ES2254745T3 - Sustratos cromogenos enzimaticos y metodo para la deteccion de actividad de beta-d-ribofuranosidasa. - Google Patents
Sustratos cromogenos enzimaticos y metodo para la deteccion de actividad de beta-d-ribofuranosidasa.Info
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Abstract
â-D-ribofuranósido de indoxilo de fórmula II en la que R1-4 son independientemente H, haluro, nitro o grupos alquilo C1-6 y R5 es H, alquilo C1-6 o aralquilo o un derivado sustituido del â-D-ribofuranósido de indoxilo.
Description
Sustratos cromógenos enzimáticos y método para la
detección de actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa.
La presente invención se refiere a sustratos
cromógenos enzimáticos.
Los sustratos enzimáticos indicadores comprenden
una parte escindible por enzima (p. ej., un monosacarilo) y una
parte que forma un indicador detectable en la escisión (p. ej. un
grupo cromógeno o fluorógeno). Se conocen un gran número de
sustratos enzimáticos basados en glucósidos y se utilizan
extensamente en microbiología, biología molecular y otros campos.
Se han sintetizado y utilizado con fines de detección glucósidos de
carbohidratos muy diferentes. Las enzimas detectadas por estos
glucósidos son con frecuencia grupos específicos (es decir,
presentan especificidad relativamente pequeña hacia una parte del
sustrato sobre el que actúan) y por consiguiente pueden tolerarse
una amplia variedad de aglucones (es decir partes de indicador). Por
esta razón, en el caso de la \beta-galactosidasa
se han utilizado \beta-galactósidos muy diferentes
en la detección de la misma. Los ejemplos incluyen
\beta-D-galactósidos de
o-nitrofenilo, p-nitrofenilo,
indoxilos
(5-bromo-4-cloro-3-indolilo
y
6-cloro-3-indolilo),
4-metilumbeliferilo, 2-naftilo,
6-bromo-2-naftilo,
ciclohexenoesculetino (CHE), alizarina,
naftol-ASBI- y
fenil-\beta-D-galactósidos.
Los glucósidos que contienen grupos de ácido glucurónico, glucosa,
galactosa, manosa, mucosa, arabinosa,
N-acetilglucosamina,
N-acetilgalactosamina, ácido siálico, xilosa y
carbohidrato de celobiosa están entre los que se encuentran más
frecuentemente en aplicaciones de sustratos enzimáticos. Muchos de
éstos, tal como los
\beta-D-glucurónidos, \alpha- y
\beta-D-galactopiranósidos y
\alpha- y
\beta-D-glucopiranósidos han
encontrado uso extendido en la identificación y enumeración de
bacterias en áreas tales como la clínica, alimentación, veterinaria,
medio ambiente y microbiología del agua. En el momento presente
existen numerosos medios comerciales y kits de ensayo disponibles
que contienen sustratos enzimáticos, que muestran la presencia de
bacterias, levaduras y otros microorganismos mediante la generación
de colonias o soluciones coloreadas.
El documento
WO-A-03/035897 que comparte la misma
fecha de prioridad con la presente solicitud, describe la síntesis
de determinados derivados de
\beta-D-ribofuranósido como
sustratos cromógenos para la detección de la actividad del
\beta-D-ribofuranósido mediante la
generación de precipitados insolubles coloreados que se forman a
partir de la parte de aglucón tras la escisión enzimática. La
actividad de la
\beta-D-ribofuranosidasa es una
actividad enzimática capaz de escindir los grupos
\beta-D-ribofuranosilo. El
documento WO-A-03/035897 ilustra la
utilidad de detectar la actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa en la
microbiología de diagnóstico. Una característica de muchas de las
moléculas ejemplificadas descritas en el documento
WO-A-03/035897 consiste en que los
aglucones son derivados del catecol. Estos sustratos pueden ser
utilizados convenientemente en medio sólido tal como los medios a
base de agar-agar. Mediante la inclusión de una sal
de hierro tal como el citrato férrico amónico en el medio, estos
sustratos producen precipitados insolubles marrones o negros que
indican claramente la zona de actividad enzimática. Esto es útil
para distinguir microbios u otras entidades que poseen actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa de los
que no la poseen. Una ventaja del precipitado marrón oscuro muy
intenso o negro producido por sustratos tal como la
3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido
cuando se utiliza en concentraciones adecuadas para diagnóstico es
que puede enmascarar el color producido por otro sustrato cromógeno
incorporado en el mismo medio para la detección de una actividad
enzimática diferente. Los expertos en la materia pueden apreciar
fácilmente que en determinadas circunstancias esto es un
inconveniente cuando se trata de desarrollar medios de diagnóstico
útiles que dependen de la observación de otras actividades
enzimáticas además de la actividad de la
\beta-D-ribofuranosidasa y
simultáneamente
con ella.
con ella.
Se ha publicado que los glucósidos de indoxilo de
varios monosacáridos están disponibles con facilidad en el mercado.
Por ejemplo el documento
WO-A-99/50438 describe varios
glucósidos de indoxilo incluyendo los glucósidos de
N-metil-indoxilo. Los glucósidos de
indoxilo están muy probados como sustratos enzimáticos cromógenos y
han hallado amplia aplicación en microbiología de diagnóstico
incluyendo su utilización en medios sólidos [M. Manafi, Int. J.
Food Microbiol., 31, 45, (1996)]. Estos sustratos producen
precipitados coloreados insolubles tras la escisión enzimática. El
precipitado coloreado procede principalmente de dos moléculas de
aglucón, indoxilo escindidas que se combinan mediante un proceso
oxidativo para formar un colorante de índigo [S. Cotson y S. J.
Holt, Proc. Roy. Soc. 8, 148, 506, (1958)].
