ES2266902T3 - Inhibicion por oligonucleotido señuelo de la expresion de cd40. - Google Patents
Inhibicion por oligonucleotido señuelo de la expresion de cd40. Download PDFInfo
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Abstract
Oligonucleótidos de ADN de doble hélice, en donde una o ambas hélices de ADN presentan una secuencia según ID SEC Nº 1, 2, 7 a 10 ó 15 a 34 y la hélice de ADN complementaria presenta la secuencia complementaria a esta.
Description
Inhibición por oligonucleótido señuelo de la
expresión de CD40.
La presente invención se refiere a
oligonucleótidos señuelo con la secuencia de ácido nucleico según la
ID SEC Nº: 1 a 36 así como a su uso como medicamentos.
El trasplante de órganos sólidos representa por
lo general la última ratio en la terapia de enfermedades, en
el que el órgano que se reemplaza en el organismo del receptor está
gravemente dañado o bien su función ya no puede cumplirse de forma
satisfactoria. Esto es el caso, por ejemplo, del estadio terminal de
la insuficiencia cardiaca, pero también en el fallo agudo o crónico
de riñón o hígado. Sin embargo, rutinariamente se trasplantan con
poca frecuencia además de los órganos citados también páncreas,
pulmón e intestino delgado. También es posible un trasplante
combinado de varios órganos. Además de los órganos sólidos se
trasplantan también la córnea de lo ojos así como células madre
hemapoyéticas de la médula ósea.
En Alemania se llevaron a cabo en el año 2000 un
total de 3130 trasplantes de órganos sólidos (eurotrasplantes), en
los que representó como principal problema el rechazo agudo del
órgano del donante por parte del organismo del receptor. Esta
reacción de rechazo (reacción huésped contra injerto) es tanto más
remarcada cuanto menos coincidan las características inmunológicas
del donante con las del receptor (falta de compatibilidad
histológica). En concreto, da buen resultado en general con
suficiente compatibilidad histológica contener la reacción de
rechazo mediante medicamentos correspondientes (inmunosupresores),
pero el tratamiento de larga duración con estos medicamentos puede
provocar fuertes efectos secundarios. De esta forma los pacientes
trasplantados desarrollan a consecuencia de su resistencia
inmunológica limitada frecuentemente tumores e infecciones; además
se refuerza el rechazo crónico de los órganos trasplantados. Esto
así como también la degeneración denominada vasculopatía de arterias
y arteriolas que suministran al órgano trasplantado se trata de una
forma especial acelerada de ateroesclerosis (ateroesclerosis por
trasplante), que conduce sucesivamente mediante una limitación
progresiva de la función al fallo del órgano trasplantado. En caso
de no ser posible un re-trasplante (por ejemplo,
falta de disponibilidad de órgano), el rechazo al trasplante crónico
tiene como consecuencia en tanto que irremediable la muerte del
paciente en cuestión.
Desde el punto de vista inmunológico el rechazo
agudo de órganos trasplantados (no confundir con la esencialmente
extraña reacción de rechazo hiperaguda, que es mediada por
anticuerpos) representa una reacción de hipersensibilidad del tipo
IV (tipo de reacción retardada o hipersensibilidad de tipo
retardado). El antígeno (por lo general antígenos de
histocompatibilidad sobre las células del endotelio que revisten los
vasos sanguíneos del órgano del donante) es fagocitado por los
macrófagos (de tejido), procesado y presentado a células
cooperadoras nativas (CD4 positivas); la sensibilización de las
células cooperadoras dura varios días. En el segundo contacto las
células cooperadoras así sensibilizadas se transforman en células
Th1; a este respecto la co-estimulación mediada por
el ligando CD154 de las células que presentan antígeno (este expresa
el receptor CD40 correspondiente) juega un importante papel, ya que
mediante esta ruta de señal se llega a la liberación de
interleuquina-12 de los macrófagos. La
interleuquina-12 inicia la diferenciación y
proliferación de células cooperadoras. Las células Th1 por su parte
inducen mediante factores de crecimiento determinados (por ejemplo,
factor de estimulación de colonia de
granulocitos-macrófagos) la formación de
monocitos en la médula ósea, reclutan estos con ayuda de
quimioquinas determinadas (por ejemplo factor inhibitorio de
migración de macrófago [MIF]) y los activan mediante la
liberación de interferona-\gamma. La fuerte
reacción de inflamación resultante de esto puede destruir el tejido
trasplantado en gran extensión. En el rechazo al trasplante
participan además células T citotóxicas CD8 positivas, que destruyen
sus células diana mediante histolisis y/o inducción de muerte
celular programada. Como las células Th1 CD4 positivas son células T
citotóxicas tienen la posibilidad de reconocer ya con la
presentación de antígeno previa su diana (la superficie celular
extraña) y correspondientemente "armarse". A este respecto la
co-estimulación mediada por CD40 de CD154 es en todo
caso significativa. Los conocimientos más recientes evidencian que
posiblemente las células del endotelio del órgano del donante
presenten propiedades de presentación del antígeno y
co-estimulatorias.
En comparación con el rechazo al trasplante,
pero en el sentido inverso, la enfermedad injerto contra
huésped (EIcH) se da en el curso de trasplantes alógenos de
médula ósea (entre individuos genéticamente no idénticos) en
aproximadamente el 40% de los receptores. En la fase aguda de hasta
tres meses de duración las células T transmitidas con las células
madre del donante atacan al organismo del huésped, la fuerte
reacción de inflamación resultante bajo estas circunstancias se
manifiesta preferiblemente en la piel, raramente en el tracto
gastrointestinal y en el hígado. Entre tanto en estos pacientes se
induce igualmente una inmunosupresión con los primeros efectos
secundarios potenciales ya descritos. En el comienzo de esta
reacción de inflamación participan de nuevo células del endotelio,
esta vez las del organismo receptor. Además de la EIcH aguda se da
también la forma que transcurre crónicamente, que necesita de una
inmunosupresión más prolongada.
Los inmunosupresores usados para evitar el
rechazo al trasplante agudo varían por lo general en función del
tipo de órgano o bien son permitidos sólo para la inmunosupresión
tras el trasplante de determinados órganos. Una terapia típica para
el receptor de un trasplante de corazón la representa la combinación
de ciclosporina A con azatioprina y cortisona, en donde
recientemente la ciclosporina A se reemplaza de forma creciente con
tacrolimus y azatioprina con micofenolatmofetilo. La ciclosporina A,
rapamicina y tacrolimus inhiben la activación de células T, la
azatioprina y micofenolatmofetilo son antimetabolitos y los
corticoesteroides actúan antiinflamatoriamente mediante inhibición
de la expresión génica. Sin embargo, su efecto terapéutico
indiscutida no permite la terapia sistémica durante la vida con
estos medicamentos sin causar efectos secundarios graves. En esto se
consideran especialmente la mielotoxicidad, neurotoxicidad,
nefrotoxicidad, trastornos del metabolismo hasta la inducción de
una diabetes mellitus, hipertono arterial, infecciones y malignoma.
También la EIcH se trata por lo general con los medicamentos
previamente citados, frecuentemente en combinación.
