ES2256415T3 - Ensayos basados en celulas y secuencias para la fosfodiesterasa 10a. - Google Patents

Ensayos basados en celulas y secuencias para la fosfodiesterasa 10a.

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Abstract

Un método para rastrear un agente que inhiba la actividad de fosfodiesterasa 10A intracelular, comprendiendo dicho método: i) administrar el agente a neuronas espinosas medias del estriado y activar de modo submáximo a la adenilato ciclasa; ii) administrar el agente a neuronas espinosas medias del estriado y activar de modo submáximo a la guanilato 10 ciclasa; iii) medir la generación de cAMP en las células de la etapa (i) y la generación de cGMP en las células de la etapa (ii); 15 iv) calcular la EC200 de cAMP para la etapa (i) y la EC200 de cGMP para la etapa (ii); en el que el agente se identifica como un inhibidor de PDE10A si la relación de EC200 de cAMP/EC200 de cGMP es comparable a la relación producida por la administración de papaverina en las mismas condiciones de ensayo.

Description

Ensayos basados en células y secuencias para la fosfodiesterasa 10A.
Campo de la invención
La presente invención proporciona métodos para identificar a agentes que modulan la actividad de PDE10A y las secuencias de polinucleótido y polipéptido para PDE10A de rata.
Antecedentes
Las nucleótido cíclico fosfodiesterasas (PDE) catalizan la hidrólisis de los segundos mensajeros cAMP (3'5'-monofosfato cíclico de adenosina) y cGMP (3'5'-monofosfato cíclico de guanina) y juegan un papel regulador clave en una amplia variedad de rutas de transducción de señal (Beavo, Physiol. Rev. 75: 725-48, 1995). Por ejemplo, las PDE median procesos implicados en la visión (McLaughlin et al., Nat. Genet. 4: 130-34, 1993), el olfato (Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9677-81, 1995), la agregación de plaquetas (Dickinson et al., Biochem. J. 323: 371-77, 1997), la síntesis de aldosterona (MacFarland et al., J. Biol. Chem. 266: 13642, 1991), la secreción de insulina (Zhao et al., J. Clin. Invest. 102: 869-73, 1998), la activación de células T (Li et al., Science 283: 848-51, 1999), y la relajación del músculo liso (Boolell et al., Int. J. Impot. Res. 8: 47-52, 1996; Ballard et al., J. Urol. 159: 2164-71, 1998).
Las PDE forman una superfamilia de enzimas que están subdivididas en 11 familias principales (Beavo, Physiol. Rev. 75: 725-48, 1995; Beavo et al., Mol. Pharmacol. 46: 399-05, 1994; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8991-96, 1998; Fisher et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 246: 570-77, 1998; Hayashi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 250: 751-56, 1998; Soderling et al., J. Biol. Chem. 273: 15553-58, 1998; Fisher et al., J. Biol. Chem. 273: 15559-64, 1998; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7071-76, 1999; y Fawcett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702-07, 2000).
Cada familia de PDE está distinguida funcionalmente por características enzimáticas únicas y perfiles farmacológicos. Además, cada familia exhibe modelos de tejidos, expresión celular y subcelular distintos (Beavo et al., Mol. Pharmacol. 46: 399-405, 1994; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8991-96, 1998; Fisher et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 246: 570-77, 1998; Hayashi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 250: 751-56, 1998; Soderling et al., J. Biol. Chem. 273: 15553-58, 1998; Fisher et al., J. Biol. Chem. 273: 15559-64, 1998; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7071-76, 1999; Fawcett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702-07, 2000; Boolell et al., Int. J. Impot. Res. 8: 47-52, 1996; Ballard et al., J. Urol. 159: 2164-71, 1998; Houslay, Semin. Cell Dev. Biol. 9: 161-67, 1998; y Torphy et al., Pulm. Pharmacol. Ther. 12: 131-35, 1999). En consecuencia, administrando un compuesto que regule selectivamente la actividad de una familia o subfamilia de enzimas PDE, es posible regular rutas de transducción de la señal de cAMP y/o cGMP en una manera a células o tejidos específicas.
La PDE10 se identifica como una PDE única basada en la secuencia de aminoácidos primaria y la diferente actividad enzimática. El rastro de la homología de bases de datos de EST reveló a la PDE10A como el primer miembro de la familia PDE10 de fosfodiesterasas (Fujishige et al., J. Biol. Chem. 274: 18438-18445, 1999; Loughney et al., Gene 234:109-117, 1999). Los homólogos humanos, de rata y murinos han sido clonados y las variantes de empalme del extremo N han sido identificadas tanto para genes de rata como para humanos (Kotera et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 261: 551-557, 1999; Fujishige et al., Eur. J. Biochem. 266: 1118-1127, 1999; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7071-7076, 1999); hay un alto grado de homología entre especies. PDE10A hidroliza cAMP y cGMP en AMP y GMP, respectivamente. La afinidad de PDE10A con cAMP (K_{m} = 0,05 \muM) es más alta que para cGMP (K_{m} = 3 \muM). Sin embargo, una V_{max} de aproximadamente 5 veces más grande para cGMP respecto cAMP ha conducido a la sugerencia de que PDE10A sea una única cGMPasa cAMP-inhibida (Fujishige et al., J. Biol. Chem. 274:18438-18445, 1999).
La PDE10A únicamente se localiza en mamíferos en relación con otras familias de PDE. El ARN mensajero para PDE10A se expresa altamente sólo en los testículos y el cerebro (Lanfear y Robas, documento EP 0967284; Fujishige et al., Eur. J. Biochem. 266:1118-1127, 1999; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7071-7076, 1999; Loughney et al., Gene 234:109-117, 1999). Estudios iniciales indicaron que, dentro del cerebro, la expresión es más alta en el cuerpo estriado (caudado y putamen), nucleus accumbens, y tubérculo olfativo (Lanfear y Robas, supra). En consecuencia, la modulación selectiva de PDE10A podría ser usada para modular los niveles de nucleótidos cíclicos en estas áreas cerebrales.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona métodos para identificar a agentes que modulen selectivamente la actividad de PDE10A y las secuencias de polinucleótido y polipéptido para PDE10A de rata.
En un aspecto, la invención se caracteriza por un método de rastreo para un agente que inhibe la actividad de fosfodiesterasa intracelular 10A que comprende administrar el agente a neuronas espinosas medias del estriado y activar de modo submáximo la adenilato ciclasa, administrar el agente a neuronas espinosas medias del estriado y activar de modo submáximo la guanilato ciclasa, medir la generación de cAMP y la generaración cGMP, respectivamente, y calcular la EC_{200} de cAMP y la EC_{200} de cGMP, respectivamente, en el que el agente se identifica como un inhibidor de PDE10A si la relación de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP es comparable a la relación producida por la administración de papaverina en las mismas condiciones de ensayo.
Preferiblemente, las neuronas espinosas medias del estriado se preparan como neuronas de cultivado primario, la adenilato ciclasa se activa por la forskolina, la guanilato ciclasa se activa por nitroprusida de sodio, y la relación de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP está en el intervalo de 1,75-5,25, más preferiblemente, de 3,0-4,0. Preferiblemente, la concentración de cAMP y cGMP se mide por un ensayo de proximidad por centelleo. Se prefiere que las neuronas usadas para evaluar cAMP y cGMP estén en muestras separadas. Además, se prefiere que el agente se identifique primero in vitro como un inhibidor selectivo de PDE10A. De forma alternativa, el agente se identifica además como un inhibidor selectivo de PDE10A por ensayo in vitro.
En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En un aspecto relacionado, la invención se refiere a un polinucleótido aislado o purificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 2 y/o la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1.
La invención también se refiere a un vector que comprende la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1, y una célula huésped que expresa la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1.
Además, la invención proporciona un método para identificar a un agente que module la actividad de PDE10A, que comprende poner en contacto el agente con un polipéptido PDE10A de rata que comprenda SEQ ID NO: 2 y medir la actividad del polipéptido PDE10A, en el que una diferencia entre la actividad del polipéptido PDE10A en presencia del agente y en ausencia del agente es indicativa de que el agente modula la actividad de PDE10A.
También la invención se refiere a un método para identificar a un agente que module la actividad de PDE10A, que comprende poner en contacto el agente con una célula huésped que exprese la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1 y medir la actividad del polipéptido PDE10A expresado por SEQ ID NO: 1, en el que una diferencia entre la actividad del polipéptido PDE10A en presencia del agente y en ausencia del agente es indicativa de que el agente modula la actividad de PDE10A.
Los expertos en la técnica entenderán totalmente los términos usados en este documento en la descripción y las reivindicaciones accesorias para describir la presente invención. Sin embargo, a no ser que se proporcione de otra manera en este documento, los términos siguientes son tal como se describen inmediatamente a continuación.
Un "agente que aumenta la actividad de PDE10A" se refiere a una molécula que intensifica o imita la actividad biológica del polipéptido PDE10A. Tales agentes (es decir, agonistas) pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, pequeñas moléculas, o cualquier otro compuesto o composición que aumente la actividad de PDE10A aumentando la cantidad de PDE10A presente en una célula o aumentando la actividad catalítica del polipéptido PDE10A.
Un "agente que disminuye la actividad de PDE10A" se refiere a una molécula que inhibe o atenúa la actividad biológica del polipéptido PDE10A. Tales agentes (es decir, antagonistas) pueden incluir proteínas tales como anticuerpos de antiPDE10A, ácidos nucleicos, carbohidratos, pequeñas moléculas, o cualquier otro compuesto o composición que disminuya la actividad del polipéptido PDE10A reduciendo la cantidad del polipéptido PDE10A presente en una célula, o disminuyendo la actividad catalítica del polipéptido PDE10A.
Una "variante alélica" es una forma alternativa del gen que codifica para el polipéptido PDE10A. Las variantes alélicas pueden ser el resultado de al menos una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos y pueden causar mRNA cambiados o polipéptidos cuya estructura o función pueden o no respecto a ser cambiados. Un gen puede no tener ninguna, una, o muchas variantes alélicas de su forma natural. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes alélicas generalmente son atribuidos a deleciones que ocurren naturalmente, adiciones, o sustituciones de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambios pueden ocurrir solos, o en combinación con los otros, una o varias veces en una secuencia dada.
Una secuencia de ácidos nucleicos "modificada" que codifica para el polipéptido PDE10A incluye una secuencia con una deleción, inserción, o sustitución de nucleótidos diferentes, dando lugar a un polipéptido con al menos una característica funcional de un polipéptido PDE10A. Incluido dentro de esta definición están los polimorfismos que pueden o no ser fácilmente detectables utilizando una sonda de oligonucleotido particular del polinucleótido que codifica para un polipéptido PDE10A. La proteína codificada también puede ser "modificada", y puede contener una o varias deleciones, inserciones, o sustituciones de los restos de aminoácidos que producen un cambio silente y originan un polipéptido PDE10A que es sustancialmente equivalente funcionalmente a un polipéptido PDE10A conocido. Las sustituciones de aminoácidos deliberadas pueden ser hechas sobre la base de la semejanza en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los restos, siempre que el polipéptido PDE10A sea sustancialmente funcionalmente equivalente, por ejemplo, en la actividad catalítica o inmunológica.
La "amplificación" se refiere a la producción de copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos. Generalmente se lleva a cabo usando tecnologías de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) conocidas en la técnica.
Un valor de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP es "comparable" al producido por papaverina si varía en menos o igual al 50% del valor de papaverina.
Una "composición" que comprende un polinucleótido dado o polipéptido puede comprender una formulación seca o una solución acuosa.
"Sustituciones de aminoácidos conservadoras" son las sustituciones que, cuando se hacen, interfieren lo menos posible con las propiedades de la proteína original, es decir, la estructura y especialmente la función de la proteína es conservada y no es modificada significativamente por tales sustituciones. Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen las siguientes: Ala sustituido por Gly o Ser; Arg sustituido por His o Lys; Asn sustituido por Asp, Gln, o His; Asp sustituido por Asn o Glu; Cys sustituido por Ala o Ser; Gln sustituido por Asn, Glu, o His; Glu sustituido por Asp, Gln, o His; Gly sustituido por Ala; His sustituido por Asn, Arg, Gln, o Glu; Ile sustituido por Leu o Val; Leu sustituido por Ile o Val; Lys sustituido por Arg, Gln, o Glu; Met sustituido por Leu o Ile; Phe sustituido por His, Met, Leu, Trp, o Tyr; Ser sustituido por Cys o Thr; Thr sustituido por Ser o Val; Trp sustituido por Phe o Tyr; Tyr sustituido por His, Phe, o Trp; y Val sustituido por Ile, Leu, o Thr. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras mantienen generalmente la misma, o esencialmente igual (a) estructura de la estructura del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja \beta o helicoidal \alpha, (b) carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio de la sustitución, y/o (c) el conjunto de la cadena lateral.