Aunque los colores exactos observados de los
precipitados insolubles pueden variar ligeramente dependiendo de
las condiciones exactas en las que se producen y pueden estar
influenciados, por ejemplo, por otros componentes presentes en los
medios, el color del precipitado proporcionado por los grupos
indoxilo principales normalmente utilizados en microbiología de
diagnóstico puede describirse aproximadamente de la manera
siguiente:
| Indoxilo | Color |
| 5-bromo-4-cloroindoxilo | Verde |
| 5-bromo indoxilo | Azul oscuro |
| indoxilo | Azul |
| 5-bromo-6-cloroindoxilo | Magenta |
| 6-cloroindoxilo | Rosa |
Escogiendo los colores de estos precipitados que
están contrastando suficientemente, es posible diseñar medios de
diagnóstico que detecten dos actividades enzimáticas simultáneamente
utilizando dos o más sustratos de indoxilo diferentes en los que
tanto el indoxilo como el carbohidrato o los grupos escindibles por
la enzima son diferentes en cada sustrato. Los medios de esta
naturaleza han sido descritos [J. N. Roth y W. J. Ferguson,
US-A-5.210.022 (1993); D. G. Flowers
y M. Sternfeld, US-A-5.364.767
(1994)]. Una particularidad de interés de los medios que contienen
sustratos de indoxilo diferentes es que pueden formarse
combinaciones de colores cuando dos de los buscados una vez están
presentes las actividades enzimáticas en la misma entidad, y esto
puede ayudar a conseguir un sistema de detección no selectivo para
los microbios en investigación.
La técnica anterior contiene varios ejemplos de
la síntesis química de glucósidos de. indoxilo Todos estos ejemplos
descritos emplean haluros de azúcar peracilados como el donante de
glucosilo, en el caso de los glucurónidos, el bromuro de metil
triacetilglucuronilo equivalente [K. Yoshida et al., Anal.
Biochem., 58, 77, (1974); K. Yoshida et al.,
Chem. Pharm. Bull., 32, 1759 (1975); A. N. Ley et
al., Can. J. Microbiol. 34, 690, (1988); S. Wolfe
y R. J. Bowers, EP-A-0284725A2,
(1988)]. El receptor de glucosilo es un derivado de
1-acetilindoxilo de fórmula general (I) o, en un
ejemplo,
3-acetil-5-bromo-4-cloroindoxilo
(1) V^{1-3}= H o
halógeno, V^{4}= H o
CO_{2}Me
\vskip1.000000\baselineskip
La mayoría de estos métodos están basados en
glucosilaciones estimuladas y por consiguiente pueden considerarse
que pertenecen a la glucosilación clásica de tipo Michael (reacción
en alcohol) o su variación desarrollada por Mannich (reacción en
acetona/agua). El primer análisis de un glucósido de indoxilo,
\beta-D-glucopiranósido de
indoxilo (indicán vegetal) fue descrito por Robertson en 1927 [A.
Robertson, J. Chem. Soc., 1937, (1927)] utilizando las
condiciones del tipo Mannich. Él logró condensar el
1-acetilindoxilo (I, V = H) con acetobromoglucosa
mediante la utilización de hidróxido de potasio en acetona acuosa
para preparar el producto intermedio glucósido de indoxilo
peracetilado. La desacetilación proporcionó el
\beta-D-glucopiranósido de
indoxilo requerido. Sin embargo, prefirió otra vía para el producto
intermedio peracetilado, citando la dificultad de entonces para
preparar el 1-acetilindoxilo como razón para esto.
Su vía alternativa implicaba la condensación de
indoxil-2-carboxilato de metilo (I,
V^{1-3} = H, V^{4} = CO_{2}Me) con
acetobromoglucosa, además mediante la ayuda de hidróxido de potasio
en acetona acuosa. Sin embargo, se requirieron varias etapas
adicionales antes de que pudiera obtenerse el producto final debido
a la necesidad de descarboxilar el núcleo de indol en la posición 2,
proceso que implica forzar las condiciones de calentamiento con
acetato de sodio en anhídrido acético a 160ºC. La vía que implica
el acoplamiento de un haluro de azúcar protegido con el
indoxil-2-carboxilato de metilo
apropiado ha tenido poca aplicación adicional [A. Robertson y R. B.
Waters, J. Chem. Soc., 72, (1931); Ley et al., loc.
cit.; S. Wolfe y R. J. Bowers, loc. cit.]. La vía más
expeditiva proporcionada por el acoplamiento directo de
1-acetilindoxilo con un haluro de azúcar totalmente
acilado (el más frecuente es el acetobromoazúcar) ha sido el método
habitual de elección. Esto impide la necesidad de una etapa de
descarboxilación. Los 1-acetilindoxilos necesarios
(1, V^{4} = H) se obtienen muy fácilmente por los métodos
desarrollados por Holt y Sadler [S. J. Holt et al., J.
Chem. Soc., 1217, (1958); c.f. S. J. Holt y P. W. Sadler,
Proc. Roy. Soc. B, 148, 481, (1958)]. Tras el
acoplamiento de los 1-acetilindoxilos con un haluro
de azúcar peracilado, la desprotección de tipo Zemplén (metóxido de
sodio en metanol) proporciona el producto final glucósido de
indoxilo. Este método fue seleccionado por Anderson y Leaback [F.
B. Anderson y D. Leaback, Tetrahedron, 12, 236;
(1961)] para la síntesis de tres glucósidos a base de
5-bromo-3-indolilo.
En un ejemplo de ellos, el
1-acetil-5-bromoindoxilo
(1, V^{2} = Br,V^{1},V^{3},V^{4} = H) se acopló con
acetobromogalactosa mediante la utilización de hidróxido de sodio
en acetona acuosa. Tras la recuperación del producto intermedio
peracetilado, el producto final se obtuvo directamente tras la
desprotección con metóxido de sodio metanólico y preparación.
Recientemente se ha descrito la síntesis de un disacárido
5-bromo-3-indolilo a
partir del acetobromoazúcar a través de las condiciones de Anderson
y Leaback [S. Kaneko et al., Biosci. Biotechnol.
