ES2259247T3 - Anticuerpos frente a vegf-d truncado y sus usos. - Google Patents
Anticuerpos frente a vegf-d truncado y sus usos.Info
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Abstract
Una composición de materia que comprende el anticuerpo 4A5 producido por las células del hibridoma de ratón 4A5A, depositado en la American Type Culture Collection como ATCC Nº HB-12698, que se une a VEGF-DNC e interfiere en la unión de VEGF-D al VEGFR-2 y al VEGFR-3, y que no se une a VEGFR-C y no interfiere en la actividad
Description
Anticuerpos frente a VEGF-D
truncado y sus usos.
Esta invención se refiere a una composición de
materia que comprende un anticuerpo monoclonal que reacciona
específicamente con un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la Figura 1 (ID SEC Nº 1). El anticuerpo
incluye fragmentos inmunorreactivos o recombinantes del mismo. La
invención también se refiere a composiciones y procedimientos
farmacéuticos y diagnósticos que utilizan este anticuerpo.
En el desarrollo embrionario, la red vascular
primaria se establece mediante la diferenciación in situ de
las células mesodérmicas en un procedimiento denominado
vasculogénesis. Se cree que todos los procedimientos posteriores
implicados en la generación de nuevos vasos en el embrión y en la
neovascularización en adultos, están regidos por la gemación o la
división de nuevos capilares a partir de la vasculatura preexistente
en un procedimiento denominado angiogénesis (Pepper y col.,
Enzyme & Protein, 49:138-162,
1996; Breier y col, Dev. Dyn.,
204:228-239, 1995; Risau, Nature,
386:671-674, 1997). La angiogénesis no sólo
está implicada en el desarrollo embrionario y en el crecimiento,
reparación y regeneración normal de los tejidos, sino que también
está implicada en el ciclo reproductivo femenino, establecimiento y
mantenimiento del embarazo y en la reparación de heridas y
fracturas. Además de la angiogénesis que tiene lugar en el individuo
normal, los sucesos de angiogénesis están implicados en varios
procedimientos patológicos, en particular en el crecimiento y
metástasis tumoral y en otras dolencias en las que la proliferación
de vasos sanguíneos, especialmente del sistema microvascular, está
aumentada, tal como retinopatía diabética, psoriasis y artropatías.
La inhibición de la angiogénesis es útil en la prevención o mejora
de estos procesos patológicos.
Por otro lado, la promoción de la angiogénesis
es deseable en situaciones en las que se tiene que establecerse o
extenderse la vascularización, por ejemplo, después del trasplante
de tejidos o de órganos, o para estimular el establecimiento de
circulación colateral en infartos tisulares o estenosis arterial,
tales como en enfermedad cardiaca coronaria y tromboangitis
obliterante.
El procedimiento angiogénico es muy complejo e
implica el mantenimiento de las células endoteliales en el ciclo
celular, degradación de la matriz extracelular, migración e invasión
del tejido circundante y finalmente, la formación del tubo. Los
mecanismos moleculares que subyacen a los procesos angiogénicos
complejos están bastante lejos de ser entendidos.
Debido al papel crucial de la angiogénesis en
tantos procesos fisiológicos y patológicos, se están investigando de
forma intensiva los factores implicados en el control de la
angiogénesis. Se ha demostrado que varios factores de crecimiento
están implicados en la regulación de la angiogénesis; estos
incluyen factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de
crecimiento derivados de plaquetas, factor de crecimiento
transformante alfa (TGF\alpha) y factor de crecimiento de
hepatocitos (HGF). Véase, por ejemplo, Folkman y col., J. Biol.
Chem., 267:10931-10934, 1992 para
revisión.
Se ha sugerido que una familia en particular de
factores de crecimiento específicos de células endoteliales, los
factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y sus
correspondientes receptores, son los principales responsables de la
estimulación del crecimiento y diferenciación de las células
endoteliales y de ciertas funciones de las células diferenciadas.
Estos factores son miembros de la familia de PDGF y parecen actuar
principalmente a través del receptor tirosina quinasas endotelial
(RTK).
Se han identificado nueve proteínas diferentes
de la familia del PDGF, en concreto dos PDGF (A y B), VEGF y seis
miembros que están estrechamente relacionados con VEGF. Los seis
miembros estrechamente relacionados con VEGF son:
VEGF-B, descrito en la solicitud de patente
internacional PCT/US96/02957 (documento WO 96/26736) y en las
patentes de EE.UU. 5.840.693 y 5.607.918 del Ludwig Institute for
Cancer Research y La Universidad de Helsinki;
VEGF-C, descrito en Joukov y col., EMBO J.,
15:290-298, 1996 y Lee y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 93:1988-1992, 1996;
VEGF-D, descrito en la solicitud de patente
internacional Nº PCT/US97/14696 (documento WO 98/07832) y Achen y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95:548-553, 1998; el factor de crecimiento de
placenta (PIGF), descrito en Maglione y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 88:9267-9271,1991; VEGF2,
descrito en la solicitud de patente internacional Nº PCT/US94/05291
(documento WO 95/24473) de Human Genome Sciences, Inc., y VEGF3,
descrito en la solicitud de patente internacional Nº PCT/US95/07283
(documento WO 96/39421) de Human Genome Sciences, Inc. Cada miembro
de la familia de VEGF tiene entre el 30% y el 45% de identidad de
secuencias de aminoácidos con VEGF. Los miembros de la familia de
VEGF comparten un dominio de homología con VEGF que contiene los
seis restos de cisteína que forman el motivo del nudo de cisteínas.
Las características funcionales de la familia del VEGF incluyen
grados diversos de mitogenicidad para las células endoteliales,
inducción de permeabilidad vascular y propiedades angiogénicas y
linfangiogénicas.
El factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEGF) es una glicoproteína homodimérica que se ha aislado a partir
de varias fuentes. El VEGF muestra una actividad mitogénica
altamente específica sobre las células endoteliales. El VEGF tiene
importantes funciones reguladoras en la formación de nuevos vasos
sanguíneos durante la vasculogénesis embrionaria y en la
angiogénesis durante la vida adulta (Carmeliet y col.,
Nature, 380:435-439, 1996; Ferrara y
col., Nature, 380:439-442, 1996;
revisado en Ferrara y Davis-Smyth, Endocrine
Rev., 18:4-25, 1997). La importancia de
la función de VEGF se ha demostrado en estudios que muestran que la
inactivación de un único alelo de VEGF da lugar a letalidad
embrionaria debido a que no se puede desarrollar la vasculatura
(Carmeliet y col., Nature, 380:435-439, 1996;
Ferrara y col., Nature, 380:439-442,
1996). Además, el VEGF tiene una potente actividad quimiotáctica
hacia monocitos, puede inducir en las células endoteliales al
activador del plasminógeno y al inhibidor del activador del
plasminógeno y también puede inducir la permeabilidad
microvascular. Debido a esta última actividad, algunas veces se
denomina factor de permeabilidad vascular (VPF). Se ha revisado el
aislamiento y las propiedades del VEGF; véase Ferrara y col., J.
Cellular Biochem., 47:211-218, 1991 y
Connolly, J. Cellular Biochem.,
47:219-223, 1991. Un ayuste alternativo del
ARNm de un único gen de VEGF origina cinco isoformas del VEGF.
