ES2273482T3 - Composiciones de vacunas combinadas. - Google Patents
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Abstract
Una composición de vacuna que comprende: (a) un antígeno viral de hepatitis B (HBV); y (b) el antígeno viral de herpes simplex (HSV) rgD2t en conjunción con un adyuvante que es un estimulador preferencial de respuesta celular TH1, en la que la composición de vacuna está hecha mezclando el antígeno viral de hepatitis B y el antígeno viral de herpes y en la que el estimulador preferencial de respuesta celular TH1 se selecciona del grupo de adyuvantes constituido por: 3D-MPL, 3D-MPL en el que el tamaño de las partículas de 3D MPL es de preferencia menor que 100 nm, QS21, una mezcla de QS21 y colesterol y un oligonucleótido CpG.
Description
Composiciones de vacunas combinadas.
Esta invención se refiere a formulaciones de
vacunas nuevas, procedimientos para prepararlas y su uso en
tratamientos. En particular la presente invención se refiere a
vacunas de combinación para administrar a la población
adolescente.
HSV-2 es el agente etiológico
primario del herpes genital. HSV-2 y
HSV-1 (el agente causal del herpes labial) se
caracterizan por su capacidad para inducir enfermedades agudas y
establecer una infección latente, de manera primaria en células de
ganglios nerviosos.
Se estima que se produce herpes genital en
aproximadamente 5 millones de personas en EEUU con 500.000 casos
clínicos informados cada año (infección primaria y recurrente). La
infección primaria se produce típicamente tras la pubertad y se
caracteriza por la aparición localizada de lesiones dolorosas en la
piel, que persisten durante un período de entre 2 y 3 semanas.
Dentro de los seis meses posteriores a la infección primaria el 50%
de los pacientes experimentarán una recurrencia de la enfermedad.
Aproximadamente el 25% de los pacientes pueden experimentar entre
10 y 15 episodios recurrentes de la enfermedad cada año. En
pacientes inmunocomprometidos la incidencia de recurrencia con
frecuencia alta es estadísticamente mayor que en la población de
pacientes normales.
Tanto el virus HSV-1 como el
HSV-2 tienen una cantidad de componentes
glicoproteicos ubicados en la superficie del virus. Estos se
conocen como gB, gC, gD y gE, etc.
Son bien conocidas las vacunas para la
profilaxis de infecciones de Hepatitis B, que comprenden uno o más
antígenos de Hepatitis B. Por ejemplo la vacuna
Engerix-B (Marca Registrada) de SimthKline Beecham
Biologicals se usa para prevenir la Hepatitis B. Esta vacuna
comprende antígeno de superficie de Hepatitis B (específicamente
los 226 aminoácidos del antígeno S descritos por Hardford y col. en
Postgraduate Medical Journal, 1987, 63 (supl. 2), págs.
65-70) y está formulada usando hidróxido de aluminio
como adyuvante.
Existe una necesidad de vacunas de combinación
eficaces para prevenir enfermedades para las que los adolescentes
son particularmente propensos.
El documento
WO-A-4211291 describe un polipéptido
híbrido inmunogénico que comprende un primer componente
polipeptídico que es un antígeno de superficie de Hepatitis B unido
de manera covalente por medio de un átomo de azufre nativo en el
primer componente polipeptídico al segundo componente polipeptídico
tal como gD de HSV.
La presente invención provee una composición de
vacuna que comprende:
(a) un antígeno viral de hepatitis B (HBV);
y
(b) el antígeno viral de herpes simplex (HSV)
rgD2t
en combinación con un adyuvante que
es un estimulador preferencial de respuesta celular TH1, en la que
la composición de vacuna está hecha mezclando el antígeno viral de
hepatitis B y el antígeno viral de herpes y en la que el
estimulador preferencial de respuesta celular TH1 se selecciona del
grupo constituido por 3D-MPL,
3D-MPL en el que el tamaño de las partículas de 3D
MPL es de preferencia menor que 100 nm, QS21, una mezcla de QS21 y
colesterol y un oligonucleótido
CpG.
La composición de vacunas de la invención es de
gran beneficio para la administración a adolescentes que pueden
estar particularmente en riesgo de sufrir infección con HBV y/o
HSV.
Opcionalmente la composición de vacunas de la
invención comprende además uno o más de una cantidad de otros
antígenos como se describe a continuación.
Se ha encontrado que las composiciones de
vacunas de acuerdo con la invención sorprendentemente no muestran
interferencia, es decir que la respuesta inmune a cada antígeno en
la composición de la invención es esencialmente la misma que la
obtenida por cada antígeno administrado individualmente en
conjunción con un adyuvante que es un estimulador preferencial de
respuesta celular TH1.
La vacuna Havrix (Marca Registrada), también de
SimthKline Beecham Biologicals es un ejemplo de una vacuna que
puede usarse para prevenir infecciones de Hepatitis A. Está
formulada con hidróxido de aluminio como adyuvante. Esta vacuna
comprende una cepa atenuada del virus de Hepatitis A
HM-175 inactivado con formol (formaldehído); ver
Andre y col. (Prog. Med. Virol. Vol. 37, págs.
1-24).
Como se usa en este documento el término
antígeno viral de hepatitis A (HAV) se usa para referirse a una
proteína derivada del virus de hepatitis A o una cepa atenuada de
HAV, opcionalmente inactivada, por ej. con formaldehído. Si el
antígeno HAV es una proteína derivada del virus de hepatitis A puede
ser opcionalmente una proteína recombinante.
La vacuna Twinrix (Marca Registrada) es una
combinación de un antígeno de hepatitis B recombinante con el
anteriormente mencionado virus atenuado de hepatitis A inactivado.
La vacuna puede usarse para proteger simultáneamente contra
hepatitis A y hepatitis B.