Las células que presentan el antígeno y las
células T se comunican, entre otros, por el receptor CD40 y el
ligando CD154 y esta co-estimulación juega un
importante papel en la reacción de inflamación mediada por células
Th1 o bien en la activación de células T citotóxicas en el marco del
rechazo al trasplante al igual que la EIcH. Como las células que
presentan el antígeno también las células del endotelio expresan
constitutivamente el receptor CD40. La interacción de las células
del endotelio con células cooperadoras que expresan CD154 (células
cooperadoras nativas y/o células Th1 activadas) da lugar a una
expresión de quimioquina y moléculas de adhesión creciente de estas
células. A consecuencia de esto se llega a un reclutamiento y
activación múltiples de monocitos circulantes, estos emigran a la
pared del vaso y se diferencian para dar macrófagos. Además de esto
las células del endotelio liberan, al contrario que otras células
que presentan antígeno, exclusivamente tras activación de CD40
interleuquina-12 biológicamente activa. La
interleuquina-12 es el factor más importante para
la diferenciación de células cooperadoras nativas en células Th1 y
fomenta la expansión clonal siguiente (proliferación) de las células
Th1. La formación reforzada de interferón-\gamma
por las células Th1 diferenciadas no estimula sólo la actividad de
los macrófagos infiltrados, sino que refuerza también la expresión
de CD40 en las células del endotelio. En lo sucesivo se puede
desarrollar un círculo vicioso en el que las células del endotelio,
células cooperadoras y macrófagos se estimulen recíprocamente y así
se retiene la reacción de inflamación que daña el trasplante
(rechazo al trasplante) o al organismo del receptor (EIcH).
Entre tanto el bloqueo de la
co-estimulación mediada por CD154/CD40 representa un
fin muy prometedor para el debilitamiento o inhibición del rechazo
al trasplante agudo. De este modo hay indicios por experimentos en
animales que conducen a que la neutralización apoyada por anticuerpo
de CD154 puede producir inmediatamente a continuación del
trasplante incluso una inmunotolerancia. Además se ve influenciado
favorablemente el rechazo al trasplante crónico (ateroesclerosis
por trasplante) mediante esta intervención terapéutica. Una
desventaja de esta terapia con anticuerpos consiste, entre otros,
en el peligro de reacciones de hipersensibilidad (contra los
anticuerpos), sobre todo en aplicación repetida, así como la peor
accesibilidad al menos para antígenos presentes en el tejido (por
ejemplo, células T emigradas a la pared de los vasos sanguíneos del
órgano del donante), ya que los anticuerpos se deben aplicar por lo
general en el lado de la sangre y luego se deshacen en la barrera
celular del endotelio.
Por tanto la presente invención se basa en el
objetivo de proporcionar agentes para una prevención y/o terapia
del rechazo al trasplante agudo y crónico, incluyendo la EIcH y las
consecuencias asociadas a estos en cuanto a movilidad y mortalidad
de los pacientes en cuestión. El objetivo se consigue mediante el
objeto definido en las reivindicaciones.
La invención se aclara más detalladamente
mediante las siguientes figuras:
La figura 1 muestra en un diagrama de barras las
repercusiones de un señuelo de AP-1 elemento cis (ID
SEC Nº: 3) y un oligonucleótido de control mutado (mut) sobre la
expresión de proteína CD40 basal en células del endotelio humanas en
reposo, que se incubaron durante 8 horas con el oligonucleótido
correspondiente (10 \muM) (n = 7 a 10, resumen estadístico,
referido al % de la expresión basal, *P < 0,05 frente a basal,
^{\dagger}P < 0,05 frente a señuelo de elemento cis). El
análisis por Western Blot representativo muestra las repercusiones
(incubación de 4 u 8 horas) de los ácidos nucleicos usados sobre el
contenido en proteína CD40 basal en células en reposo. La
\beta-actina (patrón interno) sirve para la
comprobación de que se analizaron las mismas cantidades de
proteína.
La figura 2 muestra en un análisis Western Blot
representativo los efectos de señuelos de AP-1
elemento cis seleccionados (ID SEC Nº: 3, 5, 11, 13 y 35) y un
oligonucleótido de control mutado (mut) sobre la expresión de
proteína CD40 basal en células del endotelio humanas en reposo, que
se incubaron durante 8 horas con el señuelo de elemento cis
correspondiente (10 \muM). Las intensidades relativas (%) dadas,
determinadas mediante valoración densitométrica (software
One-Dscan-Gel Analysis, Scanalytics,
Billerica, MA, Estados Unidos), se refieren al valor máximo del
contenido en proteína CD40 en células del endotelio, que no se
incubaron con un señuelo de AP-1 elemento cis.
La figura 3 muestra en un diagrama de barras y
en un análisis por Western Blot representativo con
\beta-actina como patrón interno el efecto del
señuelo de AP-1 elemento cis ID SEC Nº: 3 en
comparación con el efecto fallido de un señuelo de elemento cis NAFT
(factor nuclear de células T activadas) sobre la expresión de
proteína CD40 basal en células del endotelio humanas en reposo, que
se incubaron durante 8 horas con el oligonucleótido correspondiente
(10 \muM). Resumen estadístico (n = 4, referido al % de la
expresión basal, *P < 0,05 frente a basal, ^{\dagger}P <
0,05 frente a señuelo de AP-1 elemento cis).
La figura 4 muestra en un diagrama de líneas el
efecto de una exposición prolongada (círculos huecos) o de una
pre-incubación en dos etapas (círculos sólidos) con
el señuelo de AP-1 elemento cis ID SEC Nº: 3 (10
\muM) sobre la expresión de proteína CD40 basal en células del
endotelio humanas en reposo durante un periodo de tiempo de 24 horas
(n = 3 a 7).
La figura 5 muestra en un diagrama de barras y
en un análisis por RT-PCR (reacción en cadena de la
polimerasa-transcripción inversa) las repercusiones
de una pre-incubación (4 horas, 10 \muM) con el
señuelo de AP-1 elemento cis ID SEC Nº: 3 o de un
oligonucleótido de control mutado (mut) sobre la expresión de ARNm
de IL-12p40 inducida por ligando CD40 consiguiente
(exposición frente a células Jurkat T que expresan el ligando CD40;
CD154) en células del endotelio humanas (n = 3). Análisis por
RT-PCR representativo y resumen estadístico
(referido al % del valor máximo de la expresión de
IL-12-p40 en estimulación con CD154,
*P < 0,05 frente a CD154; ^{\dagger}P < 0,05 frente a
señuelo de AP-1 elemento cis).
La figura 6 muestra en un diagrama de barras el
efecto del señuelo de AP-1 elemento cis ID SEC Nº: 3
en comparación con el oligonucleótido de control (mut) sobre la
adhesión de monocitos THP-1 humanos en células del
endotelio humanas, que se pre-incubaron durante 8
horas con el oligonucleótido correspondiente (10 \muM) y a
continuación se co-cultivaron durante 12 horas con
células del mieloma de ratón transfectadas con CD154 humano
(P3xTB.A7, CD154) (resumen estadístico, n = 10 a 13, *P < 0,05
frente a CD154; ^{\dagger}P < 0,05 frente a señuelo de
AP-1 elemento cis). Se incorporaron células P3xTP.A7
no transfectadas (-CD154) como control negativo. Antes del comienzo
de la perfusión de células THP-1 se separaron casi
completamente las células del mieloma de las células del endotelio
mediante una etapa de lavado con medio.
La figura 7 muestra en un ensayo de
desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) representativo el
efecto de un exceso de 50 veces del señuelo de AP-1
elemento cis seleccionado (ID SEC Nº: 3, 5, 11, 13 y 35) en
comparación con un oligonucleótido de control mutado (mut) sobre la
formación de complejos de ADN-proteína entre un
oligonucleótido marcado con ^{32}P (11 fmol), que se une de forma
específica al factor de transcripción AP-1, y una
preparación de proteína nuclear de monocitos THP-1
humanos en una mezcla de reacción de 15 \mul.
