ES2262431B1

ES2262431B1 - "nuevos antioxidantes obtenidos de fuente natural y sintetica y procedimiento de obtencion".

Info

Publication number: ES2262431B1
Application number: ES200501121A
Authority: ES
Inventors: Maria Encarnaci Femenia Rios; Isidro Gonzalez Collado; Antonio Jose Macias Sanchez; Carlos Mario Garcia Pajon
Original assignee: Universidad de Cadiz
Current assignee: Universidad de Cadiz
Priority date: 2005-05-10
Filing date: 2005-05-10
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2025-05-10
Also published as: ES2262431A1; WO2006120266A1

Abstract

Nuevos antioxidantes obtenidos de fuente natural y sintética y procedimiento de obtención. Se reivindica una clase de compuestos de formula general 1, entre los que se encuentra el (-)-2-(3'',4''-dihidroxifenil)tetrahidrofurano-3,4-diol ((-)-2a), y su uso como agentes antioxidantes. Se reivindica un procedimiento de aislamiento de ((-)-2a) a partir de caldos de cultivo del hongo fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides y también un proceso de preparación mediante síntesis química de compuestos de formula general 1, incluyendo al compuesto ((+/-)-2a).

Description

Nuevos antioxidantes obtenidos de fuente natural y sintética y procedimiento de obtención.

Dominio de la técnica

La invención pertenece al campo de los antioxidantes de origen natural y al campo de la síntesis racémica de compuestos antioxidantes.

Estado anterior de la técnica

Existen numerosas evidencias derivadas de estudios epidemiológicos que indican una asociación entre una dieta rica en frutas y vegetales y un descenso en el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de ciertas formas de cáncer. Se suele asumir que los principios activos que contribuyen a estos efectos protectivos son, principalmente, metabolitos secundarios antioxidantes.

Las investigaciones realizadas en las últimas décadas han permitido acumular suficientes evidencias sobre el efecto beneficioso de las sustancias capaces de capturar radicales libres (antioxidantes) como agentes antimutagénicos, antiinflamatorios, antiarterioscleróticos, antidiabéticos, antihepatotóxicos, antienvejecimiento, etc. La búsqueda de nuevos principios antioxidantes se ha convertido, por tanto, en esencial para el tratamiento farmacológico de condiciones patológicas relacionadas, bien con daño oxidativo (radicales libres), bien con alteraciones en el balance del metabolismo oxidativo, tales como cataratas, enfermedades reumáticas, arteriosclerosis, enfermedad de Alzheimer y otras condiciones neurodegenerativas.

En consecuencia, las aproximaciones farmacológicas se han orientado hacia la búsqueda de fuentes con nuevos principios antioxidantes. Mientras que las plantas medicinales han constituido una fuente tradicional de este tipo de compuestos, mucha menos atención se ha prestado al estudio de los extractos de cultivos de hongos.

Recientes estudios han puesto de manifiesto la relación que existe entre la capacidad infectiva de determinados hongos fitopatógenos y la producción de especies activas de oxígeno en los procesos de infección. Así mismo es conocido que el denominado "estrés oxidativo" provoca cambios en el crecimiento, morfología y metabolismo de los hongos. En consecuencia, es razonable considerar que estos microorganismos, en general, deben contar con sistemas, enzimáticos y no enzimáticos, que les permitan regular su metabolismo oxidativo.

Por tanto, es de interés el estudio de los caldos de cultivo de hongos fitopatógenos como fuentes de compuestos antioxidantes.

Las especies de hongos fitopatógenos pertenecientes al género Colletotrichum son consideradas como unas de las más perjudiciales en la agricultura debido a la diversidad de especies vegetales que pueden ser afectadas y la magnitud de los daños ocasionados sobre las plantas. Diversos estudios de los metabolitos aislados de especies de este género han puesto de manifiesto la existencia de compuestos con potencial actividad antioxidante, como es el caso del ácido colletótrico y otros polifenoles. Por tanto, el estudio de nuevas cepas de hongos de este género tiene gran interés en la búsqueda de nuevos agentes antioxidantes.

Explicación de la invención

La invención comprende compuestos con la formula general 1, donde R puede ser H ó cadenas ó ciclos que pueden contener átomos de carbono, hidrógeno u otros heteroátomos (figura 1). Estos incluyen al compuesto (-)-2-(3',4'-dihidroxifenil)tetrahidrofurano-3,4-diol ((-)-2a) (de ahora en adelante denominado (-)-DFTD), obtenido desde un cultivo del hongo fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides (figura 2).

Para aislar el compuesto (-)-DFTD ((-)2a) se puede emplear un procedimiento que implique el cultivo en medio líquido del hongo C. gloeosporioides, la filtración del micelio y posterior extracción del caldo de cultivo resultante, un inicial fraccionamiento del extracto crudo resultante mediante cromatografia en columna, y su posterior análisis y separación mediante cromatografia en columna y HPLC.