Biochem., 64, 741, (2000)]. La gama de monosacáridos de
indoxilo halogenados fue ampliada más por Horwitz y colaboradores
[J. P. Horwitz et al., J. Med. Chem., 7, 574,
(1964)]. En una síntesis de estos investigadores, se acopló
1-acetil-5-bromo-4-cloroindoxilo
(X-OH) (I, V^{11} = Cl, V^{2} = Br,
V^{3-4} = H) con acetobromogalactosa en las
condiciones utilizadas por Anderson y Leaback. Tras la
desprotección del galactósido de indoxilo peracetilado obtuvieron
5-bromo-4-cloro-3-indolil
\beta-D-galactopiranósido
(X-gal). X-Gal es actualmente el
glucósido de indoxilo encontrado más extensamente utilizado en
microbiología de diagnóstico así como en otros campos tal como la
microbiología molecular. En la misma publicación, Horwitz y
colaboradores emplearon también
3-acetil-5-bromo-4-cloroindoxilo
[S. J. Holl y P. W. Sadler, loc. cit.] como producto
intermedio. Utilizando este reactivo fue necesario eliminar el grupo
3-acetilo con sodio en metanol para generar la sal
sódica de indoxilo in situ antes de tratarlo con
acetobromoglucosa. Debido a que las condiciones de la reacción
condujeron también a la eliminación de todos los demás grupos
protectores de acetilo, se obtuvo en una sola etapa el glucósido
totalmente desprotegido,
\beta-D-glucopiranósido de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
(X-glucósido). Sin embargo esta vía presenta tres
inconvenientes distintos. En primer lugar, los
3-acetilindoxilos son más difíciles de preparar que
los 1-acetilindoxilos. En segundo lugar, su
estabilidad muy reducida les hace más difíciles de trabajar con
ellos. En tercer lugar, debido a que la reacción es "en un
recipiente" y el rendimiento es bajo, existe una cantidad
sustancial de residuo muy coloreado que ha de ser eliminado antes
de que el producto pueda emplearse de forma útil como sustrato
enzimático y esto es muy engorroso de realizar de forma
satisfactoria a gran escala de
preparación.
preparación.
Más recientemente, Berlin y Saber [W. Berlin y B.
Sauer, Anal. Biochem., 243, 171, (1996)] describieron
la dificultad con la reacción básica favorecida entre
1-acetil-5-bromoindoxilo
(I, V^{2} = Br, V^{1}, V^{3}, V^{4} = H) y un bromuro de
perbenzoil-arabinofuranosilo. Sin embargo, fueron
capaces de lograr una reacción de glucosilación utilizando triflato
de plata como catalizador en diclorometano. Estas condiciones
representan una variación de la reacción clásica de
Koenigs-Knorr [K. Toshima y K. Tatsuta, Chem.
Rev., 93, 1503, (1993)].
Antes de la presente invención, no habían sido
descritos los derivados de los
\beta-D-ribofuranósidos de
indoxilo.
Un primer aspecto de la presente invención
proporciona un
\beta-D-ribofuranósido de indoxilo
de fórmula II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1-4}
son independientemente H, haluro, nitro o grupos alquilo
C_{1-6} y R^{5} es H, alquilo
C_{1-6} o aralquilo o un derivado sustituido o un
éster del \beta-D-ribofuranósido
de
indoxilo.
Un segundo aspecto de la presente invención
proporciona un procedimiento para la producción de un
\beta-D-ribofuranósido de indoxilo
según el primer aspecto de la presente invención; que comprende a)
poner en contacto un
\beta-D-ribofuranosiltricloroacetilamidato
protegido con un compuesto de fórmula III
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1-4}
son independientemente H, haluro, nitro o grupos alquilo
C_{1-6} y T^{5} es acilo, trialquilsililo u
otros grupos protectores en presencia de un catalizador para formar
un
indoxil-\beta-D-ribofuranósido
protegido; y b) eliminar los grupos
protegidos.
Los grupos protegidos son fragmentos unidos a
grupos de hidroxilo reactivo en
\beta-D-ribofuranosilo o al
nitrógeno del indoxilo para impedir las reacciones que tienen lugar
que no se requieren. El grupo protector utilizado más
frecuentemente es acetilo.
Un tercer aspecto de la presente invención
proporciona un método para detectar actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa en una
muestra que comprende:
a) poner en contacto la muestra con un
\beta-D-ribofuranósido de indoxilo
según el primer aspecto de la presente invención; en la que dicho
\beta-D-ribofuranósido de indoxilo
comprende un fragmento de
\beta-D-ribofuranosilo y un
fragmento de indoxilo, siendo escindible el grupo
\beta-D-ribofuranosilo por la
\beta-D-ribofuranosidasa del
fragmento indoxilo que libera el fragmento indoxilo que forma un
compuesto coloreado; y
b) sacar en conclusión si la actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa está
presente para detectar si se forma un compuesto coloreado a partir
del fragmento indoxilo.
Según un cuarto aspecto de la presente invención
se proporciona un kit que comprende
a) un
\beta-D-ribofuranósido de indoxilo
según el primer aspecto de la presente invención y
b) un componente para su utilización en la
producción de un medio de crecimiento microbiano.
Según un quinto aspecto de la presente invención
se proporciona una composición que comprende un
\beta-D-ribofuranósido de indoxilo
según el primer aspecto de la presente invención y otro
componente.
En la escisión por
\beta-D-ribofuranosidasa, el
fragmento indoxilo de los
\beta-D-ribofuranósidos de
indoxilo produciría una gama de compuestos coloreados, como se
indicó anteriormente diferente de los proporcionados por los
\beta-D-ribofuranósidos derivados
del catecol ejemplificados en el documento
WO-A-03/035897. Además, a
diferencia de los compuestos tales como los formados a partir del
3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido
en un medio que contiene una sal de hierro, el compuesto coloreado
producido por los
\beta-D-ribofuranósidos de
indoxilo tras la escisión enzimática no es probablemente para
enmascarar completamente el color generado por un sustrato
enzimático diferente (tal como el compuesto coloreado producido por
una parte de indoxilo diferente unido a otro azúcar o grupo
escindible por la enzima), incorporado en el medio para la
observación de una actividad enzimática diferente. Además, se prevé
que algunos medios cromógenos nuevos de la presente invención
permitirían detectar la presencia de actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa mediante
la utilización de un
\beta-D-ribofuranósido cromógeno
que está enmascarado por un segundo compuesto coloreado más
intensamente liberado por una actividad enzimática diferente en la
misma muestra tras su acción en un segundo sustrato enzimático
cromógeno. Los expertos en la materia apreciarán que bajo
determinadas circunstancias esto representa una ventaja cuando se
trata de desarrollar medios de diagnóstico útiles que dependan de la
observación de otras actividades enzimáticas además de la actividad
de \beta-D-ribofuranosidasa. Se
consideró por consiguiente que la síntesis de
\beta-D-ribofuranósidos de
indoxilo y su aplicación como sustratos enzimáticos cromógenos es
complementaria a la de los
\beta-D-ribofuranósidos a base de
catecol ejemplificados en el documento
WO-A-03035897 y por consiguiente
supera las limitaciones presentes en el diseño de nuevos medios
cromógenos en los que la detección de la actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa es
crítica.