El término "derivado" se refiere a la modificación química de una secuencia de polinucleótido o polipéptido. Las modificaciones químicas de una secuencia de polinucleótido pueden incluir, por ejemplo, el reemplazo de hidrógeno por un grupo alquilo, acilo, hidroxilo, o amino. Un polinucleótido derivado codifica para un polipéptido que conserva al menos una función biológica o inmunológica de la molécula natural. Un polipéptido derivado es uno que se modifica por glicosilación, pegilación, o cualquier otro procedimiento que conserve al menos una función biológica o inmunológica del polipéptido del cual fue derivado.
Un "fragmento" es una parte única de un polipéptido PDE10A o el polinucleótido que codifica para un polipéptido PDE10A que es idéntico en la secuencia, pero más corto en la longitud, que la secuencia parental. Un fragmento usado como una sonda, iniciador, antígeno, molécula terapéutica, o para otros objetivos, puede ser de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250, o al menos 500 nucleótidos contiguos o restos de aminoácidos en longitud. Los fragmentos pueden seleccionarse preferencialmente a partir, o carecer, de ciertas regiones de una molécula.
El término "identidad" se refiere a un grado de complementariedad. Puede haber semejanza parcial o identidad completa. La palabra "semejanza" puede sustituir a la palabra "identidad". Una secuencia parcialmente complementaria que inhiba al menos parcialmente una secuencia idéntica de la hibridación a un ácido nucleico objetivo se denomina "sustancialmente similar". La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente complementaria en la secuencia objetivo puede ser examinada usando un ensayo de hibridación (inmunoensayo Southern o Northern, hibridación en solución, y similares) en unas condiciones de severidad reducida. Una secuencia sustancialmente similar o sonda de hibridación competirán e inhibirán la unión de una secuencia completamente similar (idéntica) a la secuencia objetivo en condiciones de severidad reducida. Esto no debe querer decir que las condiciones de severidad reducida sean tales que se permita la unión no específica. Más bien, las condiciones de severidad reducidas requieren que la unión de dos secuencias entre sí sea una interacción específica (es decir, una selectiva). La ausencia de unión no específica puede ser analizada por el uso de una segunda secuencia objetivo que carezca hasta de un grado parcial de complementariedad (por ejemplo, menos de una semejanza o identidad de aproximadamente 30%). En ausencia de una unión no específica, la secuencia sustancialmente similar o la sonda no hibridarán la segunda secuencia objetivo no complementaria.
Las expresiones "porcentaje de identidad" y "% de identidad", aplicadas a las secuencias del polinucleótido, se refieren al porcentaje de coincidencias de restos entre al menos dos secuencias de polinucleótidos alineadas usando un algoritmo estandarizado. Tal algoritmo puede insertar, de un modo estandarizado y reproductible, huecos en las secuencias que se comparan para optimizar el alineamiento entre dos secuencias, y por lo tanto para alcanzar una comparación más significativa de las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre secuencias de polinucleótidos puede ser determinada usando los parámetros estandar del algoritmo CLUSTAL V como se incorpora en el programa de alineamiento de secuencias MegAlign® versión 3.12e. Este programa es parte del paquete de software LASERGENE, una serie de programas de análisis biológicos moleculares (DNASTAR, Madison, Wis.). CLUSTAL V se describe en Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989, y en Higgins et al., CABIOS 8:189-19, 1992. El porcentaje de identidad se refiere en CLUSTAL V como el "porcentaje de semejanza" entre pares de secuencia de polinucleótidos alineados. De forma alternativa, una serie de algoritmos de comparación de secuencia usados comúnmente y libremente disponibles se proporciona en el "National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)" (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990), que está disponible en varias fuentes, incluyendo el NCBI, Bethesda, Md., y en http://www.ncbi.nim.nih.gov/blast/. La serie del software BLAST incluye varios programas de análisis de secuencia incluyendo el "blastn", que se usan para alinear una secuencia de polinucleótido conocida con otras secuencias de polinucleótido de una variedad de bases de datos. También está disponible una herramienta llamada "BLAST 2 Sequences" que se usa para una comparación de parejas directa de dos secuencias de nucleótidos. Al "BLAST 2 Sequences" puede accederse y usarse interactivamente en http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. La herramienta "BLAST 2 Sequences" puede usarse tanto para blastn como para blastp (mencionado debajo). Los programas BLAST se usan comúnmente con hueco y otros parámetros puestos en ajustes estándar. Por ejemplo, para comparar dos secuencias de nucleótidos, se puede usar el blastn con la herramienta "BLAST 2 Sequences" Versión 2.0.9 (7 de mayo de 1999) que usa la matriz Blossum 62 o la matriz PAM250, un peso de hueco de 40, 50, 60, 70, ó 80, y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. El porcentaje de identidad puede medirse en la longitud de una secuencia entera definida, por ejemplo, como se define por un número SEQ ID particular, o puede medirse en una longitud más corta, por ejemplo, en la longitud de un fragmento tomado a partir de una secuencia más grande, definida, por ejemplo, un fragmento de al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 70, al menos 100, o al menos 200 nucleótidos contiguos. Tales longitudes son ejemplares sólo, y se entiende que cualquier longitud de fragmento descrita por las secuencias mostradas en este documento puede ser usada para describir una longitud sobre la cual el porcentaje de identidad pueda ser medido. Las secuencias de ácidos nucleicos que no muestren un alto grado de identidad, sin embargo, pueden codificar para secuencias de aminoácidos similares debido a la degeneración del código genético. Se entiende que los cambios de una secuencia de ácidos nucleicos pueden hacerse usando esta degeneración para producir múltiples secuencias de ácidos nucleicos abarcadas según la invención que codifiquen todas los mismos o sustancialmente los mismos polipéptidos de PDE10A.
Las expresiones "porcentaje de identidad" y "% de identidad" aplicadas a las secuencias del polipéptido, se refieren al porcentaje de coincidencias del resto entre al menos dos secuencias del polipéptido alineadas usando un algoritmo estandarizado. Los métodos de alineamiento de la secuencia del polipéptido son conocidos. Algunos métodos de alineamiento tienen en cuenta sustituciones de aminoácidos conservadoras. Tales sustituciones conservadoras, explicadas más detalladamente anteriormente, conservan generalmente la hidrofobicidad y la acidez en el sitio de sustitución, conservando así la estructura y la función del polipéptido. El porcentaje de identidad entre secuencias del polipéptido puede ser determinado usando los parámetros estandar del algoritmo CLUSTAL V como se incorpora en el programa de alineamiento de secuencias MegAlign® (DNASTAR, Madison, Wis.). La matriz de PAM250 se selecciona como la tabla de peso del resto estandar. Como con los alineamientos del polinucleótido, el porcentaje de identidad se refiere mediante el CLUSTAL V como el "porcentaje de semejanza" entre pares de secuencia del polipéptido alineados.
De forma alternativa, puede usarse la serie del software NCBI BLAST. Por ejemplo, para una comparación por parejas de dos secuencias del polipéptido, se puede usar la herramienta "BLAST 2 Sequences" Versión 2.0.9 (7 de mayo de 1999) con el blastp puesto en los parámetros estandar. En tales parámetros estandar, por ejemplo, se pueden usar Matriz 62 Blossum, puntuación = 50, y longitud de palabra = 3. El porcentaje de identidad puede medirse sobre la longitud de una secuencia de polipéptido entera definida, por ejemplo, como se define por un número de SEQ ID particular, o puede medirse sobre una longitud más corta, por ejemplo, sobre la longitud de un fragmento tomado a partir de una secuencia del polipéptido más grande definido, por ejemplo, un fragmento de al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 70, o al menos 100 restos contiguos. Tales longitudes son ejemplares sólo, y se entiende que cualquier longitud de fragmento basado en las secuencias mostradas en este documento, incluyendo las Figuras y el Listado de Secuencias, puede usarse para describir una longitud sobre la cual el porcentaje de identidad pueda medirse.
Por un "huésped" se propone una célula transgénica (por ejemplo, mamífera, bacteriana, de insecto) o un animal (por ejemplo, mamífero no humano) que es transfectado, y capaz de expresarse, con un polinucleótido heterólogo.
Un polinucleótido "heterólogo" es uno que es extraño, o que se da artificialmente, o que se coloca artificialmente en el genoma de la célula huésped.
La "hibridación" se refiere al procedimiento por el cual una cadena de polinucleótido se hibrida con una cadena complementaria a través de la base que se aparea en condiciones de hibridación definidas. La hibridación específica es una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos comparten un alto grado de identidad. Los complejos de hibridación específicos se forman en condiciones de hibridación permisivas y quedan hibridados después de la(s) etapa(s)
de "lavado". La(s) etapa(s) de lavado es(son) particularmente importante(s) en la determinación de la severidad del procedimiento de hibridación, con condiciones más rigurosas que permitan menos la unión no específica, es decir, la unión entre los pares de las cadenas de ácidos nucleicos que no estén perfectamente emparejadas. Las condiciones permisivas para hibridar las secuencias de ácidos nucleicos son determinables rutinariamente por cualquier experto ordinario en la técnica y pueden ser constantes entre experimentos de hibridación, mientras que las condiciones de lavado pueden variarse entre experimentos para alcanzar la severidad deseada, y por lo tanto la especificidad de la hibridación. Las condiciones de hibridación permisivas ocurren, por ejemplo, a 68ºC en presencia de aproximadamente 6X SSC, aproximadamente 1% (p/v) de SDS, y aproximadamente 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado.
Generalmente, la severidad de la hibridación se expresa, en parte, con referencia a la temperatura bajo la cual la etapa de lavado se lleva a cabo. Generalmente, tales temperaturas de lavado se seleccionan para que sean de aproximadamente 5ºC a 20ºC más bajas que el punto de fusión termal (Tm) para la secuencia específica con una fuerza iónica definida y pH. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica definida y pH) a la que el 50% de la secuencia objetivo se hibrida en una sonda perfectamente emparejada. Una ecuación para calcular la Tm y las condiciones para la hibridación de ácidos nucleicos se conoce y puede ser encontrada en Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview, Nueva York; véase específicamente el vol. 2, capítulo 9.
Altas condiciones de severidad para la hibridación entre los polinucleótidos de la presente invención incluyen condiciones de lavado de aproximadamente 55-68ºC en presencia de aproximadamente 0,2-1,0X SSC y aproximadamente 0,1% de SDS, durante aproximadamente 1 hora.
En general, las reacciones de hibridación pueden llevarse a cabo a temperaturas de aproximadamente 65ºC, 60ºC, 55ºC, o 42ºC. La concentración de SSC puede variar de aproximadamente 0,1 a 2X SSC, estando SDS presente en aproximadamente 0,1%. Típicamente, los reactivos bloqueantes se usan para bloquear la hibridación no específica. Tales reactivos de bloqueo incluyen, por ejemplo, ADN de esperma de salmón desnaturalizado a aproximadamente 100-200 pg/ml. El disolvente orgánico, tal como formamida a una concentración en v/v de aproximadamente 35-50%, también puede usarse en circunstancias particulares, tales como para hibridaciones RNA:DNA. Variaciones útiles sobre estas condiciones de lavado serán fácilmente evidentes para los expertos ordinarios en la técnica. La hibridación, particularmente a altas condiciones de severidad, es sugestiva de una semejanza evolutiva entre los nucleótidos, que es fuertemente indicativa de un papel similar para los nucleótidos y sus polipéptidos codificados.
La expresión "complejo de hibridación" se refiere a un complejo formado entre dos secuencias de ácidos nucleicos en virtud de la formación de enlaces de hidrógeno entre bases complementarias. Un complejo de hibridación puede formarse entre las secuencias presentes en la solución o formarse entre una secuencia de ácidos nucleicos presente en solución y otra secuencia de ácidos nucleicos inmovilizada sobre un soporte sólido (por ejemplo, papel, membranas, filtros, chips, varillas o portaobjetos).