Para llevar a cabo la síntesis racémica de DFTD ((\pm)-2a), y de derivados del mismo con la fórmula general 1 (figura 1), con R tal y como se ha definido previamente, se puede emplear un procedimiento de síntesis secuencial que implique la protección de los grupos hidroxilo del 3,4-dihidroxibenzaldehido (3), la vinilación del producto resultante, la introducción de un grupo prop-2-enilo mediante una O-alilación, una reacción de metátesis de cierre de anillo sobre la diolefina no conjugada anteriormente preparada, una dihidroxilación estereoselectiva sobre el sistema de dihidrofurano anteriormente preparado y reacciones de desprotección/derivatización para dar (\pm)-DFTD ((\pm)-2a) o derivados como el tetracetato de (\pm)-DFTD ((\pm)-2b).

Los compuestos de fórmula general 1, pueden presentar actividad antioxidante, tal y como revela el ensayo de (\pm)-DFTD ((\pm)-2a) frente al radical libre 1,1-difenil-2-picrilhidrazil radical (denominado de ahora en adelante DPPH).

Breve descripción de las figuras

Para la mejor comprensión de lo descrito en esta memoria, se acompañan una serie de figuras que describen los compuestos a los que se hace referencia a lo largo del texto.

Figura 1.- Compuestos de fórmula general 1, donde R puede ser H, cadenas ó ciclos que pueden contener átomos de carbono, hidrógeno u otros heteroátomos.

Figura 2.- (-)-2-(3',4'-dihidroxifenil)tetrahidrofurano-3,4-diol ((-)-2a) y su tetracetato ((-)-2b).

Figura 3.- Diagrama del proceso de filtrado y extracción de los medios de cultivo de la cepa 20122 CECT de Colletotrichum gloeosporioides.

Figura 4.- Esquema global de síntesis de los compuestos (\pm)-2a y (\pm)-2b.

Figura 5.- Preparación del compuesto 4.

Figura 6.- Preparación del compuesto 5.

Figura 7.- Preparación del compuesto 6.

Figura 8.- Preparación del compuesto 7.

Figura 9.- Preparación de los compuestos 8a y 8b.

Modo de realización de la invención. Ejemplos de aislamiento, preparación y actividad Ejemplo 1 Aislamiento de DPTD ((-)2a) y su tetracetato ((-)2b) desde un cultivo líquido de Colletotrichum gloeosporioides (Figura 3)

La cepa del hongo Colletotrichum gloeosporioides, código de registro 20122 CECT, obtenida de plantaciones canadienses de Fragaria spp. (fresas y fresones), previamente subcultivado en medio sólido Agar-Malta (20 g de malta, 20 g de glucosa, 1 g de peptona y 20 g de agar en un litro de agua destilada a pH= 6.5-7) a una temperatura de 25-28ºC, es añadido troceado, directamente del medio sólido, a un cultivo líquido estéril de 65 litros de medio Czapek Dox (para 1 litro de medio: 50 g de glucosa, 1 g de extracto de levadura, 5 g de KH_{2}PO_{4}, 2 g de NaNO_{3}, 0.5 g de MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O y 0.01 g de FeSO_{4} \cdot 7H_{2}O en 1 L de agua destilada a pH = 6.5-7), repartido en botellas de 500 mL. La fermentación se llevó a cabo en agitación, a 140 rpm, en presencia de luz artificial (tubos fluorescentes tipo "daylight") y a una temperatura de 25-28ºC durante 7 días. Transcurrido el tiempo de fermentación, el micelio fue separado del medio de cultivo por filtración a presión reducida, usando primero un filtro de nylon de 3 mm de poro y después, tras saturación con NaCl, usando CELITA 545. El medio se extrajo con acetato de etilo y el crudo resultante (9.30 g) tras secar el disolvente (sobre Na_{2}SO_{4} anhidro) y evaporar el disolvente a presión reducida, fue fraccionado mediante cromatografia de columna, empleando gel de sílice 60. De la elución con acetato de etilo se obtuvo una fracción de 2.6 g que, por un lado fue estudiada directamente mediante cromatografia en columna y HPLC para dar (-)-DPTD ((-)-2a), que por acetilación (Ac_{2}O en piridina) dio lugar al tetracetato de (-)-DPTD ((-)-2b). Alternativamente, la fracción anteriormente mencionada fue acetilada (Ac_{2}O en piridina) y metilada (diazometano en Et_{2}O) antes de proceder a la separación de sus componentes. La posterior separación de esta fracción derivatizada, mediante HPLC permitió obtener 2-(3',4'-diacetoxifenil)-3,4-diacetoxitetrahidrofurano ((-)-2b) en cantidad suficiente para un estudio espectroscópico completo.

Datos físicos y espectroscópicos del compuesto (-)-2a

Aceite transparente.

RMN de ^{1}H (400 MHz, CD_{3}OD): \delta (ppm) 3.80 (dd, J = 2.4, 8.8 Hz, 1H, H-5b), 3.87 (dd, J = 4.2, 7.6 Hz, 1H, H-3), 4.22 (ddd, J = 2.4, 4.2, 4.6 Hz, 1H, H-4), 4.25 (dd, J= 4.6, 8.8 Hz, 1H, H-5a), 4.51 (d, J= 7.6 Hz, 1H, H-2), 6.70 (2H, H-5', H-6'), 6.80 (d, J = 2.0 Hz, H-2').

