ES2269211T3 - Enzimas homologas de la heparanasa humana y sus variantes de empalme. - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido que: a) comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. ID No. 2 (Figura 1), que comienza en el residuo 1, 2, 11, 12 o 43; b) comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. ID No. 4 (Figura 2), que comienza en el residuo 1, 2, 11, 12 o 43; c) comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. ID No. 6 (Figura 3), que comienza en el residuo 1, 2, 11, 12 o 43; o d) es un derivado de por lo menos 40 aminoácidos de longitud que tiene una o más sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos en relación con un polipéptido definido en a), b) o c) anteriores, siendo dicho derivado por lo menos 80% idéntico a una secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido; o e) es un fragmento de un polipéptido definido en a), b) o c) anteriores, el cual tiene al menos 40 aminoácidos de longitud o un fragmento de un polipéptido definido en d) anterior, el cual tiene al menos 50 aminoácidos de longitud.

Description

Enzimas homólogas de la heparanasa humana y sus variantes de empalme.
La presente invención se refiere a proteínas semejantes a heparanasa y nucleótidos que las codifican.
La heparanasa es una enzima que puede degradar heparansulfato además de proteoglicanos de heparina (HPG) y proteoglicanos de heparansulfato (HSPG). La actividad de heparanasa en las células de mamíferos es bien conocida. La actividad se ha identificado en diversas células de melanomas (Nakajima, et al, Cancer Letters 31:277-283, 1986), células de adenocarcinomas mamarios (Parish, et al., Int. J Cancer, 40:511-518, 1987), células de leucemia (Yahalom, et al, Leukemia Research 12:711-717, 1988), células de carcinoma de próstata (Kosir, et al., J. Surg. Res. 67:98-105, 1997), mastocitos (Ogren and Lindahl, J. Biol. Chem. 250:2690-2697, 1975), macrófagos (Savion, et al, J Cell, Physiol. 130:85-92, 1987), células mononucleares (Sewell, et al, Biochem. J. 264:777-783, 1989), neutrófilos (Matzner et al, 51:519-524, 1992,) células T (Vettel et al, Eur. J. Immunol. 21:2247-2251, 1991), plaquetas (Haimovitz-Friedman, et al, Blood 78:789-796, 1991), células endoteliales (Godder, et al, J. Cell Physiol. 148:274-280, 1991), y placenta (Klein and von Figura, BBRC 73:569, 1976), y células B.
Se ha informado una elevada actividad de heparanasa en células invasivas, móviles, tales como las células de tumores metastásicos. Ejemplos incluyen el melanoma invasivo (Nakajima et al Science 220:611 (1983)), linfoma (Vlodaysky et al, Cancer Res. 43:2704, (1983)), fibrosarcoma (Becker et al, J. Natl. Cancer Inst., 77:417, (1986)), rabdomiosarcoma (Patente estadounidense No 4.882.318), mastocitoma, adeno-carcinoma mamario, leucemia y fibroblastos reumatoides. La actividad de heparanasa se ha informado en situaciones no patológicas que involucran la migración de linfocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos y plaquetas (Vlodaysky et al, Invasion Metastasis 12:112-127, 1992). La actividad de heparanasa está también implicada en la inflamación (Hoogewerf J. Biol Chem 270:3268-3277 (1995); W097/11684), cicatrización de heridas (Whitelock et al, J. Biol. Chem. 271:10079-10086, (1996)), angiogénesis (Patente estadounidense No. 5.567.417), enfermedades inflamatorias tales como artritis (que incluyen la artritis reumatoide y osteoartritis), asma, lupus eritematoso, injertos, además de restenosis vascular, ateroesclerosis, crecimiento y avance de tumores, trastornos fibroproliferativos, enfermedad de Alzheimer (McBubbin et al Biochem. J. 256:775-783 (1999); Snow et al, Neuron 12:219-234 (1996)) y otras varias. En general, se puede decir que la actividad de heparanasa está presente en las células invasivas móviles en una variedad de patologías. De esta manera, los inhibidores de heparanasa son de probable gran valor en el tratamiento de éstas.
Además, la inhibición de la degradación de heparansulfato debería inhibir la liberación de factores de crecimiento unidos y otros modificadores de la respuesta biológica que debería en el caso de ser liberados, estimular el crecimiento de los tejidos adyacentes y proporcionar un ambiente propicio para el crecimiento celular (Rapraeger et al, Sdence 252:1705-1708, 1991).
W099/11798, W099121975, W099/40207 y W099/43830 todas se refieren a ácidos nucleicos que codifican heparanasa humana, además de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos.
Descripción general de la invención
Los presentes inventores han identificado una proteína semejante a la heparanasa humana que está presente en por lo menos tres variantes de empalme.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido que:
a) comprende la secuencia de ácidos nucleicos que se muestra en la Figura 1 (Sec. ID No. 2), partiendo tanto del residuo 1 como del residuo 11;
b) comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 2 (Sec. ID No. 4) partiendo tanto del residuo 1 como del residuo 11;
c) comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 3 (Sec. ID No 6), partiendo tanto del residuo 1 como del residuo 11;
d) es un derivado de por lo menos 40 aminoácidos de longitud que tiene una o más sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos en relación con una sustancia definida en a), b) o c) anterior, o dicho derivado es por lo menos 80% idéntico a una secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido.
e) es un fragmento de un polipéptido definido en a), b) o c) anterior, que tiene por lo menos 40 aminoácidos de largo o un fragmento de un polipéptido definido en d) anterior, que tiene por lo menos 50 aminoácidos de largo.
Los presentes inventores han hallado un homólogo humano de heparanasa que está presente en tres variantes de empalme. Existe una homología considerable entre las variantes de empalme y la secuencia publicada para la heparanasa humana, y los péptidos de la invención pueden demostrar actividad bioquímica típica de una enzima heparanasa. Los nuevos polipéptidos de la presente invención pueden exhibir una actividad que es similar a la de la heparanasa. Alternativamente o adicionalmente, el homólogo puede modular la actividad de la heparanasa endógena (por ej., por tener fragmentos del dominio de unión al heparano).
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos predicha de la variante de empalme más grande de la proteína semejante a heparanasa de la presente invención, que incluye 600 nucleótidos de 5'UTR y 260 nucleótidos de 3'UTR. El exón de empalme se muestra en negrita y subrayado y la secuencia putativa iniciadora está subrayada;
La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos predicha de la variante de empalme de tamaño medio de la proteína semejante a heparanasa de la presente invención, que incluye 600 nucleótidos de 5'UTR y 260 nucleótidos de 3'UTR. El exón de empalme se muestra en negrita y subrayado;
La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos predicha de la variante de empalme más pequeña de la proteína semejante a heparanasa de la presente invención, que incluye 600 nucleótidos de 5'UTR y 260 nucleótidos de 3'UTR. Los nucleótidos en itálica son 9 cebadores de PCR que se usan para extender la secuencia para cada región, se muestran dos cebadores PCR: cebadores hepa delanteros (F) o inversos ®;
La Figura 4 muestra un alineamiento de la proteína heparanasa publicada ("heparanasa") con la variante de empalme más corta de la proteína semejante a heparanasa de la presente invención ("nueva"). Se similar la secuencia de proteínas traducida. * = identidad, : muy similar, . = levemente similar, y - = espaciamiento introducido para permitir un mejor ajuste.
La Figura 5 muestra la estrategia general que se emplea para identificar las proteínas semejantes a la heparanasa de la presente invención;
La Figura 6 ilustra la a homología entre las secuencias de las proteínas semejantes a la heparanasa de la presente invención y la de la heparanasa humana.
La Figura 7 es un gráfico que muestra la expresión de ARNm, en relación con ADNc, para la proteína semejante a la heparanasa de la presente invención en una variedad de tejidos, normales y tumorales, y líneas celulares; y
La Figura 8a muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la secuencia semejante a la heparanasa de ratón parcial con parte de la forma larga de la proteína semejante a heparanasa humana de la presente invención. Las identidades se muestran en negrita. La Figura 8b muestra un alineamiento de la secuencia de nucleótidos de la secuencia semejante a la heparanasa de ratón con parte de la forma larga de la proteína semejante a heparanasa humana de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
Las proteínas o polipéptidos de la presente invención se denominan Hpa2 o proteínas relacionadas con Hpa2. Hpa2 se refiere a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 1, 2 o 3 (Sec. ID No. 2, 4 o 6), partiendo del residuo 1, 2, 11 o 12. Las proteínas relacionadas con Hpa2 son derivados de Hpa2, que incluyen análogos, ortólogos y homólogos, proteínas de fusión Hpa2, fragmentos, isoformas, variantes o fragmentos de cualquiera de los
precedentes.
La persona experta es capaz de determinar si cualquier polipéptido dado tiene o no actividad de heparanasa, por ejemplo mediante cualquier ensayo conocido para determinar la actividad de heparanasa. Haimovitz-Friedman et al (Blood 78:789-796,1991) describe un ensayo para determinar la actividad de heparanasa que involucra el cultivo de células endoteliales en ^{35}SO_{4} radiomarcado para producir proteoglicanos de heparansulfato radiomarcados. Las células se retiran para dejar la matriz extracelular depositada que contiene el ^{35}S-HSPG, se agrega la heparanasa putativa y se detecta la actividad al pasar el sobrenadante de la matriz extracelular radiomarcada por una columna de filtración de gel. Los cambios en la cantidad de material radiomarcado indican que se ha producido la degradación de HSPG. Un ensayo alternativo está descripto por Nakajima et al (Anal. Biochem. 196:162-171, 1986). En este ensayo, la actividad de heparanasa del melanoma se determina por radiomarcado de heparansulfato de pulmón bovino con anhídrido [^{14}C]-acético. Los grupos amino libres del [^{14}C]-heparansulfato se acetilan y los terminales reductores se aminan. El [^{14}C]-heparansulfato se acopla químicamente a un soporte de agarosa por medio de los grupos aminos introducidos en los terminales reductores para proporcionar un sustrato en fase sólida. Un ensayo indirecto para determinar la actividad de heparanasa utiliza la capacidad de la heparina de interferir con el desarrollo de color entre una proteína y el colorante azul brillante Coomassie (Khan & Newman, Anal. Biochem, 196:373-376, 1991). La actividad de heparanasa se detecta por la pérdida de esta interferencia. W099/43830 también describe un ensayo para determinar la actividad de heparanasa.
Los polipéptidos de la presente invención pueden estar en cualquier forma apropiada. Estos pueden estar en forma aislada o recombinante, y pueden estar fusionados a otros residuos. Estos se pueden proporcionar en forma sustancialmente pura. De esta manera, un polipéptido de la presente invención se puede proporcionar en una composición en la cual este es el componente predominante presente (es decir, este está presente en un nivel de por lo menos 50%; con preferencia por lo menos 75%, por lo menos 90%, o por lo menos 95%; cuando se determina sobre la base de peso/peso excluyendo solventes o vehículos).
La proteína Hpa2 o relacionada con Hpa2 de la presente invención pueden existir como dos cadenas de polipéptidos, una tiene el extremo amino terminal exactamente o aproximadamente de 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 kD de Hpa2 o proteína relacionada con Hpa2de longitud completa, la segunda es el extremo carboxilo terminal restante de la proteína. Opcionalmente, la segunda cadena polipeptídica del extremo carboxilo terminal puede tener eliminados exactamente o aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8 o 9 kD de su extremo amino terminal. Las dos cadenas de polipéptidos se pueden producir separadamente o a partir de un transcripto simple. Cuando se produce a partir de un transcripto simple, el polipéptido de longitud completa resultante se procesa adicionalmente para producir los dos polipéptidos.
Con el fin de apreciar más plenamente la presente invención, a continuación se tatarán con mayor detalle los polipéptidos dentro del alcance de a)-e) anteriores.
Polipéptidos dentro del alcance de a), b) o c)
Un polipéptido dentro del alcance de a)-b) o c) puede consistir en la secuencia de aminoácidos particular dada en la Figura 1, 2 o 3 (Sec. ID No. 2, 4 o 6), respectivamente o pueden tener una secuencia de aminoácido N-terminal adicional y/o un aminoácido C-terminal adicional en relación con la secuencia dada en la Figura 1, 2 o 3 (Sec. ID No. 2, 4 o 6) respectivamente.
El término "proteína de fusión" como se usa en la presente memoria se refiere a un polipéptido que comprende (f) una secuencia de aminoácidos de Hpa^{2} o un polipéptido relacionado con Hpa^{2} y (ii) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido heterólogo (es decir, un no Hpa^{2} o un polipéptido relacionado con no Hpa^{2}).
Se pueden proporcionar secuencias N-terminales o C-terminales adicionales por diversas razones. Las técnicas para proporcionar tales secuencias adicionales son bien conocidas en la técnica.
Se pueden proporcionar secuencias adicionales para alterar las características de un polipéptido particular. Esto puede ser útil para mejorar la expresión o la regulación de la expresión en sistemas de expresión particulares. Por ejemplo, una secuencia adicional puede proporcionar alguna protección contra la ruptura proteolítica. Esto ha sido realizado para la hormona somatostatina por fusión de ésta en su extremo N-terminal a parte de la enzima \beta galactosidasa (ltakwa et al., Science 198:105-63 (1977)).
Las secuencias adicionales pueden ser también útiles para alterar las propiedades de un polipéptido para colaborar en la identificación o purificación. Por ejemplo, se puede proporcionar una proteína de fusión en la cual un polipéptido se une a un residuo que se puede aislar por cromatografía de afinidad. El residuo puede ser un antígeno o un epítope y la columna de afinidad puede comprender anticuerpos inmovilizados o fragmentos de anticuerpos inmovilizados que se unen a dicho antígeno o epítope (en forma deseable con un alto grado de afinidad). La proteína de fusión se puede eluir usualmente de la columna por medio de la adición de un buffer apropiado.
Las secuencias N-terminales o C-terminales adicionales pueden, sin embargo, estar presentes simplemente como resultado de una técnica particular empleada para obtener un polipéptido de la presente invención y no necesita proporcionar ninguna características ventajosa particular para el polipéptido de la presente invención. Tal polipéptido está dentro del alcance de la presente invención.
Cualquiera que sea la secuencia N-terminal o C-terminal adicional presente; se prefiere que el polipéptido resultante tenga por lo menos una sustancial proporción de la actividad del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1, 2 o 3 (Sec. ID No. 2, 4 o 6). El término "por lo menos una sustancial proporción de la actividad" cuando se usa en la presente memoria significa por lo menos 50% de la actividad de la sustancia dada (con preferencia por lo menos 75% de dicha actividad, con más preferencia por lo menos 90% de dicha actividad, y con mayor preferencia el mismo nivel de actividad o un nivel de actividad superior).
También se incluyen dentro del alcance de las a), b) y c) las isoformas. El término "isoforma" tal como se usa en la presente memoria se refiere a las variantes de un polipéptido que están codificadas por el mismo gen, pero que difieren en pI o PM o ambos. Tales isoformas pueden diferir en su composición de aminoácidos (por ej., como resultado del procesamiento alternativo de un ARNm o pre-ARNm, por ej. empalme alternativo o proteólisis limitada) y además o en un proceso alternativo, puede originarse a partir de una modificación pos-traduccional diferencial (por ej., glicosilación, acilación o fosforilación).
Polipéptidos dentro del alcance de d)
Retornando a los polipéptidos definidos en d) anterior, el experto en la técnica apreciará que estos polipéptidos son análogos, homólogos, ortólogos y variantes del polipéptido dado en a), b) o c) anteriores. Tales polipéptidos pueden o no tener por lo menos una sustancial proporción de actividad del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1, 2 o 3 (Sec. ID No. 2, 4 o 6).
\newpage
El término "análogo de Hpa2" tal como se usa en la presente memoria se refiere a un polipéptido que posee funcione(s) similares o idénticas a Hpa2 pero no debe necesariamente comprender una secuencia de aminoácidos que sea similar o idéntica a la secuencia de aminoácidos de Hpa2, o posee una estructura que es similar o idéntica a la de Hpa2. Como se usa en la presente memoria, una secuencia de aminoácidos de un polipéptido que es "similar" a la de Hpa2 satisface el siguiente criterio: el polipéptido tiene una secuencia de residuos de aminoácidos, por lo menos 50 residuos de aminoácidos, por lo menos 60 residuos de aminoácidos, por lo menos 70 residuos de aminoácidos, por lo menos 80 residuos de aminoácidos, por lo menos 90 residuos de aminoácidos, por lo menos 100 residuos de aminoácidos, por lo menos 125 residuos de aminoácidos o por lo menos 150 residuos de aminoácidos) que es por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de Hpa2. Como se usa en la presente memoria, un polipéptido con "estructura similar" a la de Hpa2 se refiere a un polipéptido que tiene una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria similar a la de Hpa2. La estructura de un polipéptido se puede determinar por métodos conocidos para los expertos en la técnica, que incluyen pero sin limitaciones a, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear y microscopía electrónica cristalográfica.
El término "homólogo" como se usa en la presente memoria se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos similar a la de Hpa2, pero no posee necesariamente una función similar o idéntica a la de Hpa2.