Los
\beta-D-ribofuranósidos de
indoxilo de la presente invención están definidos por la fórmula II
anterior. Se prefiere generalmente que las posiciones R^{1} a
R^{4} sean H, alquilo C_{1-6} o haluro y los
haluros sean generalmente bromo o cloro. R^{5} puede ser alquilo
C_{1-6} o aralquilo tal como bencilo, pero
generalmente es H o metilo. Las partes de indoxilo especialmente
preferidos se seleccionan de entre el grupo constituido por
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
(también denominado X),
5-bromo-6-cloro-3-indolilo,
5-bromo-3-indolilo,
6-cloro-3-indolilo,
3-indolilo,
4-cloro-3-indolilo,
6-bromo-3-indolilo,
6-fluoro-3-indolilo,
5,7-dibromo-3-indolilo,
4,5-dicloro-3-indolilo,
5-nitro-3-indolilo,
1-metil-3-indolilo,
5-bromo-4-cloro-1-metil-3-indolilo,
5-bromo-6-cloro-1-metil-3-indolilo,
5-bromo-1-metil-3-indolilo,
6-cloro-1-metil-3-indolilo,
4-cloro-1-metil-3-indolilo,
6-bromo-1-metil-3-indolilo,
6-fluoro-1-metil-3-indolilo,
5,7-dibromo-1-metil-3-indolilo,
5,6-dibromo-3-indolilo,
5,6-dibromo-1-metil-3-indolilo
y
5-nitro-1-metil-3-indolilo
y
4,5-dicloro-1-metil-3-indolilo.
El segundo aspecto de la presente invención
proporciona un procedimiento para producir
\beta-D-ribafuranósidos de
indoxilo y fue desarrollado tras estudios prolongados y en
profundidad realizados por el inventor.
Para proporcionar compuestos de la invención, se
intentó en primer lugar tratar de acoplar
1-acetil-5-bromo-4-cloroindoxilo
(X-OH)
(1-acetil-5-bromo-4-cloroindol-3-ol)
con acetobromo- o acetoclororribofuranosa en las condiciones
utilizadas por Andersen y Leaback (loc. cit.) para preparar
los glucósidos de
5-bromo-3-indolilo y
por Horwitz y colaboradores (loc. cit.) para preparar
X-Gal, siendo la molécula diana de la presente
invención por consiguiente
\beta-D-ribofuranósido de
5-bromo-4-cloro-3-indolil
(X-\beta-D-ribofuranósido).
Por lo tanto, la acetobromorribofuranosa o la
acetoclororribofuranosa algo más estable [H. Zinner, Chem.
Ber., 83, 153, (1950)] (preparadas ambas a partir de
tetraacetato de
\beta-D-ribofuranosa disponible
en el mercado) y X-OH se trataron con la cantidad
apropiada de hidróxido de sodio o de potasio en acetona acuosa. El
análisis de las reacciones por tlc (durante la aparición de un nuevo
producto activo por UV) y, cuando proceda, por aislamiento de
algunos productos nuevos formados por cromatografía en columna en
gel de sílice C60 seguido por análisis de rmn, demostró que ninguna
de las reacciones producía el producto intermedio
indoxil-ribofuranósido protegido esperado.
Se intentó a continuación la ribosilación
utilizando el bromuro de
tribenzoil-D-ribofuranosilo [S.
Hanessian y A. G. Pernet, Can. J. Chem., 52, 1280,
(1974)] y cloruro [H. M. Kissman et al., J. Amer. Chem.
Soc., 77, 18, (1955)]. No obstante, tampoco se observó
formación de producto en estas reacciones. Debido a la
imposibilidad de acoplar X-OH a un haluro de
ribofuranosilo peracilado bajo la influencia del hidróxido de
potasio o de sodio, se buscó un procedimiento de glucosilación
alternativo empleando estos haluros. La reacción de
Koenigs-Knorr que utiliza haluros de azúcar
protegidos es un procedimiento muy utilizado para construir
O-glucósidos y ha sido aplicado ya en las series de
indoxilo [W. Berlin y B. Sauer, loc. cit.]. Se desarrollaron
al principio utilizando sales de plata como catalizador y como
aceptor de haluro [W. Koenigs y E. Knorr, Chem. Ber.,
34, 957, (1901)], el alcance de la reacción ha sido
prolongado a lo largo de los años mediante la utilización de otros
catalizadores metálicos [K. Toshima y K. Tatsuta, loc. cit.].
Varios de estos se exploraron durante el trabajo en la presente
invención con los haluros de peracetil- y perbenzoilrribofuranosilo
mencionados anteriormente. Utilizando los disolventes, acetonitrilo,
cloroformo, diclorometano, éter dietílico, dimetilformamida,
nitrometano o piridina, se trataron los siguientes catalizadores de
glucosilación, todos sin éxito; carbonato de plata (I), cianuro de
plata (I), óxido de plata (I), nitrato de plata (I), triflato de
plata (I), carbonato de cadmio, bromuro de mercurio (II), cloruro de
mercurio (II) y óxido de mercurio (II).
La imposibilidad de la reacción de
Koenigs-Knorr para producir el glucósido deseado
condujo a la evaluación de otros métodos de glucosilación que no
entrañan el producto intermedio de un haluro de glucosilo en la
etapa clave de acoplamiento. La utilización de donantes de glucosilo
1-O-acilados en las glucosilaciones
(reacción de Helferich) se demostró por primera vez en 1933 [B.
Helferich y E. Schmitz-Hillebrecht, Chem.
Ber., 66, 378, (1933)). Esta reacción implica con
frecuencia calentar un azúcar peracilado con un aglucón en
presencia de un activador de ácido de Lewis tal como el ácido
p-toluensulfónico (PTSA) o cloruro de cinc [E. M.
Montgomery, N. K. Richtmyer y C. S. Hudson, J. Amer. Chem.