La Patente Europea
EP-B-0339667 (Chemo Sero) describe
el concepto general de combinar un antígeno de hepatitis A y un
antígeno de hepatitis B para realizar una vacuna de combinación. En
esa memoria se establece que el adyuvante que se usa no es crítico:
sólo debe ser capaz de potenciar la actividad inmune hasta un punto
deseado y no causar ningún efecto colateral. Se establece que puede
usarse gel de aluminio, en particular gel de hidróxido de aluminio
y gel de fosfato de aluminio.
En otro aspecto, la invención provee una
composición de vacuna:
(a) un antígeno viral de hepatitis B (HBV);
(b) el antígeno viral de herpes simplex (HSV)
r9D2t;
(c) un antígeno viral de hepatitis A (HAV)
en combinación con un adyuvante
seleccionado del grupo constituido por 3D-MPL,
3D-MPL en el que el tamaño de las partículas de
3D-MPL es de preferencia menor que 100 nm, QS21, una
mezcla de QS21 y colesterol y un oligonucleótido
CpG.
Tal vacuna es muy beneficiosa para la
administración a adolescentes que pueden estar particularmente en
riesgo de infección con HBV y/o HSV y/o HAV.
Una respuesta inmune puede diferenciarse
ampliamente en dos categorías extremas, una respuesta inmune humoral
o una respuesta mediada por células (tradicionalmente caracterizada
por mecanismos de protección por medio de anticuerpos o por medio
de células respectivamente). Estas categorías de respuesta han sido
denominadas respuestas inmunes de tipo TH1 (respuesta mediada por
células) y respuestas inmunes de tipo TH2 (respuesta humoral).
Las respuestas inmunes extremas de tipo TH1
pueden caracterizarse por la generación de linfocitos T citotóxicos
específicos de antígeno, con haplotipo restringido y respuestas
celulares natural killer. En ratones, las respuestas TH1
frecuentemente se caracterizan por la generación de anticuerpos del
subtipo IgG2a, mientras que en los seres humanos estos corresponden
a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunes de tipo TH2 se
caracterizan por la generación de una amplia variedad de isotipos de
inmunoglobulinas incluyendo IgG1, IgA e IgM en ratones.
Puede considerarse que lo que genera el
desarrollo de estos dos tipos de respuesta inmune son las
citoquinas. Niveles altos de citoquinas TH1 tienden a favorecer la
inducción de respuestas inmunes mediadas por células para el
antígeno dado, mientras que niveles altos de citoquinas de tipo TH2
tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales
para el antígeno dado.
La distinción entre respuestas humorales de tipo
TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una
respuesta inmune descrita predominantemente como TH1 o
predominantemente como TH2. Sin embargo, frecuentemente es
conveniente considerar las familias de citoquinas en los términos
descritos en clones de células T CD4+ve murinas por Mosmann y
Coffman (Mosmann, T. R. and Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells:
different patterns of lymphokine secretion lead to different
functional properties. Annual Review of Immunology, 7, págs.
145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo
TH1 están asociadas con la producción de
INF-\gamma y citoquinas IL-2 por
los linfocitos T. Otras citoquinas frecuentemente asociadas
directamente con la inducción de respuestas inmunes de tipo TH1 no
son producidas por células T, tal como IL-12. En
contraste, las respuestas de tipo TH2 están asociadas con la
secreción de IL-4, IL-5,
IL-6, IL-10 y factor de necrosis
tumoral-\beta (TNF-\beta).
Se sabe que ciertos adyuvantes de vacunas son
particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de
citoquinas de tipo TH1 o de tipo TH2. Tradicionalmente, los mejores
indicadores de equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune tras una
vacunación o infección incluye la medición directa de la producción
de citoquinas TH1 o TH2 por los linfocitos T in vitro tras
reestimulación con antígeno y/o la medición de la proporción
IgG1:IgG2a de las respuestas de anticuerpos específicas de
antígeno.
Por ello, un adyuvante de tipo TH1 es uno que
estimula poblaciones aisladas de células T para producir niveles
elevados de citoquinas de tipo TH1 cuando se reestimula con el
antígeno in vitro e induce respuestas de inmunoglobulinas
específicas de antígeno asociadas con el isotipo de tipo TH1.
Los adyuvantes capaces de producir estimulación
preferencial de la respuesta celular TH1 se describen en la
Solicitud de Patente Internacional Nº WO 94/00153 y en WO
95/17209.
Uno de tales adyuvantes es monofosforil lípido A
3-de-O-acilado
(3D-MPL). Se lo conoce del documento GB 2220211
(Ribi). Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A
3-de-O-acilado con
4, 5 ó 6 cadenas aciladas y es fabricado por Ribi Immunochem,
Montana. En la Patente Europea
EP-B-0689454 (SmithKline Beecham
Biologicals SA) se describe una forma de preferencia del
monofosforil lípido A
3-de-O-acilado.
De preferencia, las partículas de
3D-MPL son lo suficientemente pequeñas como para
filtrarlas de manera estéril a través de una membrana de 0,22
micrómetros (como se describe en la Patente Europea Nº 0689454). El
3D-MPL estará presente en el intervalo desde 10
\mug hasta 100 \mug. De preferencia de 25 a 50 \mug por dosis
en la que el antígeno estará típicamente presente en un intervalo de
2 a 50 \mug por dosis.
Otro adyuvante de preferencia comprende QS21,
una fracción no tóxica purificada por HPLC de la corteza de
Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente ésta puede mezclarse con
monofosforil lípido A
3-de-O-acilado
(3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.
El procedimiento de producción de QS21 se
describe en la Patente de EEUU Nº 5.057.540.
Anteriormente se describieron formulaciones de
adyuvantes no reactogénicas conteniendo QS21 (WO 96/33739). Tales
formulaciones comprendiendo QS21 y colesterol demostraron ser
adyuvantes estimuladores de TH1 exitosos cuando se formulan junto
con un antígeno. Por lo tanto las composiciones de vacunas que
forman parte de la presente invención pueden incluir una
combinación de QS21 y colesterol.
