ES2263361B1 - Metodo de deteccion de residuos de antibioticos y otros compuestos antibacterianos. - Google Patents
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Abstract
Método de detección de residuos de antibióticos y otros compuestos antibacterianos. Esta invención tiene por objeto un nuevo método de ensayo microbiológico para la detección rápida de la presencia o ausencia de residuos de antibióticos y otros compuestos antimicrobianos como sulfamidas en muestras biológicas tales como leche, huevo, carne, miel, suero y orina. Este nuevo método presenta notables ventajas frente a los actuales métodos rápidos de ensayo microbiológicos comercializados con igual o similar objetivo. Más concretamente, en la invención se ha ideado un nuevo método basado en la inhibición del crecimiento de Geobacillus kaustophilus en presencia de muestras contaminadas con residuos de compuestos antimicrobianos. Este nuevo método de ensayo permite detectar en un plazo de 1 1/2 a 4 1/2 horas un gran número de antibióticos en concentraciones próximas a los Límites Máximos de Residuos (LMRs) permitidos en alimentos destinados al consumo humano (Directiva 96/23 CEE).
Description
Método de detección de residuos de antibióticos
y otros compuestos antibacterianos.
Sector Agroalimentario.
Esta invención tiene por objeto un nuevo método
de ensayo microbiológico para la detección rápida de la presencia o
ausencia de residuos de antibióticos y otros compuestos
antimicrobianos como sulfamidas en muestras biológicas tales como
leche, huevo, carne, miel, suero y orina. Este nuevo método
presenta notables ventajas frente a los actuales métodos rápidos de
ensayo microbiológicos comercializados con igual o similar
objetivo.
Más concretamente, en la invención se ha ideado
un nuevo método basado en la inhibición del crecimiento de
Geobacillus kaustophilus en presencia de muestras
contaminadas con residuos de compuestos antimicrobianos. Este nuevo
método de ensayo permite detectar en un plazo de 1 ½ a 4 ½ horas
un gran número de antibióticos en concentraciones próximas a los
Límites Máximos de Residuos (LMRs) permitidos en alimentos
destinados al consumo humano (Directiva 96/23 CEE).
La detección de residuos de medicamentos y,
especialmente de antibióticos y sulfamidas en los alimentos, tiene
una extraordinaria importancia dadas sus repercusiones en la Salud
Pública y sus efectos sobre los procesos tecnológicos de
elaboración de los alimentos.
El problema es de tal magnitud que la Unión
Europea ha establecido que no podrán destinarse al consumo humano
aquellos alimentos cuyo contenido en residuos de sustancias
farmacológicas activas supere unos Límites Máximos de Residuos
(LMRs), establecidos según la Directiva 96/23 CEE, que marcan en la
actualidad las exigencias mínimas para el comercio
internacional.
En la actualidad, es posible determinar
específicamente la presencia de diversos compuestos
antimicrobianos, en matrices tanto sólidas como líquidas, mediante
técnicas inmunoquímicas, enzimáticas, HPLC, etc., pero por su
simplicidad, bajo coste y amplio espectro, las basadas en la
inhibición del crecimiento microbiano son las más ampliamente
utilizadas. Dentro de este grupo, las técnicas basadas en la
colocación de un disco de un material absorbente, empapado en la
muestra problema, sobre una placa de agar sembrada con una
determinada especie microbiana son las más antiguas. Estos métodos
permiten confirmar la presencia de sustancias inhibidoras por la
aparición, tras la correspondiente incubación, de un "halo de
inhibición" alrededor del disco.
Existen diversas variantes de la técnica del
"disco en placa" que difieren en el uso de diversas
especies/cepas microbianas (Geobacillus stearothermohilus,
Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium,
Streptococcus thermophilus, Sarcina lutea, etc.), de diversos
medios y condiciones de cultivo, etc., que en general resultan
útiles en situaciones concretas. Sin embargo, todas ellas presentan
el inconveniente común de su laboriosidad que impide su uso
sistemático para la realización de pruebas rutinarias tanto en
centros oficiales de control como en los propios laboratorios de las
industrias agroalimentarias.
Para subsanar esta limitación se han lanzado al
mercado diversos métodos listos para el uso basados en la detección
de los cambios inducidos por la actividad metabólica de
Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 en
diversos medios, en presencia de la muestra problema. Se han
descrito ejemplos de tales ensayos en los documentos EP 0005891, EP
0611001, US 4946777, US 3941658, ES 2176220 o ES 2153562. Por lo
general, estos métodos proporcionan un resultado en un plazo de 1 ½
a 4 ½ horas mediante el cambio de color de un indicador
ácido-base o redox añadido al sistema de ensayo.
Permiten procesar gran número de muestras por lo que son los más
utilizados en nuestros días.
