ES2272012T5 - Proteinas de fusion que comprenden las proteinas tat y/o nef del vih-1. - Google Patents
Proteinas de fusion que comprenden las proteinas tat y/o nef del vih-1. Download PDFInfo
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Abstract
Una composición para vacuna que comprende una proteína que comprende (a) una proteína Tat del HIV completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o una Tat mutada que ha experimentado una deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23, unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipropoteica o a (ii) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal o a Nef que ha experimentado una deleción, adición o sustitución de un aminoácido; o (b) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, unida a (i) una pareja de fusión proteica o liproproteica o a (ii) una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal o a una Tat mutada que ha experimentado una deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23; o (c) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, unida a una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal o a una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de uno aminoácido, o auna Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23 y una pareja de fusión proteica o lipoproteica, mezclada con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Description
Proteínas de fusión que comprenden las proteínas
Tat y/o Nef del VIH-1.
La presente invención se refiere a nuevas
construcciones de proteínas del VIH, a su uso en medicina, a
composiciones farmacéuticas que las contienen y a procedimientos
para su fabricación.
En particular, la invención se refiere a
proteínas de fusión que comprenden las proteínas Tat y/o Nef del
VIH-1.
El VIH-1 es la causa principal
del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) que se considera
uno de los principales problemas de salud del mundo. Aunque se han
realizado investigaciones exhaustivas en todo el mundo para producir
una vacuna, hasta ahora estos esfuerzos no han tenido éxito.
Se han descrito proteínas del
VIH-1 que no son de la cubierta y que incluyen, por
ejemplo, proteínas estructurales internas, tales como los productos
de los genes gag y pol y otras proteínas no
estructurales, tales como Rev, Nef, Vif y Tat (Greene y col., New
England J. Med, 324, 5, 308 y siguientes (1991) y Bryant y col. (Ed.
Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 y siguientes
(1992).
Las proteínas Nef y Tat del VIH son proteínas
tempranas, es decir, se expresan muy pronto durante la infección y
en ausencia de proteínas estructurales.
Según la presente invención, se proporciona una
composición de vacuna proteínica que comprende una proteína
expresada, recuperada y aislada que comprende
(a) una proteína Tat del VIH completa o Tat con
una cola de histidina en el extremo C-terminal, o
una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución
de un aminoácido, o una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº
23, unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipoproteica o a
(ii) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de
histidina en el extremo C-terminal, o a Nef que ha
experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido;
o
(b) una proteína Nef del VIH completa o Nef con
una cola de histidina en el extremo C-terminal, o
Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un
aminoácido, unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipoproteica
o a (ii) una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de
histidina en el extremo C-terminal, o a una Tat
mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un
aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23;
o
(c) una proteína Nef del VIH completa o Nef con
una cola de histidina en el extremo C-terminal, o
Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un
aminoácido, unida a una proteína Tat del VIH completa o Tat con una
cola de histidina en el extremo C-terminal, o a una
Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de
un aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23,
y una pareja de fusión proteica o lipoproteica.
\vskip1.000000\baselineskip
Por "pareja de fusión" se pretende
significar cualquier secuencia proteica que no sea Tat o Nef.
Preferiblemente, la pareja de fusión es una proteína D o su derivado
unido a lípidos, la lipoproteína D de Haemophilus influenzae
de tipo B. En particular, se prefiere que se utilice el tercio
N-terminal, es decir, aproximadamente los primeros
100-130 aminoácidos. Esto se representa en este
documento como Lipo D 1/3. En una realización preferida de la
invención la proteína Nef o un derivado de la misma puede unirse a
la proteína Tat o un derivado de ésta. Estas fusiones
Nef-Tat pueden unirse también opcionalmente a una
pareja de fusión proteica o lipoproteica, como la proteína D.
La pareja de fusión se une normalmente al
extremo N-terminal de la proteína Nef o Tat.
Los derivados que abarca la presente invención
incluyen moléculas con una cola de histidina en el extremo
C-terminal que comprende preferiblemente entre
5-10 restos histidina. Generalmente, una cola de
histidina que contiene n restos se representa en este documento como
His (n). La presencia de una cola de histidina (o "His") ayuda
a la purificación. Más específicamente, la invención proporciona
proteínas con la siguiente estructura
La Figura 1 proporciona la secuencia de
aminoácidos (ID SEC Nº 7) y de ADN (ID SEC Nº 6) de la pareja de
fusión para tales construcciones.
En una realización preferida las proteínas se
expresan con una cola de histidina que comprende entre 5 y 10, y
preferiblemente seis restos histidina. Estos son ventajosos porque
ayudan a la purificación. Se ha descrito ya la expresión
independiente, en levadura (Saccharomyces cerevisiae), de Nef
(Macreadie I.G. y col., 1993, Yeast 9 (6) 565-573)
y Tat (Braddock M y col., 1989, Cell 58 (2) 269-79),
y sólo la proteína Nef está miristilada. La presente invención
proporciona por primera vez la expresión de Nef y Tat de forma
independiente en un sistema de expresión de Pichia
(construcciones Nef-His y Tat-His) y
la expresión eficaz de una construcción de fusión
Nef-Tat-His. Las secuencias de ADN y
de aminoácidos de las proteínas de fusión representativas
Nef-His (c Nº 8 y 9), Tat-His (ID
SEC Nº 10 y 11) y de Nef-Tat-His (ID
SEC Nº 12 y 13) se muestran en la Figura 2.
Los derivados que abarca la presente invención
también incluyen proteínas mutadas. El término "mutada" se usa
en este documento para referirse a una molécula que ha experimentado
deleción, adición o sustitución de uno o más aminoácidos usando
técnicas bien conocidas para mutagénesis dirigida a sitio o
cualquier otro procedimiento convencional.
En la Figura 2 se ilustra una Tat mutada (ID SEC
Nº 22 y 23) como es
Nef-Tat-mutante-His
(ID SEC Nº 24 y 25).