Otros adyuvantes que son estimuladores
preferenciales de la respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos
inmunomoduladores, por ejemplo secuencias de CpG no metiladas como
se describe en el documento WO 96/02555.
También se contempla que combinaciones de
diferentes adyuvantes que estimulan TH1, tales como los mencionados
anteriormente, provean un adyuvante que es un estimulador
preferencial de la respuesta celular TH1. Por ejemplo, puede
formularse QS21 junto con 3D-MPL. La proporción
QS21:3D-MPL será típicamente del orden de 1:10 a
10:1; de preferencia 1:5 a 5:1 y frecuentemente 1:1. El intervalo
de preferencia para el sinergismo óptimo es 2,5:1 a 1:1 de
3D-MPL:QS21.
De preferencia también está presente un vehículo
en la composición de vacunas de acuerdo con la invención. El
vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de
aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.
Una emulsión de aceite de agua de preferencia
comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa
tocoferol y Tween 80 (Marca Registrada). Adicionalmente la emulsión
de aceite de agua puede contener Span 85 y/o lecitina y/o
tricaprilina.
En un aspecto particularmente de preferencia los
antígenos en la composición de vacuna de acuerdo con la invención
están combinados con 3D-MPL y alum.
Para administración en seres humanos, QS21 y
3D-MPL típicamente estarán presentes en una vacuna
en el intervalo de 1 \mug a 200 \mug, tal como 10 a 100 \mug,
de preferencia 10 \mug a 50 \mug por dosis. Típicamente la
emulsión de aceite en agua comprenderá desde 2 hasta 10% de
escualeno, desde 2 hasta 10% de alfa tocoferol y desde 0,3 hasta 3%
de Tween 80. De preferencia la proporción escualeno:alfa tocoferol
es igual o menor que 1, puede también estar presente Span 85 en un
nivel de 1% debido a que provee una emulsión más estable. En
algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente
invención contengan además un estabilizante.
Las emulsiones no tóxicas de aceite en agua de
preferencia contienen un aceite no tóxico, por ejemplo escualano o
escualeno, un emulsionante, por ej. Tween 80, en un vehículo acuoso.
El vehículo acuoso puede ser por ejemplo, solución salina tamponada
con fosfatos.
En el Documento WO 95/17210 se describe una
formulación de adyuvante particularmente potente que incluye QS21,
3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en
agua.
El antígeno HSV en la composición de la
invención de HSV-2, es una glicoproteína D truncada
(rgD2t). La glicoproteína D nativa está localizada en la membrana
viral y también se encuentra en el citoplasma de las células
infectadas (Eisenberg R. J. y col; J of Virol 1980, 35,
428-435). Comprende 393 aminoácidos que incluyen un
péptido señal y tiene un peso molecular de aproximadamente 60 kD.
De todas las glicoproteínas de envoltura de HSV ésta es
probablemente la mejor caracterizada (Cohen y col.; J. of Virology,
60, 157-166). Se sabe que in vivo juega un
papel central en la unión viral a las membranas celulares. Más aún,
la glicoproteína D ha demostrado ser capaz de promover la formación
de anticuerpos neutralizantes in vivo (Eing y col. J. Med.
Virology 127: 59-65). Sin embargo, el virus
HSV-2 latente puede todavía aún reactivarse e
inducir recurrencia de la enfermedad a pesar de la presencia de un
título alto de anticuerpos neutralizantes en el suero de los
pacientes.
En la invención se emplea una glicoproteína D
truncada de HSV-2 de 308 aminoácidos que comprende
desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 306 presentes en la
glicoproteína naturalmente con el agregado de Asparagina y
Glutamina en el extremo C terminal de la proteína truncada
desprovista de su región de anclaje a la membrana. Esta forma de la
proteína incluye el péptido señal que está clivado para dar una
proteína madura de 283 aminoácidos. En la Patente Europea de
Genetech EP-B-139417
\hbox{se
describe la producción de tal proteína en células de ovario de
Hámster Chino.}
La glicoproteína D de HSV-2
madura truncada recombinante se usa en las formulaciones de vacuna
de la presente invención y se la nombra rgD2t.
En el Documento WO 92/16231 se describe una
combinación de este antígeno en combinación con el adyuvante
3D-MPL.
El antígeno viral de hepatitis B (HBV) en la
composición de la invención es típicamente antígeno de superficie
de hepatitis B.
La preparación de antígeno de superficie de
hepatitis B (HBsAg) está bien documentada. Ver por ejemplo, Harford
y col. en Develop. Biol. Standard 54, página 125 (1983), Gregg y
col. en Biotechnology, 5, página 479 (1987), los Documentos
EP-A-0 226 846 y
EP-A-0 299 108 y sus
referencias.
Como se usa en este documento la expresión
"antígeno de superficie de Hepatitis B", abreviado aquí como
"HBsAg" o "HBS" incluye cualquier antígeno HBsAg o
fragmento del mismo que despliega la antigenicidad del antígeno de
superficie de HBV. Debe entenderse que en el agregado de antígeno S
de HBsAg a la secuencia de 226 aminoácidos (ver Tiollais y col.
Nature, 317, 489 (1985) y sus referencias), HBsAg como se describe
en este documento puede, si se desea contener toda o parte de la
secuencia pre-S como se describe en las referencias
a continuación y en el documento
EP-A-0278940. HBsAg como se usa en
este documento puede también referirse a variantes, por ejemplo el
"mutante de escape" descrito en el documento WO 91/14703. En
otro aspecto el HBsAg puede comprender una proteína descrita como
L* en la Solicitud de Patente Europea Nº 0414374, esto es, la
secuencia de aminoácidos constituida por partes de la secuencia de
aminoácidos de la proteína grande (L) del virus de hepatitis B
(subtipo ad o ay), caracterizada porque la secuencia de aminoácidos
de la proteína está constituida por:
(a) los residuos 12-53, seguidos
por los residuos 133-145, seguidos por los residuos
175-400 de dicha proteína L; o
(b) el residuo 12, seguido por los residuos
14-52, seguidos por los residuos
133-145, seguidos por los residuos
175-400 de dicha proteína L.