Geobacillus stearothermophilus var.
calidolactis C953 presenta un rápido crecimiento y la ventaja
adicional de que es termófilo, es decir, que su temperatura óptima
de crecimiento se encuentra entre 50 y 70ºC. Estas temperaturas
extremas impiden el crecimiento de posibles microorganismos
contaminantes presentes en el medio de ensayo que pudieran afectar
el resultado del ensayo. Además, su temperatura mínima de
crecimiento es superior a 45ºC, lo que permite que el método de
ensayo sea estable a temperaturas de almacenamiento o temperatura
ambiente.
Si bien la utilización de estos métodos de
ensayo ofrece numerosas ventajas, también muestran algunas
carencias en relación con la falta de sensibilidad a algunos grupos
de antibióticos comúnmente utilizados en los tratamientos
terapéuticos/profilácticos de animales destinados al consumo humano.
Los métodos de ensayo basados en la inhibición del crecimiento de
Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis se
muestran especialmente sensibles a antibióticos
beta-lactámicos, y gracias a la adición de
sustancias coadyuvantes y la modificación de las condiciones de
ensayo también resultan suficientemente sensibles a tetraciclinas y
sulfamidas. Sin embargo, los límites de detección que presentan
frente a una gran mayoría de antibióticos aminoglucósidos y
macrólidos difieren en ocasiones en varios órdenes logarítmicos de
los LMRs establecidos.
La presente especificación demuestra que la
utilización de Geobacillus kaustophilus como organismo de
ensayo permite ampliar la gama de compuestos antimicrobianos que
pueden ser detectados mediante un método rápido de ensayo listo para
su uso en un periodo de tiempo inferior a 4 ½ (ver Figuras 1 y
2).
El método de ensayo de detección de antibióticos
y otros compuestos antimicrobianos, objeto de esta memoria,
reivindica la utilización de Geobacillus kaustophilus como
microorganismo de ensayo de un nuevo método rápido de ensayo que
permita detectar uno o varios compuestos antimicrobianos en una
muestra biológica, como por ejemplo leche, huevo, carne, miel,
suero u orina. Este nuevo método de ensayo comprende la puesta en
contacto de la muestra problema con un microorganismo de ensayo
seleccionado de entre las cepas termofilicas de Geobacillus
kaustophilus, y la provisión de las condiciones de realización
del ensayo en las que: en ausencia de compuestos antimicrobianos la
actividad metabólica de dicho microorganismo de ensayo suceda y
pueda ser detectada; y en presencia de compuestos antimicrobianos
dicha actividad metabólica sea inhibida y por tanto, no pueda ser
detectada.
Este nuevo método de ensayo permite ampliar la
gama de compuestos antimicrobianos que pueden ser detectados
mediante un método rápido listo para su uso en un periodo de tiempo
inferior a 4 ½ horas.
El medio de ensayo puede ser opcionalmente un
medio sólido, como por ejemplo un medio de agar, o líquido, como
por ejemplo un caldo nutritivo, al que se añade el microorganismo de
ensayo, los nutrientes necesarios para soportar el crecimiento de
dicho microorganismo, un indicador de la actividad metabólica
microbiana, tales como un indicador de pH o uno o más indicadores
redox, y opcionalmente, sustancias que permitan modificar la
sensibilidad a ciertos compuestos antimicrobianos. Todos estos
componentes o parte de ellos pueden opcionalmente ser añadidos al
medio de ensayo por separado mediante una pastilla o un disco de
papel.
Geobacillus kaustophilus presenta un
rápido crecimiento y la ventaja adicional de que es termófilo, por
lo que puede crecer a temperaturas extremas
(50-70ºC) impidiendo la interferencia de posibles
microorganismos contaminantes que pudieran afectar al resultado del
método de ensayo. Además, no puede crecer a temperatura ambiente lo
que permite que el método de ensayo sea estable a temperaturas de
almacenamiento hasta su uso.
El microorganismo se añade preferentemente al
medio de ensayo en forma de una suspensión de esporas. En función
del tiempo de realización del ensayo o del grado de sensibilidad a
los distintos compuestos antimicrobianos que se pretenda conseguir
dicho microorganismo estará presente en una concentración de
10^{4} a 10^{9} UFC/ml.
El microorganismo puede, o bien conservarse
dispersado en un medio sólido, por ejemplo un medio de agar
solidificado, líquido, por ejemplo en un caldo nutritivo, o bien
puede conservarse en forma deshidratada o liofilizada.
El microorganismo de ensayo se activa al ponerse
en contacto con la muestra problema y al ser incubado en el medio
de ensayo a temperaturas entre 40 y 75ºC.
Entre los nutrientes adecuados se incluyen
fuentes de carbono asimilables, fuentes de nitrógeno asimilables y
fuentes de factores de crecimiento y minerales.
