir de una biopsia), una muestra líquida (por ejemplo una muestra de sangre o de orina), o cualquier otro espécimen del paciente utilizado comúnmente en la comunidad médica, por ejemplo una muestra de cultivo celular o una muestra fecal. En algunas formas de realización de la invención la muestra líquida puede ser un líquido corporal, tal como líquido linfático, lisados celulares, leche, plasma, saliva, semen, suero, líquido medular, lágrimas, sangre completa, fracciones de sangre completa, muestras de heridas, las secciones externas de la piel, y las secreciones de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario. Preferentemente la muestra es una muestra de tejido, una muestra de sangre completa, una muestra de glóbulos blancos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de cultivo celular, una muestra fecal o una muestra de orina.

Procedimientos de preparación de muestras

Una forma de realización de la invención consiste en un procedimiento para preparar una muestra para la utilización en un ensayo, que comprende:

(a): añadir un polialquilenglicol y partículas magnéticas a una muestra para formar una mezcla, en la que las partículas magnéticas son capaces de unirse no específicamente a materiales que contienen proteínas contenidas dentro de la mezcla y en la que la mezcla presenta una concentración salina inferior o igual a aproximadamente 0,2 M;

(b): precipitar los materiales que contienen proteínas fuera de la mezcla cuando los materiales que contienen proteínas quedan unidos no específicamente a las partículas magnéticas, para formar un precipitado y un sobrenadante;

(c): descartar el sobrenadante; y

(d): aislar el precipitado para producir una muestra preparada.

Pueden utilizarse numerosos polialquilenglicoles en los procedimientos de la invención, e incluyen, a título ilustrativo no limitativo, polietilenglicoles, polipropilenglicoles y polibutilenglicoles, así como las combinaciones de los mismos. Los polialquilenglicoles preferidos son los polímeros de polietilenglicol (PEG), que son productos de condensación de etilenglicol y presentan la fórmula general: HO-(CHSCHS-O)x-H. PEG se encuentra disponible fácilmente de numerosas fuentes comerciales y típicamente se comercializa como mezcla de polímeros de PEG de pesos moleculares variables. El PEG con un peso molecular medio comprendido en el intervalo entre aproximadamente 300 y 30.000 resulta particularmente adecuado para la utilización en los procedimientos de la invención, más específicamente de entre 2.000 y 15.000, siendo particularmente preferentes los pesos moleculares particulares de aproximadamente 8.000.

Existen numerosas partículas magnéticas que resultan adecuadas para la utilización en los procedimientos y kits de la invención, e incluyen partículas paramagnéticas y perlas magnéticas de látex.

Las partículas o perlas magnéticas se encuentran disponibles comercialmente de fuentes tales como PerSeptive Biosystems, Inc. (Framingham, ME), Bayer Diagnostics (Medfield, MA), Bangs Laboratories (Carmel, IN) y BioQuest, Inc. (Atkinson NH). Entre los materiales ejemplares se incluyen hierro, óxido de hierro, nitruro de hierro, carburo de hierro, níquel y cobalto, así como mezclas y aleaciones de los mismos.

Las perlas magnéticas de látex se encuentran disponibles comercialmente de una fuente tal como Seradyne.

Las partículas magnéticas presentan típicamente un diámetro medio de aproximadamente 0,1 a 100 \mum de diámetro, preferentemente de aproximadamente 1 a 50 \mum, más preferentemente de aproximadamente 1 a 5 \mum. La forma de las partículas magnéticas comúnmente es esférica, aunque también pueden utilizarse partículas de otras configuraciones, irregulares, de bastón, etc.

Aunque la concentración salina es preferentemente inferior o igual a aproximadamente 0,2 M, puede resultar deseable utilizar una concentración salina inferior o igual a aproximadamente 0,125 M. Típicamente, el procedimiento opera dentro de parámetros aceptables presentando una concentración salina comprendida dentro del intervalo entre aproximadamente 0,01 y 0,10 M. Entre las sales típicas se incluyen, a título ilustrativo no limitativo, NaCl, mgCl_{2}, LiCl, KCl, etc.

La etapa de precipitación puede realizarse por gravedad únicamente, al sedimentar los complejos de material que contiene proteína-partícula magnética. Puede resultar deseable facilitar la velocidad de este proceso mediante la aplicación de un campo magnético al fondo del recipiente de reacción. De esta manera, el precipitado puede aislarse permitiendo que los complejos de partícula magnética sedimenten por gravedad o con la aplicación de un campo magnético en algún punto durante la etapa de sedimentación. En otra forma de realización, se aplica un campo magnético mientras se descarta el sobrenadante, con el fin de maximizar la cantidad de precipitado aislado.

A continuación, la muestra preparada puede utilizarse inmediatamente en un ensayo, o puede almacenarse para su utilización posterior, bajo condiciones de almacenamiento apropiadas.