La figura 8 muestra en un EMSA representativo el
efecto del señuelo de AP-1 elemento cis seleccionado
(ID SEC Nº: 3, 5 y 13) y de un oligonucleótido de control mutado
(mut) sobre la translocación de AP-1 en el núcleo
de células del endotelio humanas, que se incubaron durante 4 horas
con el señuelo de AP-1 elemento cis correspondiente
(10 \muM). EMSA representativo confirma que la captación celular
(y efecto) de los distintos señuelos de elemento cis tiene lugar en
células del endotelio humanas. Se obtuvieron resultados comparables
en al menos otros dos experimentos independientes.
La figura 9 muestra en una
RT-PCR representativa las repercusiones de una
pre-incubación (4 horas, 10 \muM) con señuelo de
AP-1 elemento cis seleccionado (ID SEC Nº: 3, 5 y
11) sobre la expresión de MCP-1 (proteína 1
quimioatrayente de monocitos) en células del endotelio humanas,
que se incubaron durante 6 horas con 60 U/ml de
interleuquina-1\beta
(IL-1\beta). Las intensidades relativas (%) dadas
de RT-PCR representativa, determinadas mediante
valoración densitométrica, se refieren al valor máximo en
estimulación de IL-1\beta.
El dibujo 10 muestra en un diagrama de barras y
un análisis por Western Blot representativo el efecto de un señuelo
de AP-1 elemento cis (ID SEC Nº: 3) y un
oligonucleótido de control mutado (mut) sobre la expresión de
proteína CD40 basal en segmentos intactos del endotelio aislados de
la aorta de rata, que se incubaron en medio de Waymouth. Después de
1 horas de pre-incubación se añadieron los señuelos
de elementos cis (10 \muM) al medio de incubación y se incubaron
durante 11 horas con los segmentos de vasos (6 a 8 segmentos de 5
animales distintos, resumen estadístico, referido al % de la
expresión basal, *P < 0,05 frente a basal; ^{\dagger}P <
0,05 frente a señuelo de elemento cis). El análisis por Western Blot
representativo muestra a modo de ejemplo que la proteína CD40 en los
segmentos de vasos investigados está localiza primordialmente en
las células del endotelio y su expresión se puede aumentar
claramente mediante la adición de factor de necrosis tumoral
\alpha de citoquina (TNF\alpha, 1000 U/ml) e
interferona-\gamma (IFN\gamma, 100 U/ml) al
medio de incubación durante 12 horas. La detección de
\beta-actina (patrón interno) sirve para la
comprobación de que se analizaron las mismas cantidades de
proteína.
El término aquí usado "oligonucleótido
señuelo" o "señuelo de elemento cis" designa una molécula de
ADN de doble hélice que presenta una secuencia, a la que se une el
factor de transcripción AP-1 en las células, y que
corresponde o se parece (derivado) a la secuencia de unión al núcleo
de AP-1 natural en el genoma. El señuelo de elemento
cis actúa por tanto como molécula para la inhibición competitiva
(neutralización) de AP-1.
Los factores de transcripción son proteínas que
se unen a ADN, que se adicionan en el núcleo celular a la región
promotora de uno o varios genes y con ello controlan su expresión,
es decir, la nueva formación de proteínas que codifican estos
genes. Además del control fisiológicamente importante de procesos de
desarrollo y diferenciación en el cuerpo humano, los factores de
transcripción tienen, sobre todo cuando activan la expresión génica
en un momento de tiempo equivocado, un potencial de enfermedad
elevado. Adicionalmente los factores de transcripción pueden (en las
mismas circunstancias) bloquear genes con función de protección y
actúan con predisposición para el desencadenamiento de una
enfermedad.
Por tanto la presente invención consiste en la
preparación de un oligonucleótido señuelo, que se pueda unir de
forma específica de la secuencia al activador o proteína 1 de
activación (AP-1) del factor de transcripción y
tenga una de las siguientes secuencias, en donde sólo
respectivamente una hélice del oligonucleótido señuelo se repite y
está comprendida igualmente la hélice complementaria:
| 5'-VTGAGTCAS-3' | (ID SEC Nº: 1), | en donde significa V = A, C o G y S = C o G. |
| 5'-STGACTAB-3' | (ID SEC Nº: 2), | en donde significa S = C o G y B = G, C o T |
\vskip1.000000\baselineskip
| 5'-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3' | (ID SEC Nº: 3), |
| 5'-GTGCTGACTCAGCAC-3' | (ID SEC Nº: 5), |
| 5'-GTGGTGACTCACCAC-3' | (ID SEC Nº: 7), |
| 5'-AGTGGTGACTCACCACT-3' | (ID SEC Nº: 9), |
| 5'-TGTGCTGACTCAGCACA-3' | (ID SEC Nº: 11), |
| 5'-TTGTGCTGACTCAGCACAA-3' | (ID SEC Nº: 13), |
| 5'-TGGTGAGTCACCA-3' | (ID SEC Nº: 15), |
| 5'-ATGGTGAGTCACCAT-3' | (ID SEC Nº: 17), |
| 5'-TATGGTGAGTCACCATA-3' | (ID SEC Nº: 19), |
| 5'-CTATGGTGAGTCACCATAG-3' | (ID SEC Nº: 21), |
| 5'-CCTATGGTGAGTCACCATAGG-3' | (ID SEC Nº: 23), |
| 5'-TGTTGAGTCACCA-3' | (ID SEC Nº: 25), |
| 5'-GTGTTGAGTCACCAC-3' | (ID SEC Nº: 27), |
| 5'-TGTGTTGAGTCACCACA-3' | (ID SEC Nº: 29), |
| 5'-CTGTGTTGAGTCACCACAG-3' | (ID SEC Nº: 31), |
| 5'-ACTGTGTTGAGTCACCACAGT-3' | (ID SEC Nº: 33), |
| 5'-GTCGCTTAGTGACTAAGCGAC-3' | (ID SEC Nº: 35). |
Secuencias según ID SEC Nº: 3 a 6, 11 a 14, 35 y
36 se conocen del documento JP 2001095573 como oligonucleótidos de
ADN que se unen al factor de transcripción AP-1 para
la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades
de los vasos.
Los inventores han observado de forma
sorprendente que la neutralización del factor de transcripción
AP-1 con ayuda de oligonucleótidos señuelo
correspondientes en el periodo de unas pocas horas conduce a una
caída de la expresión de CD40 en células del endotelio cultivadas
humanas (figura 1 a 4) al igual que en células del endotelio nativas
de rata (figura 10). Este efecto tuvo lugar tras aproximadamente 4
horas y se mantuvo durante al menos 10 horas (figura 1 y 4). Fue
además inesperado y sorprendente que este efecto fuese visible casi
simultáneamente y en extensión sensiblemente idéntica sobre el ARNm
y plano de la proteína. Los oligonucleótidos señuelo, que van
dirigidos contra otros factores de transcripción (por ejemplo,
factor nuclear de células T activadas, NAFT), no influyen
por el contrario en la expresión de CD40 constitutiva (figura 3)
Tampoco los oligonucleótidos de control, que presentan hasta sobre
una o dos bases una secuencia idéntica con la secuencia de unión al
núcleo de consenso AP-1 (ID SEC Nº: 1 y 2),
mostraron este efecto (figura 1 y 2). Además fue suficiente una
exposición en dos etapas de las células del endotelio frente al
oligonucleótido señuelo de AP-1 para la supresión
de la expresión de CD40 (figura 4).
