ES2252234T3

ES2252234T3 - Procedimiento de preparacion de composiciones para la reparacion y regeneracion de tejidos animales.

Info

Publication number: ES2252234T3
Application number: ES01934009T
Authority: ES
Inventors: Christoph Andree; Matthias Voigt; G. Bjorn Stark
Original assignee: Universitaetsklinikum Freiburg
Current assignee: Universitaetsklinikum Freiburg
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2021-05-23
Also published as: JP2012021034A; US20040043007A1; DE60114193D1; AU2001260328A1; JP2004531453A; AU2007201342A1; AU2007201342B2; JP4951185B2; EP1292340A1; DE10025609A1; CA2410000A1; DE60114193T2; JP2008208145A; ATE306946T1; EP1292340B1; CA2410000C; WO2001089593A1

Abstract

Método para la preparación de una composición para la curación de heridas y para la reparación y regeneración de tejido de mamíferos, método que comprende las siguientes etapas: a. provisión de un ADN plasmídico en forma sustancialmente pura que codifica un gen que tiene un efecto positivo en la progresión de la regeneración del tejido, b. provisión de un componente/componentes de un biopolímero autoendurecible, y c. provisión de una suspensión celular con células que promueven la regeneración, caracterizado porque los componentes (a), (b) y (c) se incuban unos con otros simultánea o sucesivamente de modo que el plásmido y la suspensión celular se obtienen homogéneamente distribuidos en uno de los componentes del biopolímero.

Description

Procedimiento de preparación de composiciones para la reparación y regeneración de tejidos animales.

La presente invención se refiere a sistemas de transfección mediada por matriz, en los que la matriz está compuesta de un biopolímero autoendurecible. Además, la invención se refiere a un método para producir un preparado que contiene ADN plasmídico, un componente del material autoendurecible, y una suspensión celular de las células que se han de transfectar, al preparado en sí y a su utilización para tratar lesiones y cambios en tejidos.

En particular, la presente invención se refiere a un sistema de transfección mediada por fibrina para células para mejorar la curación de heridas, la regeneración de tejidos y la reparación de tejidos.

Antecedentes de la invención

En medicina, los defectos tisulares y su tratamiento constituyen un gran problema. Tanto en las intervenciones quirúrgicas como a consecuencia del desgaste, de influencias externas tales como lesiones provocadas por quemaduras, golpes, etc., se producen los correspondientes traumas en el tejido, cuya curación y regeneración es decisiva. También en numerosas enfermedades hay tejidos que resultan dañados, pudiendo mencionarse a modo de ejemplo la psoriasis y la artritis.

Por lo tanto, uno de los objetivos es desarrollar métodos y posibles modos de mejorar y acelerar estos procesos de curación y regeneración. Especialmente cuando hay grandes áreas de tejido dañado, tales como los daños en la piel, daños en los huesos, daños en los cartílagos, o en personas que tengan una predisposición a ello, cuya propia capacidad de regeneración y curación esté limitada, es necesario apoyar este proceso natural, en particular también desde el punto de vista de que esta regeneración debería ser tal que no difiriera de su entorno natural, es decir que no tuviese como resultado un tejido restringido o alterado, por ejemplo la formación de una cicatriz, debido a un crecimiento antinatural. Con este fin, se utilizan matrices destinadas, por ejemplo, a apoyar el proceso de curación. Con frecuencia, estas matrices se construyen de modo que liberen factores que ayuden positivamente al proceso de curación.

En los métodos convencionales se utiliza, por ejemplo, un trasplante de queratinocitos para quemaduras de gran superficie. Éstos se aplican a la herida en forma de injertos autólogos o alogénicos. Estas células se injertan en la herida en forma de, así llamadas, hojas, es decir en forma de múltiples capas de células. Con este fin, es necesario obtener previamente queratinocitos del individuo, aislarlos y cultivarlos in vitro para formar hojas celulares multicapa que incluyan una matriz de soporte para que a continuación puedan injertarse en la herida.

Otro posible modo de acelerar la regeneración del tejido dañado es la administración externa de factores promotores. Por una parte, estos factores pueden promover el crecimiento de las células implicadas en el proceso de regeneración. Por otra parte, estos factores pueden inhibir también procesos que contrarrestan la regeneración rápida. Hasta la fecha, estos factores, que principalmente son factores de crecimiento, se suministraban al tejido dañado de muy distintas maneras, tales como por ejemplo mediante aplicación externa. Sin embargo, esto tiene la desventaja de tener que suministrar dosis elevadas. Además, la mayoría de estos factores tienen una vida media in vivo corta, por lo que eran necesarias múltiples administraciones. Cuando se administran factores externamente, existe también el riesgo de que puedan contener contaminantes. En ambos casos, tanto en la depuración de material a partir de fuentes naturales como en la producción recombinante de los factores, existe el riesgo de que los preparados contengan contaminantes que puedan afectar negativamente a la progresión de la regeneración. Por consiguiente, la administración externa de mediadores, tales como los factores de crecimiento, ha demostrado ser un sistema poco eficaz, principalmente también considerando que algunos mediadores no pueden en absoluto administrarse exter-
namente.

Por lo tanto, recientemente se ha intentado producir estos factores de crecimiento in vivo mediante una transfección de células (transferencia génica). Andree et al. (PNAS, 91, pág. 12188-12192, 1994) lograron demostrar que la transferencia in vivo de un plásmido que contiene un gen que codifica para un factor de crecimiento para la epidermis en queratinocitos mejora la curación de heridas en el modelo animal. La transferencia génica se realizó por un método convencional, mediante una, así llamada, "pistola génica", en el que los plásmidos acoplados a un portador se aplican a la herida y se introducen en las células presentes en la misma. Posteriormente, las células se transfectan de forma inespecífica con los plásmidos. A pesar de la rápida curación de la herida, se ha observado que con este sistema de transfección el factor sólo es expresado por células que se hallan en los bordes de la herida en ese momento determinado.

Además, con este método no es posible realizar una transfección específica. Sin embargo, es deseable una administración sistemática de factores. Para ello resulta especialmente adecuada la transfección de células.

