ES2261507T3

ES2261507T3 - Compuestos derivados de phyllanthus para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con un retrovirus.

Info

Publication number: ES2261507T3
Application number: ES01986262T
Authority: ES
Inventors: Ralf Wagner; Frank Notka
Original assignee: Phytrix Inc
Current assignee: Phytrix Inc
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2001-10-05
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2021-10-05
Also published as: DE60118592T2; JP2004513092A; EP1333848B1; EP1333848A1; CA2424869A1; PT1333848E; DE60118592D1; US20040161477A1; ATE322278T1; WO2002028403A1; AU2002220594A1

Abstract

Uso de un extracto de Phyllanthus o una fracción del mismo, o un galotanino o una combinación de galotaninos, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con retrovirus asociadas a un retrovirus resistente a un inhibidor nucleosídico y/o a un retrovirus resistente a un inhibidor no nucleosídico.

Description

Compuestos derivados de Phyllanthus para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con un retrovirus.

La presente invención se refiere al uso de un extracto de Phyllanthus o una fracción del mismo, o un galotanino o una combinación de galotaninos, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con retrovirus asociadas a un retrovirus resistente a un inhibidor nucleosídico y/o a un retrovirus resistente a un inhibidor no nucleosídico. Preferiblemente, el retrovirus es un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Según la presente invención, adicionalmente se prefiere que dicho galotanino o combinación de galotaninos sea o comprenda corilagino y/o geraniíno y/u otro elagitanino. Adicionalmente se prefiere que dicho Phyllanthus sea Phyllanthus amarus.

Las infecciones por retrovirus pueden provocar enfermedades graves y a menudo dan como resultado la muerte de seres humanos. Los retrovirus patógenos para el hombre incluyen el virus del sarcoma de Rous, el virus de la leucemia humana de los linfocitos T (HTLVI y HTLVII) así como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En particular, el VIH es una preocupación importante para las autoridades sanitarias debido a su dispersión, a su modo de infección y a que hasta la fecha no se ha identificado satisfactoriamente una cura. Actualmente, el tratamiento de los pacientes infectados por el VIH se basa en una politerapia que es cara y que puede dar lugar a cepas resistentes del VIH tras una progresión prolongada de la terapia.

Los extractos de Phyllanthus o los componentes derivados de Phyllanthus han sido descritos como agentes antivíricos en la materia. Así, el documento US-A 4.937.074 (Venkateswaran y col.) refiere que los extractos de Phyllanthus niruri pueden inhibir la actividad de transcriptasa inversa (RT) de retroviruses tales como el VIH. El extracto puede obtenerse extrayendo plantas completas con metanol u otros disolventes convencionales. Uchiumi y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 220 (1996), 411-417 describen el uso de ácidos tánicos para la supresión de la actividad promotora del VIH. Liu y col., Planta Med. 65 (1999), 43-46 describen que la variedad de elagitaninos tales como corilagino y geraniíno tienen un fuerte efecto inhibidor sobre la transcriptasa inversa del VIH. Hirayama, en el documento US-A 5.159.060, describe el uso de taninos sulfatados para inhibir la transcriptasa inversa de retrovirus.

Todos los informes anteriores se basan en la inhibición de la dispersión del virus o de la actividad de la RT en retrovirus naturales. Tales virus normalmente son susceptibles a los inhibidores nucleosídicos o a los inhibidores no nucleosídicos. Se ha observado que después del tratamiento con dichos inhibidores o combinaciones de dichos inhibidores el VIH puede desarrollar resistencia a la terapia. Una vez que los virus muestran resistencia frente a dichos inhibidores, las metodologías terapéuticas actuales habitualmente fallan.

Consecuentemente, el problema técnico subyacente en la presente invención era proporcionar nuevas metodologías para tratar o prevenir infecciones por retrovirus que son resistentes a los inhibidores nucleosídicos o no nucleosídicos. La solución a dicho problema técnico es proporcionada por las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones.

Consecuentemente, la presente invención se refiere al uso de un extracto de Phyllanthus o una fracción del mismo, o un galotanino o una combinación de galotaninos, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con retrovirus asociadas a un retrovirus resistente a un inhibidor nucleosídico y/o a un retrovirus resistente a un inhibidor no nucleosídico.

La presente invención también se refiere al uso de un extracto de Phyllanthus o una fracción del mismo, o un galotanino o una combinación de galotaninos, para la preparación de una composición farmacéutica para la inhibición de la replicación de un retrovirus resistente a un inhibidor nucleosídico y/o de un retrovirus resistente a un inhibidor no nucleosídico.

La presente invención se refiere adicionalmente al uso de un extracto de Phyllanthus o una fracción del mismo, o un galotanino o una combinación de galotaninos, para la preparación de una composición farmacéutica para la inhibición de la captación del virus de un retrovirus resistente a un inhibidor nucleosídico y/o de un retrovirus resistente a un inhibidor no nucleosídico.