HBsAg puede también referirse a los polipéptidos
descritos en los documentos EP 0198474 ó EP 0304578.
Normalmente el HBsAg estará en forma de
partícula. Puede comprender sólo proteína S o puede ser como
partículas compuestas, por ejemplo (L*,S) en la que L* es como se
definió anteriormente y S significa proteína S del antígeno de
superficie de hepatitis B.
El HBsAg puede estar adsorbido en fosfato de
aluminio como se describe en el documento WO 93/24148.
De preferencia el antígeno de hepatitis B (HBV)
usado en la formulación de la invención es antígeno S de HBsAg como
se usa en el producto comercial Engerix-B (Marc
antígeno de superficie de hepatitis B a Registrada; SmithKline
Beecham Biologicals).
En la Solicitud de Patente Europea 0633784 se
describió una vacuna comprendiendo antígeno de superficie de
Hepatitis B en conjunción con 3D-MPL.
El Virus de Epstein Barr (EBV), un miembro del
grupo herpesvirus, causa la mononucleosis infecciosa como enfermedad
primaria en seres humanas. Afecta predominantemente a niños y
adultos jóvenes. Más del 90% de la población adulta promedio está
infectada por EBV que persiste durante toda la vida en los
linfocitos B periféricos. El virus es producido de por vida en la
glándula parótida y se esparce primariamente por medio de
intercambio de saliva por parte de los individuos que acogen este
virus. Los niños infectados con EBV son muy sintomáticos o tienen
síntomas muy leves, mientras que los adolescentes y adultos que se
infectan desarrollan la mononucleosis infecciosa típica,
caracterizada por fiebre, faringitis y adenopatía. Las personas que
fueron infectadas mantienen anticuerpos anti EBV durante el resto
de sus vidas y son por ello inmunes a otra infección.
Además de sus cualidades infecciosas, EBV ha
demostrado que transforma linfocitos en células en rápida división
y ha sido implicado por consiguiente en varios linfomas diferentes,
incluyendo el linfoma Africano de Burkitt (BL). EBV puede también
estar involucrado como causante del carcinoma nasofaríngeo (NPC). Se
estima que mundialmente se producen 80.000 casos de carcinoma
nasofaríngeo y es más prevalente en las poblaciones chinas. La
mononucleosis infecciosa es consecuencia de la infección primaria
por EBV. No es una enfermedad que ponga en riesgo la vida si están
ausentes otros factores de riesgo.
Se describieron cuatro proteínas de la envoltura
viral de EBV constituyendo el llamado complejo antígeno de
membrana. Usualmente se las nombra como gp 220/350 o gp 250/350 o
simplemente como gp 250 o 350 (ver documento
EP-A-151079). Existe evidencia
convincente de que gp 350 y gp 250 inducen la producción de
anticuerpos neutralizantes y que los anticuerpos contra gp 350 y gp
250 tienen capacidad neutralizante. Estas proteínas son por lo tanto
candidatas para una posible vacuna para EBV. Para más información
acerca de la aplicación de gp 250/350 para tratamientos de
profilaxis de enfermedades relacionadas con EBV ver el documento EP
0173254.
La principal glicoproteína de superficie de EBV,
gp 350/220 infecta células blanco humanas a través de la
interacción con la proteína de membrana celular, CD21. El principal
blanco para los anticuerpos neutralizantes de EBV es gp350/220 en
seres humanos y algunas formas de gp 350/220 demostraron que
protegen contra la enfermedad relacionada con EBV. De preferencia,
una composición de vacuna de acuerdo con la invención comprende gp
350 de EBV aunque pueden usarse otros antígenos protectores.
Los papilomavirus son pequeños virus tumorales
de ADN, que son altamente específicos de especie. Hasta ahora, se
han descrito más de 70 genotipos individuales de papilomavirus
humano (HPV). Los HPVs son generalmente específicos de la piel (por
ej. HPV-1 y -2) o de superficies mucosas (por ej.
HPV-6 y -11) y usualmente causan tumores benignos
(verrugas) que persisten durante varios meses o años. Tales tumores
benignos pueden ser angustiosos para quienes los sufren pero no
implican riesgo para la vida, con unas pocas excepciones.
Algunos HPVs están también asociados con cáncer.
La más fuerte asociación positiva entre un HPV y el cáncer humano
es la que existe entre HPV-16 y
HPV-18 y carcinoma cervical. El carcinoma cervical
es la neoplasia más común en los países en desarrollo, con
aproximadamente 500.000 nuevos casos en el mundo cada año. Ahora es
técnicamente factible combatir activamente las infecciones primarias
con HPV-16 y aún cánceres establecidos conteniendo
HPV-16. Para una revisión de las perspectivas para
la vacunación profiláctica y terapéutica contra
HPV-16 ver Cason J., Clin. Immunother. 1994;
1(4) 293-306 y Hagenesee M. E., Infections in
Medicine 1997 14(7)
555-556,559-564. De preferencia, una
composición de vacuna de acuerdo con la invención comprende la
proteína principal de la cápside, la proteína L1.
Actualmente, se han aislado y caracterizado los
diferentes tipos de HPVs con la ayuda de los sistemas de clonación
en bacterias y más recientemente mediante amplificación con PCR. Se
ha definido la organización molecular de los genomas de HPV en base
a comparación con la bien caracterizada del papilomavirus bovino
tipo 1
(BPV1).
(BPV1).
Aunque pueden ocurrir variaciones menores, todos
los genomas de HPVs descritos tienen al menos siete genes
tempranos, E1 a E7 y dos genes tardíos L1 y L2. Además, una región
reguladora secuencia arriba contiene la secuencia reguladora que
parece controlar la mayoría de los acontecimientos transcripcionales
del genoma de
HPV.