El término "ortólogo" como se usa en la presente memoria se refiere a un polipéptido no humano que (1) comprende una secuencia de aminoácidos similar a la de Hpa2, y (ii) posee una función similar o idéntica a la de Hpa2.
El porcentaje de identidad de las dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos se determina por alineamiento de las secuencias con propósitos de comparación óptima (por ej., se pueden introducir brechas en la primer secuencia para un mejor alineamiento con la secuencias) y comparación de los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones correspondientes. El "mejor alineamiento" es un alineamiento de dos secuencias que producen el mayor porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se determina por el número de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos en las secuencias que se comparan (es decir.; % de identidad =·# de posiciones idénticas /# total de posiciones x 100).
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede obtener mediante un algoritmo matemático conocido por los expertos en la técnica. Un ejemplo de un algoritmo matemático para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990 Prod Natl. Acad. Sci USA 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:5873-5877. Los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 han incorporado tales algoritmos. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntaje = 100, longitud de palabra: 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la invención.. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntaje = 50, longitud de palabras = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineamientos con brechas con propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25S389-3402. Alternativamente, se puede usar PSI-Blast para realizar una búsqueda repetida que detecta relaciones distantes entre moléculas (Id.). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast se pueden emplear los parámetros en defecto de los respectivos programas (por ej., XBLAST y NBLAST) Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Otro ejemplo de un algoritmo matemático empleado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). El programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete del programa de computación de lineamiento de secuencias CGC ha incorporado tal algoritmo. Otros algoritmos para el análisis de secuencias conocidos en la técnica incluyen ADVANCE y ADAM tal como se describe en Torellis y Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci, 10:3.5; y FASTA descripto en Pearson y Lipman (1988) Prod Natl. Acad. Sol 85:2444-8. Within FASTA, ktup es una opción de control que ajusta la sensibilidad y velocidad de la búsqueda.
La presente invención también se refiere a las variantes de los polipéptidos de la invención dentro de las limitaciones de secuencias detalladas anteriormente. Tales variantes tienen secuencias de aminoácidos alteradas que pueden funcionar tanto como agonistas (miméticos) o como antagonistas. Las variantes se pueden generar por mutagénesis, por ej. mutación puntual o truncamiento. Un agonista puede retener sustancialmente la misma, o un subconjunto de las actividades biológicas de las formas que se producen naturalmente de la proteína. Un antagonista de una proteína puede inhibir uno o más de las actividades de la forma que se produce naturalmente de la proteína por medio, por ejemplo, de la unión competitiva a un miembro secuencia arriba o secuencia abajo de una cascada de señalización celular que incluye a la proteína de interés. De este modo, los efectos biológicos específicos se pueden estimular por tratamiento con una variante de función limitada. El tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subconjunto de actividades biológicas de las formas que se producen naturalmente de la proteína puede tener menos efectos secundarios en un sujeto en relación con la forma natural de la proteína.
Las variantes de una proteína de la invención, como se describe en la presente memoria, que funcionan como agonistas (miméticos) o como antagonistas se pueden identificar por selección de genotecas combinatorias de mutantes, por ej. mutantes por truncamiento de la proteína de la invención para la actividad de agonistas o antagonistas. En una realización, se genera una genoteca variegada de variantes por medio de una mutagénesis combinatoria a nivel del ácido nucleico y está codificada por una genoteca variegada. Una genoteca variegada de variantes se puede producir, por ejemplo, por ligamiento enzimático de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos dentro de secuencias de genes para que un conjunto degenerado de secuencias de proteínas potenciales se pueda expresar como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ej., por despliegue en fagos). Hay una variedad de métodos que se pueden usar para producir genotecas de variantes potenciales de los polipéptidos de la invención a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerados. Los métodos de síntesis de oligonucleótidos degenerados son conocidos en la técnica (ver por ej., Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakara et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).
Además, las genotecas de fragmentos de la secuencia codificadora de un polipéptido de la invención, tal como se describe en la presente memoria, se pueden usar para generar una población variegada de polipéptidos para identificación y posterior selección de variantes. Por ejemplo, se puede generar una genoteca de fragmentos de la secuencia codificadora por el tratamiento de un fragmento de PCR de doble cadena de la secuencia codificadora de interés con una nucleasa en condiciones, en las que la mella se produce solo aproximadamente una vez por molécula, se desnaturaliza el ADN de doble cadena, se renaturalización el ADN para formar el ADN de doble cadena que puede incluir pares homosentido/antisentido provenientes de diferentes productos mellados, se eliminan las porciones de cadena simple de los ADN bicatenarios reformados por el tratamiento con nucleasa S1 y ligamiento de la genoteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Por este método, se puede derivar una genoteca de expresión que codifica fragmentos N-terminal e internos de diferentes tamaños de la proteína de interés.
Se conocen en la técnica varias técnicas para identificar productos génicos de genotecas combinatorias realizadas por mutaciones puntuales o truncamientos, y para identificar genotecas de ADNc para determinar productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Las técnicas más ampliamente usadas que están disponibles para el análisis de alto rendimiento, para identificar genotecas grandes generalmente incluyen la clonación de la genoteca en vectores de expresión replicable, los cuales se transforman en células apropiadas con la genoteca resultante de vectores y que expresan los genes combinatorios en condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento de vectores que codifican el gen cuyo producto fue detectado. La mutagénesis recursiva en conjunto (REM), una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales de las genotecas; se puede usar en combinación con los ensayos de detección para identificar variantes de una proteína de la invención (Arkin y Yourvan (1992), Proc Natl. Acad. Sci USA 89:7811.7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327431).
Se pueden producir alteraciones en la secuencia de aminoácidos de una proteína que no afectan la función de una proteína. Estas incluyen supresiones, inserciones y sustituciones de aminoácidos y pueden resultar del empalme alternativos y/o la presencia de múltiples sitios de iniciación y detención de la traducción. Los polimorfismos se pueden originar como resultado de la infidelidad del proceso de traducción. De esta manera se pueden tolerar cambios en la secuencia de aminoácidos que no afecten la función de la proteína.
La persona experta apreciará que se pueden realizar diversos cambios en al secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene una actividad particular para producir variantes (algunas veces conocidas como muteínas) que tienen por lo menos una proporción de dicha actividad, y con preferencia tienen una proporción sustancial de dicha actividad. Tales variantes de polipéptidos descriptas en a), b) y c) anteriores están dentro del alcance de la presente invención y se discuten con mayor detalle más adelante. Estas incluyen variantes alélicas y no alélicas.
Un ejemplo de variante de la presente invención es un polipétido como se define en a) b) o c) anteriores, además de la sustitución de uno o más aminoácidos con uno o más aminoácidos diferentes. La persona experta sabe que diversos aminoácidos tienen propiedades similares. Uno o más de tales aminoácidos de una sustancia, con frecuencia se pueden sustituir con uno o más aminoácidos diferentes sin eliminar la actividad deseada de esa sustancia.
De esta manera, los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina se pueden sustituir con frecuencia entre sí (aminoácidos que tiene cadenas alifáticas laterales). De tales posibles sustituciones, se prefieren que glicina y alanina se usen para sustituirse entre sí (ya que ellos tienen cadenas laterales relativamente cortas) y que valina, leucina e isoleucina se empleen para sustituirse entre sí (ya que ellos tienen cadenas laterales más grandes que son hidrofóbicas).
Otros aminoácidos que se pueden sustituir frecuentemente entre sí incluyen:
- fenilalanina, tirosina y triptofano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas);
- lisina, alginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas);
- aspártico y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas);
- asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales amidas); y
- cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre).
Las sustituciones de esta naturaleza con frecuencia se denominan sustituciones "conservadoras" o "semi-conservadoras".
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Las supresiones o inserciones también se pueden realizar en relación con la secuencia de aminoácidos dada en a) b) o c) anteriores. De esta manera, por ejemplo, los aminoácidos que no tienen efecto sustancial sobre la actividad del polpéptido, o por lo menos no eliminan tal actividad, pueden ser suprimidos. Tales supresiones pueden ser ventajosas ya que se pueden reducir la longitud total y el peso molecular del polipéptido mientras que la actividad aun continúa. Esto puede permitir que la cantidad de polipéptido requerido para un propósito particular se pueda reducir, por ejemplo los niveles de dosificación.
Las inserciones de aminoácidos se pueden realizar en relación con la secuencia dada en a), b) o c) anteriores. Esto se puede realizar para alterar las propiedades de la presente invención (por ej., colaborar en la identificación, purificación o expresión tal como se explicó anteriormente en relación con las proteínas de fusión).
Los cambios de aminoácidos en relación con la secuencia dada en a), b) o c) anteriores se puede hacer empleando cualquier técnica adecuada por ej. mutagénesis dirigida a un sitio.
Se debe apreciar que las sustituciones o inserciones de aminoácidos dentro del alcance de la presente invención se pueden realizar mediante aminoácidos que se producen naturalmente o no naturalmente. Si se emplean aminoácidos no naturales o sintéticos, se prefiere que solo estén presentes L-aminoácidos.
En cualquiera de los cambios de aminoácidos que se realicen (ya sea por medio de sustitución, inserción o sustitución), los polipéptidos de la presente invención tienen por lo menos 50% de identidad de secuencia con un polipéptido definido en a), b) o c) anteriormente, con más preferencia el grado de identidad de secuencia es por lo menos 75%. Las identidades de secuencias de por lo menos 90% o por lo menos 95% son las más preferidas.
El término identidad se puede usar para describir la similitud entre dos secuencias de polipéptidos. El grado de identidad de secuencia de aminoácidos se puede calcular mediante un programa tal como "bestfit" (Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)) para hallar el mejor segmento de similitud entre cualquiera de las dos secuencias. El alineamiento se basa en la maximizacíon de la clasificación realizada mediante una matriz de similitudes de aminoácidos, tal como la que se describe en Schwarz y Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof M.O., Ed pp 353-358.
Un paquete del programa de computación bien conocido en la técnica para llevar a cabo este procedimiento es el programa CLUSTAL. Este compara las secuencia de aminoácidos de dos polipéptidos y encuentra el alineamiento óptimo por medio de la inserción de espacios en cada secuencias tal como sea apropiado. La identidad o similitud de los aminoácidos (identidad más conservación del tipo de aminoácido) para un alineamiento óptimo se puede calcular también empleando un paquete del programa de computación BLASTx. Este programa alinea las extensiones más largas de secuencias similares y asigna un valor al ajuste. Para cualquier patrón de comparación, se pueden hallar varias regiones similitud, cada una tiene un puntaje diferente. Un experto en la técnica apreciará que dos polipéptidos de diferente longitud se pueden comparar con la longitud completa del fragmento más largo. Alternativamente, se pueden comparar las regiones pequeñas. Normalmente las secuencias de la misma longitud se comparan para realizar una comparación útil.
Cuando están presentes secuencias con alto grado de identidad de secuencia habrá relativamente pocas diferencias en las secuencias de aminoácidos. De esta manera, por ejemplo estas puede ser menos de 20, menos de 10 o aun menos de 5 diferencias de residuos de aminoácidos.
Polipéptidos dentro del alcance de e)
Tal como se discutió supra, con frecuencia es ventajoso reducir la longitud de un polipéptido, con la condición que el polipéptido de longitud reducida resultante todavía presenta una actividad deseada o puede dar origen a anticuerpos útiles. La característica e) de la presente invención en consecuencia abarca los fragmentos de los polipéptidos a), b), c) o d) anteriores.
El término "fragmento" como se usa en la presente memoria se refiere a un péptido o polipéptido que comprende un secuencia de aminoácidos de por lo menos 40 residuos de aminoácidos, con referencia al polipéptido definido en a) -c), por lo menos 50 aminoácidos, con referencia al polipéptido definido en d) o por lo menos 60 residuos de aminoácidos, por lo menos 70 residuos de aminoácidos, por lo menos 80 residuos de aminoácidos, por lo menos 90 residuos de aminoácidos, por lo menos 100 residuos de aminoácidos, por lo menos 125 residuos de aminoácidos, por lo menos 150 residuos de aminoácidos, por lo menos 175 residuos de aminoácidos, por lo menos 200 residuos de aminoácidos o por lo menos 250 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de un segundo polipéptido. El fragmento de Hpa2 o de péptido relacionado con Hpa puede poseer o no actividad funcional de Hpa2.
Una persona experta puede determinar si un fragmento particular tiene o no actividad empleando las técnicas que se describieron anteriormente. Los fragmentos preferidos tienen por lo menos 10 aminoácidos de largo. Estos tienen por lo menos 20, por lo menos 50 o por lo menos 100 aminoácidos de largo.
Una realización proporciona una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1, 2 o 3 (Sec. ID No. 2, 4 o 6), a partir de l residuo 2 o residuo 12.
Otra realización proporciona polipéptidos con inicio en el residuo de aminoácido 43 de la respectiva secuencia que se muestra en las Figuras 1, 2 y 3 3 (Sec. ID No 2, 4 o 6), donde el primer residuo de metionina que se muestra es el residuo 1.
Los polipéptidos terapéuticos de la presente invención se pueden usar para el tratamiento de un ser humano o animal. El tratamiento puede ser profiláctico o puede ser con respecto a una afección existente. Por ejemplo, los polipéptidosde la invención se pueden usar para el tratamiento de una enfermedad/trastorno resultante de una carencia/deficiencia de heparanasa. Además estos se pueden usar para la degradación de heparina o para bloquear la actividad anticoagulante de la heparina durante o después de la cirugía (ver Freed et al, Ann. Biomed Eng 21:67-76,1993). Alternativamente, estos se pueden usar para modular la actividad de la heparanasa endógena.
De esta manera, en un aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido del primer aspecto de la invención y un vehículo aceptable para uso farmacéutico. El polipéptido de la presente invención también se puede usar en la fabricación del medicamento para el tratamiento de uno o más de las enfermedades/trastornos anteriormente mencionados.
El medicamento usualmente se suministrará como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un vehículo aceptable para uso farmacéutico. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del método deseado de administración para un paciente).
Se puede proporcionar en una forma de dosis unitaria, generalmente se proporcionará en un recipiente sellado y se puede proporcionar como parte de un equipo. Tal equipo normalmente incluiría (aunque no necesariamente) instrucciones para el uso. Este puede incluir una pluralidad de dichas formas de dosificación unitarias.
La composición farmacéutica se puede adaptar para la administración por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral (incluye bucal y sublingual), rectal, nasal, tópica (incluye bucal, sublingual o transdérmica), vaginal o parenteral (incluye subcutáneo, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Tales composiciones se pueden preparar por cualquier método conocido en la técnica farmacéutica, por ejemplo, por mezcla del componente activo con el vehículo(s) o excipiente(s) en condiciones estériles.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración oral se pueden presentar como unidades discretas tales como cápsulas o comprimidos, como polvos o gránulos, como soluciones, jarabes o suspensiones (en agua o líquidos no acuosos, o como formas comestibles o cremas o como emulsiones).
Los excipientes adecuados para comprimidos o cápsulas de gelatina dura incluyen lactosa, almidón de maíz o derivados del mismo, ácido esteárico o sales del mismo.
Los excipientes adecuados para uso en cápsulas de gelatina blanda incluyen por ejemplo aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semi-sólidos o líquidos, etc.
Para la preparación de soluciones y jarabes, los excipientes que se pueden usar incluyen por ejemplo agua, polioles y azúcares. Para la preparación de suspensiones, se pueden usar aceites (por ej., aceites vegetales) para proporcionar suspensiones aceite en agua o agua en aceite.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración transdérmica se pueden presentar como diferentes parches destinados a permanecer en contacto íntimo con la epidermis del recipiente durante un período prolongado de tiempo. Por ejemplo, el componente activo se puede administrar a partir del parche por iontoforesis como se describe en forma general en Pharmaceutical Research, 3(6):318 (1986).
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica se pueden formular como ungüentos, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, aspersiones, aerosoles o aceites. Para las infecciones oculares y otros tejidos externos, por ejemplo boca y piel, las composiciones se aplican con preferencia como un ungüento o crema tópica. Cuando se formula en un ungüento, el componente activo se puede emplear con una base de ungüento parafínico o miscible en agua. Alternativamente, el componente activo se puede formular en una base de crema aceite en agua o una base de agua en aceite. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica en los ojos incluyen gotas oculares donde el componente activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente un solvente acuoso. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas duras, pastillas y enjuagues bucales.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración rectal se pueden presentar como supositorios o enemas.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración nasal cuando el vehículo es un sólido grueso que tiene un tamaño de partícula por ejemplo en el rango de 20 a 500 micrones, que se administra en forma de polvo para aspirar, es decir por inhalación rápida a través del pasaje nasal a partir de un recipiente del polvo mantenido muy cerca de la nariz. Las composiciones adecuadas donde el vehículo es un líquido, para la administración como aerosol nasal o gotas nasales, incluyen soluciones acuosas u oleosas del componente activo.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración por inhalación incluyen polvos de partículas finas o vapores que se pueden generar por medio de diferentes tipos de aerosoles presurizados con dosis programadas, nebulizadores o insufladores.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración vaginal se pueden presentar como óvulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración parenteral incluyen una solución inyectable estéril acuosa y no acuosa que pude contener antioxidantes, buffers, bacteriostáticos y solutos que producen que la solución sea sustancialmente isotónica con la sangre del recipiente a que se destina y suspensiones acuosas y no acuosas estériles que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Los excipientes que se pueden usar incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Las composiciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitarias o múltiples, por ejemplo, ampollas y viales sellados y se pueden conservar en una condición secado-congelado (liofilizado) que requieren solo por la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones extemporáneas inyectables se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes conservantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, odorantes, sales (las sustancias de la presente invención se pueden proporcionar en forma de sales aceptables para uso farmacéutico), reguladores de pH, agentes de recubrimiento o antioxidantes. Estos también pueden contener agentes terapéuticamente activos además de la sustancia de la presente invención.
