ES2258471T3

ES2258471T3 - Suministro de liposomas cationicos de taxanos a vasos sanguineos angiogenicos.

Info

Publication number: ES2258471T3
Application number: ES00960004T
Authority: ES
Inventors: Donald M. Mcdonald; John W. Mclean; O. Gavin Thurston
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2006-09-01
Anticipated expiration: 2020-09-08
Also published as: PL354721A1; HK1046506A1; PL203128B1; HK1046506B; KR100591767B1; CZ2002850A3; EP1210065A1; AU7122900A; DE60027730T2; DE60027730D1; CA2383412A1; IL148372A0; US20100226970A1; KR20030038530A; CA2383412C; CN1378443A; EP1210065B1; ATE324867T1; WO2001017508A9; IL148372A

Abstract

Un liposoma catiónico, que comprende: al menos un lípido catiónico en una cantidad mayor que 5% molar y opcionalmente al menos un lípido neutro, caracterizado porque comprende un taxano en una cantidad menor que 20% molar.

Description

Suministro de liposomas catiónicos de taxanos a vasos sanguíneos angiogénicos

Campo de la invención

La presente invención corresponde al campo del suministro de liposomas, y particularmente del suministro catiónico de liposomas de taxanos a los vasos sanguíneos.

Antecedentes de la invención

La presente invención puede aplicarse al tratamiento y diagnóstico de una diversidad de enfermedades y anormalidades diferentes. Aunque la presente invención no se limita a ello, puede utilizarse en el tratamiento del cáncer y una diversidad de enfermedades crónicas inflamatorias. En general, cada una se trata actualmente de modo directo por medios físicos tales como la extirpación quirúrgica de tejido canceroso, la suturación de heridas y la extirpación quirúrgica de articulaciones inflamadas. Adicionalmente, cada una puede tratarse por medios químicos.

La quimioterapia se aplica a los cánceres, y se aplican fármacos anti-inflamatorios para tratar las afecciones inflamatorias crónicas. Éstos, y los tratamientos afines están dirigidos, en general, a tratar directamente el tejido canceroso o inflamado. Con objeto de proporcionar una comprensión del modo en que la presente invención se aparta de las modalidades de tratamiento convencionales, se proporciona una descripción breve y general de las tecnologías de tratamiento actuales en estas áreas.

Tratamientos del cáncer

El término "cáncer" abarca un espectro de enfermedades que varían en tratamiento, pronóstico, y curabilidad. El enfoque para el diagnóstico y el tratamiento depende del sitio de origen del tumor, la extensión de propagación, los sitios de implicación, el estado fisiológico del paciente, y el pronóstico. Una vez diagnosticado, el tumor se "escalona" usualmente, un proceso que implica el uso de las técnicas de cirugía, examen físico, histopatología, obtención de imágenes, y evaluación en laboratorio para definir la extensión de la enfermedad y dividir la población de los pacientes de cáncer en grupos por orden de probabilidad de curación decreciente. Tales sistemas se utilizan tanto para planificar el tratamiento y determinar los pronósticos para el paciente (Stockdale (1996) "Principles of Cancer Patient Management", en: Scientific American Medicine, Vol. 3, Dale, D.C., y Federman, D.D. (compiladores), Scientific American Press, Nueva York). El tipo o etapa del cáncer puede determinar cuál de los tres tipos generales de tratamiento se utilizará: cirugía, terapia de radiación, y quimioterapia. También puede seleccionarse un plan de tratamiento agresivo de modalidades combinadas. A este fin, puede utilizarse la cirugía para extirpar el tumor primario, y las células remanentes se tratan con terapia de radiación o quimioterapia. Rosenberg (1985) New Engl. J. Med. 312: 1512-14.

La cirugía juega el papel central en el diagnóstico y tratamiento del cáncer. En general, se requiere un enfoque quirúrgico para la biopsia, y la cirugía puede ser el tratamiento definitivo para la mayoría de los pacientes con cáncer. La cirugía se utiliza también para reducir la masa tumoral, para resecar las metástasis, para resolver emergencias médicas, para paliación y rehabilitación. Aunque la técnica quirúrgica primaria para el tratamiento del cáncer ha implicado el desarrollo de un campo operatorio en el que los tumores se resecan bajo visualización directa, las técnicas actuales permiten que algunas resecciones se realicen por medios endoscópicos. Una implicación primaria en el tratamiento del cáncer es la consideración del riesgo operatorio (Stockdale, F. supra).

La terapia de radiación juega un papel importante tanto en el tratamiento primario del cáncer como en el paliativo. Tanto la teleterapia (terapia de radiación con megavoltaje) como la braquiterapia (radiación intersticial e intracavitaria) son de uso común. La radiación electromagnética en la forma de rayos x se utiliza muy comúnmente en teleterapia para tratar tumores malignos comunes, si bien se utilizan también los rayos gamma, una forma de radiación electromagnética similar a los rayos x pero emitida por isótopos radiactivos de radio, cobalto, y otros elementos. La terapia de radiación transfiere energía a los tejidos en forma de paquetes de energía discretos, denominados fotones, que lesionan tanto los tejidos malignos como los normales por producir ionización en el interior de las células. La diana para los iones es en la mayoría de los casos el DNA; la terapia de radiación aprovecha el hecho de que la lesión por radiación no es uniforme entre los tejidos malignos y no malignos - las células que se dividen rápidamente son más sensibles a la lesión del DNA que las células quiescentes (Pass (1993) J. Natl. Cancer Inst. 85: 443-56.) La terapia de radiación está asociada con ventajas singulares así como con toxicidades importantes. La radiación se prefiere en ciertas áreas anatómicas, (v.g., el mediastino), donde la radiación puede ser el único método local de tratamiento factible, y la radiación puede ser también la única modalidad local factible si la implicación del tumor es extensa. La radiación puede utilizarse también cuando el paciente encuentra inaceptable la cirugía, o cuando el estado médico del paciente hace prohibitivo un procedimiento quirúrgico. El tratamiento por radiación implica un deterioro del tejido que puede conducir a efectos de radiación tempranos y tardíos. Los efectos tempranos (toxicidad aguda de la terapia de radiación) incluyen eritema de la piel, descamación, esofagitis, náusea, alopecia, y mielosupresión, mientras que los efectos tardíos incluyen necrosis y fibrosis tisular, y determinan usualmente la toxicidad límite de la terapia de radiación (Stockdale, F. supra).

Prácticamente todos los agentes quimioterapéuticos actualmente en uso interfieren con la síntesis del DNA, con la provisión de precursores para la síntesis de DNA y RNA, o con la mitosis, y por consiguiente están dirigidos a células diana proliferantes (Stockdale, F., "Cancer growth and chemotherapy", supra). La investigación de tumores en animales y pruebas clínicas en humanos han demostrado que las combinaciones de fármacos producen tasas de respuesta objetiva más altas y supervivencia más duradera que los agentes individuales (Frei (1972) Cancer Res. 32: 2593-2607). La terapia con fármacos de combinación utiliza los diferentes mecanismos de acción y potenciales citotóxicos de fármacos múltiples, que incluyen los agentes alquilantes, antimetabolitos, y antibióticos (Devita, et al. (1975) Cancer 35: 98-110). La condición fisiológica del paciente, las características de crecimiento del tumor, la heterogeneidad de la población de células tumorales, y el estado de resistencia a fármacos múltiples del tumor influyen en la eficacia de la quimioterapia. Generalmente, la quimioterapia no está direccionada (aunque estas técnicas están siendo desarrolladas, v.g. Pastan (1986) Cell 47: 641-648), y pueden producirse como resultado efectos secundarios tales como depresión de la médula ósea, gastroenteritis, náusea, alopecia, lesión hepática o pulmonar, o esterilidad.

Inflamación crónica

Mecanismos inmunitarios naturales, humorales, y celulares han sido implicados todos ellos en la patogénesis de las enfermedades inflamatorias crónicas (Seymour et al. (1979) J. Oral Pathol. 8: 249-65). Las enfermedades autoinmunes son resultado de anormalidades en la función de los linfocitos. Anormalidades en la función de las células T pueden ser responsables de enfermedad por inmunidad mediada por las células, y la actividad de las células adyuvantes T en la producción de anticuerpos puede contribuir a la formación de autoanticuerpos. El papel central de las células T adyuvantes en la enfermedad autoinmune está soportado por la asociación de muchas de estas enfermedades con ciertas moléculas HLA. El fallo de uno o más pasos en el mantenimiento de la tolerancia podría dar como resultado autoinmunidad (Robinson (1996) "Immunologic Tolerance and Autoimmunity", en: Scientific American Medicine, Vol. 2, Section VI, Scientific American Press, Nueva York, p. 1-11).

En las enfermedades autoinmunes se utilizan varios tipos de tratamiento, todos los cuales están dirigidos a aminorar la respuesta inmunológica en el tejido afectado. Por ejemplo, el tratamiento para la artritis reumatoide, una enfermedad autoinmune, puede utilizar agentes anti-inflamatorios tales como agentes anti-inflamatorios no esteroidales (NSAIDs) o glucocorticosteroides, agentes inductores de remisión tales como sales de oro, y/o fármacos inmunosupresores tales como ciclofosfamida. Puede utilizarse también la cirugía ortopédica para reemplazar articulaciones lesionadas durante el proceso inflamatorio (véase Gilliland B.C., y Mannik, M. 1983, "Reumatoid Arthritis" en: Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw Hill, Nueva York, p. 1977-1984). Trabajos recientes han sugerido las posibilidades de nuevos tratamientos, dirigidos también al tejido afectado, tales como el uso de TNF\alpha en el tratamiento de la artritis reumatoide (Brennan, et al. (1995) Br. Med. Bull. 51: 368-384).

La alergia hace referencia a una condición en la cual la respuesta inmunológica a los antígenos ambientales causa inflamación tisular y disfunción orgánica. Como en las enfermedades autoinmunes, los datos sugieren una interacción de varios componentes del sistema inmunitario en las enfermedades alérgicas. La diversidad de expresión de las enfermedades alérgicas proviene de diferentes mecanismos inmunológicos efectores, que evocan patrones específicos de lesión tisular (Beer, et al. (1996) "Allergy", en: Scientific American Medicine, Vol. 2, Section VII, Scientific American Press, Nueva York, p. 1-29). Las características clínicas de cada enfermedad alérgica reflejan la respuesta inflamatoria mediada inmunológicamente en los órganos o tejidos afectados (v.g. el asma refleja una respuesta inflamatoria en las vías aéreas).

Se utilizan varias estrategias de tratamiento para tratar las enfermedades alérgicas mediadas inmunológicamente, todas las cuales están dirigidas a aminorar la respuesta inmunológica en el tejido inflamado. Por ejemplo, en el tratamiento del asma, la terapia puede implicar control ambiental, farmacoterapia, e inmunoterapia con alérgenos (Beer, et al., (1996) "Allergy", en: Scientific American Medicine, Vol. 2, Section VII, Scientific American Press, Nueva York, p. 1-29). En el tratamiento del asma, la eliminación del agente causal es el medio más satisfactorio de prevención de la inflamación. Sin embargo, esto no es posible en muchos casos, por lo que se han utilizado varias clases de fármacos. Éstos incluyen las metilxantinas (para broncodilatación) estimulantes adrenérgicos (estimulación de los receptores \alpha-adrenérgicos, broncodilatadores), glucocorticoides (reducen la inflamación en el pulmón), cromonas (regulan decrecientemente los mastocitos, reducen la inflamación en el pulmón), y anticolinérgicos (broncodilatadores) (McFadden, et al., "Lung disease caused by immunologic and environmental injury", en: Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw Hill, Nueva York, p. 1512-1519). La desensibilización o inmunoterapia con extractos de los alérgenos sospechosos ha sido sugerida también a fin de reducir la inflamación en el asma (McFadden y Austen, op. cit.; Jacquemin and Saint-Remy (1995) Ther. Immunol. 2:41-52).

Placas ateroescleróticas

La ateroesclerosis es el estrechamiento progresivo del lumen (conducto interior) de los vasos sanguíneos arteriales por capas de placa (tejidos grasos y fibrosos). Las complicaciones principales de la ateroesclerosis, con inclusión de enfermedad cardiaca isquémica, infarto de miocardio, derrame cerebral, y gangrena de las extremidades, responden de más de la mitad de la mortalidad anual en los Estados Unidos.

Las arterias se componen de tres capas: la íntima, que comprende endotelio y tejido conectivo en el lado luminal de la lámina elástica interna; la media, que comprende células musculares lisas y, en las arterias elásticas, fibras elásticas, y, en los vasos grandes, el vasa vasorum; y la adventicia, que es la capa externa de la pared del vaso y comprende una vaina de tejido conectivo compuesta de fibroblastos, pequeños vasos, y nervios. La ateroesclerosis puede ocurrir en cualquier arteria. En las arterias coronarias, puede dar como resultado ataques cardiacos; en las arterias cerebrales puede dar como resultado derrames cerebrales; y en las arterias periféricas puede dar como resultado gangrena de las extremidades. La ateroesclerosis es un proceso complejo, y no se conoce exactamente el modo en que comienza o cuál es su causa. Sin embargo, se cree que una lesión endotelial es un paso inicial en la formación de las lesiones ateroescleróticas, y puede estar causada por tensión hemodinámica, hipercolesterolemia, hipertensión o enfermedad inmunológica compleja. La lesión endotelial conduce a acumulación de colesterol y lípidos, engrosamiento de la íntima, proliferación de células musculares lisas, y formación de fibras de tejido conectivo. Gradualmente, la acumulación de depósitos grasos y la proliferación de las células musculares lisas conducen a la formación de placas que, con el tiempo, estrechan y bloquean la arteria.

La neovascularización en el interior de la íntima de las lesiones ateroescleróticas humanas ha sido descrita, pero su papel en la progresión de la ateroesclerosis no está claro. Moulton, et al. (1999) Circulation 99: 1726-1732; Isner (1999) Circulation 99: 1653-1655; Depre, et al. (1996) Catheterization and Cardiovascular Diagnosis 39: 215-220.

La tasa de mortalidad debida a la ateroesclerosis y patologías afines demuestra claramente que los tratamientos actuales son inadecuados. El factor más importante en la causa de los sucesos ateroescleróticos es una elevada concentración de colesterol en el plasma sanguíneo, en la forma de lipoproteínas de baja densidad. Los métodos actuales de tratamiento incluyen fármacos que inhiben el sistema enzimático del hígado para la síntesis de colesterol.