El VEGF-B tiene propiedades
angiogénicas y otras similares a las del VEGF, pero se distribuye y
expresa en tejidos de modo diferente a VEGF. En especial,
VEGF-B se expresa muy fuertemente en corazón, y sólo
débilmente en pulmón, mientras que para el VEGF es el caso inverso.
Esto sugiere que VEGF y VEGF-B, a pesar del hecho de
que se expresan conjuntamente de muchos tejidos, pueden tener
diferencias funcionales.
El VEGF-B se aisló usando una
técnica de selección trampa de interacción con doble híbrido en
levadura mediante selección de proteínas celulares que podría
interaccionar con las proteínas celulares que se unen al ácido
retinoico de tipo I (CRABP-I). Su aislamiento y
características se describen en detalle en el documento
PCT/US96/02957 y en Olofsson y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 93:2576-2581, 1996.
VEGF-C se aisló a partir de
medios condicionados de la línea celular de adenocarcinoma de
próstata PC-3 (CRL1435) mediante la selección de la
capacidad del medio para producir fosforilación de la tirosina del
receptor tirosina quinasa específico de células endoteliales
VEGFR-3 (Flt4), usando células transfectadas para la
expresión de VEGFR-3. VEGF-C se
purificó usando cromatografía de afinidad con
VEGFR-3 recombinante, y se clonó a partir de una
genoteca de ADNc de PC-3. Su aislamiento y
características se describen en detalle en Joukov y col.; EMBO
J., 15:290-298, 1996.
VEGF-D se aisló a partir de una
genoteca de ADNc de mama humana, disponible en el mercado en
Clontech, mediante selección con una secuencia etiqueta expresada
obtenida a partir de una biblioteca de ADNc humano, denominada
"Soares Breast 3NbHBst" como sonda de hibridación (Achen y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95:548-553, 1998). Su aislamiento y
características se describen en detalle en la solicitud de patente
internacional Nº PCT/US97/14969 (documento WO98/07832).
El gen de VEGF-D se expresa
ampliamente en el humano adulto, pero ciertamente no se expresa de
forma ubicua. VEGF-D se expresa fuertemente en
corazón, pulmón y músculo esquelético. En el bazo, ovario, intestino
delgado y colon se expresan niveles intermedios de
VEGF-D y en el riñón, páncreas, timo, próstata y
testículos se da la expresión más baja. No se ha detectado ARNm de
VEGF-D en ARN de cerebro, placenta, hígado o
leucocitos de sangre periférica.
PIGF se aisló a partir de la denominada
biblioteca de ADNc de placenta. Su aislamiento y características se
describen en detalle en Maglione y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 88:9267-9271, 1991. Actualmente no
se conoce bien su función biológica.
VEGF2 se aisló a partir de una línea celular
cancerígena de mama humana independiente de estrógenos altamente
tumorigénica. Mientras que se indica que esta molécula tiene
aproximadamente el 22% de homología con PDGF y el 30% de homología
con VEGF, el procedimiento de aislamiento del gen que codifica VEGF2
no está claro y no se ha descrito la caracterización de la actividad
biológica.
VEGF3 se aisló a partir de una biblioteca de
ADNc derivado de tejido de colon. Se indica que el VEGF3 tiene
aproximadamente el 36% de identidad y el 66% de similitud con VEGF.
No está claro el procedimiento de aislamiento del gen que codifica
VEGF3 y no se ha descrito la caracterización de la actividad
biológica.
La similitud entre dos proteínas se determina
comparando las secuencias de aminoácidos y las sustituciones de
aminoácidos conservados de una de las proteínas en la secuencia de
la segunda proteína, mientras que la identidad se determina sin
incluir las sustituciones de los aminoácidos conservados.
Los miembros de la familia PDGF/VEGF actúan
principalmente mediante la unión a receptores tirosina quinasas. Se
han identificado cinco receptores tirosina quinasa específicos de
células endoteliales, en concreto VEGFR-1
(Flt-1), VEGRF-2
(KDR/Flk-1), VEGFR-3 (Flt4), Tie y
Tek/Tie-2. Todos ellos tienen la actividad tirosina
quinasa intrínseca que se necesita para la transducción de la
señal. La función específica esencial en la vasculogénesis y
angiogénesis de VEGFR-1, VEGFR-2,
VEGFR-3, Tie y Tek/Tie-2 se ha
demostrado mediante mutaciones dirigidas que inactivan estos
receptores en embriones de ratón.
Los únicos receptores tirosina quinasa conocidos
que se unen a los VEGF son VEGFR-1,
VEGFR-2 y VEGFR-3.
VEGFR-1 y VEGFR-2 se unen a VEGF con
elevada afinidad y VEGFR-1 también se une a
VEGF-B y a PIGF. Se ha demostrado que
VEGF-C es el ligando de VEGFR-3 y
también activa VEGFR-2 (Joukov y col., The EMBO
Journal, 15:290-298, 1996).
VEGF-D se une tanto a VEGFR-2 como a
VEGFR-3. Se ha descrito un ligando de
Tek/Tie-2 en la solicitud de patente internacional
Nº PCT/US95/12935 (documento WO96/11269) de Regeneron
Pharmaceuticals, Inc. Aun no se ha identificado el ligando de
Tie.
Recientemente se ha purificado y clonado un
nuevo receptor específico isoforme de VEGF de
130-135 kDa (Soker y col., Cell,
92:735-745, 1998). Se encontró que el
receptor de VEGF se unía específicamente a la isoforma VEGF_{165}
a través de la secuencia que codifica el exón 7, que muestra una
débil afinidad por la heparina (Soker y col., Cell,
92:735-745, 1998). Sorprendentemente, se
demostró que el receptor era idéntico a la
neuropilina-1 (NP-1), un receptor
implicado en la fase temprana de la neuromorfogénesis. También
parece que PIGF-2 interacciona con
NP-1 (Migdal y col., J. Biol. Chem.,
273:22272-22278, 1998).
Las células endoteliales expresan de modo
distinto VEGFR-1, VEGFR-2 y
VEGFR-3. Tanto VEGFR-1 como
VEGFR-2 se expresan en los endotelios de los vasos
sanguíneos (Oelrichs y col., Oncogene,
8:11-18, 1992; Kaipainen y col., J. Exp.
Med., 178:2077-2088, 1993; Dumont y col.,
Dev. Dyn., 203:80-92, 1995;
Fong y col., Dev. Dyn., 207:1-10,
1996) y VEGFR-3 se expresa mayoritariamente en el
endotelio linfático de tejidos adultos (Kaipainen y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 9:3566-3570, 1995).
VEGFR-3 también se expresa en la vasculatura
sanguínea que rodea a los tumores.
La interrupción de los genes VEGFR da lugar al
desarrollo anómalo de la vasculatura llevando a la letalidad
embrionaria a mitad de la gestación. El análisis de embriones
portadores de un gen de VEGFR-1 completamente
inactivado sugiere que se requiere este receptor para la
organización funcional del endotelio (Fong y col., Nature,
376:66-70, 1995). Sin embargo, la deleción
del dominio tirosina quinasa intracelular del
VEGFR-1 genera ratones viables con una vasculatura
normal. (Hiratsuka y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95:9349-9354, 1998). Las razones que
subyacen bajo estas diferencias permanecen sin explicar, pero
sugieren que no es necesaria la señalización del receptor a través
de la tirosina quinasa para el funcionamiento adecuado del
VEGFR-1. El análisis de ratones homocigóticos con
alelos inactivados de VEGF-2 sugiere que este
receptor es necesario para la proliferación de las células
endoteliales, hematopoyesis y vasculogénesis (Shalaby y col.,
Nature, 376:62-66, 1995; Shalaby y
col., Cell, 89:981-990, 1997). La
inactivación de VEGFR-3 da lugar a una insuficiencia
cardiovascular debido a la organización anómala de los vasos grandes
(Dumont y col. Science, 282:946-949,
1998).