Por "aislado o purificado" se entiende cambiado desde el estado natural "por la mano del hombre". Si un polinucleótido o polipéptido existe en la naturaleza, entonces es "aislado o purificado" si es cambiado y/o eliminado de su ambiente original. Por ejemplo, un polinucleótido "aislado o purificado" se separa de otros polinucleótidos con los cuales está asociado en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de cDNA que es eliminada de la secuencia intrónica normalmente asociada con la secuencia de codificación es "aislada o purificada". Una secuencia del polinucleótido "aislada o purificada" puede ser introducida en células huésped en un cultivo o en organismos enteros para su expresión transitoria o estable y ser todavía "aislado y purificado", porque el polinucleótido no estaría en su forma que ocurre naturalmente o ambiental. Sin embargo, las secuencias del polinucleótido como miembros de genotecas de cDNA están excluidas de lo que se propone por "aislado o purificado". Un polipéptido "aislado o purificado" se separa de al menos un componente celular con el cual está asociado en la naturaleza. Preferiblemente, el polipéptido está al menos 60% libre, más preferiblemente, al menos 75% libre, y, lo más preferiblemente, al menos 90% libre de otros componentes.
Por "modula" se propone aumentos o disminuciones (incluyendo una eliminación completa).
"Operativamente unido" se refiere a la situación en la cual una primera secuencia de ácidos nucleicos es colocada en una relación funcional con una segunda secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido para una secuencia de codificación si el promotor funciona para regular la transcripción de la secuencia de codificación. Generalmente, las secuencias de ADN unidas operativamente pueden estar en una proximidad cercana o contigua y, cuando sea necesario, unirse a regiones que codifiquen para dos proteínas, en el mismo marco de
lectura.
"Polinucleótido" generalmente se refiere a cualquier ARN (por ejemplo, mRNA), tipo ARN, ADN (por ejemplo, cDNA o genómico), o secuencias del tipo ADN, incluyendo, sin límite, secuencias monocatenarias, bicatenarias, y tricatenarias, cadenas sentido o antisentido, secuencias generadas usando análogos de nucleótidos, moléculas híbridas que comprenden ARN y ADN, y ARN o ADN que contienen bases modificadas. El polinucleótido puede darse naturalmente o ser sintetizado.
El término "polipéptido" se refiere a una secuencia de aminoácidos, oligopéptido, péptido, polipéptido, o secuencia de proteína, o un fragmento de cualquiera de estos, y darse naturalmente o ser moléculas sintéticas. Esto incluye secuencias de aminoácidos modificadas por procesos naturales, tales como tratamiento de post-translación, o por modificaciones químicas conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, "Proteins-Structure and Molecular Properties", editor Creighton, W.H. Freeman y Col., Nueva York, 2ª Ed., 1993; "Posttranslational Covalent Modification of Proteins", editor Johnson, Academic Press, Nueva York, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol., 182: 626-46, 1990; y Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663: 48-62, 1992). Las modificaciones conocidas incluyen, pero no están limitadas, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, enlace covalente de flavina, enlace covalente del resto hemo, enlace covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, lípido o derivado de lípido, o fosfotidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de puente de disulfuro, desmetilación, formación de cistina o piroglutamato, formilación, g-carboxilación, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, tratamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas, tales como arginilación y ubiquitinación.
Por "actividad de PDE10A" se entiende la hidrólisis mediada por PDE10A de cAMP y/o cGMP in vitro, in vivo, o in situ.
Por un inhibidor de PDE10A "selectivo" se propone un agente que inhiba la actividad de PDE10A con una IC_{50} de al menos 10 veces menos que la observada para la inhibición de otras PDE.
Una "sustitución" se refiere al reemplazo de uno o varios aminoácidos o nucleótidos por aminoácidos diferentes o nucleótidos, respectivamente.
Por adenilato ciclasa o guanilato ciclasa activando "de modo submáximo" se entiende administrar un compuesto a una concentración que alcance un aumento de cAMP o cGMP, respectivamente, que sea de aproximadamente 10-50%, preferiblemente, aproximadamente 20-25%, del valor producido por la concentración máxima eficaz del compuesto.
"Transformación" o "transfección" describen un procedimiento de modificación genética por el que el ADN heterólogo entra y da una célula receptora capaz de expresar el ADN heterólogo. La transformación puede ocurrir en una célula huésped procariota o eucariota de acuerdo con varios métodos conocidos en la técnica. El método se selecciona basado en el tipo de célula huésped que se transforma e incluye, pero no está limitado, a la infección viral, electroporación, choque térmico, lipofección, y bombardeo de partículas. Las expresiones "células transformadas" o "células transfectadas" incluyen células establemente transformadas en las que el ADN insertado es capaz de replicación tanto como un plásmido que se replica autónomamente o como parte del cromosoma del huésped, así como células transitoriamente transformadas o transfectadas que expresan el ADN insertado o el ARN durante períodos limitados de tiempo. Todas tales células transformadas o transfectadas se denominan "transgénicas".
Una "variante" de una secuencia de ácidos nucleicos particular se define como una secuencia de ácidos nucleicos que tiene una identidad de secuencia de al menos 40% frente a la secuencia de ácidos nucleicos particular sobre una cierta longitud de una de las secuencias de ácidos nucleicos usando la herramienta blastn "BLAST 2 Sequences" Versión 2.0.9, puesta en los parámetros estandar. Tales secuencias pueden mostrar, por ejemplo, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98%, o mayor, identidad de secuencia respecto a una cierta longitud definida. Una variante puede ser descrita como, por ejemplo, una de variante "alelo" (como se define anteriormente), "empalme", "especie", o "polimorfa". Una variante de empalme puede tener una identidad significativa con una molécula de referencia, pero generalmente tendrá un número mayor o menor de polinucleótidos debido al empalme alterno de exones durante el procesamiento del mRNA. El polipéptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o carecer de dominios que estén presentes en la molécula de referencia. Las variantes de especie son las secuencias de polinucleótido que varían de una especie a otra. Los polipéptidos resultantes generalmente tendrán una identidad de aminoácidos significativa entre sí. Una variante polimorfa es una variación en la secuencia de polinucleótidos de un gen particular entre los individuos de una especie dada. Las variantes polimorfas también pueden abarcar "polimorfismos de un solo nucleótido" (SNP) en los que la secuencia de polinucleótidos varía por una base de nucleótido. La presencia de SNP puede ser indicativa de, por ejemplo, una cierta población, un estado de enfermedad, o una propensión para un estado de enfermedad.
Otras propiedades y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones. Aunque la invención está descrita en conexión con realizaciones específicas, será entendido que otros cambios y modificaciones que puedan ser practicados son también parte de esta invención y están también en la amplitud de las reivindicaciones añadidas. Con esta memoria descriptiva se pretende cubrir cualquier equivalente, variaciones, usos, o adaptaciones de la invención que siguen, en general, los principios de la invención, incluyendo las salidas de la presente descripción que vienen dentro de la práctica conocida o usada comúnmente dentro de la técnica, y que pueden averiguarse sin una experimentación excesiva. La dirección adicional en lo que concierne a la fabricación y utilización de ácidos nucleicos y polipéptidos es encontrada en los manuales estándar de biología molecular, ciencia de las proteínas, e inmunología (véase, por ejemplo, Davis et al., "Basic Methods in Molecular Biology", Elsevir Sciences Publishing, Inc., New York, 1986; Hames et al., "Nucleic Acid Hybridization", IL Press, 1985; "Molecular Cloning", Sambrook et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Eds. Ausubel et al., John Wiley and Sons; "Current Protocols in Human Genetics", Eds. Dracopoli et al., John Wiley and Sons; "Current Protocols in Protein Science", Eds. John E. Coligan et al., John Wiley and Sons; y "Current Protocols in Immunology", Eds. John E. Coligan et al., John Wiley and Sons). Todas las publicaciones mencionadas en este documento son incorporadas como referencia en su totalidad.
Descripción de las figuras
La figura 1A muestra la secuencia del polinucleótido que codifica para PDE10A de rata (SEQ ID NO: 1). La figura 1B muestra la secuencia de aminoácidos para el polipéptido PDE10A de rata (SEQ ID NO: 2).
Descripción detallada
La presente invención proporciona un ensayo de rastreo de células que usa neuronas espinosas medias del estriado para identificar a agentes que inhiban la actividad de PDE10A a nivel celular. Considerando el alto nivel confirmado de PDE10A en neuronas espinosas medias del estriado (como además se describe en el Ejemplo 1 debajo), estas células son candidatos excelentes para el uso en un ensayo de células para identificar a los inhibidores de la actividad de PDE10A. Tales inhibidores son útiles, por ejemplo, para tratar trastornos de movilidad o de ánimo, ansiedad, psicosis, drogadicción, y trastornos con síntomas de cognición deficiente, como se describe además en la solicitud provisional de EE.UU. 60/285.148. La presente invención también se refiere a las secuencias del polinucleótido de PDE10A de rata y del polipéptido.
Ensayo de células para identificar inhibidores de PDE10A
El ensayo de células de la invención se deriva de dos descubrimientos descritos además en los Ejemplos siguientes. Primero, la papaverina es un inhibidor selectivo de PDE10A. Y segundo, la administración de papaverina a neuronas espinosas medias del estriado produce un perfil único de cambios a niveles de cAMP y cGMP. Este perfil único indica que otros agentes que producen la misma combinación de cambios en nucleótidos cíclicos en neuronas espinosas medias del estriado también se identifican como inhibidores de PDE10A.
Para llevar a cabo el ensayo, se usan neuronas espinosas medias del estriado de mamífero. Las células pueden prepararse como un cultivo primario (véase, por ejemplo, Ventimiglia et al., Eur. J. Neurosci. 7: 213-22, 1995). De forma alternativa, puede usarse una línea celular de neuronas espinosas medias del estriado inmortalizadas (Ehlich et al., Exp. Neurol. 167: 215-26, 2001; Cattaneo y Conti, J. Neuroscience Res. 53: 223-34, 1998; Wainwright et al., J. Neuroscience 15: 676-88, 1995).
Para el cultivo celular primario, las neuronas se preparan disecando cerebros de un embrión de mamífero (por ejemplo, un embrión de rata E17 o ratón), disociando el tejido en una suspensión de células individuales, y cultivando las células en los recipientes apropiados, tales como placas de multipocillos. De ser deseado, puede ser determinada la presencia de neuronas espinosas medias del estriado en la preparación analizando la inmunorreactividad de GABA (Ventimiglia et al., supra) y puede confirmarse la expresión de PDE10A, por ejemplo, por inmunotransferencia o ensayo de protección de RNasa (véase el Ejemplo 3 debajo).
Un ejemplo del protocolo de ensayo es como sigue. Un cultivo de células primario de neuronas espinosas medias del estriado (por ejemplo, rata) de 4-5 días se lava in vitro en una solución salina tamponada de fosfato libre de Ca^{2+}/Mg^{2+} y se preincuba durante aproximadamente 1 hora en una solución salina tamponada de fosfato que contiene HEPES 30 mM, pH 7,4, CaCl_{2} 1 mM, dextrosa 1 mg/ml, y MgCl_{2} 5 mM. Los agentes de ensayo entonces se incuban con las células en el mismo tampón a 37ºC durante aproximadamente 20 minutos.
Para analizar los cambios de cAMP, el cultivo de neuronas también se incuba con una concentración submáxima de un compuesto que estimula la adenilato ciclasa (por ejemplo, forskolina 1 \muM). Para analizar los cambios de cGMP, el cultivo de neuronas se incuba con una concentración submáxima de un compuesto que estimula a la guanilato ciclasa (por ejemplo, nitroprusida de sodio 100 \muM (SNP)). Una concentración submáxima para un compuesto que estimula la generación de nucleótidos cíclicos es una concentración que genera 10-50%, preferiblemente 20-25%, de la concentración eficaz máxima. El compuesto puede ser administrado durante la incubación del agente de ensayo o durante un período subsecuente a la incubación del agente de ensayo (por ejemplo, 1-5 minutos).
Las células son lisadas y los niveles de cAMP y cGMP apropiados son medidos en el lisado de células utilizando métodos estándar. Por ejemplo, los niveles de cAMP y cGMP pueden ser medidos usando kits del ensayo de proximidad por centelleo (SPA) (Nº. de cat. RPA 540 y RPA 559, respectivamente, Amersham, Piscataway, N.J.). Los agentes de ensayo se estudian a concentraciones que varían tal que el valor de EC_{200} pueda ser determinado. La EC_{200} se define como la concentración de agente de ensayo que aumenta los niveles de cAMP o cGMP en un 200% comparado con el nivel de cAMP o cGMP medido en lisados de células no tratadas por el agente de ensayo. Idealmente, las muestras separadas de células son usadas para estimular las ciclasas y evaluar los niveles de nucleótido cíclico. Sin embargo, la estimulación de adenilato ciclasa y guanilato ciclasa puede ser llevada a cabo en una sola muestra de células, el lisado de células puede ser dividido en dos muestras, y luego pueden medirse cAMP y cGMP separadamente en estos dos lisados.