La composición farmacéutica preparada según la presente invención puede comprender adicionalmente un vehículo y/o un diluyente farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son conocidos en la materia e incluyen disoluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, disoluciones estériles, etc.. Las composiciones que comprenden dichos vehículos pueden formularse mediante procedimientos convencionales conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse mediante diferentes vías, por ejemplo, mediante administración por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal o intrabronquial. El régimen de dosificación será determinado por el médico y los factores clínicos. Como se sabe en la materia médica, las dosis de cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de la superficie corporal, la edad, el compuesto en particular que se va a administrar, el género, el tiempo y la vía de administración, el estado general de salud y de otros fármacos que se estén administrando simultáneamente. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 150 a 1200 mg; sin embargo, se contemplan dosis por encima por debajo de este intervalo ejemplar, considerando especialmente los anteriormente mencionados factores. Generalmente, el régimen de administración regular de la composición farmacéutica debería estar en el intervalo de 3 a 6 unidades al día. El progreso puede ser monitorizado mediante una evaluación periódica. Las composiciones pueden administrarse local o sistémicamente. La administración será generalmente por vía oral, en el intervalo de dosificación indicada anteriormente. Las preparaciones para su administración por vía parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Algunos ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales, aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Algunos vehículos acuosos incluyen agua, disoluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados. Algunos vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa en cloruro sódico, Ringer-lactato o aceites fijados. Algunos vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. También puede haber presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelatantes, y gases inertes y similares.

El término "enfermedades relacionadas con retrovirus asociadas a un retrovirus resistente a un inhibidor nucleosídico y/o a un retrovirus resistente a un inhibidor no nucleosídico" se refiere a enfermedades o estados de enfermedad que son inducidos por o están coasociados a dichos retrovirus resistentes a inhibidores. Por ejemplo, dichas enfermedades o estados de enfermedad pueden haber sido inducidos por cepas de un retrovirus no resistente y controlado con un tratamiento adecuado, pero pueden haberse inducido cepas resistentes. Debido a los efectos patógenos de dichos retrovirus resistentes que pueden haber sido inducidos previamente, la enfermedad o el estado de enfermedad puede deteriorarse. Además, dichas enfermedades o estados de enfermedad pueden haber sido inducidos por retrovirus resistentes, tras una infección primaria con retrovirus resistentes. Es importante mencionar que el término "resistente" también incluye una resistencia parcial, típicamente una resistencia de al menos el 10%.

El término "captación del virus de un retrovirus resistente a un inhibidor nucleosídico y/o de un retrovirus resistente a un inhibidor no nucleosídico" se refiere a la entrada de un retrovirus en su célula objetivo. Se ha demostrado que un retrovirus entra en su célula objetivo mediante un proceso que comprende al menos tres etapas consecutivas. La primera etapa implica la unión del retrovirus a moléculas de la superficie de su célula objetivo. El VIH, por ejemplo, se une a sus células objetivo a través de las glucoproteínas víricas gp4l y gp120. En una etapa adicional, el virus es captado por la cédula objetivo mediante un mecanismo que implica la endocitosis de la partícula vírica en dicha célula objetivo. En la siguiente etapa el virus es desprovisto de su cubierta, y su material genético del ARN y la enzima transcriptasa inversa codificada por el virus son liberados en el citoplasma. La transcriptasa inversa comienza el ciclo de replicación del retrovirus transcribiendo el material genético del ARN en el provirus de ADN, que posteriormente es integrado en el genoma de la célula objetivo. Las células objetivo de los retrovirus son células que son capaces de unirse al retrovirus a través de moléculas de la superficie celular. Por ejemplo, dichas células objetivo son células CD4 positivas en el caso del VIH-1.

Según la presente invención, se ha averiguado que los extractos de Phyllanthus inhiben de forma eficaz la replicación de retrovirus que son resistentes a inhibidores nucleosídicos y/o a inhibidores no nucleosídicos mediante la inhibición de la infección de los linfocitos T CD4. Además, se ha averiguado que además de la replicación del virus, también se inhibía significativamente la captación del virus por parte de las células objetivo. Sorprendentemente, se encontró que los extractos, fracciones y galotaninos anteriormente mencionados eran tan eficaces, o eran más eficaces, contra varias cepas de NRTI (inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa), varias cepas de NNRTI (inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa) y una cepa de VIH-2 en comparación con la cepa de VIH-1 natural, lo que demuestra un potencial protector inusualmente amplio. Ventajosamente, los extractos de Phyllanthus o fracciones del mismo, o galotaninos o una combinación de galotaninos, son capaces de inhibir simultáneamente al menos dos etapas clave del ciclo de vida de un retrovirus, a saber, la captación y la transcripción inversa, in vitro.

En una forma de realización preferida del uso de la invención, dicho retrovirus es un VIH, un virus del sarcoma de Rous o un HTLV I o II.

El VIH puede ser un VIH-1 o un VIH-2. Particularmente se prefiere que dicho VIH sea un VIH-1.

El extracto de Phyllanthus puede prepararse según procedimientos convencionales conocidos en la materia; véase, por ejemplo, Liu y col., loc. cit. Hirayama y col., loc. cit., Venkateswaran y col., loc. cit. Preferiblemente, dicho extracto es un extracto en agua, un extracto en alcohol, un extracto en agua-alcohol, un extracto en hexano o un extracto en CO_{2}.

Adicionalmente se prefiere que los compuestos de Phyllanthus usados como principios activos no sean destruidos durante el proceso de extracción. Dichos procesos de extracción son conocidos en la materia y se han mencionado en este documento anteriormente como referencia.

Lo que más se prefiere es que dicho alcohol sea metanol o etanol.