Tratamientos actuales - inmunología

Los regímenes de tratamiento arriba descritos han tenido grados de éxito variables. Dado que la tasa de éxito está lejos de ser perfecta en muchos casos, la investigación continúa desarrollando mejores tratamientos. Un área prometedora de investigación se refiere a la afectación del sistema inmunitario. Por el uso de ingeniería genética y/o estimulación química es posible modificar y/o estimular las respuestas inmunológicas de tal modo que el sistema inmunitario del propio cuerpo trate la enfermedad, v.g., que los anticuerpos destruyan las células cancerosas. Este tipo de tratamiento se desvía de los descritos anteriormente en el sentido de que utiliza un proceso biológico para luchar contra una enfermedad. Sin embargo, el tratamiento es todavía un tratamiento directo, lo que significa que los anticuerpos creados atacan directamente las células cancerosas.

La presente invención puede utilizarse para tratamientos que implican una desviación radical de los tratamientos normales en el sentido de que la presente invención no implica la afectación directa a las células cancerosas, lesionadas o inflamadas.

Otros investigadores han reconocido que, al menos teóricamente, es posible tratar el cáncer o la inflamación asociada con la angiogénesis por inhibición de la angiogénesis. Un ejemplo típico del pensamiento actual en relación con esto se expone en la publicación PCT WO 95/25543, publicada el 28 de Septiembre de 1995. Esta solicitud publicada describe la inhibición de la angiogénesis por administración de un anticuerpo que se fija a un antígeno que se cree está presente en la superficie de las células endoteliales angiogénicas. Específicamente, la solicitud describe la administración de un anticuerpo que se fija a \alpha_{v}\beta_{3} que es un receptor de membrana que se cree media las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular a las que se hace referencia generalmente como sucesos de adhesión celular. Por el bloqueo de este receptor, se espera que el tratamiento inhiba la angiogénesis y trate de este modo el cáncer y la inflamación.

Sumario de la invención

Se describe un método de suministro selectivo de un taxano a las células endoteliales angiogénicas. El método implica inyectar, preferiblemente en el sistema circulatorio y de modo más preferible intraarterialmente, liposomas catiónicos que comprenden lípidos catiónicos y un taxano que inhibe la angiogénesis. Después de la administración, los liposomas catiónicos se asocian selectivamente con las células endoteliales angiogénicas, lo que significa que aquéllos se asocian con las células endoteliales angiogénicas en una proporción doble o mayor (preferiblemente diez veces mayor o más) de la que se asocian los mismos con las células endoteliales quiescentes correspondientes que no toman parte en la angiogénesis. Cuando los liposomas se asocian con las células endoteliales angiogénicas, aquéllos son absorbidos por la célula endotelial y producen su efecto deseado. El taxano puede destruir la célula endotelial y promover la coagulación.

Un objeto de la invención es proporcionar un método de afectar selectivamente a las células endoteliales angiogénicas, inhibiendo con ello la angiogénesis.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método para diagnosticar un sitio de angiogénesis por administración de liposomas catiónicos que comprenden un taxano y un marcador detectable, diseñándose dichos liposomas a fin de asociarse de modo selectivo con las células endoteliales angiogénicas y no asociarse con las células endoteliales correspondientes que no toman parte en la angiogénesis.

Otro objeto de la invención es proporcionar liposomas catiónicos, estando dichos liposomas constituidos por lípidos catiónicos y un taxano que están destinados y diseñados específicamente para inhibir la angiogénesis, pudiendo ser dicho taxano soluble en agua o fácilmente dispersable en agua o compatible con los lípidos, y pudiendo estar incorporado en las capas lipídicas.

Otro objeto de la invención es proporcionar composiciones catiónicas que comprenden lípidos catiónicos y un taxano.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método de direccionar las células endoteliales angiogénicas con un taxano asociado a un lípido catiónico.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método de afectar selectivamente a las células endoteliales angiogénicas de una manera que da como resultado la coagulación local de la sangre intravascular que inhibe o bloquea por completo el flujo de sangre un vaso sanguíneo.

Otro objeto es proponer un método para analizar las células endoteliales angiogénicas por marcación de las células con un marcador detectable y hacer posible con ello la separación de las células endoteliales angiogénicas de las células circundantes para cultivo y/o análisis subsiguientes.

Otro objeto adicional de la invención es proporcionar un método para destruir un tumor indeseable por suministro de un taxano a las células endoteliales angiogénicas del tumor, destruyendo dicho compuesto las células endoteliales angiogénicas, y destruyendo después de ello las células tumorales.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar un método para reducir la formación de una placa ateroesclerótica en un vaso sanguíneo por suministro de un complejo de lípido catiónico que contiene una sustancia que reduce la angiogénesis, reduciendo con ello la formación de placa.

Una característica de la invención es que los liposomas catiónicos de la invención se asocian selectivamente con las células endoteliales angiogénicas con una preferencia mucho mayor (dos veces o más y preferiblemente diez veces o más) de la preferencia con que se asocian aquéllos con las células endoteliales correspondientes no implicadas en la angiogénesis.

Una ventaja de la invención es que los liposomas catiónicos de la invención pueden utilizarse para suministrar con precisión pequeñas cantidades de un taxano a las células endoteliales, células que son afectadas de una manera (v.g., muertas) tal que el vaso sanguíneo se destruye o se hace inoperante por ejemplo por un coágulo de sangre y se suprime el suministro de nutrientes a los tejidos circundantes (tales como células tumorales), destruyendo con ello el tejido (v.g., destruyendo un tumor sólido).

Otra ventaja de la invención es que los liposomas catiónicos de la invención pueden utilizarse para inhibir la angiogénesis asociada con tumores malignos o benignos asociados con angiogénesis progresiva.

Una característica importante de la invención es que se tratan varias clases de enfermedades y/o anormalidades sin tratar directamente el tejido implicado en la anormalidad; v.g., se suprime el suministro de sangre a un tumor por inhibición de la angiogénesis, y se destruye el tumor sin tratar directamente las células tumorales de ningún modo.

Estos y otros objetos, ventajas y características de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica después de la lectura de la exposición aquí proporcionada en conexión con las figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una micrografía de fluorescencia que muestra la absorción de los complejos fluorescentes rojos DDAB:colesterol-DNA marcados con CM-Dil en vasos sanguíneos angiogénicos de un folículo en un ovario de ratón normal (barra de escala: 60 \mum);

La Figura 2 es una micrografía de fluorescencia que muestra la absorción de los complejos fluorescentes rojos DDAB:colesterol-DNA marcados con CM-Dil en vasos sanguíneos angiogénicos en una sección de un tumor pancreático en un ratón RIP1-Tag5 - los vasos teñidos de color verde con una lectina fluorescente (barra de escala: 40 \mum);

La Figura 3 es una micrografía de fluorescencia con bajo aumento que muestra la escasa o nula absorción de los complejos DOTAP:colesterol-DNA marcados con Rojo Texas (amarillo-anaranjados) en los vasos sanguíneos de un islote pancreático de ratón normal (barra de escala: 150 \mum);

La Figura 4 es una micrografía de fluorescencia con bajo aumento que muestra la absorción de los complejos DOTAP:colesterol-DNA marcados con Rojo Texas (amarillo-anaranjados) en los vasos sanguíneos de un tumor pancreático en de ratón RIP1-Tag2 (barra de escala: 150 \mum);

La Figura 5 es una micrografía confocal que muestra la escasa o nula absorción de los liposomas DOTAP:colesterol marcados con Rojo Texas (rojo-anaranjados) en un islote pancreático normal; los vasos se tiñeron (verde) con lectina fluorescente (barra de escala 50 \mum);

La Figura 6 muestra una micrografía confocal de la absorción de los liposomas DOTAP:colesterol marcados con Rojo Texas (rojo-anaranjados) en un tumor pancreático de un ratón RIP1-Tag2. Los vasos se tiñeron por perfusión de lectina fluorescente de Lycopersicon esculentum (verde) después que se inyectaron los liposomas por vía intravenosa (barra de escala: 50 \mum);

La Figura 7 muestra una micrografía confocal de la absorción de liposomas DOTAP:colesterol marcados con Rojo Texas (rojo-anaranjados) en un tumor pancreático de un ratón RIP1-Tag2. Los vasos se tiñeron por perfusión de lectina de Lycopersicon esculentum fluorescente (verde) después de inyectar los liposomas por vía intravenosa (barra de escala: 50 \mum);

La Figura 8 muestra una micrografía confocal de la absorción de liposomas DOTAP:colesterol marcados con Rojo Texas (rojo-anaranjado) en un tumor pancreático en un ratón RIP1-Tag2. Los vasos se tiñeron por perfusión de lectina de Lycopersicon esculentum fluorescente (verde) después de inyectar los liposomas por vía intravenosa. Los sitios posibles de crecimiento de vasos exhiben absorción intensa (barra de escala: 50 \mum);

La Figura 9 es una micrografía confocal que muestra la escala absorción de los liposomas DOTAP:colesterol marcados con Rojo Texas (rojo-anaranjado) en vasos sanguíneos normales en la tráquea de un ratón exento de patógenos; los vasos se tiñeron en verde con una lectina fluorescente (barra de escala: 50 \mum);

La Figura 10 muestra una micrografía confocal de la absorción de los liposomas DOTAP:colesterol teñidos con Rojo Texas (rojo-anaranjado) en vasos sanguíneos angiogénicos en la tráquea de un ratón con infección por Mycoplasma pulmonis (barra de escala: 50 \mum);

La Figura 11 es un gráfico que muestra la cantidad de absorción de los liposomas Rojo Texas-DOTAP:colesterol por los vasos sanguíneos de tráqueas de ratón exenta de patógenos (normal) e infectada con Mycoplasma pulmonis, evaluada por medida de la intensidad de fluorescencia de los liposomas 4 horas después de inyección intravenosa. Las medidas se realizaron con un microscopio confocal Zeiss LSM 410. Los ratones infectados se inocularon por vía intranasal con organismos de M. pulmonis y se examinaron 4 semanas después. El asterisco designa una diferencia estadísticamente significativa (P < 0,05, ``SE medio, n = 4 ratones por grupo);

La Figura 12 es una micrografía electrónica de transmisión que muestra liposomas DOTAP-colesterol asociados con una célula endotelial en la tráquea de un ratón infectado con M. pulmonis (barra de escala: 50 \mum);

La Figura 13 es una micrografía electrónica de transmisión que muestra liposomas DOTAP-colesterol absorbidos por una célula endotelial en la tráquea de un ratón infectado con M. pulmonis (barra de escala: 80 \mum);

La Figura 14 es una micrografía de fluorescencia que muestra la asociación de liposomas catiónicos de paclitaxel con el revestimiento interior de células endoteliales de la tráquea de un ratón exento de patógenos (panel A), y la tráquea de un ratón infectado con M. pulmonis (panel B).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Antes de describir el método presente de afectar/marcar selectivamente las células endoteliales angiogénicas y los liposomas utilizados en el método, debe entenderse que esta invención no se limita a los liposomas, métodos, o taxanos particulares, dado que las sustancias activas descritas como tales pueden variar, por supuesto. Debe entenderse también que la terminología utilizada en esta memoria tiene por objeto describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Debe tenerse en cuenta que, tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "y" y "el" incluyen referentes plurales a no ser que los contextos dicten claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un liposoma" incluye mezclas y grandes números de tales liposomas, la referencia a "un taxano" incluye grandes números de taxanos y mezclas de los mismos, y la referencia a "el método" incluye uno o más métodos o pasos del tipo descrito en esta memoria.

Las publicaciones expuestas en esta memoria se proporcionan únicamente por su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada contenido en ellas debe interpretarse como admisión de que la presente invención no tenga derecho a preceder a dicha publicación en virtud de invención previa.

A no ser que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos incluidos en esta memoria tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualesquiera métodos y materiales, similares o equivalentes a los aquí descritos, pueden utilizarse en la práctica o el ensayo de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen en esta memoria. Todas las publicaciones citadas en esta memoria se incorporan por la presente por referencia para el propósito de exposición y descripción de aspectos específicos de la invención para los cuales se cita la publicación.

Definiciones

Los términos "tratamiento", "terapia", "tratar" y análogos se utilizan en esta memoria para significar generalmente la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de ella y/o puede ser terapéutico en términos de una estabilización o curación parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se utiliza en esta memoria, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un humano, e incluye:

(a): prevenir la aparición de la enfermedad o síntoma en un individuo que puede ser propenso a la enfermedad o síntoma pero que no ha sido diagnosticado de haberla contraído todavía;

(b): inhibir el síntoma de la enfermedad, es decir, frenar su desarrollo; o

(c): aliviar el síntoma de enfermedad, es decir, causar la regresión de la enfermedad o síntoma.

Tal como se utiliza en esta memoria, "sal farmacéuticamente aceptable" hace referencia a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto originario y no imparte efecto toxicológico indeseable alguno. Ejemplos de dichas sales incluyen, pero sin carácter limitante (a) sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, y análogos; y sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalenosulfónico, ácidos naftalenodisulfónicos, y ácido poligalacturónico; (b) sales con cationes metálicos polivalentes tales como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, y análogos; y (c) sales formadas con un catión orgánico formado a partir de N,N'-dibenciletilenodiamina o etilenodiamina; y (d) combinaciones de (a) y (b) o (c), v.g., una sal tanato de cinc; y análogas.

El término "angiogénesis" se refiere a un proceso de vascularización de tejidos que implica el desarrollo de nuevos vasos. La angiogénesis ocurre por uno de tres mecanismos: (1) neovascularización, donde las células endoteliales migran fuera de vasos preexistentes, comenzando la formación de nuevos vasos; (2) vasculogénesis, donde los vasos se generan a partir de células precursoras de novo; o (3) expansión vascular, donde pequeños vasos existentes aumentan de diámetro para formar vasos mayores (Blood, et al. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1032: 89-118).

La angiogénesis es un proceso importante en los procesos normales de crecimiento de los recién nacidos y en el sistema reproductor de las hembras durante el ciclo de crecimiento del cuerpo lúteo (véase Moses, et al. (1990) Science 248: 1408-10). En condiciones normales, todos los procesos que implican la nueva formación o la remodelización de vasos sanguíneos existentes o nuevos constituyen un proceso auto-limitante, y la expansión de los tipos específicos de células está controlada y concertada.

La angiogénesis está implicada también en la curación de las heridas y en la patogénesis de un gran número de enfermedades clínicas que incluyen inflamación tisular, artritis, asma, crecimiento de tumores, retinopatía diabética, y otras afecciones. Las manifestaciones clínicas asociadas con la angiogénesis se conocen como enfermedades angiogénicas (Folkman, et al. (1987) Science 235: 442-7).