Datos físicos y espectroscópicos para el compuesto (-)-2b

Aceite viscoso (cera), amarillento.

HPLC: Tiempo de retención rt = 44.66 minutos en hexano/acetato de etilo

(7:3) con flujo de 1.1 ml/mto. en columna analítica de gel de sílice.

[\alpha]^{25}_{D} (CHCl_{3}, c = 2 mg/mL) - 34

IR \nu_{max} (cm^{-1}): 2936 (\nu C=C-H), 2861 (\nu C-C-H), 1768 (\nu C=O), 1747 (\nu C=O), 1213 (\nu C-O).

EM m/z (intensidad relativa): 381 (0.5) [M+1]^{+}, 338 (0.6), 337 (0.8), 320 (38), 278 (46), 261 (82), 219 (90), 176 (98), 137 (100).

EMAR: Observado m/z = 320.0895, C_{16}H_{16}O_{7} [M-CH_{3}CO_{2}H]^{+} calculado para m/z = 320.0896

^{1}H-RMN (400 MHz, CDCl_{3}): \delta (ppm): 2.09 (3H, s, CH_{3} acetato en C-4), 2.11 (3H, s, CH_{3} acetato en C-3), 2.28 (6H, s, 2CH_{3} acetato en C-3',4'), 3.97 (1H, dd, J = 10.3,5.6 Hz, H-5e), 4.43 (1H, dd, J = 10.3, 5.6 Hz, H-5d), 4.94 (1H, d, J = 7.0 Hz, H-2c), 5.03 (1H, dd, J = 6.8, 5.2 Hz, H-3b), 5.41 (1H, ddd, J = 5.3, 5.2,4.0 Hz, H-4a), 7.17 (1H, d, J = 8.4 Hz, H - 5'), 7.23-727 (2H, H-2', H-6'). La estereoquímica relativa de los centros C-2, C-3, C-4 y C-5 se asignó por análisis de los efectos NOE-DIF.

^{1}H-RMN (400 MHz, (CD_{3})_{2}CO): \delta (ppm) 2.04 (3H, s, CH_{3} acetato en C-4), 2.09 (3H, s, CH_{3} acetato en C-3), 2.26 (3H, s, CH_{3} acetato en C-4'), 2.27 (3H, s, CH_{3} acetato en C-3'), 3.95 (1H, dd, J = 10.2, 3.5 Hz, H - 5e), 4.51 (1H, dd, J = 10.2, 5.3 Hz, H - 5d), 4.93 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-2c), 5.07 (1H, dd, J = 7.4,5.3 Hz, H-3b), 5.44 (1H, ddd, J = 5.2,5.2,3.5 Hz, H-4a), 7.23 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-5'), 7.30 (1H, dd, J = 2.1,0.64 Hz, CH - 2'), 7.34 (1H, ddd, J = 8.3, 2.1, 0.64 Hz, H-6').

^{13}C-RMN (400 MHz, CDCl_{3}): \delta (ppm) 20.61 (2c, acetatos en C-3',4'), 20.69 (2c, acetatos en C-3,4), 71.08 (t, C-5 y d, C-4), 77.16 (d, C-2), 80.35 (d, C-3), 120.93 (d, C-5'), 123.58 (d, C-2'), 123.83 (d, C-6'), 137.47 (s, C-1'), 141.81 (s, C-4'), 142.18 (s, C-3'), 168.04 (s, C=O acetato en C-4'), 168.19 (s, C=O acetato en C-3'), 169.84 (s, C=O acetato en C-4), 169.95 (s, C=O acetato en C-3)

Ejemplo 2 Síntesis racémica de (\pm)-DFTD ((\pm)-2a) y de su tetracetato ((\pm)-2b) A. Preparación de 3',4'-bis-(tert-butil-dimetil-silaniloxi)-benzaldehído (4)

A una disolución del compuesto 3,4-dihidroxibenzaldehído (3) (1000 mg, 7.24 mmol) e imidazol (1971 mg, 28.96 mmol) en tetrahidrofurano seco (10 mL), en atmósfera inerte de argón y a 0ºC, se le añade una disolución de cloruro de t-butildimetilsililo (2250 mg, 14.5 mmol) en tetrahidrofurano seco (10 mL). Después de 12 horas de reacción, se añade agua y se lava con Et_{2}O (3 veces). Las fases orgánicas se reúnen y se lavan con salmuera; a continuación, se secan sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se evapora el disolvente a presión reducida. La posterior purificación por cromatografia en columna sobre gel de sílice del crudo de reacción, utilizando como eluyente una mezcla éter de petróleo/acetato de etilo al 5%, permitió obtener 1859 mg del compuesto 4 (70%).