Soc., 64, 690, (1942)]. El calentamiento del tetraacetato de
\beta-D-ribofuranosa y
X-OH con uno de los dos activadores no pudo
proporcionar el producto deseado. Desde los experimentos iniciales
de Helferich y colaboradores, el alcance de la reacción de Helferich
ha sido más ampliado mediante la utilización de otros catalizadores
y realizando la reacción en disolventes orgánicos. De hecho, la
ribofuranosilación de compuestos aromáticos ha sido descrita
utilizando \beta-D-ribofuranosas
peraciladas en disolventes orgánicos con trifluoruro dietileterato
de boro como catalizador [L. Kalvoda, Coll. Czech. Chem.
Comm., 38, 1679 (1973) y el documento
WO-A-03035897. Sin embargo, la
sustitución de X-OH por los compuestos aromáticos
utilizados en estos ejemplos no proporcionó el ribósido. Se
intentaron reacciones de Helferich adicionales en acetonitrilo,
cloroformo, diclorometano, 1,2-dicloroetano, éter
dietílico y nitrometano con tetraacetato de
\beta-D-ribofuranosa, tribenzoato
de
1-O-aetil-\beta-D-ribofuranosa
o tribenzoato de
1-p-nitrobenzoil-\beta-D-ribofuranosa
y los siguientes catalizadores de ácido de Lewis; tricloruro de
aluminio, trifluoruro dietileterato de boro, cloruro de hierro
(III), cloruro de estaño (IV), triflato de TMS y PTSA. Ninguna
reacción tuvo éxito.
Los tioglucósidos han demostrado ser versátiles
como donantes de glucosilo [K. Toshima y K. Tatsuta, loc.
cit.]. Un reactivo considerado adecuado para la ribosilación, el
feniltio-\beta-D-ribofuranósido,
se preparó convenientemente a partir del tetraacetato de
\beta-D-ribofuranosa y tiofenol
[G. Kim et al., Tetr. Lettr. 34, 7627,
(1993)]. El tratamiento de este tioglucósido y X-OH
con cloruro de mercurio (II) o sulfato de mercurio (II) como
activador en diclorometano o nitrometano no pudo producir ninguna
formación de ribósido. Crich y Smith han desarrollado recientemente
un procedimiento de glucosilación basado en tioglucósidos que es
suave y además ha sido aplicado a una gama de aglucones [D. Crich y
M. Smith, J. Amer. Chem. Soc., 123, 9015, (2001)]. La
glucosilación de Crich implica el tratamiento del tioglucósido
apropiado y del aceptor de glucosilo con
1-bencenosulfonilpiperidina (BSP) y anhídrido
trifluorometansulfónico (Tf_{2}O) en diclorometano a baja
temperatura (-60ºC), con o sin la base
2,4,6-tri-terc-butilpirimidina
(TTBP) impedida. Al aplicar estas condiciones a feniltio
\beta-D-ribofuranósido y XOH, no
se observó ninguna reacción, ni con ni sin presencia de TTBP.
Otro acceso todavía a los glucósidos que no
implica un producto intermedio del 1-haluro en la
etapa clave de glucosilación es el método de tricloroacetamidato de
Schmidt [R. R. Schmidt, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,
25, 212 (1986)]. Los tricloroacetamidatos de ribofuranosilo
se han utilizado como donantes de ribofuranosilo en las síntesis de
glucósidos [I. Chiu Machado et al., J. Carbohydr.
Chem., 13, 465, (1994)]. El donante más adecuado para el
acoplamiento con X-OH sería un tricloroacetamidato
de ribofuranosilo peracilado. Esto es debido a que todos los grupos
acilo en el producto acoplado protegido podrían eliminarse
convenientemente en una etapa por el procedimiento de Zemplén
descrito para otros indoxil-glucósidos. La síntesis
de dos tricloroacetamidatos de ribofuranosilo peracilados ha sido
descrita por Verez-Bencomo y colaboradores [I.
Chiu-Machado et al., J. Carbohydr.
Chem., 14, 551, (1995)]. El tricloroacetamidato de
D-ribofuranosilo peracetilado, obtenido como otra
mezcla anomérica, se utilizó con éxito por ellos para producir
\beta-D-ribofuranósidos, aunque no
se publicó su utilización con aglucones aromáticos. El punto de
partida de su síntesis de este donante de ribosilo fue el
2,3,5-tri-O-acetil-\beta-D-ribofuranósido
de metilo. Éste se prepara mediante acetilación del
\beta-D-ribofuranósido de metilo
con anhídrido acético [S. J. Angyal et al, Carbohydr.
Res., 157, 83, (1986)]. El
\beta-D-ribofuranósido de metilo
se prepara de forma conveniente a partir de la ribosa [R. Barker y
H. G. Fletcher Jr., J. Org. Chem., 26, 4605, (1981)].
La reacción del tricloroacetamidato de
D-ribofuranosilo peracetilado con XOH en
diclorometano a temperatura ambiente que utiliza triflato de TMS
como catalizador proporcionó nuevo material que era activo a UV en
la tlc. La separación de este material de otros compuestos por
cromatografía en columna en gel de sílice C60 seguido de la
preparación dio como resultado el aislamiento del peracetato de
X-\beta-D-ribofuranósido
del requisito esencialmente exento de cualquier impureza
significativa. La desacetilación con una cantidad catalítica de
metóxido de sodio en metanol, seguida de evaporación del solvente y
de disgregación del sólido dio el
X-\beta-D-ribofuranósido
como un sólido con una pureza por XPLC de alrededor del 96%.
[Condiciones HPLC: columna; gel de sílice 5 \mu de fase inversa
C_{18} Chromosphere 250 mm \times 4,6 mm (ChromosExpress,
Macclesfield, UK); disolvente: metanol/agua 1:1 v/v, caudal 1
ml/min; detección, UV a 290 nm; carga, 1 mg de producto en 1 g de
disolvente, inyección 20 \mul; tiempo de la serie, 30 min; tiempo
de retención aproximadamente
17 minutos].
17 minutos].
El procedimiento descrito en el segundo aspecto
de la presente invención se realiza generalmente en la etapa a) que
se produce en un disolvente orgánico.
El procedimiento de la presente invención se
realiza generalmente con el catalizador de la etapa a) que es un
ácido de Lewis.
Es preferible que el procedimiento de la presente
invención se realice con el tricloroacetamidato de
\beta-D-ribofuranosilo protegido
que se selecciona de entre el grupo constituido por
tricloroacetamidato de
2,3,5-tri-O-acetil-\beta-D-ribofuranosilo
y tricloroacetamidato de
2,3,5-tri-O-benzoil-\beta-D-ribofuranosilo.