Una consecuencia de la reducción mediada por
oligonucleótido señuelo de AP-1 del contenido de
proteína CD40 en las células del endotelio fue una inhibición
remarcada de la nueva formación inducida por CD154 de
interleuquina-12 p40 (figura 5), la etapa que
determina la velocidad en la síntesis de
interleuquina-12 biológicamente activa (Lienenlüke y
col. (2000) Eur. J. Immunol. 30, 2864). También la expresión
inducida por CD154 de la molécula-1 de adhesión
celular vascular (VCAM-1) se redujo en una
extensión comparable (inhibición del 58%), y en concordancia con
ello la adhesión reforzada inducida por CD154 (y en primer lugar
mediada por VCAM-1) de monocitos
THP-1 en las células del endotelio (figura 6).
El AP-1
(http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess33?request=FCT-DBRTRV-Accno&key=T00029)
pertenece al grupo que comprende cerca de 46 componentes de los
denominados factores de transcripción región básica con cremallera
de leucina o bZIP. Por lo general el factor de transcripción activo
consiste en un homodímero Jun/Jun o un heterodímero Jun/Fos. Tanto
el Fos (número de acceso al banco de genes V01512) como también Jun
(número de acceso al banco de genes J04111) deben ser fosforilados
para ello en el marco de la activación celular sobre proteinquinasas
correspondientes, en donde la activación de estas quinasas Fos o Jun
depende de nuevo de la actividad de la otra, de modo que la ruta de
transducción de señal depende de otras proteinquinasas dispuestas
por encima (por ejemplo proteinquinasa C o proteinquinasa
activada por estrés, SEK-1). El
AP-1 juega, en general junto con otros factores de
transcripción, un importante papel en la expresión de una
multiplicidad de genes de importancia inmunológica como, por
ejemplo, interleuquina-2,
interleuquina-4, interleuquina-8,
interferona-\gamma, MCP-1, MIF y
factor de necrosis tumoral \alpha. Un bloqueo de la actividad de
AP-1 puede por tanto interferir, por ejemplo, con la
estimulación autocrina dependiente de la
interleuquina-2 de células T y su expansión
clonal.
Para no generar debilitamiento general de la
defensa inmune específica (celular o humoral), se aplica el
oligonucleótido señuelo de acuerdo con la invención preferiblemente
no de forma sistémica sino local. El tratamiento ex vivo de
un órgano de donante o de una donación de médula ósea antes del
trasplante representa indicaciones preferidas.
A este respecto es de especial importancia que
los oligonucleótidos señuelo de acuerdo con la invención lleguen a
ser activos inmediatamente tras la captación en las células diana, a
la vez que la actividad de los oligonucleótidos antisentido o de
interferencia con ARN sea dependiente en primer lugar de la
generación de la proteína en las células y con ello de su
re-síntesis.
Si se usa un oligonucleótido señuelo de acuerdo
con la invención contra AP-1 en células del
endotelio humanas, entonces se reduce la expresión de CD40, en
contraposición al uso de un oligonucleótido señuelo de control
correspondiente, claramente en más del 50%. Además una exclusión de
la actividad de AP-1 tiene como consecuencia una
inhibición altamente significativa de la expresión estimulada de
CD154 de interleuquina-12 p40 o
VCAM-1. Esto conduce a un debilitamiento claro de la
interacción entre células del endotelio-células T o
células del endotelio-monocitos pero también de la
interacción de células T con otras células que presentan antígeno
(por ejemplo, macrófagos, células dendríticas y linfocitos B) en el
marco del rechazo al trasplante o EIcH).
Estos efectos de un oligonucleótido señuelo
contra AP-1 (ID SEC Nº: 3) se podrían comprobar
inequívocamente en un modelo de rechazo al trasplante agudo
(trasplante de corazón heterótopo en ratas). El oligonucleótido de
control mutado correspondiente (ID SEC Nº: 47) no mostró por el
contrario efecto terapéutico alguno y por tanto tampoco la
especificidad de este preparado terapéutico. Aún más impresionante y
en esta medida inesperado fue la inhibición en más del 60% del
rechazo al trasplante crónico en el mismo modelo experimental en
animales mediante exposición breve de las arterias coronarias del
trasplantado al señuelo de AP-1 elemento cis
previamente al implante.
Entre tanto el uso de los oligonucleótidos de
ADN de doble hélice de acuerdo con la invención, también denominado
oligonucleótido señuelo o señuelo de elemento cis, que contienen un
sitio de unión del núcleo de consenso para AP-1,
representa el procedimiento preferido para la inhibición específica
de la actividad de AP-1. La incorporación exógena de
un gran número de sitios de unión del factor de transcripción a una
célula, especialmente en mucho mayor número que el disponible en el
genoma, genera una situación en la que la multiplicidad de un factor
de transcripción determinado se une de forma específica al señuelo
de elemento cis respectivo y no a sus sitios de unión diana
endógenos. Este hecho para la inhibición de la unión de factores de
transcripción en sus sitios de unión endógenos se designa también
como silenciamiento. El silenciamiento (o también neutralización) de
factores de transcripción con uso de señuelos de elementos cis se
usó con éxito para inhibir el crecimiento de células. A este
respecto se usaron fragmentos de ADN que contenían los sitios de
unión específicos para el factor de transcripción E2F (Morishita y
col., PNAS (1995) 92, 5855).
La secuencia de un ácido nucleico que se usa
para evitar la unión del factor de transcripción
AP-1 es por ejemplo la secuencia a la que se une el
AP-1 de forma natural en las células. El
AP-1 se une de forma específica al motivo con la
secuencia 5'-VTGAGTCAS-3' (ID SEC
Nº: 1) en la que significa V = A, C o G y S = C o G. Para una unión
efectiva de AP-1 se requiere la coincidencia exacta
con esta secuencia, en donde la hélice complementaria
5'-STGACTCAB-3'
(ID SEC Nº: 2) con S = C o G y B = G, C o T puede unirse igualmente de forma eficiente al factor de transcripción. El señuelo de elemento cis puede ser además mayor que la secuencia de unión del núcleo 9-mer y se alargan en los extremos 5' y/o en los extremos 3'. Mutaciones correspondientes en la zona de la secuencia de unión al núcleo (por ejemplo, 5'-VTGACTCAA-3' o 5'-VTTACTTAG-3') conducen a una pérdida parcial o completa de la unión de VP-1 al oligonucleótido señuelo (figura 7).
(ID SEC Nº: 2) con S = C o G y B = G, C o T puede unirse igualmente de forma eficiente al factor de transcripción. El señuelo de elemento cis puede ser además mayor que la secuencia de unión del núcleo 9-mer y se alargan en los extremos 5' y/o en los extremos 3'. Mutaciones correspondientes en la zona de la secuencia de unión al núcleo (por ejemplo, 5'-VTGACTCAA-3' o 5'-VTTACTTAG-3') conducen a una pérdida parcial o completa de la unión de VP-1 al oligonucleótido señuelo (figura 7).
Además de esto una secuencia sensiblemente
palindrómica favorece a las dos hélices de ADN el transporte a las
células diana sin ayuda. Sin tener en cuenta la hipótesis
fundamental de que los oligonucleótidos señuelo de acuerdo con la
invención neutralizan el factor de transcripción
AP-1 de forma efectiva in vitro, es decisivo
para la actividad terapéutica que la molécula de ADN sea captada
rápidamente y en una extensión suficiente en las células diana. Esto
se demuestra mediante la neutralización distintamente efectiva de
AP-1 por los mismos oligonucleótidos señuelo en un
sistema libre de células (figura 7) en comparación con células
intactas (figura 8) o su efecto sobre la expresión génica en estas
células (inhibición de la expresión estimulada con
IL-1\beta de MCP-1; figura 9).