Datos físicos y espectroscópicos del compuesto 4

Aceite amarillento.

IR (KBr) \nu_{max} (cm^{-1}): 1698 (\nu C=O); 1592 (\nu C=C núcleo aromático); 1256 (\delta_{s} Si-CH_{3}); 841 (\nu Si-CH_{3}).

RMN de ^{1}H (400 MHz, C_{6}D_{6}): \delta (ppm) 0.12 (s, 6H, H_{3}-5''*, H_{3}-6''*), 0.13 (s, 6H, H_{3}-5'''*, H_{3}-6'''*), 0.98 (s, 18H, H_{3}-2'', H_{3}-3'', H_{3}-4'', H_{3}-2''', H_{3}-3''', H_{3}-4'''), 6.77 (d, J = 8.2 Hz, 1H, H-5'), 7.11 (dd, J= 1.6, 8.2 Hz, 1H, H-6'), 7.56 (d, J = 1.6 Hz, 1H, H-2', 9.66 (s, 1H, H-1). *Señales intercambiables.

RMN de ^{13}C (100 MHz, C_{6}D_{6}): \delta (ppm) -4.15 (c, C-5''*, C-6''*), -4.12 (c, C-5'''*, C-6''*), 18.5 (s, C-1'''*), 18.6 (s, C-1'''*), 25.9 (c, C-2''*, C-3''*, C-4''*), 26.0 (c, C-2'''*, C-3'''*, C-4'''*), 120.6 (d, C-2'), 121.2 (d, C-5'), 125.3 (d, C-6'), 131.8 (s, C-1'), 148.0 (s, C-4'), 153.0 (s, C-3'), 189.7 (d, C-1). HMBC (selección de correlaciones): C-1'\rightarrow H-5'; C-3' \rightarrow* H-2', H-5'; C-4' \rightarrow 4 H-2', H-5'. * Señales intercambiables.

MS (E.I.) m/z (intensidad relativa): 366 [M]^{+}. (0.58); 309 (59); 253 (12); 195 (21); 193 (15); 179 (15); 73 (100).

B. Preparación de 1-[(3',4'-bis-(tert-butil-dimetil-silaniloxi)-fenil)]prop-2-en-1-ol (5)

Se disuelve el compuesto 4 (697 mg, 1.9 mmol) en tetrahidrofurano seco (5 mL), en atmósfera inerte de argón y a 0ºC. A continuación se adiciona bromuro de vinilmagnesio (9.5 mL, 9.5 mmol). Transcurridas 2 horas de reacción, se añaden, con cuidado, 20 mL de una disolución saturada de NH_{4}Cl; a continuación se elimina el disolvente a presión reducida, se diluye con Et_{2}O y se lava con salmuera. La disolución etérea obtenida tras decantar se seca sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se evapora el disolvente a presión reducida. La purificación del crudo de reacción mediante cromatografia en columna sobre gel de sílice, eluyendo con una mezcla éter de petróleo/acetato de etilo de polaridad creciente, desde 100% hexano hasta al 5% de éter de petróleo/acetato de etilo, permite obtener 340 mg del producto 5 (45%).

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Datos espectroscópicos del compuesto 5

Aceite amarillento.

IR (KBr) \nu_{max} (cm^{-1}): 3350 (\nu O-H); 1574 (\nu C=C); 1508 (\nu C=C núcleo aromático); 1254 (\delta_{s} Si-CH_{3}); 835, 780 (\gamma Si(CH_{3})_{3}).

RMN de ^{1}H (300.03 MHz, C_{6}D_{6}): \delta (ppm) 0.18 (s, 6H, H_{3}-5''*, H_{3}-6''*), 0.21 (s, 6H, H_{3}-5'''*, H_{3}-6'''*), 1.03 (s, 9H, H_{3}-2''^{\dagger}, H_{3}-3''^{\dagger}, H_{3}-4''^{\dagger}), 1.04 (s, 9H, H_{3}-2'''^{\dagger}, H_{3}-3'''^{\dagger}, H_{3}-4'''^{\dagger}), 1.46 (s_{a}, 1H, OH), 4.88 (dd, J = 1.6, 4.4 Hz, 1H, H-1), 4.97 (ddd, J = 1.6, 1.6, 10.4 Hz, 1H, H-3b), 5.21 (ddd, J = 1.6, 1.6, 17.1 Hz, 1H, H-3a), 5.91 (ddd, J = 1.6, 1.6, 4.4 Hz, 1H, H-2), 6.81 (dd, J = 1.7, 8.1 Hz, 1H, H-6'), 6.87 (d, J = 8.1 Hz, 1H, H-5'), 7.07 (d, J = 1.7 Hz, 1H, H-2').*^{\dagger}, Señales intercambiables.