HPV.
Los genes E1 y E2 están involucrados en el
control de la replicación y transcripción viral, respectivamente y
tienden a ser interrumpidos por la integración viral. E6 y E7, y
también evidencias recientes implican a E5, están involucrados en
el carcinoma cervical tal como HPV 16 y 18, el proceso oncogénico
comienza tras la integración del ADN viral. La integración da como
resultado la inactivación de los genes que codifican las proteínas
de cápside L1 y L2 y la instalación continua sobre la expresión de
dos proteínas tempranas E6 y E7 que llevarán a una pérdida gradual
de la diferenciación celular normal y al desarrollo del
carcinoma.
El carcinoma de cérvix es común en mujeres y se
desarrolla a través de un estado intermedio precanceroso hasta el
carcinoma invasivo que frecuentemente lleva a la muerte. Los estados
intermedios de la enfermedad se conocen como neoplasia
intraepitelial y se divide en grados I a III en términos de gravedad
incrementada.
Clínicamente, la infección por HPV del tracto
anogenital femenino se manifiesta como condilomas cervicales
planos, cuya característica distintiva es la coilocitosis que afecta
predominantemente a las células superficiales e intermedias del
epitelio escamoso cervical.
Los coilocitos, que son la consecuencia de un
efecto citopático del virus, aparecen como células multinucleadas
con un halo perinuclear claro. El epitelio está espesado con
queratinización anormal responsable de la apariencia verrugosa de
la lesión.
Cuando tales condilomas planos son positivos
para serotipos de HPV 16 o 18, son factores de alto riesgo para la
evolución hacia neoplasia cervical intraepitelial (CIN) y carcinoma
in situ (CIS) que son considerados como lesiones precursoras
del carcinoma invasivo de cérvix.
La Solicitud de Patente Internacional Nº WO
96/19496 describe variantes de proteínas de virus de papiloma
humano E6 y E7, particularmente proteínas de fusión de E6/E7 con una
deleción en ambas proteínas, E6 y E7. Se dice que estas proteínas
de fusión con deleciones son inmunogénicas.
En los Documentos WO94/00152, WO94/20137,
WO93/02184 y WO94/05792 se describen vacunas basadas en HPLV L1.
Tales vacunas pueden comprender el antígeno L1 como un monómero, un
capsómero o una partícula similar a un virus. Tales partículas
pueden además comprender proteínas L2. Otras vacunas de HPV se basan
en las proteínas Tempranas, tal como E7 o proteínas de fusión tal
como L2-E7.
En la vacuna de la invención resulta de
preferencia usar composiciones que comprenden una proteína E6 o E7
unida a un acompañante inmunológico de fusión con epitopes de
células T.
En una forma de preferencia de la invención, el
acompañante inmunológico de fusión deriva de la proteína D de
Haemophilus influenza B. De preferencia, el derivado de
proteína D comprende aproximadamente el primer 1/3 de la proteína,
en particular aproximadamente los primeros 100-110
aminoácidos del extremo N terminal.
\newpage
Por consiguiente, en una forma de realización la
presente invención comprende antígeno(s) derivados de HPV
como se describió anteriormente. De preferencia la invención
comprende proteínas de fusión que comprenden Proteína
D-E6 de HPV 16, Proteína D-E7 de HPV
16, Proteína D-E7 de HPV 18 y Proteína
D-E6 de HPV 18. La parte de proteína D de
preferencia comprende el primer 1/3 de la proteína D.
Las proteínas de la presente invención se
expresan de preferencia en E. coli. En una forma de
realización de preferencia se expresan con una cola de Histidina
comprendiendo de 5 a 9 y de preferencia seis residuos Histidina.
Éstos son ventajosos para ayudar en la purificación. La descripción
de la fabricación de tales proteínas de describe en su totalidad en
la solicitud de patente en trámite de UK número GB 9717953.5.
En un aspecto de preferencia la composición de
vacunas de la invención además comprende un antígeno viral de
Varicella Zoster (antígeno VZV). Los antígenos adecuados de VZV para
inclusión en la formulación de vacuna incluyen
gpI-V descrito por Longnecker y col., Proc Natl Acad
Sci USA 84, 4303-4307 (1987).
En una forma de realización de preferencia se
usa gpI (ver Ellis y col., Patente de EEUU Nº 4.769.239). Ver
también la Patente Europea Nº EP-B-0
405 867.
En otro aspecto de preferencia la composición de
vacunas de la invención además comprende un antígeno de
citomegalovirus humano (HCMV). HCMV es un virus humano de ADN que
pertenece a la familia de los herpesvirus. HCMV es endémico en la
mayor parte del mundo. Entre dos poblaciones, HCMV es responsable de
afecciones médicas serias. HCMV es una causa principal de defectos
congénitos en recién nacidos. La segunda población en riesgo son los
pacientes inmunocomprometidos tales como aquellos que sufren de
infección con HIV y aquellos pacientes sometidos a transplantes. La
enfermedad clínica causa una diversidad de síntomas incluyendo
fiebre, hepatitis, neumonitis y mononucleosis. Un antígeno de
preferencia para uso en una vacuna contra HCMV es gB685** como está
descrito en el documento WO 95/31555. También se proveen
inmunógenos para uso en vacunas de HCMV de pp65, una Proteína de
Matriz de HCMV como se describe en el documento WO 94/00150 (Ciudad
de
Hope).
Hope).
En un aspecto de preferencia la composición de
vacunas de la invención además comprende un antígeno de VZV y un
antígeno de HCMV, en particular aquellos antígenos descritos
anteriormente.
