ES2253263T3 - Procedimiento para identificar compuestos que modulan la actividad neuronal. - Google Patents
Procedimiento para identificar compuestos que modulan la actividad neuronal.Info
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Abstract
Un procedimiento para identificar compuestos que afectan al aprendizaje y la memoria, comprendiendo dicho procedimiento puesta en contacto de un compuesto candidato con un péptido que comprende el sitio de unión para Homer proximal al término carboxi de un canal de iones de calcio P/Q de mamífero; en el que dicho péptido comprende la secuencia de aminoácidos PLMF y no más de 20 aminoácidos corriente arriba y/o corriente debajo de la secuencia PLMF en dicho canal de iones P/Q; o en el que el péptido es al menos homólogo al 90% con el péptido 1966-YYRQSKAKKL QAMREEQDRT PLMFQRMEPP SPTQEGGPGQ NALP-2009 o un fragmento del mismo, siempre que dicho péptido comprenda la secuencia PLMF y no más de 20 aminoácidos corriente arriba y/o corriente abajo de dicha secuencia PLMF; y determinación de si dicho compuesto se une a dicho péptido; en el que un compuesto candidato que se une a dicho péptido se identifica como un compuesto que afecta al aprendizaje o la memoria.
Description
Procedimiento para identificar compuestos que
modulan la actividad neuronal.
La invención se refiere al campo de la
transmisión neural y al descubrimiento de fármacos.
Las patentes de EE.UU. 6.090.631 y 5.623.051
describen una región de los canales de iones de calcio de tipo N y
P/Q que unen proteínas sintaxina y SNAP-25. Esta
región está situada entre los dominios II y III de la subunidad
\alpha_{1} de estos canales. La sintaxina y
SNAP-25 son proteínas que median el ensamblaje de
vesículas presinápticas requeridas para liberación de
neurotransmisores. Según se describe en estos documentos, estas
regiones de unión sintaxina/SNAP-25 pueden usarse
para detectar selectivamente compuestos que bloquearán la unión de
estas regiones a sintaxina y/o SNAP-25, inhibiendo
así la transmisión neuronal.
Las condiciones que rodean a la transmisión de
señales a través de redes neuronales afectan claramente a una
diversidad de respuestas fisiológicas, incluyendo la percepción del
dolor, el aprendizaje, la memoria y similares. La modulación del
nivel de transmisión neural y la condición del entorno presináptico
tienen efectos fisiológicos profundos, principalmente dentro del
sistema nervioso. Los principales canales de iones de calcio que
realizan la transmisión neural son estos canales de tipo N y P/Q.
Los canales de tipo P/Q se han implicado principalmente en los
terminales presinápticos del sistema nervioso central (SNC) mientras
que los canales de tipo N parecen dominar en el sistema nervioso
periférico. Así, los canales de tipo P/Q son particularmente
importantes en funciones del SNC como la memoria y el dolor.
Los canales de iones de calcio están compuestos
en general por subunidades \alpha_{1}, con dichas subunidades
\alpha_{1} acopladas opcionalmente con subunidades adicionales,
pero pueden funcionar en solitario.
Según la terminología actual, los canales de tipo
N están constituidos por subunidades \alpha_{1B}, mientras que
los canales P/Q están compuestos por subunidades \alpha_{1A}. Las
secuencias de ADN que codifican subunidades \alpha_{1A} se
describen en el documento
WO-95-04.822 y en Zhuchenko,. O., y
col. (1997) Nature Genetics 15:62-68.
Sería claramente deseable proporcionar compuestos
que sean capaces de controlar el entorno presináptico de manera que
permitan un mayor control sobre las funciones del sistema nervioso
central, incluyendo memoria, aprendizaje y dolor. La presente
invención proporciona un mecanismo para este control. Como se
demostrará más adelante, una región específica de la subunidad
\alpha_{1A} contiene una secuencia que se une a la proteína Homer
conocida que se describen en artículos de Xiao, B., y col., Cur.
Opinion in Neurobiol. (2000) 10:370-374 y de
Tu, J.C., y col., Neuron (1998) 21:717-726.