El crecimiento del microorganismo de ensayo
puede detectarse o bien visualmente, o por el cambio de color del
medio de ensayo en el que se encuentra presente un indicador de la
actividad metabólica. Éste puede ser un indicador de pH,
preferentemente púrpura de bromo-cresol, o uno o
varios indicadores redox, preferentemente negro brillante.
La sensibilidad del método de ensayo puede
modificarse por diversos medios: por ejemplo cambiando las
condiciones de ensayo, tales como la temperatura y tiempo de
incubación, o el pH del medio de ensayo, variando la relación de
volúmenes del medio de detección y la sustancia a analizar, o
mediante la adición de sustancias que permitan modificar la
sensibilidad a ciertos compuestos antimicrobianos. Como ejemplo, se
sugiere la adición de trimetoprim para incrementar la sensibilidad
del método de ensayo a las sulfamidas.
En relación con las unidades de ensayo, éstas
pueden ser de distinto tamaño, entendiendo que la relación entre la
cantidad de medio de detección y de la muestra problema determina
la sensibilidad del método de ensayo. Así, pueden utilizarse
opcionalmente tubos de entre 3-30 mm de altura y
1-20 mm de sección transversal, placas, placas de
microtitulación o bloques con hendiduras tubulares que alojan el
medio de ensayo. El volumen del medio de ensayo y de la muestra
problema podrá variar en función de la unidad de ensayo. Por
ejemplo, cuando la unidad de ensayo sea un tubo el volumen del
medio de ensayo podrá oscilar entre 10 \mul y 3 ml y el volumen
de la muestra problema entre 10 \mul y 1 ml.
En relación con las condiciones de realización
del ensayo, la temperatura de ensayo puede estar entre 40 y 75ºC,
con mayor preferencia entre 60-65ºC; el pH del medio
de ensayo entre 5-8; y el tiempo de incubación puede
ser de entre 1 ½ y 4 ½ horas.
La incubación puede realizarse opcionalmente en
un baño de agua, en una estufa, o en cualquier otro tipo de
incubadora convencional.
La lectura del resultado del método de ensayo
puede obtenerse visualmente u opcionalmente mediante la medida
espectrofotométrica de los cambios de absorbancia experimentados
por el medio de ensayo.
Figura 1.- Comparación de la sensibilidad de
Geobacillus kaustophilus y Geobacillus
stearothermophilus var. calidolactis C953 a diversos
antibióticos y sulfamidas, determinada según el método del disco en
placa. La figura representa en ordenadas el diámetro del halo de
inhibición de placas de Petri inoculadas con Geobacillus
kaustophilus o Geobacillus stearothermophilus var.
calidolactis, causado por la presencia de un disco de papel
conteniendo concentraciones conocidas de penicilina, ampicilina,
cefazolina, tetraciclina, oxitetraciclina, cloranfenicol,
sulfanilamida, norfloxacina, gentamicina, neomicina, polimixina o
eritromicina.
Como se observa en la figura, Geobacillus
kaustophilus mostró una mayor sensibilidad que Geobacillus
stearothermophilus var. calidolactis a todos los
compuestos antimicrobianos testados, aunque en distinta cuantía.
Mientras que la sensibilidad a beta lactámicos fue similar en ambas
especies, Geobacillus kaustophilus se mostró entre un 30 y
un 45% más sensible que Geobacillus stearothermopnilus var
calidolactis frente a tetraciclina, sulfanilamida,
gentamicina, cloranfenicol, y neomicina.
Figura 2.- Establecimiento del límite de
detección para la estreptomicina del método de ensayo basado en la
inhibición del crecimiento de Geobacillus kaustophilus y
realizado según la descripción de un ensayo preferente descrito en
el siguiente apartado. La figura representa en abcisas el tiempo de
incubación en horas y en ordenadas los cambios de absorbancia que
se producen como consecuencia de la actividad metabólica del
organismo de ensayo.
Para la realización de este ensayo se utilizó
una placa de microtitulación fabricada según se describe en el
siguiente apartado (Descripción de un ensayo preferente). Como
solución control se inoculó 0,1 ml de agua destilada, y como
muestras problemas se inocularon 0,1 ml de agua destilada
contaminada con 50, 100, 200, 300, 400, 600 y 1000 ppbs de
estreptomicina. Todas las muestras se inocularon por
cuadruplicado.
Como se observa en la figura, el método de
ensayo detectó la presencia de estreptomicina en concentraciones
iguales o superiores a 200 ppb en un tiempo inferior a las 4 ½
horas.
Para complementar la descripción, aunque de
forma ilustrativa y no limitativa, se acompaña la presente memoria
de la descripción de un ensayo preferente realizado en las
siguientes condiciones:
Unidad de ensayo: como placas de ensayo se
utilizaron placas de microtitulación de 96 pocillos lo que nos
permitió disponer de 96 unidades de ensayo independientes.