Cuando la muestra preparada se almacena para su utilización posterior, no resulta necesario ningún procesamiento adicional. Tras descartar el sobrenadante y aislar el precipitado para producir la muestra preparada, la muestra se congela. Las condiciones de almacenamiento típicas se encuentran a temperaturas comprendidas en el intervalo entre +4ºC y -80ºC. La condición de almacenamiento preferida es a una temperatura comprendida en el intervalo entre -20ºC y -80ºC, durante hasta seis meses o más.

Cuando la muestra preparadas debe utilizarse inmediatamente en un ensayo, puede resultar deseable procesar adicionalmente la muestra, típicamente para separar los materiales que contienen proteína de las partículas magnéticas. De acuerdo con ello, otra forma de realización del procedimiento de la invención comprende además las etapas siguientes:

(e): disolver la muestra preparada en una solución para formar una mezcla de materiales que contienen proteína no unida y partículas magnéticas;

(f): aplicar un campo magnético a la mezcla para eliminar las partículas magnéticas;

(g): recoger los materiales que contienen proteína para formar una preparación de muestra aislada.

La solución utilizada en esta etapa de disolución puede ser una solución tampón estándar o una solución de lisis. La selección del tipo de solución dependerá de si resulta deseable mantener la integridad de cualquier materia celular en los materiales que contienen proteína (por ejemplo para la utilización en un inmunoensayo), o si resulta deseable romper las células para liberar cualquier ADN o ARN contenido en las mismas (por ejemplo para la utilización en un ensayo de hibridación).

El procedimiento también puede implicar la adición de un detergente, que puede ser catiónico, aniónico, iónico, etc. Resultan preferidos los detergentes catiónicos y entre los detergentes catiónicos ejemplares se incluyen, a título ilustrativo no limitativo, las sales cuaternarias de amonio, tales como el bromuro de cetil trimetilamonio y la sal de octadecil trimetilamonio. El detergente puede encontrarse presente a una concentración comprendida en el intervalo entre aproximadamente 1 y 10 mM.

Debido a que es conocido que los virus se encuentran asociados a diversas proteínas dentro de las muestras, la inclusión de un detergente en la etapa de precipitación facilita una liberación más eficiente de los virus (y ácidos nucleicos posteriores) de estas proteínas unidas, haciendo que resulten accesibles en el ensayo de hibridación de ADNb. La inclusión de detergente únicamente en el ensayo de ADNb no produjo señales más altas que en el control, sugiriendo que este detergente no acelera la reacción de hibridación (Pontius y Berg, 1991). Además, se utilizó una reacción de hibridación de 16 a 18 horas en el protocolo de ensayo de ADNb, eliminando de esta manera cualquier aceleración potencial de la hibridación.

En una forma de realización preferida de la invención, la muestra es una muestra de sangre y el procedimiento para preparar una muestra de sangre para la utilización en un ensayo comprende las etapas siguientes:

(a): añadir un polialquilenglicol y partículas magnéticas a una muestra de sangre para formar una mezcla, en la que las partículas magnéticas son capaces de unión no específica a las células contenidas en la mezcla y en la que la mezcla presenta una concentración salina inferior o igual a aproximadamente 0,2 M;

(b): precipitar las células fuera de la mezcla cuando las células quedan unidas no específicamente a las partículas magnéticas, formando un precipitado y un sobrenadante;

(c): descartar el sobrenadante; y

(d): aislar el precipitado para producir una preparación de muestra de sangre.

La muestra de sangre preparada puede almacenarse o tratarse adicionalmente tal como se ha indicado anteriormente, para su utilización inmediata en un ensayo.

Inmunoensayos

La invención resulta de particular utilidad como procedimiento de preparación de muestras para inmunoensayos. En estos casos, el analito es típicamente una proteína. Puede utilizarse cualquier inmunoensayo conocido en la técnica que pueda detectar proteínas.

En general, los inmunoensayos implican técnicas que hacen uso de la unión específica entre un epítopo en una molécula y su anticuerpo homólogo con el fin de identificar, y preferentemente cuantificar, una sustancia en una muestra. De esta manera, los inmunoensayos utilizados para medir marcadores de proteína hacen uso de la unión específica entre el marcador de proteína y un anticuerpo correspondiente dirigido contra el marcador de proteína. Un procedimiento para detectar los marcadores de proteína implica colocar la muestra sobre un portaobjetos, añadir un anticuerpo apropiadamente marcado, lavar el anticuerpo marcado no unido, y visionar la muestra con un dispositivo apropiado, por ejemplo un microscopio, para la presencia de proteína unida.