RMN de ^{13}C (75.44 MHz, C_{6}D_{6}): \delta (ppm) -4.00 (c, C-5''*, C-6''*), -3.99 (c, C-5'*, C-6'''*), 18.62 (s, C-1''^{\dagger},), 18.64 (s, C-1'''^{\dagger},), 26.12 (c, C-2''^{\ddagger}, C-3''^{\ddagger}, C-4''^{\ddagger}), 26.14 (c, C-2'''^{\ddagger}, C-3'''^{\ddagger}, C-4'''^{\ddagger}), 74.7 (d, C-1), 114.0 (t, C-3), 119.9 (d, C-2'^{#}), 120.0 (d, C-5'^{#}), 121.3 (d, C-6'), 137.1 (s, C-1'), 141.3 (d, C-2), 146,6 (s, C-3'), 147.3 (s, C-4'). HMBC (selección de correlaciones): C-1' \rightarrow H-1; C-3' \rightarrow H-2'. *^{\dagger}^{\ddagger}^{#} Señales intercambiables.

MS (E.I.) m/z (intensidad relativa): 394 [M]^{+}. (4); 337 (12); 247 (7); 205 (100); 73 (90).

C. Preparación del 1-[(3',4'-bis-(tert-butil-dimetil-silaniloxi)-fenil))prop-2-enil alfil éter (6)

En atmósfera inerte de argón y a 0ºC, se disuelve el compuesto 5 (3576 mg, 9.1 mmol) en tetrahidrofurano seco (50 mL). A continuación se añade bis-(trimetilsilil)-amiduro de litio ((TMS)_{2}NLi) (1 M, 10 mL) y se agita durante 15 minutos, antes de adicionar bromuro de alilo (1207 mg, 10 mmol). En este momento el sistema se pone a reflujo. Tras 12 horas de reacción, se añaden 50 mL de una disolución saturada de cloruro amónico, y se extrae con AcOEt (2 veces). Los extractos orgánicos se reúnen, se lavan con salmuera, se secan sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se elimina el disolvente a presión reducida. La purificación del crudo de reacción se realiza mediante cromatografia en columna sobre gel de sílice, utilizando como eluyente éter de petróleo/acetato de etilo al 3%. Así se obtienen 2500 mg de material de partida y 1158 mg del producto 6 (98%).

Datos espectroscópicos del compuesto 6

Aceite amarillento.

IR (KBr) \nu_{max} (cm^{-1}): 1509 (\nu C=C núcleo aromático); 1255 (\delta_{s} Si-CH_{3});840, 781 (\gamma Si(CH_{3})_{3}).

RMN de ^{1}H (300.03 MHz, C_{6}D_{6}): \delta (ppm) 0.17 (s, 3H, H_{3}-5''*), 0.18 (s, 3H, 0.22 (s, 3H, H_{3}-6''*), 0.21 (s, 3H, H_{3}-5'''*), 0.22 (s, 3H, H_{3}-6'*), 1.03 (s, 91-1, H_{3}-2''^{\dagger}, H_{3}-3''^{\dagger}, H_{3}-4''^{\dagger}), 1.04 (s, 9H, H_{3}-2''^{\dagger}, H_{3}-3''^{\dagger}, H_{3}-4'''^{\dagger}), 3.88 (m, 2H, H-4a, H-4b), 4.64 (m, 1H, H-1), 5.03 (ddd, J = 1.6, 1.6, 9.6 Hz, 1H, H-3b), 5.05 (ddt, J = 1.6, 1.6, 9.4 Hz, 1H, 11-6b), 5.25 (ddd, J= 1.6, 1.6, 17.3 Hz, 1H, H-3a), 5.30 (ddt, J= 1.6, 1.6, 17.2 Hz, 1H, H-6a), 5.88 (m, 1H, H-5), 5.93 (m, 1H, H-2), 6.86 (dd, J = 1.6, 8.2 Hz, 111, H-6'), 6.89 (d, J = 8.2 Hz, 1H, H-5'), 7.15 (d, J= 1.6 Hz,1H, H-2'). *^{\dagger} Señales intercambiables.

RMN de ^{13}C (75.44 MHz, C_{6}D_{6}): \delta (ppm) -4.0 (c, C-5'', C-6'', C-5''', C- 6'''), 18.6 (s, C-1''*), 18.7 (s, C-1'''*), 26.09 (c, C-2''^{\dagger}, C-3''^{\dagger}, C-4''^{\dagger}), 26.14 (c, C-2'''^{\dagger}, C-3'''^{\dagger}, C-4'''^{\dagger}), 69.1 (t, C-4), 81.9 (d, C-1), 115.3 (t, C-3), 115.8 (t, C-6), 120.2 (d, C-2'), 120.7 (d, C-6'), 121.3 (d, C-5'), 135.1 (s, C- 1'), 135.5 (d, C-5), 139.9 (d, C-2), 146.7 (s, C-3'^{\ddagger}), 147.4 (s, C-4'^{\ddagger}). HMBC (selección de correlaciones): C-1' \rightarrow H-6', H-2, H-1. *^{\dagger}^{\ddagger} Señales intercambiables.

MS (E.L) m/z (intensidad relativa): 434 [M]^{+}. (5); 377 (20); 247 (9); 205 (92); 73 (100).