Aunque VEGFR-1 se expresa
durante el desarrollo principalmente en las células endoteliales,
también puede encontrarse en células precursoras hematopoyéticas
durante las fases tempranas de la embriogénesis (Fong y col.,
Nature, 376:66-70, 1995). En adultos,
los monocitos y macrófagos también expresan este receptor (Barleon y
col., Blood, 87:3336-3343, 1995). En
el embrión, VEGFR-1 se expresa en la mayoría de, si
no en todos, los vasos (Breier y col., Dev. Dyn.,
204:228-239, 1995; Fong y col., Dev.
Dyn., 207:1-10, 1996).
El receptor VEGFR-3 se expresa
ampliamente en células endoteliales durante el desarrollo
embrionario temprano pero conforme avanza la embriogénesis, se
restringe al endotelio venoso y, a continuación, al endotelio
linfático (Kaipainen y col., Cancer Res.,
54:6571-6577, 1994; Kaipainen y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
92:3566-3570, 1995). El
VEGFR-3 se expresa en células endoteliales
linfáticas de tejidos adultos. Este receptor es esencial para el
desarrollo vascular durante la embriogénesis. La inactivación
dirigida de ambas copias del gen VEGFR-3 en ratones
da lugar a la formación de vasos sanguíneos defectuosos
caracterizados por ser vasos grandes organizados de forma anómala
con lúmenes defectuosos, que conducen a la acumulación de fluido en
la cavidad pericárdica y a una insuficiencia cardiovascular el día
9,5 postcoital. En base a estos hallazgos se ha propuesto que
VEGFR-3 es necesario para la maduración de las redes
vasculares principales en vasos sanguíneos grandes. Sin embargo, la
función de VEGFR-3 en el desarrollo de la
vasculatura linfática no puede estudiarse en estos ratones ya que
los embriones mueren antes de que aparezca el sistema linfático. Sin
embargo, se asume que VEGFR-3 juega un papel en el
desarrollo de la vasculatura linfática y linfangiogénesis dado su
expresión específica en células endoteliales linfáticas durante la
embriogénesis y la vida adulta. Esto está apoyado por el hallazgo de
que esta expresión ectópica de VEGF-C, un ligando de
VEGFR-3, en la piel de ratones transgénicos, daba
lugar a la proliferación de células endoteliales linfáticas y a la
prolongación de los vasos de la dermis. Además, esto sugiere que
VEGF-C puede tener una función principal en el
endotelio linfático y una función secundaria en la angiogénesis y en
la regulación de la permeabilidad, que comparte con VEGF (Joukov y
col., EMBO J., 15:290-298, 1996).
Se ha demostrado que algunos inhibidores del
sistema VEGF/receptor de VEGF previenen el crecimiento tumoral a
través de un mecanismo anti-angiogénico; véase Kin y
col., Nature, 362:841-844, 1993 y
Saleh y col., Cancer Res., 56:393-401,
1996.
La invención en general proporciona una
composición de materia que comprende un anticuerpo que reacciona
específicamente con un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la Figura 1 (ID SEC Nº 1), donde el
anticuerpo es el anticuerpo monoclonal (AcM) 4A5 producido por las
células del hibridoma depositado como ATCC Nº
H9-1296, un fragmento inmunorreactivo o un
recombinante del mismo. En otra realización de la invención, la
composición de materia comprende el anticuerpo monoclonal 4A5 que
puede interferir con la actividad de VEGF-D mediada
por el VEGFR-2 de mamíferos y/o interfiere con la
unión de VEGF-D al VEGFR-3 de
mamíferos. El anticuerpo monoclonal 4A5 puede interferir con la
actividad de VEGF-D mediada por
VEGFR-2 y/o interferir con la unión de
VEGF-D al VEGFR-3, pero no con la
actividad de VEGF mediada por VEGFR-2 y/o en la
unión a VEGF-C. La invención también se refiere a
composiciones y procedimientos farmacéuticos y diagnósticos que
utilizan el anticuerpo monoclonal 4A5.
\newpage
Según un primer aspecto, la invención
proporciona una composición de materia que comprende el anticuerpo
monoclonal 4A5, que reacciona específicamente con el polipéptido que
tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (ID SEC Nº
1).
Según un segundo aspecto, la invención
proporciona una composición de materia que comprende el anticuerpo
monoclonal 4A5 que interfiere con la actividad de
VEGF-D mediada por el VEGFR-2. En
una realización preferida, este anticuerpo también interfiere con la
unión de VEGF-D al VEGFR-3, pero no
interfiere con la actividad de VEGF mediada por el
VEGFR-2 y/o se une a VEGF-C. AcM 4A5
que tiene el isotipo IgG_{1}.
En un tercer aspecto, la invención proporciona
una composición de materia que comprende el anticuerpo monoclonal
4A5 que interfiere con la unión de VEGF-D a
VEGFR-3.
Pueden obtenerse anticuerpos frente al
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Figura 1 (ID SEC Nº 1) o un fragmento del polipéptido usando
procedimientos convencionales en la técnica. Además, este
polipéptido puede estar unido a un epítope etiqueta, tal como el
octapéptido FLAG® (Sigma, St. Louis, MO), que ayuda a la
purificación por afinidad. Para algunos fines, por ejemplo cuando se
usa el anticuerpo monoclonal 4A5 para inhibir los efectos de
VEGF-D en una situación clínica, puede ser deseable
usar anticuerpos monoclonales humanizados o quiméricos o fragmentos
inmunorreactivos de los mismos. A continuación se proporcionan los
procedimientos para producirlos y también son bien conocidos en la
técnica, incluyendo procedimientos de ADN recombinante.
Estos aspectos de la invención también incluyen
fragmentos inmunorreactivos o recombinantes de los mismos y todos
pueden estar convenientemente marcados.
Los anticuerpos según la invención pueden estar
marcados con un marcador detectable y utilizarse para fines
diagnósticos. El anticuerpo puede estar unido covalente o no
covalentemente a un agente supermagnético, paramagnético, electrón
denso, ecogénico o radiactivo para la formación de imágenes. Para su
uso en ensayos diagnósticos, pueden usarse marcadores radiactivos o
no radiactivos. Los ejemplos de marcadores radiactivos incluyen un
átomo o grupo radiactivo, tal como ^{125}I o ^{32}P. Los
ejemplos de marcadores no radiactivos incluyen marcadores
enzimáticos, tales como la peroxidasa de rábano picante, o
marcadores fluorimétricos, tales como el isotiocianato de
5-fluoresceina (FITC). El marcaje puede ser directo
o indirecto, covalente o no covalente.
Un aspecto adicional de la invención es una
célula de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 4A5 que
reacciona específicamente con un polipéptido que tiene la secuencia
de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (ID SEC Nº 1) o que
interfiere con la actividad de VEGF-D mediada por el
VEGFR-2 y/o interfiere con VEGF-D
unido a VEGFR-3.