Otro tipo de inmunoensayo implica anticuerpos unidos a una fase sólida dirigidos contra un marcador de proteína particular que se ponen en contacto con el espécimen del paciente con el fin de inmovilizar el marcador de proteína particular. Tras lavar la proteína no unida, un segundo anticuerpo marcador dirigido contra un epítopo diferente sobre el marcador de proteína se pone en contacto con la proteína inmovilizada. El anticuerpo marcado se detecta y se cuantifica. Los inmunoensayos específicos son bien conocidos por los expertos ordinarios en la materia. Por ejemplo, los inmunoensayos enzimáticos, tales como un ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) utilizan un enzima como marcaje detectable.

Los anticuerpos específicos para el analito proteína pueden encontrarse disponibles comercialmente o producirse utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como la producción monoclonal o policlonal de anticuerpos. Por ejemplo, se inyecta una proteína en un huésped (por ejemplo un conejo o un ratón) y se extirpa el bazo varias semanas después. En presencia de etilenglicol, se añaden células de bazo del huésped a células de mieloma que carecen de hipoxantina-guanosina fosfotibosil transferasa (HGPRT). En un medio que contenga hipoxantina, aminopterina y timina, sólo sobreviven las células fusionadas, debido a que las células de bazo no fusionadas no crecen in vitro y las células de mieloma no fusionadas no pueden crear nuevos nucleótidos en el medio sin HGPRT. A continuación, las células fusionadas pueden someterse a ensayo para la producción del anticuerpo deseado y separarse y cultivarse posteriormente. El resultado es un suministro de anticuerpos dirigidos contra la proteína. Dependiendo del diseño del ensayo, los anticuerpos pueden marcarse previamente a su utilización.

Ensayos de hibridación

La invención resulta asimismo de utilidad como procedimiento de preparación de muestras para ensayos de hibridación, tales como los ensayos de AND de cadena ramificada (ADNb) y los ensayos de reacción en cadena de transcriptasa inversa-polimerasa (RT-PCR). Estos ensayos son bien conocidos en la técnica y típicamente se llevan a cabo utilizando kits disponibles comercialmente. Por ejemplo, un ensayo RT-PCR para detectar la presencia de ARN de HCV es el ensayo Amplicor HCV Monitor (Roche Diagnostics, Molecular Systems Division, Nutley, NJ), mientras que un ensayo de ADNb para el ARN de HCV es el ensayo Quantiplex HCV-RNA 2.0 (Bayer Diagnostics).

La hibridación de ácidos nucleicos es un procedimiento bien conocido para identificar secuencias específicas de ácidos nucleicos o de polinucleótidos. En general, la hibridación se basa en el apareamiento entre cadenas complementarias de ácidos nucleicos. Pueden utilizarse oligonucleótidos de cadena única con secuencias conocidas como sondas para identificar secuencias diana de analitos ácidos nucleicos, mediante la exposición de las sondas a soluciones de muestra que contienen los analitos ácidos nucleicos e interés. Si un analito ácido nucleico se hibrida con una sonda, el analito contiene necesariamente la secuencia diana. Se han estudiado en detalle diversos aspectos de este procedimiento. En esencia, todas las variaciones de los ensayos de hibridación permiten el apareamiento de secuencias de bases complementarias y la formación de moléculas de doble cadena, y se entiende que los procedimientos de la invención pueden utilizarse en todos los tipos de ensayo de hibridación. Se proporcionan detalles de algunos de estos ensayos a continuación.

Ensayos de hibridación sándwich

Los ensayos de hibridación sándwich son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes US nº 5.124.246, nº 5.710.264 y nº 5.849.481 de Urdea et al. En resumen, se pone en contacto una muestra, tal como un espécimen de paciente, con sondas de oligonucleótidos bajo condiciones de hibridación. A continuación, las sondas de oligonucleótidos se hibridan con cualquier ARNm de interés que se encuentre presente en la muestra. Las sondas típicamente se inmovilizan sobre un sustrato de manera que se captura o se inmoviliza el ARNm complementario. La muestra permanece en contacto con las sondas de oligonucleótidos unidas a sustrato durante un periodo de tiempo suficiente para garantizar que la hibridación con las sondas de oligonucleótidos se ha completado. Un experto en la materia puede determinar los tiempos de "incubación" necesarios, aunque es típico un tiempo comprendido entre aproximadamente 0,25 horas y aproximadamente 3,0 horas. Tras transcurrir un tiempo de incubación suficiente, la muestra se lava con una solución de lavado adecuada con el fin de eliminar el material no hibridado. Las técnicas de lavado son bien conocidas y/o pueden ser fácilmente determinadas por un experto ordinario en la materia. Típicamente, se utiliza un líquido de lavado que comprende una solución tampón y posiblemente un detergente. La solución tampón puede ser cualquier solución convencional conocida en la técnica que resulte adecuada para eliminar el material no hibridado, y con frecuencia contiene una o más sales de metales alcalinos, tales como cloruro sódico y citrato sódico o combinaciones de los mismos. El detergente puede ser cualquier detergente que resulte adecuado para lavar sondas de oligonucleótidos no unidas, tales como detergentes no iónicos basados en polioxietileno comercializados bajo las denominaciones comerciales Brij®, Triton®, Tween®, Genapol®, Igepal Ca®, Thesit y Lubrol®. Todos ellos se encuentran disponibles comercialmente de suministradores comerciales, tales como Sigma Corp. (St. Louis, MO). Uno o más lavados se llevan a cabo a temperaturas comprendidas en el intervalo entre aproximadamente 21ºC y 60ºC. Óptimamente la etapa de lavado se lleva a cabo a temperatura ambiente.