Muchos experimentos han sugerido que los tejidos pueden producir factores angiogénicos que promueven angiogénesis en condiciones de suministro deficiente de sangre durante condiciones tanto normales como patológicas. Estos factores y compuestos difieren en especificidad celular y en los mecanismos por los cuales aquéllos inducen el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos. Estos factores funcionan por una diversidad de mecanismos. Por ejemplo, pueden inducir la migración y proliferación de células endoteliales o estimular la producción de colagenasa (véase Klagsbrun, et al. (1991) Ann. Rev. Physiol. 53: 217-39). Existen varios bioensayos que permiten la determinación directa de actividades angiogénicas (Wilting, et al. (1991) Anat. Embrol. (Berl) 183:259-71).

Se ha propuesto que los inhibidores angiogénicos pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, la interferencia con la angiogénesis puede restringir el crecimiento de los tumores. Se han propuesto varios medios para inhibir la angiogénesis, que incluyen (1) inhibir la liberación de factores angiogénicos, (2) neutralizar los factores angiogénicos utilizando medios tales como anticuerpos monoclonales, y (3) inhibir las respuestas de las células endoteliales (Folkman, et al. (1992) Seminars in Cancer Biology 3: 89-96), por el uso de factores anti-angiogénicos, moléculas que se sabe inhiben la angiogénesis. Se han descrito varios inhibidores de las células endoteliales de este tipo, tales como el inhibidor de colagenasa, inhibidores de la renovación de la membrana basal, esteroides angiestáticos, inhibidores derivados de hongos, el factor 4 de las plaquetas, trombospondina, fármacos contra la artritis tales como penicilamina, y alfa-interferón, entre otros (véase Folkman, et al. (1992) Seminars in Cancer Biology 3: 89-96; para ejemplos véanse: Stepien, et al. (1996) J. Endocrinol. 150: 99-106; Malone, et al. (1990) Science 247:
77-9).

El término "células endoteliales" significa aquellas células que constituyen el endotelio, la monocapa de células escamosas simples que reviste la superficie interna del sistema circulatorio. Estas células retienen capacidad de división celular, aunque las mismas proliferan muy lentamente en condiciones normales, sufriendo división celular quizás una sola vez al año. La proliferación de las células endoteliales puede demostrarse utilizando [^{3}H]-timidina para marcar las células que se encuentran en la fase S. En los vasos normales, la proporción de células endoteliales que llegan a marcarse es especialmente alta en los puntos de ramificación de las arterias, donde la turbulencia y el desgaste parecen estimular la reposición. (Goss, (1978) The Physiology of Growth, Academic Press, Nueva York, pp. 120-137). Las células endoteliales normales están quiescentes, es decir, no se dividen, y como tales pueden distinguirse de las células endoteliales angiogénicas como se expone más adelante.

Las células endoteliales tienen también la capacidad de migrar, un proceso importante en la angiogénesis. Las células endoteliales forman nuevos capilares in vivo cuando existe necesidad de ellos, por ejemplo durante la curación de las heridas o cuando existe una necesidad percibida de aquéllos como en la formación de tumores. La formación de nuevos vasos se denomina angiogénesis, e implica moléculas (factores angiogénicos) que pueden ser mitógenas o quimioatrayentes para las células endoteliales (Klagsburn, supra). Durante la angiogénesis, las células endoteliales pueden migrar fuera de un capilar existente para comenzar la formación de un nuevo vaso; es decir, las células de un vaso migran de una manera que permite la extensión de dicho vaso (Speidel, Am. J. Anat. 52: 1-79). Estudios in vitro han documentado tanto la proliferación como la migración de las células endoteliales; las células endoteliales puestas en cultivo pueden proliferar y desarrollar espontáneamente nuevos capilares (Folkman et al. (1980) Nature 288: 551-56).

Los términos o expresiones "células endoteliales angiogénicas" y "células endoteliales que sufren angiogénesis" y análogos se utilizan intercambiablemente en esta memoria para significar células endoteliales (como se definen anteriormente) que sufren angiogénesis (como se define arriba). Así, las células endoteliales angiogénicas son células endoteliales que están proliferando a una tasa que excede con mucho de la condición normal de experimentación de la división celular aproximadamente una vez al año. La tasa de diferenciación de la proliferación normal de las células endoteliales puede ser 2 veces, 5 veces, o 10 veces mayor o más que la de proliferación normal, y puede variar notablemente dependiendo de factores tales como la edad y el estado del paciente, el tipo de tumor involucrado, el tipo de herida, etc. Con la condición de que la diferencia en el grado de proliferación entre las células endoteliales normales y las células endoteliales angiogénicas pueda medirse y se considere biológicamente significativa, entonces los dos tipos de células pueden ser diferenciados por la presente invención, es decir, las células endoteliales angiogénicas pueden diferenciarse de las células endoteliales correspondientes normales quiescentes en términos de fijación preferencial de los liposomas catiónicos.

Las expresiones "células endoteliales correspondientes", "células endoteliales normales o quiescentes" y análogas se utilizan para hacer referencia a células endoteliales normales quiescentes contenidas dentro del mismo tipo de tejido (en condiciones normales) cuando algunas de las células endoteliales están sufriendo angiogénesis y algunas de las células endoteliales se mantienen quiescentes. En conexión con la presente invención, las células endoteliales angiogénicas están direccionadas preferentemente y se direccionan con una preferencia que es cinco veces, preferiblemente diez veces mayor que el direccionamiento de las células endoteliales quiescentes correspondientes.

El término "lípido" se utiliza en su sentido convencional como término genérico que abarca grasas, lípidos, y los constituyentes del protoplasma solubles en alcohol-éter, que son insolubles en agua. Los lípidos constituyen las grasas, aceites grasos, aceites esenciales, ceras, esteroides, esteroles, fosfolípidos, glicolípidos, sulfolípidos, aminolípidos, cromolípidos (lipocromos), y ácidos grasos. El término abarca tanto lípidos existentes naturalmente como lípidos producidos por síntesis. Lípidos preferidos en conexión con la presente invención son: colesterol, fosfolípidos, con inclusión de fosfatidilcolinas y fosfatidiletanolaminas, y esfingomielinas. Donde existen ácidos grasos, los mismos podrían tener una longitud de 12 a 24 carbonos, conteniendo hasta 6 insaturaciones (enlaces dobles), y unidos a la cadena principal por eslabones acilo o éter. Donde existe más de un ácido graso enlazado a la cadena principal, los ácidos grasos podrían ser diferentes (asimétricos), o puede estar presente únicamente 1 sola cadena de ácido graso, v.g. lisolecitinas. Son también posibles formulaciones mixtas, particularmente cuando los lípidos no catiónicos se derivan de fuentes naturales, tales como lecitinas (fosfatidilcolinas) purificadas a partir de yema de huevo, corazón de bovino, cerebro, o hígado, o soja. Son también interesentes esteroides y esteroles, particularmente colesterol, y esteroles sustituidos en la posición 3\beta.

El término "lípido catiónico" se utiliza en esta memoria para abarcar cualquier lípido de la invención (como se ha definido arriba) que es catiónico. El lípido se definirá como catiónico cuando el mismo tiene una carga positiva (al pH fisiológico) tal como puede medirse por instrumentación utilizada en el momento de la medida. En los casos en que existen ácidos grasos presentes en el lípido catiónico, aquéllos pueden tener una longitud de 12 a 24 carbonos, conteniendo hasta 6 insaturaciones (enlaces dobles), y estar unidos a la cadena principal por eslabones acilo o éter; podría existir también una sola cadena de ácido graso unida a la cadena principal. En los casos en que existe más de un ácido graso enlazado a la cadena principal, los ácidos grasos pueden ser diferentes (asimétricos). Son también posibles formulaciones mixtas.

El término "liposoma" abarca cualquier compartimiento encerrado por una bicapa lipídica. Se hace también referencia los liposomas como vesículas lipídicas. A fin de formar un liposoma, las moléculas lipídicas comprenden porciones alargadas no polares (hidrófobas) y porciones polares (hidrófilas). Las porciones hidrófobas e hidrófilas de la molécula están posicionadas preferiblemente en dos extremos de una estructura molecular alargada. Cuando tales lípidos se dispersan en agua, los mismos forman espontáneamente membranas bicapa a las que se hace referencia como laminillas. Las laminillas están compuestas de dos hojas monocapa de moléculas lipídicas con sus superficies no polares (hidrófobas) enfrentadas unas a otras y sus superficies polares (hidrófilas) enfrentadas al medio acuoso. Las membranas formadas por los lípidos encierran una porción de la fase acuosa de una manera similar a la de una membrana celular que encierra el contenido de una célula. Así, la bicapa de un liposoma tiene semejanzas con una membrana celular sin los componentes proteínicos presentes en una membrana celular. Tal como se utiliza en conexión con la presente invención, el término liposoma incluye liposomas multilaminares, que tienen generalmente un diámetro comprendido en el intervalo de 1 a 10 micrómetros y están constituidos por cualquier número desde dos a centenares de bicapas lipídicas concéntricas que alternan con capas de una fase acuosa, e incluye también vesículas unilaminares que están constituidas por una sola capa lipídica y tienen generalmente un diámetro comprendido en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 400 nanómetros (nm), aproximadamente 50 a aproximadamente 300 nm, aproximadamente 300 a aproximadamente 400 nm, aproximadamente 100 a aproximadamente 200 nm, vesículas que pueden producirse sometiendo los liposomas multilaminares a ultrasonidos, por extrusión a presión a través de membranas que tienen poros de tamaño definido, o por homogeneización a alta presión.

Los liposomas preferidos que comprenden taxanos serían vesículas unilaminares que tienen una sola bicapa lipídica, y un diámetro comprendido en el intervalo de 25 a 400 nm. Se prefieren también vesículas multilaminares que comprenden un taxano y que tienen un diámetro en el intervalo de aproximadamente 25 a aproximadamente 400 nm.

Los liposomas catiónicos pueden definirse funcionalmente por tener un potencial zeta mayor que 0 mV.

El término "liposoma catiónico" tal como se utiliza en esta memoria tiene por objeto abarcar cualquier liposoma como se ha definido arriba que es catiónico. El liposoma se define como catiónico cuando está presente en pH fisiológico. Debe indicarse que el liposoma propiamente dicho es la entidad que se está determinando como catiónica, lo que significa que el liposoma que tiene una carga positiva medible en su pH fisiológico puede, en un ambiente in vivo, llegar a unirse a otras sustancias. Dichas otras sustancias pueden estar cargadas negativamente y dar como resultado por consiguiente la formación de una estructura que no tiene una carga positiva. La carga y/o estructura de un liposoma de la invención presente en un ambiente in vivo no ha sido determinada con precisión. Sin embargo, de acuerdo con la invención, un liposoma catiónico de la invención se producirá utilizando al menos algunos lípidos que son catiónicos en sí mismos. El liposoma no precisa estar constituido completamente por lípidos catiónicos, pero debe estar constituido por una cantidad suficiente de lípidos catiónicos tal que cuando se forma el liposoma y se pone en el interior de un ambiente in vivo al pH fisiológico, el liposoma tiene inicialmente una carga positiva.

El término "se asocia con" hace referencia a la acción de los liposomas catiónicos de la invención que se mantienen en proximidad suficientemente estrecha a las células endoteliales angiogénicas durante períodos de tiempo suficientemente largos de tal modo que el liposoma y/o su contenido entra en la célula endotelial. Los liposomas de la invención pueden asociarse con células endoteliales angiogénicas en una diversidad de circunstancias pero, muy preferiblemente, se asocian con la célula endotelial angiogénica cuando se encuentran en condiciones in vivo. Así, el liposoma puede estar modificado por la unión, fijación o asociación de otras moléculas o materias presentes en el torrente sanguíneo antes de la asociación con la célula endotelial angiogénica. Una diversidad de fuerzas pueden ser responsables de la asociación de los liposomas con las células endoteliales angiogénicas tales como las interacciones inespecíficas que ocurren entre dos moléculas cualesquiera no relacionadas, es decir, otras macromoléculas tales como seroalbúmina humana y transferrina humana. Estas fuerzas intermoleculares pueden clasificarse en cuatro áreas generales que son (1) electrostáticas; (2) puentes de hidrógeno; (3) hidrófobas; y (4) de Van der Waals. Las fuerzas electrostáticas son debidas a la atracción entre grupos iónicos con carga opuesta como la existente entre grupos con carga opuesta en un liposoma catiónico y grupos presentes sobre o en el interior de la célula endotelial angiogénica. La fuerza de atracción (F) es inversamente proporcional al cuadrado de la distancia (d) entre las cargas. Las fuerzas de enlaces de hidrógeno son proporcionadas por la formación de puentes de hidrógeno reversibles entre grupos hidrófilos. Los liposomas de la invención pueden incluir grupos hidrófilos tales como -COOH y pueden estar presentes grupos similares en la superficie de las células endoteliales, como pueden ser los grupos -OH, y -NH_{2}. Estas fuerzas dependen en gran parte del posicionamiento próximo de dos moléculas que llevan estos grupos. Las fuerzas hidrófobas operan del mismo modo que las gotitas de aceite en agua se fusionan para formar una gota grande individual. De acuerdo con ello, los grupos hidrófobos no polares tales como los que están presentes en los liposomas de la invención tienden a asociarse en un entorno acuoso y pueden tender a asociarse con grupos hidrófobos presentes en la superficie de las células endoteliales. Finalmente, se crean fuerzas de Van der Waals entre moléculas que dependen de las interacciones entre las nubes electrónicas externas.

Las expresiones "se asocia selectivamente" y "se direcciona selectivamente" y análogas se utilizan en esta memoria para describir una propiedad de los liposomas catiónicos de la invención que hace que los liposomas catiónicos se asocien con las células endoteliales angiogénicas en mayor grado que los liposomas catiónicos se asocian con las células endoteliales normales correspondientes no implicadas en la angiogénesis. De acuerdo con la invención, asociación selectiva o preferencial significa que el liposoma se asociará en un grado cinco o más veces mayor con las células endoteliales que sufren angiogénesis en comparación con las células endoteliales normales correspondientes que no sufren angiogénesis. Más preferiblemente, la asociación preferible o selectiva indica una selectividad diez o más veces mayor entre las células endoteliales angiogénicas y las células endoteliales normales correspondientes.