En otro aspecto de preferencia la composición de
vacunas de la invención además comprende un antígeno de
Toxoplasma gondii. Toxoplasma gondii es un protozoo
parásito intracelular obligado responsable de la toxoplasmosis en
animales de sangre caliente, incluyendo al hombre. Aunque
generalmente es clínicamente asintomático en los individuos sanos,
la toxoplasmosis puede causar complicaciones graves en mujeres
embarazadas y pacientes inmunocomprometidos. Un antígeno de
preferencia para uso en una vacuna contra el toxoplasma
gondii es SAG1 (también conocido como P30) como se describe en
el documento WO96/02654 o Tg34 como se describe en el documento
WO92/11366.
En un aspecto de preferencia la composición de
vacunas de la invención además comprende un antígeno VZV o un
antígeno HCMV combinado con un antígeno de Toxoplasma gondii,
en particular aquellos antígenos descritos anteriormente.
En un aspecto de preferencia la composición de
vacunas de la invención es una vacuna multivalente, por ejemplo una
vacuna tetra o pentavalente.
Las formulaciones de la presente invención son
muy eficaces induciendo inmunidad protectora, aún con dosis muy
bajas de antígeno (por ej. tan bajas como 5 \mug de rgD2t).
Estas vacunas proveen una protección excelente
contra la infección primaria y estimulan, de manera ventajosa
respuesta inmune humoral específica (anticuerpos neutralizantes) y
también respuesta inmune mediada por células efectoras (DTH).
En otro aspecto la presente invención provee una
formulación de vacuna como se describe en este documento para uso
en tratamiento médico, particularmente para uso en el tratamiento o
profilaxis de infecciones por Herpes Simplex y Hepatitis B
viral.
La vacuna de la presente invención contendrá una
cantidad inmunoprotectora de antígenos y puede prepararse por medio
de técnicas convencionales.
La preparación de vacuna está descrita en
general en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design -
the subunit and adjuvant approach, editado por Powell y Newman,
Plenurn Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines,
editado por Voller y col., University Park Press, Baltimore, Md.,
U.S.A. 1978. El encapsulado dentro de liposomas está descrito por
ejemplo por Fullerton, en la Patente de EEUU Nº 4.235.877. La
conjugación de proteínas con macromoléculas está descrita, por
ejemplo, por Likhite, Patente de EEUU Nº 4.372.945 y por Armor y
col., Patente de EEUU Nº 4.474.757.
\newpage
La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna
se selecciona como una cantidad que induce una respuesta
inmunoprotectora sin los efectos colaterales adversos
significativos de las vacunas típicas. Tal cantidad variará
dependiendo del inmunógeno específico usado. Generalmente, se
espera que cada dosis comprenderá de 1 a 1000 \mug de proteína,
de preferencia de 2 a 100 \mug, de más preferencia de 4 a 40
\mug. Para una vacuna en particular puede determinarse una
cantidad óptima por medio de estudios estándar que incluyen la
observación de títulos de anticuerpos y otras respuestas en los
sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir un
estímulo es aproximadamente 4
semanas.
semanas.
Además de la vacunación de personas susceptibles
de infecciones virales por HSV o HBV, las composiciones
farmacéuticas de la presente invención pueden usarse para tratar,
inmunoterapéuticamente, a pacientes que sufren de dichas
infecciones virales.
En otro aspecto de la presente invención se
provee un procedimiento de fabricación como en el descrito en este
documento, en el que el procedimiento comprende mezclar un antígeno
viral de herpes y un antígeno viral de hepatitis B con un adyuvante
que induce TH-1, por ejemplo 3D-MPL
y, de preferencia, un vehículo, por ejemplo alum.
Si se desea, pueden agregarse otros antígenos,
de cualquier manera conveniente, para proveer composiciones de
vacunas multivalentes como se describe en este documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El objetivo del estudio fue demostrar la
factibilidad de la combinación HSV gD/HBV HBs en una formulación
con Al(OH)_{3}/3D-MPL. Se compararon
las respuestas inmunes inducidas en cobayas por inmunización con
estos antígenos usados solos o en combinación. HBs es una
abreviatura para antígeno de superficie de Hepatitis B,
específicamente la proteína S como se describió anteriormente. gD es
una abreviatura para rgD2t como se describió anteriormente.
El protocolo experimental fue el siguiente. Se
inyectaron cobayas Hartley por vía intramuscular en el día 0 y el
día 28 con las siguientes formulaciones:
- grupo 1: HBs 5
\mug/Al(OH)_{3} 125 \mug/3D-MPL
12,5 \mug
- grupo 2: gD 5
\mug/Al(OH)_{3} 125 \mug/3D-MPL
12,5 \mug
- grupo 3: HBs 5 \mug + gD 5
\mug/Al(OH)_{3} 125 \mug/3D-MPL
12,5 \mug
- grupo 4: HBs 5 \mug + gD 5
\mug/Al(OH)_{3} 125 \mug/3D-MPL
de un lote diferente de 3D-MPL 12,5 \mug
Se extrajo sangre de los animales en los días 14
y 31 tras la segunda inmunización. Se evaluó la respuesta inmune
humoral contra HSV gD y HBV HBs en ambos momentos con ELISA.
También se evaluó las reacciones de
hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) para HBs. Consistió en la
inyección intradérmica de 10 \mug de HBs por duplicado. Se
controló el desarrollo de reacciones DTH midiendo el espesor de la
piel a las 0, 24 y 48 horas tras la inyección.
En la Fig. 1 se muestran los títulos de
Anti-gD obtenidos por ELISA. Los títulos de
anti-gD en el grupo inmunizado con gD fueron
comparables con aquellos inducidos en animales inmunizados con la
combinación gD + HBs. La presencia de HBs en la formulación no
afectó la inducción de respuestas de anticuerpos
anti-gD.
De manera similar, se compararon los títulos de
anticuerpos anti HBs en animales inmunizados con HBs solo o
combinado con gD. La Fig. 2 muestra que se observaron títulos
comparables de anti HBs en animales inmunizados con HBs solo o con
HBs + gD.