Reacción en cadena de transcriptasa inversa-polimerasa

Los ensayos de hibridación de reacción en cadena de transcriptasa inversa-polimerasa (RT-PCR) implican preparar ADNc basado en cualquier ARNm presente en una muestra, seguido de la medición. Estas técnicas son bien conocidas en la materia. Generalmente, se añade a la muestra un exceso de las cuatro moléculas de desoxinucleótido trifosfato (es decir, desoxiadenosina trifosfato, desoxicitidina trifosfato, desoxitimidina trifosfato y desoxiguanosina trifosfato) y un cebador, es decir un cebador oligodT. Tras la separación de la cadena de ARNm (mediante la desnaturalización en un medio básico, por ejemplo), el oligonucleótido resultante es un ADN de cadena única complementario a la secuencia de ARNm original. A continuación, puede añadirse una ADN polimerasa en presencia de un exceso de las cuatro moléculas de desoxinucleótido trifosfato y un cebador para crear ADN de doble cadena. Se proporcionan detalles adicionales en Gerard et al., Mol. Biotechnol. 8(1):61-77, 1997, y Ando et al., J. Clin. Microbiol. 35(3):570-577, 1997. A continuación, el ADN de doble cadena puede desnaturalizarse en ADN de cadena única, en el que una de las dos cadenas es esencialmente un ADN correspondiente al ARNm original. El ADN, sin embargo, es menos susceptible a la degradación y, por lo tanto, puede utilizarse como sustituto más estable del ARNm para determinar la cantidad del ARNm en la muestra. Son conocidos una diversidad de procedimientos para detectar ADN, y pueden utilizarse para detectar y para determinar la cantidad del ARNm correspondiente originalmente contenido en la muestra. Tal como se apreciará, muchos de los procedimientos para detectar y para medir ARNm descritos en la presente memoria pueden adaptarse para detectar y medir ADN.

Amplificación mediada por transcripción

Los ensayos de amplificación mediada por transcripción (TMA) son similares a los ensayos de RT-PCR en los que la transcriptasa inversa se añade a la muestra para crear ADNc del ARNm diana. Sin embargo, en la TMA, se añade una ARN polimerasa para sintetizar amplicones de ARN utilizando ADNc como molde. Cada uno de los amplicones nuevamente sintetizados reentra en el procedimiento de TMA y sirve como molde para una nueva ronda de replicación. De esta manera, el procedimiento de TMA resulta en una amplificación efectiva del ARNm. A continuación, se detectan los amplicones de ARN y se miden mediante sondas marcadas complementarias a los amplicones de ARN. En la literatura se describen ensayos similares basados en la TMA (ver, por ejemplo, Pasternack et al., J. Clin. Microbiol. 35(3):676-678, 1997).

Amplificación basada en la secuencia de los ácidos nucleicos

La amplificación basada en la secuencia de los ácidos nucleicos o NASBA® es un procedimiento de amplificación homogéneo. El procedimiento implica la adición de tres enzimas (transcriptasa inversa, ARNasa H y ARN polimerasa de T7) y dos cebadores a un solo recipiente de reacción que contiene ARNm de la muestra. El primer cebador contiene una secuencia 3' terminal que es complementaria a una secuencia en el ARNm y una secuencia 5' terminal que resulta reconocida por la ARN polimerasa de T7. En combinación, estos reactivos resultan en la síntesis de múltiples copias de ARNm que seguidamente pueden medirse a continuación mediante la adición de una sonda marcada apropiadamente. Este tipo de ensayo es bien conocido en la técnica y se describe en, por ejemplo, Davey et al., patente EP nº
0329822.

Ensayo de protección frente a ARNasa

En los ensayos de protección frente a ARNasa, se añade una sonda de oligonucleótido marcada a la muestra, resultando en la hibridación entre la sonda marcada y cualquier ARNm complementario. A continuación, la muestra se trata con ARNasa para degradar la totalidad del ARNm de cadena única remanente. Las partes hibridadas de la sonda se encontrarán protegidas frente a la digestión. Los fragmentos no hibridados pueden separarse de los complejos hibridados más grandes que portan un marcaje mediante, por ejemplo, electroforesis. A continuación, puede medirse el marcaje. Si la sonda se añade en un exceso molar, por ejemplo un exceso molar de por lo menos el doble con respecto al ARNm, la señal resultante es proporcional a la cantidad de ARNm en la muestra.