El término "cáncer" hace referencia a una enfermedad de proliferación celular inadecuada. Esta perturbación es muy evidente clínicamente cuando la masa de tejido tumoral pone en peligro la función de órganos vitales. Los conceptos que describen el crecimiento normal de los tejidos son aplicables al tejido maligno dado que los tejidos normales y malignos pueden compartir características de crecimiento similares, tanto al nivel de la células individual como al nivel del tejido. El cáncer es una enfermedad tanto de regulación desordenada del crecimiento de los tejidos como de regulación desordenada del crecimiento celular. El tiempo de duplicación hace referencia al tiempo requerido para que un tejido o tumor se duplique en tamaño o número de células. El tiempo de duplicación de un tumor clínicamente evidente es por lo general considerablemente más largo que el tiempo del ciclo celular de las células de las que se compone el tumor. Sin embargo, al contrario que un tumor, el hígado, el corazón o los pulmones normales en un adulto no tienen un tiempo de duplicación, dado que los órganos se encuentran en estado estacionario de tal modo que las velocidades de producción de células y muerte celular son iguales (Stockdale, (1996) "Cancer Growth and Chemotherapy", en: Scientific American Medicine, Vol. 3, Scientific American Press, Nueva York, pp. 11-18). Las características de crecimiento de los tumores son tales que la producción de células nuevas excede a la muerte celular; un suceso neoplástico tiende a producir un aumento en la proporción de células madre que sufren auto-renovación y una disminución correspondiente en la proporción que progresa hacia la maduración (McCulloch, et al., (1982) Blood 59: 601-608). Para cada población tumoral, existe un tiempo de duplicación y puede establecerse una curva de crecimiento específica (Stockdale, supra). El patrón de crecimiento en los tumores puede describirse por una curva de Gomperz (Steel (1987) Growth kinetics of tumors, Oxford University Press, Inc., Nueva York, p. 40), que indica que durante el desarrollo de un tumor, la velocidad de crecimiento es inicialmente muy rápida y decrece luego progresivamente a medida que aumenta el tamaño.

Aspectos generales de la invención

Las figuras adjuntas proporcionan una representación visual clara de la manera altamente selectiva en la que los liposomas catiónicos de la invención se direccionan hacia las células endoteliales angiogénicas. Una realización básica de la invención implica un método de afectar selectivamente a las células endoteliales angiogénicas por administración (preferiblemente por inyección intravascular, y más preferiblemente por inyección intraarterial) de una formulación que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y liposomas catiónicos que contienen un taxano. Se deja luego que los liposomas catiónicos dentro de la formulación inyectada entren en las células endoteliales angiogénicas (por endocitosis) que revisten las paredes de los vasos sanguíneos angiogénicos. Los liposomas catiónicos se asocian con las células endoteliales angiogénicas durante un período de tiempo suficiente y de una manera tal que los liposomas propiamente dichos y/o el contenido de los liposomas entren en la célula endotelial angiogénica. Después de ello, el taxano que entra en la célula puede inhibir la angiogénesis. La selectividad del direccionamiento a las células endoteliales angiogénicas puede comprenderse mejor haciendo referencia a las figuras adjuntas.

La Figura 1 muestra una porción de un ovario de ratón que tiene un folículo redondo grande (en amarillo) situado en él. Dado que la angiogénesis está ocurriendo dentro de un ovario de ratón normal, los liposomas catiónicos que contienen un marcador detectable se asocian con las células endoteliales angiogénicas de los vasos sanguíneos en crecimiento del folículo (rojo-anaranjado). Sin embargo, en la Figura 1 no es posible determinar claramente si el marcador está asociado únicamente con las células endoteliales angiogénicas o si el mismo está asociado con la totalidad del tejido dentro del ovario y el folículo.

La Figura 2 es una micrografía de fluorescencia que muestra una sección de un tumor pancreático de un ratón que fue inyectado por vía intravenosa con liposomas catiónicos (rojo-anaranjado) de la invención que contenían un marcador detectable. La angiogénesis ocurre fácilmente en el interior de los tumores. Así, esta foto proporciona cierta indicación de que los liposomas catiónicos (rojo-anaranjado) de la invención se asociaban específicamente con las células endoteliales angiogénicas (verde). Sin embargo, estos resultados no demuestran de modo espectacular la especificidad de la invención.

Una comparación de las Figuras 3 y 4 demuestra la capacidad de la invención para localizar un sitio de angiogénesis. La Figura 3 es una foto que muestra vasos sanguíneos dentro del tejido pancreático normal de un ratón. Existe mucho menos marcación de las células endoteliales normales que de las células endoteliales angiogénicas correspondientes. Esto se demuestra claramente por comparación de la Figura 4 con la Figura 4 que es una foto de un tumor pancreático en un ratón. La Figura 4 muestra claramente un alto grado de acumulación del marcador (amarillo-anaranjado) contenido en el interior de los liposomas catiónicos en el área de un tumor. La diferencia espectacular entre las Figuras 3 y 4 indica la utilidad de la presente invención para marcar clara y precisamente el sitio de un tumor. Sin embargo, debido a que está asociada una cantidad tan grande del marcador con los vasos sanguíneos angiogénicos en la Figura 4, puede no ser posible apreciar plenamente la especificidad de los liposomas catiónicos para direccionarse preferentemente a las células endoteliales angiogénicas.

La Figura 5 es una foto de vasos sanguíneos (verde) en un islote pancreático de un ratón normal. La pequeña cantidad de colorante rojo-anaranjado indica la asociación limitada de los liposomas catiónicos con las células endoteliales normales que revisten interiormente los vasos sanguíneos del tejido pancreático.

La especificidad de los liposomas catiónicos que contienen un marcador detectable se muestra más claramente por comparación de la Figura 5 con la Figura 6. La Figura 6 muestra claramente un grado de acumulación mucho mayor del marcador en las células endoteliales de los vasos sanguíneos angiogénicos del tumor dentro del páncreas de un ratón.

La capacidad precisa de los liposomas catiónicos para direccionarse a las células endoteliales angiogénicas se muestra espectacularmente en las Figuras 7 y 8. La Figura 7 muestra claramente que el marcador fluorescente se asocia únicamente con los vasos sanguíneos, es decir, el marcador no se fuga o migra al tejido circundante. La especificidad se muestra del modo más espectacular en la Figura 8, que está enfocada claramente en liposomas catiónicos marcados detectados dentro de células endoteliales angiogénicas, mostrando que el marcador es específico para dichas células y no se fuga o migra al tejido circundante.

Las Figuras 9 y 10 demuestran el mismo efecto arriba descrito pero con un modelo de angiogénesis diferente. Las Figuras 1 a 8 estaban direccionadas todas ellas a tejido normal o canceroso. Las Figuras 9 y 10, respectivamente, exhiben tejido normal e inflamado de la tráquea de un ratón. De modo más específico, la Figura 9 muestra los vasos sanguíneos normales de una tráquea, es decir, una tráquea de ratón exenta de patógenos. La Figura 10 muestra los vasos sanguíneos de una tráquea con la aparición de angiogénesis inducida por infección. La mayor concentración del marcador detectable en la Figura 10 es evidente, indicando que los liposomas catiónicos de la invención se asocian selectivamente con las células endoteliales angiogénicas - asociándose de modo específico con las células endoteliales de la tráquea que han sido inducidas a angiogénesis por una infección.

La Figura 11 es un gráfico que representa la diferencia en la especificidad de los liposomas catiónicos entre su capacidad para asociarse con células endoteliales angiogénicas y las células endoteliales normales correspondientes que no sufren angiogénesis. Como se muestra en la Figura 11, los liposomas catiónicos de la invención (por este experimento) han demostrado una afinidad aproximadamente 10 veces mayor para las células endoteliales angiogénicas en comparación con las células endoteliales correspondientes que no sufren angiogénesis.

Las Figuras 12 y 13 muestran de qué modo los liposomas catiónicos de la invención penetran en las células endoteliales angiogénicas. En la Figura 12, los liposomas catiónicos se han puesto en contacto con la superficie de la célula endotelial angiogénica. En la Figura 13, los liposomas catiónicos han penetrado en la célula endotelial angiogénica por endocitosis y están presentes en el interior de la célula. La Figura 14 muestra la absorción de una formulación de liposomas que comprende paclitaxel en las tráqueas de ratones exentos de patógenos e infectados con Mycoplasma pulmonis, y demuestra adicionalmente que los liposomas catiónicos se asocian preferentemente con y son absorbidos por las células endoteliales angiogénicas, en comparación con las células endoteliales que no sufren angiogénesis.

Una vez descrita en palabras y demostrado por medio de las figuras la especificidad de los liposomas catiónicos de la invención, los expertos en la técnica podrán producir una diversidad de liposomas catiónicos diferentes que contienen una diversidad de sustancias diferentes a fin de hacer uso de la invención. Sin embargo, para finalizar la exposición, se da a continuación una descripción de liposomas catiónicos y sus métodos de fabricación, seguida por una descripción de sustancias que inhiben o promueven la angiogénesis.

Liposomas

Los liposomas pueden formarse fácilmente poniendo lípidos (como se han definido arriba) que incluirán lípidos catiónicos (como se han definido arriba) en una solución acuosa y agitando la solución durante un período de tiempo de varios segundos hasta horas. El procedimiento simple produce espontáneamente grandes liposomas multilaminares o vesículas con diámetros comprendidos en el intervalo de aproximadamente 1 a 10 micrómetros. Estos liposomas están constituidos por dos a varios centenares de bicapas de lípidos concéntricas que pueden alternar con capas de la fase acuosa en cuyo interior están presentes los lípidos. Una sustancia tal como un compuesto que inhibe la angiogénesis, promueve la angiogénesis o proporciona un marcador detectable puede incluirse en la fase acuosa. La sustancia puede ser soluble en agua o puede, como mínimo, dispersarse fácilmente en agua. Alternativamente, tales sustancias pueden incluirse en la bicapa lipídica. Las sustancias que se incluyen en la bicapa lipídica pueden ser hidrófobas.

El espesor de la capa acuosa y por consiguiente la cantidad total de fase acuosa atrapada en el liposoma, depende del balance de las fuerzas de repulsión electrostáticas entre los lípidos cargados y las fuerzas atractivas de Van der Waals entre las bicapas como un todo. Así, el espaciamiento acuoso (y por tanto el volumen de material acuoso atrapado) aumenta con la proporción creciente de lípidos cargados en la membrana y con las concentraciones decrecientes de electrólitos (iones cargados) en la fase acuosa.

Pueden producirse liposomas de diversos tamaños. Los liposomas o vesículas pequeñas formados son unilaminares y tienen un tamaño comprendido en el intervalo de aproximadamente 20 a 400 nanómetros y pueden producirse sometiendo vesículas multilaminares a ultrasonidos, por extrusión a presión a través de membranas que tienen de tamaño definidos, o por homogeneización a alta presión. Liposomas unilaminares mayores que tienen un tamaño comprendido en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 1 \mum de diámetro pueden obtenerse cuando el lípido se solubiliza en un disolvente orgánico o un detergente y el agente solubilizado se elimina por evaporación o diálisis, respectivamente. La fusión de liposomas unilaminares más pequeños por métodos que requieren lípidos particulares o condiciones severas de deshidratación-hidratación puede producir vasos unilaminares tan grandes o mayores que las células.

A fin de formar los liposomas catiónicos de la invención es necesario que los liposomas se produzcan utilizando al menos algún lípido catiónico. Sin embargo, los liposomas catiónicos de la invención no precisan estar constituidos enteramente por lípidos catiónicos. Por ejemplo, la utilización de lípidos neutros en una cantidad de aproximadamente 45% y lípidos catiónicos en una cantidad de aproximadamente 55% producirá lípidos catiónicos que son útiles en relación con la invención y se direccionan preferentemente a las células endoteliales angiogénicas.

Los liposomas catiónicos de la invención pueden comprender un taxano y pueden comprender adicionalmente un fluoróforo u otro marcador y/o un taxano soluble en el compartimiento acuoso. La generación de liposomas catiónicos que comprenden un taxano y opcionalmente un marcador puede llevarse a cabo utilizando cualquiera de varios métodos que son estándar en la técnica, según lo cual, por ejemplo, se mezclan soluciones de 1,2-dioleoil-3-trimetil-amonio-propano (DTOAP), colesterol, y Rojo Texas DHPE (N-(5-dimetilaminonaftaleno-1-sulfonil)-1,2-dihexa-decanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), se evaporan a sequedad y la película lipídica se rehidrata subsiguientemente en dextrosa al 5% para producir vesículas multi-laminares (MLVs). Estas vesículas se extruyen a través de filtros de membrana de policarbonato para producir vesículas unilaminares. Los liposomas y la sustancia a incorporar en la composición, por ejemplo DNA plasmídico, se mezclan juntos en relaciones específicas en una solución de dextrosa al 5% u otro excipiente fisiológicamente aceptable. Lípidos catiónicos útiles incluyen: DDAB, bromuro de dimetildioctadecil-amonio; metilsulfato de N-[1-(2,3-dioloiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamonio; 1,2-diacil-3-trimetilamonio-propanos, (con inclusión pero sin carácter limitante de dioleoil (DOTAP), dimiristoil, dipalmitoil, diestearoil); 1,2-diacil-3-dimetilamonio-propanos, (con inclusión pero sin carácter limitante de dioleoil, dimiristoil, dipalmitoil, diestearoil) DOTMA, cloruro de N-[1-[2,3-bis(oleoiloxi)propil]-N,N,N-tri-metilamonio; DOGS, dioctadecilamidoglicilespermina; DC-colesterol, 3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]-colesterol; DOSPA, trifluoroacetato de 2,3-dioleoiloxi-N-(2-(esperminacarboxamido)-etil)-N,N-dimetil-1-propanaminio; 1,2-diacil-sn-glicero-3-etilfosfocolinas (con inclusión pero sin carácter limitante de dioleoil (DOEPC), dilauroil, dimiristoil, dipalmitoil, diestearoil, palmitoil-oleoil); \beta-alanil-colesterol; CTAB, bromuro de cetil-trimetil-amonio; diC14-amidina, N-t-butil-N'-tetradecil-3-tetradecilaminopropionamidina; 14Dea2, cloruro de O,O'-ditetradecanolil-N-(trimetilamonioacetil)-dietanolamina; DOSPER, 1,3-dioleoiloxi-2-(6-carboxi-espermil)-propilamida; yoduro de N,N,N',N'-tetrametil-N,N'-bis(2-hidroxiletil)-2,3-dioleoiloxi-1,4-butanodiamonio; derivados de cloruros de 1-[(2-aciloxi)etil]-2-alquil-(alquenil)-3-(2-hidroxietil)imidazolinio tales como cloruro de 1-[2-(9(Z)-octadecenoiloxi)etil]-2-(8(Z-heptadecenil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DOTIM), cloruro de 1-[2-(hexadecanoiloxi)etil]-2-pentadecil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DPTIM); cloruro de 1-[(2-tetradecanoiloxi)etil]-2-tridecil-3-(2-hidroxietil)imida-zolio (DMTIM) - como se describe en Solodin et al. (1995) Biochem. 43: 13537-13544; derivados de compuestos de 2,3-dialquiloxipropilamonio cuaternario, que contienen un resto hidroxialquilo en la amina cuaternaria, tales como bromuro de 1,2-dioleoil-3-dimetil-hidroxietil-amonio (DORI); bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil-amonio (DORIE); bromuro de 1,2-dioleil-oxipropil-3-dimetil-hidroxipropil-amonio (DORIE-HP); bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxibutil-amonio (DORIE-HB); bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxipentil-amonio (DORIE-HPe); bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil-amonio (DMRIE); bromuro de 1,2-dipalmitiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil-amonio (DPRIE); bromuro de 1,2-diesteriloxipropil-3-dimetil-hidroxietil-amonio (DSRIE) - como se describe, v.g., en Felgner et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 2550-2561. Muchos de los lípidos arriba mencionados están disponibles comercialmente de v.g., Avanti Polar Lipids, Inc.; Sigma Chemical Co.; Molecular Probes, Inc.; Northern Lipids, Inc.; Roche Molecular Biochemicals; y Promega Corp.