Usando un cultivo primario de neuronas espinosas medias del estriado y las condiciones de ensayo ejemplares descritas anteriormente, un agente de ensayo se identifica como un inhibidor de PDE10A si causa un aumento de cAMP y cGMP, en el que la relación de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP está en el intervalo de 1,75-5,25, preferiblemente, 2,5-4,5, más preferiblemente, 3,0-4,0. Si las células particulares o las condiciones de ensayo son variadas de las de arriba, entonces el intervalo de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP que indique que el agente es un inhibidor de PDE10A puede ser determinado analizando la papaverina como un control positivo en las condiciones apropiadas. Un agente se identifica como un inhibidor de PDE10A si produce una relación de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP que es comparable (es decir, varía en no más del 50%) del valor para papaverina.
Con el método de ensayo de la presente invención se pueden usar protocolos de preparación de células estándar alternativos (Misgeld y Dietzel, Brain Res. 492: 149-57, 1989; Shi y Rayport, J. Neurosci. 14: 4548-60, 1994; Mao y Wang, Mol. Brain Res. 86: 125-37, 2001; Snyder et al., J. Neuroscience 20: 4480-88, 2000), métodos alternativos estándar de estimular la formación de nucleótido cíclico (Svenningsson et al., Neuroscience 84: 223-28, 1998; Glass y Felder, J. Neurosci. 17: 5327-33, 1997), y/o métodos alternativos estándar para la detección de nucleótido cíclico (Villegas y Brunton, Analytical Biochem. 235: 102-3, 1996; Corbin et al., Methods Enzymol. 159: 74-82, 1988).
Aunque el ensayo de células de la presente invención pueda ser llevado a cabo con agentes de ensayo para los cuales no se conoce ninguna información anterior en cuanto a la inhibición de PDE10A, se prefiere que el ensayo de células sea usado como un ensayo secundario para confirmar que los agentes que son identificados como inhibidores de PDE10A por análisis in vitro también inhiban PDE10A a un nivel celular. Preferiblemente, los agentes se identifican como inhibidores selectivos de PDE10A. Como una alternativa al prerrastreo in vitro también se pueden confirmar a agentes como inhibidores de PDE10A analizando in vitro después de la identificación en el ensayo de células.
Para los análisis in vitro, los agentes serían identificados como inhibidores selectivos de PDE10A si la IC_{50} para la inhibición de otras PDE diferentes a PDE10A fuera al menos 10 veces mayor que la IC_{50} para la inhibición de PDE10A. Para alcanzar valores de IC_{50} comparables, todos los ensayos de PDE son llevados a cabo a las concentraciones de sustrato de nucleótido cíclico que sean equivalentemente proporcionales a la Km del nucleótido cíclico para cada enzima. Un tipo de rastreo para identificar moduladores selectivos de PDE10A usa enzimas naturales aisladas a partir de tejido o de enzimas recombinantes aisladas a partir de células huésped transfectadas, por ejemplo, células de insecto Sf9 (Fawcett, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702-07, 2000), células de levadura (Loughney et al., patente de EE.UU. Nº. 5.932.465), o células COS-7 (Yuasa, J. Biol. Chem. 275: 31469-79, 2000). Preferiblemente, la enzima de PDE10A es humana (por ejemplo, Loughney et al., patente de EE.UU. Nº. 5.932.465, Lanfear et al., documento EP 967284), ratón (por ejemplo, Lanfear et al., documento EP 967294), o rata (por ejemplo, SEQ ID NO: 2).
La actividad de PDE10A se mide, por ejemplo, como la velocidad de hidrólisis de un sustrato apropiado, [^{3}H]cAMP o [^{3}H]cGMP. Esta actividad se mide, por ejemplo, por métodos basados en SPA (Fawcett, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702-07, 2000; Phillips et al., documento WO 00/40733, y Thompson et al., Biochem. 18: 5228, 1979 (como se modifica utilizando el código del producto TRKQ7090/7100, Amersham Int'l Ltd., Buckhamshire, Inglaterra)). Brevemente, se ponen en contacto muestras que contienen la enzima de PDE10A con un sustrato de cAMP o cGMP (Sigma Chemical), una parte (por ejemplo, de ^{1}/_{4} a ^{1}/_{2}) de la cual se marca con ^{3}H (Amersham). Las reacciones se llevan a cabo, por ejemplo, en placas de microtítulo (por ejemplo, placas Microfluor®, Dynex Technologies, Chantilly, Va.), y son terminadas por la adición de perlas de SPA de silicato de itrio (Amersham) que contienen un exceso del nucleótido cíclico no marcado. Después se permite que las perlas sedimenten en la oscuridad, las placas se leen mediante una placa lectora de microtítulo (por ejemplo, TopCount®, Packard, Meriden, Conn.).
La actividad de PDE10A también puede ser analizada por la detección de ^{32}P- fosfato liberado a partir de ^{32}P-cAMP o ^{32}P-cGMP (como se describe, por ejemplo, en Loughney et al., J. Biol. Chem. 271: 796-806, 1996, y Loughney, patente de EE.UU. Nº. 5.932.465), o usando anticuerpos para distinguir entre los sustratos de PDE, cGMP o cAMP, y sus productos hidrolizados (utilizando, por ejemplo la tecnología FlashPlate®, NEN® Life Sciences Products, Boston, MA).
Como una alternativa al ensayo de la actividad catalítica de PDE10A, pueden identificarse agentes como los moduladores positivos de PDE10A o moduladores negativos (antagonistas) si modulan indirectamente la actividad catalítica de PDE10A, por ejemplo, vía la modificación de post-translación (por ejemplo, fosforilación), la modulación de unión de ligando alostérico (por ejemplo, vía el dominio GAF (Fawcett, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702-7, 2000)), o uniendo a las PDE10A mismas en un sitio catalítico o regulador alostérico. Los métodos para determinar la fosforilación de PDE10A y la unión de ligando alostérico se describen en la bibliografia (véase, por ejemplo, McAllister-Lucas et al., J. Biol. Chem. 270: 30671-79, 1995, y Corbin et al., Eur. J. Biochem. 267: 2760-67,
2000).
Los agentes de ensayo usados para rastrear in vitro y en los ensayo de células de la presente invención pueden seleccionarse individualmente o ser obtenidos a partir de una genoteca de compuestos. Tales agentes incluyen péptidos, genotecas moleculares derivadas por química combinatoria hechas de aminoácidos con configuración D y/o L, fosfopéptidos, anticuerpos, y pequeños compuestos orgánicos e inorgánicos. Las genotecas incluyen genotecas biológicas, genotecas de compuestos naturales, genotecas peptoides (genotecas de moléculas que tienen las funciones de péptidos, pero con estructuras no peptídicas nuevas que son resistentes a la degradación enzimática aunque permanezcan bioactivas) (véase, por ejemplo, Zuckermann, J. Med. Chem. 37: 2678-85, 1994), genotecas de fase sólida paralela espacialmente direccionable o fase en solución, métodos de genoteca sintética que requieren desconvolución, el método de genoteca de "una-perla un-compuesto", y métodos de genoteca sintéticos usando la selección por cromatografía de afinidad.
Los ejemplos de métodos para la síntesis de genotecas moleculares pueden ser encontrados en la técnica, por ejemplo, en DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 6909, 1993; Erd et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37: 2678, 1994; Cho et al., Science, 261: 1303, 1995; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061, 1994; y Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233, 1994.
Las genotecas de compuestos pueden ser presentadas en solución (por ejemplo, Houghten, Biotechniques, 13: 412-421, 1992), o sobre perlas (Lam, Nature 354: 82-841, 1991), sobre chips (Fodor, Nature 364: 555-556, 1993), bacterias o esporas (Ladner, patente de EE.UU. Nº. 5.223.409), plásmidos (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 1865-1869, 1992) o sobre bacteriófagos (Scott et al., Science 249: 386-390, 1990; Devlin, Science 249: 404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU) 87: 6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222: 301-310, 1991; Ladner, supra).
La secuencia de codificación del nucleótido y la secuencia del aminoácido para la PDE10A de rata
La invención abarca la secuencia de PDE10A aislada o purificada de rata, por ejemplo, como se muestra en la figura 1B (SEQ ID NO: 2).
La invención también comprende las secuencias que codifican para el nucleótido que codifican para PDE10A de rata, por ejemplo, como se muestra en la figura 1A.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para PDE10A de rata pueden ser ampliadas utilizando una secuencia de nucleótidos parcial y empleando varios métodos basados en PCR conocidos en la técnica para detectar las secuencias corriente arriba, tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, un método que puede ser empleado, PCR de sitio de restricción, usa iniciadores universales y anidados para amplificar la secuencia desconocida del ADN genómico dentro de un vector de clonación (véase, por ejemplo, Sarkar, PCR Methods Applic. 2: 318-322, 1993). Otro método, PCR inversa, usa iniciadores que amplian en direcciones divergentes para amplificar la secuencia desconocida de una plantilla circularizada. La plantilla se deriva de fragmentos de restricción que comprenden un lugar genómico conocido y secuencias circundantes (véase, por ejemplo, Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16: 8186, 1988). Un tercer método, PCR de captura, implica la amplificación por PCR de fragmentos de ADN adyacentes a secuencias conocidas en humanos y ADN de cromosoma artificial de levadura (véase, por ejemplo., Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111-119, 1991). En este método, pueden usarse múltiples digestiones de enzima de restricción y ligamientos para insertar una secuencia bicatenaria genéticamente modificada en una región de secuencia desconocida antes de la realización de la PCR.
En otra realización de la invención, puede clonarse un polinucleótido de la invención en moléculas de ADN recombinantes que dirigen la expresión de PDE10A de rata en células huésped apropiadas. Las secuencias de nucleótidos de la presente invención pueden ser modificadas genéticamente usando métodos generalmente sabidos en la técnica para modificar secuencias que codifican para PDE10A con una variedad de objetivos incluyendo, pero no limitados, a la modificación de la clonación, el procesamiento, y/o la expresión del producto génico.
Puede usarse la técnica de barajar el ADN por fragmentación aleatoria y reensamblaje por PCR de fragmentos génicos y oligonucleotidos sintéticos para modificar genéticamente las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, puede usarse mutagénesis dirigida mediada por oligonucleotido para introducir las mutaciones que crean nuevos sitios de restricción, modificar el modelo de glicosilación, modificar la preferencia del codon, producir variantes de empalme, etcétera, etcétera. En otra realización, pueden ser sintetizadas secuencias que codifican para PDE10A de rata, en todo o en parte, usando métodos químicos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Caruthers et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 7: 215-223, 1980; y Horn et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 7: 225-232, 1980). De forma alternativa, la PDE10A de rata en sí misma o uno de sus fragmentos pueden ser sintetizados usando métodos químicos. Por ejemplo, puede ser realizada la síntesis del péptido usando varias técnicas en fase sólida (véase, por ejemplo, Roberge et al., Science 269: 202-204, 1995). La síntesis automatizada puede ser lograda usando el sintetizador de péptidos ABI 431A (Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.). Además, la secuencia de aminoácidos de PDE10A de rata, o cualquiera de sus partes, puede ser modificada durante la síntesis directa y/o combinada con secuencias de otras proteínas, o cualquiera de sus partes, para producir el polipéptido variante. El péptido puede ser purificado sustancialmente por cromatografía líquida de alta resolución preparatoria (véase, por ejemplo, Chiez y Regnier, Methods Enzymol. 182: 392-421, 1990). Se puede confirmar la composición de los péptidos sintéticos mediante el análisis de aminoácidos o por secuenciación (véase, por ejemplo, Creighton, "Proteins, Structures and Molecular Propierties", WH Freeman, Nueva York,
1984).