Adicionalmente se prefiere según la invención que dicha fracción sea una fracción de proteína o una fracción de galotanino. Las fracciones de proteína también pueden obtenerse según protocolos convencionales. Los protocolos apropiados para obtener fracciones de galotanino también son conocidos en la materia; véase, por ejemplo, Liu y col., loc. cit. Por ejemplo, pueden calentarse 100 g de sustancia farmacéutica recién pulverizada con 1000 ml del metanol destilado durante dos horas en un matraz redondo. Después de enfriar, la disolución se filtra a través de lana de algodón. El sedimento sólido se calienta posteriormente dos veces con 500 ml de metanol seguido de una decantación después de enfriar. Los extractos metanólicos combinados se secan posteriormente en un evaporador rotatorio. El sedimento seco puede resuspenderse en 200 ml de agua destilada y someterse a un tratamiento con ultrasonidos durante tres minutos. La suspensión así obtenida puede extraerse tres veces con 100 ml de diclorometano. Las fases de diclorometano combinadas se extraen posteriormente con 100 ml de agua destilada. Las fases acuosas se combinan, se elimina aproximadamente la mitad del líquido en un evaporador rotatorio, y el producto de este proceso se liofiliza posteriormente. Una cantidad típica de fracción de galotanino obtenida es
10,5 g.

Adicionalmente se prefiere según la presente invención que dicho galotanino sea, o dicha fracción de galotanino comprenda, corilagino.

También se prefiere que dicho galotanino sea, o dicha fracción de galotanino comprenda, geraniíno.

Adicionalmente se prefiere que dicho galotanino sea, o dicha fracción de galotanino comprenda, ácido elágico.

Adicionalmente se prefiere que dicho galotanino sea, o dicha fracción de galotanino comprenda, ácido brevifolincarboxílico.

Según la presente invención se prefiere adicionalmente que dicho galotanino sea, o dicha fracción de galotanino comprenda, otro elagitanino. Algunos ejemplos de elagitaninos adicionales son ácido quebulágico, elaeocarpusino, malotusinino, filantusiíno y 1-galoil-3, 6-hexahidrodifenoil-4-0-brevifolincarboxil-\beta-D-glucopiranosa.

En otra forma de realización preferida del uso de la invención, dicha combinación de galotaninos o dicha fracción de galotanino comprende al menos dos, tal como tres, cuatro o cinco de corilagino, geraniíno, ácido elágico y ácido brevifolincarboxílico y opcionalmente otro elagitanino. Las cantidades relativas de coraligino, geraniíno, ácido elágico y ácido brevifolincarboxílico y opcionalmente dicho otro elagitanino puede variar en la composición farmacéutica. Se prefiere que al menos estén presentes tres elagitaninos diferentes, incluyendo corilagino y geraniíno, en dicha composición farmacéutica.

En otra forma de realización preferida del uso de la presente invención, dichos galotaninos están formulados en dicha composición farmacéutica en una concentración final del 0,1 al 99,9%, preferiblemente del 1 al 95%. Esto es particularmente cierto para la administración por vía oral.

También se prefiere que dicho extracto o dicha fracción esté presente en una concentración final del 0,1 al 99,9%, preferiblemente del 1 al 95% en dicha composición farmacéutica. Esto es particularmente cierto para la administración por vía oral.

Cuando dicho Phyllanthus pueda pertenecer a una variedad de especies diferentes de Phyllanthus (todas las cuales están comprendidas en la presente invención), se prefiere que dicho Phyllanthus sea Phyllanthus amarus.

La presente invención también se refiere al uso en el tratamiento de pacientes afectados por una enfermedad causada por o asociada a un retrovirus que es resistente a inhibidores de la transcriptasa inversa nucleosídicos o no nucleosídicos que comprende la administración de una cantidad adecuada de un extracto de Phyllanthus o una fracción del mismo, o un galotanino o una combinación de galotaninos, a dicho paciente. Preferiblemente, dicho retrovirus es un VIH, más preferiblemente un VIH-1. También se prefiere que dicho galotanino sea corilagino o geraniíno u otro elagitanino o una combinación de los mismos. Se han discutido formas de realización preferidas adicionales del procedimiento de tratamiento de la presente invención en relación con el uso de la invención, y son igualmente aplicables.

Finalmente, en la presente invención se refiere a procedimientos para inhibir la replicación de retrovirus en los que dicho retrovirus es resistente a inhibidores de la transcriptasa inversa nucleosídicos o no nucleosídicos, que comprenden administrar una cantidad adecuada de extracto de Phyllanthus o una fracción del mismo, o un galotanino o una combinación de galotaninos, a dicho paciente infectado por dicho retrovirus. Se han discutido formas de realización preferidas adicionales del procedimiento de inhibición de la presente invención en relación con el uso de la invención, y son igualmente aplicables.

Las Figuras muestran:

Figura 1: representa gráficamente el porcentaje de inhibición (ordenadas) de la transcriptasa inversa del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1, determinado in vitro en función de la concentración de corilagino y geraniíno purificados a partir de P. amarus (\mug/ml) (abscisas).

Figura 2: representa gráficamente el porcentaje de inhibición (ordenadas) de la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 en células MT4 determinado in vitro en función de la concentración de geraniíno purificado a partir de P. amarus (\mug/ml) (abscisas).

Figura 3: representa gráficamente el porcentaje de inhibición (ordenadas) de la replicación de un HX10 natural y una variante ARP145 resistente a inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 en células MT4 determinado in vitro a diferentes concentraciones de geraniíno purificado a partir de P. amarus (\mug/ml) (abscisas).