Sin embargo, hasta la fecha sólo se conocían sustancialmente métodos de transfección celular en los que el ADN se introducía en la célula por medio de portadores externos. Pero al hacerlo así, también se introduce en la célula el portador, lo que puede tener consecuencias negativas.

Entre los métodos de transfección ya conocidos se incluye la transfección vírica con retrovirus, adenovirus u otros virus. En la transfección de célula eucariotas, el mayor problema es la eficacia de la transfección. Especialmente con los vectores víricos, su tropismo, es decir su afinidad con relación a ciertos tipos de células, continúa siendo uno de los principales problemas. Por este motivo, ya se están utilizando vectores adenovíricos que tienen un amplio tropismo y también son capaces de transfectar células tales como miocitos, hepatocitos, células sinoviales, células epiteliales y similares. Por otra parte, los adenovirus son capaces de transfectar células que no se dividen. Pero la transfección de células por medio de vectores víricos presenta también ciertas desventajas. Dado que la posición en la que se produce la integración del vector es aleatoria, es posible que estas células se vean transformadas y se cambien genes críticos para la vida de la célula. Los virus y vectores víricos pueden presentar una alta tasa de polimorfismo, lo que puede tener como resultado genes o vectores inactivos. Como ya se ha mencionado, el tropismo de los vectores víricos es un problema adicional.

Los adenovirus, aunque son capaces de transfectar células no proliferativas, también presentan las desventajas arriba mencionadas para los vectores víricos, es decir que se integran aleatoriamente en el genoma de la célula diana. Con ello pueden destruirse otros genes importantes. Las tasas de polimorfismo en virus son altas y por último, en orden aunque no en importancia, estos virus preparados por recombinación han de propagarse y tratarse para la transfección.

Otros sistemas de transfección con composiciones no víricas son, por ejemplo, los métodos mediados por liposomas (por ejemplo Lipofektin®). Una desventaja de estos liposomas es, por ejemplo, una citotoxicidad remanente del agente de transfección liposomal que afecta a las células diana. Esto significa que las células que se han de transfectar (células diana) resultan dañadas por el propio agente de transfección, lo que les causa la muerte.

Además, se han descrito sistema policatiónicos, sistemas que utilizan calcio (precipitados de calcio-fosfato-ADN), transfecciones por DEAE-dextrano y otros.

Como métodos mecánicos para la transfección de células se conocen los métodos de electroporación de células o la pistola génica arriba mencionada.

Con el método de la pistola génica es posible disparar el ADN desnudo o el ADN asociado a liposomas u otras moléculas portadoras directamente a las células que se han de transfectar. Aunque este método permite en parte la transfección de células sin un portador, se trata de una transfección aleatoria de la célula que no permite determinar la cantidad de material transfectado. Tampoco hay especificidad del sistema, principalmente en la transfección transitoria de células. La transfección por medio de la electroporación presenta la desventaja de que la transfección se realiza in vitro, en un aparato especial. En primer lugar han de propagarse las células. Esto requiere varias etapas de proceso, y el riesgo de una contaminación de la suspensión celular es alto. Se han hecho intentos de transfectar ADN directamente en células sin la utilización de agentes auxiliares. Pero con este procedimiento, la eficacia de la transfección es demasiado pequeña. Por lo tanto, es necesario desarrollar otros sistemas de transfección que superen las desventajas arriba mencionadas.

En el documento WO 97/38729 se explica que es posible conseguir una mayor eficacia de transfección de células si el paciente a tratar recibe el plásmido junto con una matriz. Las células que migran a la región dañada en la que se ha aplicado dicha matriz junto con el plásmido presentarán una transfección más eficaz. Con este método, es necesario que las células migren a la matriz para absorber el plásmido. Esto significa también que no hay distribución homogénea de las células durante la regeneración de la región dañada, sino que las células se transfectarán partiendo del borde. Así pues, no se trata de una transfección simultánea de las células.

En el documento DE 197 16 098 A1 se explica que es posible utilizar fibroblastos transfectados con un gen extraño para el tratamiento de heridas, gen extraño que codifica un factor promotor de la curación de heridas. Sin embargo, estos fibroblastos constituyen meramente un medio cuya función es evitar la administración externa del factor que promueve la curación de heridas. Los propios fibroblastos administrados se han irradiado con el fin de que ya no puedan dividirse. Así pues, ellos mismos no participan como células en la curación de heridas. Además, la línea celular de fibroblastos descrita en el documento DE 197 16 098 constituye una línea celular inmortalizada que se transfecta de modo permanente con el plásmido. Sin embargo, una transfección permanente de las células no siempre es deseable y en su lugar es preferible una transfección transitoria de las células para que la expresión del factor codificado por el plásmido se produzca sólo durante cierto espacio de tiempo. Una vez curada la herida, no es deseable que continúe la expresión de este factor. Por el contrario, esto podría, por ejemplo, promover la formación de una cicatriz y una formación anormal no deseada de la estructura tisular.

Recientemente, Horch et al. (Cell Transplantation, 7, 3, pág. 309-317, 1998) explicaron que, en el modelo animal del ratón desnudo, una suspensión monocelular de queratinocitos cultivados se había aplicado a la herida con ayuda de un adhesivo de fibrina. De este modo ha sido posible reconstruir una epidermis de buena calidad. Con este método, ya se ha hecho posible acortar el espacio de tiempo entre la retirada de las células y el transplante de las células expandidas. Así pues, uno de los objetivos de la presente invención ha sido proporcionar un sistema sencillo e inmediatamente disponible con el que, con unos requisitos de tiempo mínimos y con la menor intervención quirúrgica posible, en pacientes que padecen lesiones importantes - agudas o crónicas - en tejidos, se proporcionan células, en particular células autólogas, transfectadas con genes que codifican para sustancias que ejercen un efecto positivo en la curación de heridas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para la preparación de una composición para la curación de heridas y para la reparación y regeneración de tejidos. Según la invención, esto se logra mediante las siguientes etapas:

a.: provisión de un ADN plasmídico que codifica un gen que tiene un efecto positivo en la progresión de la regeneración del tejido, sustancialmente en forma pura,

b.: provisión del componente/de los componentes de un biopolímero autoendurecible, y

c.: provisión de una suspensión celular con células que promueven la regeneración,

caracterizado porque los componentes (a), (b) y (c) se incuban unos con otros simultánea o sucesivamente de modo que el plásmido y la suspensión celular se obtienen homogéneamente distribuidos en uno de los componentes del biopolímero.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición para la curación de heridas, y para la reparación y regeneración del tejido dañado en sí. Esta composición comprende

a.: un ADN plasmídico que codifica un gen que tiene un efecto positivo en el desarrollo de la curación de heridas y en la reparación y regeneración del tejido, en forma sustancialmente pura;

b.: el o los componentes de un biopolímero autoendurecible, y

c.: una suspensión celular de células implicadas en la curación de heridas y en la reparación y regeneración del tejido dañado.