D. Preparación del 2[(3',4'-bis-(tert-butil-dimetil-silaniloxj)-fenil)]-2,5-dihidrofurano (7)

Se disuelve el compuesto 6 (79 mg, 0.2 mmol) en 5 mL de CH_{2}Cl_{2} seco y desgasificado con argón. A continuación, en atmósfera de argón, se añade el catalizador de Grubbs^{1} .(30 mg, 0.04 mmol) y se pone el sistema en agitación y a reflujo. Transcurridas dos horas de reacción, se evapora el disolvente a presión reducida e inmediatamente se realiza una cromatografia en columna de la mezcla de reacción sobre gel de sílice, eluyendo con una mezcla éter de petróleo/acetato de etilo al 2%; de este modo se obtienen 76 mg del compuesto 7 (99.8%).

Datos espectroscópicos del compuesto 7

Aceite amarillento.

IR (KBr) \nu_{max} (cm^{-1}): 1509 (\nu C=C núcleo aromático); 1255 (\delta_{s} Si-CH_{3}); 840, 781 (\gamma Si(CH_{3})_{3}).

\newpage

RMN de ^{1}H (300 MHz, C_{6}D_{6}): \delta (ppm) 0.17 (s, 6H, H_{3}-5''*, H_{3}-6''*), 0.20 (s, 3H, H_{3}-5'''*), 0.21 (s, 3H, H_{3}-6'''*), 1.03 (s, 9H, H_{3}-2''^{\dagger}, H_{3}-3''^{\dagger}, H_{3}-4''^{\dagger}), 1.04 (s, 9H, H_{3}-2'''^{\dagger}, H_{3}-3'''^{\dagger}, H_{3}-4'''^{\dagger}), 4.53 (dddd, J = 1.6, 2.4, 4.0, 12.8 Hz, 1H, H-4a^{\ddagger}), 4.64 (dddd, J = 1.6, 2.4, 6.0, 12.8 Hz, 1H, H-4b^{\ddagger}), 5.50 (m, 1H, H-2), 5.58 (m, 1H, H-3), 5.71 (m, 1H, H-1), 6.79 (dd, J = 2.2, 8.2 Hz, 1H, H-6'), 6.87 (d, J = 8.2 Hz, 1H, H-5'), 7.04 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-2'). *^{\dagger}^{\ddagger} Señales intercambiables.

RMN de ^{13}C (75 MHz, C_{6}D_{6}): \delta (ppm) -4.02 (c, C-5''*, C-6''*), -3.95 (c, C-5'''*, C-6'''*), 18.61 (s, C-1''^{\dagger}), 18.64 (s, C-1'''^{\dagger}), 26.12 (c, C-2''^{\ddagger}, C-3''^{\ddagger}, C-4''^{\ddagger}), 26.16 (c, C-2'''^{\ddagger}, C-3'''^{\ddagger}, C-4'''^{\ddagger}), 75.6 (t, C-5), 87.7 (d, C-2), 119.95 (d, C-2'), 120.03 (d, C-6'), 121.4 (d, C-5'), 126.6 (d, C-3), 130.6 (d, C-4), 136.6 (s, C-1'), 146.7 (s, C-4'), 147.3 (s, C-3'). HMBC (selección de correlaciones): C-1' \rightarrow H-5', H-2', H-4a^{\ddagger} o H-4b^{\ddagger}; C-4' \rightarrow H-5', H-6'; C-3' \rightarrow H-2'. *^{\dagger}^{\ddagger} Señales intercambiables.

MS (E.I.) m/z (intensidad relativa): 406 [M]^{+}. (1); 217 (95); 115 (6); 73 (100).

E. Preparación de (2S(R),3S(R),4S(R))-2-[(3',4'-bis-(tert-butil-dimetil-silaniloxi)-fenil)]tetrahidrofurano-3,4-diol (8a) y (2R(S),3S(R),4S(R))-2[(3',4'-bis-(tert-butil-dimetil-silaniloxi)-fenil)]tetrahidrofurano-3,4-diol (8b)

A temperatura ambiente, se disuelve el compuesto 7 (44 mg, 0.11 mmol) en 2 mL de ^{t}BuOH y se añaden N-óxido de trimetilamina (17 mg, 0.15 mmol), piridina (0.01 mL) y agua (1.5 mL). A continuación se adiciona una disolución de OsO_{4} 2.5% en ^{t}BuOH (0.13 mL, 0.01 mmol) y el sistema se pone a reflujo. Tras 24 horas de reacción, se añaden 20 mL de una disolución de bisulfito sódico (20% w/w) y se agita durante 1 hora. Después se evapora el ^{t}BuOH a presión reducida, se extrae la fase acuosa con Et_{2}O (tres veces); se reúnen las fases orgánicas, se lavan con salmuera, se secan sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y el disolvente se evapora a presión reducida. La purificación del crudo de reacción se realiza por cromatografia en columna sobre gel de sílice eluyendo con una mezcla éter de petróleo/acetato de etilo al 20%; de este modo se obtienen 23 mg de una mezcla de dioles, que se purifican posteriormente mediante HPLC (columna analítica), utilizando como eluyente una mezcla de éter de petróleo/acetato de etilo al 15%. Finalmente se obtiene:

\bullet: (2S(R),3S(R),4S(R))-2-[(3',4'-bis-(tert-butil-dimetil-silaniloxi)-fenil)]tetrahidrof irano-3,4-diol (8a) (2.3 mg, 5%).