Figura 4: representa gráficamente el porcentaje de inhibición (ordenadas) de la replicación de un HX10 natural y una variante ARP145 resistente a inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1, y un virus de la inmunodeficiencia humana natural de tipo 2 (VIH-2 rod) en una línea celular indicadora HeLa CD4+ determinado in vitro en función de la concentración de extracto CMI-111 de P. amarus (Ejemplo 7) (\mug/ml) (abscisas).

Figura 5: representa gráficamente el porcentaje de inhibición (ordenadas) de la transcriptasa inversa del virus de la inmunodeficiencia humana 1 determinado in vitro en función de la concentración de extracto CMI-111 de P. amarus (Ejemplo 7) (\mug/ml) (abscisas).

Figura 6: huella molecular de HPLC del extracto seco de Ph. amarus.

Figura 7: huella molecular de HPLC del extracto seco de Ph. amarus + ácido brevifolincarboxílico (4a).

Figura 8: representa gráficamente el porcentaje de reducción de la concentración intracelular de p24 del VIH-1 (=inhibición de la internalización del virus) (ordenadas) en una línea celular indicadora HeLa CD4+ infectada por VIH-1, determinado in vitro en presencia de geraniíno a diferentes concentraciones (\mug/ml) (abscisas). También se describe el porcentaje de reducción para el sulfato de heparina (Hep-S) a una concentración de 100 \mug/ml y para un anticuerpo monoclonal gp120 de \alpha-VIH-1 (dilución final 1:40).

Figura 9: representa gráficamente el porcentaje de reducción de la concentración intracelular de p24 del VIH-1 (=inhibición de la internalización del virus) (ordenadas) en una línea celular indicadora HeLa CD4+ infectada por VIH-1, determinado in vitro en presencia de CMI-111 a diferentes concentraciones (\mug/ml) (abscisas). También se describe el porcentaje de reducción para el sulfato de heparina (Hep-S) a una concentración de 100 \mug/ml y para un anticuerpo monoclonal gp120 de \alpha-VIH-1 (dilución final 1:40).

Figura 10: representa gráficamente el porcentaje de reducción de la unión de gp120 del VIH-1 a CD4 inmovilizados (=inhibición de la unión al receptor del virus) (ordenadas) determinado in vitro en presencia de geraniíno a diferentes concentraciones (\mug/ml) (abscisas).

Figura 11: representa gráficamente el porcentaje de reducción de la unión de gp120 del VIH-1 a CD4 inmovilizados (=inhibición de la unión al receptor del virus) (ordenadas) determinado in vitro en presencia de CMI-111 a diferentes concentraciones (\mug/ml) (abscisas).

Los Ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1 Actividad anti-VIH-1 de galotaninos de P. amarus en ensayos de infección

Se preparó VIH-1 (HX10, Ratner L., y col. (1987; AIDS research and retroviruses 3, 57-69 o HBIO, nº de acceso 15654, Wong-Staal F y col. (1985), Nature 313, 277-284) a partir de un fluido de cultivo condicionado de una línea celular MT4 (Miyoshi I y col. (1982), Gann Monograph on Cancer Res 28: 219; Pauwels R y col. (1987), J. Virol. Methods 16: 171). El fluido de cultivo de clarificó de células mediante centrifugación a baja velocidad (900 x g) y se añadió un volumen igual de suelo bovino fetal (FCS) antes de su almacenamiento a -80°C. La inhibición de la infección del virus por parte del extracto de galotanino de P. amarus y de los galotaninos purificados corilagino y geraniíno se evaluó usando una línea celular indicadora HeLa-CD4-LTR-\beta-gal (Multinuclear activation of galactosidase indicator (MAGI) cells, Kimpton J, Emerman M. (1992), J Virol 66 (4): 2232-2239). En resumen, se colocaron en placas 1,5 x 10^{4} células MAGI/pocillo en placas de cultivo de 48 pocillos y se hicieron crecer hasta el día siguiente. Al día siguiente las células se incubaron con 70 \mul de una estirpe de VIH-1 en 100 \mul en presencia de extracto de galotanino o corilagino o geraniíno a unas concentraciones de 10 \mug/ml, 5 \mug/ml, 2,5 \mug/ml o 1,25 \mug/ml, o en PBS durante 2 horas en una atmósfera humidificada. Entonces se añadieron 200 \mul de medio con o sin sustancia farmacéutica, y las células se incubaron durante 2 días. Las células infectadas fueron detectadas mediante una tinción con 5-bromo-4-cloro-3-inolil-galactopiranósido (X-Gal) de las células que expresaban una \beta-galoctidasa endógena como consecuencia de la infección por el VIH. Las células se fijaron mediante una incubación con glutaraldehído al 0,2% y formaldehído al 1% en PBS durante 5 min. Las células fijadas se lavaron dos veces con PBS y se cubrieron con la disolución de tinción (ferricianuro potásico 4 mM, ferrocianuro potásico 4 mM, MgCl_{2} 2 mM y X-Gal 0,4 mg/ml) durante 30 min a 37°C. El número de células azules se determinó mediante una observación al microscopio (para los detalles véase Kimpton J, Emerman M. (1992). J Virol 66 (4): 2232-9). La actividad antivírica se calculó a partir de la proporción entre las células teñidas de azul con y sin extracto, y se da como porcentaje de inhibición. Las pruebas se realizaron por triplicado. La inhibición de la infección se refiere en la tabla 1. Como puede observarse a partir de la tabla 1, los galotaninos inhiben la replicación del VIH-1 de una forma dependiente de la dosis.