Como se muestra en estos artículos, la proteína Homer se une a una
multiplicidad de dianas que son importantes para señalización y
neurotransmisión. También se describe una secuencia de consenso que
es rica en prolina.
La invención reside en la identificación de una
región peptídica específica del canal de iones de calcio P/Q que es
responsable de la cascada de acontecimientos que tienen como
resultado la expresión del gen que codifica la
sintaxina-1A. Así, el uso de este péptido en ensayos
de detección selectiva permite la identificación de compuestos que
pueden usarse para regular los niveles de
sintaxina-1A disponible en la región presináptica y
modular así funciones como el aprendizaje, la memoria y el
dolor.
Según el descubrimiento de los solicitantes de la
presente memoria descriptiva, el calcio que circula a través del
canal de iones P/Q realiza específicamente la expresión del gen que
codifica sintaxina en sistemas celulares modelo y en células
neuronales per se. Se ha encontrado ahora que una secuencia
de 4 aminoácidos específica de aproximadamente 200 aminoácidos del
término C del canal de iones de calcio P/Q es el sitio de
interacción de este canal con proteína Homer, una proteína que,
según se sabe, afecta a los depósitos intracelulares de iones de
calcio, y esta interacción es esencial para la capacidad del canal
de iones de calcio P/Q para realizar la expresión del gen que
codifica la sintaxina-1A.
Así, en un aspecto, la invención se dirige a un
procedimiento para identificar compuestos que afectan a la función
del sistema nervioso central, como el aprendizaje y la memoria,
comprendiendo dicho procedimiento la puesta en contacto de un
compuesto candidato con un péptido que comprende el sitio de unión
para Homer que reside en posición proximal con el término carboxi
del canal de iones de calcio P/Q y determinando si dicho compuesto
se une con dicho péptido. Los compuestos que se unen con este
péptido se identifican como compuestos que afectan a la función del
sistema nervioso central (SNC). Este ensayo de detección selectiva
puede realizarse de manera sencilla simplemente evaluando la
capacidad del compuesto de unirse. Más comúnmente, la capacidad del
compuesto candidato para inhibir la unión de un ligando que se sabe
que se une al péptido, incluyendo la capacidad de Homer para unirse
así, puede usarse para evaluar dicha unión.
En otro aspecto, la invención se dirige a un
péptido que comprende la secuencia del sitio de unión flanqueado
por aminoácidos adicionales, normalmente los que flanquean el sitio
de unión en el canal de iones nativos, y a antibióticos que son
inmunoespecíficos para esta región.
Los solicitantes de la presente invención han
demostrado que el aflujo de calcio selectivamente a través de
canales de iones de calcio de tipo P/Q es responsable de activar la
expresión de sintaxina-1A, una proteína
presináptica que juega un papel central en la mediación del
ensamblaje de vesículas, fusión y liberación de neurotransmisor.
Los solicitantes han demostrado que la señal de calcio inicial se
amplifica a través de ion de calcio desde depósitos intracelulares
y actúa a través de una fosforilación que depende de una serie de
cofactores, que incluyen CaMK II/IV, PKA y MAPKK. Como la
sintaxina-1A interacciona con canales de iones de
calcio de tipo P/Q para reducir la disponibilidad de canales, la
expresión del gen que codifica sintaxina-1A se
regula por una ruta de alimentación dependiente de la actividad.
Los solicitantes han demostrado ahora que la
interacción de la señal de calcio extracelular inicial con el
calcio liberado de depósitos intracelulares está mediada por la
unión de la proteína Homer conocida con una secuencia de
aminoácidos específica proximal al término C del canal de iones de
tipo P/Q y es específica de la subunidad P/Q \alpha_{1A}, en
oposición a otros canales de iones de calcio conocidos. La
identificación de este sitio de unión permite el uso de péptidos
que contienen este sitio como instrumentos de detección selectiva
para compuestos importantes que modulan la actividad del SNC.