Ensayos de ADN ramificado

El ADN ramificado (ADNb) se describe en detalle en Urdea et al., Gene 61:253-264, 1987. Otros ADNb ejemplares se describen en la patente US nº 4.868.105 de Urdea et al., patente US nº 5.124.246 de Urdea et al., patente US nº 5.132.204 de Urdea et al., patente US nº 5.635.352 de Urdea et al., y patente US nº 5.681.702 de Collins et al. El Ejemplo 3 ilustra uno de estos protocolos.

Kits

Otra forma de realización de la invención es un kit que resulta útil en la preparación de muestras para la utilización en un ensayo, que comprende:

(a): un polialquilenglicol;

(b): partículas magnéticas que son capaces de unirse no específicamente a materiales que contienen proteína contenidos en las muestras;

(c): sales a una concentración inferior o igual a aproximadamente 0,2 M; y

(d): instrucciones para la preparación de las muestras.

Otros materiales que resultan útiles en la ejecución de los ensayos también pueden incluirse en los kits, incluyendo probetas, imanes, pipetas de transferencia, y similares. Los kits pueden contener reactivos, sondas de ácidos nucleicos, analito marcado y estándares. Los kits pueden contener materiales suficientes para un ensayo, o pueden contener materiales suficientes para múltiples ensayos, por ejemplo en un solo kit pueden proporcionarse materiales para 10, 25, 50 o más ensayos. Los kits también pueden incluir instrucciones para la utilización de uno o más de estos reactivos en cualquiera de los ensayos descritos en la presente memoria.

Ejemplos

La práctica de la presente invención utiliza, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de formulación farmacéutica, química médica, y similares, que se encuentran dentro de los conocimientos del experto en la materia. Estas técnicas se explican exhaustivamente en la literatura. La preparación de diversos tipos de formulaciones farmacéuticas se describe, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, decimonovena edición, 1995, citada supra, y en Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6a edición (Media, PA: Williams & Wilkins, 1995).

Los ejemplos siguientes se proporcionan para proporcionar a los expertos ordinarios en la materia una exposición y descripción completas de cómo preparar y utilizar los compuestos de la invención, y no pretenden limitar el alcance de los que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud de los datos numéricos (por ejemplo cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, la temperatura se indica en ºC y la presión es la atmosférica o aproximadamente la atmosférica. La totalidad de los componentes se obtuvieron comercialmente a menos que se indique lo contrario.

Abreviaturas

ADNb	ADN de cadena ramificada
BGG	globulina gamma bovina
DS	dextrán sulfato
HBV	virus de la hepatitis B
HCV	virus de la hepatitis C
VIH	virus de la inmunodeficiencia humana
Meq	millones de equivalentes
MLP	partículas magnéticas de látex
PBMC	célula mononuclear de sangre periférica
PBS	solución salina tamponada con fosfato
PBS/Tx-100	solución de Dulbecco IX, Tx-100 al 0,1%
PEG	polietilenglicol
PMP	partículas paramagnéticas
SA	estreptavidina

Ejemplo 1 Adsorción incrementada de proteínas precipitadas con PEG a partículas magnéticas en medio de baja concentración salina A. Separación de BGG-PEG/NaCl

Se preparó una solución de BGG agregado por calor en PBS mediante calentamiento de la BGG a 60ºC durante 20 minutos. La solución presentaba una densidad óptica inicial (280 nm) de 0,362, y adquirió una turbidez elevada al añadir 0,15 ml de PEG al 17,2% (vol./vol.) más NaCl 3 M a 0,5 ml de solución de proteína. La mezcla turbia se enfrió a continuación durante 30 minutos sobre hielo y se centrifugó durante 20 minutos a 2.000 rpm para sedimentar la proteína precipitada. Este procedimiento clarificó por completo la solución y la densidad óptica se redujo a 0,03, indicando la eliminación de la mayor parte de la BGG de la solución.

B. Separación de BGG-PEG/NaCl y PMP

Se repitió el experimento de separación de BGG, excepto en que se omitió el NaCl de la solución de PEG. Inicialmente se desarrolló el mismo grado de turbidez, y al añadir 1 mg de PMP, una separación magnética clarificó por completo la solución. Esto indicaba que, en ausencia de sal, la proteína precipitada se había adherido a PMP más eficientemente.

Se llevó a cabo un experimento similar utilizando 20 sueros humanos diferentes en lugar de BGG agregado por calor. En la totalidad de estos sueros, la clarificación de turbidez inducida por PEG resultó más eficiente en ausencia del NaCl. La clarificación se consiguió utilizando PMP o MLP (Seradyne).