Puede sintetizarse una secuencia de ADN que
codifique las proteínas de la presente invención usando técnicas
convencionales de síntesis de ADN, tal como mediante ligamiento
enzimático, como describen D.M. Roberts y col. en
Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, mediante
síntesis química, mediante polimerización enzimática in vitro
o mediante tecnología de PCR utilizando, por ejemplo, una polimerasa
termoestable, o mediante una combinación de estas técnicas.
La polimerización enzimática de ADN puede
realizarse in vitro usando una polimerasa de ADN, tal como la
ADN polimerasa I (fragmento Klenow) en un tampón apropiado que
contenga los nucleósidos trifosfato dATP, dCTP, dGTP y dTTP, según
sea necesario, a una temperatura de 10º-37ºC, generalmente en un
volumen de 50 \mul o menos. Se puede realizar el ligamiento
enzimático de fragmentos de ADN usando una ADN ligasa, tal como la
ADN ligasa de T4, en un tampón apropiado, tal como Tris 0,05 M (pH
7,4), MgCl_{2} 0,01 M, ditiotreitol 0,01M, espermidina 1 mM, ATP
1 mM y albúmina de suero bovino a 0,1 mg/ml, desde una temperatura
de 4ºC a temperatura ambiente, generalmente en un volumen de 50 ml
o menos. La síntesis química del polímero o fragmentos de ADN puede
realizarse mediante procedimientos químicos convencionales de
fosfotriéster, fosfito o fosforamidito, usando técnicas en fase
sólida, tales como aquellas descritas en "Chemical and Enzymatic
Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual" (H.G. Gassen
y A. Lang editores), Verlag Chemie, Weinheim (1982), o en otras
publicaciones científicas, por ejemplo, M.J. Gait, H.W.D. Matthes,
M. Singh, B.S. Sproat y R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982,
10, 6243; B.S. Sproat y W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24,
5771; M.D. Matteucci, M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980,
21, 719; M.D. Matteucci t M.H. Caruthers, Journal of the American
Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams y col., Journal of the
American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat,
J. McMannus y H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; y
H.W.D. Matthes y col., EMBO Journal, 1984, 3, 801.
La invención también proporciona un
procedimiento para preparar una proteína que comprende (a) una
proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el
extremo C-terminal, o una Tat mutada que ha
experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o
una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23, unida a (i) una
pareja de fusión proteica o lipoproteica o a (ii) una proteína Nef
del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo
C-terminal, o a Nef que ha experimentado deleción,
adición o sustitución de un aminoácido; o (b) una proteína Nef del
VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo
C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción,
adición o sustitución de un aminoácido, unida a (i) una pareja de
fusión proteica o lipoproteica o a (ii) una proteína Tat del VIH
completa o Tat con una cola de histidina en el extremo
C-terminal, o a una Tat mutada que ha experimentado
deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o a una Tat
mutada como se define en la ID SEC Nº 23; o (c) una proteína Nef del
VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo
C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción,
adición o sustitución de un aminoácido, unida a una proteína Tat
del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo
C-terminal, o a una Tat mutada que ha experimentado
deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o a una Tat mutada
como se define en la ID SEC Nº 23, y una pareja de fusión proteica
o lipoproteica, en Pichia pastoris, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas de trasformar Pichia pastoris con
ADN que codifica dicha proteína, expresar dicha proteína y recuperar
al proteína.
El procedimiento de la invención puede
realizarse mediante técnicas convencionales de recombinación, tales
como las descritas en Maniatis y col., Molecular Cloning - A
Laboratory Manual; Cold Spring Harbor,
1982-1989.
El término "transformación" se usa en este
documento para significar a la introducción de ADN extraño dentro de
una célula hospedadora. Esto se puede conseguir, por ejemplo,
mediante transformación, transfección o infección con un vector
plasmídico o vírico apropiado usando, por ejemplo, técnicas
convencionales como se describe en Genetic Engineering; Editores.
S.M. Kingsman y A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications;
Oxford, Inglaterra, 1988. El término "transformado" o
"transformante" se aplicará de aquí en adelante a la célula
hospedadora resultante que contiene y expresa el gen extraño de
interés.
\newpage
Los vectores de expresión capaces de replicarse
pueden prepararse de acuerdo con la invención, escindiendo un vector
compatible con la célula hospedadora para proporcionar un segmento
de ADN lineal que tenga un replicón intacto y que combine dicho
segmento lineal con una o más moléculas de ADN que, junto con dicho
segmento lineal, codifique el producto deseado, tal como el polímero
de ADN que codifica la proteína de la invención, o un derivado de la
misma, en condiciones de ligamiento.
De este modo, el polímero de ADN puede
realizarse o formarse durante la construcción del vector, según se
desee.
La elección del vector estará determinada, en
parte, por la célula hospedadora, que puede ser procariota o
eucariota, pero preferiblemente es E. coli o levadura. Los
vectores adecuados incluyen plásmidos, bacteriófagos, cósmicos y
virus recombinantes.
La preparación del vector de expresión capaz de
replicarse puede llevarse a cabo de forma convencional con enzimas
apropiadas de restricción, polimerización y ligamiento de ADN,
mediante procedimientos descritos en, por ejemplo, Maniatis y col.,
citado anteriormente.
La célula hospedadora recombinante se prepara,
según la invención, transformando una célula hospedadora con un
vector de expresión de la invención capaz de replicarse en
condiciones de transformación. Las condiciones de transformación
adecuadas son las convencionales y se describen en, por ejemplo,
Maniatis y col. citado anteriormente, o en "DNA Cloning" Vol.
II, D.M. Glover editor, IRL Press Ltd., 1985.