Las dosis de la sustancia de la presente invención pueden variar entre límites amplios, dependiendo del trastorno o enfermedad que se trata, la edad y del individuo tratado, etc. y el médico determinará finalmente las dosis apropiadas para usar. Esta dosis se puede repetir con la frecuencia que sea conveniente. Si se desarrollan efectos secundarios, la cantidad y/o frecuencia de la dosificación se puede reducir, de acuerdo con la práctica clínica normal.
Además de los usos descriptos anteriormente en relación con los tratamientos, los polipéptidos de la presente invención se pueden emplear para diagnóstico. Por ejemplo, la expresión del polipéptido se puede asociar con una afección, o un aumento del riesgo de contraer una afección.
Los polipéptidos de la presente invención se pueden emplear también en investigación. Por ejemplo, se pueden usar para identificar agentes que modulan la actividad de los polipéptidos de la presente invención.
De esta manera, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para la identificación de agentes que modulan la actividad de los de polipéptidos de la invención, que comprende la actividad de un polipéptido de la invención en presencia de un agente de prueba con la actividad de un polipéptido de la invención en ausencia del agente de prueba.
La invención proporciona métodos para identificar agentes (por ej., compuestos candidatos o compuestos de ensayo) que se unen a Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 o tiene un efecto estimulatorio o inhibitorio sobre la expresión o actividad de Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2. Ejemplos de agentes, compuestos candidatos o compuestos de ensayo incluyen, pero sin limitación a, ácidos nucleicos (por ej., ADN y ARN), carbohidratos, lípidos, proteínas,, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas y otros fármacos. Los agentes se pueden obtener mediante cualquiera de los numerosos abordajes de los métodos de genoteca combinatoria conocidos en la técnica, que incluyen: genotecas biológicas; genotecas de fase sólida o fase líquida paralela dirigible en el espacio; métodos de genoteca sintética que requieren deconvolución; el método de la genoteca "una cuenta-un compuesto"; y métodos de genotecas sintéticas que emplean selección por cromatografía de afinidad. El abordaje de la genoteca biológica está limitado a las genotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro abordajes son aplicables a péptidos, oligómeros no peptídicos o genotecas de pequeñas moléculas de compuestos (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145; Patente Estadounidense. No 5.738.996; y Patente Estadounidense No. 5.807.683, las cuales están incorporadas en su totalidad como referencia en la presente memoria).
Ejemplos de los métodos de síntesis de genotecas moleculares se pueden hallar en la técnica, por ejemplo, en DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. SM. USA 90:6909; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; 1993, Science 261:1303; Carrell et al, 1994, Angew Chem. Int. Engl. 33:2061 y Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233, las cuales están incorporadas en su totalidad como referencia en la presente memoria.
Las genotecas de compuestos se pueden presentar, por ej., en solución (por ej., Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412-421) o en microesferas (Lam,1991, Nature 354:82-84) chips (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), bacterias (Patente Estadounidense. No 5.223.409), esporas (Patentes Nos 5.571.698; 5.403.484 y 5.223.409), plásmidos (Cull et al, 1992, Proc. Natl. Acad, Sci USA 89:1865-1869) o fagos (Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, Proc. Natl. Acad, Sci USA 87:6378-6382 y Felici, 1991, J. Mol, Biol, 222-301-310), cada una de las cuales están incorporadas en su totalidad como referencia en la presente memoria.
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En una realización, los agentes que interactúan con (es decir, se unen a) Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 se identifican en un sistema de ensayo basado en células. De acuerdo con esta realización, las células que expresan Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 se ponen en contacto con el compuesto candidato o un compuesto control y se determina la capacidad del compuesto candidato para interactuar con Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2. Si se desea, este ensayo se puede usar para detectar una pluralidad (por ej., una genoteca) de compuestos candidatos. La célula, por ejemplo, puede ser de origen procariota (por ej., E. coli) o de origen eucariota (por ej., de levaduras o mamíferos). Además, las células pueden expresar Hpa2 o proteínas relacionadas con Hpa2 endógenas o diseñadas genéticamente para expresar Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2, o el compuesto candidato está marcado, por ejemplo con marca radiactiva (tal como ^{32} P, ^{35}S y ^{125}I) o una marca fluorescente (tal como isotiacianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído o fluorescamina) para permitir la detección de una interacción entre Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 y un compuesto candidato. La capacidad del compuesto candidato para interactuar en forma directa o indirecta con Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 se puede determinar por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la interacción entre un compuesto candidato y Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 se puede determinar por citometría de flujo, ensayo de centelleo, inmunoprecipitación o análisis de transferencia western.
En otra realización, los agentes, los agentes que interactúan con (es decir, se unen a) Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 se identifican en un sistema de ensayo libre de células. De acuerdo con esta realización, un polipéptido de Hpa2 nativo o recombinante o un fragmento del mismo se pone en contacto son un compuesto candidato o un compuesto control y se determina la capacidad del compuesto candidato para interactuar con Hpa2 o un polipéptido relacionado con Hpa2. Si se desea, este ensayo se puede usar para identificar una pluralidad (por ej., una genoteca) de compuestos candidatos. Con preferencia Hpa2 o la proteína relacionada con Hpa2 primero se inmoviliza, por ejemplo, por contacto de Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 con un anticuerpo inmovilizado que reconoce específicamente se une a esta, o por contacto de una preparación purificada de Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 con una superficie diseñada para unirse con proteínas. Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 pueden estar parcial o completamente purificadas (por ej., parcial o completamente libre de otros polipéptidos) o ser parte de un lisado de células. Además, Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 pueden ser una proteína de fusión que comprende Hpa2 o una porción biológicamente activa de la misma o un polipéptido relacionado con Hpa2 y un dominio tal como glutationina-S-transferasa. Alternativamente, Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 se puede biotinilar mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica (por ej., equipo de biotinilación, Pierce Chemicals; Rockford II). La capacidad de un compuesto candidato para interactuar con Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 se puede determinar por medio de métodos conocidos por los expertos en la técnica.
En otra realización, se emplea un sistema de ensayo basado en células para identificar agentes que se unen o modulan la actividad de una proteína, tal como una enzima o porción biológicamente activa de la misma, la cual es responsable de la producción o degradación de Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 o es responsable de la modificación pos-traduccional de Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2. En un ensayo primario, una pluralidad (por ej., una genoteca) de compuestos se ponen en contacto con células que se expresan en forma natural o recombinante: (i) Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 o un fragmento biologicamente activo de cualquiera de los anteriores; y (ii) una proteína que es responsable del procesamiento de Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 para identificar compuestos que modulan la producción, degradación o modificación pos-traduccional de Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2. Si se desea, los compuestos identificados en el ensayo primario se pueden ensayar en un en una identificación secundaria contra las células que se expresan en forma natural o recombinante que expresan la Hpa2 específico de interés. La capacidad del compuesto para modular la producción, degradación o modificación pos-traduccional de Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 se puede determinar por métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen sin limitación, a la citometría de flujo, ensayo de centelleo, inmunoprecipitación o análisis de transferencia western.
En otra realización, los agentes que interactúan competitivamente con (es decir se unen a) Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 se identifican por ensayos de unión competitiva. De acuerdo con esta realización, las células que expresan Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 se ponen en contacto con un compuesto candidato y un compuesto conocido para interactuar con Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2; luego se determina la capacidad del compuesto candidato para interactuar competitivamente con Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2. Alternativamente, los agentes que interactúan competitivamente con (es decir se unen a) Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 se identifican por un sistema de ensayo libre de células por medio del contacto de Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 con un compuesto candidato y un compuesto conocido para interactuar con Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2. Como se estableció anteriormente, la capacidad del compuesto candidato para interactuar con Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 se puede determinar por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Estos ensayos, ya sea basados en células o libres de células, se pueden usar para identificar una pluralidad (por ej., una genoteca) de compuestos candidatos.
En otra realización, los agentes que modulan (es decir, regulan por aumento o por disminución) la expresión de Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 se identifican por contacto de las células (por ej., células de origen procariota u origen eucariota) que expresan Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 con un compuesto candidato o compuesto control (por ej., buffer fosfato salino (PBS)) y Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2 y determinación de la expresión de Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2, ARNm que codifica Hpa2 Hpa2 o ARNm que codifica una polipéptido relacionado con Hpa2 en ausencia del compuesto candidato( por ej., en presencia de un compuesto control). Luego el compuesto candidato se puede identificar como modulador de la expresión de Hpa2 o un polipéptido relacionado con Hpa2 sobre la base de esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de Hpa2 o ARNm es significativamente mayor en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de la expresión de Hpa2 o ARNm. Alternativamente, cuando la expresión de Hpa2 o ARNm es significativamente menor en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor de la expresión de Hpa2 o ARNm. El nivel de expresión de un Hpa2, polipéptido relacionado con Hpa2, ARNm que codifica Hpa2, o ARNm que codifica un polipéptido relacionado con Hpa2 seleccionado en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión de Hpa2, polipéptido relacionado con Hpa2, ARNm que codifica Hpa2, o ARNm que codifica un polipéptido relacionado con Hpa2 en ausencia del compuesto candidato (por ej., en presencia del compuesto control). El compuesto candidato luego se puede identificar como un modulador de la expresión de Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 sobre la base de esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de Hpa2 o ARNm es significativamente mayor en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de la expresión de Hpa2 o ARNm. Alternativamente, cuando la expresión de Hpa2 o ARNm es significativamente menor en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor de la expresión de Hpa2 o ARNm. El nivel de expresión de Hpa2 o ARNm que lo codifica se puede determinar por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la expresión de ARNm se puede evaluar por análisis de transferencia Northern o RT-PCR, y los niveles de proteína se pueden evaluar por análisis de transferencia western.
En otra realización, los agentes que modulan la actividad de Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 se identifican por contacto con una preparación que contiene Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2, o células (por ej., células procariotas o eucariotas) que expresan Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 con un compuesto de ensayo o compuesto control y determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular (por ej., estimular o inhibir) la actividad de Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2. La actividad de Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 se puede medir por medio de la detección de la actividad enzimática de Hpa2 o proteína relacionada con Hpa2 blanco sobre un sustrato adecuado, detección de la inducción del gen marcador (por ej., un elemento regulatorio que responde a Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 y está unido operativamente unido a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ej., luciferasa), o detección de la respuesta celular, por ejemplo, diferenciación celular o proliferación celular. Sobre la base de la presente descripción se pueden emplear técnicas conocidas por los expertos en la técnica para medir estas actividades. El compuesto candidato se pude identificar como un modulador de la actividad de Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 por comparación de los efectos del compuesto candidato con el compuesto control. Los compuestos control incluyen buffer fosfato salino (PBS) y salina normal (NS).
En otra realización, los agentes que modulan la expresión (es decir, regulación por disminución o aumento), actividad o ambas expresión y actividad de Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 se identifican en un modelo animal. Los ejemplos de animales adecuados incluyen, pero sin limitación a, ratones, ratas, conejos, monos, cobayos, perros y gatos. De acuerdo con esta realización, el compuesto de ensayo o compuesto control se administra (por ej., por vía oral, rectal o parenteral tal como intraperitoneal o intravenosa) a un animal adecuado y se determina la expresión, actividad o ambas actividades o expresión de Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2. Los cambios de expresión de Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 se pueden evaluar por medio de los métodos descriptos anteriormente
En aún una otra realización, se emplea Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 como "proteína señuelo" en un ensayo de dos híbridos o tres híbridos para identificar otras proteínas que se unen a o interactúan con Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 (ver, por ej., Patente Estadounidense 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Bio/Techniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; y Publicación de PCT No. WO 94/10300). Como los expertos en la técnica apreciarán, probablemente tales proteínas de unión están involucradas en la propagación de señales por Hpa2 o proteína relacionada con Hpa2 de las invenciones como, por ejemplo, como elementos corriente arriba o corriente abajo de un sistema de señalización que involucra a Hpa2 o proteína relacionada con Hpa2.
Las publicaciones científicas que describen ensayos adecuados para detectar o cuantificar la actividad de heparanasa se enumeran en la presente memoria.
Un uso adicional de los polipéptidos de la presente invención está es la generación o selección de anticuerpos. La presente invención en consecuencia incluye a los anticuerpos que se unen a un polipéptido de la presente invención o a un fragmento de tal polipéptido. Los anticuerpos preferidos se unen específicamente a polipéptidos de la presente invención por eso se pueden usar para purificar y/o inhibir la actividad de tales polipéptidos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales.
Una proteína Hpa2 o relacionada con Hpa2 se pueden usar como inmunógeno para generar anticuerpos que se unen en forma inmunoespecífica a tal inmunógeno. Tales inmunógenos se pueden aislar por cualquier medio conveniente, que incluye los métodos descriptos anteriormente. Los anticuerpos de la invención, incluyen pero sin limitación a anticuerpos policlonales, monoclonales, biespecíficos, humanizados o quiméricos,.anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab y F(ab'), fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) y fragmentos de unión a epítopes de cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo" como se usa en la presente memoria se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención puede ser de cualquier clase (por ej., IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o una subclase de moléculas de inmunoglobulina.
En una realización de la invención, se producen anticuerpos para un dominio específico de Hpa2 o proteína relacionada con Hpa2. En una realización específica, se emplean fragmentos hidrofílicos de Hpa2 o proteína relacionada con Hpa2 como inmunógenos para la producción de anticuerpos.
En la producción de anticuerpos, la identificación del anticuerpo deseado se puede lograr por técnicas conocidas en la técnica; por ej., ELISA (ensayo inmunoabsobente ligado a enzimas). Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un domino específico de Hpa2 o proteína relacionada con Hpa2, se pueden ensayar hibridomas generados para un producto que se une al fragmento de Hpa2 o proteína relacionada con Hpa2 que contiene tal dominio.
Los anticuerpos policlonales que se pueden usar en los métodos de la invención son poblaciones heterogéneas de las moléculas de anticuerpos derivados del suero de animales inmunizados. También se puede usar suero inmune sin fraccionar. Se pueden emplear diferentes procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales de Hpa2 o proteína relacionada con Hpa2. En una realización particular, se pueden obtener anticuerpos policlonales de conejo para un epítope de Hpa2 o proteína relacionada con Hpa2. Por ejemplo, para la producción de los anticuerpos policlonales o monoclonales, se pueden inmunizar diferentes animales hospedantes por inyección con la versión nativa o sintética (por ej., recombinante) de Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 o un fragmento de un polipéptido relacionado con Hpa2; que incluyen pero sin limitaciones a conejos, ratones, ratas, etc.
Se pueden usar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, lo cual depende de la especie del hospedante, que incluye, pero sin limitación a, adyuvante de Freund completo o incompleto, un gel mineral tal como hidróxido de aluminio, sustancias activas en superficie tal como lisolecitina, poliol plurónico, un polianión, un péptido, una emulsión en aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol y un adyuvante tal como BCG (bacilo Calmette-Guerin) o corynebacterium parvum. Los adyuvantes adicionales son también conocidas en la técnica.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigido hacia Hpa2 o proteína relacionada con Hpa2, un fragmento de Hpa2 o proteína relacionada con Hpa2, se puede emplear cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por línea celulares continuas. Por ejemplo, la técnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497), además de la técnica del trioma, técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma- EBV para producir anticuerpos monoclonales humanas (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulinas que incluyen lgG, IgM, IgB, IgA, IgD y cualquier a subclase de la misma. El hibridoma que produce los mAb de la invención se pueden cultivar in vitro o in vivo. En una realización adicional de la invención, se pueden producir anticuerpos monoclonales en animales libres de gérmenes utilizando tecnología conocida (PCTIUS90/02545, incorporada en la presente memoria como referencia).
Los anticuerpos monoclonales incluyen, pero sin limitación a, anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos monoclonales quiméricos (por ej., quimeras humanas-de ratón). Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que se derivan diferentes porciones de especies animales diferentes, tales como las que presentan una región constante de inmunoglobulina humana y una región variable derivada de un mAb murino. (Ver, po ej., Cabilly at al., Patente Estadounidense No. 4.816.567; y Boss et al., Patente Estadounidense No. 4.816.97, las cuales están incorporadas en su totalidad en la presente memoria como referencia). Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos de especies no humanas que tienen una o más de regiones determinantes de complementariedad (CDR) de especies no humanas y una región de la estructura de una molécula de inmunoglobulina humana (Ver, por ej., Queen, Patente Estadounidense No. 5.585.089, la cual está incorporada en su totalidad en la presente memoria como referencia).