Los liposomas catiónicos se preparan a partir de los lípidos catiónicos propiamente dichos, o en mezcla con otros lípidos, particularmente lípidos neutros tales como: colesterol; 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanol-aminas, (con inclusión pero sin carácter limitante de dioleoil (DOPE), 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfocolinas; fosfatidil-colina natural de yema de huevo (PC), y análogos; mono- y diacil-fosfocolinas sintéticas (v.g., monoacil-fosfatidil-colina (MOPC)) y fosfoetanolaminas. También pueden incluirse ácidos grasos asimétricos, tanto sintéticos como naturales, y formulaciones mixtas, para los diacilderivados anteriores.

Liposomas del tipo arriba descrito y de otros tipos que pueden ser ideados por los expertos en la técnica pueden utilizarse en la presente invención con los liposomas que contienen un taxano y opcionalmente un marcador detectable. Un ejemplo de liposomas de la invención son liposomas catiónicos que contienen un taxano soluble en lípidos o soluble en agua. Los taxanos solubles en lípidos pueden encontrarse en la bicapa lipídica. Lo que sigue proporciona una descripción de taxanos. Sin embargo, debe indicarse que otros taxanos serán ideados por los expertos en la técnica y/o serán desarrollados conforme a la presente invención, y que tales taxanos podrían ser utilizados fácilmente en conexión con la presente invención.

Taxanos

La invención proporciona adicionalmente liposomas catiónicos que contienen un taxano como agente antiangiogénico. Tales liposomas pueden inhibir la angiogénesis y son por consiguiente útiles en el tratamiento de tumores, inflamación crónica y otras enfermedades asociadas con la angiogénesis.

El término "taxanos" incluye paclitaxel, así como cualquier derivado o profármaco activo de taxano, con tal que se observe la actividad requerida, es decir que se inhiba la angiogénesis en un vaso sanguíneo al menos aproximadamente 2 veces, de modo más preferible al menos aproximadamente 5 veces, de modo más preferible al menos aproximadamente 10 veces, y de modo todavía más preferible al menos aproximadamente 50 veces o más, en comparación con la angiogénesis en un vaso sanguíneo que no esté en contacto con una formulación de lípido catiónico que contenga un taxano.

Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente, utilizando una diversidad de métodos conocidos, si se inhibe la angiogénesis. Tales métodos incluyen, pero sin carácter limitante, métodos que implican invasión de una matriz sintética, in vitro o in vivo, por vasos sanguíneos en respuesta a una sustancia que es un promotor de la angiogénesis (es decir, una sustancia pro-angiogénica, v.g., un ensayo de membrana corioalantoica; un ensayo de bolsa corneal; y ensayos para inhibición de la proliferación de células endoteliales. Tales métodos han sido descritos ampliamente en la bibliografía incluyendo, entre otros artículos, Vázquez, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 23349-23357; y Belotti, et al., (1996) Clin. Cancer Res. 2: 1843-1849.

El taxano puede incorporarse en la bicapa lipídica del liposoma, puede estar presente en el compartimiento acuoso del liposoma, o ambas cosas. De acuerdo con ello, en algunas realizaciones, la invención proporciona un liposoma catiónico que comprende lípidos catiónicos y un taxano en la bicapa lipídica. En algunas de estas realizaciones, el liposoma catiónico comprende adicionalmente un taxano en el compartimiento acuoso. En otras realizaciones, la invención proporciona liposomas catiónicos que comprenden lípidos catiónicos y un taxano en el compartimiento acuoso. Taxanos que pueden incluirse en el compartimiento acuoso incluyen taxanos solubles en agua (v.g., un derivado hidrófilo). Taxanos que pueden incorporarse en una bicapa lipídica de un liposoma catiónico incluyen taxanos hidrófobos y derivados de taxanos hidrófobos.

Generalmente, la proporción de taxano en las formulaciones de liposomas catiónicos de la presente invención es menor que aproximadamente 20% molar. En algunas realizaciones, la formulación del liposoma catiónico comprende taxano en una proporción de 0,5% molar a 20% molar, en otras realizaciones desde 2% molar a 10% molar. En otras realizaciones, el taxano está presente en 1% molar a 5% molar, y en otras realizaciones adicionales, desde 1% molar a 3% molar. Cuando un taxano se incorpora en un liposoma catiónico en una proporción de 0,5% molar a 20% molar, desde 2% molar a 10% molar, o desde 1% molar a 5% molar, desde 1% molar a 3% molar, el taxano no se separa sustancialmente de la bicapa liposómica, y/o no forma sustancialmente cristales de taxano en un período de tiempo de al menos aproximadamente 0,5 horas, por regla general al menos aproximadamente 1 hora, de modo más general al menos aproximadamente 2 horas, usualmente al menos del orden de 24 horas, usualmente al menos alrededor de 48 horas, a una temperatura comprendida entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente 25ºC. Pueden incorporarse mayores proporciones de taxano, con tal que el taxano no se separe sustancialmente de la bicapa liposómica y/o no contenga sustancialmente cristal de taxano alguno. Los liposomas catiónicos que comprenden un taxano contienen "sustancialmente ningún cristal de taxano", es decir, que generalmente menos de 10%, usualmente menos de 5%, normalmente menos de 2%, típicamente menos de 1%, y preferiblemente menos de 0,5% del taxano presente en el liposoma catiónico está en la forma de cristales. Un liposoma catiónico en el cual el taxano no se separa sustancialmente de la bicapa lipídica es uno en el cual generalmente menos de 20%, usualmente menos de 10%, usualmente menos de 5%, típicamente menos de 1%, y preferiblemente menos de 0,5% del taxano se ha separado de la bicapa liposómica.

La proporción del lípido catiónico en la formulación liposoma-taxano es generalmente mayor que 5% molar, usualmente mayor que 10% molar, más típicamente mayor que aproximadamente 20% molar. En algunas realizaciones, el lípido catiónico está presente en la formación liposoma-taxano en una proporción de 20% molar a 99% molar. En otras realizaciones, el lípido catiónico está presente en una proporción que va desde 30% molar a 80% molar; en otras realizaciones, desde 40% molar a 98% molar, y en otras realizaciones, desde 40% molar a 60% molar. Composiciones de liposomas adecuadas para uso en el suministro de un taxano se han descrito anteriormente. El taxano puede estar unido también a un resto orgánico hidrófobo, tal como un ácido graso, un fosfolípido, y análogos, e incorporarse en un liposoma. Tales derivados de taxano han sido descritos, y son adecuados para uso en la presente invención. Véase, v.g., la patente U.S. No. 5.580.899. Se han descrito formulaciones de fosfatidil-colina que comprenden taxol (patente U.S. No. 5.683.715).

Las formulaciones de liposomas catiónicos que comprenden un taxano tienen una mayor afinidad para, se asocian preferentemente con, y son absorbidas por, las células endoteliales en los vasos sanguíneos que sufren angiogénesis (es decir, las células endoteliales angiogénicas), es decir, los liposomas catiónicos que comprenden taxanos son absorbidos por (de tal modo que el taxano penetra en la célula) las células endoteliales angiogénicas en una cantidad al menos aproximadamente doble, de modo más preferible al menos aproximadamente cinco veces mayor, y de modo más preferible al menos aproximadamente diez veces o más mayor que una cantidad absorbida por las células endoteliales no angiogénicas. Esta comparación se hace generalmente sobre una base de célula-a-célula, es decir, se hace una comparación directa entre la absorción por una célula endotelial angiogénica y una célula endotelial no angiogénica. Como ejemplo, un ensayo para determinar la relación de absorción por células endoteliales angiogénicas frente a las no angiogénicas se realiza ex vivo, v.g., se marcan células en un animal in vivo, se extraen del animal, y se ensayan ex vivo para absorción de la formulación de liposomas catiónicos. Un ejemplo de un método de ensayo adecuado se proporciona en el Ejemplo 5. En este ensayo, se trata un animal con una sustancia conocida que induce angiogénesis. Las células endoteliales se ponen en contacto con la formulación liposoma catiónico/taxano que comprende un marcador que puede distinguirse del marcador utilizado para marcar todas las células endoteliales. Después de un tiempo adecuado, se marcan todas las células endoteliales con un marcador fluorescente. El animal puede someterse a perfusión con un medio fijador antes, al mismo tiempo, o después de la marcación de las células endoteliales. Después de un tiempo adecuado (v.g. desde aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 2 horas) se extraen las células endoteliales del animal, y, por visualización directa por microscopía confocal, se compara la proporción de células endoteliales que contienen el marcador asociado con la formulación liposoma catiónico/taxano con la proporción de células endoteliales que no contienen el marcador asociado con el liposoma catiónico/taxano. De esta manera, puede hacerse una comparación directa, de célula-a-célula, entre la absorción por las células endoteliales angiogénicas y las células endoteliales no angiogénicas. Si un liposoma catiónico es absorbido preferentemente por una célula dada puede determinarse utilizando cualquier método conocido, con inclusión del uso de lípidos marcados y microscopía fluorescente, como se describe en los ejemplos. Los métodos que implican v.g., medida de la absorción en homogenizados de tejidos enteros no se prefieren generalmente, dado que la presencia de una gran proporción de células no endoteliales puede reducir la relación de señal a ruido de fondo, y por consiguiente puede no reflejar exactamente la diferencia entre la absorción por las células endoteliales angiogénicas frente a las células endoteliales no
angiogénicas.

Puede incorporarse un lípido neutro en las formulaciones de liposomas catiónicos y, cuando está presente, puede encontrarse en proporciones de 1% molar a 80% molar, generalmente desde 2% molar a 50% molar, usualmente desde 40% molar a 50% molar. Puede incorporarse cualquier lípido neutro, con inclusión pero sin carácter limitante de una fosfatidil-etanolamina, con inclusión, pero sin carácter limitante de DOPE; y una fosfatidil-colina, con inclusión de pero sin carácter limitante de PC de huevo, DOPC y MOPC. También pueden incluirse mezclas de una fosfatidil-etanolamina y una fosfatidil-colina.

Los liposomas catiónicos que comprenden un taxano pueden comprender adicionalmente un marcador detectable, una gran diversidad de los cuales se conocen en la técnica, como se describe en detalle en esta memoria.

El Ejemplo 5 proporciona datos experimentales que muestran el direccionamiento de liposomas catiónicos que contienen paclitaxel a las células endoteliales angiogénicas. De acuerdo con ello, en algunas realizaciones, la invención proporciona liposomas catiónicos que contienen paclitaxel. En algunas de estas realizaciones, el liposoma catiónico comprende 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) en 20% molar a 99% molar, desde 40% molar a 70% molar, desde 50% molar a 60% molar. En algunas de estas realizaciones, el liposoma catiónico comprende DOTAP:fosfatidil-colina de huevo(PC):rodamina-DHPE:pacli-taxel en una relación molar de 50:47:1:2. En otras realizaciones, el liposoma catiónico comprende DOTAP:PC de huevo:paclitaxel en una relación molar de 50:48:2. En otras realizaciones, el liposoma catiónico comprende DOTAP:DOPC:paclitaxel en una relación molar de 50:47:3. En otras realizaciones, el liposoma catiónico comprende DOTAP:DOPE:paclitaxel en una relación molar de 50:47:3. En otras realizaciones, el liposoma catiónico comprende DOTAP:MOPC:paclitaxel en una relación molar de 50:47:3.

El paclitaxel actúa para estabilizar la estructuras microtubulares por fijación a la tubulina. En las células que se encuentran en división, esto puede conducir a la formación de husillos mitóticos anormales. Adicionalmente, los taxanos pueden tener también actividad anti-angiogénica (Belotti et al. (1996) Clin. Cancer Res. 2:1843-1849; y Klauber et al. (1997) Cancer Res. 57:81-86). Los liposomas catiónicos de la invención pueden comprender cualquier sustancia que inhiba la angiogénesis, con inclusión, pero sin carácter limitante, de un taxano, con inclusión pero sin carácter limitante de paclitaxel; y cualquiera de los inhibidores de la angiogénesis arriba descritos. De acuerdo con ello, en algunas realizaciones, se proporcionan composiciones de liposomas catiónicos que comprenden un taxano y una o más sustancias anti-angiogénicas distintas.

El paclitaxel es un diterpenoide altamente derivatizado (Wani, et al. (1971) J. Am. Chem. Soc. 93: 2325-2327) que se ha obtenido a partir de la corteza cosechada y secada de Taxus brevifolia (Tejo del Pacífico) y Taxomyces andreanae, un hongo endofítico del Tejo del Pacífico (Stierle, et al. (1993) Science 60:214-216. "Paclitaxel" (que debe entenderse en esta memoria como inclusivo de análogos, formulaciones, y derivados tales como, por ejemplo, docetaxel, TAXOLJ, TAXOTEREJ (una formulación de docetaxel), análogos desacetilados en posición 10 de paclitaxel y análogos sustituidos con 3'N-desbenzoil-3'-N-t-butoxicarbonilo de paclitaxel) se puede preparar fácilmente utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica (véanse también los documentos WO 94/07882; WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; y las patentes U.S. Núms. 5.294.637; 5.283.253; 5.279.949; 5.274.137; 5.202.448; 5.200.534; 5.229.529, y el documento EP 590.267), o puede obtenerse de una diversidad de fuentes comerciales, que incluyen por ejemplo, Sigma Chemical Co.; St. Louis, Mo. (T7402 de Taxus brevifolia; o T-1912 de Taxus yannanensis).

Debe entenderse que el término "paclitaxel" hace referencia no sólo a la forma común de paclitaxel disponible químicamente, sino a análogos (v.g., taxotere, como se ha indicado arriba) y conjugados de paclitaxel (v.g., paclitaxel-PEG, paclitaxel-dextrano, o paclitaxel-xilosa).