Además de lo anterior el señuelo de elemento cis de acuerdo con la
invención no supera una determinada longitud, ya que esto es
limitante para el transporte a las células diana. Es adecuado que
cada oligonucleótido señuelo tenga una longitud de al menos 9 pb
(secuencia de consenso de unión al núcleo) hasta una longitud de
aproximadamente 45 pb, preferiblemente hasta una longitud de
aproximadamente 27 pares de bases, con especial preferencia hasta
una longitud de aproximadamente 23, con especial preferencia una
longitud de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o
23 pares de bases.
Debido a que el señuelo de elemento cis es un
ácido nucleico de doble hélice, el oligonucleótido de ADN de
acuerdo con la invención comprende respectivamente no sólo la
secuencia en sentido o hacia adelante sino también la secuencia
anti-sentido o inversa complementaria. Los
oligonucleótidos de ADN de acuerdo con la invención preferidos
presentan una secuencia de unión al núcleo de 9-mero
para AP-1, como está contenida en la ID SEC Nº: 1.
El señuelo de elemento cis puede presentar sin embargo también una
secuencia discrepante con la secuencia previa y que sea más larga
que un 9-mero. Son especialmente preferidas las
secuencias como las que están contenidas en ID SEC Nº: 3 a ID SEC
Nº: 36. Esta enumeración de las secuencias preferidas no es
definitiva. Es manifiesto para el especialista en la técnica que se
pueden usar una multiplicidad de secuencias como inhibidor para
AP-1, en tanto estas presenten las condiciones
previamente indicadas de la secuencia de unión al núcleo de consenso
de 9-mero y una afinidad con
AP-1.
AP-1.
La afinidad de la unión de una secuencia de
ácido nucleico a AP-1 se puede determinar mediante
el uso del ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética
(EMSA) (Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning. Cold Spring
Harbor Laboratory Press; Krzesz y col. (1999) FEBS Lett. 453, 191).
Este sistema de ensayo es adecuado para el control de calidad de
ácidos nucleicos, que se plantean para el uso en el procedimiento de
la presente invención, o las determinaciones de la longitud óptima
de un sitio de unión. Esto es también adecuado para la
identificación de otras secuencias que se une mediante
AP-1.
El procedimiento de la presente invención modula
la transcripción de un gen o de genes en una forma tal que el gen o
los genes, por ejemplo CD40, no se expresan o lo hacen de forma
reducida. La expresión reducida o restringida en el marco de la
presente invención significa que la velocidad de transcripción es
reducida en comparación con células que son tratadas con un
oligonucleótido señuelo de acuerdo con la invención. Una reducción
de este tipo se puede determinar, por ejemplo, mediante Northern
Blot (Sambrook y col., 1989) o RT-PCR (Sambrook y
col., 1989). De forma típica una reducción de este tipo es una
reducción de al menos 2 veces, especialmente de al menos 5 veces,
especialmente de al menos 10 veces.
La pérdida de activación se puede conseguir, por
ejemplo, si AP-1 actúa en un gen determinado como
activador de transcripción y por tal motivo el silenciamiento del
activador conduce a la pérdida de la expresión del gen diana. Sin
embargo es también igualmente posible una inhibición indirecta
mediante modulación del ARNm (efecto
post-transcripcional) o de la estabilidad de la
proteína (efecto post-traduccional) del gen diana.
En este caso la neutralización de AP-1 tendría como
consecuencia, por ejemplo, una expresión reducida de proteínas, que
evita la descomposición del ARNm del gen diana mediante ARNasas y/o
la degradación proteolítica de la proteína diana. Un efecto de este
tipo parece ser que toma parte en el efecto descrito del señuelo de
AP-1 elemento cis sobre la expresión de CD40 en las
células del endotelio humanas.
Los oligonucleótidos se descomponen por lo
general rápidamente mediante endo- o exonucleasas, en las ADNasas y
ARNasas especiales en las células. Por este motivo los
oligonucleótidos de ADN se pueden modificar para estabilizarlos
contra la descomposición, de modo que durante un periodo de tiempo
prolongado se conserva una elevada concentración de
oligonucleótidos en las células. De forma típica se puede obtener
una estabilización de este tipo mediante la inclusión de uno o
varios enlaces internucleótido modificadas.
Un oligonucleótido de ADN estabilizado con éxito
no contiene de forma necesaria una modificación en cada enlace
internucleótido. Preferiblemente los enlaces internucleótidos están
modificadas en los extremos respectivos de ambos oligonucleótidos
del señuelo de elemento cis. A este respecto pueden estar
modificados los últimos seis, cinco, cuatro, tres, dos o el última o
uno o varios enlaces internucleótido dentro de los últimos seis
enlaces internucleótido. Además se pueden incorporar distintas
modificaciones de los enlaces internucleótido en el ácido nucleico y
los oligonucleótidos señuelo generados de estas se ensayan en cuanto
a la unión específica de secuencia en AP-1, con uso
de la rutina sistema de ensayo EMSA. Este sistema de ensayo permite
la determinación de la constante de unión del señuelo de elemento
cis y de este modo la determinación de si cambió la afinidad con la
modificación. Los señuelos de elementos cis modificados que muestran
una unión suficiente se pueden seleccionar de forma que una unión
suficiente significa al menos aproximadamente el 50% o al menos
aproximadamente el 75%, y con especial preferencia aproximadamente
el 100% de la unión del ácido nucleico no modificado.
Los señuelos de elementos cis con enlace
internucleótido modificado que muestran todavía suficiente unión,
se puede comprobar si son más estables en las células que señuelos
de elementos cis no modificados. Las células "transfectadas"
con los señuelos de elemento cis de acuerdo con la invención se
estudian en distintos momentos en cuanto a la cantidad de señuelos
de elementos cis aún presentes. A este respecto se usa a
continuación preferiblemente un señuelo de elemento cis marcado con
un colorante de fluorescencia (por ejemplo, rojo texas) o un señuelo
de elemento cis marcado radiactivamente (por ejemplo, ^{32}P o
^{35}S) con microscopía de fluorescencia digital o
autorradiografía o escintigrafía. Un señuelo de elemento cis
modificado con éxito tiene un semiperiodo de vida en las células
que es mayor que el del señuelo de elemento cis no modificado,
preferiblemente de al menos aproximadamente 48 horas, más
preferiblemente de al menos aproximadamente 4 días, los más
preferiblemente de al menos aproximadamente
7 días.
7 días.
Se resumen enlaces internucleótido modificados
adecuados en Uhlmann y Peyman ((1990) Chem. Rev. 90, 544). Restos
de internucleótido-fosfato modificados y/o puentes
no fósforo en un ácido nucleico, que se pueden usar en un
procedimiento de la presente invención, contienen por ejemplo
fosfonato de metilo, tioato de fósforo, ditioato de fósforo,
amidato de fósforo, éster fosfato, mientras que los análogos de
internucleótido no fósforo contienen, por ejemplo, puentes de
siloxano, puentes de carbonato, puentes de éster carboximetílico,
puentes de acetamidato y/o puentes de tioéter. En el uso de enlaces
internucleótido modificados con tioato de fósforo estos no deberían
encontrarse preferiblemente entre las bases citosina y guanina, ya
que esto puede llevar a una activación de las células diana del
señuelo de elemento cis.