La elección de las condiciones de transformación
está determinada por la célula hospedadora. De este modo, puede
tratarse un hospedador bacteriano, tal como E. coli, con una
solución de CaCl_{2} (Cohen y col., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973,
69, 2110) o con una solución que comprenda una mezcla de RbC1,
MnCl_{2}, acetato potásico y glicerol y luego con ácido
3-[N-morfolino]-propano-sulfónico,
RbC1 y glicerol. Las células de mamífero en cultivo pueden
transformarse mediante la coprecipitación con calcio del ADN del
vector en las células.
El cultivo de la célula hospedadora transformada
en condiciones que permiten la expresión del polímero de ADN se
lleva a cabo de forma convencional, como se describe, por ejemplo,
en Maniatis y col. y en "DNA Cloning" citado anteriormente. De
este modo, preferiblemente, se suministran nutrientes a la célula y
se cultiva a una temperatura inferior a 50ºC.
El producto se recupera mediante procedimientos
convencionales según la célula hospedadora. De este modo, ya sea la
célula hospedadora bacteriana, tal como E. coli, o de
levadura, tal como Pichia, puede lisarse física, química o
enzimáticamente y el producto proteico puede aislarse del lisado
resultante. Si la célula hospedadora es de mamífero, el producto
generalmente puede aislarse a partir del medio nutriente o a partir
de extractos sin células. Las técnicas convencionales de aislamiento
de proteínas incluyen la precipitación selectiva, cromatografía de
absorción y cromatografía de afinidad, que incluye una columna de
afinidad con anticuerpo monoclonal.
Para las proteínas de la presente invención
provistas de colas de histidina, la purificación puede lograrse
fácilmente mediante el uso de una columna de afinidad con iones
metálicos. En una realización preferida, la proteína se purifica
adicionalmente sometiéndola a una cromatografía de intercambió
catiónico y/o cromatografía de filtración en gel. A continuación, la
solución proteica se esteriliza pasándola a través de una membrana
de 0,22 \mum.
Entonces, las proteínas de la invención pueden
formularse como vacuna, o eliminarse enzimáticamente los restos
histidina.
Las proteínas de la presente invención se
proporcionan preferiblemente al menos con una pureza del 80%, más
preferiblemente del 90%, como se visualiza mediante
SDS-PAGE. Preferiblemente las proteínas aparecen
como una única banda en la SDS-PAGE.
La presente invención también proporciona una
composición farmacéutica que comprende una proteína de la presente
invención en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La preparación de vacunas se describe de forma
general en New Trends and Developments in Vaccines, Voller y
col. (editores), Universidad Park Press, Baltimore, Maryland, 1978.
La encapsulación en liposomas se describe en Fullerton, Patente de
EE.UU. 4.235.877.
Las proteínas de la presente invención se
preparan en la formulación para vacuna de la invención
preferiblemente con coadyuvante. Los coadyuvantes adecuados incluyen
una sal de aluminio, tal como el gel de hidróxido de aluminio
(alumbre) o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de
calcio, de hierro o de cinc, o puede ser una suspensión insoluble de
tirosina acetilada o azúcares acetilados, polisacáridos
derivatizados catiónica o aniónicamente o polifosfacenos
En la formulación de la invención se prefiere
que la composición coadyuvante induzca una respuesta preferentemente
TH1. Los sistemas de coadyuvante adecuados incluyen, por ejemplo,
una combinación de monofosforil lípido A o un derivado del mismo,
preferiblemente monofosforil lípido A
3-de-O-acetilado
(3D-MPL) junto con una sal de aluminio.
Un sistema potenciado implica la combinación de
un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, en especial la
combinación de QS21 y 3D-MPL, como se describe en el
documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica donde el
QS21 se inactiva con colesterol como se describe en el documento WO
96/33739.
Una formulación de coadyuvante especialmente
potente que implica a QS21, 3D-MPL y tocoferol en
una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO
95/17210 y es una formulación preferida.
Por consiguiente, en una realización de la
presente invención, se proporciona una vacuna que comprende una
proteína según la invención preparada con un coadyuvante como un
monofosforil lípido A o un derivado del mismo, especialmente
3D-MPL.
Preferiblemente la vacuna comprende
adicionalmente una saponina, más preferiblemente QS21.
Preferiblemente la formulación adicional
comprende una emulsión de aceite en agua y tocoferol. La presente
invención también proporciona un procedimiento para producir una
formulación para vacuna que comprende mezclar una proteína de la
presente invención junto con un excipiente farmacéuticamente
aceptable, tal como 3D-MPL.
La vacuna de la presente invención puede
comprender adicionalmente más proteínas del VIH, tal como la
glicoproteína de la cubierta gp160 o su derivado gp120.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
proteína Nef del VIH o Tat del VIH o derivados de las mismas
expresadas en Pichia pastoris.
La invención se describirá más detalladamente en
referencia a los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas Nef y Tat, dos proteínas
reguladoras codificadas por el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH-1), se produjeron en E. coli y en la
levadura metilotrófica Pichia pastoris.
Se seleccionó el gen nef del clon aislado
Bru/Lai (Cell 40: 9-17, 1985) para estas
construcciones, porque este gen está entre los más relacionados con
la proteína Nef de consenso.
El material inicial para el gen nef de
Bru/Lai era un fragmento de ADN de 1.170 pb clonado en el vector de
expresión de mamífero pcDNA3 (pcDNA3/nef).
El gen tat se origina a partir del clon
molecular BH10. Este gen se recibió como un clon de ADNc de HTLV III
denominado pCV1 y descrito en Science, 229, pág.
69-73, 1985.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias que codifican la proteína Nef,
así como una fusión de las secuencias nef y tat se
colocó en vectores plasmídicos: pRIT14586 y pRIT14589 (véase la
Figura 1).