En otro aspecto de la invención, esta preparación puede utilizarse para el tratamiento de tejido dañado y para el tratamiento de heridas. Además, la invención se refiere a un kit que contiene un plásmido que comprende un gen que codifica para una sustancia, preferentemente para una proteína, que tiene un efecto positivo en el proceso de curación de las heridas y en el proceso de regeneración del tejido dañado, una suspensión celular de células implicadas en la regeneración del tejido dañado y un componente de un biopolímero autoendurecible, así como opcionalmente el segundo componente de dicho biopolímero que se requiere para o que facilita el endurecimiento o la solidi-
ficación.

Además, la presente invención se refiere a la fabricación de un medicamento para tratar defectos tisulares utilizando una composición preparada según la presente invención, una composición farmacéutica según se define en la misma o un kit según la presente invención.

Descripción de las figuras

Fig. 1: Transfecciones in vitro de queratinocitos humanos cultivados, con el plásmido EGF, utilizando el sistema de transfección según la invención. Las células se incubaron durante 3 h con el plásmido EGF humano en el componente de trombina (grupo 1a) o con plásmido EGF sin trombina (grupo 2a) o con células sin plásmido y sin trombina (grupo 3a). Los niveles de proteína EGF se midieron los días 1, 3, 5, 6, 10 y 14.

Fig. 2: Transfección in vitro de queratinocitos humanos no cultivados, con el plásmido EGF, utilizando el sistema de transfección según la invención. Las células se incubaron durante 3 h con plásmido EGF humano en el componente de trombina (grupo 1b) o con plásmido EGF sin trombina (grupo 2b) o con células sin plásmido y sin trombina (grupo 3b). Los niveles de proteína EGF se midieron los días 1, 2, 3, 4, y 5.

Fig. 3: Transfección in vivo de queratinocitos humanos cultivados, con plásmido hEGF, utilizando el sistema de transfección según la invención. En el grupo 1a, las células se incubaron con EGF, posteriormente se suspendieron en el componente de trombina del adhesivo de fibrina y se transplantaron a una herida completa de ratón desnudo. Se realizaron biopsias los días 1, 3, 5 y 7 y los niveles de proteína en las heridas homogeneizadas se determinaron por medio de ELISA. Se trataron heridas de control (grupo 2a) con células que habían sido preincubadas con plásmido de b-galactosidasa humana.

Fig. 4: Transfección in vivo de queratinocitos humanos no cultivados, con plásmido EGF humano. En el grupo 1b, las células se incubaron con EGF, posteriormente se suspendieron en el componente de trombina del adhesivo de fibrina y se transplantaron a una herida completa de ratón desnudo. Se realizaron biopsias los días 1, 3, 5 y 7 y los niveles de proteína en las heridas homogeneizadas se determinaron por medio de ELISA. Se trataron heridas de control (grupo 2b) con células que habían sido preincubadas con plásmido de b-galactosidasa humana.

Fig. 5: Determinación sobre la concentración óptima de queratinocitos. Se transfectaron distintas cantidades de queratinocitos con 200 \mug de plásmido EGF en 5,7 \mul de tampón PBS y se preincubaron durante 3 horas. El volumen de coagulación fue de 333 \mul, la expresión de EGF se midió a los 1, 3, 5 y 7 días.

Figuras 6 - 9: Histologías de la reepitelización de heridas completas realizadas después de distintos tratamientos (grupos 1 - 4), según se describe en el ejemplo 1. Para todos estos estudios, la cantidad de fibrina utilizada fue de 333 \mul, la cantidad de plásmido EGF fue de 200 \mug y las biopsias se realizaron a los 12 días. Se utilizaron 2,5 au-
mentos.

Fig. 6: Tratamiento de heridas completas con fibrina y plásmido EGF (grupo 1).

Fig. 7: Tratamiento de heridas completas con fibrina y queratinocitos (grupo 2).

Fig. 8: Tratamiento de heridas completas con fibrina, plásmido EGF y células endoteliales (grupo 3).

Fig. 9: Tratamiento de heridas completas con fibrina, plásmido EGF y queratinocitos (grupo 4).

Fig. 10: Como la figura 9, pero con 10 aumentos.

Fig. 11: Transfección de distintos tipos de células con el sistema de transfección según la invención.

Definiciones de términos utilizados en la presente invención

"Defectos tisulares" incluye aquí tanto las heridas completas como las que se producen, por ejemplo, en quemaduras de gran superficie, y también otras lesiones cutáneas, así como los daños sufridos en huesos, cartílagos, nervios y otros tejidos.

El "biopolímero autoendurecible" es un biopolímero biodegradable y biocompatible que según la invención se endurece o solidifica solo, mediante la adición o la presencia de un segundo componente. Comprende tanto las composiciones naturales como las sustancias sintéticas.

Un "gen con un efecto positivo" en la regeneración del tejido dañado o defectuoso incluye todas las secuencias de ADN que tienen un efecto promotor en la regeneración cuando se traducen como una proteína o un polipéptido, pero también como una molécula antisentido o como una ribozima.

"Células implicadas en la curación de heridas" incluye tanto las células que se forman nuevamente en el tejido como las células capaces de inhibir factores negativos.

"Células de reparación" son células que están activamente implicadas en la curación apropiada de heridas y/o los procesos de reparación apropiados y que pueden estimularse y/o activarse utilizando el sistema de transfección según la presente invención.