Una forma de realización adicional de la
invención es la estabilización de ácido nucleicos mediante la
introducción de características estructurales en el ácido nucleico,
que aumentan el semiperiodo de vida del ácido nucleico. Tales
estructuras, que contienen ADN en horquilla y de campana, se dan a
conocer en el documento US 5.683.985. Al mismo tiempo se pueden
incorporar restos de internucleótido-fosfato
modificados y/o puentes no fósforo, junto con las estructuras
citadas. Los ácidos nucleicos resultantes de estos se pueden ensayar
en el sistema de ensayo descrito anteriormente en cuanto a la unión
y estabilidad.
Un señuelo de elemento cis de la presente
invención es captado rápidamente en las células. Una captación
suficiente se caracteriza por la modulación de la expresión de uno
o varios genes, que se someten a un control mediante
AP-1, (por ejemplo CD40). El señuelo de elemento cis
de la presente invención modula de forma preferida la transcripción
de un gen o genes tras aproximadamente 4 horas del contacto con las
células, más preferiblemente tras aproximadamente 2 horas, tras
aproximadamente 1 hora, tras aproximadamente 30 minutos y lo más
preferiblemente tras aproximadamente 10 minutos. Una mezcla típica
que se usa este estudio contiene 10 \mumol/l de señuelo de
elemento cis.
La presente invención se refiere además al uso
del oligonucleótido señuelo de acuerdo con la invención para la
preparación de un medicamento, especialmente para la prevención y/o
terapia del rechazo de trasplante agudo y crónico, de la
enfermedad injerto contra huésped (EIcH) así como de los
daños por isquemia/reperfusión de órganos en una intervención
quirúrgica.
La presente invención se refiere además a un
procedimiento para la modulación de la transcripción de al menos un
gen en células, especialmente en células del endotelio y células que
presentan antígeno (monocitos, macrófagos, células dendríticas,
células B), en donde el procedimiento comprende la etapa de poner en
contacto las células citadas con una mezcla, que contiene uno o
varios ácido(s) nucleico(s) de doble hélice de acuerdo
con la invención, que se pueden unir de forma específica a la
secuencia al factor de transcripción AP-1. Un
procedimiento preferido es, por ejemplo, el tratamiento ex
vivo de un órgano de donante antes de introducirlo en el cuerpo
del receptor, de modo que la mezcla que contiene ácido nucleico se
aplique a los vasos sanguíneos del órgano del donante (ortógrado
o
retrógrado).
retrógrado).
La mezcla que contiene el señuelo de elemento
cis de acuerdo con la invención se pone en contacto con las células
diana (por ejemplo, células del endotelio, células de epitelio,
leucocitos, células del músculo liso, queratinocitos o
fibroblastos). La finalidad de esta puesta en contacto es la
transferencia de los señuelos de elemento cis, que se unen al
AP-1, en las células diana (es decir, por ejemplo,
las células que expresan CD40 dependiendo de AP-1).
Por este motivo se pueden usar la modificación del ácido nucleico
y/o aditivos o coadyuvantes, como es conocido, de modo que aumenta
la penetración de membranas, en el marco de la presente invención
(Uhlmann y Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 544).
Una mezcla según la invención contiene en una
forma de realización preferida esencialmente sólo ácido nucleico y
tampón. Una concentración adecuada del señuelo de elemento cis se
encuentra en el intervalo de al menos 0,1 a 100 \muM,
preferiblemente en 10 \muM, en donde se añaden uno o varios
tampones adecuados. Un ejemplo de un tampón de este tipo es una
solución de Ringer modificada que contiene 145 mmol/l de Na^{+}, 5
mmol/l de K^{+}, 50 mmol/l de Cl^{-}, 2 mmol/l de Ca^{2+}, 1
mmol/l de Mg^{2+}, 10 mmol/l de Hepes, 106 mmol/l de isetionato,
10 mmol/l de D-glucosa,
pH 7,4.
pH 7,4.
En una forma de realización adicional de la
invención la mezcla contiene además al menos un aditivo y/o
coadyuvante. Se proponen aditivos y coadyuvantes como lípidos,
lípidos catiónicos, polímeros, liposomas, nanopartículas, aptámeros
de ácido nucleico, péptidos y proteínas, que están unidos a ADN, o
moléculas de péptido-ADN sintéticas, para aumentar
por ejemplo el aporte de ácidos nucleicos en las células, para
enriquecer la mezcla en sólo un subgrupo de células, para evitar la
descomposición del ácido nucleico en las células, para facilitar el
almacenamiento de la mezcla de ácido nucleico antes del uso.
Ejemplos de péptidos y proteínas o moléculas de
péptido-ADN sintéticas son, por ejemplo,
anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ligandos, moléculas de
adhesión, que puede estar modificadas o no modificadas.
Aditivos que estabilizan los señuelos de
elementos cis en las células son, por ejemplo, sustancias que
condensan ácido nucleico como polímeros catiónicos,
poli-L-lisina o
poli-etilenimina.
La mezcla que se usa en el procedimiento de la
presente invención se aplica preferiblemente localmente mediante
inyección, infusión, catéter, geles plurónicos, polímeros, que
liberan los medicamentos retenidos, o cualquier otro dispositivo
que haga posible el acceso local. También la aplicación ex
vivo de la mezcla (infusión o incubación), usada en el
procedimiento de la presente invención, permite un acceso local.
Las siguientes figuras y ejemplos sirven sólo
para la aclaración y no limitan el alcance de la invención en modo
alguno.
Se aíslan células del endotelio humanas mediante
tratamiento con 1,6 U/ml de dispasa en solución de tiroides
modificada con Hepes durante 30 minutos a 37ºC de las venas del
cordón umbilical y se cultivan sobre placas de cultivo de tejido de
6 pocillos recubiertos de gelatina (2 mg/ml de gelatina en HCl 0,1 M
durante 30 minutos a temperatura ambiente) en 1,5 ml de medio M199
(Gibco Life Technologies, Karlsruhe, Alemania), que contiene suero
bovino fetal al 20%, 50 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de
estreptomicina, 10 U/ml de nistatina, HEPES 5 mM y TES 5 mM, 1
\mug/ml de heparina y 40 \mug/ml de factor de crecimiento del
endotelio. Estas se identificaron por su morfología de adoquín
típica, coloración inmune positiva para la detección por factor de
Willebrandt (vWF) y fluorométrica (FACS) de PECAM-1
(CD13) así como cloración inmune negativa para
\alpha-actina del músculo liso (Krzesz y col.
(1999) FEBS Lett. 453, 191).
La línea celular de monocitos humanos
THP-1 (ATCC TIB 202), la línea celular Jurkat
humana D1.1 (ATCC CRL-10915) así como la línea
celular del mieloma de ratón P3xTB.A7 se cultivaron en medio RPMI
1640 (Life Technologies), que contiene suero bovino fetal al 10%,
50 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina y 10 U/ml de
nistatina.
El ARN completo del endotelio se aisló con el
kit Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania), a continuación de esto
se llevó a cabo una ADNc-sintasa con un máximo de 3
\mug de ARN y 200 U de transcriptasa inversa Superscript^{TM} II
(Life Technologies) en un volumen total de 20 \mul en
correspondencia a las indicaciones del fabricante. Para el
equilibrio de la carga en ADNc se usaron 5 \mul (aproximadamente
75 ng de ADNc) de la solución de ADNc resultante y el par cebador
(Gibco) para el factor-1 de elongación
(F-1)-PCR con 1 U de Taq
ADN-polimerasa (Gibco) en un volumen total de 50
\mul. El EF-1 sirvió como patrón interno para la
PCR. Los productos de PCR se separaron sobre geles de agarosa al
1,5% que contienen bromuro de etidio al 0,1% y se determinó la
intensidad de las bandas densitométricamente con un sistema de
cámara CCD y el software One-Dscan Gelanalyse de
Scanalytics (Billerica, MA, Estados Unidos), para ajustar en los
análisis por PCR siguientes el volumen de ADNc.
Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo
individualmente para cada par cebador en un termociclo Hybaid OmnE
(AWG, Heidelberg, Alemania). Las condiciones de PCR individuales
para el ADNc de células del endotelio humanas fueron como siguen:
CD40 (tamaño del producto 381 pb, 25 ciclos, temperatura del
material dispuesto 60º C, (cebador directo)
5'-CAGAGTTCACTGAAACGGAATGCC-3' (ID
SEC Nº: 37), (cebador inverso)
5'-TGCCTGCCTGTTGCACAACC-3' (ID SEC
Nº: 38); EF-1 (tamaño del producto 220 pb, 22
ciclos, temperatura del material dispuesto 55º C, (cebador directo)
5'-TCTTAATCAGTGGTGGAAG-3' (ID SEC
Nº: 39), (cebador inverso)
5'-TTTGGTCAAGTTGTTTCC-3' (ID SEC Nº:
40); IL-12p40 (tamaño del producto 281 pb, 30
ciclos, temperatura del material dispuesto 62º C, (cebador directo)
5'-GTACTCCACATTCCTACTTCTC-3' (ID SEC
Nº: 41), (cebador inverso)
5'-TTTGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3' (ID SEC
Nº: 42); MCP-1 (tamaño del producto 330 pb, 22
ciclos, temperatura del material dispuesto 63º C, (cebador directo)
5'-GCGGATCCCCTCCAGCATGAAAGTCTCT-3'
(ID SEC Nº: 43), (cebador inverso)
5'-ACGAATTCTTCTTGGGTTGTGGAGTGAG-3'
(ID SEC Nº: 44); VCAM-1
(tamaño del producto 523 pb, 26 ciclos, temperatura del material dispuesto 63º C), (cebador directo) 5'-CATG
ACCTGTTCCAGCGAGG-3' (ID SEC Nº: 45), (cebador inverso) 5'-CATTCACGAGGCCACCACTC-3' (ID SEC Nº: 46).
(tamaño del producto 523 pb, 26 ciclos, temperatura del material dispuesto 63º C), (cebador directo) 5'-CATG
ACCTGTTCCAGCGAGG-3' (ID SEC Nº: 45), (cebador inverso) 5'-CATTCACGAGGCCACCACTC-3' (ID SEC Nº: 46).
Se llevaron a cabo con los extractos nucleares y
oligonucleótidos de consenso de doble hélice marcados con [^{32}P]
(Santa Cruz Biotechnologie, Heidelberg, Alemania), la electroforesis
en gel de poliacrilamida no desnaturalizada, autorradiografía y
análisis de superdesplazamiento como describen Krzesz y col. (1999)
FEBS Lett. 453, 191. A este respecto se usó un olignucleótido de ADN
de doble hélice con la siguiente secuencia de hélice simple (se
subraya la secuencia de unión al núcleo): AP-1,
5'-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3'
(ID SEC Nº: 3). Para el análisis de la contención de
AP-1 endógeno en extractos nucleares de las células
del endotelio mediante los distintos señuelos de elemento cis se
seleccionó en la formulación para unión EMSA una relación de 50:1 de
señuelo de AP-1 elemento cis:oligonucleótido
AP-1 marcado con [^{32}P] (11 fmol)).
Se prepararon oligonucleótidos señuelo de doble
hélice de los oligonucleótidos unidos a tioato de fósforo de hélice
simple complementarios (Eurogentec, Colonia, Alemania) como
describen Krzesz y col. (1999) FEBS Lett. 453, 191. Se incubaron
las células del endotelio humanas cultivadas durante al menos 2
horas con el oligonucleótido señuelo respectivo en una
concentración de 10 \muM. Acto seguido se reemplazó el medio que
contenía el oligonucleótido señuelo en general por medio fresco.
Las secuencias de hélice simple de los oligonucleótidos eran como
sigue (letras subrayadas señalan bases que se unen a tioato de
fósforo):
| AP-1 | 5'-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3' | (ID SEC Nº: 3), |
| AP-1 | 5'-GTGCTGACTCAGCAC-3' | (ID SEC Nº: 5), |
| AP-1 | 5'-TGTGCTGACTCAGCACA-3' | (ID SEC Nº: 11), |
| AP-1 | 5'-TTGTGCTGACTCAGCACAA-3' | (ID SEC Nº: 13), |
| AP-1 | 5'-GTCGCTTAGTGACTAAGCGAC-3' | (ID SEC Nº: 35), |
| AP-1 mut | 5'-CGCTTGATTACTTAGCCGGAA-3' | (ID SEC Nº: 47) |
| NFAT | 5'-CGCCCAAAGAGGAAAATTTGTTTCATA-3' | (SEC ID Nº: 48) |
Las células del endotelio de venas del cordón
umbilical humanas se descompusieron mediante cinco congelaciones
sucesivas en nitrógeno líquido y descongelaciones a 37ºC. Los
extractos proteicos se prepararon como describen Hecker y col.
(1994) Biochem J. 229, 247. Se separaron de 20 a 30 \mug de
proteína con ayuda de una electroforesis en gel de poliacrilamida al
10% en condiciones de desnaturalización en presencia de SDS según el
protocolo estándar y se transfirieron a una membrana de
transferencia de poli(fluoruro de vinilideno) BioTrace^{TM}
(Pall Corporation, RoBdorf, Alemania). Para la detección
inmunológica de la proteína CD40 se usó un anticuerpo CD40
anti-humano primario policlonal de Research
Diagnostics Inc., Flanders NJ, Estados Unidos. Las bandas proteicas
se detectaron tras adición de un IgG anti-conejo
acoplado con peroxidasa (1:3000, Sigma, Deisenhofen, Alemania) con
ayuda del procedimiento de quimioluminiscencia (SuperSignal
Chemiluminescent Substrate; Pierce Chemical, Rockford, IL, Estados
Unidos) y autorradiografía subsiguiente (Hyperfilm^{TM} MP,
Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra). La
ejecución y transferencia de iguales cantidades de proteína se
mostró tras "extracción" de la membrana de transferencia (5
minutos, NaOH 0,2 N, seguido de lavado 3 veces durante 10 minutos
con H_{2}O) con detección de las mismas bandas de proteína de
\beta-actina con un anticuerpo monoclonal primario
y una IgG anti-ratón acoplada con peroxidasa (ambos
de Sigma-Aldrich, dilución 1:3000).