Nef y la fusión Nef-Tat se
produjeron como proteínas de fusión usando como pareja de fusión una
parte de la proteína D. La proteína D es una proteína de unión a
inmunoglobulina D expuesta en la superficie de la bacteria Gram
negativa Haemophilus influenzae.
pRIT14586 contiene, bajo el control de un
promotor PL de \lambda, una secuencia de ADN derivada de la
bacteria Haemophilus influenzae que codifica los primeros 127
aminoácidos de la proteína D (Infect. Immun. 60:
1336-1342, 1992), seguida inmediatamente por una
región de un sitio de clonación múltiple más una secuencia de ADN
que codifica una glicina, 6 restos histidina y un codón de parada
(Figura 1A).
Este vector está diseñado para expresar una
proteína de fusión unida a lípidos procesada con una cola de
histidina (proteína de fusión LipoD). La proteína de fusión se
sintetiza como un precursor con una secuencia señal de 18 restos de
aminoácidos de longitud y tras el procesamiento, la cisteína en
posición 19 en la molécula precursora se convierte en el resto amino
terminal que, a continuación, se modifica uniéndose covalentemente a
ácidos grasos (Figura 1B).
pRIT14589 es casi idéntico a pRIT14586, excepto
que la secuencia derivada de la prot D comienza inmediatamente
después del codón 19 para cisteína.
La expresión de este vector da lugar a una
proteína de fusión sin unir a lípidos con cola de His (proteína de
fusión Prot D).
Se hicieron cuatro construcciones:
LipoD-nef-His, LipoD-nef tat-His, Prot D-nef
His y Prot D-nef tat-His.
Las dos primeras construcciones se hicieron
usando el vector de expresión pRIT14586 y las dos últimas
construcciones usando pRIT14589.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen nef (clon aislado Bru/Lai) se
amplificó mediante PCR a partir del plásmido pcDNA3/Nef con los
cebadores 01 y 02.
La región nefDNA amplificada comienza en
el nucleótido 8.357 y termina en el nucleótido 8.971 (Cell,
40:9-17, 1985).
Se introdujo un sitio de restricción NcoI (que
lleva el codón ATG del gen nef) en el extremo 5' del
fragmento de PCR, mientras que en el extremo 3' se introdujo un
sitio SpeI.
El fragmento de PCR obtenido y el plásmido de
expresión pRIT14586 se cortaron ambos con las enzimas de restricción
NcoI y SpeI, se purificaron en un gel de agarosa, se ligaron y se
transformaron en la célula hospedadora E. coli apropiada, la
cepa AR58. Esta cepa es un lisógeno \lambda críptico derivado de
N99 que es galE::Tn10, \Delta-8
(chlD-pgl), \Delta-H1
(cro-chlA), N^{+} y cI857.
El plásmido recombinante resultante, tras la
verificación de la región nef amplificada mediante
secuenciación automática (véase la sección 1.1.2 siguiente), recibió
la denominación de pRIT14595.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se transforma en la cepa AR58 de E.
coli, el plásmido recombinante dirige la producción
termoinducible de la proteína heteróloga.
La producción de la proteína termoinducible de
varios transformantes lipoD-Nef-His
recombinantes se analizó mediante SDS-PAGE teñido
con azul de Coomassie. Todos los transformantes analizados mostraron
la producción de la proteína heteróloga termoinducible. La cantidad
de la proteína de fusión
LipoD-Nef-Tat-His
recombinante se estimó en el 10% de la proteína total.
Se seleccionó uno de los transformantes y se le
dio el número de acceso del laboratorio ECLD-N1.
Se volvió a aislar el plásmido recombinante a
partir de la cepa ECLD-N1 y se confirmó la secuencia
de la región codificadora de nef-His mediante secuenciación
automática. Este plásmido recibió la designación oficial de
pRIT14595.
La proteína de fusión Lipo D-nef-His
recombinante completamente procesada y acetilada producida por la
cepa ECLD-N1 se compone de:
º Ácidos grasos
º 109 aa de la proteína D (comenzando en el aa
19 y extendiéndose hasta el aa 127).
º Una metionina, creada mediante el uso del
sitio de clonación NcoI de pRIT14586 (Figura 1).
º 250 aa de la proteína Nef (comenzando en el aa
2 y extendiéndose hasta el aa 206).
º Una treonina y una serina creadas mediante el
procedimiento de clonación (clonando en el sitio SpeI de
pRIT14586).
pRIT14586).
º Una glicina y seis histidinas.
\global\parskip0.950000\baselineskip
La construcción del plásmido de expresión
pRIT14600 que codifica la proteína de fusión Prot
D-Nef-His era idéntica a la
construcción plasmídica descrita en el ejemplo 1.1.1 excepto porque
se usó pRIT14589 como plásmido receptor para el fragmento nef
amplificado por PCR.
La cepa AR58 de E. coli se transformó con
pRIT14600 y los transformantes se analizaron como se describe en el
ejemplo 1.1.2. El transformante seleccionado recibió el número del
acceso del laboratorio ECD-N1.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen tat (clon aislado BH10) se
amplificó mediante PCR a partir de un derivado del plásmido pCV1 con
los cebadores 03 y 04. Se introdujeron los sitios de restricción
SpeI en ambos extremos del fragmento de PCR.
La secuencia de nucleótidos del gen tat
amplificado se ilustra en el clon pCV1 (Science 229:
69-73, 1985) y se extiende del nucleótido 5.414 al
nucleótido 7.998.
El fragmento de PCR obtenido y el plásmido
pRIT14595 (que expresa la proteína
lipoD-Nef-His) se digirieron ambos
con la enzima de restricción SpeI, se purificaron en un gel de
agarosa, se ligaron y transformaron en células AR58 competentes. El
plásmido recombinante resultante, tras la verificación de la
secuencia del tat amplificada mediante secuenciación
automática (véase la sección 1.3.2 siguiente), recibió la
denominación de pRIT14596.
\vskip1.000000\baselineskip
Los transformantes se crecieron, se indujeron
por calor y sus proteínas se analizaron mediante geles teñidos con
azul de Coomassie. El nivel de producción de la proteína
recombinante se estimó en el 1% de la proteína total. Se seleccionó
una cepa recombinante que recibió la denominación del laboratorio de
ECLD-NT6.