"Células de soporte" son células que no están directa o activamente implicadas en la curación apropiada de heridas y/o los procesos de reparación apropiados.

En la reparación de la piel, por ejemplo, para acelerar el proceso de reepitelización, una pareja de células de reparación/soporte apropiada sería queratinocitos/células endoteliales. Otras parejas apropiadas de células de reparación/soporte han de definirse de acuerdo con la herida/el tejido que se haya de curar, reparar y/o regenerar.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un nuevo método que no requiere un componente adicional para la transfección de las células in vitro, es decir que no requiere medios auxiliares tales como vectores víricos, liposomas, etc., ni métodos tales como, por ejemplo, la electroporación. Además, tampoco se requieren sustancias mediadoras de transfección, tales como por ejemplo la polilisina. El método según la invención para la transfección de células por medio de plásmidos se efectúa mediante una matriz de biopolímero autoendurecible. Esta transfección puede realizarse tanto in vitro como in vivo, pero preferiblemente la transfección se realiza ex vivo. Lo decisivo es que una composición que comprende los componentes arriba indicados juntos, es decir las células, el plásmido y la matriz de biopolímero autoendurecible o un componente de la misma, respectivamente, se aplica en o al área dañada. De este modo, las células se han transfectado antes de injertar la composición en la región dañada, o bien la transfección se produce inmediatamente después de administrar la composición al tejido dañado, y preferentemente la transfección de la célula se realiza ex vivo para que las células uniformemente distribuidas se hallen en un estado transfectado. El biopolímero autoendurecible puede estar ya endurecido o solidificado o gelificado al administrarse al área de tejido dañada o al defecto tisular. Sin embargo, el endurecimiento también puede producirse después de administrar la composición al área que se ha de tratar. No obstante, la composición también puede presentarse en dos componentes, de los cuales uno contiene el biopolímero autoendurecible, las células y el plásmido, y el segundo contiene un compuesto adicional para el endurecimiento del biopolímero. Sin embargo, el segundo componente también puede proporcionarlo el propio tejido que requiere tratamiento, por así decirlo in vivo, como por ejemplo la trombina en un adhesivo de fibrina, que entonces permitirá el endurecimiento del biopolímero in vivo. La última posibilidad es una forma preferida en mayor medida.

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Por otra parte, la presente invención proporciona un sistema de transfección transitoria que comprende un ADN plasmídico que codifica para un gen que tiene un efecto positivo en la progresión de la regeneración del tejido, una suspensión de células que se han de transfectar y un biopolímero autoendurecible. En particular, la invención se refiere a un sistema de transfección que comprende células implicadas en la curación de heridas y en la regeneración y reparación de defectos tisulares, en particular de la piel, con un plásmido que codifica un gen que codifica para una sustancia a expresar, y un biopolímero autoendurecible, como por ejemplo un componente/componentes de un adhesivo de fibrina.

El componente del biopolímero autoendurecible permite una mejor penetración del plásmido/absorción por las células. El plásmido no unido es absorbido por las células más fácilmente, la tasa de transfección se mejora considerablemente sin la utilización de sustancias mediadoras o promotoras de transfección adicionales.

Con la ayuda de este sistema de transfección es posible además aplicar homogéneamente al área dañada células transfectadas que aceleran la curación de la herida y la regeneración del tejido dañado. De este modo es posible cubrir totalmente la región dañada, como por ejemplo una herida completa, con lo que la curación de la herida y la regeneración del tejido dañado o defectuoso se realizarán con rapidez. En este caso, la sustancia expresada por las células transfectadas acelera la curación. El sistema de transfección según la invención permite también la producción ex vivo de estructuras celulares vivas, es decir de células transfectadas, sin la utilización de otras sustancias mediadoras o promotoras de transfección que no sean el componente biopolímero.

Para precisar más, la presente invención proporciona un sistema sencillo e inmediatamente disponible con el que, con unos requisitos de tiempo mínimos y con la menor intervención quirúrgica posible, en pacientes que padecen heridas importantes por quemadura o heridas crónicas, se proporcionan células autólogas que son o han sido transfectadas con genes que codifican para proteínas o péptidos, respectivamente, que tienen un efecto positivo en la curación de heridas.

La ventaja de la presente invención reside en la rápida disponibilidad de células transfectadas autólogas/alogénicas que tienen la capacidad de reparar defectos celulares y proporcionar al mismo tiempo las sustancias necesarias mediante autosíntesis en una forma óptima. Además, la distribución homogénea de las células transfectadas hace posible lograr rápidamente un efecto terapéutico. Esto es particularmente aplicable a la curación de heridas de la piel. Con ayuda de este sistema se aumenta la disponibilidad inmediata de células transfectadas, sin necesidad de complejos procedimientos de tecnología de laboratorio ni métodos de cultivo y selección previos, que requieren mucho tiempo y que, además, presentan el riesgo de contaminación y suponen una gran pérdida de tiempo.

Además, la presente invención comprende un kit que contiene los componentes del sistema de transfección, es decir un plásmido que comprende un gen/genes que codifica(n) para una sustancia, en particular para una proteína/un péptido, que tiene un efecto positivo en la regeneración del tejido, células diana transfectadas, así como el polímero autoendurecible o un componente del mismo, respectivamente.

El preparado obtenido por el método según la invención puede utilizarse para el tratamiento de tejido dañado o defectuoso, en particular heridas completas, por ejemplo de la piel. También permite el tratamiento de humanos y animales que presenten tejido dañado o defectuoso y heridas completas, en particular heridas de la piel. Entre los ejemplos de enfermedades o trastornos tratados con preferencia se incluyen las heridas por quemadura, defectos en huesos, músculos, nervios o cartílagos, heridas crónicas o aumentos de tejido, y se prefiere especialmente un método para la curación de heridas en la piel.

La composición obtenida según la invención permite el tratamiento terapéutico rápido de tejido lesionado o defectuoso. Especialmente debido a la distribución homogénea de las células transfectadas, es posible tratar rápida y homogéneamente heridas completas. En particular, también es posible reducir o evitar la poco estética formación de cicatrices en heridas completas.