Los experimentos posteriores de ensayo de ADNb para HCV y VIH indicaron que la sensibilidad era 3 a 5 veces superior con mezclas de PEG/PMP que contenían NaCl 0,01 a 0,10 M en comparación con NaCl 1 M.

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Ejemplo 2 A. Ensayo de hibridación de ADNc de virus de la hepatitis B: evaluación de la concentración vírica utilizando PEG/PMP con y sin mgCl_{2} y dextrán sulfato; liberación con PBS/Tx-100 y solución de lisis i. Protocolo de captura y liberación

Se mezcló una muestra de 500 \mul de suero con 150 \mul de solución de PEG/PMP (1 mg de PMP, PEG al 17,2% (vol./vol.)). La mezcla se mezcló con vórtex y se separó el precipitado. Se separaron 100 \mul de sobrenadante y se conservaron para la determinación de la fracción no unida. Se transfirieron 10 \mul del sobrenadante a una placa al transferir el virus liberado a la placa. El resto del sobrenadante se separó y se descartó.

Al precipitado se añadieron 150 \mul de solución de lisis o de PBS/Tx-100, se mezcló con vórtex y se incubó a 63ºC durante 30 minutos. Se separó el PMP. Se transfirieron 10 \mul del virus liberado a la placa.

ii. Cuantificación

A continuación, se llevó a cabo el ensayo del ADNb siguiendo el protocolo del fabricante. El kit de HBV utilizado era el MM11225 (Bayer Diagnostics). La entrada de suero positivo fue de 375 Meq/muestra. El tampón A era PBS/Tx-100. El tampón B era una solución de lisis.

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TABLA 1 Fracción no unida

1

TABLA 2 Fracción liberada

2

B. Ensayo de hibridación de ADNc del virus de la hepatitis B con etapa de concentración: evaluación de 4 concentraciones de dextrán sulfato en reactivo de precipitación de PEG/PMP y efecto del pH sobre el aliente de liberación de PBS/Tris/Tx-100

La composición de PBS/Tris utilizada era fosfato sódico 50 mM, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, ácido etilendiaminatetracético 1 mM, sal tetrasódica y NaN_{3} al 0,02%.

TABLA 3 Concentraciones de PEG y de D (% vol./vol.)

3

* también se encontraba presente 1 mg de NH_{2}-PMP/500 \mul de suero

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TABLA 4 Entrada de dextrán sulfato (%)

4

Ejemplo 3 Ensayo de hibridación de ADNb del virus de la hepatitis C A. Captura de HCV utilizando NH_{2}-MLP, NH_{2}-PMP y el protocolo de precipitación con BGG-PMP/PEG

Se utilizaron las tres fases sólidas siguientes (cantidades de 50 mg/mi): NH_{2}-MLP (preparado mediante el acoplamiento de bis-amina con COOH MLP (Seradyne)), BGG-PMP y NH_{2}-PMP.

TABLA 5 Protocolo de precipitación con PEG/PMP o con MLP

5

El suero se volvió turbio al añadir PEG debido a que la proteína precipitó en la solución. Se separó el precipitado (fase sólida). Se transfirieron 50 \mul de muestra pura y 50 \mul de dilución 10X (25 \mul + 225 \mul de suero negativo) a la placa de ADNb. El resto del sobrenadante se separó y se descartó.

Para las muestras sin transferencia de fase sólida, se introdujeron 125 \mul de la muestra más 375 \mul de la solución de lisis en un tubo Eppendorf y se incubaron a 53ºC durante 1 hora. A continuación se transfirieron 150 \mul a la placa.

Se añadieron 500 \mul de reactivo de lisis a las fases sólidas y después se transfirieron a tubos Eppendorf y se incubaron a 53ºC durante 60 minutos en una microcentrífuga de Eppendorfs. A continuación, se separó la fase sólida. Se transfirieron 150 \mul de muestra pura y 150 \mul de dilución 1OX (50 \mul + 400 \mul de solución de lisis) a la placa de ADNb. A continuación, se llevó a cabo el ensayo de ADNb siguiendo el protocolo del fabricante. El kit de HCV utilizado era el kit de ADNb 2,0 de HCV denominado MM833 (Bayer Diagnostics).

TABLA 6 ARN restante en suero tras el tratamiento

6

TABLA 7 ARN liberado de la superficie de la fase sólida

7

B. Captura de HCV utilizando PMP anticubierta o antinúcleo o precipitación con PEG/PMP TABLA 8 Protocolo de precipitación con PEG/PMP

8

El suero adquirió turbidez al añadir PEG a medida que la proteína precipitaba de la solución. Se separó el precipitado (fase sólida). Se transfirieron 50 \mul de solución pura y 50 \mul de dilución 10X (25 \mul + 225 \mul de suero negativo) a la placa de ADNb. A continuación, se llevó a cabo el ensayo de ADNb siguiendo el protocolo del fabricante.