El plásmido recombinante
lipoD-nef-tat-His se volvió a aislar a partir
de la cepa ECLD-NT6, se secuenció y recibió la
denominación oficial de pRIT14596.
La proteína de fusión Lipo
D-Nef-Tat-His
recombinante completamente procesada y acetilada producida por la
cepa ECLD-N6 se compone de:
º Ácidos grasos
º 109 aa de la proteína D (comenzando en el aa
19 y extendiéndose hasta el aa 127).
º Una metionina, creada mediante el uso del
sitio de clonación NcoI de pRIT14586.
º 205 aa de la proteína Nef (comenzando en el aa
2 y extendiéndose hasta el aa 206).
º Una treonina y una serina creadas mediante el
procedimiento de clonación
º 85 aa de la proteína Tat (comenzando en el aa
2 y extendiéndose hasta el aa 86).
º Una treonina y una serina introducidas
mediante el procedimiento de clonación
º Una glicina y seis histidinas.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción del plásmido de expresión
pRIT14601 que codifica la proteína de fusión Prot
D-Nef-Tat-His era
idéntica a la construcción plasmídica descrita en el ejemplo 1.3.1
excepto porque pRIT14600 se usó como plásmido receptor para el
fragmento nef amplificado por PCR.
La cepa AR58 de E. coli se transformó con
pRIT14601 y los transformantes se analizaron como se describe
previamente. El transformante seleccionado recibió el número de
acceso del laboratorio ECD-NT1.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína Nef, la proteína Tat y la fusión
Nef-Tat se expresaron en la levadura metilotrófica
Pichia pastoris bajo el control del promotor inducible de la
alcohol oxidasa (AOX1).
Para expresar estos genes del
VIH-1, se usó una versión modificada del vector de
integración PHIL-D2 (INVITROGEN). Este vector se
modificó de forma que la expresión de la proteína heteróloga se
iniciaba inmediatamente después del codón ATG nativo del gen AOX1 y
producía una proteína recombinante con una cola de una glicina y
seis restos histidina. Este vector
PHIL-D2-MOD se construyó clonando un
enlazador oligonucleotídico entre los sitios AsuII y EcoRI
adyacentes del vector PHIL-D2 (véase la Figura 3).
Además de la cola de His, este enlazador lleva los sitios de
restricción NcoI, SpeI y XbaI, entre los que se insertaron
nef, tat y la fusión
nef-tat.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen nef se amplificó por PCR a partir
del plásmido pcDNA3/Nef con los cebadores 01 y 02 (véase la sección
1.1.1 construcción de pRIT14595). El fragmento obtenido por PCR y el
vector de integración PHIL-D2-MOD se
escindieron con las enzimas NcoI y SpeI, se purificaron en gel de
agarosa y se ligaron para crear el plásmido de integración pRIT14597
(véase la Figura 3).
El gen tat se amplificó por PCR a partir
de un derivado del plásmido pCV1 con los cebadores 05 y 04 (véase la
sección 1.3.1 construcción de pRIT14596):
Se introdujo un sitio de restricción NcoI en el
extremo 5' del fragmento de PCR mientras que se introdujo un sitio
SpeI en el extremo 3' con el cebador 04. El fragmento de PCR
obtenido y el vector PHIL-D2-MOD se
escindieron ambos con NcoI y SpeI, se purificaron en un gel de
agarosa y se ligaron para crear el plásmido de integración
pRIT14598.
Para construir pRIT14599, un fragmento de ADN de
910 pb correspondiente a la secuencia codificadora
nef-tat-His se ligó entre los sitios de EcoRI
romos (polimerasa de T4) y de NcoI del vector
PHIL-D2-MOD. El fragmento que
codifica nef-tat-His se obtuvo mediante
digestiones de XbaI romas (polimerasa de T4) y de NcoI de
pRIT14596.
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener cepas de Pichia pastoris que
expresen Nef-His, Tat-His y la
fusión Nef-Tat-His, se transformó la
cepa GS 115 con fragmentos lineales NotI que llevaban los
respectivos casetes de expresión, además del gen HIS4 para
complementar la his4 en el genoma hospedador. La transformación de
GS 115 con los fragmentos lineales NotI favorece la recombinación en
el locus AOX1.
Se seleccionaron clones integrantes multicopia
mediante análisis cuantitativo por transferencia en puntos y se
determinó el tipo de integración, inserción (fenotipo Mut^{+}) o
transición (fenotipo Mut^{5}).
Para cada transformación, se seleccionó un
transformante que mostraba un elevado nivel de producción de la
proteína recombinante:
La cepa Y1738 (fenotipo Mut^{+}), que produce
la proteína Nef-His recombinante, una proteína de
215 aminoácidos miristilada que está compuesta de:
º Ácido mirístico
º Una metionina, creada mediante el uso del
sitio de clonación NcoI de
PHIL-D2-MOD.
º 205 aa de la proteína Nef (comenzando en el aa
2 y extendiéndose hasta el aa 206).
º Una treonina y una serina creadas mediante el
procedimiento de clonación (clonando en el sitio SpeI del vector
PHIL-D2-MOD).
º Una glicina y seis histidinas.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La cepa Y1739 (fenotipo Mut^{+}) que produce
la proteína Tat-His recombinante, una proteína de 95
aminoácidos miristilada que está compuesta de:
º Una metionina, creada mediante el uso del
sitio de clonación NcoI.
º 85 aa de la proteína Tat (comenzando en el aa
2 y extendiéndose hasta el aa 86).
º Una treonina y una serina creadas mediante el
procedimiento de clonación
º Una glicina y seis histidinas.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa Y1737 (fenotipo Mut^{s}) que produce
la proteína de fusión Nef-Tat-His
recombinante, una proteína miristilada de 302 aminoácidos que está
compuesta de:
º Ácido mirístico
º Una metionina, creada mediante el uso del
sitio de clonación NcoI.