Se incluyen también dentro del término "taxano" una diversidad de derivados conocidos, que incluyen tanto derivados hidrófilos, como derivados hidrófobos. Derivados de taxano incluyen, pero sin carácter limitante, derivados de galactosa y manosa descritos en la Solicitud de Patente Internacional No. WO 99/18113; piperazino y otros derivados descritos en el documento WO 99/14209; derivados de taxano descritos en los documentos WO 99/09021, WO 98/22451, y la patente U.S. No. 5.869.680; 6-tio-derivados descritos en el documento WO 98/28288; sulfenamido-derivados descritos en la patente U.S. No. 5.821.263; y el derivado de taxol descrito en la patente U.S. No. 5.415.869. El término incluye también profármacos de paclitaxel con inclusión, pero sin carácter limitante, de los descritos en los documentos WO 98/58927; WO 98/13059; y la patente U.S. No. 5.824.701.

Dentro del término "taxano" se incluyen además sales farmacéuticamente aceptables de un taxano.

Pueden incorporarse mezclas de taxanos en los liposomas catiónicos. Adicionalmente, un liposoma catiónico que comprende un taxano puede comprender también uno o más compuestos adicionales farmacéuticamente activos con inclusión, pero sin carácter limitante, de un agente (v.g., distinto de un taxano) que inhibe la angiogénesis, y un agente anti-cáncer.

Los taxanos pueden aislarse a partir de fuentes naturales, pueden sintetizarse químicamente, o pueden adquirirse de una fuente comercial. Métodos de síntesis química se conocen en la técnica, véase, v.g., la patente U.S. No. 5.580.899.

Dosificación

La cantidad de un taxano administrada a un paciente (que puede ser cualquier animal con un sistema circulatorio que tenga células endoteliales que sufren angiogénesis) variará dependiendo de una amplia gama de factores. Por ejemplo, sería necesario proporcionar dosis sustancialmente mayores a los humanos que a animales más pequeños. La cantidad de un taxano dependerá del tamaño, la edad, el sexo, el peso, y el estado del paciente así como de la potencia del taxano que se administre. Una vez indicado que existe una variabilidad considerable en términos de dosificación, se cree que los expertos en la técnica pueden, utilizando la presente exposición, determinar fácilmente la dosificación apropiada administrando primero cantidades extremadamente pequeñas y aumentando progresivamente la dosis hasta que se obtienen los resultados deseados. Aunque la cantidad de la dosis variará notablemente basándose en factores como los arriba descritos, en general, la presente invención hace posible administrar cantidades sustancialmente menores de cualquier taxano en comparación con los sistemas de suministro que están direccionados al tejido circundante, v.g., direccionados a las células tumorales propiamente dichas.

Formación de coágulos

Otro aspecto de la invención que puede ponerse en práctica utilizando liposomas implica la formación de coágulos sanguíneos. Específicamente, el liposoma está diseñado de tal manera que tiene un efecto sobre las células endoteliales angiogénicas que da como resultado la formación de coágulos de sangre en los vasos sanguíneos angiogénicos. Los coágulos de sangre previenen el flujo de nutrientes y oxígeno al resto del vaso, dando como resultado la muerte del vaso y del tejido circundante.

El concepto básico de la formación de coágulos en la vasculatura tumoral a fin de eliminar un tumor indeseable se ha llevado a cabo utilizando anticuerpos direccionados al tumor vascular. La presente invención podría alcanzar resultados mejorados utilizando lípidos catiónicos, los cuales contienen un taxano que promueve las cascadas trombogénicas.

Las células tumorales son dependientes del suministro de sangre. La interrupción local de la vasculatura tumoral producirá una avalancha de muerte de células tumorales. El endotelio vascular tumoral está en contacto directo con la sangre. Sin embargo, las células tumorales propiamente dichas se encuentran fuera del torrente sanguíneo y, en su mayor parte, son difícilmente accesibles a muchos materiales inyectados en el sistema circulatorio. Este aspecto, así como otros aspectos de la invención, se comportan de modo particularmente satisfactorio en el sentido de que las células direccionadas son las células endoteliales angiogénicas que, en sí mismas, no están transformadas, es decir, son células que es improbable que adquieran mutaciones que las hagan resistentes a la terapia. Las células tumorales sufren mutaciones considerables, y dichas mutaciones hacen a menudo las células resistentes a la terapia. Resultados con respecto a la disminución del tamaño de los tumores utilizando direccionamiento dirigido por anticuerpos han sido expuestos por otros como sigue: Burrows y Thorpe (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8996-9000; y Huang et al. (1997) Science 275:547-550).

Métodos de reducción de las placas ateroescleróticas

La invención proporciona adicionalmente métodos de reducción de las placas ateroescleróticas en un mamífero administrando al mamífero una composición que comprende lípidos catiónicos y un taxano, y dejando que la composición se asocie con las células endoteliales angiogénicas de un vaso sanguíneo angiogénico durante un tiempo y de una manera tal que la composición penetra en las células endoteliales angiogénicas, en los cuales el taxano actúa para reducir la angiogénesis, y en los cuales la reducción de la angiogénesis da como resultado la reducción de la formación de placa ateroesclerótica.

El término "ateroesclerosis" es un término bien comprendido en la técnica, y designa una enfermedad de las arterias de tamaño grande y medio que da como resultado la acumulación progresiva en el interior de la íntima de células musculares lisas y lípidos. El crecimiento continuado de las lesiones (placas) invade otras capas de la pared arterial y estrecha el lumen. El término "reducción de las placas ateroescleróticas", tal como se utiliza en esta memoria, indica que una placa o lesión ateroesclerótica ve reducido su tamaño al menos en aproximadamente 10%, de modo más preferible al menos aproximadamente 25%, de modo más preferible al menos aproximadamente 50%, de modo todavía más preferible al menos aproximadamente 75%, de modo aún más preferible al menos aproximadamente 90% o más, cuando se administra un liposoma catiónico que contiene un taxano de la invención a un mamífero que padece una lesión de este tipo, cuando se compara con una placa ateroesclerótica de este tipo en un mamífero de control tratado con el liposoma catiónico que no contiene el taxano. En algunas realizaciones, la placa ateroesclerótica se elimina por completo. De acuerdo con ello, para uso en los métodos de reducción de una placa ateroesclerótica en un individuo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "una cantidad eficaz" de un taxano es una cantidad que, cuando se administra al individuo, reduce el tamaño de una placa ateroesclerótica al menos aproximadamente en un 10%, de modo más preferible al menos aproximadamente en un 25%, de modo más preferible al menos aproximadamente 50%, de modo todavía más preferible al menos aproximadamente 75%, de modo aún más preferible al menos aproximadamente 90% o más, comparada con el tamaño de una placa formada en un individuo de control al que no se ha administrado el taxano.

Si una placa ateroesclerótica se ha reducido puede determinarse por formación de imágenes radiográficas utilizando cualquier método conocido, con inclusión de los descritos en la patente U.S. No. 5.807.536; angiografía, en donde se inserta un catéter en un vaso sanguíneo, y se utiliza un agente de contraste, tal como un colorante basado en yodo para obtener la imagen del vaso sanguíneo; y obtención de imágenes utilizando una sonda ultrasónica intravascular. En experimentos con animales, pueden inspeccionarse a simple vista secciones de vasos sanguíneos en cuanto a la reducción del tamaño de la placa. Véase, por ejemplo, Moulton et al. (1999) Circulation 99:1726-1732.

En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención dan como resultado la reducción en una o más de las secuelas de la ateroesclerosis. De acuerdo con ello, la invención proporciona un método para reducir una condición de enfermedad relacionada con la ateroesclerosis, con inclusión, pero sin carácter limitante, de enfermedad cardiaca isquémica, infarto de miocardio, restenosis, derrames cerebrales, y enfermedad vascular periférica. Si se ha reducido una o más de estas condiciones de enfermedad puede determinarse por métodos usuales para evaluación, que incluyen, pero sin carácter limitante, determinaciones electrocardiográficas, y otros métodos que son estándar en la técnica.

Los métodos de la presente invención para reducir una placa ateroesclerótica son útiles en la prevención, inhibición, o reducción de la probabilidad de recurrencia (reformación) de una placa que ha sido eliminada por un método de la invención, o por otro método, tal como angioplastia con balón o cirugía de derivación ("by-pass") coronaria. De acuerdo con ello, en algunas realizaciones, los métodos comprenden los pasos de eliminar una placa ateroesclerótica de un vaso circulatorio del paciente; y administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un liposoma catiónico y un taxano. La composición que comprende un liposoma catiónico y un taxano puede administrarse antes, durante, o después de la eliminación de la placa del paciente.

Cualquiera de los liposomas catiónicos, o formulación que comprende un liposoma catiónico, descritos anteriormente en esta memoria, en combinación con cualquier taxano conocido, con inclusión de los descritos en esta memoria, puede utilizarse en los métodos para reducir una placa ateroesclerótica. El taxano-lípido catiónico puede formularse con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen en la técnica, y han sido descritos ampliamente, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (1995) o la última edición, Mc Publishing Co., Easton, PA.

Modelos experimentales de angiogénesis

La presente invención se vio facilitada por el uso de modelos de roedor para angiogénesis. Enfermedades inflamatorias crónicas tales como el asma y la bronquitis inducen remodelización tisular y vascular en la mucosa de las vías aéreas. Para estudiar la patogénesis de la inflamación crónica de las vías aéreas, se utilizó un modelo en el cual ocurre inflamación crónica y remodelización tisular en las tráqueas de ratas y ratones. La angiogénesis se desarrolla en la mucosa de las vías aéreas como resultado de la infección por Mycoplasma pulmonis. En este modelo, los organismos Mycoplasma pulmonis causan una infección persistente en el epitelio traqueal y bronquial. La mucosa de las vías aéreas de ratas infectadas con M. pulmonis presenta varias anormalidades distintivas: 1) engrosamiento del epitelio y de la lámina propia; 2) cambios en la composición celular del epitelio; 3) angiogénesis; 4) sensibilidad incrementada de los vasos angiogénicos a la sustancia P mediadora de la inflamación en términos de fuga de plasma; 5) fuga inducida por la sustancia P de capilares y de vénulas; y 6) número incrementado de receptores para la sustancia P (receptores NK1) en las células endoteliales capilares. En este modelo, la angiogénesis es impulsada por la inflamación crónica, y los vasos sanguíneos son más susceptibles a los mediadores de inflamación.

Estudios que utilizan perfusión de lectinas para teñir la superficie luminal de las células endoteliales revelaron la extensión de la angiogénesis en ratas después de la infección por M. pulmonis. Numerosos vasos semejantes a capilares están presentes en la mucosa traqueal de las ratas infectadas, y estos vasos desaparecen después de la inyección intravenosa de la sustancia P mediadora de la inflamación.

En los ratones, M. pulmonis causa una inflamación pulmonar aguda que alcanza su pico 6-9 días después de la inoculación, seguida por una infección persistente de las vías aéreas. La respuesta de los ratones a la infección por M. pulmonis es muy dependiente de la variedad: por ejemplo, los ratones de la variedad C3H exhiben mayor mortalidad y mayor reducción de la citoquina factor-\alpha de necrosis tumoral que las variedades C57BL. Algunos aspectos de remodelización mucosal, tales como la hiperplasia epitelial, han sido descritos en las vías aéreas de ratones infectados por M. pulmonis. En los ratones C57BL/6 infectados con inoculación nasal de M. pulmonis, el número de vasos traqueales aumenta espectacularmente, al parecer por crecimiento de nuevos capilares. En esta variedad, la vasculatura de la mucosa traqueal ya no es plana, y se desarrollan pequeños vasos perpendicularmente al plano de la mucosa. Se encuentran numerosas ramificaciones vasculares aparentes en las regiones de vascularidad incrementada. Así, la infección de los ratones C57BL/6 por M. pulmonis produce inflamación crónica de las vías aéreas con proliferación endotelial, remodelización vascular, y angiogénesis. En contraste, en los ratones C3H/HeN infectados por inoculación nasal de M. pulmonis, el número de células endoteliales vasculares en la mucosa traqueal aumenta, pero el número de vasos no lo hace. La vascularidad incrementada no es debida a un aumento en la longitud o número de vasos sino a un aumento en el diámetro de los vasos, y este aumento en el tamaño de los vasos es debido a una duplicación del número de células endoteliales. El tamaño de las células endoteliales individuales en las tráqueas infectadas no aumenta significativamente. Los niveles de anticuerpos circulantes para M. pulmonis son similares en las dos variedades de ratones. Así, la infección de los ratones C3H/HeN por M. pulmonis produce infección crónica de las vías aéreas con remodelización vascular y proliferación endotelial pero no un aumento significativo en el número de vasos, mientras que en los ratones C57BL/6 produce proliferación endotelial y nuevos vasos.

En un segundo modelo, la angiogénesis ocurre en tumores que son resultado de la expresión transgénica del oncogén vírico SV40. El modelo de ratón transgénico "RIP-Tag" proporciona la oportunidad de estudiar los cambios fenotípicos en las células endoteliales angiogénicas en una progresión bien caracterizada desde tejido normal a tumores. En el modelo de ratón transgénico "RIP-Tag", el oncogén del virus SV-40, antígeno T grande (Tag), está impulsado por una región del promotor de insulina de la rata (RIP). Cuando se inserta en el genoma murino, este constructo induce la expresión de Tag específicamente en las células \beta de los islotes pancreáticos, que están localizadas en aproximadamente 400 islotes dispersos por todo el páncreas. La totalidad de los islotes pancreáticos en estos ratones expresan Tag; sin embargo, los islotes se desarrollan con normalidad hasta aproximadamente una edad de 6 semanas. A partir de este momento, aproximadamente el 50% de los islotes se vuelven hiperplásticos. Sin embargo, de estos islotes hiperplásticos, una pequeña fracción (< 5%), evoluciona en tumores al cabo de aproximadamente 10 semanas. Este cuello de botella en la tumorigénesis parece resolverse cuando un islote adquiere la capacidad de inducir la angiogénesis: por esta razón, dicha fase de tumorigénesis ha sido denominada el "cambio angiogénico". Un cambio angiogénico similar parece existir también en otros modelos de tumorigénesis murina, así como en varios tumores humanos. Por ello, el modelo "RIP-Tag" proporciona un marco bien caracterizado para examinar la progresión de la angiogénesis en los tumores.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se presentan para proporcionar a quienes poseen una experiencia ordinaria en la técnica una exposición y descripción completas del modo de producción de liposomas catiónicos y llevar a cabo la metodología para utilización de tales liposomas, y no tienen por objeto limitar el alcance de lo que se considera como la invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (v.g., cantidades, temperatura, etc.) pero deben considerarse ciertos errores y desviaciones experimentales. A no ser que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular medio ponderal; la temperatura se expresa en grados Celsius; y la presión es o está próxima a la atmosférica. Debe indicarse que cada uno de los ejemplos que siguen representa varios experimentos que se realizaron con los procedimientos y resultados que se resumen. Se apreciará por los expertos en la técnica que no todos los experimentos proporcionaron resultados positivos. No obstante, se cree que lo que sigue refleja adecuadamente los resultados obtenidos.