TABLA 1 Efectos de los galotaninos de P. amarus en un ensayo indicador de la infección por VIH-1

	% de inhibición
	Concentración
Inhibidor	10 \mug/ml	5 \mug/ml	2,5 \mug/ml	1,25 \mug/ml
Extracto de galotanino	94 \pm 1	81 \pm 1	63 \pm 6	23 \pm 1
Corilagino	85 \pm 7	73 \pm 9	38 \pm 13	9 \pm 16
Geraniíno	98 \pm 3	93 \pm 5	80 \pm 4	66 \pm 8

Ejemplo 2 Inhibición de la transcriptasa inversa del VIH-1 in vitro usando galotaninos de P. amarus

El efecto inhibidor de los galotaninos de P. amarus corilagino y geraniíno sobre la transcriptasa inversa (RT) del VIH-1 recombinante se determinó mediante un ensayo de RT disponible comercialmente (Screen RTA, Retro-Tech GmbH, UnterschleiBheim, Alemania), que utiliza la incorporación de nucleótidos biotinilados en el ADN como una medida de la transcriptasa inversa. El reactivo de la RT recombinante (5 mU) se incubó con corilagino o geraniíno a unas concentraciones de 10 \mug/ml, 5 \mug/ml, 2,5 \mug/ml o 1,25 \mug/ml, o en PBS durante 2 h, y se midió la actividad de la RT según el protocolo del fabricante. La inhibición de la RT del VIH-1 recombinante por parte de los galotaninos de P. amarus está representada gráficamente en la Figura 1. A partir de la Figura 1 puede observarse que el aumento en la inhibición es lineal con el aumento en la concentración de los galotaninos hasta 10 \mug/ml, punto en el cual la inhibición es >80% para geraniíno y >35% para corilagino.

Ejemplo 3 Actividad anti-VIH-1 de geraniíno en ensayos de infección

Se usó la estirpe de VIH-l descrita en el Ejemplo 1 para evaluar el efecto inhibidor del geraniíno de P. amarus sobre la infección de células linfoides CD4+ (MT4). Se determinó la dosis infecciosa en cultivo de tejidos al 50% (TCID_{50}) mediante infección de las células MT4 con diluciones seriadas de la estirpe del virus y la posterior cuantificación del contenido en p24 vírica en el fluido celular (ELISA del perfil del núcleo de p24 del VIH-1, NEN, Zaventem, Bélgica). Las células MT4 fueron infectadas con aprox. 100 TCID_{50} en presencia de geraniíno de P. amarus purificado a unas concentraciones de 5 \mug/ml, 2,5 \mug/ml, 1,25 \mug/ml, 0,63 \mug/ml y 0,31 \mug/ml. Previamente se había determinado que el geraniíno no era tóxico a estas concentraciones. Las células objetivo MT4 se incubaron durante 7 días en presencia del virus y del inhibidor, y se añadió medio nuevo (que contenía sustancias farmacéuticas) cada dos días. Las infecciones se monitorizaron mediante la cuantificación del contenido en p24 en el fluido celular. Las muestras sin un contenido en p24 detectable (en comparación con los inhibidores de referencia y con los controles negativos no infectados) fueron consideradas completamente protegidas frente a la infección. Por otro lado, el contenido en p24 en el fluido se correlacionaba negativamente con la protección. Cada experimento se realizó por triplicado. La Figura 2 describe gráficamente los resultados de dos pruebas independientes (medias, las barras de error reflejan la desviación típica). A partir de la Figura 2 puede observarse que una concentración creciente de geraniíno da como resultado una inhibición creciente, con una inhibición completa a una concentración de 1,25 \mug/ml.

Ejemplo 4 Actividad anti-VIH-1 de geraniíno sobre una cepa de VIH-1 resistente a inhibidores de la RT en ensayos de infección

Esencialmente se usó el mismo experimento al descrito en el Ejemplo 3 para determinar el efecto inhibidor del geraniíno sobre una cepa de VIH-1 resistente a inhibidores nucleosídicos de la RT (NRTI). La cepa, denominada ARP145 (Tisdale y col. (1993), Proc Nat Acad Sci (EE.UU.) 90 (12): 5653-5656), se obtuvo del NIBSC (MRC) y se caracteriza fenotípicamente por una resistencia a 3TC/FTC. Se infectaron células MT4 con aprox. 100 TCID_{50} de HX10 o de ARP145 en presencia del geraniíno de P. amarus purificado a unas concentraciones de 5 \mug/ml, 2,5 \mug/ml, 1,25 \mug/ml y 0,63 \mug/ml. La inhibición de la cepa resistente y de la cepa parental natural (HX10) está representada gráficamente en la Figura 3. No se observaron diferencias significativas en la inhibición de la cepa natural o resistente a los NRTI por parte del geraniíno.