Los anticuerpos quiméricos y humanizados se pueden producir por técnicas de ADN recombinante conocidas, por ejemplo mediante métodos descriptos en la Publicación PCT No WO87/02671; Solicitud de Patente Europea 184.187; Solicitud de Patente Europea 171,496; Solicitud de Patente Europea 173,494; Publicación PCT No. WO 86/01533; Solicitud de Patente Europea 4.816.567; Solicitud de Patente Europea 125,023; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al, 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 84:214-218; Nishimura et al.,1987, Canc. Natl. Cancer Inst. 80:15534559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Ol et al, 1986, Bio/Techniques 4:214; Patente Estadounidense 5.225.539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al, 1988, J, Immunol. 141:4053-4060.
Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de los sujetos humanos. Tales anticuerpos se pueden producir mediante ratones transgénicos que son incapaces de expresar los genes de cadena pesada y liviana de inmunoglobulina endógena, pero que pueden expresar genes de cadena pesada y liviana. Los ratones transgénicos se inmunizan en forma normal con un antígeno seleccionado, por ej., el total o una porción de un Hpa2 de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se pueden obtener mediante la tecnología del hibridoma convencional. Los transgenes de la inmunoglobulina humana albergados por el ratón transgénico cambian de lugar durante la diferenciación de las células B, y posteriormente experimentan un cambio de clase y una mutación somática. De esta manera, mediante tal técnica, se posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para un panorama general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, ver Lonberg y Huszar (1995; Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para una discusión detallada de esta tecnología de producción de anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, ver, por ej., Patente Estadounidense 5.625.126; Patente Estadounidense 5.633.425; Patente Estadounidense 5.569.825;
Patente Estadounidense 5.661.016; y Patente Estadounidense 5-545.806. Además, compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San Jose, CA) se pueden especializar en proporcionar anticuerpos humanas dirigidos contra un antígeno seleccionado empleando tecnología similar a la descripta anteriormente.
Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítope seleccionado se puede generar mediante una técnica mencionada como "selección guiada". En este abordaje, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ej., un anticuerpo de ratón se emplea para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítope. (Jespers et al.: (1994) Bio/technology 12:899-903)..
Los anticuerpos de la presente invención también se pueden generar mediante diversos métodos de despliegue de fagos conocidos en la técnica. En los métodos de despliegue de fagos, los dominios del anticuerpo funcionales se despliegan en la superficie de las partículas del fago que porta las secuencias de polinucleótidos que las codifican. En un método particular, tal fago se puede utilizar para desplegar los dominios de a partir del repertorio o genoteca combinatoria de anticuerpos (por ej., humana o murina). Los fagos que expresan un domino de unión al antígeno que se une al antígeno de interés se puede seleccionar o identificar con antígeno, por ej., empleando antígeno marcado o antígeno unido o capturado a en una superficie sólida o microesfera. Los fagos empleados en esos métodos son generalmente son fagos filamentosos que incluyen los dominios de unión fd y M13 expresados a partir del fago Fab, Fv o dominios del anticuerpo Fv estabilizados con disulfuro fusionados en forma recombinante tanto al gen III del fago o gen VIII de proteína. Los métodos de despliegue de fagos que se pueden usar para fabricar los anticuerpos de la presente invención incluyen a aquellos revelados en Brinkman et al; J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Bur. 7.lmmunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al, Advances in Immunology 57:191-280 (1994); Solicitud de PCT No. PCT/GB91/01134; Publicaciones PCT WO 90/02809; WO91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patentes Estadounidenses Nos. 5..698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108; cada una de las cuales está incorporada en su totalidad en la presente memoria como referencia).
Tal como se describió en las referencias anteriores, después de la selección del fago, las regiones codificadoras del anticuerpo se pueden aislar y usar para generar anticuerpos totales, que incluyen anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión al antígeno deseado y expresado en cualquier hospedante deseado, que incluye a células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, levaduras y bacterias, por ej., tal como se describe a continuación. Por ejemplo, también se pueden emplear técnicas para producir en forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 mediante métodos conocidos en la técnica tales como los que se revelan en las Publicaciones PCT WO92/22324; Mullinax et al, BioTechniques. 12, (6):864-869 (1992); y Sawai et al.; AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (dichas referencias se incorporan en su totalidad en l presente memoria).
Ejemplos de técnicas que se pueden usar para producir los Fv de cadena simple y anticuerpos incluyen a aquellos descriptos en las Patentes Estadounidenses 4.946.778 y 5.258.498, Huston et al Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerr et al., Science 240:1038-1040 (1988).
La invención proporciona además el uso de anticuerpos biespecíficos, que se pueden preparar por métodos conocidos en la técnica. Los productos tradicionales de anticuerpos biespecíficos de longitud completase basan en la coexpresión de dos pares de cadenas pesadas-livianas de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Milstein et al, 1983, Nature 305:537-539). Debido a la distribución al azar de las cadenas pesada y livianas de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. la purificación de la molécula correcta, que se realiza usualmente por pasos de cromatografía de afinidad, es bastante engorroso y los rendimientos de los productos son bajos. Procedimientos similares revelados en WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993; y en Trautecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659.
De acuerdo con un abordaje diferente y más preferido, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación del anticuerpo-antígeno) se fusionan con las secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. Con preferencia la fusión es con el dominio constante de una cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones bisagra CH2 y CH3. Se prefiere tener primero la región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena liviana, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican la cadena pesada de la inmunoglobulina se fusiona y si se desea, la cadena liviana de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan en un organismo hospedante adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en las realizaciones cuando las relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas empleadas en la construcción proporcionan óptimos rendimientos. Sin embargo, es posible, insertar las secuencias codificadoras para dos o tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones iguales produce altos rendimientos o cuando las relaciones no son de particular significación.
En una realización preferida de este abordaje, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de una inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en rama, y una par de cadena pesada- cadena liviana de la inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en otra rama. Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de las cadenas de la inmunoglobulina no queridas, ya que la presencia de una cadena liviana de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación este abordaje se revela en WO 94/04690 publicado el 3 de marzo de 1994. Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210.
La invención proporciona fragmentos funcionalmente activos, derivados o análogos de las moléculas de inmunoglobulina de anti-Hpa2. Funcionalmente activo significa que el fragmento, derivado o análogo es capaz de estimular anticuerpos anti-anti-idiotipo (es decir, anticuerpos terciarios) Estos reconocen el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo del cual deriva el fragmentó, derivado o análogo. Específicamente, en una realización preferida la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina se puede aumentar por supresión de la estructura y las secuencias CDR que son C-terminal a la secuencia de CDR que específicamente reconoce el antígeno. Para determinar cuales secuencias de CDR se unen al antígeno, se pueden usar péptidos sintéticos que contienen las secuencias de CDR en ensayos de unión con el antígeno de cualquier método de ensayo conocido en la técnica.
La presente invención proporciona fragmentos de anticuerpo tales como, pero sin limitación, fragmentos F(ab')_{2} y fragmentos Fab. Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopes específicos se pueden generar por técnica conocidas. Los fragmentos F(ab') y consisten en la región variable, la región constante de cadena liviana y el dominio CH1 de la cadena pesada y se generan por digestión con pepsina de la molécula del anticuerpo. Los fragmentos Fab se generan por reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos (ab')_{2}. La invención también proporciona dímeros de cadena pesada y cadena liviana de los anticuerpos de la invención o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como Fvs o anticuerpos de cadena simple (SCAs) (por ej., como se describe en la Patente Estadounidense 4.946.778; Bird 1988, Science 242:423-42, Huston et al, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54), o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo de la invención. Los anticuerpos de cadena simple se forman por la unión de los fragmentos de cadena liviana y pesada de la región FV por medio de un puente de aminoácido, lo cual produce un polipéptido de cadena simple. Se pueden usar técnicas para el ensamblaje de los fragmentos funcionales de Fv en E. coli (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
En otras realizaciones, la invención proporciona proteínas de fusión de las inmunoglobulinas de la invención (o fragmentos funcionalmente activos del mismo), por ejemplo en el cual la inmunoglobulina se fusiona por medio de un enlace covalente (por ej., un enlace peptídico), en el N-terminal o C-terminal de una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o porción del mismo; con preferencia por lo menos una porción de aminoácidos de 10, 20 o 50 de la proteína) que no es la inmunoglobulina. Con preferencia, la inmunoglobulina o fragmento del mismo, se une covalentemente a la otra proteína en el N-terminal del dominio constante. Tal como se indicó anteriormente, tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación, aumentar la vida media in vivo y aumentar la liberación de un antígeno a través de la barrera epitelial al sistema inmune.
Las inmunoglobulinas de la invención incluyen análogos y derivados que se modifican, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula siempre y cuando tal unión covalente no altere la unión inmunoespecífica. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados y análogos de las inmunoglobulinas incluye a aquellos que no han sido modificados adicionalmente, por ej., por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, ruptura proteolítica, unión a ligandos celulares u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se pueden llevar a cabo por técnicas conocidas; que incluyen pero sin limitaciones a la ruptura química específica, acetilación, formilación, etc. Adicionalmente, el análogo o derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Los anticuerpos precedentes se pueden usar en métodos conocidos en la técnica en relación con la localización y actividad de la Hpa2 de la invención, por ej., por visualización por imágenes de estas proteínas, mediciones de los niveles de las mismas en muestras fisiológicas apropiadas, en métodos de diagnóstico; etc.
Los anticuerpos de la invención se pueden producir por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, por síntesis química o por expresión recombinante, y con preferencia producida por una técnica de expresión recombinante.
La expresión recombinante de anticuerpos, o fragmentos, derivados o análogos del mismo, requiere la construcción de un ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Si la secuencia nucleotídica es conocida, un ácido nucleico que codifica el anticuerpo se puede ensamblar a partir de oligonucleótidos sintetizados quimicamente (por ej., como se describe en Kutmeier et al, 1994, BioTechniques 17:242), el cual, brevemente, incluye la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen porciones de las secuencias que codifican anticuerpos, apareamiento y ligamiento de estos oligonucleótidos y luego amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.
Alternativamente, se puede obtener el ácido nucleico que codifica el anticuerpo por clonación del anticuerpo. Si un clon que contiene el ácido nucleico que codifica el anticuerpo particular no está disponible, pero la secuencia de la molécula de l anticuerpo es conocida, se puede obtener el ácido nucleico que codifica el anticuerpo a partir de una fuente adecuada (por ej., una genoteca de ADNc de anticuerpo o genoteca de ADNc generada a partir de cualquier tejido o células que expresan el anticuerpo) por amplificación PCR mediante cebadores sintéticos hibridizables en los extremos 3' y 5' de la secuencia o por clonación mediante una sonda de oligonucleótidos específica para la secuencia génica particular.
Si una molécula de anticuerpo que reconoce específicamente un antígeno particular no está disponible (o una fuente para una genoteca de ADNc para la clonación de un ácido nucleico que codifica tal anticuerpo), los anticuerpos específicos para un antígeno particular se puede generar por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por inmunización de un animal; tal como un conejo, para generar los anticuerpos policlonales o con más preferencia, por generación de anticuerpo monoclonales. Alternativamente, se puede obtener un clon que codifica por lo menos la porción Fab del anticuerpo por identificación de genotecas de expresión de Fab (por ej., como se describen Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para clones de fragmentos Fab que se unen al antígeno específico por identificación de genotecas de anticuerpos (Ver, por ej., Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sri. USA 94:4937).
Una vez que se obtiene un ácido nucleico que codifica por lo menos el dominio variable de la molécula del anticuerpo, se puede introducir en un vector que contiene la secuencia nucleotídica que codifica la región constante de la molécula del anticuerpo (ver, por ej., Publicación PCT WO 86/05807; Publicación PCT WO 89/01036; y Patente Estadounidense No. 5.122.464). Los vectores que contienen la cadena liviana o pesada para la co-expresión con el ácido nucleico para permitir la expresión de una molécula de anticuerpo completo están también disponibles. Luego, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo se puede usar para introducir las sustitucione(s) o supresione(s) necesarias para sustituir (o suprimir) uno o más de los residuos de cisteína de la región variable que participan en un enlace disulfuro intracatenario con el residuo del aminoácido que no contiene un grupo sulfhidrilo. Tales modificaciones se pueden realizar por cualquier método conocido en la técnica para la introducción de mutaciones o supresiones específicas en una secuencia nucleotídica, por ejemplo, pero sin limitaciones a, mutagénesis química, mutagénesis dirigida a un sitio in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), métodos basados en PCT, etc.
Además, se pueden usar las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al, 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al, 1985, Nature 314:452-454) por medio de genes de empalme de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad antigénica apropiada junto con los genes de una molécula de anticuerpo humana de actividad biológica apropiada. Como se describió supra, un anticuerpo quimérico es una molécula en las cuales porciones diferentes derivan de especies animales diferentes, tal como los que tienen una región variable derivado de un mAb murino y una región constante de anticuerpo humano, por ej., anticuerpos humanizados.
Una vez que se ha obtenido el ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo de la invención, el vector para la producción de la molécula del anticuerpo se puede producir por tecnología de ADN recombinante mediante técnicas bien conocidas en la técnica. De esta manera, los métodos para preparar la proteína de la invención por medio de la expresión de ácido nucleico que contiene la secuencia de la molécula de anticuerpo se describen en la presente memoria. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden usar para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificadoras de una molécula de anticuerpo y señales de control transcripcional y traduccional apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Ver, por ejemplo, las técnicas descriptas en Sambrook at al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) y Ausubel et al. (eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
El vector de expresión se transfiere a una célula hospedante por técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan por técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención.
Las células hospedantes empleadas para expresar un anticuerpo recombinante de la invención puedes ser células bacterianas tales como Escherlchia coli, o, con preferencia, células eucariotas, especialmente la expresión de la molécula de anticuerpo recombinante total. En particular, las células de mamíferos tal como las células de ovario de hámster chino (CHO), en conjunto con un vector tal como el principal elemento promotor génico temprano inmediato del citomegalovirus humano es un sistema de expresión efectivo para los anticuerpos (Foecking et al, 198, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).
Una variedad de sistemas de hospedante-vector de expresión se puede utilizar para expresar una molécula de anticuerpo de la invención. Tales sistemas hospedante-expresión representan vehículos por medio de los cuales las secuencias codificadoras de interés y posteriormente se pueden producir y purificar, pero también representan células que pueden, cuando se transforma o transfecta con las secuencias codificadoras de nucleótidos apropiados, expresa la molécula del anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen, pero sin limitación a, microorganismos tales como las bacterias (por ej., E. coli, B. subtilis) transformados con ADN del bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN del plásmido o ADN del cósmido que contienen las secuencias codificadoras del anticuerpo; levaduras (por ej., Sacchharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión recombinantes de levaduras que contienen las secuencias codificadoras del anticuerpo; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión recombinantes de virus (por ej., baculovirus) que contienen las secuencias codificadoras del anticuerpo; sistemas celulares de plantas infectados con vectores de expresión recombinantes de virus (por ej., virus del mosaico de coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión recombinantes de plasmidos (por ej., plásmido Ti que contienen las secuencias codificadoras del anticuerpo; o sistemas celulares de mamíferos (por ej., células COS, CHO, BHK.293, 373) que albergan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ej., promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ej., el promotor tardío del adenovirus, promotor del virus de vaccinia 7.5K).
En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar en forma ventajosa varios vectores de expresión dependiendo del uso destinado al molécula de anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando se produce una gran cantidad de tal proteína, para la mención de las composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de l anticuerpo, se requieren vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos proteicos de fusión que se puedan purificar fácilmente. Tales vectores incluyen, pero sin limitaciones al vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al, 1983; EMBOJ. 2:1791), en el cual la secuencia codificadora del anticuerpo se puede unir individualmente en el vector en marco con la región codificadora lac Z para que tal proteína de fusión se produzca, vectores pIN (Inouye & Inouye,1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX se pueden usar también para expresar polipéptidos o extraños como proteínas de fusión con glutation S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de lisados celulares por adsorción y unión a una matriz de microesferas de glutation-agarosa seguidas por la elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir trombina o factor Xa en los sitios de ruptura de proteasa para que el producto génico blanco clonado se pueda liberar del residuo GST.
En un sistema de insectos, se emplea el virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificadora del anticuerpo se puede clonar en forma individual en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y se coloca bajo control de un promotor AcNPV (por ejemplo promotor de polihedrina). En células hospedantes de mamíferos, se pueden utilizar varios sistemas de expresión basados en virus (por ej., sistemas de expresión de adenovirus).
Tal como se trató anteriormente, se puede elegir una cepa de célula hospedante que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico del modo deseado. Tales modificaciones (por ej., glicosilación) y procesamiento (por ej., ruptura) de los productos proteicos puede ser importante para la función de la proteína.
Para la producción a largo plazo de alto rendimiento de anticuerpos recombinantes se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden producir líneas celulares que expresen en forma estable un anticuerpo de interés por medio de la transfección de células con un vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica del anticuerpo y la secuencia nucleotídica del marcador seleccionable (por ej., neomicina o higromicina), y la selección para la expresión del marcador seleccionable. Tales líneas de células diseñadas pueden ser particularmente útiles para la identificación y evaluación de compuestos que interactúen en forma directa o indirecta con la molécula de anticuerpo.