Los procedimientos para realizar dicho ensayo de
detección selectiva son bien conocidos en la técnica. Normalmente,
el péptido diana se produce de forma recombinante en células huésped
adecuadas y se muestra en la superficie de dichas células huésped o
se acopla a un soporte sólido. Dicho acoplamiento puede ser
acoplamiento covalente o puede conseguirse a través de adsorción no
covalente, como, por ejemplo, proporcionando una marca de histidina
y asociando la proteína de fusión resultante a un soporte sólido a
través de un quelato metálico. En la técnica se conoce una amplia
diversidad de procedimientos para proporcionar una forma ensayable
del péptido. De hecho, como el péptido requerido es relativamente
corto, una forma conveniente de proporcionar este péptido es la
síntesis directa en un soporte sólido.
El sitio específico requerido para unión es la
secuencia de cuatro aminoácidos PLMF. Para reproducir el ensayo
práctico y específico, sin embargo, es deseable incluir una
secuencia de aminoácidos adicional en uno o los dos términos N y C
de este tetrapéptido. Las formas de realización preferidas para
dicha secuencia de aminoácidos adicional son las secuencias
presentes en los canales de iones nativos. Normalmente, se emplean
secuencias que se extienden 20 aminoácidos corriente arriba y/o
corriente abajo, más preferentemente 15 aminoácidos corriente
arriba y/o corriente abajo, o incluso 10 ó 5 ó 2 aminoácidos de las
secuencias corriente arriba y/o corriente abajo del tetrapéptido
requerido.
Seguidamente se muestra la secuencia que contiene
el tetrapéptido, con el tetrapéptido en negrita y subrayado:
1966-YYRQSKAKKL
\hskip1cmQAMREEQDRT
\hskip1cmPLMF QRMEPP
\hskip1cmSPTQEGGPGQ NALP-2009
Esta secuencia se obtiene de un alelo que
codifica un canal de calcio de tipo P/Q humano. Se entiende que en
los canales P/Q correspondientes se incluyen secuencias similares de
otras especies de mamíferos, y en el procedimiento de la invención
pueden usarse péptidos obtenidos de estas especies, así como de
variantes alélicas de la secuencia mostrada anteriormente. En
general, se prefiere utilizar péptidos que contienen secuencia
obtenida de la secuencia mostrada anteriormente que son al menos
homólogos al 90%, preferentemente homólogos al 95%, más
preferentemente homólogos al 97% y más preferentemente homólogos al
99% con la secuencia mostrada anteriormente, o un fragmento de los
mismos en la medida en que se incluya el tetrapéptido requerido.
Los procedimientos para realizar el ensayo una
vez que se dispone del péptido, preferentemente mostrados en
células o en un soporte sólido, son bien conocidos en la técnica.
Como se ha observado anteriormente, la unión de los compuestos
puede evaluarse directamente proporcionándoles marcas, o, por
ejemplo, usando ensayos homogéneos en los que el péptido en sí está
marcado y la detectabilidad de la señal adscrita a la marca está
afectada por el péptido que se encuentra en un estado ligado o no
ligado. Alternativamente, y tal vez de modo más conveniente, la
unión puede evaluarse por la capacidad del compuesto de inhibir la
unión de un ligando del que se sabe que se une al péptido P/Q, y
específicamente a la parte esencial del tetrapéptido del mismo.
Dichos "ligandos" incluirían anticuerpos específicos para este
epítopo, incluyendo anticuerpos en diversas formas como, por
ejemplo, regiones Fv monocatenarias, fragmentos Fab, etc., la
proteína Homer que es el ligando nativo o, de hecho, cualquier
compuesto para el que se haya determinado anteriormente que se une a
este sitio. Se conoce una amplia diversidad de procedimientos de
detección para dicha inhibición de unión de ligando conocido.
Normalmente, el ligando conocido en competencia está marcado, y una
disminución en la marca unida al soporte sólido (si el péptido
tiene este soporte) proporciona una valoración de dicha inhibición.
Las marcas pueden incluir marcas fluorescentes, marcas
cromogénicas, marcas de enzimas, marcas de radioisótopos y
similares. De nuevo, pueden ser convenientes ensayos homogéneos.