º 205 aa de la proteína Nef (comenzando en el aa
2 y extendiéndose hasta el aa 206).
º Una treonina y una serina creadas mediante el
procedimiento de clonación
º 85 aa de la proteína Tat (comenzando en el aa
2 y extendiéndose hasta el aa 86).
º Una treonina y una serina creadas mediante el
procedimiento de clonación
º Una glicina y seis histidinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Así como se hizo con una proteína de fusión
Nef-Tat mutante, también se expresó una proteína Tat
recombinante mutante. La proteína Tat mutante debe ser
biológicamente inactiva y a la vez mantener sus
epítopos inmunogénicos.
Se seleccionó para estas construcciones un gen
tat doble mutante, construido por D. Clements (Universidad de
Tulane).
Este gen tat (procedente del clon
molecular BH10) tiene mutaciones en la región del sitio
activo (Lys41\rightarrowAla) y en el motivo RGD
(Arg78\rightarrowLys y Asp80\rightarrowGlu) (Virology 235:
48-64, 1997).
El gen tat mutante se recibió como un
fragmento de ADNc subclonado entre los sitios EcoRI e HindIII en un
plásmido de expresión del CMV (pCMVLys41/KGE).
\vskip1.000000\baselineskip
El gen tat mutante se amplificó por PCR a
partir del plásmido pCMVLys41/KGE con los cebadores 05 y 04 (véase
la sección 2.1 construcción de pRIT14598).
Se introdujo un sitio de restricción NcoI en el
extremo 5' del fragmento de PCR mientras que en el extremo 3' se
introdujo un sitio SpeI con el cebador 04. El fragmento de PCR
obtenido y el vector PHIL-D2-MOD se
restringieron ambos con NocI y SpeI, se purificaron en un gel de
agarosa y se ligaron para crear el plásmido de integración
pRIT14912.
Para construir pRIT14193, se amplificó el gen
tat mutante por PCR a partir del plásmido pCMVLys41/KGE con
los cebadores 03 y 04 (véase la sección 1.3.1 construcción de
pRIT14596).
El fragmento de PCR obtenido y el plásmido
pRIT14597 (que expresa la proteína Nef-His) se
digirieron ambos con la enzima de restricción SpeI, se purificaron
en un gel de agarosa y se ligaron para crear el plásmido de
integración pRIT14913.
\newpage
Se obtuvieron cepas de Pichia pastoris
que expresaban la proteína Tat mutante-His y la
fusión Nef-Tat mutante-His,
aplicando estrategias de integración y selección de cepas
recombinantes descritas previamente en la sección 2.2.
Se seleccionaron dos cepas recombinantes que
producían la proteína Tat mutante-His, una proteína
de 95 aminoácidos: Y1775 (fenotipo Mut^{+}) e Y1776 (fenotipo
Mut^{s}).
Se seleccionó una cepa recombinante que
expresaba la proteína de fusión Nef-Tat
mutante-His, una proteína de 302 aminoácidos: Y1774
(fenotipo Mut^{+}).
\vskip1.000000\baselineskip
El esquema de purificación se ha desarrollado a
partir de 146 g de células de Pichia pastoris recombinantes
(peso húmedo) o 2 l de homogeneizado con Dyno-mill
de DO 55. Las etapas cromatográficas se realizaron a temperatura
ambiente. Entre las etapas, las fracciones positivas para
Nef-Tat se mantienen durante toda la noche en la
cámara fría (+4ºC); para tiempos más prolongados, las muestras se
congelan a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El nivel de pureza estimado en
SDS-PAGE se muestra en la Figura 4 mediante la
tinción con plata de Daiichi y en la Figura 5 mediante azul de
Coomassie G250.
Tras la etapa de Superdex200: > 95%.
Tras las etapas de diálisis y filtración para
esterilización: > 95%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purifican 51 mg de proteína
Nef-Tat-His a partir de los 146 g de
células de Pichia pastoris recombinante (= 2 l de
homogeneizado con Dyno-mill de DO 55).
\vskip1.000000\baselineskip
Una vacuna preparada según la invención
comprende el producto de expresión de un ADN recombinante que
codifica un antígeno como se explica en los ejemplos 1 ó 2, y como
coadyuvante, la formulación que comprende una mezcla del
monofosforil lípido
A-3-de-O-acetilado,
3D-MPL y QS21 en una emulsión de aceite/agua.
3D-MPL: es una forma
químicamente detoxificada del lipopolisacárido (LPS) de la bacteria
Gram-negativa Salmonella minnesota.
Experimentos realizados en el Smith Kline
Beecham Biologicals han demostrado que 3D-MPL,
combinado con diversos vehículos, potencia mucho tanto la inmunidad
humoral como una inmunidad celular de tipo TH1.
QS21: es una saponina purificada a partir
de un extracto bruto de la corteza del árbol Quillaja
saponaria Molina que tiene una potente actividad coadyuvante:
activa tanto la linfoproliferación específica de antígeno como los
LCT frente a varios antígenos. Experimentos realizados en el Smith
Kline Beecham Biologicals han demostrado un efecto claramente
sinérgico de combinaciones de 3D-MLP y QS21 en la
inducción tanto de respuestas humorales como de respuestas celulares
de tipo TH1.
\newpage
La emulsión aceite en agua está compuesta
de 2 aceites (un tocoferol y un escualeno) y de PBS que contiene
Tween 80 como emulsionante. La emulsión comprendía escualeno al 5%,
tocoferol al 5%, Tween 80 al 0,4% y tenía un tamaño medio de
partícula de 180 nm (véase el documento WO 95/17210).
Experimentos realizados en el Smith Kline
Beechman Biologicals han demostrado que la agregación de esta
emulsión aceite en agua a 3D-MPL/QS21 aumenta además
sus propiedades inmunoestimulantes.