TABLA 9 ARN restante en suero tras el tratamiento

9

Ejemplo 4 Ensayos celulares

Se aplicaron los mismos procedimientos descritos anteriormente a células cultivadas (Jurkat) y a glóbulos blancos, y se realizaron recuentos del número de células capturadas mediante microscopía. Ambos tipos de células resultaron capturados con un rendimiento superior al 90%.

A. Purificación de PBMC a partir de 1 ml de sangre completa: materiales/métodos

Materiales: 1 ml de sangre completa; 300 \mul de PMP/PEG (3,33 mg de PMP/PEG al 8,75%); agua Milli-Q, 10 x PBS y 1 x PBS y sangre completa sobre hielo.

Se resuspendieron 5 ml de sangre completa en 45 ml de agua Milli-Q, y se invirtieron durante aproximadamente 30 segundos. Se añadieron 5 ml de 10 x PBS. La mezcla se sometió a centrifugación a 1.000 g durante 10 minutos y el sobrenadante se extrajo por aspiración. El lavado se repitió con 50 ml de 1 x PBS, y después se resuspendió en 5 ml de 1 x PBS, proporcionando la suspensión celular. Se preparó una alícuota de control introduciendo 1 ml de suspensión celular en tubos Eppendorf de 1,5 ml (mantenidos en hielo). Se añadió 1 ml de suspensión celular a 300 \mul del reactivo PMP/PEG, y la mezcla se invirtió 5 veces. A continuación, la mezcla se colocó sobre imanes y se separó durante 5 minutos. Se separó el sobrenadante y se introdujo en tubos Eppendorf de 1,5 ml. Los tubos Eppendorf de control y de muestra se sometieron a centrifugación durante 10 minutos a 2.000 g en una centrífuga de Eppendorfs. El líquido se separó por aspiración y el pellet se resuspendió en 100 \mul de PBS.

B. Evaluación del método: recuentos de células viables

Se introdujeron 10 \mul de azul de tripán (al 4%) en un tubo Eppendorf. SE añadieron 10 \mul de las células resuspendidas. Se contó el número de células viables en un hemocitómetro (4 matrices o 200 células). El control (diluido 1:100 en PBS), 10(x100) células/4 matrices x 10^{4} presentaba un recuento de células viables de 2.500.000 células/ml. No se observaron células viables en el sobrenadante de PMP/PEG. De esta manera, el tratamiento de PMP/PEG de la invención tuvo éxito en la eliminación de la totalidad de las células de la muestra.

Ejemplo 4 Detección de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH) de PBMC lisadas hipotónicamente con PMP/PEG

Se utilizó un ensayo de ADNb para GAPDH, un gen de mantenimiento observado en las células, para realizar el seguimiento de la linealidad de la concentración de la muestra de PMP/PEG. Se diluyó en 1 x PBS en las proporciones mostradas posteriormente un ml de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) preparadas hipotónicamente (5,5 x 10^{4} células/ml) o sangre completa (WB), y se concentró mediante el procedimiento de PMP/PEG tal como se ha descrito. La muestra concentrada resultante se analizó en un ensayo de ADNb para GAPDH. Tal como se muestra posteriormente, las proporciones de señal/ruido (S/N) son lineales hasta la dilución más baja ensayada, tanto con PBMCs como con sangre completa, demostrando la amplia aplicabilidad de este procedimiento de preparación de muestras con sangre completa, cultivos celulares, etc.

TABLA 10 Valores de S/N en ADNb de GAPDH procedente de PBMC y sangre completa concentrados con PMP/PEG

10

Claims

1. Procedimiento para la preparación de una muestra para su utilización en un ensayo, que comprende las etapas siguientes:

(a): añadir un polialquilenglicol y partículas magnéticas a una muestra para formar una mezcla, en el que las partículas magnéticas son capaces de unirse de manera no específica a los materiales que contienen proteínas contenidos en la mezcla, y en el que la mezcla presenta una concentración salina inferior o igual a aproximadamente 0,2 M;

(c): descartar el sobrenadante; y

(d): aislar el precipitado para producir una muestra preparada.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además las etapas siguientes:

(e): disolver la muestra preparada en una solución para formar una mezcla de los materiales no unidos que contienen proteínas y las partículas magnéticas;

(f): aplicar un campo magnético a la mezcla para separar las partículas magnéticas;

(g): recoger los materiales que contienen proteínas para formar una muestra preparada aislada.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la muestra es una muestra de tejido, una muestra de sangre completa, una muestra de glóbulos blancos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de células cultivadas, una muestra fecal, o una muestra de orina.