Ejemplo 5 Actividad anti-VIH-1 del extracto de Phyllanthus amarus sobre una cepa de VIH-1 y de VIH-2 resistente a inhibidores de la RT en ensayos de infección

Esencialmente se usó el mismo experimento al descrito en el Ejemplo 1 para determinar el efecto inhibidor de un extracto de Phyllanthus preparado según se describe en el Ejemplo 7 sobre una cepa de VIH-2 (ROD, Clavel F y col. (1986), Science 233: 343; Guyader M y col. (1987), Nature 326: 662) y una cepa de VIH-1 (ARP145) resistente a inhibidores nucleosídicos de la RT (NRTI). Se infectaron células MAGI con 70 \mul de la correspondiente estirpe de virus en presencia del extracto a unas concentraciones de 5 \mug/ml, 2,5 \mug/ml, 1,25 \mug/ml y 0,63 \mug/ml (en disolución salina tamponada con fosfato). La inhibición de la cepa de VIH-2, de la cepa resistente a los NRTI y de la cepa parental natural (HX10) está representada gráficamente en la Figura 4. No se observó una disminución de la inhibición en la inhibición de la cepa de VIH-2 o la cepa de VIH-1 resistente a los NRTI en comparación con la cepa natural del VIH-1 por parte de extracto. Por el contrario, la inhibición del VIH-2 se incrementó. La inhibición de la cepa resistente a los NRTI estaba incluso más incrementada.

Ejemplo 6 Inhibición de la transcriptasa inversa del VIH-1 in vitro usando extracto de Phyllanthus amarus

El efecto inhibidor del extracto de P. amarus (Ejemplo 7) sobre la transcriptasa inversa (RT) del VIH-1 recombinante se determinó esencialmente de la misma forma a la descrita en el Ejemplo 2. Sin embargo, en este experimento se usó un ensayo de la RT diferente (Reverse Transcriptase Assay, no radioactivo, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). El reactivo de la RT recombinante (2,5 mU) se incubó con el extracto a unas concentraciones de 10 \mug/ml, 5 \mug/ml, 2,5 \mug/ml o 1,25 \mug/ml, o en PBS durante 1 h, y se midió la actividad de la RT según el protocolo del fabricante. La inhibición de la RT del VIH-1 recombinante por parte del extracto está representada gráficamente en la Figura 5. A partir de la Figura 5 puede observarse que la inhibición de la RT del VIH-1 recombinante es dependiente de la dosis. A una concentración de extractos de 10 \mug/ml, la inhibición es prácticamente completa (>98%).

Ejemplo 7 Preparación del extracto de Phyllanthus amarus

Se extrajeron hojas secas completas sin cortar en recipientes de acero con una proporción entre la sustancia farmacéutica y el disolvente de 1:10 (+/-3) de etanol al 50% (v/v) durante entre 1 y 3 horas a 30-40°C. Los residuos de sustancias farmacéuticas se separaron y después se lavaron con entre 1 y 3 partes de agua. El eluido etanólico y el agua se combinaron. Entonces se añadió hidrogenocitrato disódico (1-3% m/m) y el líquido se filtró posteriormente a través de una membrana. Se añadió Sterculia en polvo (predisuelta en etanol/agua) al líquido del extracto (concentración final del 0,5-5% m/m). A continuación el líquido se evaporó a presión reducida (aprox. 300 mbar disminuyendo hasta 20 mbar), a una temperatura de evaporación de 30 a 60°C (+/-5°C) hasta que se alcanzó un contenido en material seco del 20-40% en peso seco (m/m). Posteriormente el extracto blando se mezcló con maltodextrina (28-39% m/m) hasta que apareció una suspensión homogénea. La mezcla se procesó a través de una unidad de calentamiento corto para la reducción de la contaminación microbiana a una temperatura de 80-120°C y con una duración de 20-40 s. la mezcla se secó exhaustivamente hasta que el contenido en agua era menor del 5%. Durante el proceso de secado la temperatura de salida de la unidad de secado no superó los 90°C (+/- 5%) (="temp. del producto"). Se añadió sílice (0,5-3% m/m) durante el proceso de secado y después del proceso de secado. El producto seco se mezcló y posteriormente se tamizó.

Ejemplo 8 Purificación de compuestos a partir de Phyllanthus amarus 1. Procedimiento de aislamiento

El material de partida para el aislamiento del ácido brevifolincarboxílico fue el extracto preparado según el Ejemplo 7.

El extracto seco se disolvió en etanol acuoso al 50% y se centrifugó para eliminar el material insoluble y los finos. El sobrenadante claro se aplicó a una columna Sephadex LH20 ejecutada con metanol acuoso al 20%. La fracción X purificada a partir de la cromatografía en columna se concentró en un evaporador rotatorio y se liofilizó.

2. Procedimiento de identificación

El compuesto X purificado se identificó mediante espectroscopía UV y RMN-^{13}C. Los principales picos en UV eran a 278, 350 y 362 nm, totalmente de acuerdo con los datos de la bibliografía (M. A. M. Nawwar y col. Phytochemistry 36 (3), 793-798, 1994). Nuestros datos de RMN confirman la existencia de átomos de ^{13}C y la estructura del ácido brevifolincarboxílico según se describe en Phytochemistry (véase anteriormente). El extracto se sometió a un análisis mediante HPLC (Fig. 6). Se proporcionaron pruebas adicionales añadiendo a la huella molecular de HPLC original una muestra auténtica de ácido brevifolincarboxílico del Prof.

\hbox{T. Yoshida, Okayama
University, Japón (véase la Fig. 7).}

3. Resumen

A partir de la fracción de galotanino de Ph. amarus se ha aislado otro compuesto de galotanino importante, y se ha identificado como ácido brevifolincarboxílico. Este compuesto puede obtenerse como un producto de degradación del geraniíno.