Un aspecto adicional de la invención proporciona
un procedimiento de interferencia con al menos una actividad
biológica inducida por VEGF-D en un cultivo celular
que comprende la etapa de añadir a dicho cultivo celular una
cantidad que interfiere de forma eficaz con la actividad biológica
del anticuerpo monoclonal.
Las "actividades biológicas inducidas por
VEGF-D" pueden probarse fácilmente por
procedimientos conocidos en la técnica. En particular,
VEGF-D tiene la capacidad de estimular la
proliferación o diferenciación de la célula endotelial, e
incluyendo, pero sin limitación, la proliferación o diferenciación
de las células del endotelio vascular y/o las células del endotelio
linfático. Otras actividades biológicas contempladas incluyen
angiogénesis, linfangiogénesis e inducción de la permeabilidad de
los vasos sanguíneas y de los vasos linfáticos.
El término "anticuerpos" o
"anticuerpo" se refiere a la composición de materia que
comprende el anticuerpo monoclonal 4A5 que puede interferir con la
actividad de VEGF-D mediada por el
VEGFR-2 de mamíferos y/o interferir con la unión de
VEGF-D al VEGFR-3 de mamíferos. El
anticuerpo monoclonal 4A5 puede interferir con la actividad de
VEGF-D mediada por el VEGFR-2 y/o
interferir con la unión de VEGF-D al
VEGFR-3, pero no con la actividad de VEGF mediada
por VEGFR-2 y/o la unión a
VEGF-C.
Otro aspecto de la invención se refiere a la
provisión de una composición farmacéutica que comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal 4A5 y una sal no
tóxica farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo o
adyuvante sólido o líquido farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos
de estos vehículos o adyuvantes incluyen, pero sin limitaciones,
solución salina, solución salina tamponada, solución de Ringer,
aceite mineral, talco, almidón de maíz, gelatina, lactosa, sacarosa,
celulosa microcristalina, caolín, manitol, fosfato dicálcico,
cloruro sódico, ácido algínico, dextrosa, agua, glicerol, etanol,
agentes espesantes, estabilizantes, de suspensión y combinaciones de
los mismos. Estas composiciones pueden estar en forma de soluciones,
suspensiones, comprimidos, cápsulas, cremas, pomadas balsámicas,
elixires, jarabes, obleas, pomadas u otras formas convencionales. La
formulación debe adecuarse al modo de administración.
La(s) dosis y vía de administración
dependerán de la naturaleza del paciente y la dolencia que se va a
tratar y estará a discreción del medico o del veterinario. Las vías
adecuadas incluyen la vía oral, inyección subcutánea, intramuscular,
intraperitoneal o intravenosa, vía parenteral, aplicación por vía
tópica, implantes, etc. Por ejemplo, se administra una cantidad
eficaz de anticuerpo monoclonal 4A5 a un organismo que necesita del
mismo a una dosis de entre aproximadamente 0,1 y 1.000 \mug/kg de
peso corporal.
Las aplicaciones clínicas de la invención
incluyen aplicaciones diagnósticas y supresión o inhibición de la
angiogénesis y/o linfangiogénesis en el tratamiento del cáncer,
retinopatía diabética, psoriasis y artropatías. De este modo, la
invención también se refiere a un procedimiento para interferir con
la angiogénesis, linfangiogénesis y/o neovascularización en un
mamífero que necesita de este tratamiento, que comprende usar una
cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal 4A5. El anticuerpo
monoclonal 4A5 interfiere con la acción de VEGF-D
previniendo, al menos, la activación del
VEGFR-2.
Además, este aspecto de la invención proporciona
un procedimiento para interferir con al menos una actividad
biológica seleccionada entre angiogénesis, linfangiogénesis y
neovascularización en una enfermedad de un mamífero seleccionada
entre el grupo de cáncer, retinopatía diabética, psoriasis y
artropatías, que comprende el uso de una cantidad del anticuerpo
monoclonal 4A5 eficaz para interferir en la angiogénesis,
linfangiogénesis y neovascularización. Como se señala
anteriormente, el anticuerpo interfiere, al menos en parte, en la
acción de VEGF-D, interfiriendo con la actividad de
VEGF-D mediada por el VEGFR-2 y/o
con la unión de VEGF-D al
VEGFR-3.
Los anticuerpos pueden usarse para tratar
dolencias, tales como la insuficiencia cardiaca congestiva, que
implican acumulaciones de fluido en, por ejemplo, el pulmón dando
lugar a un aumento en la permeabilidad vascular, ejerciendo un
efecto compensador de la permeabilidad vascular para contrarrestar
la acumulación de fluido. Por lo tanto, la invención proporciona el
uso del anticuerpo monoclonal 4A5 para tratar la acumulación de
fluido en el corazón y/o pulmón debido al aumento de la
permeabilidad vascular en un mamífero. Este uso comprende la
fabricación de medicamento con una cantidad de anticuerpo
monoclonal 4A5 eficaz para disminuir la permeabilidad vascular.
La invención también proporciona un
procedimiento para detectar VEGF-D en una muestra
biológica, que comprende las etapas de poner en contacto la muestra
con el anticuerpo monoclonal 4A5, y detectar la unión que implica
al anticuerpo. En una realización preferida, la unión y/o la
magnitud de la unión se detectan mediante un marcaje detectable; a
continuación se discuten los marcadores adecuados.
Según un aspecto adicional más, la invención
proporciona un dispositivo de diagnóstico/pronóstico típicamente en
forma de un kit de ensayo. Por ejemplo, en una realización de la
invención se proporciona un kit de ensayo diagnóstico/pronóstico
que comprende el anticuerpo monoclonal 4A5 para el polipéptido de la
Figura 1 (ID SEC Nº 1) y medios para detectar la unión entre el
anticuerpo y VEGF-D. En una realización preferida
del dispositivo diagnóstico/pronóstico según la invención, se
proporciona un segundo anticuerpo (un anticuerpo secundario)
dirigido frente a anticuerpos del mismo isotipo y de la misma fuente
animal del anticuerpo dirigido frente al polipéptido de la Figura 1
(ID SEC Nº 1) (el anticuerpo primario). El anticuerpo secundario se
une a un marcador detectable y, a continuación, el anticuerpo
monoclonal 4A5 sin marcar o VEGF-D se une al
sustrato de modo que la interacción
VEGF-D/anticuerpo primario pueda establecerse
mediante la determinación de la cantidad de marcador unido al
sustrato tras la unión entre el anticuerpo primario y
VEGF-D, y la posterior unión del anticuerpo
secundario marcado al anticuerpo primario. En una realización
particularmente preferida de la invención, el dispositivo de
diagnóstico/pronóstico puede proporcionarse como un kit convencional
de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA).
Según un aspecto adicional más, la invención
proporciona un procedimiento de captación de imágenes de la
vasculatura linfática en un tejido, que comprende poner en contacto
el tejido con el anticuerpo monoclonal 4A5 y detectar la aparición
de unión del anticuerpo.
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos
del polipéptido (sin el octapéptido FLAG®) usado para obtener los
anticuerpos (ID SEC Nº 1).
La Figura 2 muestra los efectos de los
anticuerpos monoclonales en la respuesta de las células
Ba/F3-NYK-EpoR a
VEGF-D\DeltaN\DeltaC.
Las Figuras 3A y 3B muestran las afinidades de
unión relativas de los anticuerpos monoclonales a
VEGF-D\DeltaN\DeltaC.