Los niveles de expresión de la molécula del anticuerpo se pueden aumentar por amplificación del vector (para una revisión ver Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)). Cuando un marcador del sistema vector que expresa el anticuerpo es amplificable, un aumento del nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedante aumentará el número de copias del gen marcador. Ya que las regiones amplificadas se asocian con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo aumentará también (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
La célula hospedante se puede co-transfectar con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector que codifica una cadena pesada derivada de un polipéptido y el segundo vector que codifica la cadena liviana derivada del polipéptido. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la expresión igual de las cadenas pesadas y livianas de los polipéptidos. Alternativamente, se puede emplear un vector simple que codifica las cadenas pesadas y livianas de los polipéptidos. En tales situaciones, la cadena liviana se debería colocar antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:2197). Las secuencias codificadoras para las cadenas livianas y pesadas pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Una vez que la molécula de anticuerpo de la invención se ha expresado en forma recombinante, se puede purificar por cualquier método conocido en la técnica para purificación de una molécula de anticuerpo, por ejemplo, por cromatografía (por ej., cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad tal como proteína A o específica del antígeno cromatografía de tamaño en columna), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para purificación de proteínas.
Alternativamente, cualquier proteína de fusión se puede purificar rápidamente por la utilización de u anticuerpo específico para la fusión de proteínas expresadas. Por ejemplo, un sistema descripto por Janknecht et al. permite la purificación rápida de las proteínas de fusión no desnaturalizadas que se expresan en línea as celulares humanas (Janknecht et al.,1991,Prom Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897). En este sistema, el gen de interés se subclona en un plásmido de recombinación de vaccinia de manera tal que el marco de lectura abierto de gen se fusiona en forma traduccional a una marca amino-terminal que consiste en seis residuos de histidina. La marca sirve como un dominio de unión a la matriz para la fusión de la proteína. Los extractos de las células infectadas con virus de vaccinia recombinante se cargan en columnas de Ni2+ ácido nitriloacético-agarosa y las proteínas con histidina marcada se eluyen en forma selectiva con buffers que contienen imidazol.
En una realización preferida, los anticuerpos Hpa2 o proteínas relacionadas con Hpa2 o fragmentos de la misma se conjugan a un residuo diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos se pueden usar para diagnóstico o para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección se puede facilitar por el acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, nucleidos radiactivos, metales que emiten positrones (para uso en tomografía de emisión de positrones) y iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Ver generalmente Patente Estadounidense No. 4.741.900 para iones metálicos que se pueden conjugar a anticuerpos para usar como diagnóstico de acuerdo con la presente invención. Enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiacianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y nucleidos radiactivos adecuados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{111}In y ^{99}Tc.
Los anticuerpos anti-Hpa2 o proteínas relacionadas con Hpa2 o fragmentos de los mismos se pueden conjugar a un agente terapéutico o residuo de fármaco para modificar una respuesta biológica dada. El agente terapéutico o terapéutico o residuo de fármaco no se interpreta como limitado a los agentes terapéuticos clásicos. Por ejemplo, el residuo de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina-A, exotoxina de pseudomonas o toxina de difteria, una proteína tal como factor de necrosis tumoral, \alpha-interferón, \beta-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, por ej., angiostatina o endostatina; o una modificador de la respuesta biológica tal como linfoquinas, interleuquinas-1 (IL-1), interleuquinas-2 (IL 2), interleuquinas-6 (IL-6), factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otro factor de crecimiento.
Las técnicas para la conjugación de tales residuos terapéuticos a anticuerpos son bien conocidas, ver, por ej Amon et al; "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.(editores.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2^{nd} Ed), Robinson et al. (editores), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (editores), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (editores), pp. 30346 (Academic Press 1985)^{-}, y Thorpe et al., The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates'', Immunol. Rev.; 62:119-58 (1982).
Alternativamente, un anticuerpo se puede conjugar a un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado como se describe en Segal en la Patente Estadounidense No: 4.676.980.
Un anticuerpo con o sin residuo terapéutico conjugado se puede usar como un agente terapéutico que se administra solo o en combinación con factor(es) citotóxico(s) y/o citoquina(s).
Los anticuerpos policlonales se pueden originar por medio de la estimulación de su producción en un hospedante animal adecuado (por ej., pollo, ratón, rata, cobayo, conejo, oveja, cabra o mono) cuando el polipéptido de la presente invención se inyecta en un animal. Si fuera necesario, se puede administrar un adyuvante junto con el polipéptido de la presente invención. Los anticuerpos luego se pueden purificar en virtud de su unión al polipéptido de la presente invención.
Los anticuerpos monoclonales se pueden producir a partir de hibridomas. Estos se pueden formar por fusión de las células del mieloma y células del bazo que producen el anticuerpo deseado con el fin de formar una línea de células inmortal. Esta es la bien conocida técnica de Kohler & Milstein (Nature 25652-55 (1975)).
Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales y policlonales que se unen a una proteína particular están en actualidad bien desarrolladas en la técnica. Estas se tratan en manuales de inmunología estándares, por ejemplo en Roitt et al, Immunology segunda edición (1989), Churchill Livingstone, London.
Además de los anticuerpos totales, la presente incluye a derivados de los mismos que son capaces de unirse a los polipéptidos de la presente invención. De esta manera, la presente invención incluye fragmentos de anticuerpos y construcciones sintéticas. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos y construcciones sintéticas se dan en Dougall et al en Tibtech 12 372-379 (Setiembre 1994).
Los fragmentos de anticuerpos incluyen, por ejemplo, los fragmentos Fab, F(ab') y Fv (ver Roitt el al [supra]). Los fragmentos Fv se pueden modificar para producir una construcción sintética conocida como una molécula de Fv de cadena simple (scFV). Esto incluye un péptido ligado en forma covalente a las regiones de unión V_{h} y V_{l} que contribuyen a la estabilidad de la molécula.
Otras construcciones sintéticas incluyen a los péptidos CDR. Estos son péptidos sintéticos que comprenden determinantes de unión al antígeno. También se pueden usar péptidos miméticos. Estas moléculas son usualmente anillos orgánicos de conformación restringida que imitan la estructura de un bucle del CDR y que incluyen cadenas laterales interactivas con el antígeno.
Las construcciones sintéticas incluyen moléculas quiméricas. De esta manera, por ejemplo, los anticuerpos humanizados (o primatizados) derivados del mismo están dentro del alcance de la presente invención. Un ejemplo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene regiones de la estructura humana, pero regiones hipervariable de roedores.
Las construcciones sintéticas también incluyen moléculas que comprenden un residuo unido en forma covalente que proporciona la molécula con alguna propiedad deseable además de la unión al antígeno. Por ejemplo, el residuo puede ser una marca (por ej., una marca fluorescente o radiactiva) o un agente activo para uso farmacéutico.
Los anticuerpos o sus derivados de la presente invención presentan una amplia variedad de usos. Se pueden usar para la purificación y/o identificación de las sustancias de la presente invención. De esta manera, se pueden usar para diagnóstico. Estos se pueden proporcionar en forma de un equipo para detección de los polipéptidos de la presente invención. La invención también proporciona el uso de tal anticuerpo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de afecciones asociadas con actividad elevada de la heparanasa tal como cáncer (en metástasis particulares), enfermedades del SNC y neurodegenerativas, inflamación y en enfermedades cardiovasculares tales como restenosis posterior a angioplastía y aterosclerosis. A partir de los datos disponibles (ver Figura 7) parece que le cáncer pancreático puede ser una enfermedad que podría tratarse con los anticuerpos originado con los polipéptidos de la presente invención.
La presente invención también proporciona fragmentos antigénicos/inmunogénicos de los polipéptidos de la invención. Ejemplos de tales fragmentos son:
QPIRIYSRASLYGPNIGRPRIKNV (Sec. ID No. 9)
DTLSDQIRKIQKVVNTYTPGKKIW (Sec. ID No. 10)
AVHiVAGLQRKPRPGRVIRDKLRIYA (Sec. ID No. 11)
Los fragmentos se pueden proporcionar solos, como una preparación purificada o aislada, o como parte de una mezcla con otro.
La invención también proporciona una composición del antígeno que comprende uno o más de tales fragmentos y un equipo para uso para la detección de la proteína semejante a heparanasa de la presente invención, tal equipo comprende uno o más fragmentos. Además, los fragmentos se pueden usar para inducir una respuesta inmune contra la proteína semejante a heparanasa de la presente invención. De esta manera, esta invención también proporciona el uso de tales fragmentos en medicina.
La presente invención también proporciona una composición capaz de estimular una respuesta inmune en un sujeto, tal composición comprende un fragmento. Adecuadamente, la composición será una composición de vacuna, opcionalmente comprende uno o más adyuvantes adecuados. Tal composición de vacuna puede ser una composición de vacuna profiláctica o terapéutica. Las composiciones de vacunas pueden incluir uno o más adyuvantes. Ejemplos bien conocidos en la técnica incluyen geles inorgánicos, tale como hidróxido de aluminio, y emulsiones de agua en aceite, tal como
el adyuvante de Freund incompleto. Otros adyuvantes útiles serán bien conocidos por las personas experimentadas.
La presente invención también proporciona: el uso de tal fragmento en al preparación de una composición inmunogénica, con preferencia una vacuna; y el uso de tal composición inmunogénica para inducir la respuesta inmune en un sujeto.
Hpa2 o las proteínas relacionadas con Hpa2 se pueden detectar en un inmunoensayo. En una realización, se realiza un inmunoensayo por contacto de una muestra del sujeto de examen con un anticuerpo anti-Hpa2 en condiciones tales que la unión inmunoespecífica se puede producir si el Hpa2 está presente, y se detecta o mide la cantidad de cualquier unión inmunoespecífica con el anticuerpo. Los anticuerpo anti-Hpa2 se pueden producir por los métodos y técnicas que se enseñan en la presente memoria.
Hpa2 se puede probar en ensayos adecuados que incluyen, sin limitación, sistemas de ensayo competitivos o no competitivos que usan técnicas como transferencias Western e inmunoensayos "sandwich" que emplean anticuerpos contra un polipéptido de la presente invención tal como se describe en la presente memoria.
En una realización, la unión del anticuerpo en secciones de tejido se puede usar para detectar la localización aberrante de Hpa2 o un nivel aberrante de Hpa2. En una realización específica, un anticuerpo para un Hpa2 se puede usar para ensayar una muestra de tejido de un sujeto para determinar el nivel de Hpa2 donde un nivel aberrante de Hpa2 es indicativo de una afección asociada con actividad elevada de heparanasa, heparanasa tal como cáncer (en metástasis particulares), enfermedades del SNC y neurodegenerativas, inflamación y en enfermedades cardiovasculares tales como restenosis posterior a angioplastía y aterosclerosis. En una realización preferida, se detecta cáncer pancreático con anticuerpo originados por los polipéptidos de la presente invención. Como se usa en la presente memoria, un "nivel aberrante" significa nivel que está aumentado o disminuido en comparación con el nivel del sujeto libre de la enfermedad concerniente o un nivel de referencial Si se desea, la comparación se puede realizar con una muestra apareada del mismo sujeto, tomada de una porción del cuerpo no afectado por la enfermedad.
Se puede usar cualquier inmunoensayo adecuado incluyendo, sin limitación, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos empleando técnicas tales como transferencias Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorbancia ligada a enzimas), inmunoensayos "sandwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina con difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A.
Por ejemplo, la HPa2 o proteína reaccionada con Hpa2 se puede detectar en una muestra líquida (por ej., líquido cefalorraquídeo LCR, sangre, orina u homogenato de tejido) por medio de un ensayo sandwich de dos pasos. En el primer paso, se emplea un reactivo de captura (por ej., un anticuerpo anti-Hpa2) para capturar Hpa2. El reactivo de captura opcionalmente se puede inmovilizar en una fase sólida. En el segundo paso se emplea un reactivo de detección marcado en forma directa o indirecta para detectar la Hpa2 capturada.
Si se desea, un gen que codifica Hpa2, un gen relacionado o las secuencias o subsecuencias de ácidos nucleicos relacionados también se pueden emplear en ensayos e hibridación. un nucléotido que codifica una Hpa2; o subsecuencia de la misma que comprenden por lo menos 8 nucleótidos, con preferencia por lo menos 12 nucleótidos, con preferencia por lo menos 15 nucleótidos se pueden usar como sonda de hibridación. Con preferencia, la sonda empleada es una que no hibridiza en las condiciones elegidas a las secuencias que codifican la heparanasa. Los ensayos de hibridación se pueden usar para la detección, pronóstico, diagnóstico o control de las afecciones, trastornos o estados de enfermedad asociados con la expresión aberrante de genes que codifican Hpa2 o para diagnóstico diferencial de sujetos con signos o síntomas sugestivos de una afección asociada con actividad elevada de heparanasa. En particular, tal ensayo de hibridación se puede llevar a cabo por un método que comprende poner en contacto las muestras de un sujeto que contienen ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridizar a un ADN o ARN que codifique un Hpa2 en condiciones para que tal hibridación se pueda producir y luego detectar o medir cualquier hibridación resultante. Los nucleótidos se pueden usar para la terapia de los sujetos que tienen una afección asociada con actividad elevada de heparanasa.
La invención también proporciona equipos para diagnóstico, que comprenden un anticuerpo anti-Hpa2. Además, tal equipo opcionalmente puede comprender uno o más de los siguientes: (1) instrucciones para uso del anticuerpo anti-Hpa2 para diagnóstico, pronóstico, control terapéutico o cualquier combinación de estas aplicaciones; (2) un compañero e unión marcado para el anticuerpo; (3) una fase sólida (tal como una tira reactiva) sobre la cual se inmoviliza el anticuerpo anti-Hpa2 y (4) una marca o prospecto que indica la aprobación regulatoria para uso diagnóstico, pronóstico o terapéutico o cualquiera de sus combinaciones. Si no se suministra el compañero de unión marcado para el anticuerpo, el anti-Hpa2 mismo se marcar con un marcador detectable, por ej., un residuo quimioluminiscente, enzimático, fluorescente o radiactivo.
La invención también proporciona un equipo que comprende una sonda de ácido nucleico capaz de hibridizar a ARN que codifica un Hpa2. En una realización específica un equipo comprende en uno o más recipientes un par de cebadores (por ej., cada uno en un rango de tamaño de 6-30 nucleótidos, con más preferencia de 10-30 nucleótidos y aún con más preferencia 10-20 nucleótidos) que en condiciones de reacción apropiadas puede cebar la amplificación de por lo menos una porción de ácido nucleico que codifica un Hpa2, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (ver, por ej., Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, he San Diego, CA), la reacción en cadena de la ligasa (ver EP 320,308), uso de Q\beta replicasa, reacción de sonda cíclica u otros métodos conocidos en la técnica.
También se proporcionan equipos que permiten la detección de una pluralidad de Hpa2 o proteínas relacionadas con Hpa2 o una pluralidad e ácidos nucleicos que codifican Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2. Opcionalmente un equipo puede comprender una cantidad predeterminada de un Hpa2 aislado o un ácido nucleico o que codifique Hpa2, por ej., para uso como un estándar o control.
Un aspecto adicional de la invención se relaciona con moléculas de ácidos nucleicos aislado o recombinante que codifican un polipéptido de la invención o una porción biológicamente activa del mismo, además de las moléculas de ácidos nucleicos suficientes para usar como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la invención y fragmentos de tales moléculas de ácidos nucleicos adecuadas para uso como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácidos nucleicos. Como se usa en la presente memoria, el término "moléculas de ácidos nucleico" está destinado a incluir moléculas de ADN (por ej., ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ej., ARNm) y análogos del ADN o ARN generado mediante análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena simple o cadena doble, pero con preferencia es ADN de cadena doble.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que es:
(i) una secuencia de ADN que se muestra en los residuos 601 o 631 a 2376 de la Figura 1 (Sec. ID No 1), residuos 601 o 631 a 2202 de la Figura 2 (Sec. ID No 3), o residuos 601 o631 a 2040 de la Figura 3 (Sec. ID No 5) o su ARN equivalente, incluyendo o excluyendo el total o parte de la secuencia que esta 5' y/o 3' de la misma
(ii) una secuencia que es complementaria a cualquiera de las secuencias de (i) o (iii)
(iii) una secuencia que codifica para la misma proteína o polipéptido que las secuencias de a) a c) tal como se describe en la presente memoria.
En realizaciones preferidas, los ácidos nucleicos de la invención consisten en o comprenden las secuencias de los ácidos nucleicos de la invención que se ilustran en la Figura 1, 2 o 3 (Sec. ID No. 1, 3 o 5).
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que está separada de las otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural de la molécula de ácido nucleico. Con preferencia, una molécula de ácido nucleico "aislada" está libre de secuencias (con preferencia secuencias que codifican proteínas) que flanquean en forma natural al ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de 51 kB, 4 kB, 3 kB, 2 kB, 1 kB, 0,5 kB o 0,1 kB de secuencias nucleotídicas que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula del cual deriva el ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos sintetizados. Como se usa en la presente memoria, el término "aislado" cuando se refiere a una molécula de ácido nucleico no incluye un cromosoma aislado. Con preferencia, los nucleótidos aislados de la presente invención no están dentro de un gel (es decir, un gel de separación de poliacrilamida) u otra matriz.