Ejemplo 1 Distribución de los Liposomas Catiónicos en Ratones Normales

Los liposomas y/o el DNA plasmídico se marcaron y se determinó la distribución celular de los complejos marcados en diversos momentos después de la inyección intravenosa. Los experimentos se realizaron sobre ratones exentos de patógenos (20-25 g de peso corporal) de ambos sexos.

Se prepararon liposomas catiónicos con vesículas unilaminares pequeñas a partir del lípido catiónico DDAB o DOTAP y el lípido neutro DOPE o colesterol, marcados con Rojo Texas o el colorante rojo fluorescente de carbocianina Dil o CM-Dil, y en algunos casos complejados a DNA plasmídico que contenía un gen informador tal como luciferasa o \beta-galactosidasa. Las células endoteliales se marcaron utilizando la lectina fluorescente de plantas fluoresceína-Lycopersicon esculentum. Se marcaron monocitos/macrófagos utilizando cuentas fluorescentes (Duke, 500 nm). Los núcleos celulares se marcaron con DAPI, YO-PRO, o el colorante Hoechst 33342.

Liposomas o complejos liposoma-DNA fluorescentes que contenían 10-60 \mug de DNA en hasta 300 \mul se inyectaron en ratones sin anestesiar en la vena de la cola. En algunos experimentos, se inyectaron cuentas fluorescentes de 500 nm después de los complejos. Desde 5 minutos hasta 24 horas después, se anestesiaron los animales con pentobarbital sódico y se sometieron luego a perfusión a través del ventrículo izquierdo con un fijador (paraformaldehído al 1% en solución salina tamponada con fosfato) seguido por la lectina fluorescente para marcar la superficie endotelial de la vasculatura. Después de la perfusión, se extirparon los tejidos y se prepararon como montajes totales o se cortaron en secciones utilizando un Vibratomo o cortador de tejidos. Adicionalmente, algunas muestras se procesaron para microscopía electrónica. Los tejidos se examinaron por microscopía de epifluorescencia o por microscopía confocal. Adicionalmente, algunas muestras se examinaron por microscopía electrónica de transmisión.

Resultados: En los ratones examinados desde 5 minutos a 24 horas después de la inyección, los liposomas o complejos liposoma-DNA marcados con CM-Dil o marcados con Dil eran muy abundantes en los pulmones. Adicionalmente, los mismos eran muy numerosos en las células endoteliales de los capilares alveolares. La fluorescencia en los capilares alveolares se distribuía uniformemente en todos los lóbulos de ambos pulmones. Adicionalmente, existía cierta fluorescencia de CM-Dil o Dil en los monocitos/macrófagos intravasculares.

Después del pulmón, el hígado y el bazo tenían la cantidad máxima de liposomas o complejos marcados. En estos órganos, la fluorescencia de CM-Dil o Dil estaba co-localizada con las cuentas fluorescentes. En el hígado, la fluorescencia de CM-Dil o Dil y las cuentas se encontraban en las células de Kupffer. En el bazo, aquéllas se encontraban en los macrófagos.

El ovario tenía también vasos sanguíneos marcados densamente con liposomas o complejos marcados con CM-Dil o Dil. Específicamente, se observó que las células endoteliales en los vasos sanguíneos angiogénicos de los folículos grandes y los cuerpos lúteos del ovario del ratón absorbían ávidamente los liposomas DDAB:colesterol o complejos liposoma-DNA marcados con CM-Dil o Dil después de inyección intravenosa. Estas observaciones se documentaron fotográficamente (Figura 1). Otros vasos sanguíneos ováricos contenían relativamente pocos complejos marcados. Estos resultados se utilizaron para deducir que las células endoteliales angiogénicas absorben preferentemente los liposomas y complejos liposoma-DNA, es decir, que los liposomas catiónicos utilizados en los experimentos tenían mucha más probabilidad de asociarse con las células endoteliales que sufrían angiogénesis comparados con las células endoteliales correspondientes que no sufrían angiogénesis.

Los liposomas o complejos marcados eran también muy abundantes en las células endoteliales de las vénulas endoteliales superiores (HEV) de los ganglios linfáticos y parches de Peyer del intestino delgado, en tanto que eran escasos en las células endoteliales de los capilares de estos órganos linfoides. Los liposomas o complejos marcados eran también numerosos en las células de los capilares endoteliales de la hipófisis anterior, el miocardio, el diafragma, la corteza suprarrenal, y el tejido adiposo.

Los liposomas o complejos marcados eran abundantes en monocitos/macrófagos unidos a las vénulas de la vejiga urinaria, el útero y el tubo de Falopio. Algunas vénulas contenían grandes números de monocitos/macrófagos marcados. Adicionalmente, una pequeña proporción de las células endoteliales de las arteriolas, los capilares, y las vénulas en estos órganos estaban marcadas.

Relativamente pocos liposomas o complejos marcados estaban asociados con las células de los capilares endoteliales de la hipófisis posterior, la médula renal, las vellosidades intestinales (íleon), el páncreas y la médula suprarrenal. Prácticamente no se encontraron liposomas o complejos marcados en las células endoteliales del cerebro, la glándula tiroides, la corteza renal, los islotes pancreáticos, la tráquea, o los bronquios, con la excepción de un monocito/macrófago ocasional.

Conclusiones: La formulación de los liposomas DDAB:colesterol o complejos liposoma-DNA marcados con CM-Dil o Dil utilizada en estos estudios estaba direccionada a tres tipos de células principales: células endoteliales, macrófagos, y monocitos. La absorción de los liposomas o complejos era específica del órgano y el vaso. La mayoría de ellos eran absorbidos por las células de los capilares endoteliales del pulmón y los macrófagos del hígado y el bazo. Las células de los capilares endoteliales del ovario, la hipófisis anterior, el corazón, el diafragma, la corteza suprarrenal, y el tejido adiposo estaban también direccionadas. Los vasos sanguíneos que absorbían los liposomas o complejos en el ovario eran sitios de angiogénesis. Adicionalmente, se direccionaban el HEV de los ganglios linfáticos y los parches intestinales de Peyer. El direccionamiento de las células endoteliales o macrófagos de otros órganos era menos frecuente y más variable. Los vasos sanguíneos del cerebro, tiroides, corteza renal, tráquea, y bronquios no estaban direccionados.

Adicionalmente, los experimentos documentaron que los liposomas o complejos no se escapaban de la vasculatura en la mayoría de los órganos. Aunque se encontraron aquéllos en células extravasculares del bazo, que tienen vasos sanguíneos con un endotelio discontinuo, los mismos no se extravasaban en otros órganos.

Finalmente, la ávida absorción de los liposomas catiónicos y complejos liposoma-DNA por los vasos sanguíneos de los grandes folículos ováricos y los cuerpos lúteos indican que las células endoteliales de los vasos sanguíneos angiogénicos eran sitios de absorción preferencial.

Ejemplo 2 Absorción de los liposomas DDAB:colesterol o complejos liposoma-DNA en los ratones RIP-Tag5

Los resultados de los experimentos del Ejemplo 1 indicaban que los vasos sanguíneos angiogénicos en los folículos ováricos y los cuerpos lúteos absorben ávidamente los liposomas catiónicos y complejos liposoma-DNA. De acuerdo con ello, se realizó un experimento para determinar si las células endoteliales de los vasos sanguíneos angiogénicos de los tumores absorben ávidamente los liposomas catiónicos o complejos liposoma-DNA.

Se utilizó el modelo transgénico de tumores RIP-Tag5. Véase, Hanahan, (1985) Nature 315:115-22; y Hanahan y Folkman (1996) Cell 86:353-64. En este modelo, designado Rip-Tag, el oncogén del virus SV-40, antígeno T grande (Tag), está impulsado por una región del promotor de insulina de la rata (RIP). Cuando se inserta en el genoma murino, este constructo induce la expresión del antígeno T específicamente en las células \beta de los islotes pancreá-
ticos.

Un atributo importante de este modelo es que están presentes concurrentemente diversas etapas de desarrollo de los tumores, y por consiguiente diversas etapas de la angiogénesis, en cada ratón Rip-Tag5. Aunque la totalidad de los 300-400 islotes expresan el antígeno T, los islotes se desarrollan inicialmente con normalidad. Sin embargo, a las 6 semanas de edad, aproximadamente la mitad son hiperplásticos, y de éstos, una pequeña proporción se desarrollan en tumores al cabo de 10 semanas. La tumorigénesis parece coincidir con el comienzo de la angiogénesis. Esta conversión ha sido designada como el "cambio angiogénico". Folkman et al. (1989) Nature 339:58-61; y Hanahan y Folkman (1996) Cell 86:353-64. Parece existir un cambio angiogénico similar en otros modelos de tumorigénesis murina así como en varios tumores humanos. Hanahan y Folkman (1996) Cell 86:353-64.

Se utilizaron los mismos métodos y materiales que en el Ejemplo 1. Específicamente, se inyectaron liposomas DDAB:colesterol marcados con CM-Dil o Dil por vía intravenosa en un ratón RIP-Tag5 portador de un tumor y se inyectaron complejos DDAB:colesterol-DNA marcados con CM-Dil o Dil por vía intravenosa en otro ratón RIP-Tag5. La distribución de los liposomas o complejos en los vasos sanguíneos angiogénicos de los tumores de las células de los islotes pancreáticos se examinó 24 horas después de la inyección y se comparó con la existente en los vasos de los islotes pancreáticos de ratones normales.

Resultados: Se hicieron dos nuevas observaciones: (1) los liposomas o complejos eran absorbidos por las células endoteliales de los vasos sanguíneos angiogénicos sin escapar a través del endotelio, y (2) la absorción endosómica de los liposomas o complejos era mayor en las células endoteliales de los vasos sanguíneos angiogénicos que en las células endoteliales de los vasos normales de los islotes pancreáticos. (La Figura 2 es de una muestra de tejido).

Conclusiones: Este experimento dio resultados consistentes con la absorción preferencial de los liposomas DDAB:
colesterol o complejos liposoma-DNA por los vasos tumorales angiogénicos. Antes de repetir el experimento, (1) se incrementó la intensidad de fluorescencia de los complejos liposoma-DNA, (2) se mejoró el método de localización de los sitios de absorción de los liposomas catiónicos y complejos liposoma-DNA en los tumores de los ratones RIP-Tag; y (3) se obtuvo un mayor conocimiento de la estructura y función de los vasos sanguíneos angiogénicos en los tumores de las células de los islotes pancreáticos en los ratones RIP-Tag5.

Ejemplo 3 Absorción de los complejos DOTAP:liposoma de colesterol-DNA en los ratones RIP-Tag2

Propósito: La intensidad de fluorescencia de los complejos liposoma-DNA se había incrementado por la utilización de Rojo Texas-DHPE en lugar de Dil; se mejoró el método de preparación del páncreas de los ratones RIP-Tag2 para localización de los sitios de absorción de los complejos fluorescentes liposoma catiónico-DNA; y se había estudiado la estructura y función de los vasos sanguíneos angiogénicos en los tumores de las células de los islotes pancreáticos en los ratones RIP-Tag2. Con estas mejoras, se realizaron experimentos del tipo descrito en el Ejemplo 2 para determinar de qué modo son absorbidos los liposomas catiónicos y los complejos lípido-DNA.

Métodos: Se prepararon liposomas catiónicos de pequeñas vesículas unilaminares DOTAP:colesterol, marcados con Rojo Texas-DHPE. Se prepararon complejos liposoma-DNA con na relación total lípido:DNA de 24:1 (nmoles/\mug) en glucosa al 5%, utilizando 60 \mug de DNA plasmídico en 300 \mul. Los complejos (300 \mul) se inyectaron en las venas de la cola de ratones transgénicos RIP1-Tag2 C57BL/6 sin anestesiar y ratones normales C57BL/6 sin anestesiar.

Cuatro horas después de la inyección de los complejos, se anestesiaron los ratones por inyección intraperitoneal de Nembutal, 50 mg/kg. La vasculatura se fijó por perfusión de paraformaldehído al 1% a través de la aorta ascendente, y se tiñó la superficie luminal de la vasculatura por perfusión de lectina fluorescente verde, Thurston et al (1996) Am. J Physiol 271: H2547-2562. Se prepararon montajes tisulares enteros de secciones de Vibratomo en Vectashield, y se examinaron los vasos utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiophot, o un microscopio confocal Zeiss LSM 410 equipado con un láser kriptón-argón y tubos fotomultiplicadores optimizados. Las imágenes se registraron en película Kodak Ektachrome (ASA 400) o como archivos digitales de imagen confocal.

Resultados: El experimento demostró claramente la absorción ávida de los complejos DOTAP:colesterol-DNA marcados con Rojo Texas por las células endoteliales angiogénicas en los tumores pancreáticos de los ratones RIP1-Tag2. La absorción por los vasos tumorales excedía con mucho la absorción de estos complejos por las células endoteliales correspondientes de los islotes pancreáticos normales (compárense las Figuras 3 y 4).

Los tumores se diferenciaban fácilmente de los tejidos adyacentes debido a la fuerte marcación de sus vasos sanguíneos con los complejos fluorescentes rojos de los liposomas. La geometría de la vasculatura de los tumores era variable, abarcando desde el patrón típico de los islotes normales hasta una red densa, tortuosa y anastomosante de vasos sinusoidales claramente mayores y más densamente compactados que en los islotes normales. En el último caso, la vasculatura se asemejaba a la de los cuerpos lúteos. La intensidad de marcación de los vasos tumorales era aproximadamente proporcional al tamaño del tumor. Los tumores mayores tenían la marcación máxima.

Algunos vasos sanguíneos en los tumores de tamaño pequeño a mediano presentaban protrusiones achaparradas focales, semejantes a aneurismas. Estos sitios eran particularmente claros debido a la presencia de puntos marcados con Rojo Texas anormalmente numerosos, que se suponía eran endosomas. La marcación con Rojo Texas de estos sitios era mayor que la de los vasos adyacentes. Parecía que estas estructuras podrían ser brotes capilares. Las estructuras no se encontraban en tumores grandes que tenían una vasculatura densa y compleja, donde los vasos estaban marcados de modo uniformemente denso.

No había evidencia alguna de extravasación de los complejos marcados con Rojo Texas en los tumores. Asimismo, no se observó complejo alguno marcado con Rojo Texas dentro de las agrupaciones de eritrocitos extravasculares en los tumores. La marcación densa de la vasculatura tumoral se semejaba a la de los cuerpos lúteos ováricos durante la etapa inicial de su desarrollo.