\bullet: (2R(S),3S(R),4S(R))-2-[(3',4'-bis-(tert-butil-dimetil-silaniloxi)-fenil)]tetrahidrofurano-3,4-diol (8b) (21 mg, rto. 43%).

Datos espectroscópicos del compuesto 8a

Aceite transparente.

RMN de ^{1}H (400 MHz, CD_{3}OD): \delta (ppm) 0.18 (s, 3H, H_{3}-5''*), 0.19 (s, 3H, H_{3}-6''*), 0.20 (s, 6H, H_{3}-5'''*, H_{3}-6'''*), 0.98 (s, 9H, H_{3}-2''^{\dagger}, H_{3}-3''^{\dagger}, H_{3}-4''^{\dagger}), 0.99 (s, 9H, H_{3}-2''^{\dagger}, H_{3}-3''^{\dagger}, H_{3}-4''^{\dagger}), 1.28 (s_{a}, 2H, 2 OH), 3.82 (dd, J = 7.0, 8.4 Hz, 1H, H-5a^{\ddagger}), 3.99 (dd, J = 7.0, 8.4 Hz, 1H, H-5b^{\ddagger}), 4.09 (m, 1H, H-3), 4.46 (ddd, J = 4.8, 7.0, 7.0 Hz, 1H, H-4), 4.78 (d, J = 3.6 Hz, 1H, H-2), 6.81 (2H, H-5', H-6'), 6.97 (d, J = 1.6 Hz, 1H, H-2').*^{\dagger}^{\ddagger} Señales intercambiables.

Datos espectroscópicos del compuesto 8b

Aceite transparente.

IR (KBr) \nu_{max} (cm^{-1}): 3390 (\nu O-H); 1513 (\nu C=C núcleo aromático); 1255 (\delta_{s} Si-CH_{3}); 840, 781 (\gamma Si(CH_{3})_{3}).

RMN de ^{1}H (400 MHz, CD_{3}OD): \delta (ppm) 0.18 (s, 6H, H_{3}-5''*, H_{3}-6''*), 0.19 (s, 3H, H_{3}-5'''*), 0.20 (s, 3H, H_{3}-6'''*), 0.98 (s, 9H, H_{3}-2''^{\dagger}, H_{3}-3''^{\dagger}, H_{3}-4''^{\dagger}), 0.99 (s, 9H, H_{3}-2''^{\dagger}, H_{3}-3''^{\dagger}, H_{3}-4''), 3.82 (m, 1H, H-5a^{\ddagger}), 3.85 (m, 1H, H-3), 4.21 (m, 1H, H-4), 4.25 (m, 1H, H-5b^{\ddagger}), 4.54 (d, J = 7.6 Hz, 1H, H-2), 6.82 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-5'), 6.86 (dd, J = 2.0, 8.4 Hz, 1H, H-6'), 6.89 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H-2').*^{\dagger}^{\ddagger} Señales intercambiables.

RMN de ^{13}C (100 MHz, CD_{3}OD): \delta (ppm) -3.89 (c, C-5''*, C-6''*), -3.83 (c, C-5'''*), -3.79 (c, C-6'''*), 19.3 (s, C-1''^{\dagger}), 19.4 (s, C-1'''^{\dagger}), 26.47 (c, C-2''^{\ddagger}, C-3''^{\ddagger}, C-4''^{\ddagger}), 26.51 (c, C-2'''^{\ddagger}, C-3'''^{\ddagger}, C-4'''^{\ddagger}), 72.4 (d, C-4), 74.4 (t, C-5), 79.9 (d, C-3), 83.9 (d, C-2), 120.2 (d, C-2'), 120.4 (d, C-6'), 122.1 (d, C-5'), 135.5 (s, C-1'), 147.6 (s, C-3'^{#}), 148.0 (s, C-4'^{#}). HMBC (selección de correlaciones): C-1' \rightarrow H-3, H-6'. *^{\dagger}^{\ddagger}^{#} Señales intercambiables.

F. Preparación de (\pm)-2-(3',4'-dihidroxifenil)tetrahidrofurano-3,4-diol, (\pm)-(DFTD) ((\pm)-2a)

En atmósfera inerte de argón, se disuelve el compuesto 8a (9.2 mg, 0.02 mmol) en 2.5 mL de tetrahidrofurano seco; a continuación se añade fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF) en THF (1 M, 0.09 mL, 0.09 mmol)) y el sistema se pone en agitación a temperatura ambiente. Tras 4 horas de reacción, se añade agua y se extrae con porciones de 50 mL de acetato de etilo (tres veces). Las fracciones orgánicas se reúnen y se secan sobre Na_{2}SO_{4} anhidro; finalmente, el disolvente se evapora a presión reducida. La purificación del crudo de reacción mediante cromatografia en columna sobre gel de sílice, utilizando como eluyente una mezcla éter de petróleo/acetona al 50%, permite obtener 2 mg del compuesto (\pm)-2a (47%).