\vskip1.000000\baselineskip
El Tween 80 se disuelve en solución salina
tamponada con fosfato (PBS) para obtener una solución al 2% en el
PBS. Para proporcionar 100 ml de una emulsión concentrada dos veces,
se mezclan mediante agitación 5 g de
DL-alfa-tocoferol y 5 ml de
escualeno. Se añaden 90 ml de solución PBS/Tween y se mezcla bien. A
continuación, la emulsión resultante se pasa a través de una jeringa
y, finalmente, se microfluidiza usando una máquina para microfluidos
M110S. Las gotitas de aceite resultantes tienen un tamaño de
aproximadamente 180 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
El antígeno preparado según el ejemplo 1 ó 2 (5
\mug) se diluyó en PBS pH 6,8, concentrado 10 veces y H_{2}O
antes de la adición posterior de SB62, 3D-MPL (5
\mug), QS21 (5 \mug) y tiomersal a 50 \mug/ml como conservante
con un intervalo de 5 min. El volumen de emulsión es igual al 50%
del volumen total (50 \mul para una dosis de 100 \mul).
Todas las incubaciones se realizaron a
temperatura ambiente con agitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la caracterización de la respuesta
inmune inducida tras la inmunización con Tat y
Nef-Tat. Para obtener información de los perfiles
de isotipo y de la inmunidad celular (IC) se realizaron dos
experimentos de inmunización en ratones. En el primer experimento,
los ratones se inmunizaron dos veces con dos semanas de diferencia
en las almohadillas plantares con Tat o Nef-Tat en
forma oxidada o reducida, respectivamente. Los antígenos se
formularon en una emulsión de aceite en agua que comprendía
escualeno, tween 80^{TM} (monooleato de sorbitán polioxietileno)
QS21, 3D-MPL y \alpha-tocoferol y
un grupo control que recibió sólo el coadyuvante. Dos semanas
después de la última inmunización, se obtuvieron los sueros y se
sometieron a un ELISA específico para Tat (usando Tat reducido para
el recubrimiento) para la determinación de los valores e isotipos de
los anticuerpos (Figura 6a). Los valores de anticuerpos fueron
mayores en los ratones que habían recibido Tat oxidada. En general,
las moléculas oxidadas inducían valores de anticuerpos mayores que
las formas reducidas y Tat por sí sola inducía valores de
anticuerpos mayores de Nef-Tat. La última
observación se confirmó en el segundo experimento. Curiosamente, el
perfil de isotipo de anticuerpos específicos de Tat difería
dependiendo de los antígenos usados para la inmunización. Tat por
sí sola provocada un perfil equilibrado de IgG1 e IgG2a, mientras
que Nef-Tat inducía un sesgo hacia T_{H2} más
fuerte (Figura 6b). Esto se confirmó una vez más en el segundo
experimento.
En el segundo experimento con ratones, los
animales recibieron sólo las formas reducidas de las moléculas o
sólo el coadyuvante. Además del análisis serológico (véase
anteriormente), se evaluaron las respuestas linfoproliferativas de
células de ganglios linfáticos. Tras la reestimulación de estas
células in vitro con Tat o Nef-Tat, se midió
la incorporación de ^{3}H-timidina tras 4 días de
cultivo. La presentación de los resultados como índices de
estimulación indica que se inducían respuestas muy potentes en los
dos grupos de ratones que habían recibido el antígeno (Figura
7).
En conclusión, los estudios en ratones indican
que Tat, así como Nef-Tat, son antígenos muy
inmunogénicos candidatos a vacunas. La respuesta inmune dirigida
frente a las dos moléculas se caracteriza por altas respuestas de
anticuerpos con al menos el 50% de IgG1. Además, se observaron
fuertes respuestas IC (según se midió por linfoproliferación).
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigó la capacidad de las moléculas Tat y
Nef-Tat en forma oxidada o reducida para unirse a
líneas de células T humanas. Además, se evaluó el efecto sobre el
crecimiento de estas líneas celulares. Las placas de ELISA se
recubrieron durante toda la noche con concentraciones diferentes de
las proteínas Tat y Nef-Tat, la gD no relacionada
del virus del herpes simple de tipo II o sólo con un tampón control.
Tras retirar la solución de recubrimiento, se añadieron a los
pocillos células HUT-78. Tras dos horas de
incubación, los pocillos se lavaron y se evaluó microscópicamente
la unión de las células al fondo de los pocillos. Como medida
cuantitativa, las células se tiñeron con azul de toluidina, se
lisaron con SDS y se determinó la concentración de azul de
toluidina en el sobrenadante con un lector de placas de ELISA. Los
resultados indican que las cuatro proteínas, Tat y
Nef-Tat en forma oxidada o reducida, se unen a las
células de la placa de ELISA (Figura 8). Ni la proteína no
relacionada (datos no mostrados) ni el tampón se fijaban a las
células. Esto indica que las proteínas que contienen Tat expresadas
de forma recombinante se unen específicamente a líneas de células T
humanas.
En un segundo experimento, las células
HUT-78 se dejaron en contacto con las proteínas
durante 16 horas. Al final del periodo de incubación, las células
se marcaron con [^{3}H]-timidina y se determinó la
tasa de incorporación como medida del crecimiento celular. Las
cuatro proteínas incluidas en este estudio inhibían el crecimiento
celular a juzgar por la disminución de la incorporación de
radiactividad (Figura 9). El control de tampón no mediaba en este
efecto. Estos resultados demuestran que las proteínas recombinantes
que contienen Tat son capaces de inhibir el crecimiento de una línea
de células T humanas.