Según una posible alternativa, las células diana transfectadas por medio del sistema de transfección según la invención ya están presentes en la matriz en forma transfectada. Estas células están homogéneamente distribuidas en la matriz, de modo que puede realizarse una curación homogénea. Así pues, según la invención, se aplica al tejido dañado una matriz que contiene las células diana transfectadas ex vivo que, a su vez, contienen genes que codifican para sustancias que tienen un efecto positivo en la regeneración del tejido defectuoso. Sin embargo, según otra alternativa, la transfección de las células también puede realizarse después de la aplicación en la matriz. Gracias a la distribución homogénea del plásmido y de las células, es posible una transfección homogénea de las células, que tendrá como resultado una expresión homogénea del factor que tiene un efecto positivo en el progreso de la regeneración.

Para la transfección de células hay diversos parámetros, como por ejemplo tampones, concentración de tampón, período de tiempo o relaciones entre tampón y componente polímero autoendurecible, que pueden optimizarse para los distintos tipos de células. Se ha descubierto especialmente que la presencia de CaCl_{2}, sobre todo en las pequeñas cantidades utilizadas, no influye en la eficacia de la transfección.

Según la invención, se ha de entender por "polímero autoendurecible" en particular una sustancia que, después del así llamado endurecimiento, tendrá propiedades físicas alteradas, por ejemplo una viscosidad diferente.

Así pues, el polímero autoendurecible se presenta después del endurecimiento, por ejemplo, como un gel, mientras que antes del endurecimiento la sustancia tenía una viscosidad diferente, en particular menor.

En particular pueden mencionarse los siguientes compuestos como biopolímero que puede ser autoendurecible y biodegradable: adhesivos de fibrina o componentes de los mismos, colágenos, gelatina, alginatos, ácido hialurónico, polisacáridos, polímeros orgánicos (por ejemplo PEG, PGA, PLA), derivados de los mismos y diversas combinaciones de estas sustancias, respectivamente. Los adhesivos tisulares basados en fibrinógeno se conocen, por ejemplo, por los documentos AT-B-359 653, AT-B-359 652 y AT-B-369 990. Además del fibrinógeno, contienen un factor que convierte el fibrinógeno en fibrina. Éste puede ser, por ejemplo, la trombina. Por acción de la trombina, el fibrinógeno contenido se convertirá en fibrina. El factor XIII opcionalmente contenido en el adhesivo tisular se activará en factor XIIIa. Este último reticula la fibrina formada para producir un alto polímero. La actividad de trombina necesaria se añadirá al fibrinógeno en forma de una solución que contiene trombina e ion Ca2+. Además, el fibrinógeno puede contener otras proteínas, tales como fibronectina, plasminógeno y albúmina.

El adhesivo tisular puede ser, por ejemplo, como el descrito en el documento DE 195 21 324 o en el documento EP 0 345 246; se prefiere particularmente un adhesivo de fibrina adquirible bajo la marca de fábrica Tissucol® de Baxter, Alemania.

El ADN plasmídico se mezcla preferentemente con el componente de trombina del adhesivo de fibrina. Así mismo, las células se añaden preferentemente al componente de trombina y se mezclan con él, dado que el componente de fibrinógeno tiene una mayor viscosidad. Sin embargo, el ADN plasmídico y la suspensión celular también pueden mezclarse con el componente de fibrinógeno. Si el ADN plasmídico y la suspensión celular se mezclan con el componente de fibrinógeno, la trombina puede ser proporcionada por el propio tejido que requiere tratamiento, es decir in vivo.

El biopolímero según la invención promueve la eficacia de transfección, pero al mismo tiempo se utiliza como matriz de cultivo para las células. Esto significa que la transfección y el cultivo se realizan in vivo en la misma matriz, y ya no se requieren otras etapas de depuración y aislamiento, ni tampoco se necesitan otros medios promotores de transfección. En particular, no se requieren sustancias mediadoras de transfección, tales como por ejemplo la polilisina, que actúen como un "mediador" entre la matriz y el plásmido. En otras palabras, el plásmido no se presenta unido a la matriz, sino como plásmido libre.

El componente de matriz puede presentarse en diversas formas, tanto en forma liofilizada como en forma líquida, como un polvo seco, micropartículas o nanopartículas. Además, el biopolímero puede presentarse ya como una matriz endurecida, una masa geloidea, que contenga las células transfectadas y el plásmido distribuidos homogéneamente. Pueden aplicarse combinaciones de plásmido-biopolímero al tejido respectivo bien conjuntamente o bien sucesivamente, en particular pueden pulverizarse sobre el mismo.

Entre las células que, según la invención, se utilizan en el método para producir el preparado y, por lo tanto, están contenidas en la composición según la invención se incluyen todos los tipos de células que tengan un efecto positivo en la regeneración de tejidos. En particular, éstas son queratinocitos, trombocitos, osteoblastos, osteoclastos, fibroblastos, células epiteliales y endoteliales, miocitos, adipocitos, mioblastos, células de Schwann, otras células conjuntivas, o precursores de las mismas etc. Se prefieren particularmente las células que desempeñan una función esencial en la curación de la piel, tales como los queratinocitos.

Las células son preferentemente células autólogas o alogénicas. Las células, como se han de utilizar según la invención, pueden haber sido previamente cultivadas o pueden ser recién aisladas, es decir no haber sido cultivadas.

El plásmido que contiene un gen/genes que codifica(n) para una sustancia que tiene un efecto positivo en la regeneración de tejidos puede ser un plásmido de expresión, como los utilizados convencionalmente para la expresión de genes en células eucariotas.

El gen/los genes o el ADN, respectivamente, contenidos en el plásmido pueden codificar para una proteína o proteínas o un péptido o péptidos, respectivamente, que tengan un efecto positivo en la regeneración de tejidos. En particular, este gen codifica para factores tales como factores de crecimiento, citoquinas, proteínas terapéuticas, hormonas y fragmentos peptídicos de hormonas, inhibidores de citoquina, factores de crecimiento peptídico y factores de diferenciación. A modo de ejemplo, pueden mencionarse aquí los siguientes: moléculas de la superfamilia TGF-\beta, tales como las diversas isoformas de TGF-\beta; queratinocito, hepatocito, factor de crecimiento epidérmico, PDGF, EGF, VEGF, NGF, eritropoyetina, TPA, FGF-1 y FGF-2. Además, hormonas, tales como la hormona del crecimiento, PTH, etc., péptidos que tengan actividades agonistas o antagonistas en receptores o en otras moléculas que desempeñen una función en procesos patológicos debido a una expresión alterada.