La Figura 4 muestra los efectos de los
anticuerpos monoclonales en la respuesta de las células
Ba/F3-NYK-EpoR a VEGF_{164}
murino.
La Figura 5 muestra los efectos de AcMs
anti-VEGF-D sobre la unión de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC al dominio extracelular
del VEGFR-3.
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos
del polipéptido sin el octapéptido FLAG® (ID SEC Nº 1) usada para
obtener los anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales frente al
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Figura 1 (ID SEC Nº 1) se obtuvieron en ratones. El polipéptido
usado como inmunógeno para obtener los anticuerpos de la presente
invención se marcó con FLAG® en su extremo
N-terminal (véase la descripción a continuación).
Esta secuencia de aminoácidos es la región central de
VEGF-D y tiene una secuencia similar a la de todos
los demás miembros de la familia VEGF. Por tanto, se piensa que
probablemente la porción con actividad biológica de
VEGF-D reside en la región conservada. Un fragmento
de ADN que codifica la porción truncada del VEGF-D
humano del resto 93 al 201, es decir, con las regiones N y C
terminales eliminadas, se amplificó mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) con la ADN polimerasa Pfu, usando como
molde un plásmido que contenía el ADNc del VEGF-D
humano de longitud completa. El fragmento de ADN amplificado, cuya
secuencia se confirmó mediante secuenciación de nucleótidos, se
insertó a continuación en el vector de expresión pEFBOSSFLAG (donado
por el Dr. Clare McFarlane del Walter and Eliza Hall Institute for
Medical Research (WEHI), Melbourne, Australia) para obtener un
plásmido denominado pEFBOSVEGF-D\DeltaN\DeltaC.
El vector pEFBOSSFLAG contiene el ADN que codifica la secuencia
señal para la secreción de la proteína del gen de la interleuquina 3
(IL-3) y el octapéptido FLAG®. El octapéptido FLAG®
(Sigma, St. Louis, MO) puede ser reconocido por anticuerpos
disponibles en el mercado, tales como el anticuerpo monoclonal M2
(Sigma St. Louis, MO). El fragmento de la PCR de
VEGF-D se insertó en el vector de manera que la
secuencia señal de la IL-3 estaba inmediatamente
antes del extremo 5' del octapéptido FLAG®, que estaba a su vez
inmediatamente antes del extremo 5' de la secuencia
VEGF-D truncada. Las tres secuencias estaban en la
misma fase de lectura, para que la traducción del ARNm que resulta
de la transfección de pEFBOSVEGF-D\DeltaN\DeltaC
en células de mamífero, pudiera originar una proteína que tendría la
secuencia señal de IL-3 en su extremo
N-terminal, seguida del octapéptido FLAG® y de la
secuencia de VEGF-D truncada. La escisión de la
secuencia señal y la posterior secreción de la proteína por la
célula daría lugar a un polipéptido VEGF-D que
estaría marcado con el octapéptido FLAG® adyacente al extremo
N-terminal. Esta proteína se denominó
VEGF-D\DeltaN\DeltaC.
VEGF-D\DeltaN\DeltaC se purificó mediante
cromatografía de afinidad anti-FLAG® a partir del
medio de células COS que habían sido transfectadas de forma
transitoria con el plásmido
pEFBOSVEGF-D\DeltaN\DeltaC (Véase el Ejemplo 9
de la solicitud de patente internacional Nº PCT/US97/14696).
La VEGF-D\DeltaN\DeltaC
purificada se usó para inmunizar ratones hembras Balb/c los días 85
(intraperitoneal), 71 (intraperitoneal) y 4 (intravenosa) antes de
la recuperación de las células esplénicas de los ratones inmunizados
y de la posterior fusión de estas células esplénicas con células del
mieloma de ratón P3X63Ag8.653 (NS-1). Para las
primeras dos inmunizaciones, se inyectaron 10 \mug de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC en una mezcla 1:1 de
solución salina tamponada con fosfato (PBS) y adyuvante TiterMax
(Adyuvante para investigación Nº R-1; CytRx Corp.,
Norcross, GA), mientras que para la tercera inmunización se usaron
35 \mug de VEGF-D\DeltaN\DeltaC en PBS.
Los anticuerpos monoclonales (AcMs) frente a
VEGF-D\DeltaN\DeltaC se seleccionaron mediante
selección de los AcMs producidos por los hibridomas frente a
VEGF-D\DeltaN\DeltaC purificada usando un
inmunoensayo enzimático. Brevemente, las placas de microvaloración
de 96 pocillos se recubrieron con
VEGF-D\DeltaN\DeltaC, se añadieron los
sobrenadante de los hibridomas y se incubaron durante 2 horas a 4ºC,
seguido de seis lavados con PBS con Tween 20 al 0,02%. La
incubación con una peroxidasa de rábano picante conjugada con Ig
anti-ratón (Bio-Rad, Hercules, CA)
se realizó durante 1 hora a 4ºC. Tras el lavado, el ensayo se reveló
con un sistema sustrato de ácido
2,2'-azino-di(3-etilbenzo-tiazolin-sulfónico)
(ABTS) (Zymed, San Francisco, CA), y el ensayo se cuantificó
leyendo la absorbancia a 405 nm en un lector de placas multipocillo
(Flor Laboratories MCC/340, McLean, VA). Se seleccionaron seis
anticuerpos para un análisis adicional y se subclonaron dos veces
por dilución límite. Estos anticuerpos se denominaron 2F8, 3C10,
4A5, 4E10, 4H4 y 5F12. Los isotipos de los anticuerpos se
determinaron usando un kit para isotipaje IsostripTM (Boehringer
Mannheim, Indianápolis, IN). Los anticuerpos 2F8, 4A5, 4E10 y 5F12
eran de la clase IgG_{1} mientras que 4H4 y 3C10 eran de la clase
IgM. Los seis anticuerpos contenían la cadena ligera kappa.
Las líneas celulares de hibridoma se crecieron
en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero
libre de IgG al 5% v/v (Gibco BRL, Gaithersburg, MD),
L-glutamina 5 mM, gentamicina a 50 \mug/ml e
IL-6 recombinante a 10 \mug/ml. Los anticuerpos
2F8, 4A5, 4E10 y 5F12 se purificaron mediante cromatografía de
afinidad usando Sepharosa-proteína G según la
técnica de Darby y col., J. Immunol. Methods
159:125-129, 1993 y se evaluó el rendimiento
midiendo la absorbancia a 280 nm.
Las afinidades de unión relativas de los cuatros
AcMs anti-VEGF-D\DeltaN\DeltaC
2F8, 4A5, 4E10 y 5F12, para el
VEGF-D\DeltaN\DeltaC humano se determinaron por
análisis de las cinéticas de unión para estas interacciones mediante
estudios de biosensores usando resonancia de plasmón superficial
según las técnicas de Nice y Catimel, Bioassays 21:
339-352,1999.
VEGFR-2-FLAG,
VEGFR-3-Ig y los anticuerpos
monoclonales anti-VEGF-D se unieron
a la capa de dextrano carboximetilado de un chip sensor usando
reacciones químicas de conjugación de aminas convencionales como se
describe en Nice y Catimel, Bioassays
21:339-352, 1999 (VD1 4739 UR, VD2 5268 UR,
VD3 5781 UR y VD4 5634 UR inmovilizados se corresponden con 4,7,
5,2, 5,7 y 5,6 ng/mm^{2}, respectivamente (Stenberg y col., J.