Como se describió anteriormente T^{5} en la
fórmula III puede ser acilo, un grupo protector de trialquilsililo
u otro grupo protector. Los grupos protectores de trialquilsililo
más útiles son trimetilsililo,
t-butildimetilsililo, trietilsililo y
triisopropilsililo. El grupo protector preferido en T^{5} es
acetilo o trimetilsililo. Cuando se eliminan los grupos protectores
durante la etapa b) T^{5} puede convertirse en R^{5}. Este
puede ser el procedimiento seguido cuando T^{5} sea acetilo y
R^{5} sea H. Como alternativa no puede producirse ningún cambio y
T^{5} y R^{5} son idénticos. En otra forma de realización
T^{5} puede modificarse en una etapa independiente para producir
R^{5}. Por ejemplo, tras la etapa a) el producto intermedio puede
tener un grupo acetilo en T^{5} que se desacetila selectivamente y
una reacción posterior en el indoxil-N produce
R^{5}. Una desprotección adicional tiene lugar, etapa b), antes de
que se produzca el
\beta-D-ribofuranósido de
indoxilo.
Tal como se describió anteriormente, el tercer
aspecto de la presente invención proporciona un método para
detectar la actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa en una
muestra.
En este aspecto de la invención puede existir
también una etapa preliminar en la que la muestra que contiene las
células, normalmente células microbianas, se cultiva en o sobre un
medio de cultivo.
En una forma de realización alternativa el método
puede comprender también detectar una segunda actividad enzimática
en la muestra y en la etapa a) la muestra se pone en contacto además
con un segundo sustrato enzimático que comprende un fragmento
escindible por la enzima que no es
\beta-D-ribofuranosilo y un
fragmento indicador que no es idéntico al del indoxil
\beta-D-ribofuranósido, siendo
dicho fragmento escindible por la enzima escindible por la segunda
actividad enzimática que libera el fragmento indicador que forma un
segundo compuesto detectable; y
c) sacar en conclusión si la segunda actividad
enzimática está presente en la muestra detectando si se forma un
segundo compuesto detectable a partir del fragmento indicador del
segundo sustrato enzimático.
El segundo sustrato enzimático comprende un
fragmento indicador que generalmente es un fragmento cromógeno,
pero puede ser también un fragmento fluorógeno. Es preferible que el
segundo sustrato enzimático comprenda un fragmento escindible por
la enzima que es un fragmento de azúcar o un fosfato o un éster tal
como un caprilato.
En el método del tercer aspecto de la presente
invención la muestra puede comprender células vivas tales como
bacterias u otros procariotas, hongos, organismos eucarióticos,
cultivos celulares o alternativamente extractos celulares.
Es preferible que los métodos de detección de la
presente invención se produzcan con la muestra en un medio sólido y
el compuesto coloreado o los compuestos producidos sean
insolubles.
En una forma de realización especialmente
preferida de la presente invención el método del tercer aspecto de
la presente invención comprende un medio sólido que contiene un
indoxil \beta-D-ribofuranósido de
la presente invención.
En una forma de realización del método el
compuesto coloreado formado a partir de la parte de indoxilo del
indoxil-\beta-D-ribofuranósido
se observa simultáneamente con un compuesto coloreado formado a
partir de un grupo cromógeno del segundo sustrato enzimático.
En una forma de realización alternativa el
compuesto coloreado formado a partir del fragmento cromógeno del
segundo sustrato enzimático enmascara el compuesto coloreado formado
a partir del fragmento indoxilo del sustrato
indoxil-\beta-D-ribofuranósido.
En una forma de realización alternativa del
tercer aspecto de la presente invención la muestra está en un medio
de cultivo microbiano líquido.
El cuarto aspecto de la presente invención, como
se describió anteriormente, proporciona un kit para realizar la
detección utilizando un indoxil
\beta-D-ribofuranósido de la
presente invención. Es preferible que el componente para su
utilización en la producción de un medio sea para producir un medio
de cultivo microbiano sólido.
Según un quinto aspecto de la invención, como se
describió anteriormente, el otro componente en la composición es un
componente del medio sólido. Alternativamente el otro componente
puede ser otro sustrato enzimático cromógeno. Una composición de la
presente invención puede comprender multitud de otros componentes
suficientes para formar un medio de detección útil en la presente
invención.
La presente invención se ilustra con más detalle
mediante los ejemplos siguientes.
Se realizó la reacción en un matraz de dos bocas
de 500 ml equipado con un agitador magnético.
A una mezcla de
2,3,5-tri-O-acetil-\alpha/\beta-D-ribofuranosil
tricloroacetamida [I. Chiu-Machado et al.,
(1995), loc. cit.] (145,0 g) y tamices moleculares de 3 Å
(2,0 g) en diclorometano anhidro (300 ml) se añadió
X-OH anhidro (82,9 g) y la mezcla total se agitó a
temperatura ambiente durante 10 min. El triflato de TMS (8 ml) se
añadió a continuación en un parte mediante jeringuilla y la reacción
se dejó agitar a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se
vertió a continuación en diclorometano (3 l) y se lavó con hidróxido
de sodio 1 M (4 \times 2 l). Se separó la capa orgánica, se
filtró a través de celite y se concentró, al vacío, para reducir el
volumen (aprox. 1 l). La capa orgánica se lavó más a continuación
con hidróxido de sodio 1 M (6 \times 1 l) y agua desionizada (1
l). Después del secado (sulfato de magnesio) se filtró a través de
celite y se concentró, al vacío, para dar el producto en bruto
protegido como un sólido marrón oscuro (87,4 g).
El sólido marrón oscuro se examinó por tlc y se
observó que contenía dos productos principales con valores de
R_{f} de aproximadamente 0,37 (el
\beta-ribofuranósido protegido) y 0,43. [Placas de
gel de sílice, éter de petróleo 60/80, acetato de etilo 1:1 v/v, UV
a 254 nm]. La cromatografía de flash del producto en bruto sobre
gel de sílice C60 (600 g) utilizando como disolvente eluyente éter
de petróleo 60/80/acetato de etilo/trietilamina 1:1:0,05 v/v/v dio
el producto protegido como un aceite marrón (55 g). El aceite fue
principalmente una mezcla del tetraacetato de
X-\beta-D-ribofuranósido
y del contaminante con R_{f} 0,43. Este aceite se absorbió en
metanol caliente (30 ml) y después de dejarlo a temperatura ambiente
se formó un precipitado. Tras 16 horas, se eliminó por filtración
el sólido de color crema consistente casi enteramente en material
con un valor de R_{f} 0:43 y se concentró el filtrado a 40ºC al
vacío para dar el tetraacetato de
X-\beta-D-ribofuranósido
como un aceite marrón (33,6 g).