Células del endotelio humanas cultivadas
primarias, criadas sobre cubreobjetos hasta una densidad celular del
100%, se lavaron con tampón Hepes-tiroides (datos en
mmol/l: NaCl 137, KCl 2,7, CaCl_{2} 1,4, MgCl_{2} 0,25,
NaH_{2}PO_{4} 0,4, Hepes Na 10, D-glucosa 5),
que contenía polivinilpirrolidona al 1,5% (PVP;
Sigma-Aldrich), y se aplicaron al fondo de una
cámara de perfusión (altura de 2,5 mm y volumen de 260 \mul,
Warner Instrument, Hamden, CT, Estados Unidos). La cámara se fijó a
un microscopio S100 TV Axiovert (Zeiss, Goettingen, Alemania) sobre
una plataforma calentable (Warner Instruments) y se perfundió con el
tampón descrito calentado a 37º C (calentador de solución
en-línea, Warner Instruments). La fuerza de
empuje producida con ayuda de una bomba (Ismatec, Zürich, Suiza) fue
de 5 din/cm^{2} a una relación de cizalla de 10 s^{-1}. Las
células del endotelio se perfundieron al comienzo durante 10 minutos
con Hepes-Tiroides/PVP, seguido de una superfusión
de 10 minutos con 1,5x10^{6} células THP-1 (5 x
10^{5} células THP-1/ml) en
Hepes-tiroides/PVP. A continuación se lavó la cámara
de perfusión con Hepes-tiroides/PVP. La
documentación de los efectos de interacción
célula-célula se realizó con amplificación de 20
veces con una cámara SPOT RT Farb-CCD (Diagnostics
Instruments, Burroughs St. Sterling Heights, Michigan, Estados
Unidos). Por formulación de ensayo se valoraron tres tomas de
distintos campos visuales con el programa MetaMorph V3.0 (Universal
Imaging, West Chester, PA, Estados Unidos).
Si no se indica de otra forma, todos los datos
en las figuras se dan como valores medios \pm SEM de n
experimentos. La valoración estadística se realizó mediante análisis
de la varianza parcial (ANOVA) seguido de un ensayo Dunnett Post.
Se apreció un valor P < 0,05 como diferencia estadística más
significativa.
Para la detección de la actividad del preparado
para terapia basado en el oligonucleótido señuelo desarrollado en la
presente solicitud se llevó a cabo para la indicación de rechazo al
trasplante agudo un estudio prueba de concepto experimental
en animales con ratas (combinación de razas Wistar Furth auf Lewis;
para detalles experimentales véase Hölschermann y col. (1999) Am. J.
Pathol. 154, 211). La aplicación una sola vez de 10 \mumol/l del
oligonucleótido señuelo de AP-1 (ID SEC Nº: 3), pero
no del oligonucleótido de control mutado (AP-1 mut
(ID SEC Nº: 47), sin diferencia en comparación con los animales de
control), a los vasos coronarios del trasplantado coronario
heterótopo (incubación de 30 minutos antes del implante) alargó sus
supervivencias sin toma de un inmunosupresor de 6,2 \pm 0,2 a 7,6
\pm 0,4 días (n = 5, P < 0,05). Este efecto estaba asociado con
un debilitamiento significativo de la expresión de la molécula de
adhesión (por ejemplo, VCAM-1) en el endotelio de
los vasos coronarios del corazón del donante así como con la
infiltración de monocitos y células T en el día 1 y 3
post-operatorio.
También en el modelo de la vasculoterapia del
trasplante (rechazo crónico) se comprueba como extraordinariamente
efectiva la aplicación de una sola vez del oligonucleótido señuelo
de AP-1. En variación de los modelos de rechazo
agudos descritos hasta ahora, se trataron los animales receptores
por vía intraperitoneal con el inmunosupresor ciclosporina A (5 mg
por kg de peso corporal y día) y se explantaron los corazones de los
donantes tras 100 días. El grado de vasculopatía en las arterias
coronarias se determinó morfométricametne según los criterios de
Adams y dio lugar al siguiente cuadro: control de isotipo (n = 7),
puntuación 0,97 \pm 0,11; control de ciclosporina A (n = 6),
puntuación 2,08 \pm 0,16 (P > 0,001 frente al control de
isotipo); oligonucleótido señuelo de AP-1 (n = 6),
puntuación 1,39 \pm 0,16 (P > 0,01 frente al control de
ciclosporina A).
<110> Avontec GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Inhibición por oligonucleótido
señuelo de la expresión de CD40
\vskip1.000000\baselineskip
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<130> HEC-006 PCT
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<140> Desconocido
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<141>
2003-09-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 102 40 417,8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-09-02
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<160> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 9
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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<220>
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<221> misc-feature
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<222> (1) . . (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> V = g ó c ó a
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<220>
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<221> Oligonucleótido señuelo
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<222> (1) . . (9)
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<223>
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> misc-feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9) . . (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S = g ó c
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipvtgagtcas
\hfill9
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<210> 2
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<211> 9
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc-feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S = g ó c
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<220>
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<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (9)
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<223>
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc-feature
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<222> (9) . . (9)
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<223> B = g ó t ó c
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<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipstgastcab
\hfill9
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcttgatga ctcagccgga a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccggctga gtcatcaagc g
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgctgactc agcac
\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgctgagtc agcac
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggtgactc accac
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggtgagtc accac
\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtggtgact caccact
\hfill17
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipagtggtgagt caccact
\hfill17
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<210> 11
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgctgact cagcaca
\hfill17
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<210> 12
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgctgagt cagcaca
\hfill17
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<210> 13
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
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<210> 14
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
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<223>
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<221> Oligonucleótido señuelo
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\vskip0.400000\baselineskip
<223>
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtgagtca cca
\hfill13
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
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<223>
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtgactca cca
\hfill13
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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<400> 17
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggtgagtc accat
\hfill15
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<210> 18
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
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\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggtgactc accat
\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
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\hskip-.1em\dddseqskiptatggtgagt caccata
\hfill17
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<212> ADN
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<221> Oligonucleótido señuelo
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<223>
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskiptatggtgact caccata
\hfill17
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<210> 21
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatggtgag tcaccatag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatggtgac tcaccatag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctatggtga gtcaccatag g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctatggtga ctcaccatag g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttgagtca cca
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtgactca aca
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgttgagtc accac
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggtgactc aacac
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgttgagt caccaca
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtggtgact caacaca
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtgttgag tcaccacag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtggtgac tcaacacag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgtgttga gtcaccacag t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgtggtga ctcaacacag t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctcttagt gactaagcga c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgcttagt cactaagcga c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagagttcac tgaaacggaa tgcc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcctgcctg ttgcacaacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttaatcag tggtggaag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttggtcaag ttgtttcc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtactccaca ttcctacttc tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttgggtcta ttccgttgtg tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggatcccc tccagcatga aagtctct
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgaattctt cttgggttgt ggagtgag
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgacctgt tccagcgagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcattcacgag gccaccactc
\hfill20
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<210> 47
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia sintética
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<220>
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<221> Oligonucleótido señuelo
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<222> (1) . . (21)
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<223>
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<400> 47
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcttgatta cttagccgga a
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido señuelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (27)
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<223>
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<400> 48
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcccaaaga ggaaaatttg tttcata
\hfill27
Claims (3)
1. Oligonucleótidos de ADN de doble hélice, en
donde una o ambas hélices de ADN presentan una secuencia según ID
SEC Nº 1, 2, 7 a 10 ó 15 a 34 y la hélice de ADN complementaria
presenta la secuencia complementaria a esta.
2. Oligonucleótidos de ADN de doble hélice
según la reivindicación 1 como medicamentos.
3. Uso de oligonucleótidos de ADN de doble
hélice que se unen al factor de transcripción AP-1
de doble hélice y de oligonucleótidos de ADN de doble hélice según
la ID SEC Nº 1 a 36 para la preparación de un medicamento para la
profilaxis y/o terapia del rechazo al trasplante agudo y crónico, de
la enfermedad injerto contra huésped aguda y crónica (EIcH)
así como de los daños por isquemia/reperfusión de órganos tras una
intervención quirúrgica.
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