Colloid Interface 43:513-526, 1990)). La
unión del ligando se analizó usando un biosensor óptico BIAcore 3000
(BIAcore, Uppsala, Suecia). La localización automática de los
niveles de inmovilización se alcanzó usando el software de control
BIAcore 3.1 (Catimel y col., J. Chromatogr. A.
776:15-30, 1997). Tras la inmovilización, se
bloquearon los grupos éster residuales activados mediante el
tratamiento con clorhidrato de etanolamina 1 M pH 8,5. Esto fue
seguido del lavado con dietilamina 10 mM para retirar el material no
unido covalentemente así como regenerar la superficie del sensor
entre análisis. Las muestras para el ensayo se diluyeron en tapón de
desarrollo (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, Tween 20
al 0,005%). Las curvas de unión se obtuvieron haciendo fluir
VEGF-D\DeltaN\DeltaC humano sobre la superficie
(41-689 nM) a un caudal de 10 \mul/min. Para la
determinación de las afinidades de unión relativas de los
anticuerpos frente a VEGF-D\DeltaN\DeltaC
humano, los datos se analizaron usando el BIAevaluation 3.0
(BIAcore, Uppsala, Suecia) como se describe en Catimel y col., J.
Chromatogr. A. 776:15-30, 1997. Las constantes
de unión se obtuvieron por análisis de la fase de disociación
inicial para obtener la K_{d}, que a continuación se usó para
limitar un análisis global de la región de asociación de las curvas
donde era operativo un modelo de Langmuir 1:1 funcional. Los
análisis de las afinidades de unión relativas de los anticuerpos
para VEGF-D\DeltaN\DeltaC humano se dan en la
tabla siguiente. Puesto que los anticuerpos estaban inmovilizados,
se asumió una valencia de 1 para el ligando. Todos los anticuerpos
mos-
traban afinidad similar (K_{D} de 30 a 60 nM) con K_{S} de entre 7,4 y 10,7 x 10^{-4} M^{-1}s^{-1} y K_{d} de entre 2,1 y 5,2 x 10^{-3} s^{-1}.
traban afinidad similar (K_{D} de 30 a 60 nM) con K_{S} de entre 7,4 y 10,7 x 10^{-4} M^{-1}s^{-1} y K_{d} de entre 2,1 y 5,2 x 10^{-3} s^{-1}.
| Anticuerpo | K_{s} (1/Ms) | K_{d} (1/s) | K_{D} (M) |
| 5F12 | 8,6e4 | 5,2e-3 | 6,05e-8 |
| 4A5 | 7,4e4 | 2,16e-3 | 2,98e-8 |
| 4E10 | 7,8e4 | 4,45e-3 | 5,71e-8 |
| 2F8 | 1,07e5 | 3,9e-3 | 3,64e-8 |
Se ensayó la capacidad de los anticuerpos
monoclonales purificados (AcMs) 2F8, 4A5, 4E10 y 5F12 para
interferir en la actividad de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC mediada por el
VEGFR-2 de ratón (también conocidos como Flk1 y
NyK), usando el bioensayo descrito en el Ejemplo 7 de la solicitud
de patente internacional WO 98/07832. Este ensayo implica el uso de
células pre-B, BaF3 que se habían transfectado con
una construcción plasmídica que codifica un receptor quimérico
compuesto por el dominio extracelular de VEGFR-3 y
el dominio citoplásmico del receptor de la eritropoyetina (EpoR)
(células Ba/F3-NYk-EpoR).Estas
células se cultivan de forma rutinaria con
interleuquina-3 (IL-3) y morirán en
ausencia de IL-3. Sin embargo, si se induce la
señalización a través del dominio citoplásmico del receptor
quimérico, estas células sobreviven y proliferan en ausencia de
IL-3. Esta señalización es inducida por ligandos
que se unen al dominio extracelular del receptor quimérico
VEGFR-2. Por tanto, la unión de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC o VEGF al dominio
extracelular del VEGFR-2 hace que las células
sobrevivan y proliferen en ausencia de IL-3. La
adición de anticuerpos que interfieren con la unión de estos
ligandos al dominio extracelular o con la activación del dominio
citoplásmico causará la muerte celular en ausencia de
IL-3. En ausencia de IL-3,
VEGF-D\DeltaN\DeltaC y VEGF no inducen
proliferación en las células parentales Ba/F3 que carecen del
receptor quimérico, lo que indica que las respuestas de las células
Ba/F3-NYK-EpoR a estos ligandos es
totalmente dependiente del receptor quimérico.
Las muestras de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC purificada se incubaron con
cantidades de anticuerpos durante una hora a 4ºC en PBS antes de la
dilución de las mezclas 1:10 con medio de cultivo celular deficiente
en IL-3. Los medios resultantes contenían
aproximadamente 500 ng/ml de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC y un intervalo de
concentraciones de los anticuerpos de hasta 100 \mug/ml. A
continuación, las células
Ba/F3-NYK-EpoR se incubaron en los
medios durante 48 horas a 37ºC. Después, se cuantificó la síntesis
de ADN mediante la adición de 1 \muCi de
^{3}H-timidina e incubación adicional durante 4
horas antes de la recogida. La incorporación de
^{3}H-timidina se midió usando un recolector de
células (Tomtec®, Orange, Conn) y contando la radiación beta. El
efecto de anticuerpos 2F8, 4A5, 4E10 y 5F12 en la respuesta
proliferativa a VEGF-D\DeltaN\DeltaC de las
células Ba/F3-NYK-EpoR se muestra en
la Figura 2, en la que los valores representan la media de dos
experimentos y las barras de errores indican el intervalo de los
dos experimentos en cada punto.
El anticuerpo 4A5 bloqueaba la repuesta de las
células Ba/F3-NYK-EpoR a
VEGF-D\DeltaN\DeltaC en forma dependiente de la
dosis (Figura 2). La inclusión del anticuerpo 4A5 a 40 \mug/ml en
el medio de cultivo celular era suficiente para bloquear
completamente la respuesta de las células. Por el contrario, los
otros tres anticuerpos a una concentración de casi 80 \mug/ml no
tenían efecto detectable en la respuesta. Estos resultados
demuestran que el anticuerpo 4A5 interfiere con la actividad de
VEGF-D mediada por el VEGFR-2. Las
células del hibridoma de ratón, 4A5_{A}, que producen el
anticuerpo 4A5 se ha depositado en la American Type Culture
Collection, Manassas, VA 20110-2209, EE.UU. el 16 de
abril de 1999 (ATCC Nº HB-12698). El depósito se
hizo bajo los requerimientos del Tratado de Budapest sobre el
Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los
Fines del Procedimiento en Materia de Patentes.