Por ejemplo, se conocen ensayos de inactivación por fluorescencia en
los que tanto el péptido como el ligando en competencia contienen
marca. La invención reside en la naturaleza del péptido usado como
diana, no en el diseño específico del ensayo de detección
selectiva.
Los compuestos que se identifican en esta
detección selectiva influirán claramente en el estado de la
señalización en la ruta neuronal de un sujeto al que se administran
estos compuestos. El sujeto puede ser un animal de laboratorio
usado para estudiar pautas de aprendizaje y memoria, como ratas,
ratones y conejos. El sujeto puede ser también un sujeto humano en
el que se desea alterar un déficit de memoria o aliviar algún otro
trastorno fisiológico. La administración de dichos compuestos a
sujetos se realiza mediante procedimientos estándar y usa
formulaciones como las de Remington's Pharmaceutical
Sciences, última edición, Mack Publishing Co., Easton, PA. Así,
los compuestos identificados usando el procedimiento de la invención
podrían administrarse, por ejemplo, a modelos murinos de dolencias
con base en el SNC específico o con base en otras condiciones
neurológicas y el efecto de dichos compuestos en el modelo elucidará
los mecanismos asociados a la dolencia.
Los solicitantes de la presente memoria
descriptiva han verificado la naturaleza de la elevación de
expresión de sintaxina-1A a través del tránsito de
iones de calcio del canal de iones P/Q, como sigue:
Primero, se demostró que la expresión transitoria
de canales de calcio \alpha_{1A} (tipo P/Q) calcio en células
HEK293 tuvo como resultado una inactivación negativa de estado
estacionario que, a su vez, sugería una interacción correspondiente
con sintaxina. Esto se confirmó mediante incubación con toxina del
botulismo C1 que desplazó la inactivación de estado estacionario,
pero no afectó a la dependencia del voltaje de la activación actual.
Además, estos resultados se vieron afectados según se esperaba por
la presencia de un constructo de sintaxina antisentido.
Se mostró además que la
sintaxina-1A no se expresaba endógenamente en
células HEK293, mientras que la presencia de la proteína
sintaxina-1A se detectó en células HEK293
transfectadas con el canal de calcio de tipo P/Q \alpha_{1A};
también se detectó ARNm correspondiente a
sintaxina-1A, pero se inhibió cuando las células se
incubaron en actinomicina D. La sintaxina-1A fue la
única proteína SNARE producida en estas células; no se detectaron
sintaxina-1B, SNAP-2S,
sinaptofisina, VAMP y sinaptotagmina.
No hubo evidencia de producción de
sintaxina-1A en células HEK293 transfectadas con
subunidades \alpha_{2}\delta o \beta_{1B} de canales de iones
de calcio. Las células transfectadas con los canales de tipo T
\alpha_{1B} (tipo N); \alpha_{1C} (tipo L); \alpha_{1E} (tipo
nuevo); y \alpha_{1G} y \alpha_{11} tampoco lograron producir
ARNm de sintaxina-1A. La posibilidad de que la
especificidad de canales de tipo P/Q en la inducción de producción
de sintaxina-1A se eliminó usando controles
apropiados.
En presencia de varios antagonistas de canales de
tipo P/Q seleccionados, la producción de
sintaxina-1A, ARNm o proteína fue indetectable.
Se confirmó que la presencia de los canales de
tipo P/Q en células HEK293 transfectadas tuvo como resultado una
concentración potenciada de iones de calcio intracelular. Parece que
esta concentración potenciada de iones de calcio intracelular que
tiene como resultado producción de sintaxina-1A como
ionomicina a concentraciones de 10 nM-2 \muM, que
potencia no específicamente la concentración de iones de calcio
intracelular, definió un límite discreto superior e inferior de
inactivación dependiente de iones de calcio intracelular con
activación máxima aparecida a niveles de 50-200
nM.