Las realizaciones específicas para la clonación de un gen que codifica Hpa2 o un polipéptido relacionado con Hpa2 se presentan a continuación a modo de ejemplo y no de limitación.
Las secuencias nucleotídicas de la presente invención, que incluyen ADN y ARN, y comprenden una secuencia que codifica una Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 se puede sintetizar mediante métodos conocidos en la técnica, tales como abordajes químicos convencionales o amplificación de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias nucleotídicas de la presente invención también permiten la identificación y clonación del gen que codifican una Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2, por ejemplo, para la identificación de genotecas de ADMc, genotecas genómicas o genotecas de expresión.
Los oligonucleótidos que codifican una Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 se pueden marcar e hibridizar en filtros que contienen genotecas de ADNc y de ADn genómicos. Los oligonucleótidos para diferentes péptidos de la misma proteína con frecuencia identificarán a miembros iguales de la genoteca. Las genotecas de ADNc y de ADN genómicos se pueden obtener de cualquier especie de mamífero adecuada o deseada, por ejemplo, de seres humanos.
Las secuencias nucleotídicas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican una Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 son útiles par su capacidad de para hibridizarse en forma selectiva con extensiones complementarias de genes que codifican una Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2. De acuerdo con la aplicación, se puede emplear una variedad de condiciones de hibridación para obtener secuencias nucleotídicas por lo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idéntica o 100% idéntica a la secuencia nucleotídica de un nucleótido que codifican una Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2. La similitud de una secuencia dada a Hpa2 o polipéptido relacionado con Hpa2 se puede determinaron respecto a su longitud completa o a cualquier fragmento del mismo. Con preferencia, la secuencia o fragmento de la misma de por lo menos 10 nucleótidos (con más preferencia, por lo menos 15 nucleótidos, por lo menos 20 nucleótidos, por lo menos 25 nucleótidos, por lo menos 40 nucleótidos, por lo menos 50 nucleótidos, por lo menos 60 nucleótidos, por lo menos 70 nucleótidos, por lo menos 80 nucleótidos, por lo menos 90 nucleótidos, por lo menos 100 nucleótidos, por lo menos 125 nucleótidos o por lo menos 150 nucleótidos).
Para un alto grado de selectividad, se emplean condiciones de alta rigurosidad para formar los dúplex, tales como condiciones de baja salinidad o alta temperatura. Como se usa en la presente memoria, "condiciones altamente rigurosas" significa hibridación al ADN unido la filtro en NaHPO_{4}, 0,5 M, 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS), EDTA 1M a 65ºC y lavado en 0,1 xSS/0,1% de SDS a 48ºC (Ausubel F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc, New York, a p. 2.10.3; incorporado en la presente memoria en su totalidad como referencia). Para algunas aplicaciones, se requieren condiciones menos rigurosas para la formación de dúplex. Como se usa en la presente memoria, "condiciones moderadamente rigurosas" significa lavado en 0, 2 x SSC/0., % SDS a 42ºC (Ausubed et al, 1989, supra). Las condiciones de hibridación también pueden volverse más rigurosas por la adición de cantidades crecientes de formamida, para desestabilizar el dúplex híbrido. De esta manera, las condiciones de hibridación se pueden manipular fácilmente y generalmente se elegirán de acuerdo con los resultados deseados. En general, las temperaturas de hibridación en presencia de 50% de formamida son : 42ºC para una sonda que es 95 a 100% idéntica al fragmento de un gen que codifica Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2, 37ºC para 90 o 95% de identidad y 32ºC para 70 a 90% de identidad.
En una realización preferida, las condiciones de hibridación son las siguientes:
1. Sonda - ADNc de Hpa2 de longitud completa radiomarcada por cebadura al azar. Con preferencia, el ácido nucleico al cual la sonda se hibridizará es ARN.
2. Hibridizar a 68ºC durante 1 hora en ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech Laboratories, Inc, 1999). Este paso se llevó a cabo a 64, 65, 66, 67ºC durante 0,5, 1,5 o 2 horas.
3. Lavado (x2) durante 40 minutos a 20ºC con lavado 1 (2xSSC, 0,05 % de SDS). Este paso se llevó a cabo a 19, 18, 17, 16ºC o a temperatura ambiente durante 20, 30, 45, 60, o 190 minutos con 2,5 x SSC o 3xSSC y 0,04%, 0,03% o 0,02% SDS.
4. Lavado (x2) durante 40 minutos a 50ºC con lavado 2 (0,1 x SSC, 0,1 % SDS). Este paso se llevó a cabo a 40, 42, 45 o 47ºC, durante 20, 30, 45, 60, o 190 minutos con 0,15 x SSC o 0,2 x SSC y 0, 03%, 0,05% o 0,07% de SDS.
En la preparación de las genotecas genómicas, se generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales codificarán partes o el total de Hpa2 o una proteína relacionada con Hpa2. Se puede emplear cualquier método adecuado para la preparación de fragmentos de ADN en la presente invención. Por ejemplo, el ADN se puede escindir en sitios específicos empleando diferentes enzimas de restricción. Alternativamente, se puede usar AADN sa en presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o el ADN se puede cortar físicamente, como por ejemplo por sonicación. Los fragmentos de ADN se pueden separar de acuerdo al tamaño por medio de técnicas estándares, que incluyen pero sin limitación a electroforesis en gel de agarosa y poliacrilamida, cromatografía en columna y centrifugación en gradiente de sacarosa. Los fragmentos de ADN se pueden insertar luego en vectores adecuados, que incluyen pero sin limitación a plásmidos, cósmidos, bacteriófagos lambda o T_{4} y cromosoma artificial de levaduras, (YAC). (Ver por ej., Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork, Glover, DM. (ed), 1985, ADN Cloning: A Practical Approach, MRL Pres, Ltd. Oxford, U.K. Vol I, II; Ausubel F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & sons, Inc., New York). La genoteca genómica se puede identificar por hibridación del ácido nucleico a una sonda marcada (Benton and Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 72:3961).
Sobre la base de la presente descripción, las genotecas genómicas se pueden identificar con sondas marcadas de oligonucleótidos degenerados correspondientes a la secuencia de aminoácidos de cualquier péptido de Hpa2 o proteína relacionada con Hpa2 mediante abordajes óptimos bien conocidos en la técnica. Se usa cualquier sonda de por lo menos 10 nucleótidos, por lo menos nucleótidos, por lo menos 20 nucleótidos, por lo menos 25 nucleótidos, por lo menos 30 nucleótidos, por lo menos 40 nucleótidos, por lo menos 50 nucleótidos, por lo menos 60 nucleótidos, por lo menos 70 nucleótidos, por lo menos 80 nucleótidos o por lo menos 100 nucleótidos. Con preferencia una sonda es de 10 nucleótidos o más y con más preferencia 15 nucleótidos o más.
La presente invención abarca moléculas de ácidos nucleicos antisentido, es decir moléculas que son complementarias a un ácido nucleico homosentido que codifica un polipéptido de la invención, por ej., complementaria a la cadena codificadora de un ADNc de doble cadena o complementaria a la secuencia de ARNm. Por consiguiente, una ácido nucleico antisentido puede unirse al hidrógeno de un ácido nucleico homosentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificadora entera, o a solo una porción de la misma, por ej., el total o parte de la región codificadora de la proteína (o marco de lectura abierto). Una molécula de ácido nucleico antisentido se puede ser antisentido para toda o parte de la región no codificadora de la cadena codificadora de una secuencia de nucléotidos que codifican un polipéptido de la invención. Las regiones no codificadoras ("regiones no traducidas 5' y 3'") son las secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificadora y no se traducen en aminoácidos.
Un oligonucléotido antisentido puede tener por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos o más de longitud. Un ácido nucleico antisentido de la invención se puede construir mediante síntesis química y reacciones de ligamiento enzimático que emplean procedimientos conocidos en la técnica. POr ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ej, noligonucléotido antisentido) se puede sintetizar químicamente mediante nucleótidos que se producen en forma natural o nucleótidos diversamente modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o aumentar la estabilidad física de los duplex formados entre los ácidos nucleicos antisentido y homosentido, por ej., se pueden usar derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar ácido nucleicoincluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetiaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta,D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 3-metiluracilo, metil éster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente empleando un vector de expresión dentro de un ácido nucleico que ha sido subclonado en una orientación antisentido (es decir, un ARN transcripto del ácido nucleico insertado tendrá orientación al ácido nucleico blanco de interés, descripto adicionalmente en la siguiente subsección).
Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención se administran generalmente a un sujeto o se generan in situ de manera tal que se hibridicencon o se unan al ARNm celular y/o ADN genómico que codifica un polipéptido seleccionado de la invención para de ese modo inhibir la expresión, por ej., inhibir la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a ADN bicatenarios, mediante interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice. Un ejemplo de una vía de administración de la molécula de ácido nucleico antisentido de la invención incluye la inyección directa en un sitio tisular. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico antisentido se pueden modificar para dirigirse a células seleccionadas y luego administrarse por vía sistémica. Por ejemplo, para administración sistémica, las molécula antisentido se pueden modificar para que ellas se unan específicamente a receptores o antígenos expresados en la superficie celular seleccionada, por ej., por unión de las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores o antígenos de la superficie celular. Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención también se pueden administrar a las células mediante los vectores descriptos en la presente memoria. Para obtener concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren las construcciones de vectores en los cuales la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor potente pol II o pol III.
Una molécula de ácido nucleico antisentido de la invención puede ser una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una moléculas de ácido nucleico \alpha-anomérica forma híbridos de doble cadena específicos con el ARN complementario, en el cual, en forma contraria a las unidades \beta usuales, las cadenas corren en paralelo entre sí (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-o-metilrribonucleótido (Inoue et al (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).
La invención también abarca ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico de cadena simple, tal como un ARNm con el cual tienen una región complementaria. De esta manera se pueden usar ribozimas (por ej ribozimas cabeza de martillo (descripto en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) de para escindir catalíticamente transcriptos de ARNm para de ese modo inhibir la traducción de una proteína codificada por el ARNm. Se puede diseñar una ribozima que tenga especificidad para una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención sobre la base de la secuencia nucleotídica de un ADNc descripto en la presente memoria. Por ejemplo, se puede construir un derivado de ARN de Tetrahymena 1191VS RNA en el cual la secuencia nucleotídica del sitio activo es complementaria con la secuencia nucleotídica que será escindida en Cech et al., Patente Estadounidense No. 4.987.071; y Cech et al. Patente Estadounidense No 5.116.742. Alternativamente, se puede usar un ARNm que codifica un polipéptido de la invención para seleccionar un ARN catalítico que tenga actividad de ribonucleasa específica a partir de un a mezcla de moléculas de ARN. Ver, por ej., Bartel and Szostak (1993) Science 261:1411-1418.
La invención también abarca moléculas de ácido nucleico que forman estructuras de triple hélice. Por ejemplo, la expresión de un polipéptido se puede inhibir dirigiendo secuencias nucleotídicas complementarias a la región regulatoria del gen que codifica al polipéptido (por ej., el promotor y/o potenciador) para formar estructuras de triple hélice que impiden la transcripción del gen en células blanco. Ver generalmnte Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569.84; Helene (1992) Ann. NY. Acad. Sci 66027-36; y Maher (1992) Bioassays 14(12):807-15.
En varias realizaciones, las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden modificar las bases de los residuos, los azucares de los residuos o el esqueleto de fosfatos para mejorar por ej, la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, el esqueleto de fosfato de desoxirribosa de los ácidos nucleicos se puede modificar para generar ácidos nucleicos de péptidos (ver Hyrup et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1):5-23). Como se usa en la presente memoria, los términos "ácidos nucleicos de péptidos" o "PNA, por su sigla en inglés" se refiere a imitadores de ácido nucleico, por ej, imitadores de ADN, en los cuales el esqueleto de fosfato de desoxirribosa está reemplazado por un esqueleto de seudopéptidos y solo se conservan cuatro bases naturales. Se ha demostrado que el esqueleto neutro de los PNA permite la hibridación específica al ADN y ARN en condiciones de baja fuerza iónica. La síntesis de ARN de los oligómeros de PNA se puede realizar mediante protocolos estándares de síntesis de péptidos en fase sólida como se describe en Hyrup et al. (1996), supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675.
Los PNA se pueden usar en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. Por ejemplo, los PNAs se pueden usar como agentes antisentidos o antígeno para la modulación específica de secuencia de la expresión génica, por ej., por inducción de la transcripción o detención dela traducción o inhibición de la replicación. También se pueden usar los PNA, por ej., en el análisis de mutaciones de pares de bases simples en un gen, por ej., pinzamiento en PCR dirigido por PNA; como enzimas de restricción artificial cuando se usa en combinación con otras enzimas por ej nucleasas Sl (Hyrup (1996), supra; o como sondas o cebadores para secuencias de ADN e hibridización (Hyrup (1996), supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Nad. Acad. Sd. USA 93:14670-675).
En otra realización, los PNA se pueden modificar, por ej, para aumentar su estabilidad o captación celular, por unión de grupos lipofílicos y u otros grupos auxiliares al PNA, por la formación de quimeras PNA-ADN, o por el uso de liposomas u otras técnicas de administración de fármacos conocidas en la técnica. Por ejemplo, se pueden generar las quimeras PNA-ADN que pueden combinar las propiedades ventajosas de PNA y ADN. Tales quimeras permiten que las enzimas de reconocimiento de ADN, por ej, ARNsa H y ADN polimerasas, para interactuar con la porción de ADN mientras que la porción de PNA podría proporcionar afinidad de unión y especificidad elevada. Las quimeras PNA-ADN se pueden mediante ligadores de longitudes apropiadas seleccionadas en términos de apilamiento de bases, números de enlaces entre las nucleobases y orientación (Hymp (1996), supra). La síntesis de quimeras PNA-ADN se pueden realizar como se describe en Hyrup (1996), supra, y Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63. Por ejemplo una cadena de ADN se puede sintetizar en un soporte sólido mediante reacciones químicas de acoplamiento estándar de fosforamidita y análogos de nucléosidos modificados. Los compuestos tales como 5'-(4-metoxitritil)amino-5'-deoxi-timidina fosforamidita se pueden usar como una unión entre el PNA y el extremo 5’ del ADN (Mag et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:5973-88). Los monómeros de PNA de una manera escalonada para producir moléculas quiméricas con un segmento 5' de PNA y un segmento 3' ADN (Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63). Alternativamente, las moléculas quiméricas se pueden sintetizar con un segmento 5’ de ADN y un segmento 3' de PNA (Petersen et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124).
En otras realizaciones, los oligonucléotidos pueden incluir otros grupos anexos tales como péptidos (por ej., para dirigirse a receptores de la célula hospedante in vivo), o agentes que faciliten el transporte a través de la membrana celular (ver, por ej, Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sci USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc Natl Acad. Sci. USA 84:648-652; Publicación PCT No. WO 88/09810) o la barrera hematoencefálica (ver, por ej Publicación PCT No. WO 89/10134). Además, los oligonucléotidos se pueden modificar con agentes de ruptura desencadenados por la hibridación (ver, por ej, Krol et al. (1988) Bio/Techniques 6:958-976) o agentes intercalantes (ver, por ej, Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Con este fin, el oligonucleótido se puede conjugara otra molécula, por un péptido, agente de unión cruzada desencadenado por la hibridación, agente transportador, agentes de ruptura desencadenados por la hibridación, etc.
En una realización, se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que se muestra en los residuos 727 a 2376 de la Figura 1 (Sec. ID No. 1), residuos 727 a 2202 de la Figura 2 (Sec. ID No. 3), o residuos 727 a 727 a 2040 de la Figura 3 (Sec. ID No. 5).
El término identidad se puede usar también para describir la similitud entre dos secuencias individuales de ADN. El programa "bestfit" (Smith and Waterman, Advances in applied Mathematics, 482-489 (1981)) es un ejemplo de un tipo de programa de computación empleado para hallar el mejor segmento de similitud entre dos secuencias nucleotídicas, mientras que el programa GAP permite que las secuencias se alineen a lo largo de su longitud total y halla el alineamiento óptimo por medio de la inserción de espacios en las secuencias cuando fuera apropiado. Se prefiere que las secuencias que muestran identidad sustancial con cualquiera de las de (i), (ii) y (iii) tengan por lo menos 50%, por lo menos 75% o por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencia.
Los polipéptidos de la presente invención pueden estar codificados por una gran variedad de moléculas de ácidos nucleicos, teniendo en cuenta la bien conocida degeneración del código genético. Todas estas moléculas están dentro del alcance de la presente invención. Estas se pueden insertar en vectores y clonarse para proporcionar grades cantidades de DNA o ARN para estudios adicionales. Los vectores adecuados se pueden introducir en células hospedantes para permitir la expresión de los polipéptidos de la presente invención empleando técnicas conocidas por los expertos de la técnica.
El término "ARN equivalente" usado anteriormente indica que una molécula de ARN dada tiene una secuencia que es complementaria a la de la molécula de ADN dada lo cual permite el hecho de que una ``U'' del ARN reemplaza una "T" del código genético. La molécula de ácido nucleico puede estar en forma aislada, recombinante o sintetizada químicamente.