Se disolvió el tetraacetato de
X-\beta-D-ribofuranósido
(30 g) en metanol (200 ml) y se añadió gota a gota una solución de
metóxido de sodio (preparada a partir de 1 g de sodio en 20 ml de
metanol) hasta que la solución alcanzó el pH 10. Se dejó la
solución reposar a temperatura ambiente durante 90 min, a
continuación se concentró, al vacío, hasta un aceite alquitranado
marrón. Se disgregó el aceite en acetona (500 ml). Precipitó un
sólido gris y éste se eliminó por filtración al vacío. Se descartó
el sólido y se concentró el filtrado al vacío, hasta un aceite
marrón (19,3 g). Se disgregó el aceite con metanol (80 ml) y el
producto precipitó como un sólido azul pálido que se recuperó por
filtración (2,57 g). Se concentró el filtrado, al vacío y se
disgregó con metanol (30 ml) para obtener una segunda recogida como
un sólido de color crema pálido que se recuperó también por
filtración (4,04 g). Se combinaron ambas recogidas y se lavaron con
acetona fría (aprox. 20 ml) seguido de filtración para recuperar el
compuesto del título como un sólido blanco (aprox. 2,5 g).
Se produjeron los medios siguientes para
demostrar la utilidad de los compuestos de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio A (componentes por
litro)
| Agar-agar de Columbia (Oxoid) | 40 g |
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil \beta-D-ribofuranósido (conocido también como X-\beta-D- | |
| ribofuranósido, compuesto de la presente invención) | 80 mg |
| 6-cloro-3-indolil \beta-D-glucopiranósido | 200 mg |
\vskip1.000000\baselineskip
Medio B (componentes por
litro)
| Agar-agar de Columbia (Oxoid) | 40 g |
| 3'4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido | 300 g |
| 6-cloro-3-indolil \beta-D-glucopiranósido | 200 mg |
| Citrato férrico amónico | 500 mg |
Medio C (componentes por
litro)
| Agar-agar de Columbia (Oxoid) | 40 g |
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil \beta-D-ribofuranósido (X-\beta-D-ribofuranósido) | 80 mg |
| 3,4-ciclohexenoesculetin-\beta-D-galactopiranósido | 300 mg |
| isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido | 30 mg |
| Citrato férrico amónico | 500 mg |
\vskip1.000000\baselineskip
Medio D (componentes por
litro)
| Agar-agar de Columbia (Oxoid) | 40 g |
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil \beta-D-ribofuranósido (X-\beta-D-ribofuranósido) | 80 mg |
| 3',4'-dihidroxi-3-metoxiflavona-4'-\beta-D-galactopiranósido | 300 mg |
| isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido | 30 mg |
| Citrato férrico amónico | 500 mg |
\vskip1.000000\baselineskip
Medio E (componentes por
litro)
| Agar-agar de Columbia (Oxoid) | 40 g |
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil \beta-D-ribofuranósido (X-\beta-D-ribofuranósido) | 80 mg |
\vskip1.000000\baselineskip
Medio F (componentes por
litro)
| Agar-agar de Columbia (Oxoid) | 40 g |
| 3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido | 300 mg |
| Citrato férrico amónico | 500 mg |
\vskip1.000000\baselineskip
Los derivados de flavona utilizados en los medios
B, D y F se sintetizan como se describe en el documento
WO-A-03035897.
Todos los componentes se añadieron a 1 litro de
agua desionizada y se esterilizaron al autoclave a 116ºC durante 10
minutos. Se prepararon placas de cultivo de
agar-agar fundido a 50ºC y secado. Se prepararon
varias cepas de referencia con características enzimáticas conocidas
en una suspensión de aproximadamente 10^{8} cfu/ml utilizando un
densitómetro. Se inoculó 10 \mul de esta suspensión en cada uno de
los diferentes tipos de medios y se incubaron toda la noche a 37ºC.
En la Tabla 1 se muestra el aspecto del cultivo de las diversas
cepas probadas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}
\newpage
El análisis descrito anteriormente indica que
cuando el
X-\beta-D-ribofuranósido
(\beta-D-ribofuranósido de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo)
se probó con cepas de glucósido de Rose
(\beta-D-glucopiranósido de
6-cloro-3-indolilo)
que tanto la
\beta-D-ribofuranosidasa como la
\beta-glucosidasa producidas produjeron una
mezcla de colores debido a la hidrólisis de ambos sustratos
cromógenos (véase resultados para el medio A). Dichas colonias se
distinguieron claramente de las que hidrolizaron únicamente uno o
ninguno de los dos sustratos.
Este atributo de
X-\beta-D-ribofuranósido
no es presentado por el
3',4'-dihidroxiflavona-4'-\beta-D-ribofuranósido
ya que el quelato de hierro de
3',4'-dihidroxiflavona enmascaró la presencia de
cualquier actividad de \beta-glucosidasa (véase
los resultados para el medio B). Precisamente como esta reacción de
glucosidasa puede enmascararse, la propia hidrólisis del
X-\beta-D-ribofuranósido
puede ser enmascarada por otros cromógenos quelantes. Por ejemplo,
los resultados en los medios C y D demuestran que la hidrólisis del
X-\beta-D-ribofuranósido
puede enmascararse cuando el
3,4-ciclohexenoesculetin-\beta-D-galactopiranósido
o el
3'4'-dihidroxi-3-metoxiflavona-4'-\beta-D-galactopiranósido
están presentes en el medio.
Los resultados demostrados anteriormente para el
X-\beta-D-ribofuranósido
demuestran las tres ventajas de la presente invención. En primer
lugar los indoxil
\beta-D-ribofuranósidos de la
presente invención tienen capacidad para detectar la actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa con gran
sensibilidad y bajas concentraciones de sustrato. En segundo lugar,
los indoxil
\beta-D-ribofuranósidos de la
presente invención pueden utilizarse simultáneamente con otros
sustratos de indoxilo para producir un medio en el cual pueda
generarse una multitud de colores.