En resumen, la caracterización funcional de las
proteínas Tat y Nef-Tat revela que estas proteínas
son capaces de unirse a líneas de células T humanas. Además, las
proteínas son capaces de inhibir el crecimiento de estas líneas
celulares.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: SmithKline Beecham Biologicals. S.A.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 27
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: SmithKline Beecham
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Two New Horizons Court
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Brentford
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Middx, Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: TW8 9EP
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ para Windows, Versión 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD :
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 26-SEP-1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Bor, Fiona R.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 0181 975 2817
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 0181 975 6141
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 441 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 144 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 648 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 216 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 288 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 909 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 303 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.029 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 325 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.290 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 16:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 412 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 981 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 327 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.242 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 414 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 288 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 909 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 24:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 303 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Una composición de vacuna proteínica que
proteínica que comprende una proteína expresada, recuperada y
aislada que comprende
(a) una proteína Tat del HIV completa o Tat con
una cola de histidina en el extremo C-terminal, o
una Tat mutada que ha experimentado una deleción, adición o
sustitución de un aminoácido, o una Tat mutada como se define en la
ID SEC Nº 23, unida a (i) una pareja de fusión proteica o
lipoproteica o a (ii) una proteína Nef del VIH completa o Nef con
una cola de histidina en el extremo C-terminal o a
Nef que ha experimentado una deleción, adición o sustitución de un
aminoácido; o
(b) una proteína Nef del VIH completa o Nef con
una cola de histidina en el extremo C-terminal, o
Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un
aminoácido, unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipoproteica
o a (ii) una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de
histidina en el extremo C-terminal o a una Tat
mutada que ha experimentado una deleción, adición o sustitución de
un aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23;
o
(c) una proteína Nef del VIH completa o Nef con
una cola de histidina en el extremo C-terminal, o
Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un
aminoácido, unida a una proteína Tat del VIH completa o Tat con una
cola de histidina en el extremo C-terminal o a una
Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de
uno aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23
y una pareja de fusión proteica o lipoproteica, mezclada con un
excipiente farmacéuticamente aceptable mezclada con un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Una composición según la reivindicación 1 que
comprende una proteína de fusión Tat-Nef o un
derivado de la misma.
3. Una composición según la reivindicación 1 que
comprende una proteína de fusión Nef-Tat o un
derivado de la misma.
4. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en la que la lipoproteína es la proteína D de
Haemophilus influenzae de tipo B o un derivado de la
misma.
5. Una composición según la reivindicación 4 en
la que la pareja de fusión comprende entre 100-130
aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína D
de Haemophilus influenzae de tipo B.
6. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína Tat se fusiona con una
proteína Nef del VIH y una pareja de fusión.
7. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que la proteína tiene una cola de
histidina.
8. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 en la que la proteína es una proteína de
fusión Nef-Tat y está carboximetilada.
9. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que adicionalmente comprende un
coadyuvante.
10. Una composición según la reivindicación 9,
en la que el coadyuvante es un coadyuvante que induce una respuesta
TH1.
11. Una composición según la reivindicación 9 ó
10 cuyo coadyuvante comprende el monofosforil lípido A o un derivado
del mismo, tal como monofosforil lípido A
3-de-O-acilado.
12. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11 que adicionalmente comprende una saponina
como coadyuvante.
13. Una composición según la reivindicación 11 o
la reivindicación 12 que adicionalmente comprende una emulsión de
aceite en agua y tocoferol.
14. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a la reivindicación 13 en la que el coadyuvante
comprende 3D-MPL, QS21 y una emulsión de aceite en
agua de tocoferol, escualeno y Tween 80^{TM}.
15. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14 que además comprende la gp160 del VIH o su
derivado gp120.
16. Una proteína que comprende una proteína Tat
del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo
C-terminal o una Tat mutada que ha experimentado
deleción, adición o sustitución de un aminoácido o una Tat mutada
como se define en la ID SEC Nº 23, unida a una proteína Nef del VIH
completa o a Nef con una cola de histidina en el extremo
C-terminal o Nef que ha experimentado una deleción,
adición o sustitución de un aminoácido, en orientación
Nef-Tat o Tat-Nef.
17. Un procedimiento para preparar una proteína
que comprende (a) una proteína Tat del VIH completa o Tat con una
cola de histidina en el extremo C-terminal, o una
Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de
un aminoácido, o una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23,
unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipoproteica o a (ii)
una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en
el extremo C-terminal, o a Nef que ha experimentado
deleción, adición o sustitución de un aminoácido; o (b) una proteína
Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo
C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción,
adición o sustitución de un aminoácido, unida a (i) una pareja de
fusión proteica o lipoproteica o a (ii) una proteína Tat del VIH
completa o Tat con una cola de histidina en el extremo
C-terminal, o a una Tat mutada que ha experimentado
deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o a una Tat mutada
como se define en la ID SEC Nº 23; o (c) una proteína Nef del VIH
completa o Nef con una cola de histidina en el extremo
C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción,
adición o sustitución de un aminoácido, unida a una proteína Tat del
VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo
C-terminal, o a una Tat mutada que ha experimentado
deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o a una Tat mutada
como se define en la ID SEC Nº 23, y una pareja de fusión proteica o
lipoproteica, en Pichia pastoris, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas de trasformar Pichia pastoris con
ADN que codifica dicha proteína, expresar dicha proteína y recuperar
al proteína
18. El procedimiento de la reivindicación 17 en
el que la proteína es una proteína de fusión Nef-Tat
y el procedimiento además comprende una etapa de carboximetilación
realizada en la proteína expresada.
19. Un procedimiento de producción de una
vacuna, que comprende mezclar la proteína de una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 18 con un diluyente farmacéuticamente
aceptable.
20. El procedimiento de la reivindicación 19 que
además comprende la adición de la gp 160 del VIH o su derivado gp
120.
21. El procedimiento de las reivindicaciones 17
a 20 que además comprende la adición de un coadyuvante,
especialmente un coadyuvante que induce una respuesta TH1.
22. Una proteína o polinucleótido
Nef-Tat-His o
Nef-Tat mutante-His que tiene la
secuencia de aminoácidos o de ADN mostrada en las ID SEC Nº 12, 13,
16, 17, 20, 21, 24 ó 25.
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