Los resultados se muestran en las Figuras
1-4 de las que puede concluirse que en la
formulación probada, la combinación gD/HBs induce respuestas de
anticuerpos comparables con aquellas inducidas por los mismos
antígenos usados solo y respuestas DTH a HBs comparables a aquellas
inducidas por HBs solo. Por ello no se observaron diferencias
significativas en las respuestas DTH para HBs en animales vacunados
con HBs o HBs + gD. La presencia de gD no afectó la respuesta DTH
para HBs.
\newpage
Ejemplo
2
El objetivo de este estudio fue evaluar la
eficacia protectora de una combinación de HSV gD + HBV HBs en una
formulación con 3D-MPL/alum en el modelo de HSV en
cobaya comparada con gD solo en una formulación con
3D-MPL/alum. La formulación con
3D-MPL/alum comprende alum (10 partes en peso) con
eD-MPK (1 parte en peso).
Se inmunizaron grupos de doce cobayas hembra
Hartley con las siguientes formulaciones o se dejaron sin
tratamiento:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron los animales por vía
intramuscular dos veces en los días 0 y 28. Se realizó un desafío
intravaginal en el día 57 (1 mes tras la segunda inmunización) con
10^{5} unidades formadoras de placa (pfu) de cepa MS de HSV2 (100
\mul) y posteriormente se controlaron diariamente buscando signos
clínicos de enfermedad primaria (días 4 a 12 postinfección) y
recurrente (días 13 a 39 postinfección). Se midió la protección
inducida de acuerdo con varios criterios descritos en la Tabla 1,
así como por medio de curvas de puntuación acumulada.
También se realizaron pruebas en los sueros
recogidos en los días 14 y 28 tras la inmunización II para
determinar los títulos de anticuerpos anti gD por ELISA (expresados
como EU/ml); también se realizaron pruebas en los sueros recogidos
en el día 28 tras la inmunización II para determinar la actividad
neutralizante de HSV ("NEUTRA"; los títulos corresponden a la
inversa de la dilución del suero que brinda 100% de protección
contra el efecto citopático de HSV2).
Los datos de inmunogenicidad se presentan en la
Tabla siguiente y en la Figura 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se indujeron títulos ELISA y neutralizantes
similares mediante la combinación gD (5 \mug) + HBs (5 \mug) en
la formulación 3D-MPL/alum y gD/formulación
3D-MPL/alum.
Como se muestra en la Figura 6 (curva de
puntuación acumulada) y en la Tabla 1 a continuación, la combinación
gD + HBs/formulación 3D-MPL/alum confirió una
protección contra la enfermedad primaria tan buena como gD solo en
formulación 3D-MPL/alum.
En la Figura 7 (curvas de puntuación acumulada)
y en la Tabla 2 a continuación se muestra la protección contra las
recurrencias del herpes La combinación de gD + formulación
HBs/3D-MPL/alum confirió una protección contra la
enfermedad recurrente tan buena como gD solo en la formulación
3D-MPL/alum.
Una cantidad similar de animales tuvieron
recurrencias en los grupos gD + HBs y gD solo. Exactamente la misma
cantidad de animales en estos grupos tuvieron más de 1 recurrencia
durante el período de observación (días 13 a 39 post desafío). En
aquellos animales con recurrencia, se informaron lesiones de
gravedad comparable.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tanto las cobayas inmunizadas con la combinación
gD + HBs como las inmunizadas con gD solo estuvieron muy bien
protegidas contra el desafío con HSV. Mientras que la mayoría de los
animales control tuvieron lesiones, éstas se observaron sólo en
2/12 y 3/12 animales en los grupos gD + HBs y gD solo,
respectivamente.
Ejemplo
3
El objetivo del estudio es evaluar las
respuestas inmunes serológicas inducidas en ratones por una vacuna
de combinación que comprende HAV, HBs y gD formulada con sales de
Aluminio y 3D-MPL. El componente de hepatitis A
usado en este ejemplo (y abreviado en este documento como
"HAV") fue la cepa HM175 inactivada encontrada en Havrix.
\vskip1.000000\baselineskip
HBs: Al: 4550 \mug/ml, HBs preadsorbido:
227,62 \mug/ml
HAV: Al: 1380 \mug/ml, HAV: 25230 EU/ml
gD: 493 \mug/ml
3D-MPL: 957 \mug/ml
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Grupo 1: HBs AlPO_{4}/3D-MPL
- HBs/H_{2}O/NaCl/fenoxi/AlPO_{4} durante 15 minutos + 3D-MPL durante 1 hora
- \bullet
- Grupo 2: gD AlOH_{3}/3D-MPL
- H_{2}O/AlOH_{3} durante 5 minutos + gD durante 15 minutos + 3D-MPL durante 30 minutos + PBS durante 15 minutos + Fenoxi
- \bullet
- Grupo 3: HAV AlOH_{3}/3D-MPL
- H_{2}O/NaCl/Fenoxi durante 5 minutos + AlOH_{3}/HAV durante 30 minutos/3D-MPL
- \bullet
- Grupo 4:
- 1.
- H_{2}O/NaCl/Fenoxi durante 5 minutos + AlPO_{4}/HBs durante 5 minutos + 3D-MPL durante 30 minutos
- 2.