El efecto inhibidor del anticuerpo 4A5 en el
bioensayo del Ejemplo IV podría ser debido al efecto del anticuerpo
bloqueando la unión de VEGF-D\DeltaN\DeltaC al
receptor o el posterior entrecruzamiento del receptor. El bioensayo
del Ejemplo IV no permite distinguir entre la inhibición debida a
estos dos mecanismos diferentes. Para estudiar directamente el
efecto de los cuatro AcMs
anti-VEGF-D\DeltaN\DeltaC, 2F8,
4A5, 4E10 y 5F12 en la unión de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC a los respectivos
receptores, la interacción de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC con los dominios
extracelulares del receptor inmovilizado se analizó con un
biosensor. El dominio extracelular del VEGFR-2
(VEGFR-2 FLAG) de ratón y una proteína quimérica
compuesta por el dominio extracelular del VEGFR-3
humano y la porción Fc de la IgG_{1} humana
(VEGFR-3-Ig), se inmovilizaron en
los chips sensores como se ha descrito en el Ejemplo III (4.677 y
5.113 UR equivalen a 4,7 y 5,1 ng/mm^{2}, respectivamente). Los
efectos de los anticuerpos en las interacciones con el receptor se
determinaron mediante mezclas de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC humano purificado (61 nM),
preincubado con concentraciones variables (37,5 a 1.200 nM) de los
anticuerpos frente a VEGF-D\DeltaN\DeltaC
durante 1 h en PBS a 4ºC. Se inyectaron alícuotas de 30 \mul en
los chips sensores a un caudal de 10 \mul/ml, de las mezclas que
contienen VEGF-D\DeltaN\DeltaC humano a 2
\mug/ml y concentraciones variables de anticuerpos, como se
muestra en las Figuras 3A y 3B. Las Figuras 3A y 3B muestran los
resultados de este ensayo. El anticuerpo 4A5 era suficiente para
bloquear casi por completo la unión a ambos receptores. Los
anticuerpos 2F8 y 5F12 también inhiben las interacciones con ambos
receptores, pero a concentraciones de anticuerpo mucho mayores que
las de 4A5. Se requería aproximadamente un exceso molar de 40 veces
de 2F8 y 5F12 para bloquear prácticamente la unión a ambos
receptores. Por el contrario, 4E10 sólo tenía efectos marginales.
Estos datos indican que los anticuerpos 4A5, 2F8 y 5F12 serán útiles
para los análisis de la función biológica de VEGF-D
y para la inhibición de la bioactividad de VEGF-D en
un contexto clínico. El porcentaje de inhibición de la unión se
calculó usando las señales del biosensor observadas al principio de
la fase de disociación en presencia de un competidor (URc) y la
señal observada con VEGF-D\DeltaN\DeltaC
inyectado a 2 \mug/ml en presencia de un anticuerpo control no
específico (AcM anti-EGFR 528 (8)) (URt) como sigue:
% de Competición = URt-URc/URt x 100.
Como control, se ensayó la capacidad de los
anticuerpos para interferir con la respuesta proliferativa de las
células Ba/F3-NYK-EpoR a
VEGF_{164} murino purificado. Los resultados de estos ensayos se
muestran en la Figura 4. Ninguno de los anticuerpos tenía ningún
efecto significativo en la respuesta de las células a VEGF_{164}
murino. Estos resultados demuestran que el anticuerpo 4A5 interfiere
con la actividad de VEGF-D mediada por el
VEGFR-2, pero no interfiere con la actividad de VEGF
mediada por este receptor.
El mismo inmunoensayo enzimática descrito
anteriormente se usó para ensayar la capacidad de los seis AcMs
frente a VEGF-D para unirse a
VEGF-C\DeltaN\DeltaC.
VEGF-C\DeltaN\DeltaC está compuesto del domino
de homología de VEGF (VHD) de VEGF-C (restos 103 a
215) y es la región de VEGF-C que es más idéntica a
VEGF-D\DeltaN\DeltaC.
VEGF-C\DeltaN\DeltaC, al que se ha añadido una
etiqueta de histidina x 6 en el extremo C-terminal,
se expresó en la cepa GS115 de la levadura P. pastoris
usando el vector de expresión pIC9 (Invitrogen, San Diego, CA)
según las instrucciones del fabricante y se purificó usando una
resina Superflow, Ni-NTA (QIAGEN, Valencia, CA). De
los seis anticuerpos analizados en este inmunoensayo, sólo 4E10 se
unía a VEGF-C\DeltaN\DeltaC.
Se ensayó la capacidad de los cuatro AcMs
anti-VEGF-D\DeltaN\DeltaC 2F8,
4A5, 4E10 y 5F12, para interferir con la unión de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC al dominio extracelular del
VEGFR-3, usando un ensayo in vitro de unión
al receptor. Una construcción plasmídica que codificaba una proteína
quimérica compuesta por el dominio extracelular del
VEGFR-3 humano y la porción Fc de la IgG humana (K.
Pajusola, Biotechnology Institute, Helsinki) se transfectó en
células 293-EBNA usando Fugene 6 (Boehringer
Mannheim, Alemania) según las instrucciones proporcionadas por el
fabricante. La proteína quimérica se purificó a partir de los
sobrenadantes de las células por agitación suave con perlas de
Sepharose Proteína A (Amersham, Reino Unido) durante una noche a 4ºC
y elución con glicina-HCl 10 mM, pH 2,8. La
presencia de la proteína quimérica en el eluído se confirmó usando
una pequeña proporción de la muestra para su análisis por
inmunoelectroforesis con un anticuerpo IgG de cabra
anti-humano, específico del fragmento Fc, purificado
por afinidad y conjugado con peroxidasa (Jackson Immunoresearch
Labs. West Grove, PA). La muestra restante se diluyó 1:3 con tampón
bicarbonato sódico 50 mM (pH 9,6), se concentró aproximadamente 4
veces usando un concentrador Centricon 10 (Amicon, Beverly, MA) y se
incubó a 37ºC durante una hora en los pocillos de una placa de
microvaloración de 96 pocillos (Linbro/Titertek, ICN Biomedicals,
Aurora, OH). Tras retirar la solución que contenía la proteína
quimérica, las placas se lavaron exhaustivamente con PBS y Tween 20
(PT20) al 0,05% y se bloquearon con albúmina sérica bovina al 1% en
PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se
lavaron una vez más con PT20 y, a continuación, se incubaron con PBS
que contenía VEGF-D\DeltaN\DeltaC (7,3
\mug/ml) y los AcMs durante una hora a temperatura ambiente. Tras
la adición a la placa de microvaloración, el
VEGF-D\DeltaN\DeltaC y los AcMs se incubaron
conjuntamente durante una hora a 4ºC. Tras la incubación con la
solución de VEGF-D\DeltaN\DeltaC y AcMs, las
placas se lavaron con PT20 y se incubaron agitando con PBS que
contenía 3,5 \mug/ml del AcM anti-FLAG M2 (Sigma,
St. Louis, MO) durante dos horas a 4ºC. El AcM M2 podía usarse para
detectar el VEGF-D\DeltaN\DeltaC unido al
VEGFR-3 en el ensayo de unión al receptor ya que el
polipéptido está marcado en el extremo N-terminal
con el octapéptido FLAG® (Sigma, St. Louis, MO). Las placas se
lavaron de nuevo con PT20, se incubaron con el conjugado de
estreptavidina-peroxidasa (Boehringer Mannheim,
Alemania) agitando durante una hora a 4ºC y se lavaron una vez más
con PT20. A continuación, el ensayo se reveló con el sistema del
sustrato ABTS (Zymed, San Francisco, CA) y se cuantificó leyendo la
absorbancia a 414 nm en un lector de placas multipocillo (Flow
Laboratories MCC/340, McLean, VA).