Las técnicas para la clonación, expresión y purificación de proteínas y polipéptidos son conocidas por los expertos de la técnica conocidas por los expertos de la técnica. Las construcciones de ADN se pueden generar mediante técnicas conocidas en la técnica. Estas técnicas se describen en, por ejemplo, Sambrook et al Molecular Cloning 2^{nd} Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989); in Old & Primrose [Principles of Gene Manipulation 5th Edition''. Blackwell Scientific Publications (1994); y en Stryer [Biochemistry 4th Edition, W Freeman and Company (1995)]. Las modificaciones de las construcciones de ADN y las proteínas expresadas tal como la adición de promotores, potenciadores; secuencias señal, secuencias líderes, comienzo de traducción y señales de detención y regiones que controlan la estabilidad de las señales, o la adición de compañeros de fusión entonces pueden estar facilitadas.
Normalmente la construcción de ADN se insertará en un vector que puede ser de origen de un fago o un plásmido. La expresión de la proteína se logra por la transformación o transfección del vector en una célula hospedante., la cual puede ser de origen eucariota o procariota. Tales vectores y células hospedantes constituyen otro aspecto de la presente invención.
El conocimiento de la estructura del ácido nucleico se puede usar para originar anticuerpos y para terapia génica. Las técnicas para esto son bien conocidas por los expertos en la técnica.
Por medio del uso de sistemas de expresión apropiados, los polipéptidos de la presente invención se pueden expresar en forma glicosilada o no glicosilada. Las formas no glicosiladas se pueden producir por la expresión de células hospedantes procariotas, tal como E coli.
Los polipéptidos que comprenden metionina N-terminal se pueden producir mediante ciertos sistemas de expresión, mientras que otros polipéptidos maduros carecerán de este residuo. Las técnicas preferidas para clonación, expresión y purificación de una sustancia de la presente invención se sintetizan a continuación.
Los polipéptidos se pueden preparar en forma nativa o en condiciones de desnaturalización y luego se repliegan posteriormente. Los vectores de expresión de baculovirus incluyen plásmidos (tales como ACGP67 de Pharmingen), que pueden una secuencia del epítope con marcaclonada en marco (por ej., myc, V5 o His) para ayudar a la detección y permitir la posterior purificación de la proteína. Los vectores de expresión de mamíferos pueden incluir pCADN 3 y pSecTag (ambos de Invitrogen), y pRBP9 y pCEP4 (invitrogen), sistemas de E. coli incluyen las series pBad (His marcada - Invilrogeii)o series orpGex (Pharamacia).
Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos de acuerdo con la presente invención, mencionados en la presente memoria como moléculas de ácido nucleico "codificadoras", la presente invención también incluye moléculas complementarias de las mismas. De esta manera, ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico de cadena doble están incluidas den el alcance de la presente invención (estén o no asociadas con otras). También se incluyen moléculas de ARN y moléculas de ADN complementarias (por ej., moléculas de ADNc).
Las moléculas de ácido nucleico que se pueden hibridizar a cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descriptas anteriormente están contempladas en la presente invención. Tales moléculas de ácido nucleico se mencionan en la presente memoria como moléculas de ácido nucleico "hibridizante". LAs moléculas de ácido nucleico hibridizantes pueden ser útiles, por ejemplo, como sondas o cebadores.
Las moléculas hibridizantes deseables son moléculas de por lo menos 10 nucleótidos de longitud y con preferencia son por lo menos 25 nucleótidos de longitud o por lo menos 50 nucleótidos de longitud. Las moléculas de ácido nucleico hibridizantes con preferencia hibridizan a ácidos nucleicos dentro del alcance de específicamente (i), (ii), (iii), (iv) o (v) anteriores.
Las moléculas hibridizantes en forma deseable hibridizarán a tales moléculas en condiciones de hibridación rigurosas. Un ejemplo condiciones de hibridación rigurosas es cuando la hibridación intentada se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 35ºC a aproximadamente 65ºC empleando una solución salina que es aproximadamente 0,9M. Sin embargo, la persona experta podrá variar tales condiciones como fuera apropiado teniendo en cuenta variables tales como longitud de la sonda, composición de bases, tipos de iones presentes, etc.
La manipulación del ADN que codifica la proteína es una técnica particularmente poderosa para modificar proteínas y generar grandes cantidades de proteína con propósitos de purificación. Este proceso puede involucrar el uso de técnicas de PCR para amplificar una secuencia de ácido nucleico deseada. De este modo los datos de secuencia proporcionados en la presente memoria se pueden usar para diseñar cebadores para uso en PCR para que la secuencia deseada se pueda localizar y luego amplificar en gran medida.
Típicamente, los cebadores serán por lo menos de cinco nucleótidos de largo y generalmente serán de por lo menos diez nucleótidos de largo (por ej., quince a veinte nucleótidos de largo). En algunos casos, se pueden usar cebadores de por lo menos treinta o por lo menos treinta y cinco nucleótidos de largo.
Como alternativa adicional, puede utilizarse síntesis química. Esta deber ser automatizada. Se pueden sintetizar químicamente secuencias relativamente cortas y ligarlas para proporcionar una secuencia más larga.
La invención proporciona las siguientes moléculas de ácido nucleico (en forma individual y en los pares indicados) que se pueden usar como cebadores o sondas:
GTAGACAGAGCTGCAGGTTTG (Hepa4F1) (Sec. ID No. 12)
CATGATGGCTGGCTCGATTTC (Hepa4R1) (Sec. ID No 13)
TGATGTGAGCACCAAGAACC (Hepa4F2) (Sec. ID No 14)
CAGTTCCAGAACCTGAGGAA (Hepa4R2) (Sec. ID No 15)
GCAGTTACCTGGCAACATTG (Hepa2F1) (Sec. ID No 16)
GTGACCACCTCAGCTGGAGGC (Hepa2R1) (Sec. ID No 17)
GCAGTTACCTGGCAACATTG (Hepa2F1) (Sec ID No 18)
CTATCCGATTCCTATGCTGC (Hepa2R2) (Sec. ID No 19)
TCAAGCTGGCTGGGACTCTCAG (Hepa3F1) (Sec. ID No 20)
GATGGTGGACGACGGGAC (Hepa3R1) (Sec. ID No 21)
Además de emplearse como cebadores y/o sondas, Las moléculas de ácido nucleico hibridizantes de la presente invención se pueden usar como moléculas antisentido para alterar la expresión de sustancias de la presente invención por unión a moléculas de ácido nucleico complementarias. Esta técnica se puede usar en terapia antisentido.
Una molécula de ácido nucleico hibridizante de la presente de la invención puede tener alto grado de identidad de secuencia a lo largo de su longitud con una molécula de ácido nucleico dentro del alcance de (i)-(v) anteriores (por lo menos 50%, por lo menos 75% o por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencia). Como será apreciado por el experto, a mayor identidad de secuencia de una molécula de ácido nucleico de cadena simple dada con otra molécula de ácido nucleico, mayor probabilidad de que esta hibridizará a una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la otra molécula de ácido nucleico en condiciones apropiadas.
En vista de la descripción precedente la persona experta apreciará que una gran cantidad de ácidos nucleicos están dentro del alcance de la presente invención. A menos que el contexto indique lo contrario, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden tener una o más de las siguientes características:
1) estas pueden ser ADN o ARN;
2) estas pueden ser de cadena simple o doble
3) estas se pueden proporcionar en forma recombinante, es decir unido en forma covalente a la secuencia flanqueante a 5' y/o 3', para proporcionar una molécula que no se produce en la naturaleza;
4) estas se pueden proporcionar sin las secuencias flanqueantes 5' y/o 3' que se producen normalmente en la naturaleza;
5) estas se pueden proporcionar en forma sustancialmente pura. De esta manera estas pueden proporciona en una forma que está sustancialmente libre de proteínas contaminantes y/o de otros ácidos nucleicos;
6) estas se pueden proporcionar con intrones o sin intrones (por ej., como ADNc).
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Los inventores han hallado también un homólogo de ratón de la proteína humana.
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De esta manera, de acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un polipéptido que:
a) comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 8 (Sec. ID No 8);
b) es un derivado que tiene una o más sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos en relación con una sustancia tal como se definió en a), anterior o
c) es un fragmento de una sustancia tal como se definió en a) anterior que tiene por lo menos cinco o diez aminoácidos de largo
d) es un análogo, proteína de fusión, ortólogo, homólogo, fragmento, derivado, isoforma o variante de las secuencias de a), b) o c) o fragmento de cualquiera de los precedentes.
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En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que es:
(i) una secuencia de ADN que se muestra en la Figura 8b (Sec. ID No 7) o su ARN equivalente;
(ii) una secuencia que es complementaria con cualquiera de las secuencias de (i);
(iii) una secuencia que codifica para la misma proteína o polipéptido que las secuencias de (i) o (ii);
(iv) una secuencia que codifica para cualquiera de los polipéptidos descriptos (i), (ii) y (iii); o
(v) una secuencia que codifica para cualquiera de los polipéptidos descriptos a); b), c) o d) anteriores, que incluye un derivado o fragmento de una molécula de ácido nucleico que se muestra en la Figura 8b (Sec. ID No 7).
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La secuencia nucleotídica que codifica para Hpa2 o un péptido relacionado con Hpa2, se puede insertar en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificadora de la proteína insertada. Las señales transcripcionales y traduccionales necesarias pueden ser aportadas por el gen nativo que codifica para Hpa2 o sus regiones flanqueantes o el gen nativo que codifica el polipéptido relacionado con Hpa2, o sus regiones flanqueantes. Se pueden utilizar una variedad de sistemas de vectores hospedante en la presente invención para expresar la secuencia codificadora de la proteína. Estas incluyen pero sin limitaciones a sistemas celulares de mamíferos infectados con el virus (por ej. virus vaccinia, adenovirus, etc) sistemas celulares de insectos infectados con virus (por ej, baculovirus), microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levaduras o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN de plásmidos o ADN de cósmido. Los elementos de expresión de los vectores varían en sus fuerzas y especificidades. De acuerdo con el sistema de vectores hospedante usado, se puede emplear cualquiera de varios de los elementos de transcripción y traducción adecuados. En realizaciones específicas, se expresa una secuencia nucleotídica que codifica un gen humano (o una secuencia nucleotídica que codifica una porción funcionalmente activa de un HPa2 humano). En aún otra realización, se expresa un fragmento de Hpa2 que comprende un dominio de Hpa2.
Cualquiera de los métodos previamente descriptos para la inserción de fragmentos de ADN en el vector se pueden usar para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que consiste en señales de control transcripcional y traduccional y las secuencias codificadoras de la proteína apropiadas. Estos métodos pueden incluir técnicas in vitro de ADN recombinante y sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica Hpa2 o un fragmento de la misma se puede regular por una segunda secuencia de ácido nucleico para que Hpa2 o un fragmento de la misma se exprese en un hospedante transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de Hpa2 se puede controlar por cualquier elemento promotor o potenciador conocido en la técnica. Los promotores que se pueden usar para controlar la expresión del gen que codifica Hpa2 o un polipéptido relacionado con Hpa2 incluyen, pero sin limitación, la región del promotor temprano SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' de l virus del sarcoma Rous (Yamamoto et al, 1980, Cell 22:787-797), el promotor de qunasa timidina del herpes (Wagner et al, 1981, Proc. Natl, Acad, Sci USA 78:1441-1445), las secuencias regulatorias del gen de metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:3942), el promotor (Tet) de tetraciclina (Gossett et al., 1995, Proc. Nat. Mad. Sci. USA 89:5547.5551); vectores de expresión tales como promotor de b-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), o el promotor tacr (DeBoer, et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:21-25; ver también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94); vectores de expresión en plantas que comprenden la región promotora de la nopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al, Nature 303209-213) el promotor del ARN del virus del mosaico de coliflor 35S (Gardner, et al, 1981, Mel. Acids Res:9:2871), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al, 1984, Nature 310:115-120); elementos promotores de levaduras u otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor PGK (fosfoglicerol quinasa), promotor de fosfatasa alcalina y las siguientes regiones de control transcripcional en animales, que exhibe especificidad tisular y ha sido utilizado en animales transgénicos: región control del gen de elastasa I que es activo en células pnacreáticas acinares (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409, MacDonald, 1987, Hepatology, 7:425-515); región control del gen de insulina que es activo en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985; Nature 315:115-122), región control del gen de inmunoglobulina que es activo en células linfoides (Grossched et al, 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7:14364444), región control del virus del tumor mamario de ratón que es activo en células de testículo, mamas, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45.485-495), región control del gen de albúmina que es activo en hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), región control del gen de alfa-fetoproteína que es activo en hígado (Krumlauf et al, 1985, Mol Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al, 1987, Science 235:53-58; región control del gen de alfa-antitripsina que es activo en hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), región control del gen de beta-globina que es activo en células mieloides (Mogram et al, 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al, 1986, Cell 46:89-94; región control del gen de la proteína básica de la mielina que es activo en células oligodendrocíticas del cerebro (Readhead et al,1987, Cell 48:703-712); región control del gen de la cadena liviana 2 de la miosina que es activo en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286); enolasa específica neuronal (NSE) que es activo en células neuronales (Morelli et al, 1999, Gen. Virot 80:571-83); región control del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) que es activo en células neuronales (Tabuchi et al, 1998, Biochem. Biophysic. Res. Cam. 253:818-823); promotor de la proteína ácida fibrilar de la glia (GFAP) que es activo en astrocitos (Games et al, 1999, Braz J Med Biol Res 32(5):619-631; Morelli et al, 1999, Gen. Viral. 80:571-83) y región control de la hormona de liberación de gonadotrofinas que es activo en hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378)
En una realización específica se emplea un vector que comprende un promotor operativamente unido a un ácido nucleico que codifica HPa2, uno o más orígenes de replicación y opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ej., gen de resistencia a los antibióticos).
En una realización específica, se realiza una construcción de expresión por subclonación de una secuencia codificadora de Hpa2 o un polipéptido relacionado con Hpa2 en el sitio de restricción EcoRI de cada uno de los tres vectores pGEX (vectores de expresión de glutation-S-transferasa; Smith and Johnson, 1988, Gene 7:31-40). Esto permite la expresión del producto de Hpa2 o un polipéptido relacionado con Hpa2 a partir del subclon en el marco de lectura correcto.
En células hospedantes de mamíferos, se pueden utilizar varios sistemas de vectores de expresión basados en virus. En los casos en que se emplea un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificadora de Hpa2 o la secuencia codificadora de un polipéptido relacionado con Hpa2 se puede liga en un complejo de control de transcripción/traducción, por ej., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico se puede insertar en el genoma del adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción de una región no esencial del genoma viral (por ej, región E1 o E3) producirá un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula del anticuerpo en los hospedantes infectados (por ej., ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359). También se pueden requerir señales específicas de iniciación para la traducción eficiente de las secuencias codificadoras del anticuerpo insertado. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificadora deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control de transcripción y codones de inciación exógenos pueden ser de una variedad de orígenes, tanto sintéticos como naturales. Las eficiencia de la expresión se puede mejorar por la inclusión de elementos apropiados potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. (see Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).
Los vectores de expresión que contiene insertos de un gen que codifica Hpa2 o un polipéptido relacionado con Hpa2 se pueden identificar por medio de tres abordajes generales: (a) hibridación de ácido nucleico, (b) presencia o ausencia de funciones del gen "marcador" y (c) expresión de secuencias insertadas. En el primer abordaje, la presencia de un gen que codifica una Hpa2 insertada en el vector de expresión se puede detectar por hibridación del ácido nucleico empleando sondas que comprenden secuencias que son homólogas a un gen insertado que codifica una Hpa2. En el segundo abordaje, el sistema vector recombinante/hospedante se puede identificar y seleccionar sobre la base de la presencia o ausencia de ciertas funciones del gen "marcador" (por ej., actividad de timidina quinasa, resistencia a antibióticos, transformación del fenotipo, formación de cuerpos de oclusión en el baculovirus, etc.) causado por la inserción de un gen Hpa2 en el vector. Por ejemplo, si el gen que codifica Hpa2 se inserta dentro de la secuencia del gen marcador del vector, los recombinantes que contienen el gen que codifica el inserto de Hpa2 se puede identificar por la ausencia de la función del gen marcador. En el tercer abordaje, los vectores de expresión recombinante se pueden identificar por medio del ensayo del producto génico (es decir, Hpa2) expresado por el recombinante. Tales ensayos se pueden basar, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales de Hpa2 en sistemas de ensayo in vitro, por ej, unión con anticuerpo anti-Hpa2.