Vectores de expresión y células huésped
Para expresar una PDE10A de rata biológicamente activa, la secuencia de nucleótidos que codifica para PDE10A de rata puede ser insertada en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para el control transcripcional y de translación de la secuencia de codificación insertada en un huésped adecuado. Estos elementos incluyen secuencias reguladoras, tales como potenciadores, promotores constitutivos e inducibles, y regiones 5' y 3' no traducidas derivadas del vector y/o de las secuencias del polinucleótido que codifican para PDE10A de rata. Tales elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. También pueden usarse señales de iniciación específicas para alcanzar una traducción más eficiente de secuencias que codifican para el polipéptido PDE10A. Tales señales incluyen el codon de iniciación ATG y las secuencias adyacentes, por ejemplo la secuencia Kozak. En los casos en los que las secuencias que codifican para PDE10A de rata y su codon de iniciación y las secuencias corriente arriba reguladoras son insertadas en el vector de expresión apropiado, pueden no ser necesarias ningunas señales de control adicionales transcripcionales o de translación. Sin embargo, en los casos en los que se inserta sólo la secuencia de codificación, o uno de sus fragmentos, las señales control de translación exógena incluyendo un codon de iniciación de ATG en marco debería ser proporcionado por el vector. Los elementos de translación exógenos y los codones de iniciación pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión puede ser realzada por la inclusión de potenciadores apropiados por el sistema de célula huésped particular usado (véase, por ejemplo, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162, 1994). Pueden usarse métodos que son conocidos para los expertos en la técnica, a la luz de esta descripción, para construir vectores de expresión que contienen las secuencias que codifican para el polipéptido PDE10A y elementos de control transcripcionales y de translación apropiados. Estos métodos incluyen la técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo (véase, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning, Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, Plainview, Nueva York, capítulos 4, 8, y 16-17, 1989; Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley e Hijos, Nueva York, capítulos 9, 13, y 16, 1995). Una variedad de sistemas de expresión de vector/huésped puede ser utilizada para contener y expresar las secuencias que codifican para PDE10A de rata. Estos incluyen, pero no están limitados, a microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, plásmidos, o vectores de expresión de ADN cósmido; levaduras transformadas con vectores de expresión de levadura (por ejemplo, episomas, elementos cromosómicos); sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión viral (por ejemplo, baculovirus, paponavirus, Vaccinia, adenovirus, virus de la viruela, virus de la rabia, y retrovirus); sistemas de células de plantas transformados con vectores de expresión viral (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV, o virus del mosaico del tabaco, TMV), con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322), o sistemas de células de animales. La invención no está limitada por la célula huésped empleada.
En los sistemas bacterianos, pueden seleccionarse varios vectores de clonación y expresión dependiendo del uso pretendido para las secuencias del polinucleótido que codifican para PDE10A de rata. Por ejemplo, una clonación de rutina, subclonación, y propagación de las secuencias del polinucleótido que codifican para el polipéptido PDE10A de rata pueden ser logradas usando un vector de E. coli multifuncional tal como pBlueScript (Stratagene, La Jolla, California) o el plásmido pSport1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD). El ligamiento de las secuencias que codifican para el polipéptido PDE10A de rata en los múltiples sitios de clonación del vector interrumpe el gen lacZ, permitiendo un procedimiento de rastreo colorimétrico para la identificación de bacterias transformadas que contienen moléculas recombinantes. Además, estos vectores pueden ser útiles para la transcripción in vitro, secuenciación didesoxi, rescate monocatenario con bacteriófago auxiliar, y la creación de deleciones anidadas en la secuencia clonada (véase, por ejemplo, Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509, 1989). Cuando son necesarias grandes cantidades del polipéptido PDE10A, por ejemplo, para la producción de anticuerpos, pueden usarse vectores que dirigen un nivel alto de expresión del polipéptido PDE10A. Por ejemplo, pueden usarse los vectores que contienen el promotor de bacteriófago T5 o T7 fuerte e inducible.
La expresión de proteínas recombinantes puede ser maximizada en la bacteria huésped proporcionando una base genética en la que la célula huésped tiene una capacidad impedida de escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185: 119-28, 1990). De forma alternativa, la secuencia del polinucleótido puede ser modificada para proporcionar un uso del codon preferencial para una célula huésped específica, por ejemplo, E. coli (Wada et al., Nucleic Acids Res. 20: 2111-18, 1992).
En los sistemas de expresión de levadura, pueden usarse varios vectores que contienen a promotores constitutivos o inducibles, tales como el factor alfa, la alcohol oxidasa, o promotores de PGH, por ejemplo, en la levadura Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris. Además, tales vectores dirigen la secreción o la retención intracelular de proteínas expresadas y permiten la integración de secuencias extrañas en el genoma del huésped para una propagación estable (véase, por ejemplo, Ausubel, 1995; Bitter et al., Methods Enzymol. 153: 516-544, 1987; y Scorer et al., BioTechnology 12: 181-184, 1994). Los sistemas de plantas también pueden usarse para la expresión de PDE10A de rata. Puede llevarse a cabo la transcripción de secuencias que codifican para el polipéptido PDE10A mediante promotores virales, por ejemplo, los promotores 35S y 19S de CaMV usados solos o en combinación con la secuencia de líder Omega a partir de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6: 307-311, 1987). De forma alternativa, pueden usarse promotores de planta tales como la pequeña subunidad de RUBISCO o promotores de choque térmico (véase, por ejemplo, Coruzzi et al., EMBO J. 3: 1671-1680, 1984; Broglie et al., Science 224: 838-843, 1984; y Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105, 1991). Estos constructos pueden ser introducidos en células de plantas por la transformación de ADN directa o la transfección mediada por patógenos (véase, por ejemplo, "The McGraw Hill Yerabook of Science and Technology", McGraw Hill, Nueva York, págs. 191-196, 1992).
En las células de mamíferos, pueden ser utilizados varios sistemas de expresión viral. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican para el polipéptido PDE10A pueden ser ligadas en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en un promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral puede usarse para obtener el virus infectivo que exprese PDE10A de rata en células huésped infectadas (véase, por ejemplo, Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659, 1984). Además, pueden usarse potenciadores de transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para aumentar la expresión en células huésped de mamíferos. Los vectores basados en SV40 o EBV también pueden usarse para expresar la proteína en un alto nivel.
También pueden emplearse HAC, BAC o YAC para suministrar los fragmentos más grandes de ADN que puedan estar contenidos y expresarlos a partir de un plásmido. Por ejemplo, HAC de aproximadamente 6 kb a 10 Mb son construidos y suministrados vía métodos de suministro convencionales (liposomas, polímeros de amino policatiónicos, o vesículas) con objetivos terapéuticos (véase, por ejemplo, Harrington et al., Nat. Genet. 15: 345-355, 1997). Para la producción a largo plazo de proteínas recombinantes en sistemas de mamíferos, se prefiere la expresión estable de PDE10A de rata en líneas celulares. Por ejemplo, las secuencias que codifican para PDE10A de rata pueden ser transformadas en líneas celulares usando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable sobre el mismo o sobre un vector separado. Después de la introducción del vector, se deja a las células crecer durante aproximadamente 1 a 2 días en un medio enriquecido antes de cambiar al medio selectivo. El objetivo del marcador seleccionable es conferir resistencia a un agente selectivo, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresen satisfactoriamente las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células establemente transformadas pueden ser propagados usando técnicas de cultivo de tejido apropiadas a cada tipo de célula.
La invención también abarca vectores en los cuales las secuencias de ácidos nucleicos descritas en este documento son clonadas en el vector en orientación inversa, pero que se unen operativamente a una secuencia reguladora que permita la transcripción de ARN antisentido. Así, puede ser producida una transcripción antisentido en todo, o una parte, de las secuencias de la molécula del ácido nucleico descritas en este documento, incluyendo tanto regiones codificantes como no codificantes. La expresión de este ARN antisentido está sujeta a cada uno de los parámetros descritos anteriormente en relación con la expresión del ARN sentido.
Cualquier número de sistemas de selección puede usarse para recuperar las líneas celulares transformadas. Estos incluyen, pero no están limitados, a genes de quinasa de timidina del virus del herpes simple y adenina fosforibosiltransferasa, para el uso en células TK^{-}, y APR^{-}, respectivamente (véase, por ejemplo, Wigler et al., Cell 11: 223-232, 1997; Lowy et al., Cell 22: 817-823, 1980). También, puede usarse la resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como base para la selección. Por ejemplo, Dhfr confiere resistencia a metotrexato; Neo confiere resistencia a la neomicina de aminoglucósidos y G-418; y Als y Pat confieren resistencia a clorosulfuron y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (véase, por ejemplo, Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567-3570, 1980; Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1-14, 1981). Otros genes seleccionables han sido descritos, por ejemplo, TrpB y HisD, que cambian los requerimientos celulares para metabolitos (véase, por ejemplo, Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047-8051, 1988). Pueden usarse marcadores visibles, por ejemplo, antocianinas, proteínas fluorescentes verdes (GFP; Clontech, Palo Alto, California), \beta-glucuronidasa y su sustrato \beta-glucurónido, o luciferasa y su sustrato luciferina. Estos marcadores pueden usarse no sólo para identificar transformantes, sino que también para cuantificar la cantidad de expresión de la proteína transitoria o estable atribuible a un sistema de un vector específico (véase, por ejemplo, Rhodes, Methods Mol. Biol. 55: 121-131, 1995). Aunque la presencia/ausencia de las expresión del gen marcador sugiera que el gen de interés está también presente, la presencia y la expresión del gen pueden tener que ser confirmadas. Por ejemplo, si la secuencia que codifica para PDE10A de rata es insertada dentro de una secuencia de un marcador génico, las células transformadas que contienen las secuencias que codifican para el polipéptido PDE10A pueden ser identificadas por ausencia de la función del marcador génico. De forma alternativa, un gen marcador puede ser colocado en tándem con una secuencia que codifique para el polipéptido PDE10A bajo el control de un promotor individual. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o la selección indica por lo general la expresión de la secuencia de PDE10A tándem también.
En general, las células huésped que contienen la secuencia de ácidos nucleicos que codifican para PDE10A de rata y las que expresan PDE10A de rata pueden ser identificadas por una variedad de procedimientos conocidos para los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no están limitados, a hibridaciones de ADN-ADN o ADN-ARN, amplificación por PCR, y bioensayo de proteínas o técnicas de inmunoensayo que incluyen las tecnologías basadas en la membrana, disolución, o chips para la detección y/o la cuantificación de secuencias de ácidos nucleicos o proteínas.
Se conocen métodos inmunológicos para detectar y medir la expresión de PDE10A usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos en la técnica. Los ejemplos de tales técnicas incluyen ensayo inmunosorbente ligada a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), inmunotransferencias, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, y separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Estos y otros ensayos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Hampton, "Serological Methods, A laboratory Manual", APS Press, San Pablo, MN, Sección IV, 1990; Coligan et al., "Current Protocols in Immunology", Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience, Nueva York, 1997; y Pound, "Immunochemical Protocols", Humana Press, Totowa, N.J., 1998). Se conoce una amplia variedad de técnicas de marcaje y conjugación por los expertos en la técnica y pueden usarse en los diversos ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos.
El medio para producir la hibridación marcada o sondas de PCR para detectar secuencias relacionadas a los polinucleótidos que codifican para PDE10A de rata incluye oligomarcaje, traslación por cortez, marcaje del extremo, o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado.
De forma alternativa, las secuencias que codifican para PDE10A de rata, o cualquiera de sus fragmentos, pueden ser clonadas en un vector para la producción de una sonda de mRNA. Se conocen tales vectores en la técnica, están disponibles en el comercio, y pueden usarse para sintetizar sondas de ARN in vitro por la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3, o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden ser llevados a cabo usando una variedad de kits disponibles en el comercio (por ejemplo, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.; Promega, Madison, Wis.; y US Biochemical, Cleveland, Ohio). Moléculas indicadoras adecuadas o marcadores que pueden usarse para facilitar la detección incluyen radioisótopos, enzimas, agentes fluorescentes, quimiluminiscentes, o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y otros por el estilo.
Las células huésped transformadas con secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido PDE10A pueden ser cultivadas en condiciones adecuadas para la expresión y la recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. La proteína producida por una célula transformada puede ser secretada o conservada intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Como será entendido por los expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen los polinucleótidos que codifican para PDE10A de rata pueden ser diseñados para que contengan las secuencias de señal que dirigen la secreción de PDE10A de rata por una membrana de célula procariota o eucariota. Además, una cepa de célula huésped puede ser escogida por su capacidad de modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada de la manera deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no están limitadas, a acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. El procesamiento de post-translación que rompe una forma "prepro" o "pro" de la proteína también puede usarse para especificar el reconocimiento de la proteína, la desnaturalización, y/o la actividad.