Estos factores pueden utilizarse individualmente o en combinación.

El plásmido puede contener una o varias secuencias de ADN que codifiquen uno o varios de los factores arriba indicados.

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Sin embargo, según la invención, también puede codificar un ARN antisentido o un ARN ribozima que entonces inhiba factores que dificulten la curación de las heridas.

El preparado según la invención y el kit según la invención pueden utilizarse especialmente para aplicaciones terapéuticas. Son adecuados para el tratamiento de tejido dañado o defectuoso, como por ejemplo huesos, cartílagos, músculos, nervios o partes de piel dañados o defectuosos, en particular son adecuados para la curación de heridas en la piel. Así pues, otro aspecto de la presente invención es la puesta a disposición de una composición farmacéutica para el tratamiento de tejidos defectuosos, que comprende un biopolímero autoendurecible, un plásmido con las propiedades arriba indicadas, y células diana, especialmente de reparación, implicadas en el proceso de regeneración del tejido defectuoso, en particular la curación de heridas en la piel.

Estas composiciones farmacéuticas pueden estar presentes en varios componentes. Aparte de las células diana que se añaden poco antes de utilizar el preparado farmacéutico, la composición farmacéutica puede suministrarse en forma líquida, liofilizada o congelada.

Entre los campos de aplicación de la composición farmacéutica se incluyen sobre todo la medicina humana, la medicina veterinaria y la medicina dental.

Las cantidades relativas de plásmido, componente biopolímero y células pueden ajustarse con exactitud, o variarse, respectivamente, dependiendo del tipo de tejido que se haya de tratar. Por ejemplo, la relación entre plásmido y componente biopolímero es de, como mínimo, 5 \mug/ml y preferentemente oscila entre 5 y 100 \mug/ml. Se prefiere particularmente un rango de 5-25 \mug/ml y niveles alrededor de 50 \mug/ml.

La relación entre células y plásmido oscila, por ejemplo, entre 25.000 y 2.500.000 células/\mug de plásmido. Los rangos preferidos son 25.000 - 75.000 células/\mug de plásmido, 75.000 - 100.000 y 250.000 - 750.000.

La relación entre células y componente biopolímero puede ajustarse también correspondientemente y optimizarse para cada tipo de célula y/o herida/tejido a tratar. El número de células por ml de biopolímero puede variar dentro de un amplio margen, por ejemplo entre 100.000 y 8 millones de células por ml de componente(s) biopolímero(s).

Para los queratinocitos, un rango preferido está entre 200.000 y 6 millones y se prefiere especialmente una cantidad de alrededor de 3 millones de células por ml de un componente biopolímero (= 6 millones de células por ml de un coágulo formado por una mezcla 1:1 de 2 componentes.

En particular, las relaciones dependen también de si se realiza una transfección in vitro o in vivo. In vivo, en particular, significa la transfección de las células añadidas a la matriz ex vivo, que están homogéneamente distribuidas en la matriz con el ADN plasmídico distribuido también homogéneamente.

Así pues, por ejemplo, la relación de células por ml de componente biopolímero en una transfección in vivo es 3-10 veces, preferentemente 4-6 veces, mayor que en la transfección in vitro. A continuación se describe la presente invención más detalladamente por medio de los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 Aumento de la tasa de transfección mediante la presencia de un biopolímero autoendurecible

Plásmido de expresión: En este ejemplo, se utilizaron como plásmidos de expresión pCMV\beta-Gal y CMVhEGF, ya descritos anteriormente por Andree et al. (supra). El plásmido de expresión EGF consiste en el promotor de transcripción muy precoz del CMV y codifica el péptido señal de secreción del factor de crecimiento humano (hGF) y el polipéptido EGF maduro en una fusión en marco.

Como adhesivo de fibrina se utilizó Tissucol® de Baxter, Heidelberg, Alemania. Este adhesivo de fibrina de dos componentes consiste en fracciones de proteína plasmática humana heteróloga y los componentes de fibrinógeno y de trombina. El componente de fibrinógeno contiene fibrinógeno, fibronectina plasmática, factor VIII, plasminógeno, aprotinina y albúmina humana. El componente de trombina se compone de trombina y cloruro cálcico.

Se obtuvieron preparados celulares de muestras de piel tras una cirugía plástica. Los queratinocitos se separaron de la dermis utilizando un 0,3% de dispasa (Boehringer, Mannheim, Alemania) después de 2 h de incubación a 40ºC. A continuación se obtuvieron células epidérmicas en forma de una suspensión monocelular utilizando un 0,05% de tripsina y un 0,02% de EDTA (GIBCO, Alemania) a 37ºC durante 30 minutos, que se resuspendieron en medio sin suero. Las células se utilizaron directamente o bien se cultivaron según los protocolos estándar (Horch et al., supra).

Grupo 1

Se mezclaron queratinocitos humanos cultivados (grupo 1a) y no cultivados (grupo 1b) con plásmido CMVh EGF durante 3 horas y a continuación se resuspendieron en el componente de trombina. Tras la resuspensión en trombina, el adhesivo de fibrina se colocó en una placa de 24 pocillos y se añadieron 2 ml de medio sin suero.

El medio se cambió cada 24 h y se sometió a una congelación súbita a -70ºC.

Grupo 2

Se resuspendieron queratinocitos cultivados y no cultivados (grupo 2a y grupo 2b, respectivamente) en 2 ml de medio, que contenía el plásmido CMVhEGF, y se incubaron durante 3 horas. A continuación, se colocaron las células en placas de 24 pocillos y el medio se cambió cada 24 horas y se sometió a una congelación súbita a -70ºC.