Ejemplo 4 Absorción de liposomas catiónicos y complejos liposoma-DNA por los vasos sanguíneos angiogénicos en los tumores y en la inflamación crónica

Propósito: Se llevaron a cabo experimentos del tipo descrito en el Ejemplo 3 para extender las observaciones a otros modelos de angiogénesis. Estos experimentos enfocaban también la cuestión de si tenía que estar presente DNA para que los liposomas catiónicos se direccionaran a los vasos sanguíneos angiogénicos. Se examinaron cuatro modelos animales de angiogénesis con respecto a si existía una absorción preferencial de los liposomas DOTAP:colesterol o los complejos liposoma-DNA por los vasos sanguíneos angiogénicos.

Modelos: Modelo de tumor RIP1-Tag2. Se produjeron ratones transgénicos C57BL/6 y se determinó su fenotipo al nacer por análisis PCR. El modelo de ratón se ha descrito anteriormente.

Modelo de tumor HPV. Se produjeron ratones transgénicos HPV (virus del papiloma humano) y se determinó su fenotipo al nacer por análisis PCR. Se utilizaron hermanos de camada no transgénicos como controles. En este modelo, el oncogén del virus de papiloma humano está impulsado por una región del promotor 14 de queratina. Cuando se inserta en el genoma murino, este constructo induce la expresión de HPV específicamente en las células epidérmicas. Todos los ratones transgénicos desarrollan displasia acompañada por angiogénesis en la piel del tórax superior y de las orejas, y una pequeña proporción de ellos desarrollan tumores.

Modelo de la infección por Mycoplasma pulmonis en las ratas. Como en los ratones, esta infección causa enfermedad crónica de las vías aéreas, una de cuyas características es la angiogénesis en la mucosa de las vías aéreas. Después de la anestesia (40 mg/kg de ketamina y 8 mg/kg de xilazina inyectados intraperitonealmente), se inocularon ratas Wistar macho de 8 semanas exentas de patógenos (procedentes de Charles River) por vía intranasal diariamente durante tres días consecutivos con Mycoplasma pulmonis de la variedad 5782C4 en un volumen de 200 \mul. Ratas exentas de patógenos inoculadas con caldo sirvieron como controles. Las ratas infectadas y de control se enjaularon por separado en condiciones de barrera. Los niveles en suero de anticuerpo para M. pulmonis y otros patógenos se midieron al final del experimento (Microbiological Associates, Bethesda MD).

Métodos: Se prepararon liposomas catiónicos DOTAP:colesterol, marcados con Rojo Texas-DHPE como se ha descrito en el Ejemplo 3. Los liposomas se inyectaron en una vena de la cola de los ratones a una dosis de 360 nmol de lípido total en un volumen de 100 \mul en glucosa al 5%. Las ratas se inyectaron por la vena femoral. Los complejos liposoma-DNA se prepararon con una relación lípido total:DNA de 24:1 en glucosa al 5%, utilizando 60 \mug de DNA plasmídico en 200-300 \mul. Se inyectaron los liposomas o complejos (200-300 \mul) en una vena de la cola de ratones RIP-Tag2, HPV o infectados con M. pulmonis sin anestesiar. Como control se utilizaron animales no transgénicos, o exentos de patógenos, según fuese apropiado.

A los 20 minutos o 4 horas después de la inyección, los ratones o ratas se anestesiaron por inyección intraperitoneal de Nembutal, 50 mg/kg. La vasculatura se fijó por perfusión de paraformaldehído al 1% a través de la aorta ascendente, y la superficie luminal de la vasculatura se tiñó por perfusión de lectina fluorescente verde, Thurston et al. (1996) Am. J. Physiol. 271: H2547-2562. Se prepararon montajes enteros de tejido o secciones de Vibratomo en Vectashield, y los vasos se examinaron con un microscopio de fluorescencia Zeiss o microscopio confocal.

La cantidad de absorción de los liposomas o complejos fluorescentes se cuantificó por microscopía confocal. Resumidamente, una serie de 12 imágenes confocales separadas por 2,5 \mum en el eje focal (z) se recogió en la región rostral de la tráquea en los canales de fluoresceína y Rojo Texas utilizando una lente 20x NA 0,6 (Zeiss) y ajustes estandarizados del tamaño del estenope confocal, la ganancia del tubo fotomultiplicador, y la potencia del láser. Se generaron proyecciones de la serie de imágenes que mostraban los vasos (fluoresceína-L. esculentum) y los liposomas (Rojo Texas) por separado. Utilizando el soporte lógico confocal, se definieron regiones de aproximadamente 200 \mum^{2} de área en las imágenes de los vasos, después de lo cual se midió la fluorescencia media de las regiones correspondientes de la imagen de los liposomas. Se determinó la intensidad de fondo por medida de la fluorescencia en regiones seleccionadas adyacentes a los vasos. Las medidas se realizaron sobre 25 vasos por tráquea y 4 tráqueas por grupo (n = 4). La significación de las diferencias se evaluó por el ensayo t de Student.

Los tejidos preparados para microscopía electrónica de transmisión se procesaron como se ha descrito previamente, McDonald (1994) Am. J. Physiol. 266: L61-L83. Resumidamente, la perfusión del fijador primario (aldehído glutárico al 3% en tampón de cacodilato 75 mM, pH 7,1, más 1% de sacarosa, 4% de PVP, 0,05% de CaCl_{2} y 0,075% de H_{2}O_{2}) durante 5 minutos a la temperatura ambiente fue seguida por perfusión del fijador secundario (aldehído glutárico al 3% en tampón de cacodilato 75 mM, pH 7,1, que contenía 0,05% de CaCl_{2}, 1% de sacarosa, y 4% de PVP) durante 5 minutos. Se dejaron fijar los tejidos in situ durante 1 hora a la temperatura ambiente y se separaron y dejaron luego en reposo durante una noche en el fijador secundario a 4ºC. Los tejidos se recortaron con una cuchilla de afeitar o se cortaron en rodajas con un cortador de tejidos, se fijaron posteriormente en osmio (2% OsO_{4} en tampón de cacodilato 100 mM, pH 7,4, durante 18 horas 4ºC), se lavaron en agua (18 horas a 4ºC), y se tiñeron en bloque con acetato de uranilo (acuoso, 37ºC durante 48 horas). El tejido se deshidrató luego con acetona, se infiltró, y se embebió en resina epoxi. Se cortaron secciones ultradelgadas con un ultramicrotomo, se montaron sobre rejillas de muestra mono-rendija, y se examinaron con un microscopio electrónico Zeiss EM-10.

Resultados: Los experimentos revelaron que los liposomas DOTAP:colesterol marcados con Rojo Texas, en ausencia de DNA, se dirigían selectivamente a las células endoteliales angiogénicas de los tumores en los ratones RIP1-Tag2, análogamente a los resultados obtenidos previamente con los complejos DOTAP:colesterol-DNA marcados con Rojo Texas y los complejos DDAB:colesterol-DNA marcados con Dil. Este experimento y los experimentos subsiguientes con ratones transgénicos RIP1-Tag2 confirmaron que la absorción de los liposomas catiónicos por los vasos sanguíneos angiogénicos de los islotes y tumores hiperplásticos excedía con mucho la de los vasos normales correspondientes (Figuras 5, 6, 7 y 8). En algunos vasos de los islotes hiperplásticos y tumores pequeños, los liposomas eran absorbidos por las células endoteliales únicamente en las regiones focales (Figura 8), mientras que en los tumores mayores la absorción era más generalizada (Figura 6). Las regiones focales de absorción se consideraron como posibles sitios de crecimiento de nuevos vasos (Figura 8).

Dado que esta propiedad de los liposomas catiónicos o complejos liposoma-DNA tenía el uso práctico potencial de suministrar selectivamente sustancias a las células endoteliales angiogénicas, pareció deseable determinar si esta propiedad de las células endoteliales angiogénicas en los tumores era compartida por las células endoteliales en otros sitios de angiogénesis patológica. Esta cuestión se abordó en experimentos en los cuales se examinó la absorción de liposomas DOTAP:colesterol marcados con Rojo Texas por las células endoteliales angiogénicas en la tráquea de ratones con infección por Mycoplasma pulmonis, que causa inflamación crónica de las vías aéreas, una de cuyas características es la angiogénesis (compárense las Figuras 9 y 10). Se encontró que las células endoteliales angiogénicas en regiones de inflamación crónica eran sitios de absorción anormalmente alta de liposomas catiónicos (Figura 10). Específicamente, los vasos de las tráqueas de ratones infectados con M. pulmonis tenían un grado de absorción anormalmente grande. Las medidas con el microscopio confocal de vasos sanguíneos angiogénicos demostraron que los ratones infectados tenían una absorción 20 a 30 veces mayor que los controles (Figura 11). Algunos vasos angiogénicos tenían una absorción 100 veces mayor. Los estudios por microscopía confocal y electrónica de células endoteliales angiogénicas en ratones infectados con M. pulmonis sugerían que los liposomas catiónicos se asociaban primeramente con endosomas (Figura 12) y se interiorizaban luego en ellos (Figura 13).

De modo semejante, los liposomas catiónicos eran absorbidos ávidamente por los vasos sanguíneos angiogénicos en los folículos ováricos y los cuerpos lúteos de los ratones, la piel displástica de los ratones transgénicos HPV, y las tráqueas de ratas con angiogénesis debida a infección por M. pulmonis.

Conclusiones: Estos experimentos confirmaron que los liposomas catiónicos y complejos liposoma-DNA se direccionan preferentemente a las células endoteliales angio-génicas de los tumores y sitios de inflamación crónica.

Ejemplo 5 Absorción de liposomas catiónicos que contienen paclitaxel por los vasos sanguíneos angiogénicos en la inflamación crónica

Se infectaron ratones C3H/HeN con Mycoplasma pulmonis, como se describe en el Ejemplo 4. Como controles sirvieron ratones exentos de patógenos. Los ratones infectados y de control se enjaularon por separado en condiciones de barrera. Siete días después de la infección, se inyectó por vía intravenosa en ratones una formulación de pequeños liposomas unilaminares compuestos de DOTAP:PC de huevo:rodamina DHPE:paclitaxel (relación molar 50:47:1:2) en un volumen de 150 \mul (150 \mul de inyección en la vena de la cola de una solución 10 mM de lípido total (con inclusión de paclitaxel); dosis total de 20 \mug de paclitaxel por ratón). Veinte minutos después de la inyección de los liposomas, los ratones se inyectaron por vía intravenosa con lectina de Lycopersicon esculentum marcada con fluoresceína para teñir las células endoteliales en todo el cuerpo. Inmediatamente después, los ratones se sometieron a perfusión a través de la vasculatura con fijador, como se describe en el Ejemplo 4. De esta manera, los liposomas catiónicos pudieron identificarse por su fluorescencia roja y los vasos sanguíneos pudieron identificarse por su fluorescencia verde. La cantidad de absorción de los liposomas fluorescentes que contenían paclitaxel se cuantificó por microscopía confocal de secciones de tejidos, como se describe en el Ejemplo 4.

Resultados: El examen de los tejidos en los ratones exentos de patógenos demostró que los liposomas catiónicos que contenían paclitaxel eran absorbidos ávidamente por las células endoteliales de los vasos sanguíneos de las vías aéreas en la tráquea de los ratones infectados. Se observó poca absorción en los vasos sanguíneos de la tráquea de los ratones no infectados, como se muestra en la Figura 14. Estas observaciones confirmaron que los liposomas catiónicos que contienen paclitaxel tienen las mismas propiedades de direccionamiento que los liposomas catiónicos sin paclitaxel.

Resumen

Las células endoteliales angiogénicas se direccionan selectivamente con liposomas catiónicos que contienen un taxano que afecta a las células direccionadas por inhibir su crecimiento. Un sitio de angiogénesis puede localizarse con precisión por administración de liposomas catiónicos que contienen un marcador detectable.

Claims

1. Un liposoma catiónico, que comprende:

al menos un lípido catiónico en una cantidad mayor que 5% molar y opcionalmente al menos un lípido neutro,

caracterizado porque comprende un taxano en una cantidad menor que 20% molar.

2. El liposoma de la reivindicación 1, que comprende un taxano en una cantidad de 0,5% molar a 20% molar, preferiblemente de 2% molar a 10% molar y más preferiblemente de 1% molar a 5% molar.

3. El liposoma de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende al menos un lípido catiónico en una cantidad de 20% molar a 99% molar, con preferencia de 40% molar a 98% molar.

4. El liposoma de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende al menos un lípido neutro en una cantidad de 1% molar a 80% molar, preferiblemente de 2% molar a 50% molar, y muy preferiblemente de 40% molar a 50% molar.

5. El liposoma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende cristales de taxano en una cantidad menor que 10%, preferiblemente menor que 5%, más preferiblemente menor que 2% y muy preferiblemente menor que 0,5%.

6. El liposoma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dicho taxano es un derivado farmacéuticamente aceptable y se selecciona de paclitaxel, docetaxel, un análogo de paclitaxel desacetilado en posición 10, un análogo de 3'N-desbenzoil-3'N-t-butoxicarbonilo de paclitaxel, un derivado de galactosa o manosa de un taxano, un piperazinderivado de un taxano, un 6-tioderivado o un sulfenamidoderivado de un taxano, y un taxano unido a un resto hidrófobo.

7. El liposoma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual dicho taxano es paclitaxel.

8. El liposoma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual dicho taxano es docetaxel.

9. El liposoma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual dicho liposoma es unilaminar y tiene un diámetro comprendido en el intervalo de 20 nm a 400 nm, preferiblemente de 50 nm a 300 nm.

10. El liposoma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el cual dicho taxano se encuentra en una bicapa lipídica del liposoma.

11. El liposoma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el cual dicho taxano se encuentra en un compartimiento acuoso del liposoma.

12. El liposoma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende adicionalmente un marcador detectable.

13. El liposoma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el cual dicho marcador detectable es un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, una sustancia histoquímica o inmunohistoquímicamente detectable o un colorante detectable.

14. El liposoma de la reivindicación 1, en el cual el liposoma comprende DOTAP, DOPC y paclitaxel en una relación molar 50:47:3.

15. Uso de un liposoma catiónico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la fabricación de una composición farmacéutica para tratamiento de una enfermedad angiogénica.

16. Uso de un liposoma catiónico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la fabricación de una composición farmacéutica para reducir la formación de placa ateroesclerótica.

17. Uso de un liposoma catiónico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la fabricación de una composición farmacéutica para tratamiento del cáncer.

18. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el cual dicho liposoma se administra al sistema circulatorio por inyección.