He aquí los cuatro componentes principales de Ph. amarus que se identificaron:

-: geraniíno (7)

-: corilagino (5)

-: ácido elágico

-: ácido brevifolincarboxílico (4a)

Ejemplo 9 Actividad anti-VIH-1 de geraniíno sobre una cepa de VIH-2 y una selección de cepas de VIH-1 resistentes a inhibidores de la RT en ensayos de infección

Esencialmente se usó el mismo experimento al descrito en el Ejemplo 1 para determinar el efecto inhibidor del geraniíno sobre una cepa de VIH-2 (rod) y una selección de cepas de VIH-1 resistentes a inhibidores nucleosídicos de la RT (NRTI) (ARP141, ARP145 y ARP146), así como cepas de VIH-1 resistentes a inhibidores no nucleosídicos de la RT (NNRTI) (ARP1010, ARP1011 y ARP1014). Se infectaron células MAGI con 70 \mul de las correspondientes estirpes de virus en presencia de geraniíno a unas concentraciones de 2,5 \mug/ml, 1,25 \mug/ml y 0,63 \mug/ml. Se calcularon los valores de EC_{50} de la cepa de VIH-2, de las cepas resistentes a RT y de la cepa parental natural (HX10), y están enumerados en la tabla 2. No se observó un cambio significativo en los valores de EC_{50} en la inhibición de la cepa de VIH-2 o de la cepa de VIH-1 resistente a RT en comparación con las cepas naturales de VIH-1 por parte del geraniíno.

TABLA 2 Efecto del geraniíno sobre cepas del VIH naturales y resistentes a RTI

	natural	NRTI	NNRTI
Cepa	HX10	VIH-2rod	ARP141	ARP145	ARP146	ARP1010	ARP1011	ARP1014
EC_{50}	0,74	0,83	0,83	0,95	0,71	0,83	0,89	1,10
[\mug/ml]

Ejemplo 10 Inhibición de la captación del virus por parte del geraniíno

Se monitorizó la inhibición de la entrada del virus por parte del geraniíno usando un ensayo descrito recientemente (Saphire y col. (1999) EMBO Journal 18: 6771-6785) con ligeras modificaciones. En resumen, se preincubaron células MAGI a 4°C durante 60 min (en 200 \mul), se añadieron virus e inhibidor (en un volumen de 100 \mul), las células se incubaron durante 30 min a 4°C y finalmente se cambiaron a 37°C durante dos horas. Entonces las células se lavaron con 500 \mul de PBS cinco veces para eliminar el virus desunido, se tripsinizaron durante 5 min para eliminar todo el virus fijado pero no internalizado se lavaron de nuevo con 500 \mul de PBS y finalmente se lisaron con 100 \mul de PBS que contenía NP-40 al 0,5%. El contenido en p24 de VIH-1 de los lisados celulares se determinó usando un ELISA de p24 en sándwich (NEN). El sulfato de heparina (Hep-S) a una concentración de 100 \mug/ml y un anticuerpo monoclonal de gp120 de \alpha-VIH-1 (dilución final 1:40) sirvieron como controles. Se probó el geraniíno en la prevención de la captación del VIH-1 natural a unas concentraciones finales de 10 \mug/ml, 2,5 \mug/ml y 0,625 \mug/ml, los resultados se describen en la Figura 8. Como puede observarse, la internalización del virus fue bloqueada por el geraniíno de una forma dependiente de la dosis.

Ejemplo 11 Actividad anti-VIH-1 del extracto de P. amarus (Ejemplo 7), también denominado CMI-111, sobre una selección de cepas del VIH-1 resistentes a inhibidores de la RT en ensayos de infección

Esencialmente se usó el mismo experimento al descrito en el Ejemplo 1 para determinar el efecto inhibidor del extracto de P. amarus sobre cepas de VIH-1 resistentes a inhibidores nucleosídicos de la RT (NRTI) (ARP141 y ARP146), así como cepas de VIH-1 resistentes a inhibidores no nucleosídicos de la RT (NNRTI) (ARP1010, ARP1011 y ARP1014). Se infectaron células MAGI con 70 \mul de las correspondientes estirpes de virus en presencia de extracto de P. amarus a unas concentraciones de 10 \mug/ml, 5 \mug/ml, 2,5 \mug/ml, 1,25 \mug/ml y 0,63 \mug/ml. Se calcularon los valores de EC_{50} de la cepa de VIH-2, de las cepas resistentes a RT y de la cepa parental natural (HX10), y están enumerados en la tabla 3. No se observó un cambio significativo en los valores de EC_{50} en la inhibición de la cepa de VIH-2 o de las cepas de VIH-1 resistentes a RT en comparación con las cepas naturales de VIH-1 por parte del CMI-111. Por el contrario, la inhibición del VIH-2 estaba aumentada. La inhibición de las cepas resistentes a los RTI estaba incluso más aumentada.

TABLA 3 Efecto del CMI-111 sobre cepas del VIH naturales y resistentes a RTI

	natural	NRTI	NNRTI
Cepa	HX10	VIH-2rod	ARP141	ARP146	ARP1010	ARP1011	ARP1014
EC_{50}	1,92	1,38	1,02	1,25	1,19	0,8	1,25
[\mug/ml]

Ejemplo 12 Inhibición de la captación del virus por parte del extracto de P. amarus (Ejemplo 7)

La inhibición de la entrada del virus por parte del extracto de P. amarus CMI-111 (Ejemplo 7) se determinó esencialmente según se describe en el Ejemplo 10. Se probó el impedimento del CMI-111 de la captación del VIH-1 natural a unas concentraciones finales de 10 \mug/ml, 2,5 \mug/ml y 0,625 \mug/ml, los resultados se describen en la Figura 9. Como puede observarse, la internalización del virus fue bloqueada por el CMI-111 de una forma dependiente de la dosis.