Habiendo establecido que la expresión del gen de
sintaxina-1A se induce específicamente mediante
flujo de calcio mediado por canales de iones P/Q, los solicitantes
elucidaron la ruta de transducción subsiguiente usando agentes que
alteran la concentración de calcio intracelular. La aplicación de
tapsigargina estimuló la expresión de sintaxina-1A
en células no transfectadas y en células transfectadas \alpha_{1A}
para BAPTA-AM y EGTA-AM bloqueó la
inducción dependiente del calcio de sintaxina-1A.
Cafeína o carbacol activaron liberación de calcio a partir de
depósitos sensibles de rianodina e IP3 rápidamente y estimularon los
niveles de ARNm de sintaxina-1A en células no
transfectadas. Esto se inhibió usando agentes que bloquean la
liberación a partir de estos depósitos. En general, los datos
precedentes sugieren que un nivel discreto de aflujo de calcio
específico de albahaca \alpha_{1A} induce expresión de
sintaxina-1A a través de una liberación de calcio
secundaria desde depósitos intracelulares. La expresión de
sintaxina-1A en las células transfectadas
\alpha_{1A} podría inhibirse con compuestos de los que se conoce
que bloquean la actividad de tirosincinasa, calmodulina o las
actividades de CAMK II/IV o PKA. Los activadores de PKA indujeron
ARNm de sintaxina incluso en ausencia de transfección
\alpha_{1A}. La activación de proteína cinasa C no induce
expresión. Una parte de la ruta de transducción puede implicar
también el factor de transcripción CREB, ya que se determinó que el
nivel de CREB fosforilado está regulado por incremento en las
células HEK transfectadas.
Los resultados precedentes en células
transfectadas HEK293 estaban correlacionados con los canales de tipo
P/Q endógenos en neuronas. La sintaxina-1A se
expresa basalmente en células de gránulos cerebelosos, pero se
inhibe con \omega agatoxina IVA, de la que se sabe que inhibe
específicamente los canales de tipo P/Q de calcio. Los inhibidores
de canales de tipo N o L no bloquean la expresión dependiente del
calcio de sintaxina-1A. El tratamiento de estas
células de gránulos cerebelosos, que se han incubado en \omega
agatoxina IVA con tapsigargina recuperaron la expresión de
sintaxina-1A.
La expresión de sintaxina-1A se
inhibió por los mismos agentes que la inhibieron en células HEK293
que incluyen inhibidores de liberación de calcio inducidos por
rianodina o IP_{3} a partir de depósitos de CaM cinasa II/IV, y
de PKA o MAPKK.
En resumen, el aflujo de calcio selectivo de tipo
P/Q induce la expresión de sintaxina-1A, pero no de
otras proteínas SNARE implicadas en la fusión de vesículas y
liberación de neurotransmisores. Parece estar bajo un estrecho
control espacial y temporal dependiente del calcio y está mediado
aparentemente por una asociación con depósitos de calcio
intracelular.
Además, los solicitantes han identificado la
etapa crítica inicial en la ruta de transducción que es la unión de
la proteína Homer con un sitio específico en la subunidad de canal
\alpha_{1A} proximal al término C. La disponibilidad de un
péptido que contiene este sitio permite la identificación de
compuestos que son útiles para elucidar rutas neuronales, y en la
modulación del SNC en sujetos en general, incluyendo el tratamiento
de trastornos del SNC, especialmente los que implican el
aprendizaje y la memoria.