En tercer lugar los indoxil
\beta-D-ribofuranósidos de la
presente invención pueden utilizarse también simultáneamente con
quelación basada en sustratos que producen un indicador capaz de
enmascarar el precipitado coloreado generado a partir de las partes
de indoxilo después de la actividad de la
\beta-D-ribofuranosidasa.
Claims (22)
1.
\beta-D-ribofuranósido de indoxilo
de fórmula II
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1-4}
son independientemente H, haluro, nitro o grupos alquilo
C_{1-6} y R^{5} es H, alquilo
C_{1-6} o aralquilo o un derivado sustituido del
\beta-D-ribofuranósido de
indoxilo.
2. Compuesto de indoxilo según la reivindicación
1, en el que la parte de indoxilo se selecciona de entre el grupo
constituido por
5-bromo-4-cloro-3-indolilo,
5-bromo-6-cloro-3-indolilo,
5-bromo-3-indolilo,
6-cloro-3-indolilo,
3-indolilo,
4-cloro-3-indolilo,
6-bromo-3-indolilo,
6-fluoro-3-indolilo,
5,7-dibromo-3-indolilo,
4,5-dicloro-3-indolilo,
5-nitro-3-indolilo,
1-metil-3-indolilo,
5-bromo-4-cloro-1-metil-3-indolilo,
5-bromo-6-cloro-1-metil-3-indolilo,
5-bromo-1-metil-3-indolilo,
6-cloro-1-metil-3-indolilo,
4-cloro-1-metil-3-indolilo,
6-bromo-1-metil-3-indolilo,
6-fluoro-1-metil-3-indolilo,
5,7-dibromo-1-metil-3-indolilo,
5,6-dibromo-3-indolilo,
5,6-dibromo-1-metil-3-indolilo,
5-nitro-1-metil-3-indolilo
y
4,5-dicloro-1-metil-3-indolilo,
preferentemente
5-bromo-4-cloro-3-indolilo.
3. Procedimiento para la producción de un
\beta-D-ribofuranósido de indoxilo
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores; que
comprende:
a) poner en contacto un tricloroacetiimidato de
\beta-D-ribofuranosilo protegido
con un compuesto de fórmula (III)
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1-4}
son independientemente H, haluro, nitro o grupos alquilo
C_{1-6} y T^{5} es acilo, trialquilsililo u
otros grupos protectores en presencia de un catalizador para formar
un
indoxil-\beta-D-ribofuranósido
protegido;
y
b) eliminar los grupos protegidos.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el
que T^{5} es un grupo acetilo o trimetilsililo.
5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4,
que comprende además unas etapas intermedias entre la etapa a) y la
etapa b) para convertir T^{5} en R^{5}.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que el tricloroacetimidato de
\beta-D-ribofuranosilo protegido
que se selecciona de entre el grupo constituido por
tricloroacetimidato de
2,3,5-tri-O-acetil-\beta-D-ribofuranosilo
y tricloroacetimidato de
2,3,5-tri-O-benzoil-\beta-D-ribofuranosilo.
7. Método para detectar actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa en una
muestra que comprende:
a) poner en contacto la muestra con un
\beta-D-ribofuranósido de indoxilo
según la reivindicación 1 ó 2; en la que dicho
\beta-D-ribofuranósido de indoxilo
comprende un fragmento de
\beta-D-ribofuranosilo y un
fragmento de indoxilo, siendo escindible el fragmento
\beta-D-ribofuranosilo por la
\beta-D-ribofuranosidasa del
fragmento indoxilo que libera el fragmento indoxilo que forma un
compuesto coloreado; y
b) sacar en conclusión si la actividad de
\beta-D-ribofuranosidasa está
presente para detectar si se forma un compuesto coloreado a partir
del fragmento indoxilo.
8. Método según la reivindicación 7, que
comprende una etapa preliminar de cultivo de la muestra en medio o
sobre el mismo.
9. Método según la reivindicación 7 u 8, en el
que una segunda actividad enzimática en la muestra se debe detectar
también, en el que en la etapa a) la muestra se pone en contacto
además con un segundo sustrato enzimático que comprende un
fragmento escindible por la enzima que no es
\beta-D-ribofuranosilo y un
fragmento indicador que no es idéntico al del
\beta-D-ribofuranósido de
indoxilo, siendo dicho fragmento escindible por la enzima
escindible por la segunda actividad enzimática que libera el
fragmento indicador que forma un segundo compuesto detectable; y el
método incluye:
c) sacar en conclusión si la segunda actividad
enzimática está presente en la muestra detectando si se forma un
segundo compuesto detectable a partir del fragmento indicador del
segundo sustrato enzimático.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
el fragmento indicador del segundo sustrato enzimático es un
fragmento cromógeno.
11. Método según la reivindicación 9, en el que
el fragmento indicador del segundo sustrato enzimático es un
fragmento fluorógeno.
12. Método según la reivindicación 9, en el que
el fragmento escindible por la enzima del segundo sustrato
enzimático es un fragmento de azúcar, un fosfato o un éster,
preferentemente un caprilato.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 12, en el que la muestra es un medio sólido de
crecimiento microbiano y dicho compuesto o compuestos coloreados
son insolubles.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
el \beta-D-ribofuranósido de
indoxilo está en el medio sólido.
15. Método según la reivindicación 10, en el que
el compuesto coloreado formado en la etapa c) enmascara el
compuesto coloreado formado en la etapa b).
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 12 ó 15, en el que la muestra está en un medio
líquido.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 16, en el que la muestra es de origen
bacteriano.
18. Kit que comprende
- a)
- un \beta-D-ribofuranósido de indoxilo según la reivindicación 1 ó 2; y
- b)
- un componente para su utilización en la producción de un medio de crecimiento microbiano.
19. Kit según la reivindicación 18, en el que el
componente para su utilización en la producción de un medio es para
la producción de un medio sólido.
20. Composición que comprende un
\beta-D-ribofuranósido de indoxilo
según la reivindicación 1 ó 2 y otro componente.
21. Composición según la reivindicación 20, en la
que el otro componente es un componente de un medio microbiano
sólido.
22. Composición según la reivindicación 20, en la
que el otro componente es otro sustrato enzimático.
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