Ejemplo 13 Inhibición de la unión de gp120 del VIH-1 a CD4 por parte del geraniíno

La inhibición de la unión de la glucoproteína gp120 de la cubierta vírica a su receptor celular de CD4 por parte del geraniíno se monitorizó usando CD4 inmovilizado recombinante y gp120 de VIH-1 recombinante en un formato de ensayo de tipo ELISA. En resumen, las placas de ELISA se cubrieron con 100 ng/pocillo de CD4 (en tampón de carbonato 0,1 M, pH 9,5) durante 12 h a 4°C. Las placas se lavaron 5 veces con 200 \mul de tampón de lavado (PBS, Tween 20 al 0,05%) y se bloquearon con 200 \mul de tampón de bloqueo (PBS, gelantina al 0,1%) durante 1 h. Los pocillos se incubaron con 100 ng de gp120 recombinante y diluciones de muestras de prueba (concentración final del 10% en tampón de bloqueo) durante 1 h y se lavaron 5 veces. Los pocillos se incubaron adicionalmente con 100 \mul de anticuerpo monoclonal de ratón anti-gp120-V3 durante 1 h a 37°C, se lavaron 5 veces y se incubaron con 100 \mul de anticuerpo monoclonal anti-ratón conjugado con HRP durante 1 h a 37°C y se lavaron 10 veces. Finalmente, los pocillos se incubaron con 100 \mul de sustrato (OPD) durante 15 min, la reacción se detuvo con 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1 N y la placa se leyó en un lector de ELISA (492 nm). El geraniíno se probó a unas concentraciones finales de 10 \mug/ml, 3,33 \mug/ml, 1,11 \mug/ml, 0,37 \mug/ml, 1,123 \mug/ml y 0,041 \mug/ml, por duplicado. Los resultados de este experimento representativo se describen en la figura 10. Como puede observarse, la unión de gp120 a CD4 fue boqueada por el geraniíno de una forma dependiente de la dosis. Se calculó un valor medio de IC_{50} de 0,48 \pm 0,05 \mug/ml a partir de tres experimentos independientes.

Ejemplo 14 Inhibición de la unión de gp120 del VIH-1 a CD4 por parte del extracto de P. amarus

La inhibición de la unión de la glucoproteína gp120 de la cubierta vírica a CD4 por parte del extracto de P. amarus CMI-111 se determinó esencialmente según se describe en el ejemplo 13. El CMI-111 se probó a unas concentraciones finales de 30 \mug/ml, 10 \mug/ml, 3,33 \mug/ml, 1,11 \mug/ml, 0,37 \mug/ml y 1,123 \mug/ml, por duplicado. Los resultados se describen en la figura 11. Como puede observarse, la unión de la gp120 a CD4 fue boqueada por el CMI-111 de una forma dependiente de la dosis. Se calculó un valor medio de IC_{50} de 2,65 \pm 0,44 \mug/ml a partir de tres experimentos independientes.

Claims

1. Uso de un extracto de Phyllanthus o una fracción del mismo, o un galotanino o una combinación de galotaninos, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con retrovirus asociadas a un retrovirus resistente a un inhibidor nucleosídico y/o a un retrovirus resistente a un inhibidor no nucleosídico.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que las enfermedades se tratan inhibiendo la replicación de un retrovirus resistente a un inhibidor nucleosídico y/o de un retrovirus resistente a un inhibidor no nucleosídico.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que las enfermedades se tratan inhibiendo la captación del virus de un retrovirus resistente a un inhibidor nucleosídico y/o de un retrovirus resistente a un inhibidor no nucleosídico.

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho retrovirus es un VIH.

5. El uso de la reivindicación 4, en el que dicho VIH es un VIH-1.

6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho extracto es un extracto en agua, un extracto en alcohol, un extracto en agua/alcohol, un extracto en hexano o un extracto en CO_{2}.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que dicho alcohol es metanol o etanol.

8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha fracción es una fracción de proteína o una fracción de galotanino.

9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 u 8, en el que dicho galotanino es, o dicha fracción de galotanino comprende, corilagino.

10. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a u 8, en el que dicho galotanino es, o dicha fracción de galotanino comprende, geraniíno.

11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 u 8, en el que dicho galotanino es, o dicha fracción de galotanino comprende, ácido elágico.

12. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 u 8, en el que dicho galotanino es, o dicha fracción de galotanino comprende, ácido brevifolincarboxílico.

13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 u 8, en el que dicho galotanino es, o dicha fracción de galotanino comprende, un elagitanino diferente de corilagino, geraniíno, ácido elágico y ácido brevifolincarboxílico.

14. El uso de la reivindicación 1 a 5 u 8, en el que dicha combinación de galotaninos o dicha fracción de galotanino comprende al menos dos de corilagino, geraniíno, ácido elágico y ácido brevifolincarboxílico, y opcionalmente dicho elagitanino diferente de corilagino y geraniíno.

15. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dichos galotaninos están formulados en dicha composición farmacéutica en una concentración del 0,1 al 99,9%.

16. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicho extracto o dicha fracción está presente en una concentración del 0,1 al 99,9% en dicha composición farmacéutica.

17. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho Phyllanthus es Phyllanthus amarus.