Medio de ensayo: se preparó una solución de 15 g
de agar, 5 g de peptona, 3 g de extracto de carne, y 1,2 g de
dextrosa en 1000 ml de agua destilada. La solución final se
esterilizó a 121ºC durante 20 min y se enfrió hasta aproximadamente
45-50ºC.
Microorganismo de ensayo: al medio de ensayo se
añadió cierto volumen de una suspensión de esporos de
Geobacillus kaustophilus en agua destilada para obtener una
concentración final de 108 esporas/
ml.
ml.
Indicador: se añadió cierta cantidad de una
solución de negro brillante para obtener una concentración final de
200 mg por 1000 ml.
Una vez realizada la mezcla de los componentes,
150 \mul de la solución se dispensaron en cada uno de los 96
pocillos de la placa de microtitulación en condiciones asépticas. A
continuación, la placa se cerró con una lámina de aluminio y se
almacenó bajo refrigeración (<7ºC).
Una vez atemperada la placa de ensayo a
temperatura ambiente se procedió a retirar la lámina de aluminio. A
continuación se añadieron por cuadruplicado 0,1 ml de una muestra
de agua destilada, y 0,1 ml de distintas soluciones de agua
destilada contaminadas con 50, 100, 200, 400, 600 y 1000 ppbs de
estreptomicina. Condiciones de realización del ensayo: a
continuación la placa de ensayo se incubó durante 4 horas y 30
minutos en una estufa a 65ºC.
Lectura de los resultados: mientras que las
unidades de ensayo inoculadas con las muestras control o con las
muestras contaminadas con 50 o 100 ppbs de estreptomicina viraban
desde el negro original hasta adquirir una coloración anaranjada,
las unidades de ensayo inoculadas con las muestras de leche fresca
de vaca contaminadas con 200 ppbs o más de estreptomicina
permanecían de color oscuro obteniéndose lecturas
espectrofotométricas superiores al límite de detección fijado en
0,3 de absorbancia.
Claims (8)
1. Método para detectar uno o más antibióticos u
otros compuestos antimicrobianos presentes en una muestra biológica
basado en la inhibición de la actividad metabólica de un
microorganismo de ensayo seleccionado de entre las cepas
termofilicas de Geobacillus kaustophilus, y que
comprende:
a) la puesta en contacto de la muestra problema
con el microorganismo de ensayo y,
b) la provisión de las condiciones de
realización del ensayo en las que: en ausencia de compuestos
antimicrobianos la actividad metabólica de dicho organismo de
ensayo suceda y pueda ser detectada; y en presencia de compuestos
antimicrobianos dicha actividad metabólica sea inhibida y por
tanto, no pueda ser detectada.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque el medio de ensayo puede ser
opcionalmente un medio sólido, como por ejemplo un medio de agar, o
líquido, como por ejemplo un caldo nutritivo, al que se añade el
microorganismo de ensayo, los nutrientes necesarios para soportar
el crecimiento de dicho microorganismo, y un indicador de la
actividad metabólica.
3. Método según la reivindicación 2,
caracterizado porque todos o parte de los componentes
citados pueden opcionalmente ser añadidos al medio de ensayo por
separado mediante una pastilla o un disco de papel.
4. Método según la reivindicación 2,
caracterizado porque el microorganismo de ensayo se añade al
medio de ensayo preferentemente en forma de esporos en una
concentración de entre 104 y 109 UFC/ml, lo que permite modificar el
tiempo de realización del ensayo y su sensibilidad a los distintos
compuestos antimicrobianos.
5. Método según la reivindicación 2,
caracterizado porque el indicador de la actividad metabólica
puede ser opcionalmente un indicador ácido-base o
uno o varios indicadores redox.
6. Método según la reivindicación 2,
caracterizado por permitir modificar la sensibilidad del
método en función de las condiciones de realización del ensayo tales
como la temperatura y tiempo de incubación, o el pH del medio de
ensayo, variando la relación de volúmenes del medio de detección y
la sustancia a analizar, o añadiendo sustancias que permitan
modificar la sensibilidad a ciertos compuestos antimicrobianos,
como por ejemplo la adición de trimetoprim para incrementar la
sensibilidad a sulfamidas.
7. Unidad de ensayo para llevar a cabo un método
según la reivindicación 2, en el que dicha unidad puede ser
opcionalmente un tubo o una placa, una placa de microtitulación o
un bloque con hendiduras tubulares que alojan el medio de ensayo
según se ha descrito en anteriores reivindicaciones.
8. Método según reivindicaciones anteriores,
caracterizado porque la lectura de los resultados puede
obtenerse visualmente u opcionalmente mediante la medida
espectrofotométrica de los cambios de absorbancia experimentados por
el medio de ensayo.
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