Diferentes células huésped que tienen la maquinaria celular específica y los mecanismos característicos para las actividades de post-translación (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y W138) están disponibles de la colección americana de cultivos tipo (ATCC, Manassas, VA) y pueden ser escogidas para asegurar la modificación correcta y el procesamiento de la proteína extraña. En otra realización de la invención, las secuencias de ácidos nucleicos naturales, modificadas, o recombinantes que codifican para el polipéptido PDE10A pueden ser ligadas a una secuencia heteróloga que causa la traducción de una proteína de fusión en cualquiera de los sistemas de huésped anteriormente mencionados. Por ejemplo, una proteína de PDE10A quimérica que contenga un resto heterólogo que pueda ser reconocido por un anticuerpo disponible en el comercio puede facilitar el rastreo de genotecas de péptidos para moduladores de actividad del polipéptido PDE10A. La proteína heteróloga y los restos del péptido también pueden facilitar la purificación de proteínas de fusión usando matrices de afinidad disponibles en el comercio. Tales restos incluyen, pero no están limitados, a glutationa S-transferasa (GST), proteína de unión de maltosa (MBP), tioredoxin (Trx), péptido de unión a calmodulina (CBP), 6-His, FLAG, c-myc, y hemaglutinina (HA). GST, MBP, Trx, CBP, y 6-His permiten la purificación de sus proteínas de fusión cognadas sobre glutationa inmovilizada, maltosa, óxido de fenilarsina, calmodulina, y resinas de quelato metálico, respectivamente. FLAG, c-myc, y hemaglutinina (HA) permiten la purificación por inmunoafinidad de proteínas de fusión usando anticuerpos monoclonales y policlonales disponibles en el comercio que reconocen específicamente estos marcadores de epítopo. Una proteína de fusión también puede ser genéticamente modificada para que contenga un sitio de división proteolítica localizado entre el polipéptido PDE10A que codifica la secuencia y la secuencia de la proteína heteróloga, de modo que el polipéptido PDE10A pueda ser dividido lejos del resto heterólogo después de la purificación. Los métodos para la expresión de proteínas de fusión y la purificación son discutidos en Ausubel (1995, supra, capítulo 10). Una variedad de kits disponibles en el comercio también puede usarse para facilitar la expresión y la purificación de proteínas de fusión.
En una realización más de la invención, la síntesis de PDE10A de rata radiomarcada puede ser lograda in vitro usando el sistema de lisado de reticulocito TNT de conejo o extracto de germen de trigo (Promega). Estos sistemas acoplan la transcripción y la traducción de secuencias que codifican para la proteína operativamente asociados con los promotores T7, T3, o SP6. La traducción ocurre en presencia de un aminoácido radiomarcado, por ejemplo, ^{35}S-metionina.
Los fragmentos de PDE10A de rata pueden ser producidos no sólo por medios recombinantes, sino que también por la síntesis directa del péptido usando técnicas en fase sólida (véase, por ejemplo, Creighton, supra, págs. 55-60). La síntesis de proteínas puede ser realizada por técnicas manuales o por la automatización. La síntesis automatizada puede ser lograda, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos ABI® 431A (Perkin-Elmer). Varios fragmentos de la PDE10A de rata pueden ser sintetizados separadamente y luego ser combinados para producir la molécula de longitud entera.
Sistemas de ácidos nucleicos
La presente invención proporciona además kits de detección de ácidos nucleicos, tales como sistemas o microsistemas de moléculas de ácidos nucleicos que están basados en la información de la secuencia proporcionada en la figura 1A.
Como se usa en este documento los sistemas o microsistemas se refieren a una serie de polinucleótidos distintos u oligonucleotidos sintetizados sobre un sustrato, tal como papel, nilón, u otro tipo de membrana, filtro, chip, portaobjetos, o cualquier otro soporte sólido adecuado. En una realización, el microsistema se prepara y se usa de acuerdo con métodos descritos en Chee et al., patente de EE.UU. Nº. 5.837.832, Chee et al., documento WO 95/11995, Lockhart et al., Nat. Biotech. 14: 1675-80, 1996, Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-19, 1996. Otros sistemas son producidos por los métodos descritos en Brown et al., patente de EE.UU. Nº. 5.807.522, y en Baldeschwieler et al., documento WO 95/25116.
Ejemplo 1 Modelo de expresión de PDE10A
Ha sido publicado previamente el mRNA de PDE10A dentro del cerebro en el cuerpo estriado, nucleus accumbens, y turbérculo olfativo (Lanfear y Robas, documento EP 0967284). Los experimentos siguientes confirmaron estas conclusiones y además caracterizaron la expresión de PDE10A en ratones y ratas.
Seccionamiento cerebral
Fueron recogidos cerebros de ratón y rata después de una decapitación rápida, fueron congelados en isopentano en hielo carbónico, y cortados en secciones de 20 \muM en un criostato de Hacker-Brigth (Hacker Instruments, Fairfield, N.J.). Las secciones de todos los niveles del cerebro de ratón y de rata fueron montadas por deshielo en portaobjetos antes de ser cubiertas con el reactivo Vectabond® (Vector Laboratories, Burlingame, California), fueron fijadas en una solución de paraformaldehído del 4%, deshidratadas en etanol, y almacenadas con desecante en recipientes herméticos a 4ºC hasta su uso.
Generación de la sonda de ARN mensajero
Fue insertado el ADN del plásmido que contenía un fragmento de 914 pares de bases aislado a partir de cDNA de PDE10A de ratón (correspondiente a los pares de bases 380-1294) en E. coli (DH5\alpha), que fue cultivada en un cultivo de suspensión. El ADN del plásmido fue extraído con un kit Maxi-prep Qiagen® (Qiagen, Valencia, California) y fue almacenado hasta su uso. Para la sonda antisentido, el plásmido fue linealizado con la endonucleasa de restricción XbaI. Para la sonda sentido, el plásmido fue linealizado con la enzima de restricción EcoR1. El ADN de plantilla entonces fue purificado usando un kit de PCR Qiaquick® (Qiagen) y fue transcrito y marcado con ^{33}P-UTP utilizando un kit de Maxiscript® (Ambion, Austin, Texas). La sonda antisentido fue generada con la polimerasa T7, y la sonda sentido con la polimerasa SP6. Las ribosondas marcadas finales se prepararon usando una columna G50 QuickSpin® (Novagen, Madison, Wis.), y fueron diluidas en tampón de hibridación comercial (Novagen).
Hibridación in situ
Las secciones cerebrales montadas en los portaobjetos fueron incubadas en proteinasa K (1 \mug/ml) durante 5 minutos, fueron aclaradas en agua sin RNasa, fueron suspendidas en trietilamina 0,1 M (TEA) a pH 8,0, y fueron acetiladas por la adición de anhídrido acético del 0,25% durante 5 minutos. Las sondas fueron aplicadas a las secciones montadas en los portaobjetos en un volumen de 10-25 \mul/sección que contenía ^{33}P (0,5-1 x 10^{6} cpm por sección). Como un control, un pequeño número de secciones de cerebro de ratón fueron pretratadas con RNasa (20 \mug/ml) antes de la hibridación. Las secciones fueron incubadas de la noche a la mañana en un ambiente húmedo a 50ºC, y luego fueron aclaradas en 2X SSC, fueron tratadas con RNasa A para destruir el ARN monocatenario, fueron lavadas en una serie de lavado estándar, y deshidratadas en una serie graduada de soluciones de etanol. Los cortes resultantes fueron colocados en una película \beta-max (Amersham, Piscataway, N.J.) en casetes de rayos X estándar, y fue expuesta durante 5-10 días.
Después de la exposición de la película, los cortes se sumergieron en una emulsión NTB-2 de Kodak® (Compañía Eastman Kodak, Rochester, Nueva York) diluida 1:1 con agua a 43ºC en condiciones protecctoras de la luz. Los cortes fueron secados al aire y fueron expuestos durante dos semanas a una oscuridad total durante el almacenaje a -20ºC. Los cortes fueron desarrollados en revelador D-19 de Kodak® y fijador de Kodak® a 19ºC. Los portaobjetos fueron contrateñidos con azul de toluidina del 1%, fueron deshidratados en alcohol, y cubridos.
Anticuerpo específico de PDE10A
Un anticuerpo dirigido contra el polipéptido PDE10A de rata fue generado para estudios de inmunocitoquímica. La secuencia de PDE10A de rata de cadena entera (figura 1B, SEQ ID NO: 2) con un marcaje del extremo His fue expresada en células de insecto Sf9 de acuerdo con los métodos anteriormente mencionados (Fawcett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702-07, 2000). Una purificación en tres etapas usando cromatografía Ni-NTA, intercambio de tampón, y cromatografía de intercambio aniónico proporcionó un producto final que era 95% puro, tenía la masa apropiada predicha de 97 Kd como se determina por espectrometría de masas, y tenía actividad de hidrólisis con cGMP. La PDE10A purificada fue usada para inmunizar ratones y se prepararon hibridomas clonales usando protocolos estándar. Un anticuerpo denominado 24F3. F11 fue escogido para el uso.
La afinidad del anticuerpo monoclonal 24F3. F11 para PDE10A de humano y rata fue analizado usando lisados de células de una línea celular de Sf9 que expresó PDE10A humano y una línea celular Sf9 que expresó PDE10A de rata. El anticuerpo monoclonal 24F3. F11 reconoce a PDE10A recombinante de rata y humano. Los lisados de las células recombinantes, así como el control de las células Sf9, fueron sometidos a electrofóresis de gel. Las manchas del gel fueron incubadas después con el anticuerpo 24F3. F11, y fue determinada la unión del anticuerpo 24F3. F11 a las manchas. No fue observada inmunorreactividad de PDE10A en la columna que contenía los lisados de células Sf9 que no expresan la proteína recombinante.
La especificidad del anticuerpo 24F3. F11 para PDE10A fue comparada con las de las PDE de las otras diez familias del gen de PDE. El anticuerpo 24F3. F11 no tuvo reacciones cruzadas con ninguna otra PDE.
Inmunocitoquímica e inmunotransferencia "Western Blot"
La expresión de PDE10A en diferentes regiones de cerebro de rata fue determinada por inmunotransferencia "Western Blot" con el anticuerpo 24F3. F11 y por inmunocitoquímica. Para los análisis de inmunotransferencia "Western Blot", las ratas fueron sacrificadas por decapitación y los cerebros fueron retirados rápidamente y enfriados en hielo. Las diferentes regiones cerebrales fueron identificadas y microdisecadas usando técnicas estándar. Las secciones cerebrales fueron homogeneizadas en 10 volúmenes de tampón (NaCl 250 mM, Tris HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 5 mM, NP-40 del 0,1%) en un homogeneizador de vidrio/vidrio. Los lisados fueron centrifugados a 4000 revoluciones por minuto (Eppendorf, Hamburgo, Alemania, modelo 5417R) y los sobrenadantes fueron sometidos a análisis por inmunotransferencia "Western Blot" usando protocolos estándar.
Para la inmunocitoquímica, los cerebros de rata fueron fijados por inmersión en formalina tamponada del 10% (pH 7,0) durante 24 horas y luego fueron embebidos en parafina. Secciones (6 \muM) fueron desparafinadas e hidratadas en agua destilada. Los epítopos enmascarados fueron recuperados usando tampón de citrato (pH 6) calentado a 96ºC durante 20 minutos. Las secciones fueron incubadas a temperatura ambiente con el anticuerpo 24F3. F11 (1,2 \mug/ml) durante 60 minutos. Como controles, fueron incubados en paralelo sobre secciones de replicado un anticuerpo control del isotipo de IgG1 y el anticuerpo 24F3. F11 preabsorbido con una concentración saturante (como se determina por inmunotransferencia) de PDE10A. La tinción positiva fue detectada usando el complejo avidin-biotin-HRP y fue visualizada con diaminobenzidina (DAB). Ningún producto de reacción fue observado en los controles de IgG1 y F11 preabsorbido.
Localización del mRNA de PDE10A
Las autoradiografías de las secciones de cerebro de ratón marcadas antisentido de PDE10A mostraron una señal de hibridación altamente específica. El marcaje denso fue encontrado en sólo tres áreas; cuerpo estriado dorsal (caudado y hueso), cuerpo estriado ventral (nucleus accumbens), y tubérculo olfativo. Dentro del cuerpo estriado y nucleus accumbens, el mRNA de PDE10A fue expresado altamente en neuronas espinosas medias del estriado, que representan aproximadamente el 95% de todas las neuronas encontradas en estas estructuras. Una densidad inferior de marcaje fue notada en las capas del cuerpo detentado y capas CA del hipocampo y en la capa de células granulares del cerebelo. Ninguna diferencia significativa fue observada en el modelo de marcaje en el cerebro de rata en relación con el de ratón.