- gD/AlOH_{3} durante 15 minutos + 3D-MPL durante 30 minutos
Mezclar 1 y 2 durante 20 minutos +HAV durante 1
hora.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- La cuantificación de anticuerpos anti HBs y anti gD se realizó por Elisa usando HBs o gD como antígeno de recubrimiento. Se usaron las soluciones de antígeno y anticuerpo a razón de 5 \mul por pocillo. Se diluyó el antígeno a una concentración final de 1 \mug/ml en PBS y se adsorbió durante la noche a 4ºC a los pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark). Posteriormente se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC con PBS conteniendo 1% de seroalbúmina de ternera y 0,1% de Tween 20 (tampón de saturación). Se agregaron diluciones al doble de suero en tampón de saturación a las placas recubiertas con antígeno y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS 0,1% Tween 20 y se agregó Ig anti ratón conjugada con biotina (Amersham, UK) diluida 1/1000 en tampón de saturación a cada pocillo y se incubó durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Tras una etapa de lavado, se agregó complejo estreptavidina-peroxidasa biotinilada (Amersham, UK) diluido 1/5000 ó 1/1000 en tampón de saturación (para ELISA de HBs y anti gD respectivamente) durante otros 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas como anteriormente y se incubaron durante 20 minutos con una solución de o-fenilendiamina (Sigma) 0,04%, H_{2}O_{2} 0,03% en tampón citrato 0,05 M pH 4,50 con 1% Tween 20. Se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 2 N y se leyó a 492/620 nm. Se calcularon los títulos de ELISA a partir de una referencia por medio de SoftmaxPro (usando una ecuación de cuatro parámetros) y se expresaron en EU/ml.
- \bullet
- La cuantificación de anticuerpo anti HAV se realizó por medio de Enzymun ELISA (Boehringer) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Se inmunizaron grupos de 7 ratones Balb/C por
vía intramuscular con las siguientes formulaciones (correspondientes
a 1/10 de la dosis para seres humanos)
- 1.
- HBs (2 \mug)/AlPO_{4} (50 \mug)/3D-MPL (5 \mug)
- 2.
- gD (2 \mug)/Al(OH)_{3} (50 \mug)/3D-MPL (5 \mug)
- 3.
- HAV (72 EU)/Al(OH)_{3} (50 \mug)/3D-MPL (5 \mug)
- 4.
- HAV (72 EU)/Al(OH)_{3} (5 \mug) + HBs (2 \mug)/AlPO_{4} (40 \mug)/3D-MPL (2,5 \mug) +gD (2 \mug)/Al(OH)_{3} (5 \mug)/3D-MPL (2,5 \mug)
Se inmunizaron los animales dos veces en los
días 0 y 21 con 50 \mul de vacuna. Se recogió suero en varios
momentos post inmunización (21 post I y 14 post II) y se analizaron
para determinar sus títulos de anticuerpos anti HAV, HBs y gD.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos individuales de 21 post I y 14 post II
se muestran en la Tabla 3 y se resumen a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Se observaron títulos comparables de anticuerpos anti HBs en la vacuna de combinación y en la vacuna de HBs conteniendo sales de Aluminio y 3D-MPL.
- \bullet
- Se observaron títulos comparables de anticuerpos anti gD en la vacuna de combinación y en la vacuna de gD conteniendo sales de Aluminio y 3D-MPL.
- \bullet
- Se observaron títulos comparables de anticuerpos anti HAV en la vacuna de combinación y en la vacuna de HAV conteniendo sales de Aluminio y 3D-MPL.
Por consiguiente parece no haber interferencias
cuando se combinan HBs, gD y HAV en una vacuna conteniendo sales de
Aluminio y 3D-MPL.
Claims (18)
1. Una composición de vacuna que comprende:
(a) un antígeno viral de hepatitis B (HBV);
y
(b) el antígeno viral de herpes simplex (HSV)
rgD2t
en conjunción con un adyuvante que
es un estimulador preferencial de respuesta celular TH1, en la que
la composición de vacuna está hecha mezclando el antígeno viral de
hepatitis B y el antígeno viral de herpes y en la que el
estimulador preferencial de respuesta celular TH1 se selecciona del
grupo de adyuvantes constituido por: 3D-MPL,
3D-MPL en el que el tamaño de las partículas de 3D
MPL es de preferencia menor que 100 nm, QS21, una mezcla de QS21 y
colesterol y un oligonucleótido
CpG.
2. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1 que además comprende un vehículo.
3. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 en la que el estimulador preferencial de
respuesta celular TH1 es 3D-MPL.
4. Una composición de vacuna de acuerdo una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que el antígeno de
Hepatitis B es antígeno de superficie de hepatitis B.
5. Una composición de vacuna de acuerdo una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que además está
presente un antígeno de EBV.
6. Una composición de vacuna como se definió en
la reivindicación 5 en la que en antígeno de EBV es gp 350.
7. Una composición de vacuna de acuerdo una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que además está
presente un antígeno de Hepatitis A.
8. Una composición de vacuna como se definió en
la reivindicación 7 en la que en antígeno de HAV deriva de la cepa
HM-175
9. Una composición de vacuna de acuerdo una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que además está
presente un antígeno de papilomavirus humano (HPV).
10. Una composición de vacuna como se definió en
la reivindicación 9 en la que el antígeno de HPV se selecciona de
uno o más de los siguientes: L1, L2, E6, E7, proteína
D-E6, proteína D-E7 o
L2-E7.
11. Una composición de vacuna de acuerdo una
cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10 en la que el vehículo se
selecciona del grupo que comprende hidróxido de aluminio, fosfato de
aluminio y tocoferol y una emulsión de aceite en agua.
12. Una composición de vacuna de acuerdo una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que además comprende un
antígeno de VZV.
13. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 12 en la que el antígeno de VZV es gpI.
14. Una composición de vacuna de acuerdo una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que además comprende un
antígeno de HCMV.
15. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 14 en la que el antígeno de HCMV es gB685** o
pp65.
16. Una composición de vacuna de acuerdo una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que además comprende un
antígeno de Toxoplasma gondii.
17. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 16 en la que el antígeno de Toxoplasma gondii
es SAG1 o TG34.
18. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 4 que comprende HBsAg antígeno S y HSV2gDt y
opcionalmente además uno o más de EBVgp 350; VZVgpI; HAV de cepa
HM-175 inactivada; L1, L2, E6, E7, proteína
D-E6, proteína D-E7 o
L2-E7 de HPV; gB685** o pp65 de HCMV y antígenos
SAG1 o TG34 de Toxoplasma gondii.
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