4. Procedimiento para la preparación de una muestra de sangre para su utilización en un ensayo, que comprende las etapas siguientes:

(a): añadir un polialquilenglicol y partículas magnéticas a una muestra de sangre para formar una mezcla, en el que las partículas magnéticas son capaces de unirse de manera no específica a las células contenidas en la mezcla y en el que la mezcla presenta una concentración salina inferior o igual a aproximadamente 0,2 M;

(b): precipitar las células fuera de la mezcla cuando las células quedan unidas no específicamente a las partículas magnéticas, para formar un precipitado y un sobrenadante;

(c): descartar el sobrenadante; y

(d): aislar el precipitado para producir una muestra de sangre preparada.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, que comprende además las etapas siguientes:

(e): disolver la muestra de sangre preparada en una solución para formar una mezcla de las células sanguíneas no unidas y las partículas magnéticas;

(g): recoger las células sanguíneas para formar una muestra de sangre preparada aislada.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de precipitación comprende además la aplicación de un campo magnético.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polialquilenglicol es el polietilenglicol.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solución es una solución tampón.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solución es una solución de lisis.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla presenta una concentración salina inferior o igual a aproximadamente 0,125 M.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la mezcla presenta una concentración salina comprendida en el intervalo entre aproximadamente 0,01 y 0,10 M.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sal se selecciona de entre el grupo constituido por NaCl, MgCl_{2}, LiCl y KCl.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla comprende además un detergente.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el detergente se encuentra presente a una concentración de aproximadamente 1 a 10 mM.

15. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que el detergente es un detergente catiónico.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el detergente catiónico es una sal amónica cuaternaria.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la sal amónica cuaternaria se selecciona de entre el grupo constituido por bromuro de cetiltrimetilamonio y sal octadeciltrimetilamonio.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las partículas magnéticas están compuestas por un material seleccionado de entre el grupo constituido por hierro, óxido de hierro, nitruro de hierro, carburo de hierro, níquel y cobalto, y mezclas y aleaciones de los mismos.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las partículas magnéticas son partículas paramagnéticas o partículas magnéticas de látex.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las partículas magnéticas presentan un diámetro medio comprendido en el intervalo entre aproximadamente 0,1 y 100 \mum.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que las partículas magnéticas presentan un diámetro medio comprendido en el intervalo entre aproximadamente 1 y 50 \mum.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que las partículas magnéticas presentan un diámetro medio comprendido en el intervalo entre aproximadamente 1 y 5 \mum.

23. Procedimiento según la reivindicación 1 y según cualquiera de las reivindicaciones subordinadas a la misma, en el que los materiales que contienen proteínas se seleccionan de entre el grupo constituido por células, inmunoglobulinas, proteínas y enzimas.

24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra preparada resulta adecuada para la utilización en un ensayo de hibridación.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las partículas magnéticas se encuentran recubiertas.

26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra preparada resulta adecuada para la utilización en un inmunoensayo.

27. Kit que resulta útil en la preparación de muestras para la utilización en un ensayo, que comprende:

(a): un polialquilenglicol;

(b): las partículas magnéticas que son capaces de unirse de manera no específica a los materiales que contienen proteínas en las muestras;

(c): una sal que presenta una concentración inferior o igual a aproximadamente 0,2 M; y

(d): las instrucciones para la preparación de las muestras.

28. Kit según la reivindicación 27, en el que el polialquilenglicol es el polietilenglicol.

29. Kit según la reivindicación 27 ó 28, que comprende además una solución tampón.

30. Kit según la reivindicación 27 ó 28, que comprende además una solución de lisis.

31. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, en el que la sal presenta una concentración inferior o igual a aproximadamente 0,125 M.

32. Kit según la reivindicación 31, en el que la sal presenta una concentración comprendida en el intervalo entre aproximadamente 0,01 y 0,10 M.

33. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, en el que la sal se selecciona de entre el grupo constituido por NaCl, MgCl_{2}, LiCl y KCl.

34. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, que comprende además un detergente.

35. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 34, en el que el detergente es un detergente catiónico.

36. Kit según la reivindicación 35, en el que el detergente catiónico es una sal amónica cuaternaria.

37. Kit según la reivindicación 36, en el que la sal amónica cuaternaria se selecciona de entre el grupo constituido por bromuro de cetiltrimetilamonio y sal octadeciltrimetilamonio.

38. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 37, en el que las partículas magnéticas están compuestas por material seleccionado de entre el grupo constituido por hierro, óxido de hierro, nitruro de hierro, carburo de hierro, níquel y cobalto, y mezclas y aleaciones de los mismos.

39. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 38, en el que las partículas magnéticas son partículas paramagnéticas o partículas magnéticas de látex.

40. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 39, en el que las partículas magnéticas presentan un diámetro medio comprendido en el intervalo entre aproximadamente 0,1 y 100 \mum.