El marcaje de PDE10A in situ fue específico. Las secciones del cerebro de ratón pretratadas con RNAsa A antes de la hibridación no tenían ninguna incorporación visible de marcaje.
Había una correspondencia muy buena entre las áreas de localización del mRNA de PDE10A y aquellas áreas clásicamente asociadas con la alta expresión del receptor de dopamina. Esta semejanza además fue apoyada por autoradiografías de emulsión, que permiten la localización subcelular y una mayor resolución en relación con la autoradiografía de películas. La incorporación densa de granos de plata fue notada en todas las partes del cuerpo estriado, nucleus accumbens, y tubérculo olfativo, y fue notado que cubría la basta mayoría de los enormes cuerpos de células neuronales en estas tres áreas. Además, las áreas que expresan bajos niveles pero mensurables de receptores de dopamina también mostraron una deposición de grano, en basta correspondencia con su densidad de receptor de DA relativa. Estos incluyeron notablemente las cortezas media y sulcal prefrontal, así como el cuerpo detentado y las capas de CA del hipocampo. Sin embargo, ninguna acumulación de grano fue vista en la pars reticulata de la sustancia negra, una zona de expresión del receptor de dopamina D1 densa.
Localización de proteína PDE10A
Compatible con los niveles de mRNA, un nivel alto de la proteína PDE10A fue demostrado en el cuerpo estriado (caudado y putamen), nucleus accumbens, y tubérculo olfativo. La proteína PDE10A fue observada en los cuerpos de células neuronales y en todas las partes del neurópilo. Además, un nivel alto de proteína PDE10A, pero no mRNA de PDE10A, fue observado en las regiones cerebrales que proyentan a las neuronas espinosas medias del estriado, incluyendo la cápsula interna, globus pallidus, núcleo entopeduncular, y sustancia negra. Considerando la ausencia de mRNA de PDE10A en estas regiones, el nivel alto de proteína de PDE10A debe provenir de los axones y los terminales de las neuronas espinosas medias del estriado.
Ejemplo 2 Rastreo in vitro para moduladores selectivos de PDE10A
Fue identificada papaverina analizandola in vitro como un inhibidor selectivo de PDE10A. La papaverina fue analizada por su capacidad de inhibir a PDE10A comparado con las PDE de otras familias génicas. Las PDE 2, 3, y 5 humanas fueron aisladas del cuerpo cavernoso, fue aislada PDE1 humana a partir del ventrículo cardíaco, y la PDE4 humana fue aislada a partir del músculo esquelético (Boolell et al., Int. J. Impotence Research 8: 7-52, 1996). Fueron generadas fosfodiesterasas 7-11 de clones recombinantes de longitud completa transfectados en células SF9 como se describe antes (Fisher et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 246: 570-577, 1998; Fisher et al., J. Biol. Chem. 273: 15559-15564, 1998b; Soderling et al., PNAS 96: 7071-7076, 1999; Fawcett et al., PNAS 97: 3702-3707, 2000). Las enzimas fueron purificadas por FPLC a partir de la fracción soluble de los lisados de células como se describe en Boolell et al., supra.
La actividad de PDE fue medida usando un método basado en SPA como se describe antes (Fawcett et al., 2000). Los ensayos fueron llevados a cabo usando una cantidad fija de enzima de PDE10A en presencia de concentraciones de inhibidor variables. Los sustratos de nucleótido cíclico (cGMP o cAMP en una relación 3:1 de no marcados frente a ^{3}H-marcados) usados en los ensayos fueron 1/3 de la concentración de Km, permitiendo las comparaciones en los valores de IC_{50} del inhibidor para las diferentes PDE. El volumen del ensayo final fue ajustado a 100 \mul con tampón de ensayo (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 5 mM, albúmina de suero bovino 1 mg/ml).
Las reacciones fueron iniciadas con la adición de enzima. Las muestras fueron incubadas durante 30-60 minutos a 30ºC para dar < 30% de recambio de sustrato y fueron terminadas con perlas de SPA de silicato de itrio de 50 \mul (Amersham) que contenían 3 mM del nucleótido cíclico apropiado no marcado. Las placas fueron reselladas y agitadas durante 20 minutos; después se permitió a las perlas sedimentarse durante 30 minutos en la oscuridad y luego fueron contadas en un lector de placas TopCount (Packard, Meriden, Conn.). Las unidades de radiactividad fueron convertidas a porcentaje de actividad comparando con un control sin inhibición (100%). Los valores de IC_{50} fueron obtenidos usando la aplicación de Microsoft Excel de ajuste de curva.
La papaverina fue identificada como un inhibidor competitivo de PDE10A, con un valor de IC_{50} de 17 nM. La papaverina era bastante menos potente contra todas las otras PDE analizadas (Tabla 1), demostrando la selectividad con PDE10A.
TABLA 1 Inhibición de papaverina de varias familias génicas de PDE
Isozima IC_{50} (\muM) Selectividad
PDE10A 0,018 1,0
PDE1 37 2.055
PDE2 9 500
PDE3A 1,3 72
PDE4A 1,9 105
PDE4B 1,4 78
PDE4C 0,8 44
PDE4D 0,32 18
PDE5 8 444
PDE7 27 1.500
PDE8A 10 555
PDE9 400 20.000
PDE11 11 611 
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Ejemplo 3 Neuronas espinosas medias del estriado primarias - Efectos de la papaverina
Considerando la especificidad de la papaverina para inhibir PDE10A, fue administrada papaverina a neuronas espinosas medias del estriado primarias cultivadas para determinar si la inhibición de PDE10A selectiva tenía un efecto único sobre el metabolismo del nucleótido cíclico en estas células. Los efectos de la papaverina fueron comparados con los efectos que son el resultado de la administración de otros inhibidores de PDE, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), rolipram, y zaprinast (todos inhibidores de PDE disponibles en Sigma, San Louis, Mo.).
Los cultivos del cuerpo estriado se prepararon como se describe antes (Ventimiglia et al., Eur. J. Neurosci. 7: 213-222, 1995). Brevemente, fueron disecados los cuerpo estriados (núcleo caudado y putamen) de ratas E17, fueron disociados para producir una suspensión de células solas, y colados en placas a una densidad de 5 x 10^{4} neuronas/pocillo en placas de 96 pocillos revestidas de poli-L-ornitina/laminina (Nº. de cat. 354657, BD Biosciences, Bedford, MA). Las células fueron colocadas en placas en medio Neurobasal (Nº. de cat. 21103-049, Gibco BRL, Grand Island, Nueva York) con suplementos B27 (Nº. de cat. 17504-010, Gibco BRL) y factor neurotrófico derivado de cerebro recombinante humano por (BDNF) (100 ng/ml) (Nº. de cat. 248-BD, R & D Systems, Minneapolis, Minn.). Las neuronas espinosas medias del cuerpo estriado comprendian el 50-60% de células en estos cultivos, como se confirma por un protocolo de inmunorreactividad de GABA como se ha descrito antes (Ventimiglia et al., 1995, supra). El ensayo de protección de la RNasa confirmó la expresión de mRNA de PDE10A en estos cultivos, como se describe además debajo.
Después de aproximadamente cuatro días in vitro, las células del cuerpo estriado fueron lavadas con una solución salina tamponada de fosfato sin Ca^{2+}/Mg^{2+} (pH 7,4) y fueron preincubadas durante una hora en un tampón que contenía una solución salina tamponada de fosfato sin Ca^{2+}/Mg^{2+}, HEPES 30 mM (pH 7,4), CaCl_{2} 1 mM, dextrosa 1 mg/ml, y MgCl_{2} 5 mM. Las células del cuerpo estriado fueron expuestas después a uno de los inhibidores de PDE y fueron incubadas durante 20 minutos a 37ºC. Cuando se medía cGMP, las neuronas fueron estimuladas con nitroprusida de sodio (SNP) (100 \muM) durante dos minutos después de 20 minutos de incubación con el inhibidor de PDE. Cuando se medía cAMP, las neuronas fueron estimuladas con forskolina (1 \muM) para una duración de incubación de inhibidor de 20 minutos. Estas concentraciones de SNP y forskolina fueron escogidas como las concentraciones submáximas que produjeron aproximadamente el 20-25% de la respuesta máxima (SNP 1000 \muM y forskolina 10 \muM produjeron aumentos máximos de cGMP y cAMP, respectivamente).
Los sistemas SPA de cGMP y cAMP (código Amersham RPA 540 y RPA 559, respectivamente) fueron usados para detectar las concentraciones de cGMP y cAMP respectivas en el lisado de células. Las células fueron lisadas utilizando una combinación de tampón de ensayo de rastreo directo de SPA 9:1 (acetato 0,05 M con azida de sodio del 0,01%) y tampón A (bromuro de dodeciltrimetilamonio 133 mg/ml), y los lisados fueron congelados en hielo carbónico.
En las células no estimuladas por SNP o forskolina, la papaverina no afectó a los niveles de cAMP o cGMP en los cultivos del cuerpo estriado. En ausencia de un inhibidor de PDE, las concentraciones submáximas de forskolina (1 \muM) y SNP (100 \muM) causaron un aumento de 2-3 veces sobre los cAMP y cGMP de base. La papaverina causó un aumento dependiente en la concentración de la acumulación de cGMP inducida por SNP con un valor de EC_{200} (concentración del inhibidor que proporciona un aumento de 2 veces) de 11,7 \muM (Tabla 2). Un efecto máximo fue observado con papaverina 100 \muM; los niveles de cGMP fueron elevados 5 veces en los cultivos estimulados con SNP solo. La papaverina también causó un aumento de la acumulación de cAMP en los cultivos estimulados por forskolina con una EC_{200} de 38,3 (Tabla 2). Así, la papaverina era 3,3 veces menos potente en la promoción de un aumento de cAMP que cGMP, como se determina por la relación de EC_{200} de cGMP/EC_{200} de cAMP (Tabla 2).
En contraste, IBMX, un inhibidor de PDE no selectivo, causó (en el intervalo de 3-100 \muM) un aumento dependiente de la concentración tanto para la acumulación de cGMP como de cAMP en cultivos estimulados por SNP como de forskolina con valores de EC_{200} de 19 y 30 \muM, respectivamente. El inhibidor selectivo de PDE4 rolipram aumentó la acumulación de cAMP estimulada por forskolina con un valor de EC_{200} de 2,5 \muM y requirió concentraciones 10 veces más altas para doblar la velocidad de acumulación de cGMP. Zaprinast, un inhibidor de las PDE que prefieren cGMP, dobló los niveles de cAMP en estas neuronas a una concentración de 98 \muM. Sin embargo, 100 \muM de este compuesto no dobló realmente exactamente el nivel de cGMP. Se muestran las comparaciones de las relaciones de EC_{200} de cGMP/EC_{200} de cAMP para cada inhibidor de PDE en la Tabla 2 y se demuestra que los inhibidores selectivos de PDE10A (como se representa por papaverina) tienen un efecto único sobre la regulación de nucleótido cíclico en neuronas espinosas medias del estriado.
TABLA 2 Comparación de inhibidores de PDE
inhibidor de PDE EC_{200} de cGMP EC_{200} de cAMP EC_{200} de cGMP/EC_{200} de cAMP
\muM \pm SEM (n) \muM \pm SEM (n)
Papaverina 11,7 \pm 8,2 (4) 38,3 \pm 11,4 (4) 3,3
Rolipram 29,2 \pm 10,3 (3) 2,5 \pm 2,0 (3) 0,09
Zaprinast 98,3 \pm 10,3 (3) 100 (3) 1
IBMX 19,5 (1) 30,2 (2) 1,5
Ensayo de protección de RNasa
El ARN fue preparado a partir de un cultivo primario de neuronas espinosas medias del estriado de rata por centrifugación a 150.000 x g a 20ºC durante 21 horas por un gradiente de cloruro de cesio 5,7 M como se describe antes (Iredale Pa., et al., Mol. Pharmacol. 50: 1103-1110, 1996). El pelet de ARN fue resuspendido en acetato de sodio 0,3 M, pH 5,2, y fue precipitado en etanol. La concentración de ARN fue determinada por espectrofotometría. Una ribosonda de PDE10A fue preparada por amplificación por PCR de un fragmento de 914 bp aislado de cDNA de ratón (correspondiente a las pares de bases 380-1294 de la Genoteca AF110507). Este fragmento entonces fue clonado después en pGEM3Zf. El vector fue linealizado y fue usada la ARN polimerasa T7 para sintetizar la ribosonda antisentido ^{32}P-marcada.