Se desarrollaron dos controles negativos para el
ensayo. En primer lugar, se transfectaron células
293-EBNA con una construcción plasmídica que
expresaba una proteína quimérica compuesta por el dominio
extracelular del VEGFR-1 humano y la porción Fc de
la IgG humana (E. Korpelainen, Haartman Institute, Helsinki). La
transfección de las células 293-EBNA, la
purificación de la proteína quimérica, el análisis por
inmunotransferencia y el ensayo de unión (en ausencia de AcMs) se
realizaron exactamente como se ha descrito anteriormente. La
proteína VEGFR-1/Ig actúa como control negativo
para el ensayo ya que VEGF-D\DeltaN\DeltaC no se
une al VEGFR-1. En segundo lugar, las células
293-EBNA se transfectaron con un vector de expresión
carente de las secuencias que codifican los receptores de VEGF. El
medio condicionado de estas células se usó exactamente como los que
contenían las proteínas quiméricas VEGFR-3/Ig y
VEGFR-1/Ig.
Para ensayar si los cuatro AcMs interferían con
la unión del AcM M2 a VEGF-D\DeltaN\DeltaC, la
superficie de las placas de microvaloración se recubrieron con
VEGF-D\DeltaN\DeltaC purificado por afinidad
mediante incubación a 37ºC durante una hora en tampón bicarbonato
sódico 50 mM (pH 9,6). A continuación, las placas se lavaron con
PT20, se incubaron en presencia o ausencia de los AcMs
anti-VEGF-D durante una hora a 4ºC,
se lavaron una vez más con PT20 y se incubaron con AcM M2
biotinilado, se lavaron, revelaron y cuantificaron como se describe
anteriormente. Estos ensayos controles se realizaron con una
cantidad constante de VEGF-D\DeltaN\DeltaC y el
mismo intervalo de concentraciones de los cuatro AcMs
anti-VEGF-D usando en el ensayo de
unión al receptor. Además, los controles se realizaron con una
concentración constante de cada AcM (200 \mug/ml) y
aproximadamente un intervalo de concentraciones de 100 vez de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC. En ambos grupos de
controles, la detección de VEGF-D\DeltaN\DeltaC
mediante el AcM M2 biotinilado era idéntica en presencia o ausencia
de los AcMs anti-VEGF-D,
independientemente de las concentraciones de AcMs
anti-VEGF-D o de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC en las pruebas. Estos
ensayos de control demostraron que ninguno de los cuatro AcMs
ensayados tenía ningún efecto en absoluto sobre la unión del AcM M2
a VEGF-D\DeltaN\DeltaC.
El efecto de los cuatro AcMs frente a
VEGF-D en la unión de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC al VEGFR-3
se muestra en la Figura 4. La concentración de AcM indica la
concentración de cada AcM en la solución con
VEGF-D\DeltaN\DeltaC en los pocillos de las
placas de microvaloración. Cada curva representa los resultados de
dos ensayos y las barras de error indican el intervalo de
absorbancia medido en los dos experimentos para cada concentración
de anticuerpo. El AcM 4E10 no tenía efecto sobre esta interacción
incluso hasta una concentración de 200 \mug/ml. Por el contrario,
una concentración de 25 \mug/ml del AcM 4A5 era suficiente para
bloquear casi por completo la interacción entre el ligando y el
dominio extracelular del VEGFR-3. Los AcMs 2F8 y
5F12 tenían efectos inhibidores menores a concentraciones superiores
a 90 \mug/ml, que eran bastante menos llamativos que el efecto de
4A5. Los controles negativos, carentes de los AcMs anti
VEGF-D, generados a partir de células que expresaban
tanto una proteína quimérica VEGFR-3/Ig como
derivados diferentes al receptor VEGF daban una absorbancia que era
igual a la de los ensayos de VEGFR-3/Ig cuando el
AcM 4A5 se incluía a una concentración de 200 \mug/ml, es decir,
cuando la interacción de VEGF-D\DeltaN\DeltaC
con el VEGFR-3 se había bloqueado por completo. Esto
demostró que la unión de VEGF-D\DeltaN\DeltaC a
las placas de microvaloración en el ensayo dependía del dominio
extracelular del VEGFR-3.
La descripción anterior y los ejemplos se
muestran solamente para ilustrar la invención y no pretender ser
limitantes.
<110> ACHEN, Marc G., STACKER, Steve
A.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTICUERPOS FRENTE A
VEGF-D TRUNCADO Y SUS USOS
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<130> Listado de secuencias
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<140>
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<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/113.254
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
21-12-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/134.556
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-05-1999
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
<110> LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER
RESEARCH
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<120> ANTICUERPOS FRENTE A
VEGF-D TRUNCADO Y SUS USOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> LUDWIG Institute for Cancer
Research
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US99/31332
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<141>
21-12-1999
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<150> US 60/113.254
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<151>
21-12-1998
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<150> US 60/134.556
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<151>
17-05-1999
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<160> 1
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 109
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<212> PROT
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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Claims (14)
1. Una composición de materia que comprende el
anticuerpo 4A5 producido por las células del hibridoma de ratón
4A5_{A}, depositado en la American Type Culture Collection como
ATCC Nº HB-12698, que se une a
VEGF-D\DeltaN\DeltaC e interfiere en la unión de
VEGF-D al VEGFR-2 y al
VEGFR-3, y que no se une a VEGFR-C y
no interfiere en la actividad de VEGF mediada por el
VEGFR-2.
2. Una composición de materia según la
reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo
humanizado.
3. Una composición de materia según la
reivindicación 1 ó 2, en la que dicho anticuerpo está marcado con un
marcador detectable.
4. Una composición de materia según la
reivindicación 3, en la que dicho marcador detectable es un isótopo
radiactivo.
5. Una célula de hibridoma que es 4A5_{A}, que
está depositada en la American Type Culture Collection como ATCC Nº
HB-12698.
6. Un kit de ensayo diagnóstico o pronóstico
para VEGF-D que comprende un anticuerpo según
cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y medios para
detectar la unión de dicho anticuerpo.
7. Una composición farmacéutica, que comprende
un anticuerpo según una de las reivindicaciones 1-4
y un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
8. Una composición farmacéutica para
interferir con una actividad biológica inducida por
VEGF-D, que comprende un anticuerpo según cualquiera
de las reivindicaciones 1-4, y un vehículo o
adyuvante farmacéuticamente aceptable.
9. Un procedimiento in vitro para
interferir con al menos una actividad biológica inducida por
VEGF-D seleccionada entre permeabilidad vascular,
proliferación de la célula endotelial, angiogénesis, lifangiogénesis
y diferenciación de la célula endotelial, que comprende la etapa de
añadir una cantidad de un anticuerpo eficaz para interferir con la
actividad biológica según cualquiera de las reivindicaciones
1-4.
10. Un procedimiento de detección de
VEGF-D en una muestra biológica, que comprende la
etapa de poner en contacto la muestra con un anticuerpo según
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y detectar
la aparición de la unión de dicho anticuerpo.
11. El uso del anticuerpo según cualquiera de
las reivindicaciones 1-4 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad, que podría
beneficiarse de la inhibición de la angiogénesis.
12. El uso del anticuerpo según cualquiera de
las reivindicaciones 1-4 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad, que podría
beneficiarse de la inhibición de la linfangiogénesis.
13. El uso del anticuerpo según cualquiera de
las reivindicaciones 1-4 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre
el grupo compuesto por: cáncer, retinopatía diabética, psoriasis o
artropatías.
14. Un agente de formación de imágenes que
comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones
1-4.
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