G. Preparación de (\pm)-2-(3',4'-diacetoxifenil)-3,4-diacetoxitetrahidrofurano ((\pm)-2b)

En un vial de 10 mL se disuelve el compuesto ((\pm)-2a) (16 mg, 0.08 mmol) en piridina seca (1 mL) y a continuación se añaden 24 equivalentes de anhídrido acético (189 mg, 1.85 mmol), dejando la mezcla en agitación. Tras 24 h de reacción se añaden 50 mL de AcOEt y la disolución resultante se lava con 50 mL de HCL 2 N (2 veces) y a continuación con una disolución diluída de CuSO_{4} (2 veces). Finalmente, se lava con salmuera, se seca sobre sulfato sódico anhidro y se evapora el disolvente a presión reducida. El crudo de reacción se purifica por cromatografia en columna sobre gel de sílice, utilizando como eluyente una mezcla éter de petróleo/acetato de etilo al 20%. De este modo obtenemos 1.6 mg del compuesto ((\pm)-2b) (5%); los datos espectroscópicos de este compuesto concuerdan con los del producto natural acetilado aislado de la cepa del fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides 20122.

Ejemplo 3 Evaluación de la actividad antioxidante; detección de atrapadores de radicales libres en cromatografia en capa fina

Se prepara una disolución del radical 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) en metanol (3 mg en 100 ml). A continuación, sobre una placa de cromatografia en capa fina de gel de sílice, se añaden 1 \muL de una disolución de 1 mg de DFTD en 100 \muL de metanol y un control de 1 \muL de MeOH, y se deja evaporar el disolvente. Seguidamente, se rocía la placa con la disolución anterior. Se deja reposar la placa, que adopta una coloración violeta, salvo en la zona donde se había colocado la alícuota de DFTD, donde se observa la rápida desaparición del color violeta, hasta que sólo se aprecia una zona de aproximadamente 1 cm de diámetro, en la que ha desaparecido por completo el color violeta. Esta pérdida de coloración es persistente con el tiempo (al menos 12 h).

Claims

1. Compuestos de fórmula general 1 (figura 1), donde R puede ser H, cadenas ó ciclos que pueden contener átomos de carbono, hidrógeno u otros heteroátomos.

1

2. Un compuesto nuevo, (-)-2-(3',4'-dihidroxifenil)tetrahidrofurano-3,4-diol ((-)-2a), y su tetraacetato ((-)-2b), según reivindicación 1, donde R es hidrógeno ((-) 2a) ó acetilo ((-) 2b).

2

3. Uso de compuestos de fórmula 1, según reivindicación 1, donde R puede ser H, cadenas ó ciclos que pueden contener átomos de carbono, hidrógeno u otros heteroátomos, como antioxidantes.

4. Un proceso para el aislamiento de un compuesto nuevo, denominado (-)-2-(3',4'-dihidroxifenil)tetrahidrofurano-3,4-diol ((-)-2a) y de su tetracetato ((-)-2b)), a partir del hongo fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides, que consta de los siguientes pasos:

a): El cultivo en medio líquido del hongo C. gloeosporioides.

b): La filtración del micelio y posterior extracción del caldo de cultivo resultante del apartado a).

c): Una separación inicial del extracto crudo obtenido del apartado b), mediante fraccionamiento por cromatografia en columna con gel de sílice como fase estacionaria y empleando como eluyentes disolventes de polaridad creciente (éter de petróleo, diclorometano, acetato de etilo y metanol).

d): La derivatización (metilación y acetilación) de las fracciones procedentes del tratamiento con acetato de etilo según el apartado c).

e): El análisis y separación de las fracciones obtenidas según el apartado c) y de las derivatizadas según el apartado d) mediante cromatografia en columna y HPLC.

5. Un procedimiento para preparar compuestos de formula general 1 (figura 1), según reivindicación 1, incluidos los compuestos ((+/-)2a) y ((+/-)2b), que implica un procedimiento de síntesis secuencial que consta de los siguientes pasos:

a): La protección de los grupos hidroxilo del 3,4-dihidroxibenzaldehido (3).

b): La vinilación del producto resultante del apartado a).

c): La introducción de un grupo prop-2-enilo mediante una O-alilación sobre el producto resultante del apartado b).

d): Una reacción de metátesis de cierre de anillo sobre la diolefina no conjugada anteriormente preparada según el apartado c).

e): Una dihidroxilación estereoselectiva sobre el sistema de dihidrofurano anteriormente preparado según el apartado d)

f): Reacciones de desprotección/derivatización para dar compuestos como (\pm)-DFTD ((\pm)-2a) o derivados como el tetracetato de DFTD ((\pm)-2b).