El ensayo de protección de RNase fue realizado usando el kit de RPAII (Ambion). Brevemente, 5 \mug del total del ARN celular fue hibridado con una ribosonda de PDE10A ^{32}P-marcada (aproximadamente 105 cpm/muestra) de la noche a la mañana a 42ºC. Al día siguiente las muestras fueron incubadas con RNasa A y T1 durante 30 minutos a 37ºC y los fragmentos de ARN bicatenarios protegidos fueron precipitados después y corridos en un gel de poliacrilamida del 6% que contenía urea. Los resultados de este ensayo confirmaron que el mRNA de PDE10A estaba presente en un nivel alto en el cultivo primario de neuronas espinosas medias del estriado.
Ejemplo 4 Clonación y secuenciación de PDE10A de rata
La secuencia que codifica para la proteína de PDE10A humano (Genoteca AB020593) fue usada para buscar un subconjunto seleccionado de la base de datos "National Center for Biotechnology Information" (NCBI) "Expressed Sequence Tag" (EST) que contenía los EST no humanos utilizando la herramienta "Basic Local Alignment Search Tool" (BLAST) (Altshul et al., J. Mol. Bio. 215, 403-410, 1990). La secuencia de aminoácidos predicha por un EST de rata (H32734) era homóloga a una parte interna de la proteína humana. Además, la secuencia de ácidos nucleicos de este EST era altamente homóloga a la de PDE10A de ratón (Genoteca AF110507). Los inventores usamos esta información de EST más las técnicas de "Rapid Amplification of cDNA Ends" (RACE) para identificar la secuencia de 5' y 3' auténtica a partir del ARN de cerebro de rata, que fue usado después para aislar un cDNA de PDE10A de rata completo.
El 5' RACE fue realizado usando los kit de 5' RACE (Gibco/BRL) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La primera hebra de cDNA fue generada usando el iniciador 1358 3' específico del gen (Tabla 3), 1 \mug del ARN total de cerebro de rata Sprague-Dawley, y la transcriptasa inversa Superscript® II (Gibco/BRL). El primero ciclo de la PCR fue llevado a cabo usando el iniciador 1357 específico del gen 3' anidado (Tabla 3) y el iniciador adaptador de 5' (el iniciador "Abridged Anchor Primer" (AAP)) del kit. Las condiciones de ciclación incluyeron una desnaturación inicial de 2 minutos a 94ºC seguido de una desnaturación de 35 ciclos a 94ºC durante 45 s, un templado a 54ºC durante 30 s, una extensión de 72ºC durante 3 minutos, más una extensión final de 10 minutos a 72ºC (Robocycler (R), Stratagene, La Jolla, California).
El producto de la PCR del primer ciclo (1 \mul) fue usado como plantilla en un segundo ciclo de la PCR utilizando las condiciones de ciclación anteriores, con el iniciador 1356 específico del gen anidado (Tabla 3) y el iniciador adaptador 5' (iniciador "Abridged Universal Amplification Primer" (AUAP)) del kit. Seis productos de la PCR separados fueron identificados por electrofóresis en geles de agarosa del 1,2%. Estas bandas fueron aisladas individualmente usando un kit de extracción de gel (Qiagen, Valencia, California), fueron clonadas en TOPO de pCR4 (Invitrogen, Carlsbad, California) y fueron transfectadas en células TOP10 (Invitrogen). Las colonias fueron seleccionadas por PCR con los iniciadores específicos del vector 1369 y 1370 (Tabla 3) como los descritos anteriormente y fueron secuenciados clones positivos múltiples de cada banda.
Todas las secuencias fueron alineadas para producir una secuencia acorde al extremo 5' de PDE10A de rata. La 3' RACE fue realizada usando un kit de 3' RACE (Gibco/BRL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La primera hebra de cDNA fue generada a partir de 2 \mug del ARN total de cerebro de rata usando el iniciador adaptador de 3' (AP) y la transcriptasa inversa Superscript® II. El primer ciclo de la PCR fue llevado a cabo usando el iniciador 1375 5' específico del gen (Tabla 3) y el 3' AP del kit. Las condiciones de ciclación fueron como las descritas anteriormente. El producto de la PCR del primer ciclo (1 \mul) fue usado como plantilla en un segundo ciclo de PCR, usando las mismas condiciones de ciclación, con el iniciador 1376 anidado (Tabla 3) y 3' AUAP. Cuatro productos de la PCR discretos del tamaño esperado aproximado fueron identificados por electrofóresis en geles de agarosa del 1,2%. Estas bandas fueron aisladas y subclonadas y las colonias fueron rastreadas como anteriormente. Los clones positivos fueron identificados a partir de un producto de la PCR. Las secuencias de seis de estos clones fueron alineadas para producir una secuencia acorde con el extremo 3' de PDE10A de rata.
Para aislar el cDNA de PDE10A de rata de longitud completa, la primera cadena de cDNA fue generada por triplicado a partir del ARN de cerebro de rata total usando el Sistema Superscript® (Gibco/BRL). El iniciador 1380 5' y el iniciador 1407 3' (Tabla 3) fueron diseñados a partir de la información de la secuencia 5' y 3' de rata generada anteriormente y modificada genéticamente para incluir los sitios de restricción SalI flanqueantes para facilitar la clonación. La PCR fue realizada usando una Sistema de Alta Fidelidad PCR (Boehringer Mannheim (Roche), Basilea, Suiza). Las condiciones de ciclación eran una desnaturación inicial de 2 minutos a 94ºC, seguido de 4 ciclos de desnaturación de 94ºC durante 45 s, un templado de 48ºC durante 30 s, una extensión de 72ºC durante 3,5 minutos, después 30 ciclos de desnaturación de 94ºC durante 45 s, un templado de 55ºC durante 30 s, una extensión de 72ºC durante 3,5 minutos, más una extensión final de 10 minutos a 72ºC (Robocycler (R), Stratagene). Las reacciones de la PCR separadas fueron llevadas a cabo para cada una de las tres plantillas de cDNA de la primera cadena.
Una banda de aproximadamente 2,3 kb de cada reacción PCR fue aislada por gel usando un kit de extracción de gel (Qiagen, Valencia, California) y fue ligada en Blunt PCR (Invitrogen) y fue transformada como anteriormente. Los clones correctos fueron identificados por PCR colonia utilizando los iniciadores específicos 1385 y 1386 de PDE10 de rata (Tabla 3) y la digestión de restricción SalI. Múltiples clones de cada reacción PCR por transcripción inversa separada fueron secuenciados, y todas las secuencias fueron alineadas para determinar un consenso. Fueron identificados y secuenciados dos clones libres erroneos (pNB1426 y pNB1427). Se muestran la secuencia del polinucleótido (SEQ ID NO: 1) y la secuencia del aminoácido predicha (SEQ ID NO: 2) para PDE10A de rata en la figura 1A y la figura 1B, respectivamente.
TABLA 3 Secuencias del iniciador para clonar PDE10A de rata
INICIADOR SECUENCIA (5'-3')
1317 CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG (SEQ ID NO: 3)
1318 AGCGGATAACAATTTCACACAGG (SEQ ID NO: 4)
1356 GTACAGCTCCTTGTTCTTGTGG (SEQ ID NO: 5)
1357 CCAGCAATCCCTTTCTCAATGG (SEQ ID NO: 6)
1358 GTAGGCATCAGGAATGTTCAGG (SEQ ID NO: 7)
1369 TATGACCATGATTACGCCAAGC (SEQ ID NO: 8)
1370 GTTGTAAAACGACGGCCAGTG (SEQ ID NO: 9)
1375 TAGCAATACACCAGGTGCAGG (SEQ ID NO: 10)
1376 CAGACCGAACTGAATGACTTCC (SEQ ID NO: 11)
1380 TGTCGACTATAAATATGTCTGGTTTGACGGATG (SEQ ID NO: 12)
1385 GGAATGAAGGAAGGTCAACC (SEQ ID NO: 13)
1386 GCTGTCAATTTTGTAACTGG (SEQ ID NO: 14)
1407 AGTCGACGTCATCGACCTTCCTGGTC (SEQ ID NO: 15)
<110> Pfizer Products Inc.
\hskip1cm
James, Larry C. 
\hskip1cm
Lebel, Lorraine A. 
\hskip1cm
Menniti, Frank S. 
\hskip1cm
Strick, Christine A. 
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<120> Ensayo celular de PDE10 y secuencias
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> PC23111ANIS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/308,978
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-07-31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 3219
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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1
2
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 773
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<212> PRT
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<213> Rattus norvegicus 
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<400> 2
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4
5
6
7 
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus 
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<400> 3
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cccagtcacg acgttgtaaa acg 
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23 
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<210> 4
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus 
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agcggataac aatttcacac agg 
\hfill
23 
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus 
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gtacagctcc ttgttcttgt gg 
\hfill
22 
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<210> 6
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<212> DNA
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ccagcaatcc ctttctcaat gg 
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22 
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tatgaccatg attacgccaa gc 
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gttgtaaaac gacggccagt g 
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21 
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<212> DNA
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tagcataca ccaggtgcag g 
\hfill
21 
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus 
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cagaccgaac tgaatgactt cc 
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22 
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<400> 12
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tgtcgactaatt aaatatgtct ggtttgacgg atg 
\hfill
33 
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus 
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ggaatgaagg aaggtcaacc 
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20 
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<211> 20
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<213> Rattus norvegicus 
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<400> 14
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20 
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus 
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<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskip
agtcgacgtc atcgaccttc ctggtc 
\hfill
26

Claims (14)

1. Un método para rastrear un agente que inhiba la actividad de fosfodiesterasa 10A intracelular, comprendiendo dicho método:
i) administrar el agente a neuronas espinosas medias del estriado y activar de modo submáximo a la adenilato ciclasa;
ii) administrar el agente a neuronas espinosas medias del estriado y activar de modo submáximo a la guanilato ciclasa;
iii) medir la generación de cAMP en las células de la etapa (i) y la generación de cGMP en las células de la etapa (ii);
iv) calcular la EC_{200} de cAMP para la etapa (i) y la EC_{200} de cGMP para la etapa (ii);
en el que el agente se identifica como un inhibidor de PDE10A si la relación de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP es comparable a la relación producida por la administración de papaverina en las mismas condiciones de ensayo.
2. El método de la reivindicación 1, en el que dichas neuronas espinosas medias del estriado se preparan como neuronas de un cultivo primario.
3. El método de la reivindicación 2, en el que la adenilato ciclasa se activa por forskolina, la guanilato ciclasa se activa por nitroprusida de sodio, y la relación de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP está en el intervalo de 1,75-5,25.
4. El método de la reivindicación 3, en el que dicha relación de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP está en el intervalo de de 3,0-4,0.
5. El método de la reivindicación 1, en el que la concentración de cAMP y cGMP se mide por un ensayo de proximidad por centelleo.
6. El método de la reivindicación 1, en el que, antes de las etapas (i) y (ii), dicho agente se identifica in vitro como un inhibidor selectivo de PDE10A.
7. El método de la reivindicación 1, en el que dicho agente se identifica además como un inhibidor selectivo de PDE10A por un ensayo in vitro.
8. El método de la reivindicación 1, en el que las neuronas de las etapas (i) y (ii) están en muestras separadas.
9. Un polipéptido aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
10. Un polinucleótido aislado o purificado que comprende:
i) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para el polipéptido de la SEQ ID NO: 2;
ii) la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1.
11. Un vector que comprende un polinucleótido de la reivindicación 10.
12. Una célula huésped transformada con un vector de la reivindicación 11 y que expresa un polinucleótido de la reivindicación 10.
13. Un método para identificar a un agente que modula la actividad de PDE10A, comprendiendo dicho método poner en contacto dicho agente con un polipéptido PDE10A que comprende SEQ ID NO: 2 y medir la actividad de dicho polipéptido PDE10A, en el que una diferencia entre dicha actividad del polipéptido PDE10A en presencia del agente y en ausencia del agente es indicativa de que el agente modula dicha actividad.
14. Un método para identificar a un agente que modula la actividad de PDE10A, comprendiendo dicho método poner en contacto dicho agente con una célula huésped de la reivindicación 12 y medir la actividad de dicho polipéptido PDE10A, en el que una diferencia entre dicha actividad del polipéptido PDE10A en presencia del agente y en ausencia del agente es indicativa de que el agente modula dicha actividad.
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