Además, se puede elegir una cepa de célula hospedante que module la expresión de las secuencias insertadas o modifique y procese el producto génico en el modo específico deseado. La expresión de ciertos promotores se puede elevar en presencia de ciertos inductores; de ese modo se puede controlar la expresión de Hpa2 o un polipéptido relacionado con Hpa2 diseñados genéticamente. Además, diferentes células hospedantes tiene mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación traduccional y pos-traduccional (por ej, glicosilación, fosforilación de proteínas). Se pueden elegir líneas celulares o sistemas hospedantes para garantizar la modificación y procesamiento deseado de la proteína extraña expresada. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano producirá un producto no glicosilado y la expresión en levaduras producirá un producto glicosilado. Se pueden usar las células eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcripto primario, glicosilación y fosforilación del producto génico. Tales células hospedantes de mamíferos incluyen, pero sin limitación, CHO, VERY, BEM, Hela, COS, MOCK, 293, 3T3, WJ38, y en particular, líneas celulares neuronales como, por ejemplo, neuroblastomas humanos. SK-N-AS, SK-N-Fl, SK-N-DZ (Sugimoto et al., 1984, J. Natl. Cancer lust: 73:51-57), neuroblastoma humano SK-N-SH (Biochim Biophys. Acta, 1982, 704:450-460), meduloblastoma cerebelar humano de Daoy (He et al., 1992; Cancer Res. 52:1144-1148), células de glioblastoma DBTRG-05MG(Kruse et al., 1992, in vitro Cell. Dev. Biol. 28A:609-614), neuroblastoma humano IMR-32 (Cancer Res., 1970, 30:2110-2118), astrocitoma humano 132IN1 (Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1977, 74:4816), astrocitoma humano MOG-G-CCM (Br. J. Cancer, 1984, 49:269), astrocitoma-glioblastoma humano (Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1968, 74:465-486), glioblastoma humano A172 (Olopade et al., 1992, Cancer Res.. 52:2523-2529), células de glioma de ratas C6 (Benda et al., 1968, Science 161:370-371), neuroblastoma Neuro-2a de ratón (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1970, 65:129-136), neuroblastoma de ratón NB41A3 (Proc. Natl. Mad. Sd. USA, 1962, 48:1184-1190), plexus coroide de oveja SCP (Bolin et al., 1994, T. Virol. Methods 48:211-221), G355-5, astrocito normal de gato PG-4 (Haapala et al., 1985, J. Virol. 53:827-833), cerebro de hurón Mpf (Trowbridge et al, 1982, In Vitro 18:952-960), y líneas celulares normales, por ejemplo, corteza cerebral normal de rata TNA2 (Radany et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6467-6471) tal como, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst. Además, diferentes sistemas de hospedante/vector de expresión pueden efectuar reacciones de procesamiento en diferentes grados.
Para la producción a largo plazo de alto rendimiento de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden diseñar líneas celulares que expresen en forma estable la proteína expresada diferencialmente o la vía génica. Más que empleando vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células hospedantes se pueden transformar con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ej, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, las células diseñadas se pueden permitir crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confieres resistencia a la selección y permite a las células integrar en forma estable el plásmido en sus s cromosomas y crecer para formar focos los cuales a su vez se pueden clonar y expandir en líneas celulares. Este método se puede usar ventajosamente para diseñar líneas celulares que expresen la proteína expresada diferencialmente o la vía génica. Tales líneas celulares genéticamente diseñadas pueden ser particularmente útiles para la detección y evaluación de compuestos que afectan la actividad endógena de la proteína expresada diferencialmente o la vía génica.
Varios sistemas de selección se pueden usar, incluyendo sin limitación a los genes de timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler, et al., 1977, Cell 11:223) hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybasski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), y adenosina fosforribosiltransferasa (Lowy, et al, 1980, Cell 22:817) que se pueden emplear en células tk, hgprf o aprf, respectivamente. También la resistencia a antimetabolitos se puede usar como base de la selección para los genes dhfr, que confiere resistencia a metotrexate (Wigler, et al., 1980, Natl. Mad. Sd. USA 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Scii; USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg,1981, Proc. Natl Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia a aminoglicósidos. G-418 (Colberre-GarHpa2) et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); e hygro, que confiere resistencia a higromicimina (Santerre, et al., 1984, Gene 30:147).
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En otras realizaciones específicas, la Hpa2, fragmento, análogo o derivado se puede expresar como producto proteico de fusión o quimérico (que comprende la proteína, fragmento, análogo o derivado unido por medio de un enlace peptídico a una secuencia de proteína heteróloga). Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención se pueden fusionar con el dominio constante de la inmunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM), o porciones de las mismas (CH1, CH2, CH3, o cualquier combinación de las mismas y porciones de las mismas) para producir polipéptidos quiméricos. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación, aumentar la vida media in vivo, y mejorar la administración de un antígeno a través de una barrera epitelial del sistema inmune. Se ha demostrado un aumento de la vida media in vivo y se facilita la purificación para las proteínas quiméricas que consisten en los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y varios dominios de las regiones constantes de las cadenas pesadas o livianas de inmunoglobulinas de mamíferos. Ver, por ej., EP 394,827; Traunecker et al, Nature, 331:84-86 (1988). Se ha demostrado la mejora de la liberación del antígeno a través de la barrera epitelial al sistema inmune para los antígenos conjugados (por ej., insulina) a un compañero de unión de FcRn tal como IgG o fragmentos Fc (ver, por ej., Publicaciones PCT WO 96/22024 y WO 99/04813).
Los ácidos nucleicos que codifican una Hpa2, un fragmento de Hpa2, un polipéptido relacionado con Hpa2; o un fragmento de un polipéptido relacionado con Hpa2 se puede fusionar a un epítope marcado (por ej., marca de hemaglutinina "HA" o marca de bandera) para colaborar en la detección y purificación del polipéptido expresado. Por ejemplo, un sistema descripto por Janknecht et al permite la purificación fácil de las proteínas de fusión no desnaturalizadas que se expresan en líneas celulares humanas (Janknecht et al, 1991, Proc. Nail. Acad. Sci. USA 88:8972-897).
Las proteínas de fusión se pueden preparar por ligamiento de las secuencias apropiadas de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos deseados entre sí por métodos conocidos en la técnica, en el marco del código apropiado y la expresión de los productos quiméricos por métodos comúnmente conocidos en la técnica. En forma alternativa, una proteína de fusión se puede fabricar por técnicas sintéticas, por ej., por el uso del péptido sintetizador.
Tanto las secuencias de ADNc como las genómicas se pueden clonar y expresar.
Otro aspecto de la invención se refiere a las células hospedantes en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula hospedante" y "célula hospedante recombinante" se usan en forma indistinta en la presente memoria. Se considera que tales términos se refieren no solo a la célula sujeto particular sino a la progenie o potencial progenie de tal célula. Ya que se pueden producir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido tanto a las mutaciones como las influencias ambientales, tal progenie puede, en efecto no ser idéntica a la célula progenitora, pero están aún incluidas dentro del alcance del término tal como se usa en la presente memoria.
Una célula hospedante puede ser procariota (por ej., E. coli) o una célula eucariota (por ej., células de insecto, levaduras o mamíferos).
El vector de ADN se puede introducir en células procariotas o eucariotas por medio de técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se usa en la presente, los términos "transformación" y "transfección" se refiere a una variedad de técnicas reconocidas den la técnica para introducir ácido nucleico extraño en una célula hospedante, que incluye la coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, la transfección mediada por DEAB-dextrano, lipofección o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedantes se puede hallar en Sambrook, et al (supra), y otros manuales de laboratorio.
Para la transfección estable de células de mamíferos, se sabe que de acuerdo con el vector de expresión y la técnica de transfección empleada, solo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma. para identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (por ej., para resistencia a los antibióticos) en las células hospedantes junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen a los que confieren resistencia a los fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Las células transfectadas en forma estable con el ácido nucleico introducido se pueden identificar por selección del fármaco (por ej., células que han incorporado el gen del marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células mueren).
Ejemplos
La presente invención se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1
Identificación de secuencias de proteína semejante a heparanasa a partir de la base de datos Incyte LifeSeq
La secuencia de aminoácidos de longitud completa publicada de la heparanasa humana se comparó con las bases de datos de secuencias de ADN GenBank e Incyte LifeSeq (publicada en Julio del 1999). La secuencia de aminoácidos se ingresó en el programa Basic Local Alignment Search Tool, Gapped BLAST (Altschul et al, Nucleic Acids Res: 25:3389-3402,1997) y el programa se corrió con parámetros en defecto en la versión TBLASTN, en la cual la base de datos completa se traduce en forma electrónica en seis marcos de lectura y cada traducción putativa se compara con la secuencia ingresada. No se hallaron nuevas secuencias homólogas en GenBank. Las secuencias traducidas putativas de tres secuencias no identificadas previamente de LifeSeq exhibieron homología significativa a la heparanasa humana. Los números de identificación de Incyte para estas secuencias fueron: 139678,1; 273691.1; 117316.1, de aquí en adelante mencionado como EST1, EST2 y EST3, respectivamente. Se estimó que la homología fue significativa de acuerdo con los parámetros establecidos por el programa de búsqueda y por nuestras observaciones de 65%, 60% y 44% de similitud global, respectivamente, entre la secuencia publicada y los EST, con bloques de 5 o más aminoácidos contiguos idénticos o similares hallados en cada alineamiento. La traducción conceptual seguida por la alineación electrónica de la secuencia mostró homología con la proteína heparanasa publicada lo cual es compatible con la conservación de la función de la proteína y el conjunto del origen de evolución (ver Figuras 4 y 6). Otras búsquedas basadas en la comparación con TBLASTN de las regiones de mayor conservación revelaron que ningún otro gen humano presentó homología con la secuencia de heparanasa.
Ejemplo 2
Clonación por PCR de ADNc semejante a Heparanasa e identificación de variantes de empalme
Se diseñaron cebadores de oligonucleótidos primarios e inversos alrededor de la secuencia de las tres secuencias EST (ver Figura 1). Las combinaciones del cebador de Hepa2F1/Hepa3R1 unido a Ests 139678.1 y 273691.1. Las combinaciones del cebador de Hepa4F1/Hepa2R1 unido a Ests 117316.1 y 1396783.
Las reacciones de PCR se llevaron a cabo empleando las siguientes condiciones:
5 \mul de ADNc de glándula mamaria "marathon-ready" (Clontech), 1 \mul de una mezcla de polimerasa ADNc Advantage 2 (Clontech) en un buffer que contiene 50 mM KCl, 10 mM de Tris-HCl, 1,5 mM de MgCl_{2}, pH 8,3; 0,2 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP y 10 pmoles de cebadores de oligonucleótidos. Las reacciones se realizaron en forma habitual con un volumen final de 50 \mul y la amplificación se llevó a cabo en una máquina de PCR PE GeneAmpSystems 9700 con las siguientes condiciones de ciclación: desnaturalización inicial de 94ºC durante 1 minuto seguido por 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos. Los productos de reacción se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa estándar y se tiñeron con verde SYBR (Molecular Probes, Oregon, USA).
Entre Est 117316.1 y 139678.1, por lo menos tres variantes de empalme fueron visibles en los geles, se cortaron estas bandas de los geles y se clonaron con empleando el equipo de clonación rápida TOPO II (Invitrogen, The Netherlands). Se obtuvieron tres secuencias correspondientes (ver Figuras 1-3, y Sec. ID No 1, 3, 5). Cada secuencia tiene dos codones de iniciación putativos, uno en los nucleótidos 601-603 (metionina 1) y otro en los nucleótidos 631-633 (metionina 43).
Ejemplo 3
Generación de anticuerpos
El mapeo de antigenicidad para la nueva proteína (The Binding Site, UK), dió tres secuencias peptídicas potenciales. Estas se sintetizan y emplean para generar anticuerpos en la oveja. Cada una de estos péptidos genera anticuerpos que reconocerán a las tres formas de empalme de la nueva proteína. Los tres péptidos y su localización dentro de la nueva proteína son:
Péptido 1 137-159: QPIRIYSRASLYGPNIGRPRKNV (Sec. ID No. 9)
Péptido 2 201-224: DTLSDQIRKIQKVVNTYTPGKKIW (Sec. ID No. 10)
Péptido 3 304-325: AVHVAGLQRKPRPGRVIRDKLRIYA (Sec. ID No. 11)
Ejemplo 4
Mapeo de híbridos de radiación
La localización de los cromosomas para los nuevos péptidos semejantes a heparanasa se determinó mediante el mapeo híbrido de radiación con baja resolución GENEBRIDGE 4 Radiation Hybrid Mapping Panel de 93 clones RH del genoma humano total (Research Genetics, Huntsville, AL, USA). Este es un subconjunto del panel de 199 clones desarrollados por una colaboración entre los laboratorios de Peter Goodfellow y Jean Weissenbach. La
localización de los cromosomas de los marcadores se realizaron por medio del acceso al servidor en
http://www-genome.wi.mit edu/cgibin/contig/rhmapper.pl. Los resultados mostraron que la proteína nueva se localizó en el cromosoma 10 a 10q23-24. Esta región se asocia con varios tipos de cáncer. El gen de heparanasa publicado se halló en el cromosoma 4.
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Ejemplo 5
Perfil de expresión
Se emplearon técnicas de PCR Taqman cuantitativa estándares para examinar los niveles de ARNm relativos (expresados por ng de ADN) para la proteína semejante a heparanasa de la presente invención, en varios tejidos y líneas celulares diferentes. Se emplearon dos cebadores específicos de proteína semejante a heparanasa que no diferenciaron entre las diferentes formas de empalme. Los resultados de este análisis mostraron niveles relativamente altos de ARN de proteína semejante a heparanasa en varios tejidos que incluyen cerebro, mamas, testículos y en líneas celulares de cáncer pancreático, mientras que es bajo en la mayoría de los otros tejidos (ver Figura 7).
Ejemplo 6
Identificación del homólogo en ratón
Se obtuvo una secuencia EST de ratón con homología con la secuencia de heparanasa humana por medio de la búsqueda BLAST: clon IMAGE 1378452. Estas secuencias se muestran alineadas con hpa2 en las Figuras 8a & b (Sec. ID No. 7 y 8). Se observó homología significativa con la secuencia semejante a heparanasa humana tanto a nivel de nucleótidos como de aminoácidos codificados.

Claims (17)

1. Un polipéptido que:
a) comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. ID No. 2 (Figura 1), que comienza en el residuo 1, 2, 11, 12 o 43;
b) comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. ID No. 4 (Figura 2), que comienza en el residuo 1, 2, 11, 12 o 43;
c) comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. ID No. 6 (Figura 3), que comienza en el residuo 1, 2, 11, 12 o 43; o
d) es un derivado de por lo menos 40 aminoácidos de longitud que tiene una o más sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos en relación con un polipéptido definido en a), b) o c) anteriores, siendo dicho derivado por lo menos 80% idéntico a una secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido; o
e) es un fragmento de un polipéptido definido en a), b) o c) anteriores, el cual tiene al menos 40 aminoácidos de longitud o un fragmento de un polipéptido definido en d) anterior, el cual tiene al menos 50 aminoácidos de longitud.
2. Un fragmento de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la secuencia:
QPIRIYSRASLYGPNIGRPRKNV (Sec. ID No. 9); \hskip0,2cm DTLSDQIRKIQKVVNTYTPGKKIW (Sec. ID No. 10); o AVHVAGLQRKPRPGRVIRDKLRIYA (Sec. ID No. 11).\hskip0,3cm
3. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 para su uso en el tratamiento de un ser humano o animal no humano o para uso en diagnóstico.
4. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 y un vehículo aceptable para uso farmacéutico.
5. Un equipo que comprende una composición de acuerdo con la reivindicación 4, que opcionalmente incluye instrucciones para el uso de dicha composición.
6. Un anticuerpo o un derivado del mismo que se une en forma inmunoespecífica a un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.
7. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6 que es un anticuerpo monoclonal.
8. El uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6 o 7 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de una afección asociada con actividad aumentada del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.
9. Una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en:
(i) una secuencia que codifica para un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2; o
(ii) una secuencia que es complementaria con la secuencia de (i).
10. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, la molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de ADN que se muestra en los residuos 601, 604, 631, 634 o 727 a 2376 de la Sec ID No. 1 (Figura 1), en los residuos 601, 604, 631, 634 o 727 a 2202 de la Sec. ID No. 3 (Figura 2) o en los residuos 601, 604, 631, 634 o 727 a 2040 de la Sec. ID No. 5 (Figura 3) o su ARN equivalente, que incluye o excluye el total o parte de la secuencia que está en 5' o 3' de la misma.
11. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 o 10.
12. Un vector de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además un ácido nucleico que codifica uno o más de los siguientes: promotores, potenciadores, secuencias señal, secuencias líder, señales de inicio y detención de traducción, regiones que controlan la estabilidad de ADN o un compañero de fusión.
\newpage
13. El uso de un vector de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 en la transformación o transfección de un hospedante procariota o eucariota.
14. Una célula hospedante trasformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 11 o 12.
15. Un método para obtener un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la incubación de un hospedante de acuerdo con la reivindicación 14 en condiciones que determinan la expresión del polipéptido y luego la purificación de dicho polipéptido.
16. Un método para la identificación de un agente que modula la actividad de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende comparar la actividad de dicho polipéptido en presencia de un agente de ensayo con la actividad de dicho polipéptido en ausencia del agente de ensayo.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, donde la afección se selecciona de: cáncer, cáncer con metástasis, enfermedades del SNC y neurodegenerativas, inflamación y enfermedades cardiovasculares.
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