<110> NeuroMed Technologies, Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTOS PARA IDENTIFICAR
COMPUESTOS QUE MODULAN LA ACTIVIDAD NEURONAL
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 49324-9
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/CA00/01233
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-10-13
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/159.095
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-10-13
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Tyr Arg Gln Ser Lys Ala Lys Lys Leu Gln
Ala Met Arg Glu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\sac{Gln Asp Arg Thr Pro Leu Met Phe Gln Arg Met
Glu Pro Pro Ser Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\sac{Thr Gln Glu Gly Gly Pro Gly Gln Asn Ala Leu
Pro}
Claims (13)
1. Un procedimiento para identificar
compuestos que afectan al aprendizaje y la memoria, comprendiendo
dicho procedimiento
puesta en contacto de un compuesto candidato con
un péptido que comprende el sitio de unión para Homer proximal al
término carboxi de un canal de iones de calcio P/Q de mamífero;
en el que dicho péptido comprende la secuencia de
aminoácidos PLMF y no más de 20 aminoácidos corriente arriba y/o
corriente debajo de la secuencia PLMF en dicho canal de iones P/Q;
o
en el que el péptido es al menos homólogo al 90%
con el péptido 1966-YYRQSKAKKL QAMREEQDRT
PLMFQRMEPP SPTQEGGPGQ NALP-2009 o un fragmento del mismo, siempre que dicho péptido comprenda la secuencia PLMF y no más de 20 aminoácidos corriente arriba y/o corriente abajo de dicha secuencia PLMF; y
PLMFQRMEPP SPTQEGGPGQ NALP-2009 o un fragmento del mismo, siempre que dicho péptido comprenda la secuencia PLMF y no más de 20 aminoácidos corriente arriba y/o corriente abajo de dicha secuencia PLMF; y
determinación de si dicho compuesto se une a
dicho péptido;
en el que un compuesto candidato que se une a
dicho péptido se identifica como un compuesto que afecta al
aprendizaje o la memoria.
2. El procedimiento de la reivindicación
1 en el que dicha puesta en contacto es en presencia de un ligando
del que se sabe que se une a dicho péptido, y dicha determinación
comprende la valoración de la capacidad de un compuesto candidato
de desplazar a dicho ligando.
3. El procedimiento de la reivindicación
1 en el que la secuencia PLMF está flanqueada por 10 aminoácidos
corriente arriba y/o corriente abajo de la secuencia PLMF en dicho
canal de iones P/Q.
4. El procedimiento de la reivindicación
1 en el que el péptido es al menos homólogo al 95% con el péptido
1966-YYRQSKAKKL QAMREEQDRT PLMFQRMEPP
SPTQEGGPGQ NALP-2009 o un fragmento del mismo que
comprende PLMF.
5. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 en el que el péptido se muestra en células
que contienen un sistema de expresión recombinante que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica dicho péptido unido de forma
operativa a secuencias que realizan la expresión.
6. Un péptido que comprende la secuencia
de aminoácidos PLMF y no más de 20 aminoácidos corriente arriba y/o
corriente abajo de la secuencia PLMF en un canal de iones P/Q; o un
péptido homólogo al menos al 90% al péptido
1966-YYRQSKAKKL QAMREEQDRT PLMFQRMEPP
SPTQEGGPGQ NALP-2009 o un fragmento del mismo,
siempre que dicho péptido comprenda la secuencia PLMF y no más de 20
aminoácidos corriente arriba y/o corriente abajo de dicha secuencia
PLMF.
7. El péptido de la reivindicación 6 en
el que la secuencia PLMF está flanqueada por secuencias de 10
aminoácidos correspondientes a los situados inmediatamente corriente
arriba y corriente abajo de la secuencia PLMF en dicho canal de
iones de calcio P/Q.
8. El péptido de la reivindicación 6 que
es homólogo al menos al 95% a la secuencia
1966-YYRQSKAKKL QAMREEQDRT PLMFQRMEPP
SPTQEGGPGQ NALP-2009 o un fragmento del mismo que
contiene PLMF.
9. Anticuerpos específicamente
inmunorreactivos con el péptido de cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8.
10. Un sistema de expresión recombinante
para un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicho péptido
unido de forma operativa a secuencias que realizan la
expresión.
11. Células que comprenden el sistema de
expresión de la reivindicación 10.
12. Un procedimiento para producir un
péptido que comprende el sitio de unión para Homer, comprendiendo
dicho procedimiento el cultivo de células de la reivindicación 11 en
condiciones en las que se produce un péptido.
13. Células obtenidas por el procedimiento
de la reivindicación 12 que muestran dicho péptido.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15909599P | 1999-10-13 | 1999-10-13 | |
| US159095P | 1999-10-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2253263T3 true ES2253263T3 (es) | 2006-06-01 |
Family
ID=22571069
Family Applications (1)
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