Grupo 3

Se resuspendieron queratinocitos cultivados (3a) y no cultivados (3b) en 2 ml de medio y luego se colocaron en placas de 24 pocillos. El medio se cambió cada 24 horas y se sometió convenientemente a una congelación súbita a -70ºC.

La concentración de ADN plasmídico ascendía a 20 \mug/ml de trombina. La proteína expresada se detectó in vitro con ayuda de un kit ELISA comercialmente disponible (Quantikin, R&D Systems, Minneapolis, EE.UU.).

Los resultados de la medición de la proteína EGF en el sobrenadante de cultivo están representados en la figura 1. Se ha demostrado que en el grupo 1 fue posible lograr un aumento hasta en un factor de 100 de la concentración de proteína EGF en relación con los grupos de control (grupo 2 y grupo 3). La máxima concentración de EGF se midió a las 24 h (grupo 1a: 102,14 \mug/ml; grupo 1b: 119,3 \mug/ml; control 5,1 y 2,26 \mug/ml, respectivamente). A los 5 días, se observó una disminución a 23,3 y 8,85 \mug/ml, respectivamente. La concentración de EGF, medida 14 días después de la incubación, mostró un mayor descenso para el grupo 1a, a 2,24 \mug/ml el día 14.

Ensayo in vivo de la tasa de transfección

Como animales de ensayo se utilizaron ratones desnudos de 6 a 8 semanas de edad.

Heridas y métodos de injerto

Se produjeron heridas en la piel (heridas completas) de 2x2 cm de tamaño en el lomo de los ratones desnudos anestesiados. Estas heridas se hicieron hasta el músculo panículo carnoso, y las comisuras de las heridas se cosieron para retardar la contracción de las heridas.

Las suspensiones de queratinocitos humanos, cultivados o no cultivados, se resuspendieron en la porción de trombina del adhesivo de fibrina. El componente de trombina contenía el plásmido de expresión pCMV\beta-Gal o bien el plásmido de expresión EGF. Siete heridas de cada grupo se cubrieron con queratinocitos cultivados o bien con queratinocitos no cultivados y los diversos plásmidos (tabla 2). Las heridas se cubrieron con una película adhesiva semipermeable (Op-site, Smith & Nephew, Largo, FL), que a continuación se fijó en su posición y se cubrió con una pomada antimicrobiana.

Se realizaron comprobaciones diarias para asegurar la integridad de la cubierta. Los grupos experimentales se injertaron con el plásmido hEGF (grupo 1a n=7, grupo 1b n=7) o bien con el plásmido pCMV\beta-Gal (grupo 2a n=7, grupo 2b n=7). La expresión del transgen EGF se controló los días 1, 3, 5 y 7 mediante una medición de la concentración de EGF en el producto de homogeneización de herida. Los días 1, 3, 5 (dos ratones en cada caso por grupo) y el día 7 (un ratón por grupo) se realizaron biopsias que incluían la totalidad de la herida, con el fin de obtener un producto de homogeneización de la herida y determinar así la proteína EGF. Por otra parte, se realizaron ensayos inmunohistoquímicos por medio de métodos histológicos convencionales. Los resultados se muestran en la figura 2. Como puede observarse, 24 horas después de la transformación con el plásmido EGF, los queratinocitos humanos no cultivados presentaban una concentración de EGF 181 veces mayor que las heridas transfectadas con el
pCMV\beta-Gal como control (figura 4). Las concentraciones de EGF se detectaron para todo el período de ensayo de 7 días. Sin embargo, dentro de los primeros tres días disminuyeron rápidamente, comenzando con 180 \mug/ml el día 1 después del tratamiento hasta llegar a aproximadamente 20 \mug/ml el día 7 después del tratamiento.

Tras un transplante de queratinocitos humanos cultivados que habían sido resuspendidos con la matriz de fibrina, que contenía el plásmido EGF, se obtuvieron pautas de concentración similares para la proteína EGF (figura 3),
(200,5 \mug/ml; día 7, 20 \mug/ml).

Ejemplo 2

Determinación de la concentración óptima de queratinocitos para un tampón determinado. Se utilizó plásmido EGF, Tissucol® y preparados celulares según lo descrito en el ejemplo 1. Únicamente se varió la cantidad de queratinocitos entre 100.000, 1 millón, 2 millones y 5 millones. Las mayores tasas de expresión de EGF se obtuvieron utilizando un número de células de 2 millones/333 \mul de coágulo de fibrina, lo que supone aproximadamente 6 millones de células/ml de coágulo (véase la figura 5).

Ejemplo 3

Optimización de una matriz activada por gen para el tratamiento de heridas completas de ratón desnudo. Se trataron heridas completas de ratón desnudo (12 ratones por grupo) con distintas combinaciones (grupos 1-4). La cantidad de fibrina fue en cada caso de 333 \mul, la cantidad de plásmido de 200 \mug. En cada caso se realizó una preincubación de células apropiadas con el plásmido en 5,7 \mul de PBS durante 3 horas. La cantidad de queratinocitos utilizada fue de 2 millones. Se realizaron biopsias los días 1, 3, 5, 7, 9 y 12 e histologías comenzando el día 5.

Grupo 1:: Fibrina y plásmido EGF

Grupo 2:: Fibrina y queratinocitos

Grupo 3:: Fibrina, plásmido EGF y células endoteliales (=células de soporte)

Grupo 4:: Fibrina, plásmido EGF y queratinocitos (=células de reparación)

Los resultados de las histologías muestran claramente que sólo el grupo 4 tiene como resultado una reepitelización total de las heridas completas en los ratones desnudos, presentando un epitelio completamente regenerado compuesto de 9-11 capas de células (véanse las figuras 9 y 10).

Con todos los demás grupos (1-3) sólo puede observarse cierta reepitelización desde el borde de las heridas, mientras que en el centro de las mismas no se produjo reepitelización alguna (véanse las figuras 6, 7 y 8).

Ejemplo 4 Transfección de diversos tipos de células

200.000 células, a saber: miocitos, células de Schwann, células endoteliales, preadipocitos y fibroblastos, se transfectaron con 10 \mug de plásmido EGF en cada caso. La cantidad de fibrina utilizada fue de 333 \mul. La expresión de EGF se midió en los días 1, 2, 3, 4 y 5 y se muestra en la figura 11.

Ejemplos de aislamiento de células Células de Schwann

Se prepararon células con modificación según el método de Shahar et al., (1989), en el que se recogieron células de Schwann del nervio ciático de ratas recién nacidas. En pocas palabras, las células se recogieron de segmentos de 7 mm del nervio ciático. Los nervios se reunieron en HBSS, se sacaron de su epineurio y se cortaron en trozos de 1 mm^{2}. Los trozos de nervio se disociaron incubando los fragmentos durante 30 minutos a 37ºC con un 0,3% de tripsina y un 0,1% de colagenasa. A continuación, las células se trituraron, se lavaron y se cultivaron con DMDM que contenía un 10% de FCS y penicilina/estreptomicina en matraces revestidos de poli-D-lisina. Al día siguiente se añadió ara-c al medio de cultivo 48 horas antes de sustituir el medio por un medio mitogénico que contenía forscolina. El medio se cambió cada 3 días hasta que las células de Schwann alcanzaron la confluencia.

Células endoteliales microvasculares humanas

Después de eliminar la grasa y la epidermis, la dermis se cortó en trozos de aproximadamente 4 cm^{2} de tamaño. Las células endoteliales se obtuvieron de la dermis tras la separación de dermis y epidermis después de una noche de incubación en dispasa (2,4 U/ml) a 4ºC. Los trozos dérmicos se cortaron de nuevo y se incubaron con tripsina a 37ºC durante 30 minutos. Se aplicó presión a los trozos dérmicos utilizando un escalpelo para obtener las células endoteliales. A continuación se enjuagó la placa de Petri con EGM (5%). Se filtró la suspensión /70 \mum). Después de centrifugar a 1300 rpm durante 5 minutos, la pella se resuspendió en EGM al 5% y se plaqueó en matraces revestidos de gelatina.

Claims

1. Método para la preparación de una composición para la curación de heridas y para la reparación y regeneración de tejido de mamíferos, método que comprende las siguientes etapas:

a.: provisión de un ADN plasmídico en forma sustancialmente pura que codifica un gen que tiene un efecto positivo en la progresión de la regeneración del tejido,

b.: provisión de un componente/componentes de un biopolímero autoendurecible, y

caracterizado porque los componentes (a), (b) y (c) se incuban unos con otros simultánea o sucesivamente de modo que el plásmido y la suspensión celular se obtienen homogéneamente distribuidos en uno de los componentes del biopolímero.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el biopolímero está seleccionado entre: adhesivo de fibrina, colágeno, gelatina, alginato, ácido hialurónico, polisacárido, polímero orgánico o derivados de los mismos o combinaciones de los mismos, respectivamente.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el biopolímero es un adhesivo de fibrina.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el plásmido y las células se hallan en el componente de trombina del adhesivo de fibrina.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el biopolímero se suministra en una forma líquida o liofilizada.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la relación entre plásmido y componente biopolímero es de 5-25 \mug/ml, preferentemente de 10-20 \mug/ml.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la relación entre plásmido y componente biopolímero es de 25-100 \mug/ml, preferentemente de alrededor de 50 \mug/ml.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la relación es de 25.000-75.000 células/\mug de plásmido.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la relación es de 75.000-100.000 células/\mug de plásmido, preferentemente de alrededor de 50.000.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el número de células por ml de componente biopolímero está entre 200.000 y 5.000.000, y preferentemente es de 3.000.000.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la suspensión celular es una suspensión de células seleccionadas entre: queratinocitos, condrocitos, fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, células de Schwann, osteoblastos y osteoclastos.

12. Sistema de transfección que contiene un ADN plasmídico en forma sustancialmente pura que codifica para un gen que tiene un efecto positivo en la progresión de la regeneración del tejido, un componente de un biopolímero autoendurecible y una suspensión celular con células que promueven la regeneración y que no contiene ninguna sustancia promotora de transfección o mediadora de transfección adicional.

13. Composición farmacéutica que contiene un ADN plasmídico en forma sustancialmente pura que codifica para un gen que tiene un efecto positivo en la progresión de la regeneración del tejido, componentes de un biopolímero autoendurecible, una suspensión celular con células que promueven la regeneración y, opcionalmente, otro portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico, pero ninguna otra sustancia promotora de transfección o mediadora de transfección.

14. Kit terapéutico para el tratamiento de defectos tisulares, que comprende:

-: un ADN plasmídico en forma sustancialmente pura que codifica para un gen que tiene un efecto positivo en la progresión de la regeneración del tejido,

-: componentes de un biopolímero autoendurecible, y

-: una suspensión celular que contiene células que promueven dicha regeneración y que no contiene ninguna otra sustancia promotora de transfección o mediadora de transfección.

15. Kit terapéutico que contiene una composición que puede obtenerse de acuerdo con un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

16. Utilización de un sistema de transfección, de la composición farmacéutica o del kit terapéutico según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de defectos tisulares.

17. Utilización según la reivindicación 16, en la que los defectos tisulares están seleccionados del grupo compuesto por: heridas por quemadura, defectos en huesos, músculos, nervios o cartílagos, heridas crónicas y aumentos de tejido.

18. Utilización según la reivindicación 16, en la que el tratamiento de defectos tisulares es la curación de heridas en la piel.

19. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en la que la composición se ha de pulverizar sobre el defecto tisular.

20. Utilización de un gel que contiene la composición farmacéutica obtenible de acuerdo con un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de defectos tisulares.

21. Utilización de una composición preparada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, el sistema según la reivindicación 12, la composición farmacéutica según la reivindicación 13 o el kit según la reivindicación 14 ó 15 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de defectos tisulares.

22. Utilización según la reivindicación 21, en la que los defectos tisulares están seleccionados del grupo compuesto por: heridas por quemadura, defectos en huesos, músculos, nervios o cartílagos, heridas crónicas y aumentos de tejido.

23. Utilización según la reivindicación 21 ó 22, en la que el tratamiento de defectos tisulares es la curación de heridas en la piel.